Spurenanalytische Erfassungzytostatisch wirksamer Stickstoff-Lost-Derivate
in aquatischen Umweltkompartimentenmittels gaschromatographischer Verfahren
Entwicklung, Optimierung, ValidierungRealprobenmessungen
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Rüdiger Kohl
aus Essen
Bochum 2002
Johann Sebastian Bach (1685-1750)
BWV 245
Diese Arbeit wurde in der Zeit von Mai 1998 bis April 2002 am Lehrstuhl für Analytische
Chemie an der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.
Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Götze für die interessante Themenstellung sowie für
seine ständige Diskussionsbereitschaft, engagierte Unterstützung und den mir gewährten
Freiraum bei der Anfertigung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. W.S. Sheldrick danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
Ich danke ebenso Herrn AOR Dr. P. Zinn für die technische Unterstützung sowie die ständige
Diskussionbereitschaft bei der Anfertigung dieser Arbeit.
Allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Analytische Chemie und insbesondere der Arbeitsgruppe
möchte ich für die äußerst gute Zusammenarbeit und das ausgezeichnete Arbeitsklima danken.
I Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung............................................................................................................................................. 1
2 Problemstellung .................................................................................................................................. 3
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit .................................................................................. 4
3.1 Onkologische Grundlagen............................................................................................................ 4
3.1.1 Behandlung von Krebserkrankungen ................................................................................ 5
3.1.2 Chemotherapie ...................................................................................................................... 6
3.1.3 Toxizität, Mutagenität und Kanzerogenität von Chemotherapeutika......................... 15
3.2 In der Bundesrepublik Deutschland eingesetzte Zytostatika ................................................ 18
3.3 Umweltrelevanz von Zytostatika ............................................................................................... 23
3.3.1 Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt ................................................................. 23
3.3.2 Belastung der aquatischen Umwelt .................................................................................. 26
3.3.3 Belastung der Luft............................................................................................................... 28
3.3.4 Belastung des Bodens......................................................................................................... 30
3.4 Analytik von Zytostatika ............................................................................................................. 31
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika .......................................................................................... 33
4.1 Auswahlkriterien........................................................................................................................... 33
4.2 Ökotoxikologische Bewertung................................................................................................... 34
4.3 Ausgewählte Zytostatika ............................................................................................................. 38
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten ........................................................................ 39
5.1 Der Gaschromatograph .............................................................................................................. 39
5.2 Das Massenspektrometer............................................................................................................ 40
5.2.1 Sektorfeld-Massenspektrometer ....................................................................................... 40
5.2.2 Quadrupol-Massenspektrometer ...................................................................................... 41
5.2.3 Ion Trap-Massenspektrometer.......................................................................................... 42
5.2.4 Vor- und Nachteile von GC-MS-Gerätenbezogen auf den analytischen Sachverhalt ...................................................................... 44
6 Probenvorbereitung.......................................................................................................................... 46
6.1 Verwendete Apparaturen............................................................................................................ 46
6.2 Anreicherung mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion ................................................................... 47
6.2.1 Prinzip der Flüssig/Flüssig-Extraktion............................................................................ 47
6.2.2 Optimierung der Extraktionsparameter .......................................................................... 48
6.2.3 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 51
I Inhaltsverzeichnis II
6.3 Anreicherung mittels Festphasen-Extraktion ................................................................. 55
6.3.1 Prinzip der Festphasen-Extraktion................................................................................... 55
6.3.2 Optimierung der Extraktionsparameter .......................................................................... 58
6.3.3 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 62
6.4 Derivatisierung ............................................................................................................................. 72
6.3.1 Optimierung der Derivatisierungsreaktion...................................................................... 74
6.4.2 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 76
6.5 Einteilung der Verbindungen in Gruppen für die Probenvorbereitung .............................. 80
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren.................................................................................. 82
7.1 Verwendete Geräte und Gase .................................................................................................... 82
7.2 Entwicklung der chromatographischen Methode................................................................... 82
7.2.1 Optimierung der gaschromatographischen Systemparameter...................................... 83
7.2.2 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 87
7.3 Entwicklung der massenspektrometrischen Detektionsmethode......................................... 92
7.3.1 Optimierung der massenspektrometrischen Systemparameter.................................... 92
7.3.2 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 97
7.3.3 Interpretation der Massenspektren................................................................................. 106
8 Validierung der entwickelten Methoden ..................................................................................... 122
8.1 Interne Qualitätssicherung........................................................................................................ 122
8.1.1 Kalibrierung ....................................................................................................................... 123
8.1.2 Wiederfindungsrate........................................................................................................... 124
8.1.3 Standardabweichung......................................................................................................... 125
8.1.4 Bestimmungsgrenze.......................................................................................................... 126
8.1.5 Ergebnisse .......................................................................................................................... 127
8.2 Externe Qualitätssicherung....................................................................................................... 135
8.2.1 Ringversuch – Urin........................................................................................................... 135
8.2.2 Ringversuch – Abwasser.................................................................................................. 137
8.3 Diskussion................................................................................................................................... 140
9 Untersuchung von Realproben..................................................................................................... 142
9.1 Herkunft des Probenmaterials ................................................................................................. 142
9.2 Beschaffenheit der Probenmatrix Abwasser .......................................................................... 143
9.3 Messung der Zytostatika-Konzentrationen in realen Klinkabwässern .............................. 143
9.3.1 Beschreibung des verwendeten Verfahrens .................................................................. 143
9.3.2 Ergebnisse der Messungen und Diskussion.................................................................. 145
I Inhaltsverzeichnis III
10 Zusammenfassung.......................................................................................................................... 151
11 Anhang ............................................................................................................................................. 155
11.1 Eigenschaften der untersuchten Substanzen..................................................................... 155
11.1.1 Cyclophosphamid (CP)................................................................................................... 155
11.1.2 Keto-Cyclophosphamid (KCP) ..................................................................................... 157
11.1.3 Carboxycyclophosphamid (CCP).................................................................................. 158
11.1.4 Cyclophosphamid Mustard (CPM) ............................................................................... 159
11.1.5 Ifosfamid (IF)................................................................................................................... 160
11.1.6 4-Keto-Ifosfamid (KIF).................................................................................................. 162
11.1.7 Carboxyifosfamid (CIF).................................................................................................. 163
11.1.8 Ifosfamid Mustard (IPM) ............................................................................................... 164
11.1.9 1,3-Oxazolidin-2-on (OXAZ)........................................................................................ 165
11.1.10 2-Chlorethylamin (CEA) ................................................................................................ 166
11.2 Arbeitsanweisung für die Anreicherung der Substanzen................................................. 167
11.2.1 Gruppe 1 ............................................................................................................................ 167
11.2.2 Gruppe 2 ............................................................................................................................ 169
12 Literatur............................................................................................................................................ 171
II Verwendete Abkürzungen IV
Verwendete Abkürzungen
a Jahr
ACN Acetonitril
AQS Analytische Qualitätssicherung
BLAC Bund-Länder-Arbeitsgemeinschaft Chemikaliensicherheit
CCP Carboxyphosphamid
CEA 2-Chlorethylamin
CID Kollisionsinduzierter Zerfall
CIF Carboxyifosfamid
CP Cyclophosphamid
CPM Cyclophosphamid Mustard
DIN Detusches Institut für Normung
DNA Desoxyribonukleinsäure
ECD Elektroneneinfang-Detektor
ED50, EC50 Mittlere Effektdosis, Effektkonzentration
EI Elektronenstoß-Ionisierung
EMEA The European Agency for the Evaluation of Medical Products
EtOAc Ethylacetat
EU Europäische Union
GC Gaschromatograph(ie)
GLP Gute Labor Praxis
HFBA Heptafluorbuttersäureanhydid
HFBI Heptafluorbutyrylimidazol
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie
IARC International Agency for Research on Cancer
IF Ifosfamid
IPM Ifosfamid Mustard
KCP 4-Keto-Cyclophosphamid
KIF 4-Keto-Ifosfamid
LD50, LC50 Mittlere Letaldosis, Letalkonzentration
II Verwendete Abkürzungen V
LLE Flüssig/Flüssig-Extraktion
log Pow Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient
M Mol pro Liter
m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis
MeOH Methanol
MP Mischprobe
MS, MS/MS Massenspektrometrie/-meter, Tandem-Massenspektrometrie
MURL Minsterium für Umwelt, Raumplanung und Landwirtschaft des LandesNordrhein-Westfalen
NB Nicht bestimmt
NCI Negative Chemische Ionisierung
NNM Nor Nitrogen Mustard
NOEC No Effect Concentration
OECD Organisation for Economic Co-operation and Development
OXAZ 1,3-Oxazolidin-2-on
PA Protonenaffinität
PCI Postive Chemische Ionisierung
PEC Predicted Environmental Concentration
PFPA Pentafluorpropansäureanhdrid
PNEC Predicted No Effect Concentration
QP Qualifizierte Stichprobe
RT Raumtemperatur
SIM Single Ion Monitoring
SP Schöpf- oder Stichprobe
SPE Festphasen-Extraktion
TFAA Trifluoressigsäureanhydrid
THF Tetrahydrofuran
TIC Total Ion Currency
TMSH Trimethylsulfoniumhydroxid
tR Retentionszeit
Umin-1 Umdrehungen pro Minute
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Arzneimittel werden in Mitteleuropa aufgrund des ausgedehnten Gesundheitswesens in
beträchtlichen Mengen verabreicht. Bedingt durch Menge und Art ihrer Verwendung sind die im
Jahre 2000 in Deutschland produzierten ca. 29.000t Humanarzneimittelwirkstoffe als
umweltrelevante Verbindungen einzustufen. Die Multiplikation der Anzahl der in einem Jahr
verordneten Tagesdosen [3] mit der Menge einer Tagesdosis [1] ergibt die jährlichen
Verordnungsmengen, die in einzelnen Fällen sogar Spitzenwerte von über 100 t/a erreichen.
Durch ihre gewollte mehr oder minder starke Wirkung auf den menschlichen Organismus ist das
Auftreten von Pharmazeutika in den unterschiedlichen Umweltkompartimenten per se
unerwünscht. Einige der etwa 9700 human- und 2700 veterinärmedizinischen Produkte, die sich
in Deutschland derzeit auf dem pharmazeutischen Markt befinden, zeigen einen weiten
Wirkungsradius und können akute und chronische ökotoxikolische Auswirkungen bei im Boden
oder Wasser existierenden Lebensgemeinschaften hervorrufen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind
Rückstände von 91 Arzneimitteln in verschiedenen aquatischen Umweltkompartimenten
detektiert worden [2]. In der Regel gelangen die verordneten Humanpharmaka über die
menschlichen Ausscheidungen wie Urin, Faeces oder Erbrochenes in das Abwassersystem, wo
sie je nach ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften, insbesondere ihrer Polarität,
häufig die Kläranlagen unverändert passieren und in die Bereiche der Grund- und
Oberflächengewässer vordringen. Eine Kontamination des Trinkwassers ist somit möglich. Das
Aufbringen von durch Adsorption mit pharmazeutischen Substanzen belasteten Klärschlämmen
auf landwirtschaftliche Nutzflächen ermöglicht das Eindringen dieser Verbindungen in den
Boden respektive in die Nahrungskette des Menschen. Unfälle bei der Produktion, beim
Transport und der Applikation sowie unsachgemäße Entsorgung der Arzneimittel stellen weitere
mögliche Expositionspfade dar.
Die Zulassung von Humanpharmaka ist nicht mit einer Umweltverträglichkeitsprüfung
verbunden. Obwohl das Vorkommen und die erzeugten Effekte dieser Verbindungen in der
Umwelt trotz verstärkt auftretender Untersuchungsvorhaben immer noch weitgehend unbekannt
sind, unterliegen sie nicht den im Chemikaliengesetz vorgeschriebenen ökotoxikologischen
Prüfungen. Während die EU-Richtlinie 92/39/EWG für Tierarzneimittel ein Prüfschema und
und die Art der zu leistenden Prüfungen detailliert vorschreibt, existiert eine entsprechende
Regelung für Humanarzneimittel bislang nicht.
1 Einleitung 2
2001 stellte die Europäische Arzneimittel-Agentur EMEA (The European Agency for the
Evaluation of Medical Products) ein Diskussionspapier zur Umweltbewertung von
Humanpharmaka vor. Der Entwurf sieht eine Bewertung in zwei Phasen vor. Im ersten
Abschnitt der Prüfung sollen die physiko-chemischen Parameter und die Expositionsbestimmung
des Eintrags in Gewässer und Böden bestimmt werden. Übersteigt die Konzentration einen
festgelegten Triggerwert, so erfolgt in einer zweiten Phase eine vertiefte Risikobewertung anhand
des möglichen Bioakkumulationspotentials sowie der akuten und chronischen Toxizität für
aquatische und terretrische Organismen [3,4].
Die in der Chemotherapie von Tumoren eingesetzten Zytostatika stellen aufgrund ihrer Toxizität,
Mutagenität, Teratogenität und der teilweise in Tierversuchen nachgewiesenen Kanzerogenität
ein hohes Gefährdungspotential für beteiligte und unbeteiligte Personen dar. Die auftretenden
akut-toxischen Nebenwirkungen bei Chemotherapiepatienten wie Haarausfall, Erbrechen und
Kopfschmerzen, aber auch das Auftreten sekundärer Neoplasien, die nicht durch
Metastatisierung des Primärtumors entstanden sind, belegen die völlig unspezifische
Wirkungsweise dieser pharmazeutischen Verbindungen [11-29]. Chemotherapeutika wirken auf
alle in der Teilungsphase befindlichen menschlichen Zellen meist sehr ähnlich wie einige
Antibiotika auf Bakterien: Sie hindern die Zellen an der Vermehrung, indem sie die Verdopplung
ihrer DNA vor der Zellteilung stören und dadurch bei den Zellen die Apoptose, ihren eigenen
programmierten Tod, auslösen. Dieser Eingriff in den Prozeß der Zellteilung birgt stets die
Gefahr genetischer Veränderung und kann damit die Bildung weiterer Geschwulste auslösen.
Verglichen mit anderen Pharmakagruppen wie Analgetika, Herzmittel oder Hormone ist der
jährliche Produktionsumfang in Deutschland mit geschätzten 5 Tonnen gering [30], jedoch muß
das gesundheitsschädliche und umweltgefährdende Potential dieser Verbindungen verglichen mit
den oben genannten als weitaus größer eingeschätzt werden. Die Eintragspfade der Zytostatika in
die Umwelt sind an vielen Stellen in der Literatur beschrieben worden. Nachdem in den letzten
Jahren bei Krankenhauspersonal und Angestellten von Krankenhaus-Apotheken, die mit der
Zubereitung von applikablen Zytostatika-Lösungen oder der Anwendung von Chemotherapien
zu tun hatten, hohe Konzentrationen in Urin- und Blutproben gefunden wurden, sind die
arbeitsmedizinischen Sicherheitsvorkehrungen verschärft worden. Der Hauptexpositionsweg von
Zytostatika in die aquatische Umwelt sind jedoch die in erheblichem Ausmaße mit den
unmetabolisierten Muttersubstanzen und deren aktiven Stoffwechselprodukten kontamierten
Ausscheidungen der Patienten, die mit antineoplastischen Arzneimitteln behandelt wurden. Eine
geregelte Entsorgung der Patientenausscheidungen ist gesetzlich nicht vorgeschrieben und wird
nur an wenigen Krankenhäusern in Deutschland praktiziert, was zu einer starken Belastung der
Klinikabwässer mit Chemotherapeutika führt.
2 Problemstellung 3
2 Problemstellung
Der medizinische und gesellschaftliche Wert von Arzneimitteln wie Chemotherapeutika ist
unumstritten, dennoch müssen die enormen Informationsdefizite systematisch aufgearbeitet
werden. Für die Beurteilung möglicher nachteiliger Wirkungen der Zytostatika und vor allem
deren aktiver Metaboliten in der Umwelt und für die Festlegung künftiger
Risikominderungsmaßnahmen fehlen derzeit die wissenschaftlichen Grundlagen. Für eine
Expositionsanalyse bezüglich der Zytostatika-Rückstände in den betroffenen
Umweltkompartimenten Grund- und Oberflächenwasser und mögliche Umwelteintragspfade
über Kläranlagen ist eine nachweisstarke Spurenanalytik für die Ermittlung von Konzentrationen
im Spuren- und Ultraspurenbereich der ausgesuchten Verbindungen in Oberflächengewässern
und im Klinikabwasser erforderlich.
Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit läßt sich in folgende Punkte gliedern:
→ Auswahl von Zytostatika aufgrund ihrer hohen Verbrauchsmengen, Ausscheidungsraten
und nachgewiesenen Kanzerogenität
→ Auswahl möglicher in aquatischen Umweltkompartimenten vorkommenden Metaboliten
zytostatischer Natur
→ Entwicklung neuer oder Adaption vorhandener Verfahren sowie deren Optimierung zur
Anreicherung der ausgewählten Zytostatika aus den interessierenden Matrices mit Hilfe
verschiedener Extraktionsmethoden
→ Entwicklung neuer oder Adaption und Optimierung vorhandener gaschromatogra-
phischen Bestimmungsverfahren für die Trennung und Bestimmung der ausgewählten
Zytostatika und Metabolite in Oberflächen- und Klinikabwasserproben mittels
massenspektrometrischer Detektion
→ Validierung der entwickelten spurenanalytischen Methoden durch interne und externe
Qualitätssicherung
→ Untersuchung des Vorkommens der ausgesuchten Verbindungen in realen Oberflächen-
und Klinikabwasserproben unter Einsatz der entwickelten Analyseverfahren
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 4
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit
3.1 Onkologische Grundlagen
Krebs ist keine einheitliche Krankheit, sondern ein Sammelbegriff für eine Vielzahl verschiedener
Formen maligner Erkrankungen. Nahezu jedes Gewebe des Körpers kann bösartige Entartungen
hervorbringen. Trotz der Unterschiede in der histologischen Struktur scheinen die Tumore
nahezu alle durch recht ähnliche grundlegende Prozesse hervorgerufen zu werden.
Die rund 30 Billionen gesunden Zellen in einem erwachsenen menschlichen Körper leben in
einer Gemeinschaft wechselseitiger Abhängigkeiten und geteilter Herrschaft. Die Proliferation
der Zellen respektive deren Unterbleiben unterliegt im allgemeinen dem Einfluß der
benachbarten Zellen, die die Aufforderung aussenden, sich zu teilen, so daß Gewebe, Organ und
Körper die gewünschte Funktion und Form erhalten. Dieser gegenseitigen Kontrolle entziehen
sich die Krebszellen, indem sie nur ihrem eigenen Vermehrungsprogramm folgen. Die Fähigkeit
zur Metastatisierung, also die Möglichkeit der Krebszellen, ihren Zellverband zu verlassen und
gegebenenfalls nach Transport in der Blut- oder Lymphbahn an anderer Stelle im Körper eine
weitere Geschwulst zu bilden, läßt den Verlauf der Krankheit zumeist schlimmer und deren
Behandlung schwieriger werden. Werden lebenswichtiges Gewebe oder Organe befallen, können
sie zum Tod führen.
Alle bösartigen Geschwülste sind des weiteren durch die Begriffe Anaplasie und Hyperplasie zu
charakterisieren. Während Anaplasie bedeutet, daß die Zellen einer Geschwulst nicht vollständig
ausreifen und somit ihre Funktion nicht in vollem Umfang wahrnehmen können, beschreibt der
Begriff Hyperplasie die Eigenschaft der unkontrollierten Zellteilung. Diese wiederum ist nicht in
jedem Fall schneller als die der normalen Zellen. Jedoch befinden sich die meisten Zellen der
chemotherapiesensiblen Tumore in der Teilungsphase. Derzeit stirbt in den Industrieländern
zwischen 20 und 25 Prozent der Bevölkerung an solchen malignen Tumorbildungen, und somit
ist sie die zweithäufigste Todesursache nach den Krankheiten des Kreislaufsystems. In
Deutschland erliegt jeder Dritte einer Kreislauferkrankung, und jeder Vierte stirbt an einer
bösartigen Neubildung. Wenn sich auf dem Gebiet der Krebsprävention keine ähnlich
durchschlagenden Erfolge zeigen wie bei den Kreislauferkrankungen, dann wird der Krebs in den
nächsten 15-20 Jahren die Todesursache Nummer Eins in Deutschland sein [31-35].
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 5
3.1.1 Behandlung von Krebserkrankungen
Um Krebserkrankungen behandeln zu können, bestehen prinzipiell zwei Möglichkeiten: Zum
einen kann das Geschwulstgewebe vernichtet oder aber in seinem Wachstum gehemmt werden.
Die älteste und am häufigsten angewendete Behandlungsmethode ist die operative Entfernung
des Tumors. Mit einer Operation werden die meisten Heilungen verbucht, und sie ist zudem die
einzige Therapieform, bei der sich überprüfen läßt, ob der Tumorherd vollständig beseitigt
worden ist. Hat das entfernte maligne Gewebe einen geschlossenen Kranz von normalen Zellen,
so ist von einer vollständigen Beseitigung dieses Tumors auszugehen. Jedoch garantiert dies
nicht, daß mikroskopische Ausläufer, die sogenannten invasiven Tumorzellen, mit erfaßt worden
sind.
Oft wird die Bestrahlung der Operation vorgezogen. Hierbei wird der Bereich der
Krebserkrankung einer intensiven Röntgen- oder γ-Strahlung ausgesetzt. Dies kann von außen in
Form von Bestrahlungsgeräten sowie auch durch Verabreichung winziger radioaktiver
Strahlungsquellen in den Körper erreicht werden. In beiden Fällen wird der Zelle ein so großer
genetischer Schaden zugefügt, daß die Zelle entweder abstirbt oder dazu gebracht wird, gleichsam
„Selbstmord“ zu begehen (Apoptose). Da sich gesundes Gewebe schneller von den Folgen der
Bestrahlung erholen kann als Krebszellen, kann eine solche Therapie die Gewebestruktur um den
Tumor erhalten und somit denselbigen ohne Funktionseinbußen des umgebenden Gewebes
heilen. Einige Arten von Krebs lassen sich mit Bestrahlung gut behandeln, wie zum Beispiel
Gebärmutterhals-Krebs, Frühstadien von Prostata-Krebs sowie Hodgkin-Lymphom. Ein
weiterer Vorteil dieser Behandlungsmethode ist die Tatsache, daß auch mikroskopisch kleine
Auswüchse des Tumors zerstört würden, die bei einer Operation nur schwer vollständig mit dem
Skalpell erfaßt werden können.
Aber auch die Bestrahlung erweist sich trotz aller Vorteile manchmal als unzureichend. Sie kann
teilweise nicht alle Krebszellen eines Tumors bzw. schon invasive Zellen beseitigen, die vielerorts
nach einiger Zeit zu Tumoren auswachsen. Diese beiden Behandlungsmethoden eignen sich also
zur Beseitigung lokalisierter Geschwülste, die noch nicht metastatisiert sind. Derzeit heilen sie
rund 35% aller Tumorerkrankungen.
Die dritte Möglichkeit, um Hyperplasie behandeln zu können, ist die systemische Chemotherapie
mit zytotoxisch wirkenden Medikamenten, die im Gegensatz zu den obigen Methoden ungezielt
in den Organismus eingreift.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 6
Sie ist bei fortgeschrittenen, inoperablen oder generalisierten Tumorerkrankungen (Leukämien)
sowie zur Metastasenprophylaxe und –bekämpfung die einzige Therapieform. Auf die
Wirkungsweise der sogenannten Zytostatika wird im folgenden näher eingegangen.
3.1.1 Chemotherapie
Von den weltweit über 200.000 Substanzen, die jährlich auf ihre Zytotoxizität getestet werden,
gelangt nur etwa 1% in die klinische Phase I, in der die therapeutische Wirksamkeit eines
Arzneimittels an wenigen, wenn möglich gesunden, ausgesuchten Personen getestet wird, bevor
es in den nächsten beiden Phasen bei einer größeren Anzahl von Menschen Anwendung findet
und anschließend als neues Medikament zugelassen wird.
Aufgrund der Tatsache, daß die Erkenntnisse, wie es zur Entstehung und Vermehrung bösartiger
Tumore kommt und wie Zytostatika im einzelnen genau wirken, recht rudimentär sind, ist es bis
heute noch nicht möglich, auf den Patienten und seinen Karzinom maßgeschneiderte
Chemotherapeutika zu synthetisieren.
Während bei einem chirurgischen Eingriff oder bei radiotherapeutischem Vorgehen alle drei
Zellfraktionen eines Tumors geschädigt werden können, ist bei der Behandlung einer
systemischen Erkrankung mittels einer Chemotherapie die Proliferationsfraktion das Ziel. Dies
bedeutet, daß die Zytostatika nur Zellen angreifen, die sich in einer Phase des Zellzyklus
befinden, nicht jedoch in der sogenannten G0-Phase (Ruhephase). Daraus resultiert die besondere
Empfindlichkeit der proliferierenden Zellen chemotherapiesensibler Tumoren auf Zytostatika.
Die Chemotherapie erfolgt entweder mit einzelnen Substanzen oder in der sogenannten
Polychemotherapie. Hierbei wird eine Kombination von in der Regel 3-4 Zytostatika
angewendet, um in unterschiedliche Phasen des Zellzyklus eingreifen und Resistenzbildung
vermeiden zu können, während die toxischen Nebenwirkungen minimiert werden[37-39].
Soll eine Unterteilung der als Zytostatika verwendeten Substanzen aufgrund ihrer nicht bei allen
Substanzen en detail geklärten Wirkungsmechanismen und deren chemischer Strukturen
vorgenommen werden, so kommt es meist zu der in Tabelle 3.1 gezeigten Einteilung. Hierbei
werden die in manchen Publikationen separat geführten platinhaltigen Verbindungen und die
Interferone zu den sonstigen Zytostatika gezählt.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 7
Tab. 3.1: Einteilung der verwendeten Zytostatika [1]
Substanzgruppe Zytostatika (Wirkstoffe)
AlkylantienBendamustin, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cyclophosphamid,Ifosfamid, Lomustin, Melphalan, Nimustin, Prednison, Thiotepa,Treosulfan, Trofosfamid
Antimetaboliten Cladribin, Cytarabin, Fludarabin, Fluorouracil, Gemcitabin,Mercaptopurin, Methotrexat, Tioguanin
Alkaloide Vinblastin, Vinchristin, Vindesin, Vinorelbin
Antibiotika Aclarubicin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin,Farmorubicin, Idarubicin, Mitomycin
HormoneAminoglutethimid, Buserelin, Ethinylestradiol, Flutamid, Formestan,Fosfestrol, Goserelin, Leuprorelin, Medroxyprogesteron, Tamoxifen,Triptorelin
Sonstige
Amsacrin, Dacarbazin, Docetaxel, Estramustin, Etoposid,Hydroxycarbamid, Miltefosin, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin,Porfimer, Procarbazin, Teniposid, Topotecan, Tretinoin, Interferonalpha-2a, Interferon alpha-2b, Carboplatin, Cisplatin
3.1.1.1 Alkylierende Verbindungen
Dieser Begriff vereinigt Substanzen relativ einfacher Struktur, die durch Einbau von
Alkylgruppen in Nukleinsäuren und somit durch Blockierung der DNA-Synthese eine hemmende
Wirkung auf die Zellteilungsprozesse haben. Im allgemeinen besitzen diese Moleküle zwei
reaktive Zentren, die über die Bildung eines Carbokations mit Proteinen und u.a. mit dem
Guanin der Desoxyribonukleinsäure reagieren, wobei es zu einer multiplen Veränderung des
DNA-Strangs kommt („cross-linking“, anormale Basenpaare, DNA-Spaltung, etc., Abb.3.1).
Diese Verbindungsklasse der alkylierenden, zytotoxischen Verbindungen enthält u.a.
Halogenalkylamine, N-Alkyl-N-Nitroso-Verbindungen, Phosphamidester, Aziridin-
Verbindungen und Sulfonsäureester mehrwertiger Alkohole. Für die meisten Autoren fallen die
Platinverbindungen ebenfalls unter diese Gruppe, da auch sie eine Bindung mit den DNA-
Strängen eingehen, jedoch handelt es sich hierbei nicht um Alkylierungen.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 8
Abb. 3.1: Hemmung der DNA-Replizierung durch Alkylantien und zytostatische Antibiotika [40]
Eine der ältesten Substanzgruppen ist die der Stickstoff-Lost-Derivate. Diese Stoffe entstanden
in Analogie zu den Schwefellost-Verbindungen oder Senfgasen, die als Hautkampfstoffe im I.
Weltkrieg eingesetzt wurden [41]. Soldaten, die an einer Intoxikation mit diesen Kampfstoffen
(Yperit, Gelbkreuz, N-Lost) gestorben waren, wiesen bei der Autopsie regelmäßig eine Aplasie
des Knochenmarks (fehlende Entwicklung des vorhandenen Gewebes), eine Auflösung des
lymphatischen Gewebes und Geschwürbildung im Magen-Darmtrakt auf [41].
