Synthetische Biologie und Nanosysteme
* ausgewählte Beispiele *
Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme"2008-02-06
Ausrichtung der Forschung
SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese
Mikrofluidik
Fortschritte in
VerständVerständnisnis
AnwenduAnwendungng
Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle
Transkriptionsbasierte
Schalter und Oszillatoren
de novo Design biologischer Systeme
induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus
selbstorganisierte Strukturen
DNA/RNA als Template
gerichtete EvolutionProtein Engineering
Erweiterung des genetischen Codes
nicht-natürliche Aminosäurenlogische biochemische Netzwerke
molekulare Biocomputer
Metabolic Pathway Engineering
Synthese/Abbau chemischer Substanzen
DNA Maschinen
Ausrichtung der Forschung
SequenzierungstechnikDNA-/Gensynthese
Mikrofluidik
Fortschritte in
VerständVerständnisnis
AnwenduAnwendungng
Reduktion der KomplexitätMinimale Zelle
Transkriptionsbasierte
Schalter und Oszillatoren
de novo Design biologischer Systeme
induzierbare Reaktionchemischer/optischer Stimulus
selbstorganisierte Strukturen
DNA/RNA als Template
gerichtete EvolutionProtein Engineering
Erweiterung des genetischen Codes
nicht-natürliche Aminosäurenlogische biochemische Netzwerke
molekulare Biocomputer
Metabolic Pathway Engineering
Synthese/Abbau chemischer Substanzen
Seminar 12.12.07
DNA Maschinen
Beispiel 1:
Chemotaxis in E. coli
bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Umdesign Signalweg
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY:ermöglicht Rotation gegen UZS Mobilität
WT
CheZ
geradlinigeFortbewegung
Taumeln
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
CheZ kombiniert mit Riboswitch: Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration
Chemotaxis in E. coliTopp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007)
konzentrationsabhängige Mobilität Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")
Beispiel 2:
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor
Neudesign Rezeptor
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen- extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis)- intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation)
Transformation in EnvZ E. colifür die Synthese von PCB in E. coli:ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis
EnvZ
Cph1
on off
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
SelektionChimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast"
+EnvZ
Belichtungszeit: 4h bei 37°C
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Lichtgesteuerte Expression in E. coli
räumliche Kontrolle der Genexpression Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch
Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)
Beispiel 3:
Gerichtete Evolution
bestehendes Protein
veränderte Funktionalität
Mutation Selektionsdruck
verbesserte VarianteAusgangsprotein
Gerichtete Evolution
Erzeugung der Bibliothek (107-1010) - Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette- fehleranfällige PCRUmklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coli Genpool
Kopplung von Phenotyp und Genotyp- Affinität: Phage display oder Yeast cell display - Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung
Selektion und Screening- Affinität: über Antigen- Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)
Antigen
Gerichtete Evolution
in vitro Kompartimentisierung: Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen
kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik
1010 pro ml: hoher Durchsatz
Selektionsdruck frei wählbar
kompatibel mit Mikrofluidik, FACS: 107 pro h
Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)
Gerichtete Evolution: Anwendungen
typischerweise 6-12 Runden
Biokatalysatoren
- veränderte Substratspezifität- veränderte/verbesserte Enantioselektivität- erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu- erhöhte Thermostabilität (+15°C)
Antikörper
- Affinitätssteigerung 10-100x- Affinität für neues Antigen: 100-1000x schlechter als in der Natur
Beispiel 4:
Erweiterung des genetischen Codes
Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine
Erweiterung des genetischen Codes
Standard-Code
stellenspezifisch,cotranslational
anstatt dernatürlichen AS
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
Anforderungen:- orthogonales tRNA-Codon Paar- orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase- nnAS im Cytosol
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
amber stop codon (UAG) supression- orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii- gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion- gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS
Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren
Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006)
Fluorescein
?
Beispiel 5:
DNA Computing
Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen
mithilfe von DNA Sequenzen
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph
Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Kombinatorisches ProblemHamiltonscher Pfad in Graph
Algorithmus
1. Generation zufälliger Wege
2. Auswahl Pfade von 0 nach n
3. Auswahl Pfade mit n Knoten
4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen
5. "wahr" / "falsch"
DNA ComputingAdleman, Science 266: 1021 (1994)
Knoten und Kanten20mer DNA
Algorithmus
1. Ligation
2. PCR mit Primer O0 und O6
3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp
4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5
5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6
2
1
3
Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)
boolsche Logik"0": niedrige Konzentration"1": hohe Konzentration
in out
AND
Logische biochemische NetzwerkeSeelig et al., Science 314: 1585 (2006)
Logische biochemische NetzwerkeZhang et al., Science 318: 1121 (2007)
Signalverstärkung- kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment)- Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104 - Entropie-getrieben
Beispiel 6:
DNA Maschinen
Spielerei?
DNA Maschinen
DNA-Läufer entlang DNA-Schiene
Unidirektionalität durch
Zerstörung der SchieneZugabe der Treibstoffsträngein definierter Reihenfolge
Restriktionsenzym
Passivierung der Schienedurch Treibstoffstränge
Treibstoff
Treibstoff
Abfall
Yin et al., Nature 451: 318 (2008)Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007)