Die besondere Toxizität dieser Stoffe für lymphatisches Gewebe ließ frühzeitig an die
Entwicklung besser steuerbarer Substanzen von ähnlicher Struktur denken, die bei malignen
Erkrankungen des lymphatischen Systems zum Einsatz kommen könnten. Solche Substanzen
wurden in Verbindungen mit der allgemeinen nachstehenden Formel gefunden (Abb. 3.2 ).
O N
P
O
N
R2R3
R1
Abb. 3.2: Allgemeine Struktur der Oxazaphosphinan-Derivate
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 9
Tab. 3-2: Chemische Strukturen der untersuchten Oxazaphosphinan-Derivate
Oxazaphosphinan-Derivat R1 R2 R3
Cyclophosphamid -H -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl
Ifosfamid -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl -H
Trofosfamid -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl -CH2CH2Cl
Es handelt sich hierbei um 1,3,2-Oxazaphosphinan-2-amin-2-oxide ähnlicher Struktur mit
unterschiedlicher Anordnung und Anzahl der 2-Chloroethyl-Seitengruppen, die ein breites
Anwendungsspektrum besitzen (siehe Anhang). Die Verabreichung erfolgt oral oder intravenös
in Dosen von bis zu 5000mg/m2 Körperoberfläche je nach Tumorerkrankung und Ansprechen
des Patienten auf die Therapie [43]. Die Dosierung von Ifosfamid erfolgt bedeutend höher, da
das Alkylierungsverhältnis von IF zu CP etwa 1:5 beträgt [44]. Die Muttersubstanzen sind inaktiv
und nicht zytotoxisch. Eine Metabolisierung im Körper ist also notwendig, um ein reaktives
alkylierendes Intermediat zu bilden. Da die Metabolismen der beiden in dieser Arbeit
untersuchten alkylierend wirkenden Muttersubstanzen sehr ähnlich sind, werden im folgenden
nur die biochemischen Prozesse des am besten untersuchten Cyclophosphamid nähergehend
erläutert. Die beiden schematischen Darstellungen der Stoffwechsel von Cyclophosphamid und
Ifosfamid können den Abbildungen 3.3 und 3.4 entnommen werden. In einem ersten Schritt
wird die Muttersubstanz in der Leber mit Hilfe eines Enzyms („Gemischte-Funktion-Oxidase“),
das in den endoplasmatischen Reticuli dieses Organs vorkommt, unter Verbrauch von NADPH
und Sauerstoff zu 4-Hydroxycyclophosphamid oxidiert. In Gegenwart von Wasser bzw. H3O+-
Ionen kommt es zu einer säurekatalysierten Ringöffnung dieses Primärmetaboliten. Mit dem
entstehenden Aldehyd-Tautomer Aldophosphamid steht das 4-Hydroxycyclophosphamid im
Gleichgewicht. Beide Substanzen sind atoxisch und werden zu Transportzwecken im Körper
benötigt. In dieser Form gerät das Zytostatikum in die Zelle. Der Aldehyd ist ein chemisch sehr
labiles Produkt. Es kommt, wenn keine oxidativen Enzyme, wie sie in der Leber existieren,
vorhanden sind, die ihn zur ebenfalls untoxischen Carbonsäure weiteroxidieren, durch eine
basen- oder albuminkatalysierte β -Eliminierung zur Abspaltung des toxischen Acroleins und
dadurch zur Bildung des eigentlich zytotoxischen Phosphamidmustard. Die meisten Tumoren
sind zu dem oxidativen Abbau des Aldehyds nicht fähig: Die Substanz zerfällt also am Ort der
gewünschten Wirkung und setzt dabei das alkylierende Produkt frei.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 10
O NHP
O
N
Cl
Cyclophosphamid
Cl
O NHP
O
NH
Cl
+HC
H2C ClO
N-Dechloro-Cyclophosphamid Chloracetaldehyd4-Hydroxy-CyclophosphamidAldo-Cyclophosphamid
O NHP
O
N
ClCl
OH
O P
O
NH2
N
O
Cl Cl
H
O NP
O
NH
Cl
Cl
O
4-Keto-CyclophosphamidHO O P
O
NH2
N
O
OHC
HC CH2
ON
O
Cyclophosphamid Mustard Acrolein Carboxyphosphamid
3-(2-Chloroethyl)-1,3-Oxazolidin-2-on
Cl Cl
HO P
O
NH2
N
Cl Cl
HN
Cl Cl
Nor Nitrogen Mustard
Cl+
CH2C
H2C
O
HO
3-Hydroxypropionsäure
OH
NCl
N-2-Chloroethylaziridin
+
Abb. 3.3: Metabolismus von Cyclophosphamid [45]
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 11
O NP
O
NH
Cl
Cl
Ifosfamid
O NP
O
NH
Cl
Cl
OH
O NP
O
NH
Cl
Cl
OH
HO O P
O
NH
HN
Cl
Cl
Alco-Ifosfamid
O NP
O
NH2
ClO NH
P
O
NH
Cl
OHC CH2Cl
+
OHC CH2Cl
+
O NP
O
NH
Cl
Cl
OH
HC
O P
O
NH
HN
Cl
Cl
O
4-Hydroxy-IfosfamidAldo-Ifosfamid
O NP
O
NH
Cl
Cl
O
4-Keto-Ifosfamid
HO O P
O
NH
HN
Cl
Cl
O
Carboxy-Ifosfamid
HO P
O
NH
HN
Cl
Cl
OHC
HC CH2
IfosfamidMustard
Acrolein
+
NClH
H
Chloroethylamin
ON
O
H
1,3-Oxazolidin-2-on
2-Dechloroethyl-Ifosfamid 3-Dechloroethyl-Ifosfamid
Chloroacetaldehyd Chloroacetaldehyd
Abb. 3.4: Metabolismus von Ifosfamid [46]
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 12
Im nächsten Schritt wird das Chloratom einer der 2-Chlor-Ethylgruppen abgespalten, und es
entsteht ein extrem reaktives Imonium-Ion, das durch Umwandlung in ein Carbonium-Ion nun
leicht durch in Makromolekülen vorhandenen, nucleophilen Gruppen angegriffen wird. Dadurch
wird das Stickstoff-Lost-Molekül kovalent an das Makromolekül gebunden. Die Abspaltung des
zweiten Chloratoms führt nun zur Vernetzung der beiden DNA-Stränge („cross-linking“). In
Abbildung 3-5 ist dies am Beispiel der chemisch nachgewiesenen Alkylierung des Guanin in N-7-
Position gezeigt. Diese Alkylierung hat für die DNA schwerwiegende Konsequenzen: Durch den
Übergang der normalerweise bevorzugten Ketokonfiguration von Guanin in die
Enolkonfiguration ändert sich die Spezifität der Basenpaarung. Guanin kann als Enol auch mit
Thymin ein Basenpaar bilden, wodurch der Informationsgehalt der DNA verfälscht wird.
Beheben die zelleigenen Reparaturmechanismen dies nicht, so kommt es zur Apoptose.
Abb. 3.5: DNA-Alkylierung („cross-linking“) durch Phosphamidmustard [44]
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 13
3.1.1.2 Antimetaboliten
Bei dieser Substanzklasse handelt es sich um Komponenten, die aufgrund ihrer strukturellen
Ähnlichkeit mit physiologischen Stoffwechselbausteinen (Metaboliten) im Organismus eine
höhere Affinität zu den jeweiligen Enzymen haben und daher den Einbau der eigentlichen
Bausteine verhindern oder aber bevorzugt statt derer in Stoffwechselprodukte eingebaut werden.
Auch die Antimetaboliten sind zytotoxische Verbindungen, die wegen ihres völlig unspezifischen
Verhaltens alle Zellen gleichermaßen betreffen. Die Folgen des Einbaus sind Störungen des
Stoffwechsels und des Zellwachstums.
Abb. 3.6: Hemmung der DNA-Bildung durch Antimetabolite [40]
Beispiele für typische Antimetaboliten-Klassen sind Folsäureantagonisten (z.B. Methotrexat),
Purinantagonisten (z.B. Mercaptopurin), Pyrimidinantagonisten (5-Fluorouracil) und 4-
Aminobenzoesäureantagonisten, die Verwendung als Chemotherapeutika, Zytostatika,
Immunsuppresiva, Virostatika und Gichtmittel finden.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 14
3.1.1.3 Pflanzenalkaloide
Eine weitere Möglichkeit der Zellzyklus-Hemmung ist die Blockade der Mitose durch
Pflanzenalkaloide, die aus dem Madagaskar-Immergrün Vinca rosea gewonnen werden. Diese
beeinträchtigen den Spindelapparat z.B. in der Weise, daß die Chromosomen in der Metaphase
nicht getrennt werden, weshalb Zellen mit nicht nur verdoppeltem, sondern 4-, 8-, 16-fachem
Chromosomensatz entstehen können (Polyploidisierung z.B. durch Colchicin, Nocodazol,
Podophyllotoxin, etc.).
Abb. 3.7: Wirkung der Mitosespindelgifte [40]
Als Zytostatika finden Vinblastin, Vincristin und Vindesin Verwendung.
3.1.1.4 Antibiotika
Anders als die Alkylantien, die mit den Nukleinsäuren der Erbsubstanz kovalente Bindungen
eingehen (siehe Kapitel 3.1.2.1), liegen diese Bindungen bei der Behandlung mit Antibiotika teils
ionisch, teils als Wasserstoffbrücken- oder van-der-Waals-Bindungen vor. Aufgrund dieser
Verknüpfung mit der Doppelhelix kommt es zu Fehlern - etwa Brüche oder unpassende
Verbindungen zwischen oder in den Strängen.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 15
Diese kann sich nicht mehr richtig replizieren. Versagen nun die Reparaturmechanismen der
Zelle, kommt es zum programmierten Zelltod, der Apoptose.
Wichtige Vertreter dieser Wirkklasse sind Anthracycline wie Doxorubicin und Adriarubicin sowie
Actinomycine und die synthetischen Antibiotika Mitoxantron und Amsacrin [47].
3.1.1.5 Hormone
Auch Östrogene, Antiöstrogene, Androgene, Antiandrogene und Gestagene werden seit
geraumer Zeit dazu eingesetzt, bösartige Tumoren in einer Chemotherapie zu behandeln. Im
Unterschied zu den bisher aufgeführten Substanzen haben Hormone keine direkte zytotoxische
Wirkweise, sondern sie verändern vielmehr die hormonellen Bedingungen des den Tumor
umgebenden Gewebes. So wirken die Hormone vermutlich indirekt über die Hormonrezeptoren
an der Oberfläche der Tumorzellen.
3.1.1.6 Sonstige
Substanzen, die aufgrund ihrer Struktur und zytostatischen Wirkungsweise keiner der oben
genannten Gruppen zugeordnet werden können, faßt man in dieser Gruppe zusammen. Dazu
gehören neben dem Pflanzenwirkstoff Podophyllotoxin und dessen Derivaten Etoposid und
Teniposid die häufig verwendeten Platinverbindungen, Cisplatin und Carboplatin. Deren
zytostatische Wirkung ähnelt der der Alkylierungssubstanzen, weshalb sie auch von einigen
Autoren zu dieser Gruppe gezählt werden. Auch sie wirken bifunktionell und interkalieren die
DNA-Stränge („cross-linking“), jedoch übertragen sie keine Alkylreste auf dieselbigen [39,48,49].
3.1.2 Toxizität, Mutagenität und Kanzerogenität von Chemotherapeutika
Der einzige Unterschied zwischen gesunden und krebsartigen Zellverbänden liegt in der Regel in
der weitaus höheren Teilungsrate der Tumorzellen. Aufgrund der meist völlig unspezifischen
Wirkungsweise der Zytostatika kommt es gerade auch bei gesunden Zellen mit kurzen
Teilungszyklen (Wechselgewebe) zu teils schweren Schädigungen. Als primäre toxische
Auswirkungen sind Haarausfall, die Zerstörung der Schleimhäute, des Knochenmarks und der
Keimzellen zu nennen.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 16
Im Verlaufe einer Chemotherapie kommt es häufig zu Übelkeit und Erbrechen sowie teils
schwersten Durchfällen. Eine starke Reduzierung der Leukozyten hat eine erhöhte
Infektionsgefahr zur Folge. Im Hinblick auf die teilweise starke Verschlechterung des physischen
und psychischen Wohlbefindens des Patienten müssen stets sorgfältig diese Nebenwirkungen
gegen die zu erwartende Verbesserung der Lebensqualität und die Verlängerung der Lebensdauer
abgewogen werden.
Aus dem unspezifischen Wirkmechanismus und wegen des Eingreifens in den
Nukleinsäurestoffwechsel können Zytostatika mutagen und teratogen wirken, woraus auch ein
nicht unerhebliches kanzerogenes Potential resultiert, das Gegenstand zahlreicher
Untersuchungen ist [1,14,32,48,50-52]. In der neueren toxikologischen und medizinischen
Literatur werden Zytostatika durchweg als mutagen eingestuft, und man geht heute davon aus,
daß mehr als 90% aller mutagenen Verbindungen auch kanzerogene Eigenschaften haben [48,53-
58]. Während die genannten allgemein toxischen Nebenwirkungen erst ab einer bestimmten
Mindestmenge an aufgenommener Substanz auftreten, sind mutagene und karzinogene
Wirkungen prinzipiell an keine Mindestkonzentration gebunden, und der Zusammenhang
zwischen aufgenommener Menge und kanzerogener Wirkung ist nicht unbedingt linear [53-58].
In den sechziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde erstmals das Auftreten sogenannter
Sekundärtumoren erwähnt [13-29]. Dabei handelt es sich um Tumoren, die im Gegensatz zu den
Metastasen völlig unabhängig vom eigentlichen primären Tumor sind. Zumeist sind dies
chemotherapieresistente Leukämien. Die hierzu durchgeführten wenigen Langzeitstudien [23-
29,59-62] beziffern das absolute Risiko eines Chemotherapiepatienten, an einem solchen
Sekundärtumor zu erkranken, auf 2-10%. Werden diese Personen mit einer Kontrollgruppe mit
gesunden Probanden verglichen, so entspricht das einem relativen Krebsrisiko, das um das 9- bis
100-fache erhöht ist.
Von der International Agency for Research on Cancer (IARC) sind bislang 26 Zytostatika
untersucht und, wie im folgenden aufgeführt, eingestuft worden [5-11]:
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 17
Gruppe 1: Kanzerogen für den Menschen
Chlorambucil [305-03-3] IARC26
Cyclophosphamid [50-18-0] [6055-19-2] IARC26
Semustin [13909-09-6] IARCS7
Melphalan [148-82-3] IARC9, IARCS7
Myleran [55-98-1] IARCS7
Tamoxifen [10540-29-1] IARC66
Thiotepa [52-24-4] IARC50
Treosulfan [299-75-2] IARC26, IARCS7
MOPP und andere kombinierte Chemotherapien IARCS7einschließlich der Alkylantien
Gruppe 2A: Wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen
Adriamycin [23214-92-8] IARC10, IARCS7
BCNU [154-93-8] IARC26, IARCS7
CCNU [13010-47-4] IARC26, IARCS7
Cisplatin [15663-27-1] IARC26, IARCS7
Procarbazine Hydrochloride [366-70-1] IARC26, IARCS7
Gruppe 2B: Möglicherweise kanzerogen für den Menschen
Bleomycins [11056-06-7] IARC26, IARCS7
Dacarbazine [4342-03-4] IARC26, IARCS7
Daunomycin [20830-81-3] IARC10, IARCS7
Mitomycin C [50-07-7] IARC10, IARCS7
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 18
Gruppe 3: Nicht klassifizierbare Kanzerogenität gegenüber dem Menschen
Actinomycin D [50-76-0] IARC10, IARCS7
5-Fluorouracil [51-21-8] IARC26, IARCS7
Ifosfamid [3778-73-2] IARC26, IARCS7
6-Mercaptopurin [50-44-2] IARC26, IARCS7
Methotrexat [59-05-2] IARC26, IARCS7
Prednimustin [29069-24-7] IARC50
Prednison [53-03-2] IARC26, IARCS7
Vinblastin sulfat [143-67-9] IARC26, IARCS7
Vincristin sulfat [2068-78-2] IARC26, IARCS7
Kein Zytostatikum wurde in die Gruppe 4 – Das Agens ist wahrscheinlich nicht kanzerogen für
den Menschen – eingestuft.
3.2 In der Bundesrepublik Deutschland eingesetzte Zytostatika undderen Verbrauchsdaten
Von den in der Welt vertriebenen mehreren hundert zytostatisch wirkenden Substanzen finden
sich rund einhundert in der vom Bundesverband der pharmazeutischen Industrie jährlich
herausgegebenen Roten Liste® [1], in dem sich 98% aller in der Bundesrepublik erhältlichen
Fertigarzneimittel mit ihren Zusammensetzungen, Anwendungsgebieten, Dosierungen und
Nebenwirkungen laut Herstellerangaben befinden. Die 71 als Zytostatika und Metastasehemmer
Verwendung findenden Substanzen werden hier zusätzlich zu den schon in Tab. 2.1 aufgeführten
in zwei weitere Gruppen eingeteilt; die Platinverbindungen und die Interferone werden als
gesonderte Gruppe angesehen. Über diese Anzahl hinaus befindet sich noch eine Reihe weiterer
zytostatisch wirkender Verbindungen in den klinischen Phasen respektive im
Zulassungsverfahren, die nicht in dieser Auflistung zu finden sind. Wieder andere sind
zugelassen, werden aber in Deutschland nicht vertrieben.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 19
Die Gesamtjahresproduktion aller Zytostatika in der Bundesrepublik Deutschland wird auf
ungefähr 5 Tonnen geschätzt [30]. Wegen der an den behandelnden Kliniken weit verbreiteten
Tendenz zur Hochdosis-Therapie ist mit einer weiterhin steigenden Nachfrage und somit auch
Produktion dieser Substanzen zu rechnen. An genaue Verbrauchszahlen einzelner Verbindungen
zu gelangen, hat sich immer wieder als äußerst schwer herausgestellt. Die bis dato umfangreichste
Untersuchung dieser Art wurde im Jahre 1992 von der Arbeitsgruppe Götze et al. der Ruhr-
Universität Bochum durchgeführt [63], auf deren Ergebnisse im folgenden eingegangen wird. Die
Befragung umfaßt den Jahresverbrauch von Zytostatika von 19 Krankenhausapotheken in
Deutschland. Der Übersicht halber sind die Ergebnisse in vier verschiedenen Säulendiagrammen
dargestellt. Den ersten beiden Abbildungen (Abb. 3.8 und 3.9) ist der Verbrauch aller Apotheken
zu entnehmen. Jedoch sind die Verbrauchsdaten teilweise höchst unterschiedlich, so daß die y-
Achse bei einem Jahresverbrauch von 1000g/a abgeschnitten wurde. Während Zytostatika mit
einem Verbrauch von weniger als 100g/a gar nicht erst in dieser Graphik erscheinen, werden die
sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch noch einmal in den beiden Abbildungen
3.10 und 3.11 exakt gezeigt.
Abb. 3.8: Verbrauchsdaten von Zytostatika nach einer Befragung von 19 Krankenhausapotheken [63]
13
57
911
1315
1719
Cisplatin
Methotrexat
EstramustinCytarabin
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0
200
400
600
800
1000Verbrauch
[g/Jahr]
Krankenhäuser
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 20
Abb. 3.9: Verbrauchsdaten von Zytostatika nach einer Befragung von 19 Krankenhausapotheken [63]
Abb. 3.10: Daten der sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch nach einer Befragung von
19 Krankenhausapotheken 1992 [63]
13
57
911
1315
1719
Etoposid
5-Fluorouracil
Ifosphamid
Cyclophosphamid
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0
200
400
600
800
1000
Verbrauch [g/Jahr]
Krankenhäuser
2 3 9 12 13 18 19
Etoposid
5-Fluorouracil
Cyclophosphamid
Ifosfamid
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0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Verbrauch [g/Jahr]
Krankenhaus
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 21
Abb. 3.11: Daten der sieben Krankenhäuser mit dem höchsten Verbrauch nach einer Befragung von
19 Krankenhausapotheken 1992 [63]
Die Daten dieser Untersuchung zeigen ganz deutlich, daß es erhebliche Unterschiede in der Art
und im Verbrauch der Zytostatika existieren. Lediglich acht dieser Verbindungen werden in
Mengen von mehr als 100g/Jahr eingesetzt. Wird berücksichtigt, daß es immer mehr zu
Kombinationen bestimmter Substanzen in der Chemotherapie kommt, um in alle Phasen des
Zellzyklus eingreifen zu können, kann dieses Ergebnis erklärt werden. Die beiden Verbindungen
mit dem höchsten Umsatz sind Ifosfamid und Cyclophosphamid aus der Klasse der Alkylantien.
Auch die restlichen Verbindungen zeigen alkylierende Eigenschaften auf: Während das dem
Estradiol strukturverwandte Estramustin und das Pflanzenalkaloid Etoposid, das als
Topoisomerase-II-Hemmer fungiert, ebenfalls u.a. kovalente Bindungen mit der DNA eingehen,
basieren die zytostatischen Eigenschaften des Cisplatin auf vergleichbaren [32,33,48,64-66].
Die Angaben in medizinisch-pharmazeutischen Lehrbüchern bestätigen die Aussage dieser
Umfrage. Die obigen Zytostatika werden im Vergleich zu den Antibiotika und Hormonen in
großen Mengen pro Tag und Patient und bevorzugt in der Kombinationstherapie eingesetzt [32-
36,48]
2 3 9 12 13 18 19
Cisplatin
Methotrexat
Estramustin
Cytarabin
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0
500
1000
1500
2000
2500
Verbrauch [g/Jahr]
Krankenhaus
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 22
Tab. 3.3: Zytostatika-Verbrauchsdaten in Krankenhäusern nach einer Befragung von 19
Krankenhausapotheken 1992 [63]
Klinik Verbrauchsmengen [ g/a]
Cisplatin Cyclo-phos-
phamid
Cytarabin Etoposid Estra-mustin
5-Fluoro-uracil
Ifos-famid
Metho-trexat
1 3,4 ---- ---- ---- ---- 1000 ---- 433
2 31,2 962 ---- 1000 1000 77 ---- 8,8
3 6 40 ---- ---- 540 125 50 5,8
4 32,8 319,5 111 ---- ---- 437 250 50,7
5 3,7 205 ---- ---- 27 337,5 280 30
6 13,9 361 24 ---- ---- 175 120 21,6
7 267 356,4 ---- 70,8 ---- 493,5 170 55,4
8 223,2 536,6 117,2 ---- 680 360 ---- 534,4
9 400,2 1000 1000 662,2 ---- 891,5 1000 762
10 2,7 325,5 792,8 36,1 ---- 1,3 26,4 47,3
11 45,7 366,9 706,4 91,5 ---- 224 306,5 108,2
12 43,4 481,4 ---- 577,5 ---- 341 1000 20
13 109 1000 472 7 ---- 1000 940 150
14 16,3 139,7 ---- 13,6 ---- 599,5 6 11,1
15 5,9 444 10,5 60 ---- 640 550,8 3,5
16 49 251,4 226,4 38 481,6 217,5 331,5 32,5
17 1 67,7 18,8 4,5 ---- 42,5 ---- 0,4
18 73,7 1000 491,1 157 ---- 1000 1000 147,5
19 124,9 1000 1000 297,5 173,5 686 1000 547,5
Summe 1453 6077 4970 1945 2902 5643 6161 2970
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 23
3.3 Umweltrelevanz von Zytostatika
Erst in den letzten Jahren tritt das Gefährdungspotential von Zytostatika für die Umwelt aus dem
Schatten der zahlreichen Untersuchungen bezüglich des Patientenmonitorings. Auch
arbeitsmedizinische Untersuchungen, die sich mit der Gefahr für Personen, die beruflich
während der Produktion, Zubereitung und Applikation dieser Substanzen exponiert sind, wurden
durchgeführt [59-61,67-77]. Dieses Problems hat man sich in den letzten Jahren verstärkt
angenommen, da für kanzerogene Stoffe keine unbedenkliche Geringstkonzentration angeben
werden kann und der oben genannten Personenkreis stets einer geringen Menge am Arbeitsplatz
ausgesetzt ist.
3.3.1 Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt
Wird der mögliche Eintragspfad der Zytostatika genauer betrachtet, so offenbaren sich viele
mögliche Gefahren, denen verschiedenen Menschen, die mit diesen Stoffen in Berührung
kommen können, drohen (Abb. 3.12): Gerade während der Produktion kann es schon, vor allem
wegen der immer weiter steigenden Tendenz zur Hochdosis-Therapie und somit der hohen
Produktionsrate, zur Bildung von Stäuben, kontaminierten Abfällen und Abwässern kommen.
Über das Ausmaß kann wegen des Betriebsgeheimnisses nur spekuliert werden [59,60]. Ein hohes
Risiko der Kontamination beteiligter wie unbeteiligter Personen besteht vor allem beim
Transport. Werden die Zytostatika vom Produzenten zur Apotheke oder Klinik auf dem Postweg
verschickt, so müssen sie nur als Medikamente, nicht aber als Gefahrgut gekenntzeichnet werden,
was zur Folge hat, daß keinerlei weitere Schutzmaßnahmen, wie z.B. Hinweise zur Verhalten bei
Transportschäden, getroffen werden müssen. Ist bei der Abfüllung der Arzneimittel nicht
sorgfältig gearbeitet worden oder ist es zu einem nicht bemerkten Bruch während des Transports
gekommen, birgt dies neue Gefahrenquellen durch den Hautkontakt über kontaminierte
Außenverpackungen [61].
Eine weiterer Gefahrenbereich ist die Zubereitung der Applikationen. Auch hierbei kommt es zu
Belastungen der beiteiligten Personen und der Umwelt über die Luft, den entstehenden Abfall
und über direkten Hautkontakt. Auch die Verwendung von Sicherheitswerkbänken (laminar
flow) bietet nicht immer ausreichenden Schutz. Da nach neuen Untersuchungen manche
Zytostatika einen meßbaren und vergleichsweise hohen Dampfdruck besitzen und die
Sicherheitswerkbänke häufig noch mit Umluft und entsprechenden Filtermatten betrieben
werden, kann von einer Belastung der umgebenden Raumluft ausgegangen werden [59,60,78].
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 24
Abb. 3.12: Eintragspfade der Zytostatika in die Umwelt [79]
Produktion
Transport (Post)
Zubereitung Sicherheits-werkbänke
Transport (Haus)
Applikation Abfall
Abwasser
KläranlageKlärschlamm Ablauf
Gewässer
Abfall
AbluftAbfall
Abwasser Hautkontakt
Filtermatten
AbfallVerpackungsbruch
Ausscheidungen Hautkontakt
Hautkontakt
Hautkontakt
Luftkontakt
VerpackungsbruchAußenkontamination
Dünger
Abluft
Nahrungskette
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 25
Ebenso haben Untersuchungen kürzlich ergeben, daß es trotz sorgfältigen Arbeitens bei der
Herstellung applikabler Lösungen von Cyclophosphamid in Werkbänken, die mit einem
Fortluftsystem ausgestattet sind, zu einer erheblichen Belastung der umgebenden Raumluft
kommt, die hauptsächlich in der Gasphase und nicht Partikelform vorliegt [78].
Beim Transport innerhalb des Krankenhauses oder bei einer ambulanten Behandlung im Hause
des Patienten besteht erneut die Gefahr des Bruches der Verpackung und der enthaltenen
Behältnisse. Weiterhin ist zu beachten, daß die Kontaminationsgefahr durch Zytostatika nach der
Verabreichung weiterhin besteht, da viele Zytostatika über Urin, Faeces, Erbrochenes, Atem oder
Schweiß teilweise unverändert respektive zu einem nicht unbedeutenden Teil auch in Form von
ebenfalls hochtoxischen und kanzerogenen Metaboliten wieder ausgeschieden werden. Gerade
bei den in dieser Arbeit untersuchten beiden Alkylantien Cyclophosphamid und Ifosfamid liegen
die Ausscheidungsraten der unmetabolisierten Muttersubstanz je nach Autor bei 10-20% [80,81].
Auf diesem Weg gelangt ein beträchtlicher Teil in das Abwasser der behandelnden
Krankenhäuser oder bei ambulanter Applikation umgehend in kommunale Abwässer.
Untersuchungen von Kümmerer et al. und Kiffmeyer haben gezeigt, daß ein biologischer Abbau
der Zytostatika in einem closed-bottle-Test bzw. einer Modellkläranlage häufig nur teilweise oder
gar nicht stattfindet [82-85,172]. Dadurch ist eine Belastung der Kläranlagenabläufe und des
entstehenden Klärschlamms zu befürchten.
Zusammenfassend ist festzuhalten, daß im Laufe der Herstellung, des Transports und der
Applikation von Zytostatika sowie durch Patientenausscheidungen erhebliche Risiken für die an
diesem Verlauf beteiligten wie unbeteiligten Personen besteht. Daher bedarf es einer
leistungsfähigen Analytik, die in der Lage ist, auch geringste Zytostatikabelastungen in den
verschiedenen Matrices zu bestimmen und somit ein Belastungsmonitoring von
Krankenhauspersonal, Luftmonitoring in Krankenhausapotheken sowie die Überwachung von
Krankenhausabwässern ermöglicht.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 26
3.3.2 Belastung der aquatischen Umwelt
Das mögliche und teilweise auch nachgewiesene Vorkommen von Zytostatika in der aquatischen
Umwelt hat mehrere Ursachen. Sowohl Unfälle als auch unsachgemäße Entsorgung jedweder Art
führen zu einer erheblichen Belastung der Abwässer. Jedoch erfolgen in Deutschland die
Zytostatika-Applikationen in der Regel durch Infusionen oder orale Gaben stationär im Bereich
der Krankenhäuser und Klinken. Hier gelangen die Ausgangssubstanzen durch die
Ausscheidungen der Patienten zu einem großen Teil unmetabolisiert oder in Form der
zytostatisch wirkenden Metaboliten in die Klinikabwässer [32,51,58,86,87], wodurch sie zum
Gesamteintrag von Pharmaka ins Abwasser [88-97] und zu dessen mittlerweile nachgewiesener
Mutagenität beitragen [98,99].
In der Literatur sind nur wenige Stellen über den tatsächlichen Nachweis von Zytostatika in
aquatischen Umweltkompartimenten zu finden. Erstmals wurde 1985 im Ablauf einer
onkologischen Klink in Großbritannien Methotrexat nachgewiesen. Die daran angeschlossenen
Oberflächengewässer wiesen allerdings keine Belastungen auf [90]. Ebenfalls in England wurde
fünf Jahre später das zytostatisch wirksame Antbiotikum Bleomycin sowohl in einem
Kläranlagenabfluß als auch in Fluß- und Trinkwasser gefunden [99]. Die Arbeitsgruppe um
Kümmerer in Freiburg hat im Jahre 1996 den Abwasserstrom einer Freiburger Klinik und die
Teilströme der daran angeschlossenen kommunalen Kläranlage untersucht [85]. Es konnten
sowohl in den Kläranlagenzu- und -abläufen als auch im Klinikabwasser die beiden Stickstoff-
Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid detektiert werden. Tabelle 3.4 sind die genaue
Ergebnisse dieser Untersuchungen zu entnehmen.
Bezüglich der Verteilung, der Stabilität und des biologischen Abbaus von Zytostatika in
Abwässern sind einige Untersuchungen der Arbeitsgruppen von Kümmerer in Freiburg und
Götze in Bochum unternommen worden. Während die in dieser Arbeit untersuchten
Cyclophosphamid und Ifosfamid sowohl in dem in Freiburg durchgeführten closed bottle test als
auch in dem Abbauversuch in einer Modellkläranlage an der Ruhr-Universität Bochum keinen
biologischen Abbau zeigten, wurden die Verbindungen Treosulfan, Cytarabin, Methotrexat und
5-Fluorouracil teilweise oder vollständig abgebaut. Die entsprechenden Literaturstellen sind in
Tabelle 3.5 aufgeführt.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 27
Tab. 3.4: Literaturstellen zum Nachweis von Zytostatika in verschiedenen Umweltkompartimenten
Zytostatikum Probennahmeort Konzentration Jahr Zitat
Methotrexat Abfluß Onkologische Klinik 1 µg/L 1985 [90]
Bleomycin
Kläranlagenabfluß
Flußwasser
Trinkwasser
11-19 ng/mL
5-17 ng/mL
5-13 ng/mL
1990 [99]
Cyclophos-phamid
Zu/Ablauf der Kläranlage
Klinikabwasser
bis 60 ng/L
4,5 µg/L1996 [85]
IfosfamidZu/Ablauf der Kläranlage
Klinikabwasser
bis 60 ng/L
1,9 µg/L1996 [85]
Tab. 3.5: Literaturstellen zum biologischen Abauverhalten von Zytostatika
Zytostatikum Testverfahren Abbaurate Jahr Zitat
Cyclophosphamid
Ifosfamid
Closed Bottle Test (OECD 301 D)
Closed Bottle Test (OECD 301 D)
0 %
0 %
1996
1996
[84]
[84]
Mitoxantron
Treosulfan
Closed Bottle Test (OECD 301 D)
Closed Bottle Test (OECD 301 D)
0 %
30%
1997
1997
[100]
[100]
MethotrexatManometric Respirometry Test
(OECD 301 F)< 60% 1997 [101]
Cisplatin
Cyclophosphamid
Cytarabin
5-Fluorouracil
Methotrexat
OECD Sreening Test (TensV)
OECD Confirmatory Test (TensV)
OECD Confirmatory Test (TensV)
OECD Confirmatory Test (TensV)
OECD Confirmatory Test (TensV)
0 %
0 %
60 %
100 %
98 %
1998
1998
1998
1998
1998
[102]
[102]
[102]
[102]
[102]
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 28
Abbau bedeutet hier, daß eine Konzentrationsabnahme der Ausgangssubstanz stattfand. Es
werden keine Aussagen darüber getroffen, ob der Abbau vollständig verläuft bis hin zu Wasser
und Kohlendioxid oder ob es sich hierbei um eine Umwandlung in Metaboliten handelt, die wie
im Falle des Methotrexat in einem Primärabbau in eine strukturverwandte Struktur umgeformt
wird, die aber ebenfalls zytotoxisch wirksam ist (Hier: 7-Hydroxy-Methotrexat). Über das
Vorkommen, Verhalten und den biologischen Abbau von Zytostatika-Metaboliten existieren nur
wenige Veröffentlichungen.
3.3.3 Belastung der Luft
Bisher waren noch keine Daten über die Emissionen von Zytostatika aus Produktionsbetrieben
oder aus zentralen Krankenhausapotheken bekannt. Einige Untersuchungen befassen sich mit
Arbeitsplatzmessungen zur Bestimmung der Massenkonzentration von partikelgebundenen
Zytostatika in der Raumluft [103-109]. Im Zuge des Arbeitsschutzes wurden Wisch- und
Luftproben genommen, der Urin von pharmazeutischen und pflegedienstlichen Angestellten
analysiert sowie die Permeabilität für Zytostatika von Handschuhe untersucht. Die erhaltenen
Meßergebnisse der Luftproben ergaben für die partikelgebundenen Zytostatika aufgrund
unterschiedlicher Probenahmetechniken und weiterer Schritte stark voneinander abweichende
Ergebnisse.
Neueste Forschungsergebnisse haben gezeigt, daß sowohl eine partikuläre als auch eine
gasförmige Bildung von Cyclophosphamid möglich ist [78]. Bei diesem Forschungsvorhaben
wurden die Apotheke eine Universitätsklinik und die eines städtischen Krankenhauses während
unterschiedlicher Arbeitsphasen beprobt. Bemerkenswert ist, daß die in der Gasphase
gefundenen Konzentrationen von Cyclophosphamid stets signifikant höher waren als die des
partikelgebundenen (Tabellen 3.5 und 3.6).
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 29
Tab. 3.5: Massenkonzentrationen von Cyclophosphamid in den Emissionen aus Zubereitungsräumen
für Zytostatika [78]
Massenkonzentration[µg/m3]
Universitätsklinik
Partikelphase Gasphase
Ohne Zubereitung mitlaufender Sicherheitswerkbank < 0,003 13
Zubereitung nurCyclophosphamid
(30 x 400 bis 700 mg)< 0,003 < 0,012
Routinezubereitung(Anteil Cyclophosphamid 2 g) < 0,003 0,027
Tab. 3.6: Massenkonzentrationen von Cyclophosphamid in der Raumluft von Zubereitungsräumen
für Zytostatika [78]
Massenkonzentration[µg/m3]
Universitätsklinik Städtische Klinik
Partikelphase Gasphase Partikelphase Gasphase
Ohne Zubereitung mit laufenderSicherheitswerkbank < 0,003 0,6 0,006 - 0,0065 0,045 - 0,145
Zubereitung nur Cyclophosphamid(30 x 400 bis 700 mg) < 0,003 3,9 Nicht
bestimmtNicht
bestimmt
Zubereitung nur Cyclophosphamid(100 x 1000 mg)
Nichtbestimmt
Nichtbestimmt < 0,003 0,11
Routinezubereitung(Anteil Cyclophosphamid 2 g) 0,017 - 0,223 0,017 Nicht
bestimmtNicht
bestimmt
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 30
3.3.4 Belastung des Bodens
Untersuchungen haben ergeben, daß es zu Belastungen der Böden durch Antibiotika durch das
Aufbringen kontaminierter Klärschlämme kommt. Hierbei handelt es sich aber nur um
entsprechende Substanzen für den Veterinärbereich. Es liegen jedoch noch kaum Daten zur
Bodenbelastung bzw. zum Verhalten von Zytostatika in Böden vor. Eine Forschungprojekt hatte
das Adsorptionsverhalten von Etoposid, Methotrexat und 5-Fluorouracil zum Inhalt [78]. Dabei
zeigte sich in einem Modellversuch, daß bei den jeweiligen Substanzen keine Adsorption
festzustellen war. Jedoch konnte bei der Extraktion eindeutig 7-Hydroxy-Methorexat
nachgewiesen werden. Dies bestätigt die Vermutung, daß es sich bei der Elimination von
Methotrexat um eine Hydrolyse in 7-Hydroxy-Methotrexat handelt, der damit prinzipiell in der
Lage ist, an der Oberfläche von Klärschlämmen zu adsorbieren, weshalb ein Ausbringen
kontaminierter Schlämme zu einer Belastung der Boden führen kann. Jedoch konnten keine
positiven Befunde bezüglich dieser Komponente bei der Untersuchung realer Proben festgestellt
werden.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 31
3.4 Analytik von Zytostatika
Die analytischen Bestimmungsverfahren für Zytostatika bezogen sich seit Beginn dieser
Untersuchungen vor 40 Jahren zumeist auf das in Krankenhäusern für die Einstellung der
Chemotherapie-Patienten benötigte Monitoring. Hierbei müssen die Konzentrationen der
Verbindungen in physiologischen Matrices von medizinisch-diagnostischer Bedeutung wie Urin
und Blut gemessen werden, um sie mit der dem Patienten verabreichten Menge an Substanz in
Relation setzen zu können. Dieses Verhältnis läßt Rückschlüsse auf den Umsetzungsgrad der
Verbindungen im Körper und somit auf einen möglichen Behandlungserfolg zu [32,33,110-116].
In der medizinisch-pharmazeutischen Literatur sind für die Untersuchung der Verteilung der in
der vorliegenden Arbeit untersuchten Muttersubstanzen und ihrer Metaboliten im Körper einige
Methoden zu finden [45,46,117-133]. Diese pharmakokinetischen Untersuchungen beschäftigen
sich mit den Voraussetzungen für die Resorption der Pharmaka im Organismus, also um deren
Bioverfügbarkeit.
In den letzten 15 Jahren wurden diese Bestimmungsmethoden für Zytostatika auch zur
Überprüfung der Belastung beruflich exponierter Berufgruppen wie Ärzte, Krankenpfleger und
ambulante Pflegekräfte angewendet [59-62,67,71,134-136].
Während im Blut und Urin von Chemotherapie-Patienten zum Teil äußerst hohe
Konzentrationen dieser Verbindungen auftreten, so sind in physiologischen Flüssigkeiten des
Krankenhauspersonal weitaus geringere Mengen zu erwarten, da dieser Personenkreis einer
niedrigeren, aber chronischen Zytostatika-Belastung ausgesetzt sind. Naturgemäß ist eine
Verbesserung der Nachweisstärke der Analysemethoden für diese Arbeitsschutzmaßnahmen
notwendig. Eine weitere arbeitsmedizinische Fragestellung waren und sind in den letzten Jahren
die Untersuchungen der Belastung durch Stäube und Aerosole in Krankenhaus-Apotheken,
onkologischen Stationen und Produktionsstätten. Vereinzelt wurden diese durch Wisch- und
Luftprobenahmen untersucht [137,138].
Die Untersuchung des Umweltmediums Wasser und hier im speziellen Fall das Oberflächen-
sowie das Abwasser stellt die Analytik der Zytostatika und ihrer Metaboliten vor weitere
Schwierigkeiten. So treten zum einen die Verbindungen in noch weitaus geringeren
Konzentrationen auf als bei den oben genannten Fällen, und zum anderen handelt sich hierbei
um eine sehr inhomogene und teilweise extrem stark belastete Matrix. Es ist also ein
nachweisstarkes und selektives Bestimmungsverfahren der Verbindungen verbunden mit einer
effektiven Spurenanreicherung aus einer komplexer Matrix notwendig.
3 Kenntnisstand – Ausgangspunkt der Arbeit 32
Hier liegen verglichen mit der Anzahl der Methoden zum Patienten- und Belastungsmonitoring
nur wenige Literaturstellen vor (Tab. 3.4). Zur analytischen Bestimmung der hier untersuchten
Stickstoff-Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren Metabolite wurden bisher
vor allem gas- und flüssigchromatographische Methoden mit verschiedenen Detektoren
verwendet. Die gaschromatographische Trennung der Komponenten von den
Matrixbestandteilen hat sich im Laufe der Zeit gegenüber den flüssigchromatographischen
Methoden aufgrund der höheren und schnelleren Trennleistung sowie der empfindlicheren und
nachweisstärkeren Detektionssysteme (z.B. MS) durchgesetzt. Obwohl die aufwendige und mit
Verlusten behaftete Probenaufbereitung bei der HPLC entfällt, sind mit der GC weitaus
niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen. Jedoch ist es in neuesten Untersuchungen möglich
gewesen, bei der Verwendung einer HPLC-MS/MS-Kopplung eine ähnlich gute
Nachweisempfindlichkeit zu erreichen [139]. Erstmals konnten 1997 Cyclophosphamid und das
Strukturisomer Ifosfamid mittels GC-MS-Kopplung in Konzentrationen von bis zu 60ng/L in
verschiedenen Strömen einer Kläranlage nachgewiesen werden [85,86]. In verschiedenen
Veröffentlichungen konnten die interessierenden Metaboliten im Blut mit einer speziellen
Ionisierungstechnik (Negative Chemische Ionisierung) im Massenspektrometer analysiert werden
[133].
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 33
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika
4.1 Auswahlkriterien
Das sicherlich ausschlaggebende Auswahlkriterium zur Untersuchung des Verhaltens von
Humanarzneimitteln ist deren Umweltgefährdungspotential. In der Europäischen Union erfolgen
Untersuchungen zum Umweltgefährdungspotential von Chemikalien und Pflanzenschutzmitteln
nach vereinheitlichten Grundprinzipien, für Humanpharmaka hingegen liegen bisher keine
standardisierten Bewertungsverfahren vor. Lediglich für neue Tierarzneimittel wurde 1996 eine
Richtlinie zur Durchführung eines sogenannten Environmental Risk Assessments verabschiedet
[140]. Die Schätzung dieses Potentials basiert stets auf der Betrachtung substanzbezogener Daten
und anderen gesetzlich verlangten und umweltrelevanten Informationen. Des weiteren geschieht
sie in der Regel durch den Vergleich ihrer in der Umwelt gefundenen bzw. prognostizierten
Konzentration mit denjenigen, die für repräsentative Arten oder Ökosysteme toxisch sind. In
Kapitel 4.2 wird näher auf diese Problematik eingegangen.
Ein weiteres Auswahlkriterium ist die Tatsache, daß es sich bei den beiden Muttersubstanzen um
zwei der am häufigsten verschriebenen Pharmazeutika zytostatischer Wirkung handelt, die auch
hohe Wiederauscheidungsraten von bis zu 65% - je nach medikamentöser Einstellung und
physischer Verfassung des Patienten - besitzen. Auch von den jeweiligen Metaboliten wird
vermutet, daß sie teilweise starke mutagene und kanzerogene Eigenschaften besitzen [F40,41,44
G18,19,21]. Weiter erscheint es sinnvoll, das Vorkommen einiger der im Körper zu einem großen
Teil gebildeten und ausgeschiedenen Stoffwechselprodukte zu überprüfen, da über deren
Vorkommen und Verhalten im Umweltkopartiment Wasser keinerlei Daten vorliegen.
Als Einschränkung soll hier die analytische Bestimmung mit der zur Verfügung stehenden GC-
MS-Kopplung genannt werden. Die Substanzen mußten sich, wenn nötig auch mittels zur Hilfe
genommener Derivatisierungsreaktionen, mit dieser chromatographischen Methode bestimmen
lassen.
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 34
4.2 Ökotoxikologische Bewertung
Das Bewertungsverfahren für Chemikalien basiert auf einem Vergleich der Exposition mit der
Wirkung. Dies wird durch den Quotienten der erwarteten Konzentration in der Umwelt –
„Predicted Environmental Concentration“, PEC – und der Konzentration, bei der keine Effekte
zu erkennen sind – „Predicted No Effect Concentration“, PNEC ausgedrückt.
1≥PNEC
PEC
Ist dieser Wert größer als 1, ist mit einem Auftreten wirkungsauslösender Konzentrationen in der
Umwelt zu rechnen, ist er kleiner, so sind keine weiteren Untersuchungen erforderlich. Dies gilt
jedoch nicht für Verbindungen mit kanzerogenen Eigenschaften wie z.B. Zytostatika.
Wichtig für eine Risikoabschätzung von Pharmaka sind im einzelnen [78]:
� Eintrag und Verbleib in der Umwelt
Wichtig ist vor allem zu klären, wieviel von einer Substanz auf welchem Wege in die aquatische
Umwelt gelangt. Dabei spielen die applizierte Menge der jeweiligen Substanz und deren
Ausscheidungsraten eine wichtige Rolle. Bei Humanpharmaka erfolgt ein wesentlicher Eintrag
der Wirkstoffe und ihrer Metaboliten über den Urin, Faeces oder das Erbrochene der
behandelten Patienten. Besonderes Augenmerk ist dabei auf den Eintrag in die Klinkabwässer
und die kommunalen Kläranlagen zu richten. Handelt es sich bei den Verbindungen um
hydrophile Substanzen, so kann davon ausgegangen werden, daß diese in den verschiedenen
aquatischen Umweltkompartimenten wie Oberflächengewässern und im Grundwasser äußerst
mobil sind und es nicht zu Adsorptionen an Sedimenten, Schlämmen oder Schwebstoffen
kommt. Bei lipophilen Substanzen hingegen kann es zu Bioakkumulation in Organismen
kommen. Bei der Betrachtung der Bioverfügbarkeit ist ebenfalls der mögliche biologische und
abiotische Abbau der Verbindung und ihrer Metabolite zu berücksichtigen.
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 35
� Wirkung
Die Wirkabschätzung zielt darauf ab, ein Maß für die toxischen Effekte auf die Organismen des
Ökosystems zu finden. Dazu werden entsprechende Wirkkonzentrationen in standardisierten
Labortests ermittelt. In der Regel werden akute Tests mit Fischen, Daphnien, Algen und
Mikroorganismen durchgeführt, um durch diese Kombination von Testspezies und
Testmethoden die reale Situation zu simulieren, die durch einzelne Tests nur mangelhaft zu
beschreiben wäre.
Auch dieses Vorgehen birgt wie alle Labortests noch eine Variabilität der Daten, vor allem wegen
des Übergang von akuten auf chronische Toxizitätsdaten und synergistischer Effekte. Auf der
Basis von Labordaten werden diese Umstände durch einen Unsicherheitsfaktor von 10
berücksichtigt.
Als Basisdaten sind folgende Angaben bei Vermarktungsmengen von weniger als 100t im Jahr
erforderlich:
- Akute Fischtoxizität LC50 (96h)
- Akute Daphnientoxizität EC50 (48h)
- Akute Algentoxizität EC50 (72h)
- Wachstumshemmung bei Mikroorganismen EC50
- Biologischer Abbau
- Abiotischer Abbau (Ad- und Desorption für nicht leichtabbaubare Substanzen)
Bislang sind kaum Daten über die ökotoxikologischen Wirkungen von Pharmaka bekannt. Hinzu
kommt, daß vielfach die chemische Analytik nicht in der Lage ist, die Substanzen und deren
Metabolite in den umweltrelevanten Konzentrationen nachweisen zu können, was einer
Risikoabschätzung für die meisten Zytostatika seiner wesentlichen Elemente beraubt.
Für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Muttersubstanzen sind die notwendigen
Angaben vorhanden und den nachfolgenden Tabellen 4.1 und 4.2 zu entnehmen. Bezüglich der
Bewertung der Stoffwechselprodukte fehlen viele Daten, um auch nur annähernd eine Aussage
über das ökotoxikologische Gefährdungspotential dieser Metaboliten machen zu können. Um
jedoch das Verhalten der beiden Alkylantien Cyclophosphamid und Ifosfamid in der aquatischen
Umwelt umfassender beschreiben zu können, ist es wichtig, ebenfalls mögliche Folgeprodukte in
den entsprechenden Kompartimenten nachweisen zu können.
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 36
Tab. 4.1: Physikalisch-chemische Eigenschaften, Abbaubarkeit in aquatischen Umweltkompartimenten
und Konzentrationen in Realproben von Cyclophosphamid und Ifosfamid.
Cyclophosphamid Ifosfamid Literaturstelle
Physikalisch-chemischeEigenschaften
Wasserlöslichkeit 40.000 mg/L 100.000 mg/L [43, 141]
Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient(log Pow)
-0,49 -0,9 [84]
Adsorptionskoeffizientfür Boden undSediment
12,85 7,76 [84]
Biokonzentrations-faktor 11,81 7,41 [84]
Abbaubarkeit
Abbau (28 d)OECD 301 E
< 1% < 1% [82]
Closed bottle-Test 0 % 5-7 % [84]
Zahn-Wellens-Test Keine Elimination Keine Elimination [84]
Kläranlagen-Simulationstest
< 5 %keine Toxizität
< 5%keine Toxizität
[82]
Nachweis inaquatischenUmwelt-kompartimenten
Kläranlagenzu- und-ablauf
bis 60 ng/L bis 60 ng/L [84]
Klinikabwasser 4,5 µg/L 1,9 µg/L [84]
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 37
Tab. 4.2: Ökotoxikologische Daten von Cyclophosphamid und Ifosfamid
Cyclophosphamid Ifosfamid Literaturstelle
Ökotoxizität
Akute Fischtoxizität
Salmo gairdneriNOEC (96 h)LC50 (96 h)(OECD 203)
> 984 mg/L > 555 mg/L> 1.000 mg/L
[141,142]
AkuteDaphnientoxizität
Daphnia magnaNOEC (48 h)EC 50 (48 h)(OECD 202)
> 987 mg/L 100 mg/L162 mg/L
[141,142]
Bakterientoxizität
PseudomonasputidaEC 10 (16 h)DEV/DIN 38412 T 8
> 10.000 mg/L > 10.000 mg/L
[141,142]
Keine antimikrobielleAktivität gegenüberanaeroben gram-negativen oder –positiven Bakteriensowie Hefen
[143]
KeineWachstumshemmungbei Staphylococcus a ureus,Entorococcus faeces,Pseudomonas aeroginosa,Candida alba
bei 9 mg/L
KeineWachstumshemmungbei Staphylococcus a ureus,Entorococcus faeces,Pseudomonas aeroginosa,Candida alba
bei 9 mg/L
[114,145]
Bakteriostatisch bei2 g/L, bakterizid ab3 g/L für Salmonellatyphimurium
[146]
4 Auswahl der untersuchten Zytostatika 38
4.3 Ausgewählte Zytostatika
Ziel dieser Arbeit war es, durch die Entwicklung neuer respektive die Optimierung vorhandener
Analysenverfahren, eine Möglichkeit zu schaffen, in Zukunft die durch die in großen Mengen
verabreichten Muttersubstanzen Cyclophosphamid und Ifosfamid und die ebenfalls entstehenden
und teilweise hochtoxischen Metaboliten hervorgerufene Gefährdung der Umwelt und damit
auch des Menschen besser einschätzen zu können. Hier wurden diejenigen Stoffwechselprodukte
untersucht, die zum einen entweder käuflich zu beziehen waren oder aber vom Hersteller der
Ausgangssubstanzen zur Verfügung gestellt werden konnten. Ein weiterer Beweggrund war das
bekannte oder nicht einschätzbare Umweltgefährdungspotential dieser Verbindungen. Es
handelte sich hierbei neben Cyclophosphamid und Ifosfamid um 4-Keto-Cyclophosphamid,
Carboxyphosphamid, Cyclophosphamid Mustard, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid,
Ifosfamid Mustard, 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin.
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 39
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten
5.1 Der Gaschromatograph
Die GC ist wie alle anderen chromatographischen Verfahren eine Trennmethode, die sowohl zur
Gewinnung reiner Stoffe als auch zur Durchführung qualitativer und quantitativer Analysen von
Mischungen eingesetzt werden kann.
Die beiden prinzipiell wichtigsten Bestandteile gaschromatographischer Trennsysteme sind die
Trennsäule und der Detektor. In den unter Trägergasdruck stehenden Probenaufgabeteil, den
Injektor, wird mittels einer Mikroliter-Spritze ein bestimmtes Volumen eines Stoffgemisches (1
bis 250µL) über ein selbstdichtendes Septum eingebracht. Flüssige Proben werden in einem
ersten Schritt durch schnelles Erwärmen des sich im Injektor befindlichen Glasröhrchens (Liner)
verdampft und mit Hilfe des inerten Trägergases (Stickstoff, Helium, Wasserstoff) auf die mit
dem Injektor verbundene Trennsäule überführt. Die vom Trägergas durchströmte Gepackt- oder
Kapillarsäule ist in einem Ofen angebracht, so daß die in ihr ablaufende Trennung des
Substanzgemisches durch Anlegen eines Temperaturgradienten bzw. durch temperaturkonstante
Perioden optimiert werden kann. Chromatographische Säulen unterscheiden sich im allgemeinen
durch die Effizienz der mit ihnen erreichbaren Trennungen durch die Selektivität der in ihr
enthaltenen stationären Phasen und durch ihre Belastbarkeit mit der Probe. Spezielle
Unterschiede ergeben sich durch die Arten von Trägeroberflächen, auf denen sich die stationäre
Phase befindet (Kapillarsäule, gepackte Säulen) und durch die Geometrie der Säule
(Durchmesser, Länge). Die in der Säule getrennten Komponenten des Gemisches gelangen im
optimalen Fall mit dem charakteristischen Konzentrationsprofil einer Gaußschen Kurve im
Trägergas in den Detektor, der je nach dem zu erreichenden Analysenziel alle (z.B.
Massenspektrometer) oder einzelne Vertreter bestimmter Substanzklassen (z.B. stickstoff-
/phosphorselektiver Detektor) spezifisch, unter Erzeugung eines Signals, anzeigt. Das
Registriersystem liefert dann ein Chromtogramm, also eine Aufzeichnung der Höhe des
Detektorsignals in Relation zur Zeit, die seit der Injektion vergangen ist [147]. Im weiteren
Verlauf dieses Kapitels wird näher auf die Detektorklasse der Massenspektrometer eingegangen,
die in dieser Arbeit verwendet worden ist. Details zu anderen in der Gaschromatographie
benutzten Detektoren sind in der einschlägigen Literatur nachzuschlagen [147,148].
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 40
5.2 Das Massenspektrometer
Die Kopplung eines Gaschromatographen mit einer leistungsfähigen Identifizierungsmethode
wie einem massenselektiven Detektor ermöglicht die Bestimmung der Identität der von der
Trennsäule eluierenden Komponenten des Stoffgemisches. Will man diese Informationen nur
über die Retentionsdaten erhalten, so ist dies nur schwer möglich, da schon Verbindungen
bekannter Struktur bei Verwendung von Säulen mit unterschiedlichen Trennphasen nicht
einwandfrei bestimmt werden können. Der Informationsgehalt von Massenspektren, die während
des GC-Laufs im Bereich von 1 bis 10 pro Sekunde aufgenommen werden, ist äußerst hoch, da
von ihnen häufig über den Zerfall der entstandenen Ionen auf die Struktur geschlossen und
gegenbenfalls auch mit Spektren aus einer Bibliothek verglichen werden kann.
In einem ersten Schritt werden die in dem GC-Eluat befindlichen Substanzen über ein Interface
in die unter Hochvakuum stehende Ionenquelle geleitet, wo sie mittels beschleunigter Elektronen
oder über ein Reaktandgas ionisiert werden (Siehe Kapitel 7.3.1.1). Die erzeugten Ionen und die
daraus durch Umlagerungen und Zerfall gebildeten Fragmente werden über elektronische Linsen
beschleunigt und zu einem schmalen Strahl fokussiert. Anschließend gelangen sie in den
Massenfilter, dessen unterschiedliche Ausführungen in den nächsten Kapiteln genauer
beschrieben werden.
5.2.1 Sektorfeld-Massenspektrometer
In diesem Gerät werden die entstandenen Ionen durch eine hohe Spannung von 1 bis 10 kV, die
an den Beschleunigungselektroden angelegt ist, auf hohe Geschwindigkeiten gebracht. Eine mit
geringerer Spannung versehene Ausgangsblende fungiert als Eintrittsspalt des Massenfilters. Er
fokussiert die divergenten Ströme von Ionen mit demselben Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z),
die in den Analysator eintreten, auf den Austrittsspalt am Ende des Analysators. Ein auf dieser
Strecke angelegtes Magnetfeld hat die Funktion eines Filters, der die Massen auftrennt. Das m/z-
Verhältnis der Ionen, die am Ende des Analysators durch den Austrittsspalt treten, hängt gemäß
der unten stehenden Gleichung, die Beynon et al. 1960 zur Beschreibung des Massenfilters dieser
Prägung formulierten, vom Radius r der Kreisbahn, die die Ionen im Magnetfeld beschreiben, der
Magnetflußdichte B und der angelegten Beschleunigungsspannung V ab (Formel 5.1).
m/z = 4,82 x 10-5 B2 r2 / V (Formel 5.1)
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 41
Bei einem bestimmten Wert der Magnetfelddichte oder der Beschleunigungsspannung entspricht
die Flugbahn des Ions der vorgegebenen Krümmung des Analysatorrohrs. Die Ionen, die durch
den Austrittsspalt gelangen, erzeugen am Ionenkollektor ein Signal, das mit Hilfe eines
Sekundärelektronenvervielfachers oder ähnlichem verstärkt wird. Da für diese Flugbahn jedem
bestimmten m/z-Verhältnis ein Wert von B bzw. V entspricht, kann durch Änderung eines
dieser beiden Werte der interessierende Bereich an m/z-Verhältnissen innerhalb geringer
Zeitspannen gescannt werden. In der Praxis gelingt es aber trotz Eintrittsspalt nicht, einen
Ionenstrahl nur in einer einzigen Richtung in das Magnetfeld einzuschießen. Daher spielt neben
der massendispergierenden Eigenschaft auch die richtungsfokussierende Wirkung des
Magnetfeldes eine wichtige Rolle. Ionen gleicher Masse, die mit unterschiedlicher Richtung in das
Magnetfeld gelangen, werden nach der Ablenkung wieder in einem Punkt vereinigt [149].
Wird zwischen der Beschleunigungsstrecke und dem magnetischen Sektor noch ein homogenes
elektrostatisches Feld angebracht, so ensteht ein sogenanntes doppelfokussierendes
Massenspektrometer, bei dem sowohl eine Richtungsfokussierung von Ionen gleichen m/z-
Verhältnissen als auch eine Energie-Fokussierung erfolgt.
5.2.2 Quadrupol-Massenspektrometer
Sie enthalten vier konzentrische oder elliptische, parallel zueinander angeordnete runde
Stabelektroden. An jedes Paar gegenüberliegender Elektroden legt man eine Gleichspannung mit
entgegengesetzter Polarität an den gegenüberliegenden Stabpaaren, die von einer hochfrequenten
Wechselspannung überlagert wird. Ein Ionenstrahl im Inneren des Stabsystems wird durch das
Hochfrequenzfeld zu Schwingungen angeregt, die massenabhängig sind. Die Ionen bewegen sich
auf spiralförmigen Bahnen. Nur für Ionen einer bestimmten Masse bleibt die
Schwingungsamplitude so klein, daß sie das System passieren und in den Auffänger gelangen
kann. Ionen, die leichter sind als das eingestellte m/z-Verhältnis stoßen mit den positiven Polen
und die, die schwerer sind, mit den negativen Polen zusammen und werden auf diese Weise
eliminiert. Durch Ändern der Werte für Gleich- und Wechselspannung kann ein m/z-Scan
durchfahren werden.
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 42
Abb. 5.1: Schematische Darstellung eines Quadrupol-Massenspektrometers [150]
5.2.3 Ion Trap-Massenspektrometer
Aufgrund der Tatsache, daß die vorliegende Arbeit zu einem großen Teil mit einem Ionenfallen-
Gerät gemacht wurde, wird in diesem Abschnitt genauer auf diese Art des massenselektiven
Detektors eingegangen.
Die in der Ionenquelle auf dem beschriebenen Wege erzeugten Kationen gelangen über drei
elektronische Linsen unterschiedlicher Spannung in den Massenanalysator, die sogenannte Ionen-
Falle („ion trap“). Sollen negative Ionen detektiert werden, so werden entsprechende positive
Spannungen angelegt.
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 43
Der Ion-Trap-Massenanalysator an sich besteht aus drei Elektroden aus Stahl, der
Eingangselektrode („entrance endcap electrode“), der Ringelektrode („ring electrode“) und der
Ausgangselektrode („exit endcap electrode“), die durch Siliziumnitrid-Spacer voneinander
getrennt und isoliert werden. Die Anordnung ist der Abbildung 5.3 zu entnehmen. Die
„endcap“-Elektroden besitzen in der Mitte jeweils ein kleines Loch, um den Ionen den Eintritt in
und den Austritt aus dem Ionen-Käfig zu ermöglichen.
An die Ringelektrode wird eine Wechselspannung mit konstanter Frequenz (ca. 1 MHz) und
variabler Amplitude (ca. 0 bis 8500 V) angelegt, welche ein dreidimensionales Quadrupolfeld
innerhalb der Ion Trap erzeugt. Dieses sich zeitlich ändernde Feld versetzt die Ionen in axiale
(entlang der „endcap“-Elektroden) und in radiale (entlang der Ringelektrode) Bewegung auf
stabilen, kreisähnlichen Bahnen.
Soll nun eine Massenanalyse vorgenommen werden, so wird das System durch Variation der
Ringspannungsamplitude in der Weise verändert, daß es zu einer Instabilität, die vom m/z-
Verhältnis abhängig ist, und dadurch zu einer Beschleunigung der Ionen durch das Loch in der
Ausgangselektrode auf die Konversionsdynode des Multipliers kommt. Die Spannung, bei der die
Kreisbahn eines Ion instabil wird und das geladene Teilchen aus der Kreisbahn und somit aus
dem Ionen-Käfig gerät, wird Resonanzspannung genannt.
Vom Prinzip her ist das Ion-Trap-Massenspektrometer ein Speicher-Massenspektrometer. Das ist
der grundlegende Unterschied zu Quadrupol-Massenspektrometern, die als Strahlgeräte
anzusehen sind und die vier Quadrupolstäbe als Massenfilter verwenden. Der große analytische
Vorteil liegt darin, daß Ionen innerhalb eines kurzen Entstehungszeitraums (wenige
Millisekunden) gesammelt werden können. Auf diese Weise kann ein Ionenstrom aus einer
Ionenquelle über die Sammlungszeit integriert und als „gebündeltes Paket“ auf den Multiplier
geschickt werden, was sich in höherer Empfindlichkeit und besserer Nachweisstärke
niederschlägt. Wie alle Speicher kann die Ion-Trap nur mit einer begrenzten Anzahl von Ionen,
die von der sich an die Speicherung anschließende Scanphase bestimmt wird, beladen werden.
Extreme Beladungssituationen führen zu „Raumladungseffekten“, die durch Abstoßung
gleichgeladener Ionen untereinander zustande kommen und Qualitätseinschränkungen bei der
Detektion bewirken. Für das verwendete Finnigan MAT GCQ liegt die maximal zu speichernde
Ionenzahl bei 108 Teilchen.
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 44
Effektives Arbeiten mit einem Ion-Trap-Massenspektrometer ist am besten möglich, wenn der
Ionen-Speicher maximal befüllt ist. Die korrekte Steuerung der Speicherphase wird über die
Öffnungszeiten der mittleren der Eingangslinsen („gate“, bis zu 25 ms) gesteuert. Für die
Zeitregelung, also die Bestimmung des Totalionenstroms TIC bzw. der Ionentransferzeit, ist ein
spezieller Scan-Abschnitt, der Pre-Scan, zuständig. Daran schließt sich der eigentliche Speicher-
bzw. Scanzyklus, der sogenannte analytische Scan an, bei dem das eigentliche Massenspektrum
aufgenommen wird. Die Einheit von Pre-Scan und analytischem Scan wird als Mikro-Scan
bezeichnet und bildet damit die kleinste zeitliche Funktionseinheit des Analysators.
Abb. 5.3: Querschnitt durch einen Ion-Trap-Analysator (Finnigan MAT) [150]
5.2.4 Vor- und Nachteile der GC-MS-Geräte bezogen auf den analytischenSachverhalt
Welches der oben genannten Ausführungen von Massenspektrometern das geeignetste ist, hängt
letztendlich immer vom eigentlichen analytischen Problem, das mit diesem gelöst werden soll, ab.
Um bei der Identifizierung einer Verbindung neben dem eigentlichen Full Scan-Spektrum noch
weitere Informationen zu erhalten, existieren verschiedene Möglichkeiten.
Zum einen können mit Hilfe eines hochauflösenden Massenspektrometers außerordentlich
genaue Aussagen über Substanzen gemacht werden.
5 Aufbau und Unterschiede von GC/MS-Geräten 45
Als Auflösungsvermögen A wird in der Massenspektrometrie die Fähigkeit eines Analysators
verstanden, eng benachbarte Massensignale (Ionen) nach ihrem m/z-Verhältnis zu trennen, also
als Quotient aus der Massenzahl m und der Differenz zu der gerade noch aufgelösten Massenzahl
Δm. Es gilt: A = m/Δm. Als aufgelöst werden zwei Signale bezeichnet, die sich in 10% oder
weniger ihrer Höhe überlappen. Für die meisten Geräte liegt die Auflösung bei 1.000 bis 2.000,
mit hochauflösenden doppelfokussierenden Sektorfeld-Analysatoren werden Werte von bis
150.000 erreicht. Bei letzteren ist es dadurch möglich, über ein entsprechendes
Massenchromatogramm eine sehr hohe Selektivität und damit Nachweisstärke auch bei hoher
Matrixbelastung zu erhalten. Jedoch sind die Anschaffungskosten für ein hochauflösendes
Massenspektrometer verglichen mit einem Benchtop-Gerät, wie es Quadrupol- und Ion Trap-
Analysatoren darstellen, ernom hoch. Ein weiterer Nachteil sind die geringen Scanraten bei
Verwendung dieser Massenfilter. Enthalten Chromatogramme sehr schmale Peaks, wie sie z.B.
bei der Verwendung von Wasserstoff als Trägergas respektive bei der Fast Chromatographie
auftreten, so müssen hohe Scanraten gewährleistet sein, da sonst möglicherweise keine korrekte
Bestimmung dieser Komponenten erreicht wird.
Eine weitere Möglichkeit, niedrige Konzentrationen auch mit hoher Matrixbelastung detektieren
und quantifizieren zu können, birgt die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Hierbei wird in
einem ersten Schritt ein bestimmtes Ion mit möglichst hoher Intensität und Masse entweder in
der Ion Trap als einziges gesammelt oder in einem ersten Quadrupol herausgefiltert. In dem
zweiten Schritt wird dieses Ion nun zu weiterem Zerfall angeregt und liefert dadurch wieder
spektrale Information, sprich über den strukturellen Aufbau dieses Fragmentes.
Während ein Ion Trap-Massenspektrometer aufgrund seiner Geometrie dies ohne weiteres kann,
muß bei einem Quadrupol-Gerät ein weiterer Filter hinzugefügt werden, was diese Konstellation
wieder teurer macht.
Als Nachteil gegenüber dem Quadrupol ist bei der Betrachtung der Ionenfalle zu erwähnen, daß
es im Bereich der jeweiligen Nachweisgrenze wegen gerätebaulicher Grenzen zu einer höheren
Standardabweichung kommt, was dazu führt, daß mit einer Ionenfalle nicht die Nachweisgrenzen
eines MS/MS-fähigen Quadrupol-Massenspektrometers erreicht werden kann.
Somit erfüllt das Ion Trap-Massenspektrometer die Kriterien, um die zu untersuchenden
Pharmazeutika und deren Metabolite in der hochbelasteten Matrix (Klinik-)Abwässer in
geringsten Konzentrationen detektieren, indentifizieren und quantifizieren zu können.
6 Probenvorbereitung 46
6 Probenvorbereitung
6.1 Verwendete Apparaturen
Die Schritte der Probenaufbereitung können durch Verwendung verschiedener Apparaturen
erheblich erleichert und reproduzierbarer gemacht werden:
Für die Flüssig/Flüssig-Extraktion der Blut- und Urinproben wurde ein Vortex Genie 2-Mixer
der Firma Bender & Hobein als Schüttelapparatur verwendet. Es handelt sich hierbei um eine
Apparatur zum Schütteln von bis zu 60 2mL-Safe-Lock-Vials mit stufenloser
Schüttelfrequenzregulierung. Hierdurch ist eine stets gleichmäßige, gut reproduzierbare
Extraktion der Proben möglich, was beim Vergleich der Kalibriergeraden mit und ohne
Verwendung dieser Apparatur deutlich wird.
Zur besseren Trennung der Phasen wurde die Microzentrifuge MC-13 der Firma Millipore
eingesetzt. Hierbei werden die maximal 24 Probenfläschchen á 2mL auf bis zu 13.000
Umdrehungen pro Minute beschleunigt.
Um nach der Extraktion und nach der Derivatisierung das Lösungsmittel bei mehr als einer
Probe entfernen zu können, wird mittels einer selbstgebauten Gasbrücke als
Evaporisiervorrichtung (Abb. 6-1) ein Inertgasstrom über bis zu zehn Fläschchen geleitet.
6 Probenvorbereitung 47
I n e r t g a s
P r o b e
Abb. 6.1: Evaporisiervorrichtung (Eigenbau)
6.2 Anreicherung mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion
6.2.1 Prinzip der Flüssig/Flüssig-Extraktion
Unter dieser Bezeichnung wird ein Verfahren der Extraktion verstanden, bei dem eine gelöste
Substanz aus ihrem Lösungsmittel durch ein anderes, mit dem ersten nur geringfügig mischbares
flüssiges Extraktionsmittel (kalt oder heiß) extrahiert wird, wobei die Verteilung zwischen den
Phasen dem Nernstschen Verteilungssatz entspricht. Der vom Extraktionsmittel zu isolierende
Stoff wird Extrakt, die nach Extraktion verbleibende Phase Raffinat genannt. Flüssig/Flüssig-
Übergänge zwischen Analyten und den störenden Begleitsubstanzen liegen den klassischen
Flüssig/Flüssig-Verteilungen zugrunde. Sie lassen sich sowohl im Schütteltrichter oder
Probenfläschchen als auch in Säulen an verschiedenen Sorbentien (beispielsweise Florisil®), die
mit Wasser beladen werden, durchführen.
6 Probenvorbereitung 48
Eine weitere, sehr schonende und effiziente Möglichkeit, um Verbindungen auf diesem
prinzipiellen Wege zu extrahieren, bilden die sogenannten Perforatoren. Hierbei wird bei
ständiger Extraktionsmittelrückführung in einem Kolben durch einen Rückflußkühler das
Lösungsmittel in Form feinster Tröpfchen in der wäßrigen Phase verteilt, wobei sich die
extrahierbaren organischen Bestandteile darin lösen. In der Chemie versteht man unter
Verteilung die Einstellung eines chemischen Gleichgewichts (Verteilungsgleichgewicht)
unterschiedlicher Konzentrationen eines Stoffes in zwei aneinander grenzenden Phasen. Im Fallle
der Flüssig/Flüssig-Extraktion handelt es sich hierbei um zwei nicht miteinander mischbare
Flüssigkeiten mit möglichst stark voneinander unterschiedlichen Löslichkeiten für diese
Verbindung. Es stellt sich das Verhältnis der Stoffaktivitäten in den beiden Phasen nach dem
Nernstschen Verteilungssatz ein, dieses Verhältnis wird durch den Verteilungskoeffizienten
beschrieben. Durch einige Tricks kann dieses Verhältnis zum einen durch Einsatz sogenannter
Phasen-Transfer-Salze, die bewirken, daß die Substanz in die für sie unnatürliche Phase zu
wandert, oder zum anderen durch geeignete Auswahl des Extraktionslösungsmittels beeinflußt
werden.
Die Charakterisierung eines Lösungsmittels bezüglich der Extraktionseigenschaften kann mittels
der Polarität und der Selektivität beschrieben werden. Während der Polaritätsparameter P‘ ein
Maß für die Stärke des Lösungsmittel ist, sagt die Selektivität etwas darüber aus, wie sich die
polaren Wechselwirkungseingeschaften aus den Protonenakzeptor-, Protonendonator- und
Dipolparametern zusammensetzen. [151] ist die Eluotrope Reihe der gängigsten Lösungsmittel
mit diesbezüglichen Eigenschaften zu entnehmen.
6.2.2 Optimierung der Extraktionsparameter
6.2.2.1 Verwendete Extraktionsmittel
Um die Extraktionseigenschaften der Lösungsmittel untersuchen zu können, wurden folgende
organische Lösungsmittel oder Gemische organischer Lösungsmittel verwendet:
6 Probenvorbereitung 49
Tab. 6.1: Eluotrope Reihe der verwendeten Lösungsmittel [151]
mit P‘: Polaritätsparameter, Xe: Protonenakzeptorparameter,
Xd: Protonendonatorparameter, Xn: Dipolparameter
Lösungsmittel P‘ xe xd xn
Hexan 0,1 / / /
Tetrachlor-kohlenstoff
1,6 / / /
Toluol 2,4 0,25 0,28 0,47
Diethylether 2,8 0,53 0,13 0,34
Dichlormethan 3,1 0,29 0,18 0,53
Chloroform 4,1 0,25 0,41 0,33
Ethylacetat 4,4 0,34 0,23 0,43
2-Butanon(MEK)
4,7 0,35 0,22 0,43
4:1-GemischDiethylether/iso-Propanol
2,83,9
0,530,55
0,130,19
0,340,27
Die jeweiligen Parameter geben an, zu welchem Teil die polaren Wechselwirkungen aus den
entsprechenden Eigenschaften bestehen. Die Summe ergibt stets 1.
6.2.2.2 pH-Wert
Ob ein Analyt-Molekül neutral oder geladen als Kation oder Anion in der Probenlösung vorliegt,
ist von grundlegender Bedeutung. Deswegen erschien es ratsam, den Einfluß des pH-Wertes auf
die Flüssig/Flüssig-Extraktion zu untersuchen. So wurden die Probenlösungen bei den
Anreicherungsversuchen in diesem Bereich auf ganzzahlige pH-Werte eingestellt. Als
Puffersystem wurden Kaliumdihydrogenphosphat respektive di-Kaliumhydrogenphosphat und
Phosphorsäure oder Kalilauge benutzt. Die Probenlösungen wurden je nach pH-Wert mit einem
der beiden Kaliumsalze bis zu einer Konzentration von 0,01M versetzt und schließlich mit den
Lösungen auf den entsprechenden Wert eingestellt.
6 Probenvorbereitung 50
→ pH 2,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M Phosphorsäure auf pH 2,0 ± 0,1
→ pH 3,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M Phosphorsäure auf pH 3,0 ± 0,1
→ pH 4,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M Phosphorsäure auf pH 4,0 ± 0,1
→ pH 5,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M KOH-Lösung auf pH 5,0 ± 0,1
→ pH 6,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M KOH-Lösung auf pH 6,0 ± 0,1
→ pH 7,0: 0,01M K2HPO4
Einstellung mit 0,3 M Phosphorsäure auf pH 7,0 ± 0,1
→ pH 8,0: 0,01M KH2PO4
Einstellung mit 0,3 M KOH-Lösung auf pH 8,0 ± 0,1
6.2.2.3 Sonstige Parameter
Weitere Möglichkeiten, um die Extraktion der Verbindungen zu verbessern, können zum einen
darin bestehen, die wäßrige Phase durch Zusatz von Salzen polarer zu machen und dadurch das
Verteilungsgleichgewicht der größtenteils unpolareren Substanzen auf die Seite des organischen
Lösungsmittels zu verschieben. Zum anderen dem Verlust an Substanz bei leichter flüchtigen
Metaboliten zu verhindern, indem die vereinigten organischen Phasen nur bis auf einen geringen
Flüssigkeitsrückstand reduziert werden.
6 Probenvorbereitung 51
6.2.3 Ergebnisse und Diskussion
6.2.3.1 Getestete Lösungsmittel
Als Extraktionsmittel wurden die aufgeführten organischen Lösungsmittel unterschiedlicher
Polarität auf ihre Fähigkeit hin untersucht, der wäßrigen Phase die in dieser Arbeit untersuchten
Verbindungen zu entziehen. Für die Untersuchungen wurden 500µL wäßrige Probe
(Oberflächenwasser, pH-Wert 5,5) in einem 2mL-Vial vorgelegt und die dreimalige Extraktion
mit derselben Menge an organischem Lösungsmittel durchgeführt. Die Dauer des Schüttelns
mittels eines Vortex-Mixers wurde nach einer früheren Arbeit des Autors mit 60 Sekunden für
die beiden Ausgangsverbindungen ausreichend gewählt [152]. Wie sich zeigte, war diese Zeit auch
für die Stoffwechselprodukte ausreichend.
Um die Ergebnisse miteinander vergleichbar zu machen, wurde im Anschluß an die Extraktion
das vierfach deuterierte d4-Cyclophosphamid in Ethylacetat in gleichen Mengen hinzugegeben.
Zur Auswertung wurden die Flächen der Verbindungen mit denen des Standards in Relation
gesetzt und als Maß für die Extraktionsfähigkeit der Lösungsmittel verwendet. Für
Cyclophosphamid und Ifosfamid wurden diese Extraktionsversuche schon in einer früheren
Arbeit des Autors gemacht [152]. Die Ergebnisse für die Metaboliten sind der Tabelle 6.2 zu
entnehmen (NB = Nicht bestimmbar).
Für den Metaboliten Cyclophosphamid Mustard (CPM) mußten separate Untersuchungen
gemacht werden, da sich diese Verbindung je nach Extraktionsbedingungen teilweise oder
vollständig weiter in das eigentlich zytotoxische Bis(2-Chloroethyl)amin oder in der Literatur Nor
Nitrogen Mustard (NNM) genannte Stoffwechselendprodukt abbaut. Dies stellt ein Problem dar,
weil sich andere Verbindungen dieses Metabolismus wie auch der verwendete Standard d4-
Cyclophosphamid teilweise in diese Substanz umsetzt[45, 126]. Dies erforderte eine getrennte
Betrachtung. Deswegen werden im weiteren Verlauf dieser Arbeit CP, KCP, CCP, IF, KIF, CIF
und IPM als Gruppe 1, CPM separat als Gruppe 2 bezeichnet und untersucht. Die
Vorgehensweise der Flüssig/Flüssig-Extraktion bei CPM war die gleiche wie bei Gruppe 1 bis
auf die Tatsache, daß der Standard durch das dem CPM strukturverwandte IPM ersetzt wurde.
Tabelle 6.3 stellt die Ergebnisse dar. Zur weiteren Optimierung mußte die pH-Wert-Abhängigkeit
der Extraktion experimentell bestimmt werden.
6 Probenvorbereitung 52
Tab. 6.2: Ergebnisse der Untersuchung der Extraktionsfähigkeit verschiedener Lösungsmittel und
Lösungmittelgemische bezüglich KCP, CCP, KIF, CIF, IPM,OXAZ und CEA bei pH 5,5
Extraktions-mittel
Hexan CCl4 Toluol Et2O CH2Cl2 EtOAc MEK Et2O/iso-Pr
Substanz
KCP NB 2 3 8 47 91 123 35
CCP NB NB NB NB NB 1 2 1
KIF NB 5 28 30 51 85 108 95
CIF NB NB NB NB NB NB NB NB
IPM NB 1 NB NB NB 2 6 4
OXAZ NB NB NB NB NB NB NB NB
CEA NB NB NB NB NB NB NB NB
Bei dem gewählten pH-Wert von 5,5 konnte CPM oder NNM nur bei der Verwendung von
Ethylacetat als Lösungsmittel nachgewiesen werden.
Tab. 6.3: Ergebnisse der Untersuchung der Extraktionsfähigkeit verschiedener Lösungsmittel und
Lösungmittelgemische bezüglich CPM bei pH 5,5
Extraktions-mittel
Hexan CCl4 Toluol Et2O CH2Cl2 EtOAc MEK Et2O/iso-Pr
Substanz
CPM NB NB NB NB NB 20 NB NB
6.2.3.2 pH-Wert
Während die anderen Metaboliten bei der Flüssig/Flüssig-Extraktion abgesehen von pH-Werten
unter 3 und über 7 nur wenig Veränderung in der Wiederfindungsrate, die über die Fläche im
Chromatogramm abgeschätzt wurde, zeigten, erwies sich diese Untersuchung beim CPM als
äußerst wichtig.
6 Probenvorbereitung 53
Nur bei pH-Werten ≤ 4 konnte das Abbauprodukt NNM nachgewiesen werden,
unmetabolisertes CPM hingegen bei keiner der gemachten Versuche, was sich mit den
Ergebnissen in der Literatur bezüglich der Bestimmung in physiologischen Matrices deckt [45]
Die geringe eingesetzte Menge an Probenvorlage und Extraktionsmittelvolumen ermöglichte nur
relativ geringe Anreicherungsfaktoren und somit auch eine hohe Nachweisgrenze für die
entsprechenden Verbindungen. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurden jeweils 500µL
Probe dreimal mit der gleichen Menge an Ethylacetat versehen und eine Minute lang mit einem
Vortex-Mixer geschüttelt. Die Injektionslösung hatte abschließend ein Volumen von 150µL. In
Tabelle 6.4 sind die Nachweisgrenzen, wenn es möglich war, sie zu bestimmen, aufgeführt.
Tab. 6.4: Mit Flüssig/Flüssig-Extraktion erreichbare Nachweisgrenzen (in µg/L) aus Oberflächenwasser
Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM OXAZ CEA
BG(S/N 10)
1 100 200 NB 10 50 NB 500 NB NB
NWG(S/N 3)
0,5 50 100 NB 1 10 NB 100 NB NB
6.2.2.4 Sonstige Parameter
Ein weiterer Parameter ist von außerordentlicher Bedeutung für das Erreichen einer möglichst
hohen Wiederfindungsrate. Nach der Extraktion werden die vereinigten Extraktionsmittelphasen
mit Hilfe eines Inertgasstroms eingeengt. Bei Gruppe 1 ist für das Erreichen einer hohen
Wiederfindungsrate, einer geringen Standardabweichung und verläßlichen Kalibrierung
unabdingbar, daß das Lösungsmittel nach der Extraktion vollständig bis zur Trockne entfernt
wird, während es auf der anderen Seite bei CPM bei gleicher Vorgehensweise zu einem starken
Verlust an Nachweisempfindlichkeit kommt. Um dies zu verhindern, ist es zwingend notwendig,
den Extrakt nur bis zu einem Rückstand von ungefähr 20µL zu reduzieren. Ein Vergleich der
beiden Vorgehensweisen zeigte, daß sich die Nachweisempfindlichkeit bei Gruppe 2 um nahezu
eine Zehnerpotenz verbessert (Tab. 6.5).
Eine weitere, aber geringere Verbesserung für Gruppe 2 brachte das zusätzliche Versetzen der
wäßrigen Phase mit einem wasserlöslichen Salz, um die Probe noch polarer zu machen und somit
die hydrophoben Analyten auszusalzen (Tab. 6.5).
6 Probenvorbereitung 54
Für diesen beiden Optimierungen wurde KIF als Standard dem Extrakt hingefügt.
Tab. 6.5: Ergebnisse der sonstigen CPM-Optimierungen verdeutlicht am Flächenverhältnis
Analyt/Standard (KIF)
Optimierung
MessungAussalzen derKomponenten
Zurückbehalten einesRückstandes
1 1,08 16,88
2 1,25 14,81
3 1,95 18,26
Standardabweichung 32,2 10,4
Zur Erreichung höherer Anreicherungsfaktoren müßten bei Beibehaltung des
Phasenverhältnisses enorme Mengen an teilweise giftigen und umweltschädigenden
Lösungsmitteln eingesetzt werden, was einer der Zielsetzungen dieser Arbeit, nämlich eine
möglichst wenig umweltbelastende Methode zur Bestimmung dieser Substanzen zu entwickeln,
widerspräche.
Bei einer erwarteten Konzentration von Cyclophosphamid im Oberflächenwasser von 1ng/L
wäre es notwendig, mit einer Probenvorlage und einem Extraktionsmittelvolumen von einem
halben Liter zu arbeiten. Die vereinigten organischen Phasen hätten dann einen Umfang von 1,5
Liter, die bis zur Trockne eingedampft werden müßten.
Auch die Tatsache, daß die Metaboliten mit vergleichsweise geringem Molekulargewicht –
CPM/NNM, OXAZ und CEA – mit dieser Extraktionsmethode nicht in bestimmbaren Mengen
der Matrix entzogen werden konnten, spricht gegen die Verwendung der Flüssig/Flüssig-
Extraktion.
6 Probenvorbereitung 55
6.3 Anreicherung mittels Festphasen-Extraktion
6.3.1 Prinzip der Festphasen-Extraktion
In den letzten Jahren haben die Adsorptionsverfahren für die Isolierung und Reinigung
verschiedenster Verbindungen in der Analytik stark an Bedeutung gewonnen. So werden
zunehmend die Flüssig/Flüssig- von den Flüssig/Fest-Verteilungen in Form der Festphasen-
Extraktion abgelöst.
Die Festphasen-Extraktion ist ein physikalischer Extraktionprozeß, der zwischen einer flüssigen
und einer festen Phase stattfindet. Bei der Aufgabe des wäßrigen Probevolumens haben die
Komponenten im zu erreichenden Idealfall eine höhere Affinität zur festen Phase, bei der im
Abschluß erfolgenden Elution mit einem organischen Lösungsmittel eine höhere Affinität zu
eben diesem.
Die Schritte der Probenvorbereitung sind der Abbildung 6.2 zu entnehmen.
Durch Modifizierung der stationären Phase kann eine äußerst selektive Extraktion der Analyten
aus der Matrix ermöglicht werden. Ihre Basis besteht zumeist aus einem speziellen Polymer oder
aus einem Silicagerüst, dessen endständige funktionelle Gruppen durch die Reaktion von
Organosilanen mit dem aktivierten Silica gebildet werden und somit eine stationäre Phase mit
anderen Eigenschaften erzeugt wird. Häufig verwendete Phasen werden im folgenden aufgeführt:
→ Normal- und Umkehr-Phasen unpolar: Methyl, Octyl, Octadecyl und Phenyl
polar: Diol, Cyanopropyl, Silicagel, u.a.
→ Ionenaustausch-Phasen Kationisch: Diethylaminopropyl, Trimethylaminopropyl
Anionisch: Propylsulfonsäure, Carboxymethyl, u.a.
→ Gelpermeationssorbentien
→ Wide-Bore-Sorbentien
6 Probenvorbereitung 56
Abb. 6.2: Schritte der Probenvorbereitung mittels Festphasen-Extraktion [82]
Die Trennung der Analyten von der Matrix erfolgt nach flüssigchromatographischen Prinzipien:
Es findet der Einsatz eines Lösungsmittelgradienten und der gleichen festen Phasen statt.
In der neueren Literatur erfolgt die Probenvorbereitung in der Zytostatikaanalytik aus
biologischen und Umweltproben zunehmend mittels Festphasenextraktion [153-159].
I II III IV V
Fritten
Sorbens
Konditio-nierungs-mittel
Proben-lösung
Inertgas Elutionsmittel
Wasch-lösung
Inter-ferenzen
Inter-ferenzen
Analyten
6 Probenvorbereitung 57
Die wichtigsten Vorteile gegenüber der Flüssig/Flüssig Extraktion sind:
→ Erzielung höherer Wiederfindungsraten durch vielfache Verteilung
→ Erzielung von höheren Anreichungsfaktoren, somit niedrigerer Nachweisgrenzen
→ Verringerung der Matrixbelastung durch Einsatz spezifischer stationärer Phasen
→ Einfache und schnelle Handhabung
→ Geringere Lösungsmittelmenge und dadurch Umweltbelastung
→ Möglichkeit der Automatisierung
Die für die Festphasen-Extraktion verwendeten Materialien liegen in Säulen unterschiedlichen
Volumens oder in sogenannten Disks vor. Für die Bestimmung von Substanzen aus stark
matrixbelasteten Umweltproben eignen sich diese scheibenartigen Kartuschen der Möglichkeit
hoher möglicher Durchflußraten bei großen, stark partikelbelasteten Volumina und sind deshalb
für die Untersuchung der Oberflächen- und Abwasserproben in dieser Arbeit verwendet worden.
Weitergehende Erläuterungen zu dieser Art der Extraktion sind in der Literatur zu finden
[149,160].
Die Durchführung der Anreicherung wurde mit Hilfe eines kommerziellen Gerätes (Separex 47,
spe-12G, Baker) durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine Vorrichtung, mit der bis zu 12
Proben gleichzeitig angereichert werden können. Der zum Durchsaugen des Probenvolumens
notwendige Unterdruck wird mittels einer Wasserstrahl- oder Membranpumpe erzeugt und von
einem Manometer kontrolliert. Um das wiederholte Auffüllen der Extraktionsscheiben mit der
Hand und ein Trockenlaufen der Festphase zu verhindern, wurden käuflich erhältliche
Adaptoren der Fa. Baker verwendet. Der Aufbau der verwendeten Apparatur ist in der
Abbildung 6.6 zu sehen.
6 Probenvorbereitung 58
Proben-reservoir
Wasser-strahl-pumpe
AdaptorenExtraktions-scheibe
Manometer
Abb. 6.6: Für die Festphasen-Extraktion verwendete Apparatur der Fa. J.T. Baker (Separex 47, spe-12G)
6.3.2 Optimierung der Extraktionsparameter
6.3.2.1 Getestete Festphasenmaterialien
Für eine der beiden Ausgangssubstanzen – Cyclophosphamid – sind in der Dissertationsschrift
von Kiffmeyer, deren Arbeiten hier teilweise aufgegriffen werden, sowie in der Literatur optimale
Materialien für eine möglichst effektive Festphasen-Extraktion bestimmt worden [82,133].
Hierbei handelt es sich in beiden Fällen um ein Material auf Polysiloxan-Basis, deren endständige
Gruppen mit C18-Ketten inaktiviert sind.
6 Probenvorbereitung 59
Tab. 6.6: Eigenschaften der getesteten Festphasensäulen
Sorbens EndständigeGruppen
Wechsel-wirkung
Sorbens-menge[mg]
Durch-messer[mm]
Volu-men[mL]
Handels-name
Anbieter
Modifiz.Silicagel C18
endcappedunpolar 500 12 3 BakerBond Baker
C18 unpolar 500 47 25 C18Speedisk
Baker
C18Restsilanol-gruppen
unpolar/polar 500 47 25 C18 Polar Plus
SpeediskBaker
Co-polymer
Divinylbenzol unpolar 500 47 25 DVB Speedisk Baker
500 47 25 PAH aquaSpeedisk
Baker
6.3.2.2 Konditionierung und Equilibrierung
Für eine Wechselwirkung zwischen Analyt und den funktionellen Gruppen der Festphase vor
allem auf Silica-Basis und somit eine vollständige Anreicherung der Analyten ist es unabdingbar,
die Ankergruppen zu benetzen und aufzurichten. Dies erfolgt durch Gabe eines entsprechenden
organischen Lösungsmittels. In der Regel wurde das mit Methanol, Acetonitril und Ethylacetat
sowie Hexan getestet.
6.3.2.3 Probenaufgabe
Wegen der teilweise äußerst starken Partikelbelastung der beprobten Oberflächengewässer,
Kläranlagenzu- und -abläufe sowie der Klinikabwässer dient eine vor der eigentlichen
Probenaufgabe vorgenommene Filtration einer ersten Abtrennung störender Matrixbestandteile.
Ein weiterer Optimierungsparameter ist die Durchflußgeschwindigkeit. Laut Herstellerangaben
ist es möglich, diese SPE-Disks mit einer Geschwindigkeit von 80mL/min zu betreiben. Zwei
Punkte sind dabei zu beachten.
6 Probenvorbereitung 60
Sie sollte möglichst hoch sein, um eine kurze Gesamtanalysenzeit zu gewährleisten, jedoch sollte
sie auch nicht zu schnell gewählt werden, da eine mangelhafte Gleichgewichtseinstellung zu einer
starken Verschlechterung der Wiederfindungsrate führt.
Die wichtigste Variable bei der Probenaufgabe ist der pH-Wert der Pobenlösung. Nicht nur bei
der Verwendung von Ionenaustauschern als Festphasen hat er großen Einfluß auf die Effizienz
der Extraktion. Bei den letztgenannten ist es notwendig, daß die Analyten in kationischer oder
anionischer Form vorliegen, damit ein entsprechender Austausch stattfinden kann. Aber auch bei
den hier verwendeten Festphasen auf Silica-Basis beeinflußt der pH-Wert die Anreicherung sehr
stark. So sollten die zu extrahierenden Verbindungen als Neutralteilchen vorliegen. Als Ionen
hätten sie bei diesen eine um ein Vielfaches erhöhte Affinität zur wäßrigen Phase und könnten so
nur schlecht bis gar nicht extrahiert werden. Der Hersteller der SPE-Materialien gibt die pH-
Stabilität mit 2 bis 8 an. Die Lösungen wurden mit Hilfe der unter 6.1.3.2 aufgeführten
Puffersysteme auf die jeweiligen pH-Werte eingestellt.
6.3.2.4 Waschschritt
Zwischen der Aufgabe der Probe auf das Material und dessen Trocknung wird in der Literatur
häufig ein weiterer Schritt eingeführt. Hierbei können durch geeignete Wahl eines weiteren
Lösungsmittels störende Matrixbestandteile von der Festphase eluiert werden ohne Koelution der
Analyten. Des weiteren können in den Rückständen, die sich nach Beendigung der Aufgabe auf
der oberen Fritte angesammelt haben, Reste von Analyten eingeschlossen sein, die durch einen
Waschschritt herausgelöst werden können. Es wurden jeweils 25mL von einigen organischen
Lösungsmitteln und wäßrigen Lösungen verschiedener pH-Werte getestet.
6.3.2.5 Trocknung der Extraktionsscheiben
Das Trocknen der Festphasenmaterialien mittels eines Inertgasstromes dient in erster Linie dem
Entfernen der Proben- bzw. Waschlösung aus dem Sorbensbett. Da es im folgenden Schritt – der
Elution – erneut zu einem Wechsel des das Sorbens umgebenden Lösungsmittel kommt, ist es
wichtig, möglichst quantitativ die wäßrigen Reste aus der Festphase zu entfernen. Die in ihnen
enthaltenen Matrixbestandteile können die weitere Analytik stören. Eine Verschlechterung der
Bestimmungsgrenzen wäre die Folge.
6 Probenvorbereitung 61
Da im Anschluß an die Extraktion eine Derivatisierung unter anderem mit einem Säureanhydrid
erfolgt, kommt es durch das Auftreten von Wasserspuren zu einem Verlust an
Derivatisierungsmittel. Auf der anderen Seite kann eine zu lang gewählte Trocknungszeit oder ein
zu starker Gasstrom zu geringeren Wiederfindungsraten führen. Besonders bei leichtflüchtigen
Verbindungen ist dies der Fall. Es wurden Dauer und Intensität des Gasstromes variiert.
6.3.2.6 Elution der Analyten
Durch geeignete Wahl des Elutionslösungsmittels oder eines Lösungsmittelgemisches kann
wiederum eine hohe Selektivität erreicht werden. Ziel ist es, vollständig und ausschließlich die
Analyten vom Sorbensbett zu lösen, während Interferenzen dort verbleiben, was in der Praxis
nur schwer zu erreichen ist. Das am häufigsten verwendete Elutionsmittel ist Methanol, aber
auch weitere organische Lösungsmittel wurden in unterschiedlichen Mengen auf ihre
Elutionseigenschaften hin untersucht.
Von weiterem Interesse war die Frage, ob die Art der Elution eine Rolle spielt. Hierfür wurde die
Elution vergleichsweise einmal mit einer einmaligen Gabe einer bestimmten Menge an
Lösungsmittel und dann mit der gleichen Menge in Portionen mit zwischenzeitlichem
Trockenziehen des Sorbensbettes durchgeführt. Des weiteren wurde das Gesamtvolumen des
Elutionsmittels und dessen Einwirkzeit untersucht.
6.3.2.7 Einengen des Eluats
Zur weiteren Erhöhung der Anreicherungsfaktoren sowie zum endgültigen Entfernen der
Wasserspuren kann mit Hilfe eines Inertgasstroms das Eluat weiter eingeengt werden. Für die
Ermittlung der optimalen Bedingungen wurden die Art des Gases, die Temperatur des Eluats
und die Menge des verbleibenden Rückstandes variiert.
6 Probenvorbereitung 62
6.3.3 Ergebnisse und Diskussion
6.3.3.1 Geeignete Festphasensorbentien
Um die prinzipielle Eignung einer Festphase bezogen auf das analytische Problem zu testen,
wurden 500mL Oberflächenwasser mit jeweils 100µg/L einer jeden Verbindung dotiert und aus
dieser Matrix extrahiert. Da es sich um relative Messungen handelte, wird in der folgenden
Tabelle 6.7 die Festphase mit der jeweilig höchsten Wiederfindungsrate, also dem höchsten
Verhältnis der Fläche des Analyten zu der des internen Standards im Chromatogramm, mit einem
„++“ versehen. Ist die Festphase bedingt geeignet, die Verbindung kann also extrahiert werden,
jedoch mit einer schlechteren Wiederfindungsrate, so steht in der Tabelle ein „+“. Für
Festphasen mit einer Wiederfindungsrate von ≤ 30% ist ein „–“ zu finden. Daraus resultiert, daß
sich die Scheiben mit den DVB- und den PAH aqua-Materialien aufgrund mangelnder
Wiederfindung nicht für die Extraktion der Verbindungen eignen. Weiter ist festzuhalten, daß die
beiden Ifosfamid-Metaboliten 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin auch mit diesen
Festphasen nicht in ausreichendem Maße bestimmt werden konnten. Die beiden Phasen mit C18-
modifiziertem Silicagel hingegen sind für alle restlichen Substanzen in einem ausreichenden Maße
in der Lage, sie aus der wäßrigen Probe zu extrahieren. Bei der Extraktion von Cyclophosphamid
Mustard ist eine leichte Verbesserung bei der Bestimmung mit der Polar Plus-Phase, die neben
den C18-Ketten noch Restsilanolgruppen besitzt, festzustellen.
Tab. 6.7: Ergebnisse der Eignungsprüfung einiger Festphasenmaterialien
Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM OXAZ CEA
Festphase
C18Speedisk
++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ - -
C18 PolarPlusSpeedisk
+ + + ++ + + + + - -
DVBSpeedisk + + - - + + - - - -
PAH aquaSpeedisk + + - - + + - - - -
6 Probenvorbereitung 63
6.3.3.2 Konditionierung und Equilibrierung
Beim Vergleich verschiedener organischer Lösungsmittel zeigten sich keinerlei Unterschiede
bezüglich ihrer Fähigkeit, das Sorbensbett auf die anschließende Probeaufgabe vorzubereiten.
Im weiteren Verlauf der Analysen wurde Methanol verwendet. Die Menge an organischem
Lösungsmittel belief sich stets auf 25mL, die ohne Anlegen eines Vakuums mit einer
Geschwindigkeit von ungefähr 5mL/min durch die Festphase lief. Um eine vollständige
Gleichgewichtseinstellung wirklich gewährleisten zu können, wurde der Fluß bei einem noch
gerade sichtbaren Flüssigkeitsspiegel oberhalb der Fritte gestoppt und das Methanol weitere 2
Minuten auf das Sorbensbett einwirken gelassen. Für die Phasen auf (Co-)Polymer-Basis ist dies
nicht notwendig, da sie nicht über Gruppen verfügen, die konditioniert werden müssen.Nach
dieser Equilibrierung wurden zur Umstellung auf die eigentliche wäßrige Matrix 25mL
bidestilliertes Wasser gegeben und bei Normaldruck durch das Material fließen gelassen. Auch
hier wurde das Wasser abschließend 2 Minuten in der Phase stehen gelassen.
Ziel war es, daß keine möglicherweise noch vorhandenen Reste der organischen Lösungsmittel
Teile der zu untersuchenden Substanzen mit herauslösen bzw. die Wechselwirkung derer mit
dem Sorbensmaterial verhindern. Da eine Probenaufgabe von nicht mehr als 1 Liter Volumen
vorgesehen und keine Verschlechterung der Wiederfindungsrate zu bemerken war, schien es
nicht angezeigt, durch Zusatz von organischen Lösungsmitteln eine in-situ-Equilibrierung
während der Extraktion vorzunehmen.
6.3.3.3 Probenaufgabe
Bei den Abwasser-Proben zeigte sich, daß die normalen säulenartigen Festphasen-Kartuschen
trotz einer vorgeschalteten Filtration sehr schnell verstopfen, was zu langen Verzögerungen
durch einen stark erhöhten Strömungswiderstand führt. Bei den im weiteren Verlauf
verwendeten Disks war eine Filtration trotz vergleichbaren Adsorptionsvermögens aufgrund der
größeren Oberfläche nicht notwendig. Dies ermöglicht eine Verringerung des
Strömungswiderstandes und somit einer wesentlichen Erhöhung der Flußgeschwindigkeit.
Zudem wurde die Probe, sofern es möglich war, erst aufgegeben, nachdem sich die
Schwebeteilchen in der Probe abgesetzt hatten, so daß diese festen Bestandteile erst zum
Abschluß auf die obere Fritte der scheibenförmigen Kartusche gelangten und somit die
Geschwindgkeit der Aufgabe erst zum Ende verringert wurde.
6 Probenvorbereitung 64
Die Ermittlung der optimalen pH-Werte der Probenlösungen war von außerordentlicher
Wichtigkeit. Es zeigten sich starke Unterschiede in der Wiederfindungsrate und im
Mitextrahieren störender Interferenzen. Um die unterschiedlichen Werte miteinander
vergleichbar zu machen, wurde dem Eluat jeweils nach der Extraktion einen Standard
hinzugegeben und das Flächenverhältnis im Chromatogramm bestimmt. Die Abbildungen 6.7 bis
6.15 zeigen im einzelnen und Tabelle 6.8 in einer Zusammenstellung der Abhängigkeit der
Wiederfindungsraten von den pH-Werten der Probenvorlagen. Anhand dieser Aufstellung ist
ersichtlich, daß es eine große Gruppe gibt, die bei einem pH-Wert von 4 ein Maximum an
Extraktionseffizienz duchläuft. Die beiden Mustard-Verbindungen bilden jedoch Ausnahmen. So
werden für das Cyclophosphamid Mustard bei pH 7, für das Ifosfamid-Analogon bei pH 2 die
besten Wiederfindungsraten gefunden. Da es sich bei diesen Verbindungen um Strukturisomere
und Phosphorsäure-Derivate handelt, werfen diese Ergebnisse zunächst Fragen auf. Für die
Extraktion mit C18-Material müssen die Komponenten als neutrale Moleküle vorliegen. Hierfür
müssen bei der Extraktion einer Säure hohe Hydronium-Ionen-Konzentrationen herrschen, was
den niedrigen pH-Wert für IPM erklärt. Jedoch konnte durch Wägen der Kartuschen vor und
nach der Extraktion festgestellt werden, daß die Materialien bei einem solchen pH-Wert zerstört
werden [82]. Diese Erkenntnis wurde zum Anlaß genommen, auch das Ifosfamid Mustard bei
einem pH-Wert von 4 zu bestimmen.
Wie schon weiter oben erläutert, ist es nicht möglich, das Cyclophosphamid Mustard als solches
zu extrahieren, zu derivatisieren und zu detektieren. Es zerfällt während der Lagerung in wäßriger
Lösung, der Extraktion und Derivatisierung vollständig in das ebenfalls während des
Metabolismus entstehenden zytotoxischen Stoffwechselprodukt Bis(2-chloroethyl)amin, welches
schließlich bestimmt werden kann. Dieses Amin besitzt aller Voraussicht nach einen weitaus
geringeren pKa-Wert, liegt also schon bei geringeren H3O+-Ionen-Konzentrationen als
Neutralteilchen vor. Ein weiterer Parameter, der während der Probenaufgabe von Wichtigkeit ist,
ist die Durchlaufgeschwindigkeit des Probevolumens durch das Sorbensbett. Hierbei mußte ein
Kompromiß zwischen einer möglichst kurzen Analysendauer und der möglichst vollständigen
Gleichgewichtseinstellung zwischen den Analyten und der Festphase gefunden werden. Bei der
vom Hersteller angegebenen Durchflußrate von 80mL/min traten keine Substanzverluste auf,
jedoch um schlechtere Wiederfindungsraten durch Unwägbarkeiten in der Extraktion wie
unterschiedlich hohe Matrixbelastungen der Proben zu vermeiden, wurde mit einer Rate von
20mL/min gearbeitet.
6 Probenvorbereitung 65
Abb. 6.7:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von CP
Abb. 6.8:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von IF
Abb. 6.9:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von d4-CP
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0 2 4 6 8 10
pH-Wert
F(C
P)/
F(I
S)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0 2 4 6 8 10
pH-Wert
F(I
F)/
F(I
S)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 2 4 6 8 10
pH-Wert
F(d
4-C
P)/
F(I
S)
6 Probenvorbereitung 66
Abb. 6.10:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von KCP
Abb. 6.11:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von KIF
Abb. 6.12:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von CCP
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(K
IF)/
F(I
S)
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(K
CP
)/F
(IS
)
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(C
CP
)/F
(IS
)
6 Probenvorbereitung 67
Abb. 6.13:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von CIF
Abb. 6.14:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von CPM/NNM
Abb. 6.15:
pH-Wert-Abhängigkeit der
SPE von IPM
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(C
IF)/
F(I
S)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(N
NM
)/F
(IS
)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10 12
pH-Wert
F(I
PM
)/F
(IS
)
6 Probenvorbereitung 68
Tab. 6.7: Ergebnisse der pH-Wert-Optimierung bezüglich der Festphasen-Extraktion
Substanz CP KCP CCP CPM IF KIF CIF IPM d4-CP
OptimalerpH-Wert
4 4 4 7 4 4 4 2 4
Da am Anfang der Aufgabe ein nur geringer, am Ende jedoch durch das Zurückhalten
unlöslicher Schwebstoffen auf der Kartuschenfritte ein erheblich höherer Gegendruck herrscht,
mußte der Druck manuell nachgeregelt werden, um somit eine reproduzierbare Extraktion zu
gewährleisten.
6.3.3.4 Waschschritt
Auf diesen Schritt der Probenextraktion wurde verzichtet, da es gerade bei den kleineren und
polareren Komponenten sowohl bei rein wäßrigen als auch bei mit organischem Modifier
versetzten Waschlösungen zu starken Substanzverlusten kam.
6.3.3.5 Trocknung der Extrakionsscheiben
Ein Trocknen der Festphasen ist für diese analytische Fragestellung von großer Bedeutung. Es
wurde Stickstoff, Argon und die umgebende Luft durch die Säulen gesogen. Da kein Unterschied
zwischen den verschiedenen Gasen festzustellen war, also kein Inertgas benötigt wurde, um
eventuelle Oxidationsprozesse zu unterbinden, wurde ausschließlich Luft zum Trocken der
Festphasen verwendet. Wichtig war die Dauer dieses Arbeitsschrittes. Da zumindest die
Augangsverbindungen erwiesenermaßen einen meßbaren Dampfdruck besitzen (3,3∙10-5 hPa für
CP, 1,4∙10-5 hPa für IF), erschien es ratsam, die Sorbentien nicht zu intensiv zu trocknen. Auf der
anderen Seite mußten die wäßrigen Überreste entfernt werden, damit diese die anschließende
Derivatisierung nicht störten. So wurden die Festphasen 10 Minuten im leichten Luftstrom
getrocknet.
6 Probenvorbereitung 69
6.3.3.6 Elution
Weniger die Art des organischen Elutionsmittels als vielmehr deren Aufgabe auf die Festphase
konnte die Elution der Komponenten beeinflussen. Die getesteten Lösungsmittel zeigten keine
signifikanten Unterschiede in der Elutionskraft von Methanol, Acetonitril, Ethylacetat und Hexan
bezüglich der interessierenden Verbindungen. Jedoch spielten die Aufteilung des
Gesamtvolumens und die Einwirkzeit im Sorbensbett eine erhebliche Rolle. Die
Wiederfindungsrate konnte durch dieses wiederholte Einstellen des Gleichgewichtes erhöht
werden, was anhand der beiden Hauptkomponenten Cyclophosphamid und Ifosfamid in den
folgenden Diagrammen (Abb. 6.16 bis 6.19) gezeigt werden soll.
Bei dieser Untersuchung wurden jeweils 1L mit 100ng CP und IF dotiertes Oberflächenwasser
mit Hilfe der beiden C18-Phasen extrahiert. Die Konditionierung und Trocknung der Phase
erfolgte wie oben beschrieben. Als Kompromiß aus Elutionskraft und Flüchtigkeit wurde
Acetonitril als Elutionslösungsmittel gefunden. Die Desorption erfolgte mit 10 x 5mL dieses
Lösungsmittels. Außerdem wurde die Einwirkzeit auf jeweils 2 Minuten festgesetzt. Die
einzelnen Fraktionen wurden separat aufgefangen und weiterverarbeitet. Die Analyse ergab, daß
erst nach der dritten Gabe von Elutionsmittel über 95% der Verbindungen eluiert werden
konnten. Auch ein Wechsel auf andere Festphasen oder Lösungsmittel brachte keine Änderung.
Das hatte zur Folge, daß die Elution im weiteren Verlauf jeweils mit 3 x 5mL Acetonitril erfolgte.
Die Stabilitäten der Verbindungen im Eluat sind verschieden. Während die Muttersubstanzen
und die Ketoverbindungen bei einer Tiefkühlung von –18°C über Monate hinweg keine
Substanzverluste zeigen, zerfallen die anderen Metabolite, vor allem die Carboxy-Komponenten
innerhalb weniger Tage auf nicht bekanntem Wege. Insofern ist eine sofortige weitere
Verarbeitung der Eluate indiziert.
6 Probenvorbereitung 70
Abb. 6.16: Fraktionssammlung nach Cyclophosphamid-SPE mit C18-Speedisk
Abb. 6.17: Fraktionssammlung nach Ifosfamid-SPE mit C18-Speedisk
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Fraktionsnummer
Re
l. F
läc
he
nza
hl
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Fraktionsnummer
Re
l. F
läc
he
nza
hl
6 Probenvorbereitung 71
Abb. 6.18: Fraktionssammlung nach Cyclophosphamid-SPE mit C18 Polar Plus-Speedisk
Abb. 6.19: Fraktionssammlung nach Ifosfamid-SPE mit C18 Polar Plus-Speedisk
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
0 2 4 6 8 10 12
Fraktionsnummer
Re
l. F
läc
he
nza
hl
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 2 4 6 8 10 12
Fraktionsnummer
Re
l. F
läc
he
nza
hl
6 Probenvorbereitung 72
6.3.3.7 Einengen des Eluats
Durch den Einsatz unterschiedlicher Inertgase (Stickstoff, Argon) konnte gezeigt werden, daß die
Verwendung keines der Gase zu einer Verringerung der Wiederfindungsrate führte. Wurde
jedoch Luft zu Verdrängen des überflüssigen Elutionsmittels gebraucht, so konnten geringe
Substanzverluste bei den Mustard-Metaboliten festgestellt werden.
Wie schon in Kapitel 6.3.2.7 erläutert, existiert bei diesem Punkt ein Unterschied zwischen dem
Cyclophosphamid Mustard und den restlichen Verbindungen, die unter den entwickelten
Bedingungen zu extrahieren waren. Das vollständige Entfernen des Elutionsmittels und der in
ihm enthaltenen Wasserspuren aus der Extraktion ist bei den Komponenten der Gruppe 1 zum
Erreichen maximaler Wiederfindungsraten obligat. Der Dampfdruck des CPM oder des
mittlerweile während des Extraktionsprozesses entstandenen NNM scheint so groß zu sein, daß
es unter den gewählten Bedingungen verdampft oder sich weiter zersetzt, sollte kein Rückstand
von wenigen Mikrolitern in der Probenvorlage zurückbleiben.
Um die Abkühlung durch die Kälte des verdampfenden Lösungsmittel und somit eine damit
verbundene Erniedrigung des Damfdruckes zu kompensieren, wurde auf einer Temperatur
knapp unterhalb des Lösungsmittelsiedepunktes (hier bei ACN: 80°C) temperiert.
6.4 Derivatisierung
Verbindungen, die mehrere stark polare funktionelle Gruppen wie z.B. –OH, –COOH oder
–NH2 sowie zusätzlich noch weitere Heteroatome enthalten, verursachen Schwierigkeiten bei der
gaschromatographischen Trennung wegen ihrer stark verminderten Flüchtigkeit und ihrer
Adsorption an Teilen des Systems wie Injektor, Säule und Detektor. Verbindungen dieser Art
(Dicarbonsäuren, Phenole, Polyalkohole, -saccharide, u.a.) lasssen sich unzersetzt und ohne
Tailing nur nach vorheriger Derivatisierung, d.h. durch Entfernung der polaren Gruppen durch
Reaktion mit bestimmten Reagenzien, die selbst nicht zu polar sind, chromatographieren. Für
jede dieser funktionellen Gruppen steht eine Reihe von Derivatisierungsmitteln zur Verfügung.
Häufig werden diese Reaktionen auch dafür eingesetzt, um die Detektion der derivatisierten
Verbindungen viel empfindlicher zu machen, indem funktionelle Gruppen in das Molekül
eingebaut werden, die einen sehr hohen Response in einem spezifischen Detektor (z.B.: ECD
oder GC-MS) zeigen, so daß Spurenkomponenten sicherer nachgewiesen werden können.
6 Probenvorbereitung 73
Bei der Verwendung eines Massenspektrometers als Detektor kann die Derivatisierung auch als
chemischer Test für spezifische Struktureigenschaften des unbekannten Moleküls oder eines
Fragments eingesetzt werden. Des weiteren kann durch Einfügen einer solchen Gruppe mit
möglichst hohem Molekulargewicht das Gesamtgewicht des zur Quantifizierung genutzten Ions
stark erhöht werden, was eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses im
Massenchromatogramm mit sich bringt. Je größer das zum Auswerten verwendete m/z-
Verhältnis ist, desto geringer ist das chemische Rauschen im Chromatogramm. Das resultiert aus
der Tatsache, daß Matrixbestandteile und Säulenbluten, die zu einen großen Teil zum Rauschen
beitragen, nur unterhalb des m/z-Wertes von 300 Fragmente bilden.
Eine weiterer Vorteil liegt in der Tatsache, daß durch Derivatisierungen mit Reagenzien
geeigneter Polarität und Struktur der in das Analytmolekül einzubauenden Gruppe auch die
Selektivität der chromatographischen Trennung verbessert wird.
Ein Nachteil der strukturellen Veränderung eines Analytmoleküls durch eine Derivatisierung
besteht häufig darin, daß diese Reaktionen oft nicht vollständig ablaufen und einen höheren
Arbeitsaufwand erfordern.
Bei den zu derivatisierenden Verbindungen handelt es sich um Komponenten, die Hydroxy- und
Aminogruppen als funktionelle Gruppen haben. Die OH-Gruppen sind Teil einer Carbonsäure-
(IPM) oder einer Phosphorsäure-Funktion (CCP, CIF). Die Aminofunktionen liegen sowohl als
endozyklische Sekundäraminogruppen (CP, KCP) als auch als exozyklische Primär- (CCP, ggf.
CPM) und Sekundäraminogruppen (IF, KIF, CIF, IPM, NNM) vor. Es gilt, diese Gruppen
insoweit chemisch zu verändern, daß die Verbindungen chromatographisch analysierbar werden.
Also muß ihre Polarität wie auch ihre Tendenz zur Adsorption innerhalb des Systems reduziert
werden. Des weiteren ist auch ein Abbau, wie er im folgenden anhand des Beispiel von
Cyclophosphamid gezeigt ist (Abb. 6.20), zu verhindern. Hierbei kommt es während des GC-
Laufs zu einem im Umfang nicht reproduzierbaren intramolekularen Ringschluß.
O NH
P
O
N
ClCl
O N
P
O
N
Cl
Wärme
- HCl
Abb. 6.20: Intramolekularer Ringschluß von Cyclophosphamid bei Wärmezufuhr
6 Probenvorbereitung 74
6.3.1 Optimierung der Derivatisierungsreaktion
6.3.1.1 Alkylierung, Veresterung, Veretherung
Die Verwendung von alkylierenden Reagenzien für die Derivatisierung ist nur für Analyten mit
reaktiven Wasserstoffatomen wie Carbonsäuren, Alkoholen, Aminen, Amiden oder Thiolen
geeignet. Das Ersetzen eines solchen Wasserstoffs durch eine Alkylgruppe ist wichtig für die
chromatographische Analyse wegen des Verlustes an Polarität und der intermolekularen
Wechselwirkung des Moleküls verglichen mit der Ausgangssubstanz.
In dem vorliegenden Fall wurde der Schwerpunkt auf die Einführung einer Methylgruppe in die
Molekülstruktur gelegt. Mit den folgenden Reagenzien bzw. Reagenzsystemen wurde versucht,
die Hydroxy-Gruppen zu alkylieren:
→ Methanol/HCl
→ Trimethylsulfoniumhydroxid
→ Diazomethan
→ Methyliodid/Triethylamin
→ 3,5-Bis(trifluoromethyl)benzylbromid/Triethylamin
→ Pentafluorobenzylbromid/K2CO3
Diese Reaktionen wurden in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt. Ebenfalls Gegenstand
der Untersuchungen war der Einfluß der eingesetzten Reagenzmenge sowie die Dauer und
Temperatur der Reaktionszeit auf die Effizienz.
6 Probenvorbereitung 75
6.4.1.2 Silylierung
Auch diese Derivatisierungsmethode wird angewandt, um die Flüchtigkeit der Verbindung
heraufzusetzen und die Dipol/Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen zu reduzieren.
Die Einführung einer Silylgruppe in eine Struktur kann für die massenspektrometrische
Detektion von großem Vorteil sein, weil sie entweder ein für Strukturuntersuchungen günstiges
Zerfallsschema zeigt oder charakteristische Ionen für die Bestimmung der Komponenten im
Spurenbereich erzeugt. Aufgrund der bekannten Empfindlichkeit dieser Art der Derivatisierung
gegenüber Wasserspuren in der Reaktions- und Injektionslösung wurde nur der Versuch mit N-
Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamid unternommen.
6.4.1.3 Acylierung
Das Ersetzen azider Protonen durch eine Acylgruppe kann prinzipiell auf drei Arten erfolgen:
mit Säureanhydriden, Säurehalogeniden oder anderen reaktive Acylderivaten wie acylierten
Imidazolen, Amiden oder Phenolen. Bei der Optimierung wurden folgende Reagenzien auf ihre
Fähigkeit, Gruppen wie Hydroxy-, Amino- oder Carbonsäurefunktionen zu acylieren, geprüft:
→ Trifluoressigsäureanhydrid, TFAA
→ Pentafluorpropansäureanhydrid, PFPA
→ Heptafluoressigsäureanhydrid, HFBA
→ Heptafluorbutyrylimidazol, HFBI
Hierbei wurden im besonderen Derivatisierungsmittel untersucht, die im Hinblick auf eine
möglichst spezifische und selektive Detektion mit dem Massenspektrometer gute Ergebnisse
liefern könnten. Die Derivatisierung mit diesen Reagenzien erhöhen die m/z-Verhältnisse der
detektierten Ionen und reduzieren damit das chemische Rauschen im entsprechenden
Chromatogramm. Auf der anderen Seite beinhalten die Verbindungen 3 bis 7 Fluoratome pro
eingefügtem Seitenarm. Dies erhöht die Fähigkeit der Moleküle, in der Ionenquelle des
Massenspektrometers mit emittierten Elektronen zu wechselwirken und somit zu ionisieren. Bei
der Anwendung der Negativen Chemischen Ionisierung sind solche Atome unabdingbar
notwendig.
6 Probenvorbereitung 76
6.4.2 Ergebnisse und Diskussion
6.4.2.1 Cyclophosphamid/Ifosfamid/4-Keto-Ifosfamid
Die zu derivatisierenden sekundären Aminofunktionen können mit Hilfe von TFAA hinreichend,
weil schnell und quantitativ zu Mono-TFA-Derivaten umgesetzt werden, was an einigen Stellen
in der Literatur [u.a. Dipl, Sessink, Kümmerer, de Bruijn] nachzulesen ist. Ebenso wurden zur
Steigerung der Meßempfindlichkeit und zur Strukturaufklärung eines Fragmentes von CP und IF,
welches während der Detektion im Massenspektrometer entsteht (siehe Kapitel 7.3), die übrigen
perfluorierten Säureanhydride mit den beiden Ausgangsverbindungen und dem Ifosfamid-
Metaboliten jeweils in einem großen Überschuß an Reagenz in die Vorlage gegeben und in einem
Ethylacetat-Medium 1 Stunde bei 70°C zur Reaktion gebracht.
Hierbei zeigte sich, daß die Reaktion mit allen Derivatisierungsmitteln vonstatten geht, jedoch
nahmen die Umsatzraten mit steigender Molekülmasse der Derivate ab. Daraus resultierte die
weitere Verwendung von Trifluoressigsäureanhydrid als Derivatisierungsreagenz für
Cyclophosphamid, Ifosfamid und 4-Keto-Ifosfamid.
6.4.2.2 4-Keto-Cyclophosphamid
Diese Verbindung wurde auf verschiedenste Art mit methylierenden und acylierenden
Verbindungen zur Reaktion gebracht. So wurden Versuche gemacht, 4-Keto-Cyclophosphamid
in Lösungsmitteln unterschiedlicher Polaritäten (Hexan, ACN, MeOH, THF, EtOAc, Toluol,
DMF, CH2Cl2, Diethylether, CCl4) mit Trimethylsulfoniumhydroxid zu methylieren oder mittels
TFAA (nicht in MeOH) zu trifluoracetylieren. Während das TFA-Derivat in keiner
Reaktionslösung zu detektieren war, konnte das methylierte KCP nach der Reaktion von TMSH
in CCl4 in geringen Mengen nachgewiesen werden.
Im Hinblick auf mögliche Ionisierungsmethoden wurde des weiteren das Reaktionsverhalten
verschiedener perfluorierter Verbindungen ermittelt. Sowohl die Alkylierungen mit
Pentafluorobenzylbromid/K2CO3 und 3,5-Bis(trifluoromethyl)benzylbromid/Triethylamin als
auch die Acylierungsversuche mit HFBA verliefen erfolglos. Die Reaktion mit dem
fluoroacylierten Imidazol ergab als einzige akzeptable Ausbeuten.
6 Probenvorbereitung 77
Eine äußerst schnelle und effektive Reaktion (15 Minuten bei Raumtemperatur) wurde mit der
Methylierung durch Diazomethan in einer Ether-Lösung gefunden. Die Wiederfindungsrate, die
mit dieser Methode erzielt werden konnte, war die mit Abstand beste, so daß diese Methode im
weiteren Verlauf zur Derivatisierung von KCP benutzt wurde.
6.4.2.3 Carboxyphosphamid/Carboxyifosfamid
Die beiden Carboxy-Metaboliten zeigen ein sehr ähnliches Reaktionsverhalten. Die
Methylierungsversuche mit methanolischer TMSH-Lösung in DMF und Methyliodid (K2CO3 als
Fällungsreagenz) in Aceton zeigten nur wenig Erfolg, während erneut die Derivatisierung mit
Diazomethan eine äußerst schnelle und praktikable Lösung für die Reaktion mit der
Cabonsäurefunktion darstellte. Die primäre bzw. sekundäre Aminogruppe konnte erneut gut mit
Trifluoressigsäureanhydrid in die entsprechenden TFA-Derivate überführt werden, was mit
PFPA und HFBA mißlang. Erwähnenswert ist, daß bei CIF wahrscheinlich aufgrund sterischer
Hinderung nur eine der beiden identischen Phosphorsäureamid-Funktionen derivatisiert werden
konnte, während es beim CP-Analogon während der Probenaufbereitung zu einem
reproduzierbaren intramolekularen Ringschluß kommt (Abb. 6.21).
O NH
P
O
N
ClCl
O
O
O N
P
O
N
Cl
O
O
CF3
O
O
F3C
- HCl
Abb. 6.21: Struktur des Carboxy-Derivats von Cyclophosphamid
6 Probenvorbereitung 78
Wichtig zu erwähnen ist, daß es nur möglich war, zuerst die Methylierung und dann erst die
Trifluoracetylierung vorzunehmen. Brachte dies gute Wiederfindungsraten, so konnte bei der
umgekehrten Vorgehensweise keine entsprechenden Verbindungen nachgewiesen werden.
Von Wichtigkeit ist auch, daß es sich hierbei um nur mäßig stabile Derivate handelt, die nach der
Reaktion umgehend mit der GC-MS vermessen werden mußten. Eine Alternativreaktion, die zu
stabileren Verbindungen führte, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gefunden werden.
Die Untersuchung der Reaktionsdauer und –temperatur erbrachte, daß die Methylierung schon
bei Raumtemperatur und nach 15 Minuten vollständig erfolgt war, während die
Trifluoracetylierung wie auch schon bei den oben erwähnten Verbindungen 1 Stunde bei 70°C
benötigt.
6.4.2.4 Cyclophosphamid Mustard
Wird von der Struktur dieses Metaboliten ausgegangen, so sind wiederum ein –OH- und eine
primäre Aminogruppe chemisch so zu verändern, daß sie nicht die oben erwähnten Effekte im
Chromatographen zeigt.
Das Verhalten von CPM unterscheidet sich maßgeblich von dem der anderen Metaboliten von
Cyclophosphamid und Ifosfamid. Während des Auftauens einer gefrorenen Probe, der
Aufbewahrung in Lösung, der Flüssig/Flüssig- wie Festphasen-Extraktion und der
Derivatisierung mit den obigen Reagenzien baut sich CPM unter Bruch der P-N-Bindung zu Nor
Nitrogen Mustard ab.
Die reine Methylierung mit etherischer Diazomethan-Lösung ergibt ein Gemisch aus drei
verschiedenen Methylderivaten, die durch die Reaktionen mit beiden möglichen Stellen im
Molekül entstanden sind, entweder am Stickstoff der Amino-, am Sauerstoff der Phosphorsäure-
Gruppe oder an beiden Funktionen. Da diese unterschiedlichen Reaktionswege völlig
unreproduzierbar beschritten werden, kann auch nicht nur eine Komponente zur Quantifizierung
herangezogen werden.
Soll das acide Proton der Aminogruppe durch Trifluoracetylierung ersetzt werden, so findet der
endgültige und vollständige Abbau zum Bis(2-chloroethyl)amin unter P-N-Bindungsbruch beim
CPM statt. Hierbei scheint die Anwesenheit des Reagenz den Abbau zu forcieren.
6 Probenvorbereitung 79
Die Menge des Reagenzes (10, 20, 50, 100µL), die Dauer (sofort, 30, 60, 120, 300 Minuten) und
die Temperatur der Reaktion (RT, 70°C) wurden variiert. Bis auf die Tatsache, daß bei der
Verwendung von nur 10µL TFAA nur eine geringe Ausbeute zu verzeichnen ist, haben diese
Faktoren alle keinen Einfluß auf die entstehende Menge an NNM. Es ist also davon auszugehen,
daß die Trifluoracetylierung von CPM/NNM schnell und quantitativ verläuft.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Konzentration von Cyclophosphamid Mustard
in einer Oberflächen- oder Abwasserprobe nur über die Trifluoracetylierung als NNM-TFA-
Derivat bestimmt werden kann. Da sich jedoch, wie in einigen Literaturstellen zu lesen ist [F48,
F49] und was auch im Laufe dieser Arbeit mehrfach gezeigt werden konnte, auch andere
Verbindungen des Cyclophosphamid-Metabolismus in das Abbauprodukt Nor Nitrogen Mustard
umsetzen, kann bei einer Bestimmung dieser Substanz stets nur über diese Summe, nicht jedoch
über die Konzentration des frei vorliegenden NNM eine Aussage getroffen werden.
6.4.2.5 Ifosfamid Mustard
Beim Ifosfamid-Analogon ist kein ähnliches Verhalten wie beim Cyclophosphamid Mustard zu
beobachten. Bei allen Versuchen, die Phosphorsäure-Funktion mit verschiedenen
Methylierungsreagenzien zu verestern bzw. die sekundäre Aminogruppe zu acetylieren, kommt es
nicht zu dem entsprechenden Abbau zum 2-Chlorethylamin.
Die säurekatalysierte Veresterung mit Methanol und einigen Mikrolitern konzentrierter Salzsäure
und die Methylierung mit Iodmethan und Triethylamin als Fällungsreagenz konnten keine
zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Auch die Veränderungen der eingesetzten Menge an
Reagenz sowie die Dauer (60, 120, 180, 240, 300 Minuten) und Temperatur (RT, 50°C) der
ablaufenden Reaktion erbrachten keine Verbesserungen. Ein Vergleich einer
Diazomethanreaktion in Ether mit der unternommenen Iodmethan-Derivatisierung ergab ein um
das Sechsfache verbesserte Flächenverhältnis von Analyt zu internem Standard, der bei beiden
Reaktionen in gleichen Mengen hinzugegeben worden war. Somit war es wiederum diese
Reaktion, die am besten geeignet war, um die OH-Funktion des IPM zu verestern. Um das azide
Aminproton zu ersetzen, wurden auch hier Versuche unternommen, mit TFAA, PFPA und
HFBA zu acetylieren. Jedoch erbrachte auch beim IPM nur TFAA die höchste
Wiederfindungsraten.
6 Probenvorbereitung 80
6.4.2.6 1,3-Oxazolidin-2-on/2-Chlorethylamin
Die Aminogruppen dieser beiden kleinsten Metaboliten des Ifosfamid konnten ohne
Schwierigkeiten mit Trifluoressigsäureanhydrid zu den jeweiligen TFA-Derivaten umgesetzt
werden. Hierbei wurden die gleichen Reaktionsparameter verwendet wie bei allen anderen
Verbindungen.
Die Substanzen wurden 1 Stunde lang in 70°C heißem Ethylacetat mit 100µL TFAA zur
Reaktion gebracht, danach das überschüssige Reagenz und Lösungsmittel mittels eines
Inertgasstroms entfernt und schließlich der Rückstand wieder in Ethylacetat aufgenommen.
6.5 Einteilung der Verbindungen in Gruppen für die Probenvorbereitung
Ein Ziel dieser Arbeit war, eine schnelle und effiziente Analytik zu entwickeln, die es ermöglicht,
mit geringem Zeit- und Materialaufwand viele der in den Metabolismen von Cyclophosphamid
und Ifosfamid vorkommenden, stabilen Verbindungen anreichern und detektieren zu können.
Um diese Vorgabe zu erfüllen, ist es notwendig, möglichst viele der untersuchten Komponenten
in Gruppen für die Probenvorbereitung einzuteilen. Dabei sind der Zeitgewinn und mögliche
Einbußen in der Nachweisstärke gegeneinander abzuwiegen.
Die beiden Metaboliten 1,3-Oxazolidin-2-on und 2-Chlorethylamin konnten zwar derivatisiert
und mittels einer GC-MS analysiert werden, jedoch entzogen sie sich jeglicher Versuche, sie aus
der wäßrigen Matrix zu extrahieren. Insofern wurden diese Substanzen im weiteren Verlauf dieser
Arbeit nicht weiter untersucht.
Da es sich bei den restlichen untersuchten Verbindungen naturgemäß um eine relativ homogene
Gruppe handelt, war es möglich, sie alle mit Festphasen auf Silicagel-Basis und endständigen C18-
Gruppen anzureichern. Allein das Cyclophosphamid Mustard verhielt sich aufgrund seines
Abbaus zu Nor Nitrogen Mustard im Laufe der Probenvorbereitung in drei Punkten different.
Zum einen ließ sich CPM auf einer C18-Polar Plus-Phase und bei einem pH-Wert von 7 weitaus
besser extrahieren als mit den Konditionen der restlichen Komponenten. Des weiteren war beim
Entfernen des überschüssigen Lösungs- und Derivatisierungsmittels die Reduktion bis auf einen
Rückstand von wenigen Mikrolitern durchführbar, um eine gute Wiederfindungsrate und
Reproduzierbarkeit zu erreichen.
6 Probenvorbereitung 81
Der Tabelle 6.8 ist die Einteilung der Analyten in die Gruppen für die Probenvorbereitung mit
den entsprechenden optimierten Parametern zu entnehmen.
Tab. 6.8: Einteilung der Zytostatika und deren Metabolite in Gruppen für die Probenvorbereitung
Gruppe 1
Cyclophosphamid, 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid,
Ifosfamid, 4-Keto-Ifosfamid,Carboxyifosfamid, Ifosfamid Mustard
Gruppe2
Cyclophosphamid Mustard
Sorbens C18 C18 Polar Plus
Konditionierung 25mL Methanol 25mL bidestilliertes Wasser
25mL Methanol 25mL bidestilliertes Wasser
pH-Wert Probe 4 7
Waschschritt / /
Elution 3 x 5mL Acetonitril 3 x 5mL Acetonitril
Einengen Mit Inertgas bis zur Trockne Mit Inertgas bis zu einemRückstand von ca. 20µL
Derivatisierung 1. Methylierung mit Diazomethan2. Trifluoracetylierung mit TFAA
1. Methylierung mit Diazomethan2. Trifluoracetylierung mit TFAA
Es war im weiteren darauf zu achten, daß während der Probenvorbereitung die Verbindungen
den Derivatisierungen in der angegebenen Reihenfolge zugeführt wurden. Das jeweilige Abblasen
des organischen Überschusses während der Derivatisierung ist in der gleichen Form
durchzuführen wie beim Einengen des SPE-Eluats.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 82
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren
7.1 Verwendete Geräte und Gase
Für die gaschromatographische Trennung wurde der GCQ-Gaschromatograph der Firma
Thermo Quest, der mit einer elektronischen Druck- und Flußkontrolle des Trägergases und mit
einem split/splitless-Injektor versehen ist, verwendet. Als Detektor kam ein entsprechendes
GCQ Ion Trap-Massenspektrometer mit der Option, Messungen mittels positiver und negativer
chemischer Ionisierung sowie im Full Scan-, SIM- und MS/MS-Modus durchzuführen, zum
Einsatz. Um die Vergleichsmessungen an einem Quadrupol-Massenspektrometer vornehmen zu
können, wurde von der Firma Axel Semrau GmbH & Co. (Sprockhövel, Deutschland) ein
solches, ebenfalls von Thermo Finnigan hergestelltes Strahlgerät (Automass) zur Verfügung
gestellt. Beide Gaschromatographen waren zusätzlich zu ihren split/splitless-Injektoren mit einer
speziellen Optic 200-Injektionseinheit der Firma Atas (Veldhoven, Niederlande) versehen, der es
ermöglichte, temperaturprogrammierte sowie großvolumige Probenaufgabe auf eine analytische
Säule vorzunehmen. Die rechnergestützte Datenaufnahme wie die Steuerung der beiden
Gerätekonfigurationen erfolgte mit der Software des Geräteherstellers (Xcalibur, Version 1.2).
Durch die Verwendung des Autosamplers Combi PAL der Firma CTC (Schweiz), der mit einer
10µL-Spritze (SGE, Hamilton) ausgestattet war, konnte die Probenaufgabe automatisiert und
dadurch reproduzierbarer durchgeführt werden.
Die verwendeten Gase sollten möglichst hohe Reinheiten aufweisen. Als Trägergas kam in allen
untersuchten Fällen Helium der Reinheit 5.0 zum Einsatz. Bei den Gasen, die bei der chemischen
Ionisierung als Reaktandgas in der Ionenquelle des Massenspektrometers benötigt wurden, lagen
die Reinheitsgrade zwischen 2.8 und 4.5. Alle für Injektions- und Spüllösungen benutzten
organischen Lösungsmittel wiesen p.A.-Qualität auf, konnten also für die organische
Spurenanalyse verwendet werden.
7.2 Entwicklung der chromatographischen Methode
Das Ziel einer gaschromatographischen Trennung ist zumeist eine möglichst gute Auflösung der
untersuchten Komponenten und die Separierung derselbigen von den störenden
Matrixbestandteilen.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 83
Jedoch ist oft nicht die maximale, sondern nur eine auf die spezielle analytische Fragestellung
bezogene Effizienz erforderlich. So ist bei einer komplexen Stoffmischung eine äußerst hohe
Trennleistung notwendig, um die jeweiligen Komponenten qualitativ bestimmen zu können,
während für eine quantitative Analyse einer weniger komplexen und in ihrer Zusammensetzung
bekannten Stoffmischung eine gerade ausreichende und häufig damit zeitsparende Trennung
ausreichend ist. Zu beachten ist weiter, daß die chromatographischen Peaks möglichst eine
symmetrische Form haben und keine Deformationen durch Fronting (langsam ansteigende
Vorderflanke und steil abfallende Hinterflanke des Peaks) oder Tailing (steil ansteigende
Vorderflanke und langsam abfallende Hinterflanke) aufweisen. Sollte dies auftreten, so kann es zu
einer Verfälschung der Retentionsdaten kommen. Bei der Spurenanalyse zum Nachweis
geringster Mengen in Umweltkompartimenten ist es dabei wichtig, vorab die Verbindungen in
ausreichenden Mengen zu analysieren, um die Parameter der Trennung und der Detektion
optimieren zu können. In der Spurenanalytik werden hohe Anforderungen an die Belastbarkeit
des gesamten chromatographischen Systems gestellt; die Retentionsdaten müssen reproduzierbar
sein, was bedeutet, daß die Polarität und alle anderen Parameter der Säulen eines Herstellers von
einer speziellen Säule zur anderen völlig gleich sein müssen. Außerdem müssen beim
Gaschromatographen die Temperaturprogramme reproduzierbar eingestellt sowie bei isothermen
Messungen konstant gehalten werden können. Des weiteren hängen die Retentionsdaten stark
vom Druck des Trägergases ab, was bedeutet, daß die Steuerung der Trägergasstromes korrekt
und wiederholbar sein muß.
7.2.1 Optimierung der gaschromatographischen Systemparameter
7.2.1.1 Trennsäulen
Die beiden verschiedenen Arten von gaschromatographischen Säulen werden in gepackte Säulen
und Kapillartrennsäulen unterschieden. Wurden noch bis in die achziger Jahre die gepackten
Säulen zum Lösen analytischer Probleme herangezogen, so haben sich mittlerweile die
Kapillartrennsäulen in der praktischen Anwendung durchgesetzt. Bei den für diese Arbeit
verwendeten Kapillarsäulen ist die stationäre Phase in Form eines Films an die Innenwandungen
der Säule aufgebracht.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 84
Folgende zwei Punkte waren für die Beurteilung der Leistungsfähigkeit einer Säule bezogen auf
das analytische Problem besonders von Gewicht. Zum einen wurden Säulen unterschiedlicher
Polaritäten getestet, um den möglicherweise verschiedenen intermolekularen Wechselwirkungen
zwischen Analyten und stationärer Phase Rechnung zu tragen. Auf der anderen Seite schien es
indiziert, die Beständigkeit der Säule oder besser die der stationären Phasen zu untersuchen.
Denn das Rauschen des Detektors, also das Störsignal, das den Untergrund im Chromatogramm
erzeugt, wird zu einem großen Teil vom sogenannten Säulenbluten hervorgerufen. Dieser Begriff
beschreibt das Auftreten von im Trägergas befindlichen flüchtigen Bestandteilen der stationären
Phase, die durch thermische oder katalytische Zersetzung entstehen.
7.2.1.2 Injektionstechnik
Durch das Aufkommen der Kapillar-Trennsäulen in der Gaschromatographie ist die
Probenaufgabe zu einem limitierenden Faktor für die Qualität der chromatographischen
Trennung geworden und ist somit von elementarer Bedeutung. Ziel ist es, eine möglichst schmale
Substanzzone am Kopf der Trennsäule zu schaffen. Eine bei der Entwicklung der vorliegenden
Methode benutzte Technik fällt in die Gruppe der heißen Aufgabetechniken. Hierunter versteht
man die klassische Aufgabetechnik, bei der die Dosierung der Probelösung in konstant beheizte
Injektoren erfolgt. In dem eigens dafür vorgesehenen Verdampfungsrohr (Insert) verdampft
sowohl das Lösungsmittel als auch die darin gelöste Probe und vermischt sich mit dem
eingespeisten Trägergas. Die Temperaturen der Injektionsapparatur belaufen sich auf 200 bis
300°C. Es besteht die Möglichkeit, den Transfer der Lösungsmittel-/Probe-Anteile in die Säule
mittels einer Splitvorrichtung zu steuern. Die beiden Betriebsweisen der Split-Injektion und der
Totalinjektion sind möglich.
Bei der Split-Injektion wird der Proben-/Trägergas-Strom nach dem Verdampfen im Insert
durch die Split-Technik aufgeteilt. Der größere Teil verläßt den Injektor durch den Splitausgang,
der kleinere gelangt auf die Trennsäule. Das Splitverhältnis ist variabel und kann je nach
Analytkonzentration, Detektorempfindlichkeit und Kapazität der Säule angepaßt werden. Übliche
Werte liegen zwischen 1/10 und 1/100. Das kleinste einstellbare Verhältnis ist vom
Innenvolumen des Inserts abhängig. Bei konzentrierten Proben ist diese Technik optimal, um die
Substanzmenge der Säulen- und Detektorkapazität anzupassen, während sich in der
Spurenanalytik durch einen höheren Splitstrom die Trägergasgeschwindigkeit erhöht.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 85
Somit wird ein stark beschleunigter Transport der Probenwolke am Säulenanfang vorbei und die
Aufgabe einer sehr schmalen Probezone auf die Trennsäule ermöglicht. Nachteilig wirkt sich bei
dieser Technik die unkontrollierbare Diskriminierung bei Probenzusammensetzungen mit
großem Siedepunktsbereich aus. Von Quantifizierungen mit externem Standard ist daher unter
diesen Umständen abzusehen.
Erfolgt die Probenaufgabe mit geschlossenem Splitventil, so wird diese Technik Totalaufgabe
oder splitlose Injektion genannt. Besonders zum Tragen kommt hierbei das Volumen des Inserts,
das die Probe-/Lösemittel-Dampfwolke zunächst vollständig aufnehmen muß, weshalb bei
Totalaufgabe benutzte Inserts ein größeres Volumenhaben sollten als die bei Split-Injektion
verwendeten. Dies widerspricht dem in der Literatur angegebenen Vorgehen. Ist das
Verdampfungsrohr aber zu klein, so kommt es bei der explosionsartigen Verdampfung des
Lösungsmittels zu einer Ausdehnung der Dampfwolke in den Septumsbereich hinein und somit
zu einer Kontamination des Septums oder der Septumsleitung. Zu weite Inserts bewirken eine zu
starke Verdünnung der Probenwolke und damit verlängerte Transferzeiten und Verluste durch
Diffusion. Gängige Insert-Volumina belaufen sich ungefähr auf 1mL bei einem
Injektionsvolumen von 1-2µL. Durch das Trägergas wird die Probewolke aus dem Injektor stetig
in die Trennsäule gespült. Dieser Vorgang nimmt in der Regel etwa 30 bis 90 Sekunden bis zum
vollständigen Transfer in Anspruch. Es wird ein drei- bis fünfmaliger Transfer des
Insertvolumens ermöglicht. Längere Transferzeiten begünstigen die Verbreiterung der jeweiligen
Peaks und den weiteren Eintrag von (Stör-) Komponenten in die Säule. Um dies zu unterbinden,
wird das Splitventil nach abgeschlossenem Probentransfer wieder geöffnet.
Durch die Verwendung des Optic-Injektor war es möglich, nicht nur die bei Benutzung des
eingebauten split/splitless-Injektors vorhanden Optionen zu nutzen, sondern auch spezielle
Techniken wie die Großvolumenaufgabe (large volume injection) zu testen. Hierbei werden für
die Gaschromatographie verhältnismäßig große Volumina von bis zu 250µL bei geschlossenem
Splitventil auf einen speziell gepackten Liner gegeben, der in der Lage ist, diese
Lösungsmittelmengen in seinem Bett zu speichern. Da der Injektor temperaturprogrammiert
arbeitet, startet die Injektion mit einer Temperatur, die gut 5-10°C unterhalb des
Lösungsmittelsiedepunktes liegen sollte. Dann öffnet sich ein zusätzliches Ventil (solvent vent),
über das mit Hilfe eines hohen Trägergasstromes das überschüssige Lösungsmittel aus dem
System entfernt wird. Die aufkonzentrierten Analyten verbleiben im Idealfall komplett auf dem
Packungsmaterial und werden durch Aufheizen des Liners in Form von schmalen Banden auf die
analytische Säule transferiert. Diese drei vorgestellten Injektionstechniken wurden auf ihre
Verwendbarkeit getestet.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 86
7.2.1.3 Temperaturprogrammierung
Die Säulentemperatur hat direkten Einfluß auf die absoluten und relativen chromatographischen
Flüchtigkeiten und somit auf die Retentionsdaten der Komponenten auf einer vorgegebenen
Säule. Somit hängen auch die Gesamtanalysenzeit und die erreichbare Auflösung stark von der
Säulentemperatur ab. Die Einstellung einer optimalen Temperatur für die Trennung mehrerer
Stoffpaare in verschiedenen Bereichen des Chromatogramms ist zumeist nicht möglich, was eine
Temperaturprogrammierung notwendig macht.
7.2.1.4 Trägergasströmung
Der Stofftransport und damit auch die Einstellung des Verteilungsgleichgewichtes zwischen
Analyt und stationärer Phase wird durch die Strömung des Trägergases in der Säule beeinflußt.
Hierbei stehen sich Gesamtanalysenzeit und Auflösungsvermögen gegenüber, denn große Flüsse
bewirken zwar einen schnellen Transport der Komponenten durch die Säule, aber auch eine
Verbreiterung der Peaks durch den langsamen Stoffaustausch zwischen stationärer und mobiler
Phase. Ziel der Strömungsoptimierung ist es, bei gegebenen Systemeigenschaften denjenigen
Trägergasfluß zu finden, bei dem in einem Minimum an zeitlichem Aufwand ein Maximum an
Effizienz erreicht werden kann. Je nach analytischer Problemstellung muß der Schwerpunkt
gelegt werden. Einen entsprechenden Zusammenhang zwischen der Trennleistung und der
Strömungsgeschwindigkeit sowie den verschiedenen auftretenden Diffussionsarten stellt die
Golay-Gleichung (Formel 7.1) [161,162] dar:
2
22
)1(24
)1161(2
kD
ukkr
u
DH
g
g
++++=
(Formel 7.1)
Abb. 7.1: Golay-Gleichung mit H: Trennstufenhöhe, Dg: Diffusionskoeffizient Analyt im
Trägergas, u: Durchschnittliche Trägergasgeschwindigkeit, r: Radius der Kapillartrennsäule,
k: Kapazitätsfaktor des Analyten
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 87
7.2.2 Ergebnisse und Diskussion
7.2.2.1 Trennsäulen
Es wurden einige Kapillartrennsäulen unterschiedlicher Polarität auf ihre Trenneffizienz
bezüglich des vorliegenden analytischen Problems untersucht. Jedoch nach dem Prinzip, daß sich
gleiches in gleichem am besten löst und es sich durchweg um relativ unpolare Verbindungen
handelt, wurden hauptsächlich folgende unpolare bis schwach polare Säulen verschiedener
Hersteller getestet:
Tab. 7.1: Getestete Säulen verschiedener Hersteller
Säule Hersteller Belegung Dimensionen Polarität
DB-XLB J & W Sientific88% Dimethyl-12% Diphenyl-
Polysiloxan
30m0,25mm0,25µm
schwach polar
DB-5-MS J & W Sientific95% Dimethyl-5% Diphenyl-
Polysiloxan
30m0,25mm0,25µm
unpolar
HT-8 SGE92% Dimethyl-8% Diphenyl-
Polysiloxan
25m0,25mm0,1µm
unpolar
HT-5 SGE95% Dimethyl-5% Diphenyl-
Polysiloxan
25m0,22mm0,1µm
unpolar
RTX-5 Restek95% Dimethyl-5% Diphenyl-
Polysiloxan
30m0,25mm0,25µm
unpolar
XTI-5 Restek95% Dimethyl-5% Diphenyl-
Polysiloxan
30m0,32mm0,25µm
unpolar
RTX-624 Restek94% Dimethyl-
6% Cyanopropyl-Polysiloxan
30m0,32mm1,8µm
polar
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 88
Bei den vergleichenden Untersuchungen konnten folgende Punkte festgestellt werden. Bezogen
auf die Polarität erfolgt die Trennung auf apolaren Säulen erheblich effizienter als auf der
polaren, während das Fassungsvermögen der stationären Phase proportional mit ihrer
Schichtdicke steigt. Die polare RTX-624 hatte neben der vergleichsweise schlechten
Trennleistung auch den weiteren Nachteil eines erheblich dickeren Films gegenüber den anderen,
was zur Folge hatte, daß diese Kapillartrennsäule ein hohes Rauschen im Massenspektrometer
erzeugte. Somit wurde das Erreichen einer möglichst niedrigen Bestimmungsgrenze verhindert.
Dieses konstante Bluten der stationären Phase hat üblicherweise auch eine schnelle und starke
Verunreinigung der Ionenquelle des Detektors, was die besonders blutungsarmen Säulen HT-5
und HT-8 mit ihrem sehr dünnen 0,1µm-Film für die Verwendung in einer GC-MS-Kopplung
auszeichnet. Zudem ist festzuhalten, daß eine Veränderung der anderen Säulendimensionen keine
bedeutende Rolle spielt. Einer geringere Säulenlänge oder des Innendurchmessers folgt aufgrund
kleinerer Trennstufenzahlen eine Beschleunigung der Analysenzeit, was aber nicht von
gravierender Bedeutung war. Die Grenze des Trägergas-Flusses bezüglich der maximalen
Belastbarkeit des Massenspektrometers liegt bei einem Ion-Trap-Tischgerät bei bis zu 3 mL/min,
was den einsetzbaren Säulendurchmesser bei linearer Flußgeschwindigkeit ungefähr 40cm/s auf
maximal 0,32mm limitiert.
Die besten Peakformen und Trennleistungen auch bei starker Matrixbelastung konnten mit der
schwach polaren, extrem blutungsarmen DB-XLB-Säule der Firma J & W Scientific erreicht
werden, welche bei allen weiteren Untersuchungen daraufhin verwendet wurde.
7.2.2.2 Injektionstechnik
In der Spurenanalyse werden im Hinblick auf möglichst niedrige Nachweisgrenzen größere
Volumina der Probenlösungen aufgegeben, um auch im Spurenbereich ausreichend große
Peakflächen zu erhalten. Dem entgegen stand im vorliegenden Fall die Auflösung der Peaks mit
kleinen Retentionszeiten (NNM, IPM); denn es kam bei diesen Mengen schnell zu Überladungen,
die meist mit schlechten Peakformen einhergingen. Also wurden bei der Bestimmung der
genauen Retentionszeiten der Komponenten für die Festlegung der jeweiligen
chromatographischen Fenster eine Lösung verwendet, in der größere Absolutmengen der
derivatisierten Komponenten vorlagen und 1µL dieser Lösung in einer split-Injektion
aufgegeben. Nur ein geringer Teil der Probenmenge kam durch ein entsprechend einzustellendes
split-Verhältnis auf die Säule, und somit konnten Überladungseffekte verhindert werden.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 89
Die splitlose Injektion kann hingegen vorteilhaft auf verdünnte Proben angewendet werden,
wenn mit Temperaturprogrammierung gearbeitet wird. Durch das zeitlich befristete Verschließen
des Split-Ausgangs gelangt das größte Teil des Volumens auf die Säule, was eine starke
Vergrößerung der Peakflächen zur Folge hat. Bei Verschlußzeiten (splitless time), die größer als 1
Minute waren, konnte keine weitere Vergrößerung der Peakflächen festgestellt werden. Somit
wurde dieser Parameter auf 60 Sekunden festgesetzt. Um eine möglichst vollständige
Transferierung der Analyten in schmalen Banden zu erreichen, war es ebenso notwendig, die
Temperatur des Injektors zu Beginn der Analyse auf einer Temperatur unterhalb des
Lösungsmittelsiedepunktes (70°C) zu halten und dann in einer Rate von bis zu maximal 16°C/s
auf einen Endwert von 300°C aufzuheizen. Hierbei kam es dann zu einer zeitlich verzögerten
Verdampfung des Lösungsmittels auf der einen Seite und den Analyten auf der anderen Seite.
Unter diesen Bedingungen wurden die schwerer verdampfbaren Verbindungen von dem leicht
flüchtigen Lösungsmittel (EtOAc) abgetrennt. Des weiteren bestand hierbei der Vorteil,
möglicherweise thermisch labile Substanzen ohne Zersetzung auf die Säule zu transferieren.
Die dritte Möglichkeit, ein bestimmtes Probenvolumen aufgeben zu können, lag im Nutzen der
large volume-Option des Optic 200. Da es aber bei dieser Matrix zu erheblichen Störungen durch
Interferenzen kam, wurde von der Verwendung dieser Option Abstand genommen. Erste
Versuche mit nur 50µL Injektionsvolumen zeigten eine umgehende Verschmutzung der
gepackten Liner, was eine starke und in ihrem Umfang nicht zu reproduzierende Veränderung
der Retentionsdaten und Adsorptionseffekte der Analyten im Liner zur Folge hatte. Ein starkes
Ausheizen des Liners bis 350°C noch während der Analyse erbrachte keine Verbesserung. Die
vom Injektor erreichbaren höheren Temperaturen von bis 600°C konnten nicht in Anspruch
genommen werden, da sich das Packungsmaterial oberhalb von 350°C zersetzte.
7.2.2.3 Temperaturprogrammierung
Da bei der Entwicklung der einzelnen Methodenbestandteile jede Verbindung einzeln behandelt
wurde, war es in diesen Fällen nicht notwendig, einen Temperaturgradienten zu verwenden, der
es ermöglichte, alle untersuchten Analyten in einem Lauf basisliniengetrennt detektieren zu
können. In diesem Fall standen kurze Laufzeiten des Gaschromatographen im Vordergrund.
Hier wurde die Säulenanfangstemperatur so gewählt, daß sie für die Zeit, während der das
Splitventil geschlossen war, tiefer als der Lösungsmittelsiedepunkt lag. Da die Injektionslösungen
ausschließlich in EtOAc vorlagen, wurde diese Temperatur auf 70°C festgesetzt.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 90
Das bewirkte den sogenannten „Lösungsmitteleffekt“, der durch das erneute Kondensieren des
Lösungsmittels dazu beiträgt, daß leichtflüchtige Komponenten der Probe noch besser fokussiert
werden. Das rekondensierte Lösungsmittel wirkt hierbei wie eine stationäre Phase und
vermindert durch Verdünnung derselbigen den Partialdruck der Spurenkomponenten.
Gleichzeitig kompensiert dieser Effekt die durch längere weil umfangreichere Transferierung
hervorgerufene Bandenverbreiterung in einem nicht geringen Maße. Nach den 60 Sekunden, in
denen das Splitventil geschlossen war, wurde nun ein Temperaturgradient von 30°C/min auf
300°C Endtemperatur gefahren, der die Abtrennung der untersuchten Komponenten von
interferierenden Bestandteilen möglich wurde. Unter diesen Umständen eluierten alle
Verbindungen im Bereich von 5-10 Minuten, wobei sich in einem kleineren
chromatographischen Fenster von 6-7,5 Minuten die Retentionszeiten von CP, IF, KIF, CIF und
CCP mit teilweise sich überlagernden Peaks befanden. Um diesem Problem zu begegnen, standen
zwei Möglichkeiten zur Verfügung. Auf der einen Seite wurde das Ofentemperaturprofil insoweit
verändert, daß bei einer Heizrate von nur noch 15°C/min eine weitere Trennung der Peaks
ermöglichte. Jedoch konnte es auch dann nicht verhindert werden, daß IF und sein Keto-
Metabolit koeluierten. Darüber hinaus ist es bei Verwendung der MS/MS-Technik durch
entsprechende Software-Steuerung (Xcalibur Version 1.2) möglich, ebendiese trotzdem bei
geschickter Wahl der Vorläuferionen und Einteilung in bestimmte Scanereignisse zu analysieren,
auch wenn sie gleichzeitig von der Säule eluieren.
Zusammenfassend können die verschiedenen verwendeten Temperaturprogramme wie folgt
angegeben werden:
Injektor: 70°C → ° sekC /16 300°C (Restlaufzeit)
Ofen (Methodenentwicklung): 70°C (60s) → ° min/30 C 300°C (5min)
Ofen (Realproben): 70°C (60s) → ° min/15 C 300°C (10min)
Unter den Bedigungen für das Vermessen der Realproben wird ein Chromatogramm, wie in
Abbildung 7.1 abgebildet, erhalten.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 91
Abb. 7.1: Massenchromatogramme einer Standardlösung mit allen untersuchten Verbindungen und dem
internen Standard d4-Cyclophosphamid
7.2.2.4 Druckprogrammierung
Mit Helium 5.0 als Trägergas wurde das Minimum in der graphischen Auftragung der
Golay-Gleichung bei einer Trägergasgeschwindigkeit von 40cm/s gefunden. Bei der Verwendung
einer 30 Meter langen DB-XLB-Säule mit den oben angebenen Dimensionen konnte bei diesem
Wert ein Maximum an Trenneffizienz erreicht werden, wie bei [152] nachzulesen ist.
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)
0
1000
1000
1000
1000
100%
0
1000
1000
100 Nor Nitrogen Mustard6,13
Ifosfamid Mustard9,68
Ifosfamid Cyclophosphamid12,19
12,94
4-Keto-Ifosfamid12,23
Carboxyifosfamid12,63
d4-Cyclophosphamid12,94
Carboxyphosphamid13,34
4-Keto-Cyclophosphamid13,80
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 92
7.3 Entwicklung der massenspektrometrischen Detektionsmethode
Die großen analytischen Vorteile der Ion-Trap-Technik entstehen durch die Möglichkeit, Ionen
über einen kurzen Entstehungszeitraum [ms] anzusammeln. Auf diese Weise kann ein
Ionenstrom aus einer Ionenquelle über die Sammlungszeit integriert werden und als „gebündeltes
Paket“ auf den Multiplier geschickt werden. Während der Speicherphase kann die Art der Ionen
(Full Scan, Single Ion Monitoring, positive/negative Ionen) oder Reaktionen mit den Ionen
(CID, MS/MS) kontrolliert werden. Folglich waren Optimierungen bezüglich der verschiedenen
Ionisierungsmethoden und massenspektrometrischen Ereignisse wie Speicher-, Dissoziations-
und Scanparameter erforderlich, um ein äußerst selektives Detektionsvermögen und somit eine
hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen.
7.3.1 Optimierung der massenspektrometrischen Systemparameter
7.3.1.1 Ionisierung
Bei der in der Routine-Analytik am häufigsten eingesetzten Elektronenstoß-Ionisierung (EI)
kollidieren in der Ionenquelle des Massenspektrometers, der in den beiden verwendeten
Modellen (Thermo Quest „GCQ“, Thermo Finnigan „Automass“) über eine direkte Kopplung
mit dem Gaschromatographen verbunden ist, Elektronen mit relativ hoher Energie (meist 70eV)
mit den Analytmolekülen und bilden unter anderem positive Ionen. Die von den Elektronen
übertragene Energie übersteigt die Energie zur Entfernung des ersten Elektrons aus den meisten
organischen Verbindungen (10-15eV) um ein Vielfaches, womit das ionisierte Molekül zu
Schwingungen angeregt wird und nach bekannten Regeln stark zerfällt [163]. Das meist gut
erklärbare Fragmentierungsmuster, das sogenannte Massenspektrum, dient der
Substanzidentifizierung des Analyten.
Während die EI-Reaktion als ein direkter Energietransfer von den Elektronen zum
Analytmolekül verstanden wird, kann die Chemische Ionisierung (CI) als chemische Reaktion
gesehen werden. In einer in diesem Fall fast vollständig abgeschlossenen Reaktionskammer (ion
volume) liegt hierbei ein Reaktandgas in einem Überschuß vor und wird durch die mit bis zu
200eV beschleunigten Elektronen ionisiert, oder ein Moderatorgas dient als Medium zur Bildung
energieschwacher Elektronen.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 93
Die Analytmoleküle reagieren mit den Reaktandgasionen oder den energieschwachen Elektronen
und zerfallen ebenfalls, jedoch je nach Wahl des Gases mehr oder weniger stark. Entsprechend
der Resultate der Reaktionsmöglichkeiten wird zwischen Positiver (PCI) und Negativer
Chemischer Ionsierung (NCI) unterschieden. Im allgemeinen ist der Energiebetrag, der bei der
CI auf das Analytmolekül übertragen wird, erheblich kleiner als bei der EI, was zu einer weitaus
geringeren Fragmentierung führt.
Die PCI wird bevorzugt dann eingesetzt, wenn das EI-Massenspektrum keine oder nur
unzureichende Information über die Molmasse des Analyten liefert. Das Meßergebnis, also der
Umfang der Fragmentierung, ist primär von der Wahl des Reaktandgases abhängig. Die Prozesse
der PCI werden mit dem Begriff der Protonenaffinität (PA) beschrieben. Die PA des ionisierten
Reaktandgases muß größer sein als die des Probemoleküls. Die auf den Analyten übertragene
Energiemenge ist somit abhängig von der Art des Gases. Methan ist als sehr „hartes“ PCI-Gas
weniger selektiv, während iso-Butan und Ammoniak typische „weiche“ PCI-Gase sind, die wenig
Energie zur Fragmentierung des Analytmoleküls beitragen.
Die gezielte Erzeugung negativer Ionen kann durch Anlagerung thermischer Ionen äußerst
geringer Energie (0-2eV), durch Ladungsaustausch oder durch Abstraktion azider Protonen
erfolgen. Die Bedeutung der NCI liegt in der Möglichkeit, die für diese Reaktion geeigneten
organischen Verbindungen im Ultraspurenbereich (je nach Substanz bis ppt-Bereich) selektiv
nachzuweisen. Die für die NCI geeigneten Analyten weisen hohe Elektronenaffinitäten (EA) auf,
wodurch es zum Beispiel bei Komponenten mit großer EA und der Verwendung von Methan als
CI-Gas zur oben erwähnten Anlagerung thermischer Elektronen kommt. Elektronen höherer
Energie (bis zu 15eV) bedingen eine dissoziative Reaktion, aus der Massenspektren resultieren,
die je nach Wahl des Gases eine mehr oder minder starke Fragmentierung des Molekülions
zeigen. Die Ionisierungseffizienz der Analyten kann verbessert werden, indem durch
Derivatisierung Gruppen mit elektronenziehenden Eigenschaften in das Molekül eingebaut
werden. Geeignet sind hierfür mehrfach halogenierte Verbindungen, solche mit Nitrogruppen,
Doppelbindungen und die allgemein Heteroatome in der Molekülstruktur aufweisen. Weitere
Betrachtungen der Chemischen Ionisierung und deren Reaktionsmechnismen sind einer großen
Anzahl von Literaturstellen zu entnehmen [164]
Für die Optimierung der Ionisierung wurden im allgemeinen Elektronenstoß-Ionisierung und
beide Formen der Chemischen Ioniserung gegenübergestellt. Hierfür wurde die Derivatisierung
der Verbindungen im Hinblick auf die Bestimmung ihrer Molmassen und die möglichst hohe
Empfindlichkeit bei der Ionisierung und Detektion durchgeführt.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 94
Als Reaktandgase wurden Methan, Ammoniak, Helium, Stickstoff, Argon, Wasserstoff, Methanol
und Wasser auf ihre Fähigkeit getestet, die Analyten möglichst selektiv zu ionisieren und das
Untergrund-Rasuschen weitestgehend zu unterdrücken. Um die bei Normaldruck flüssigen
Reaktanden Wasser und Methanol verwenden zu können, wurde im Eigenbau ein gasdichtes
Behältnis, in das die Flüssigkeiten gegeben werden konnten, vor das CI-Gas-Ventil des
Massenspektrometers geschaltet. Wurde nun das Ventil geöffnet, so reichte der Dampfdruck aus,
um den notwendigen Druck in der Reaktionskammer zu erzeugen. Schließlich wurden der
Gasdruck in der Reaktionskammer, die Temperatur der Ionenquelle sowie die
Beschleunigungsenergie der Elektronen variiert.
7.3.1.2 Meßtechniken
Bei der Datenaufnahme des Massenspektrometers wird zwischen der Detektion der kompletten
Spektren (Full Scan), der Einzelmassen-Registrierung (Single Ion Monitorung, SIM) und der
Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) bei mehrstufigen oder Ion Trap-Geräten unterschieden.
Die kontinuierliche Aufnahme von Spektren im Full Scan-Modus ermöglicht bei gleichzeitiger
Erfassung der Retentionszeit eine Identifizierung der Analyten durch Interpretation der
entstandenen Spektren und Vergleich mit entsprechenden Bibliotheken. Bei Ionenstrahlgeräten
ist zu beachten, daß die Empfindlichkeit zur Erfassung des Spektrums von der Effizienz der
Ionenquelle, der Transmission durch den Analysator und ganz wesentlich von der Meßzeit der
Ionen abhängt. Die Meßzeit pro Masse ergibt sich aus dem untersuchten Massenbereich (z.B. 80-
400 amu) und der Abtastrate des Chromatogramms (z.B. 0,5s pro Scan). Hierdurch wurde ein
Abwägen zwischen spektrometrischem Inhalt und Länge des einzelnen Scans sowie ein Festlegen
des minimalen Massenbereichs für das Erfassen der Full Scan-Spektren der einzelnen
Verbindungen notwendig. Dies hat für die Strahlgeräte einen weitaus größeren Stellenwert als für
die Ion Trap-Geräte, da es bei letzteren zu einer parallelen statt zu einer nacheinanderfolgenden
Detektion der einzelnen Massen kommt.
Die Aufteilung der vorhandenen Scanzeit auf wenige Massen während einer Einzelmassen-
Registrierung ermöglicht eine durch höhere Abtastraten erreichbare präzisere Darstellung des
chromatographischen Peaks und einen Gewinn an Nachweisstärke. Jedoch geht jegliche
Information über die Struktur des Analyten verloren. Es mußte eine geeignete Wahl eines oder
mehrerer SIM-Ionen zum Erreichen einer empfindlichen und mit wenig Rauschen behafteten
Analyse getroffen werden.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 95
Die Weiterentwicklung der Gerätetechnik hat im Laufe der letzten 15 Jahre die MS/MS-Analytik
zur Methode der Wahl zur Spurenbestimmung von Komponenten in einer komplexen Matrix
werden lassen. Als analytischer Hintergrund zur Nutzung der GC-MS/MS-Technik in der
Rückstandsanalytik ist der bekannte Zusammenhang zu sehen, daß das Signal/Rausch-Verhältnis
mit der Anzahl der analytischen Stufen zunimmt. Aufreinigungen verringern dabei aber auch die
potentielle Signalintensität. Die Aneinanderreihung von naßchemischen oder instrumentellen
Probenvorbereitungs-Schritten kann leicht dazu führen, daß in Folge von Aufarbeitungsverlusten
ein Substanzsignal unter die Detektierbarkeitsgrenze fällt. Aus dieser Überlegung heraus kann in
der GC-MS/MS bei der Anwendung von stark matrixbelasteten Extrakten die erste Trennstufe
als massenspezifischer „Clean up“ gewertet werden.
Im Ion Trap-Analysator wird in einem Elektronenstrahl-Puls zunächst das Probenspektrum
erzeugt. Die Selektion des Vorläufer-Ions, der stoßinduzierte Zerfall und die Analyse der
Tochter-Ionen werden durch eine zeitgesteuerte Sequenz erreicht. Durch eine "Scanfunktion"
wird der Analysator vom Rechner kontrolliert. Zusätzlich zur Wechselspannung (RF, radio
frequency) werden die Ringelektrode mit einem Gleichspannungsimpuls (DC, direct current) und die
Endkappen mit einem durchstimmbaren Frequenzgenerator (AC, alternating current) angesteuert.
Die Umlauffrequenz (Säkular-Frequenz) des Parent-Ions fehlt in diesem Spektrum und beläßt so
eine einzelne Massensorte in der Ion-Trap. Der stoßinduzierte Zerfall wird durch die gleiche
zusätzliche Wechselspannung an den Endkappen ausgelöst. Wenn die Frequenz der angelegten
Wechselspannung mit der Umlauf-Frequenz der ausgewählten Ionen identisch ist, können diese
durch Resonanz Energie aufnehmen. Die Bestimmung des Analyten erfolgt über das
charakteristische Massenspektrum von Tochterionen oder dessen Quantifizierung über
substanzspezifische Signale. Der Zeitaufwand dieser Vorgänge liegt im unteren ms-Bereich und
ist somit gut auch bei hohen Abtastraten für das GC einsetzbar. Neben der Abtrennung der
Matrix bleibt verglichen mit der SIM-Technik die spektroskopische Information
(Tochterspektrum) erhalten, so daß falsch-positive Befunde ausgeschlossen werden können.
Wie in der Abbildung 7.1 verbildlicht, kann diese Meßtechnik von mehrfachen Sektorfeld- und
Triplequadrupol-Geräten auch mit dem verwendeten Ionfallen-Massenspektrometer angewendet
werden. Hierbei war die Optimierung einer Vielzahl von Parametern erfoderlich.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 96
Abb. 7.1: GC-MS/MS-Realisierungen [164]
Tandem-in-Space: Triple-Quadrupol-Technik
Tandem-in-Time: Ion Trap-Technik
Zu Anfang mußten Vorläufer-Ionen bestimmter m/z-Werte bestimmt werden, die in einem
möglichst großem Unfang im Totalionenaufkommen vorlagen, um aus dem im GC-Eluat
enthaltenen Ionengemisch von Analyten, Koelutionen, Matrix und Säulenbluten
Spurenkonzetrationen der Komponenten ermitteln zu können. Aufgrund der entstehenden
geringen Fragmentierung ist hierfür speziell die Verwendung weicher Ionsierungsmethoden
untersucht worden. Für eine optimale Speicherung und Dissoziation mit Hilfe in die Ion Trap
eingeleiteten Helium mußten weitere Parameter variiert werden. Die Ermittlung des Optimums
bezüglich der Ionen-Speicherzeit, der Dauer und Intensität der Anregungsspannung, die an den
Endkappen angelegt einen stoßinduzierten Zerfall der Vorläuferionen hervorruft, sowie des
Stabilitätsfaktors q wurde durch Veränderung der jeweiligen Werte für jede Substanz ermittelt.
Bei dem q-Wert handelt es sich um einen Ion Trap-spezifischen Faktor, der Einfluß auf die
Stabilitäten der Speicherung der zu untersuchenden Ionen hat. Mit der Veränderung der drei
Werte für q – 0.225, 0.300, 0.450 – besteht die Möglichkeit, Einfluß auf das Meßergebnis zu
nehmen. Je größer dieser Wert, desto instabiler darf das Vorläuferion sein. Jedoch wird dadurch
die Breite der m/z-Verhältnisse des Tochterspektrums kleiner. Alle Optimierungen zielen auf
eine maximale CID-Effizienz ab, worunter das Verhältnis des Totalionenaufkommen des
Tochterspektrums und der Vorläuferionenanzahl verstanden wird. Letztendlich war noch jeweils
ein Tochterion auszuwählen, das sich zum Quantifizieren eignete.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 97
7.3.2 Ergebnisse und Diskussion
7.3.2.1 Ionisierung
Bei der Erzeugung positiver Ionen mittels Elektronenstoß-Ionisierung wurden bei allen
Verbindungen Full Scan-Spektren erzeugt, die eine geringe bis mäßig starke Fragmentierung
erzeugten, mit denen sie sich identifizieren ließen. Eine Erniedrigung der Elektronenenergie
erzeugte nur eine Verringerung des Totalionenaufkommens und nicht der Fragmentierung,
weswegen davon bei EI-Messungen abgesehen wurde. Generell kann bei allen CI-Gasen
festgestellt werden, daß die Temperatur der Ionenquelle einen Einfluß auf das Ionenaufkommen
hat. Temperaturen über 200°C gehen mit einer Zerstörung der wichtigen Cluster aus
Reaktandgasmolekülen bzw. der enstandenen Ionen einher, während unterhalb von 150°C die
Ionenquelle sehr schnell verschmutzt.
Für alle Verbindungen, die aus der wäßrigen Matrix extrahiert werden konnten, wurden ausgiebig
die Möglichkeiten der Chemischen Ionisierung untersucht. Ob die jeweiligen CI-Gase prinzipiell
für die Ionisierung der Substanzen anwendbar waren, zeigen die Ergebnistabellen 7.2 und 7.3:
Tab. 7.2: Ergebnistabelle der Eignungsuntersuchung für die Postive Chemische Ionisierung
PCI-Gas CH4 NH3 H2O
Substanz
CP + + +
IF + + +
KCP + + -
CCP + + NB
KIF + + +
CIF + + NB
NNM NB NB NB
IPM + + -
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 98
Tab. 7.3: Ergebnistabelle der Eignungsuntersuchung für die Negative Chemische Ionisierung
mit +: Generell möglich -: Nicht möglich NB: Nicht bestimmt
NCI-Gas CH4 NH3 H2O Ar He N2 H2 CH3OH
Substanz
CP + + + + + + + -
IF + + + + + + + -
KCP + + - - - - - NB
CCP + + NB NB NB NB NB NB
KIF + + + + + + + NB
CIF + - NB NB NB NB NB NB
NNM NB NB NB NB NB NB NB NB
IPM + + - NB - - NB NB
Die Untersuchungen haben gezeigt, daß sich die Verbindungen je nach Größe der Protonen-
respektive Elektronenaffinität der Moleküle sehr unterschiedlich stark durch die CI-Gase
ionisieren lassen.
Die bei der Positiven Chemischen Ionisierung verwendeten Gase Methan und Ammoniak waren
größtenteils in der Lage, die acht trifluoracetylierten bzw. methylierten Komponenten zu
ionisieren und eine Fragmentierung zu initiieren, die es ermöglichte, weitere Informationen über
den strukturellen Aufbau der Analyten und damit deren Identifizierung zu erhalten. Die
Ionisierung mittels Wasser erzeugte saubere Spektren mit einem aufgrund der hohen
Protonenaffinität erstaunlich hohen Fragmentierungsgrad; bei den beiden Metaboliten KCP und
IPM zeigte dies wiederum keinen Erfolg. Der Wasserdampf belastete aber in hohem Maße die
Filamente des Massenspektrometers, was auf Dauer einen Einbruch in der Stabilität des Gerätes
zur Folge hatte. Dies machte von vornherein eine dauerhafte Verwendung dieser Methode in der
Routine nicht praktikabel.
Eine optimale Vordruck-Einstellung des CI-Gases liegt je nach Gas zwischen 50 und 70 mTorr.
Ein zu niedriger Gasdruck reicht zur Ionenbildung nicht aus, während sich die Anwesenheit von
zuviel Reaktandgas in der Reaktionskammer in einem starken Anstieg der Basislinie zeigt.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 99
Es war jedoch möglich, unter Verwendung der PCI Chromatogramme zu erhalten, die im Bezug
auf das Signal/Rausch-Verhältnis eine Alternative zur Elektronenstoßionisierung darstellten.
Diese Möglichkeit der Ionisierung wurde aber wegen mangelnder Stabilität der
Gerätekonfiguration im PCI-Modus nur dann angewendet, wenn bei der Bestimmung der
Verbindungen in Matrix Zweifel an der Identität der Komponenten bestanden.
Neben den bei der PCI benutzten Gasen kamen bei der Negativen Chemischen Ionisierung noch
des weiteren Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff und Methanol zum Einsatz. Die Gründe für
die notwendige Erniedrigung der Temperatur der Ionenquelle entsprechen denen der Positiven
Chemischen Ionisierung. Auch hier sollte sie zwischen 150 und 200°C liegen. Der Gasvordruck
hingegen sollte bei der NCI mit 70-90 mTorr etwas höher liegen als bei den PCI-Messungen.
Bei der Untersuchung der unterschiedlichen Derivate (TFA, PFP, HFB) zeigte sich sehr schnell,
daß sich zwar bei der Derivatisierung mit steigender Fluoranzahl im Molekül durch das größere
Quantifizierungsion eine Verbesserung des S/N-Verhältnisses einstellte, jedoch konnte dies nicht
die anscheinend fehlende quantitative Umsetzung bei der Reaktion gegenüber den TFA-
Derivaten kompensieren, so daß sich die folgenden Ergebnisse auf ebendiese beziehen. Die
beiden Muttersubstanzen CP und IF ließen sich mit Ausnahme von Methanol von allen CI
negativ ionisieren. Jedoch kam es bei den CI-Gasen Ammoniak, Stickstoff und Argon zu teils
extrem starken Clusterbildungen, was sich in einer starken Reduzierung der Empfindlichkeit
zeigte, da eine scharfe Massentrennung in der Ion Trap nicht mehr möglich war. Bei CP mit
Wasser und bei IF mit Helium konnten hingegen sehr gute S/N-Verhältnisse bei geringer
Fragmentierung festgestellt werden. Aufgrund fehlender zusätzlicher Halogenatome im Molekül
ließ sich das lediglich methylierte KCP mit keinem der getesteten Gase negativ ionisieren. Das
Ifosfamid Analogon hingegen zeigte ein ähnliches Verhalten wie CP und IF. Mit allen
angewendeten CI-Gasen gelang die Ionisiserung, die auch hier bei Argon starke Clusterbildung
hervorrief. Das KIF-Spektrum zeigte bei Wasser-NCI fast ausschließlich das Isotopenpaar
307/309, wodurch ein hoher Responsegewinn einherging. Während beim Carboxyphosphamid
sowohl mit Methan als auch mit Ammoniak NCI-Spektren mit schwacher Fragmentierung
erzeugbar waren, konnten beim Carboxyifosfamid nur mittels Methan saubere Spektren
detektiert werden. Bei der Verwendung von Ammoniak zeigte sich eine sehr starke
Fragmentierung, die es verhinderte, daraus spektrale Informationen zu ziehen bzw. sie zur
Spurenanalytik einzusetzen. Auch das Ifosfamid Mustard ließ sich sowohl mit Methan als auch
mit Ammoniak, nicht jedoch mit den Inertgasen Stickstoff und Helium sowie mit Wasser
ionisieren. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß sich die Chemische Ionisierung in dem
vorliegenden Fall dazu eignet, weitere spektrale Informationen (vor allem die Molmassen) der
Verbindungen zu erhalten.
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 100
Jedoch konnte bis auf die Ionisierung von 4-Keto-Ifosfamid mit Wasser kein Responsegewinn
aus dem Einsatz der Negativen Chemischen Ionisierung im Vergleich mit den entsprechenden
EI-Messungen gezogen werden, wovon aufgrund starker Systembelastung durch das Wasser und
wegen der Vereinheitlichung der Methoden für alle untersuchten Verbindungen Abstand
genommen wurde.
7.3.2.2 Meßtechniken
Schon bei den ersten, für die MS/MS-Technik noch mit unoptimierten Parametern
unternommenen Versuchen zeigte sich die Überlegenheit der MS/MS-Technik gegenüber der
Full Scan- bzw. SIM-Methodik deutlich, wie hier in Abb. 7.10 am Beispiel einer Messung von
Cyclophosphamid und Ifosfamid in einer EtOAc-Standardlösung dargestellt ist. Während hier
das S/N-Verhältnis der Meßsignale im SIM-Lauf etwa doppelt so groß ist wie bei dem
Massenchromatogramm der entsprechenden Full Scan-Messung, verzehnfacht sich dieses
Verhältnis beim MS/MS-Chromatogramm.
Abb. 7.10: Vergleichende Massenchromatogramme eines Full Scan-, SIM- und MS/MS-Laufes (von
oben) für IF (tR: 7,02 min) und CP (tR: 7,51 min)
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0Time (min)
0
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
1000
20
40
60
80
100RT: 7,02 RT: 7,50
RT: 7,02 RT: 7,51
RT: 7,02RT: 7,51
Full ScanS/N 3
SIMS/N 10
MS/MSS/N 50
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 101
Um eine möglichst selektive und sensitive Methodik zu erreichen, war es notwendig, für jede
Komponente verschiedene Vorläufer-Ionen der EI-Massenspektren auszuwählen und mit diesen
dann die Parameter Isolationszeit T, Dissoziationsspannung U, Dissozaitionszeit t und den Ion
Trap-spezifischen q-Wert sowie ein möglichst selektives Tochter-Ion zur Quantifizierung zu
ermitteln. Zur Bestimmung der geeignetsten Vorläufer-Ionen wurden Full Scan-Massenspektren
aufgenommen.
Die jeweiligen S/N-Verhältnisse wurden in den Massenchromatogrammen der einzelnen m/z-
Werten der Verbindungen ausgerechnet und miteinander verglichen. Hierbei wurden die
folgenden Ionen als Vorläufer für die Muttersubstanzen und deren Metaboliten ausgewählt:
Tab. 7.4: Ausgewählte Vorläufer-Ionen zur Entwicklung der MS/MS-Methoden
Substanz CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM d4-CP
Vorläufer-Ion 307 307 239 335 317 324 187 188 311
Bei den Massenchromatogrammen zeigten sich hier bei Messungen aus Standardlösungen und
Realproben die geringsten Einflüsse des Untergrundes auf die Meßempfindlichkeit der
Methoden.
Im nächsten Schritt mußten geeignete Ionen aus dem Tochterspektrum ausgewählt werden, die
zur Auswertung der Meßergebnisse herangezogen werden konnten. Hierfür wurde analog zur
Auswahl der Vorläufer-Ionen verfahren, indem Standardlösungen mit den MS/MS-
Voreinstellungen im Massenspektrometer (T=8ms, t=15ms, U=1V, q=0,450) vermessen und die
S/N-Verhältnisse der entsprechenden Tochtermassen-Chromatogramme verglichen wurden. Die
folgenden sogenannten Qualifier-Ionen wurden ausgewählt:
Tab 7.5: Ausgewählte Qualifier-Ionen zur Entwicklung der MS/MS-Methoden
Substanz CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM d4-CP
Qualifier-Ion 212 212 209 281 231 158 110 63 216
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 102
Bei CP, IF, KIF, IPM und NNM kam es fast aussschließlich zur Bildung der genannten Ionen,
während für die restlichen drei Verbindungen eine stärkere Fragmentierung der Vorläufer-Ionen
nicht zu verhindern war.
Den stärksten Einfluß auf die Ionenausbeute im Tochterionenspektrum hat die
Dissoziationsspannung U. Wird das Qualifier-Ion in Abhängigkeit von ebendieser
Potentialdifferenz betrachtet, so ist zu erkennen, daß die Vorläufer-Ionen für den erneuten
Zerfall Energie aufnehmen müssen, was sich in einem Anstieg des Ionenaufkommens des
Qualifiers zeigt. Nachdem ein Maximum durchlaufen worden ist, geht dieser Wert wieder zurück,
da auch das untersuchte Ion durch die Aufnahme weiterer Energie fragmentiert und somit für die
Auswertung verlorengeht.
Um auch den den Stabilitätsfaktor q in diese Untersuchungen mit einzubeziehen, wurde das
Aufkommen der jeweiligen Qualifier-Ionen in Abhängigkeit von der Dissoziationsspannung bei
den drei Werten für q bestimmt. Hierbei wurde ein interner Standard mit stets denselben
Parametern parallel vermessen, um durch die Verhältnisbildung der Peakflächen des Analyten
und des internen Standards mögliche Abweichungen durch die Injektion in den
Gaschromatographen zu kompensieren. Die Verläufe der Graphen sind in den Abbildungen 7.11
bis 7.13 dargestellt.
Abb. 7.11: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationsspannung bei q = 0,225
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
U in V
F(A
naly
t)/F(
IS)
CPIFKCPKIFCCPCIFIPMNNM
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 103
Abb. 7.12: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationsspannung bei q = 0,300
Abb. 7.13: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationsspannung bei q = 0,450
0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
U in V
F(A
naly
t)/F(
IS)
CPIFKCPKIFCCPCIFIPMNNM
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
U in V
F(A
naly
t)/F(
IS) CP
IFKCPKIFCCPIPM
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 104
Bei der Verwendung des q-Wertes 0,450 ist die obige Untersuchung von Carboxyifosfamid und
Nor Nitrogen Mustard nicht möglich, da die zu beobachtenden Tochterionen m/z-Verhältnisse
von 158 respektive 63 haben. Das kleinste unter diesen Bedingungen in der Ionenfalle
speicherbare Tochter-Ion hat den halben Wert des Vorläufer-Ions, der in diesem Fall 162 bzw.
94 betrüge. Um die Wirkung einer Änderung des Zeitraums, in dem die Vorläufer-Ionen angeregt
werden und zerfallen, und des Stabilitätsfaktors q zu veranschaulichen, ist in den Abbildungen
7.14 und 7.15 die Beeinflussung des Ionenaufkommens durch ebendiese Parameter dargestellt.
Die jeweils anderen Parameter haben die optimierten Werte.
Abb. 7.14: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens von der Dissoziationszeit t
Abb. 7.15: Abhängigkeit des Qualifier-Ionen-Aufkommens vom Stabilitätsfaktor q
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 5 10 15 20 25 30 35
t in ms
F(A
naly
t)/F(
IS)
CP
IF
KCP
KIF
CCP
CIF
IPM
NNM
0,4500,225 0,3000,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
q
F(A
nalyt
)/F(
IS)
CPIFKCPKIFCCPCIFNNMIPM
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 105
Aus den Verläufen dieser Kurven ist ersichtlich, daß die Anzahl der Ionen zumeist mit einem
Anstieg der Dissoziationszeit und mit geringeren q-Werten einhergeht. Daraus wird ersichtlich,
daß die entstehenden Vorläuferionen vergleichsweise stabil sind und eine längere Zerfalls- und
Speicherzeit nicht gleichbedeutend ist mit stärkerer Fragmentierung. Ausnahmen bilden hierbei
4-Keto-Ifosfamid mit einem maximalen Ionenvorkommen bei q=0,300/t=20ms und
Carboxyphosphamid bei q=0,225/t=20ms. Eine Zusammenfassung der Optimierungsversuche
wird in der Tabelle 7.6 dargestellt.
Tab. 7.6: Darstellung der optimierten Parameter
Substanz CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM d4-CP
U/V 0,7 0,7 0,7 0,8 0,6 0,6 0,5 0,5 0,7
T/ms 30 30 30 20 20 30 30 30 30
q 0,225 0,225 0,225 0,300 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 106
7.3.3 Interpretation der Massenspektren
7.3.3.1 Cyclophosphamid
O NP
O
N
ClCl
CF3
O
356
212
307
- CH2Cl
O NP
O
N
Cl
CF3
O
O NP
O
N
Cl
CF3
O
O NP
O
N
Cl
CF3
O
N C CF3P
O
N
Cl
O
O
Abb. 7.16: Mögliches Zerfallsschema von Cyclophosphamid
Tab. 7.7: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
357 [M + H]+ PCI/NH3 271 [320 - CH2Cl]+ EI Full Scan
320 [M - HCl]+ EI Full Scan 176 [212 - HCl]+ EI MS3
285 [320 - Cl]+ EI Full Scan 150 [212 – H2C=CCl] EI MS3
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 107
10
01
502
002
503
003
50
m/z
0
20406080
10
0
EI F
ull
Sca
n
307
212
309
214
150
156
285
120
110
242
271
310
172
217
94
199
322
34
7
100
15
020
02
503
003
50
m/z
0
20
40
60
80
100
Wa
sser
PC
I F
ull
Sca
n
307
30
9
357
212
321
359
262
264
214
242
323
154
15
03
0617
21
863
553
6111
096
10
015
020
02
503
00
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
30
7
212
199
156
176
307
213
308
266
300
245
151
273
100
15
020
02
503
003
50
m/z
0
20
40
60
80
100
Wa
sse
r N
CI F
ull S
can
28
4
320
28
3
28
53
223
5629
32
571
9217
42
822
562
993
573
2323
11
511
37
10
69
6
10
01
201
40
160
180
200
220
240
260
280
30
0
m/z
0
20406080
10
0
EI M
SM
SM
S 3
07
212
156
120
15
0
132
17
61
58 172
138
110
212
289
184
30
228
319
425
024
226
421
3
100
15
020
02
503
003
50
m/z
0
20
40
60
80
100
M
e
th
a
n
P
C
I F
u
ll S
ca
n
2
6
2
3
0
7
3
2
1
2
6
4
3
5
73
5
9
1
5
4
2
2
6
3
2
3
2
4
2
2
1
2
2
6
6
2
9
0
3
2
6
1
3
6
3
6
0
11
6
2
5
9
1
7
2
9
4
1
8
6
2
0
0
Abb. 7.17: Massenspektren von Cyclophosphamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 108
7.3.3.2 Ifosfamid
O NP
O
N
Cl
356
212
307
- CH2Cl
O NP
O
N
Cl
O
O NP
O
N
Cl
CF3
O
N C CF3P
O
N
Cl
O
O
Cl
CF3
O
O NP
O
N
ClCF3
O
CF3
Abb. 7.18: Mögliches Zerfallsschema von Ifosfamid
Tab. 7.8: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
357 [M + H]+ PCI/H2O 284 [320 - HCl]- NCI/CH4
320 [M - HCl]- NCI/CH4NCI/He 184 [212 - H2C=CH2]+ EI MS3
293 [M - CH2CH2Cl]- NCI/CH4 150 [212 - H2C=CCl] EI MS3
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 109
100
150
20
025
030
0
m/z
0
20
40
60
80
100
EI
Fu
ll S
can
21
2
150
307
21
430
91
54
132
22
61
8224
21
84
321
106
122
15
68
227
9
100
15
020
025
030
0
m/z
0
20
40
60
80
100
Me
than
NC
I F
ull
Sca
n
293
284
320
295
32
23
072
43
257
283
18
71
61
198
24
2
100
150
200
250
300
m/z
0
20
40
60
80
100
EI
MS
MS
307
21
2
279
100
150
200
25
030
0
m/z
0
20
40
60
80
100
Hel
ium
NC
I F
ull S
can
294
320
295
285
322
283
19
42
962
43
100
15
02
00
250
300
m/z
0
20
40
60
80
100
EI
MS
MS
MS
30
7 21
2
15
0
134
18
41
56
106
100
150
20
02
503
003
50
m/z
0
20
40
60
80
100
�������������� ���
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Abb. 7.19: Massenspektren von Ifosfamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 110
7.3.3.3 4-Keto-Cyclophosphamid
O NP
O
N
ClCl
CH3
288
239
- CH2Cl
O NP
O
N
CH2Cl
CH3
O
O
209- 2*CH3
Abb. 7.20: Mögliches Zerfallsschema von 4-Keto-Cyclophosphamid
Tab. 7.9: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
307 [M + H + H2O] PCI/NH3 253 [M + H - HCl]+ PCI/CH4
289 [M + H]+ PCI/CH4 240 [M + H - H2CCl]+ PCI/NH3
257 [239 + NH4]+ PCI/NH3 216 [M - HCl - HCl]- NCI/NH3
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 111
809
010
011
01
20
130
140
150
16
017
018
019
02
00
210
220
230
240
250
m/z
0
20406080
10
0
EI
Fu
ll S
can
239 2
41
209
15
68
41
481
82
211
18
515
817
424
29
212
81
202
081
491
88
94
203
115
106
16
213
82
371
68
132
248
220
142
90
197
98
10
923
22
182
29
801
001
20
140
160
180
200
220
240
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
23
9
209
156
185
174
186
159
146
12
01
8284
208
128
200
169
138
92
148
10
611
62
192
3922
8
15
02
0025
030
0
m/z
0
20
40
60
80
100
Am
mon
iak
PC
I Ful
l Sca
n
307 30
9
290
292
240
25
431
12
57
274
242
318
168
106
195
138
176
239
204
12
315
3
10
01
50
20
02
50
300
m/z
0
20406080
10
0
Met
han
PC
I Fu
ll S
can
289
291
253
239
255
29
330
63
19
174
25
611
686
199
106
235
222
287
140
160
10
015
020
025
030
0
m/z
0
20
40
60
80
100
Am
mo
nia
k N
CI F
ull
Sca
n
215 21
6
21
31
9418
828
625
824
81
36
160
305
238
117
326
268
113
187
98
Abb. 7.21: Massenspektren von 4-Keto-Cyclophosphamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 112
7.3.3.4 4-Keto-Ifosfamid
O NP
O
N
Cl
370
335
- Cl
Cl
CF3
O
O NP
O
N
ClCF3
O
O
O NP
O
N
ClCF3
O
321
N
ClCF3
O
175
O NP
O-
- CH2Cl
Abb. 7.22: Mögliches Zerfallsschema von 4-Keto-Ifosfamid
Tab. 7.10: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
371 [M + H]+ PCI/H2O 307 [M - CH2CH2Cl]+ NCI/CH4
335 [M - Cl]+ EI Full Scan 240 [M - Cl - NCCF3]+ EI MSMS
321 [M - CH2Cl]+ EI Full Scan 175 [N(CH2CH2Cl)COCF3]+ EI MSMS
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 113
10
015
020
025
030
035
0
m/z
0
20406080
10
0
EI
Fu
ll S
can
33
5
24
02
81
187
321
337
122
18
418
92
422
83
152
96
299
255
158
148
201
239
98
33
8
100
15
020
025
03
0035
0
m/z
0
20406080
100
Me
tha
n N
CI
Fu
ll S
can
30
7 309
212
212
100
150
200
250
300
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
335
281
24
017
525
529
13
091
6118
42
63
160
23
72
01
116
22
9
100
150
20
02
503
003
50
m/z
0
20406080
100
Was
ser
PC
I Ful
l Sca
n
335
240
321
337
17
83
71
214
242
28
13
7315
814
818
72
3929
912
23
70
244
201
273
237
99
100
150
200
250
300
m/z
0
20406080
10
0
EI M
SM
SM
S 3
35
281
237
20
1
175
127
139
18
92
55
100
15
020
025
03
0035
0
m/z
0
2
0
4
0
6
0
8
0
1
0
0
W
a
sse
r N
C
I F
u
ll S
ca
n
3
0
73
0
9
2
1
2
2
7
1
Abb. 7.23: Massenspektren von 4-Keto-Ifosfamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 114
7.3.3.5 Carboxyphosphamid
O OP
O
NHN
CF3
O
O OP
O
N
CF3
O
N
Cl
O OP
O
N
CF3
O
N
- HCl
- CH2Cl
317
366
402
H2CO
P
O
N
CF3
O
N
259
OP
O
N
CF3
O
N
231
OP
O
N
CF3
O
N
245
- HCl
O OP
O
N
CF3
O
N
330
O
O- CH
O
O
CH-
O
O-
Cl
Cl
O
O
O
O
Abb. 7.24: Mögliches Zerfallsschema von Carboxyphosphamid
Tab. 7.11: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
384 [M - H2O]+ PCI/NH3 367 [M + H - HCl]+ PCI/CH4
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 115
8010
01
201
40
16
018
020
02
202
4026
028
030
03
20
m/z
0
20406080
10
0
EI F
ull
Sca
n
15
1
231
317
25
92
45
285
263
218
202
24
41
52
10
82
991
39
169
160
87
183
100
150
20
02
5030
0
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
31
7
151
231
24
5
263
285
169
10
01
502
00
250
300
350
400
m/z
0
20406080
100
Me
than
PC
I F
ull
Sca
n
281
298
352
367
335
300
201
369
245
259
87
151
18
62
31
384
100
150
20
02
5030
0
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
MS
317
231
20
2
139
151
169
183
129
21
91
0898
10
01
502
00
250
300
350
400
m/z
0
20406080
100
A
m
m
o
n
ia
k P
C
I F
u
ll S
ca
n
3
8
4
2
9
8
3
8
6
3
5
2
3
5
1
3
0
0
3
5
4
1
5
1
2
7
6
2
6
2
2
4
8
Abb. 7.25: Massenspektren von Carboxyphosphamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 116
7.3.3.6 Carboxyifosfamid
O OP
O
NNH
402
Cl
Cl
CF3
O
O
324
-
238
O OP
O
N
ClCF3
O
O
OCH
HOP
O
N
Cl
CF3
O
O
- 176
P
N
CF3
O
HO OH
- H2O
P
N
CF3
O
O
158
HN
Cl
-
Cl
Abb. 7.26: Mögliches Zerfallsschema von Carboxyifosfamid
Tab. 7.12: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum
404 [M – CH3Cl +(NH3)2*NH4]+ PCI/NH3
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 117
100
15
020
02
5030
03
504
00
45
050
05
5060
06
5070
0
m/z
0
20406080
10
0
EI F
ull
Sca
n
169
174 178
324
8719
11
60
112
92
326
228
283
192
140
126
230
273
309
284
37
22
2434
93
83
459
42
64
91
41
84
4056
053
64
695
785
956
70
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
m/z
0
20406080
10
0
EI
MS
MS
32
4
176
238
325
326
22
61
611
3927
92
8229
52
02
24
62
702
621
06
300
318
218
188
306
25
211
612
911
715
22
29
20
01
381
741
77
801
00
120
14
016
018
020
02
202
402
602
803
00
32
03
40
360
380
400
420
440
460
480
500
m/z
0
20406080
10
0
Am
mo
niak
PC
I F
ull
Sca
n
40
4 40
6
862
77
318
9240
737
233
93
00
352
265
18
320
33
8422
924
59
42
90
402
219
140
420
127
165
112
443
157
485
45
04
684
98
Abb. 7.27: Massenspektren von Carboxyifosfamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 118
7.3.3.7 Ifosfamid Mustard
OP
O
NNH
Cl
Cl
CF3
O
330
OP
O
NNH
ClCF3
O
281
- CH2Cl - HCl
OP
O
N
CF3
O
N
Cl
293
Abb. 7.28: Mögliches Zerfallsschema von Ifosfamid Mustard
Tab. 7.13: Weitere mögliche Fragmentierungen
m/z Spezifisches Ion Spektrum m/z Spezifisches Ion Spektrum
331 [M + H]+ PCI/CH4 295 [M + H - HCl]+ PCI/CH4
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 119
100
150
200
250
300
m/z
020406080100
EI F
ull
Sca
n
187 18
92
81
120
293
200
156
94
124
186
201
295
110
165
96
216
151
5060
708
090
100
110
m/z
020406080
100
EI
MS
MS
MS
187
110
110
69
60
8010
01
2014
016
018
0
m/z
020406080100
EI
MS
MS
187
110
158
100
150
20
025
030
035
0
m/z
020406080
100
Met
han
PC
I F
ull S
can
331
156
295
174
176
333
158
201
330
811
872
3717
314
01
2211
133
531
228
02
32
243
214
922
52
Abb. 7.29: Massenspektren von Ifosfamid Mustard
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 120
7.3.3.8 Nor Nitrogen Mustard
N
Cl
Cl
F3C
O
237
N
Cl
CH2
F3C
O
188
- CH2Cl - Cl
N
Cl
CH2
F3C
O
202
N
CH2
F3C
HO
126
Cl-
NH
Cl
F3C
O
63
-
Abb. 7.30: Mögliches Zerfallsschema von Cyclophosphamid
7 Spurenanalytisches Bestimmungsverfahren 121
6080
10
01
20
14
01
60
18
02
00
22
02
40
m/z
020406080100
EI F
ull S
can
18
8
63
190
69
20
21
26
20
17
820
45
65
11
66
70
237
127
170
909
620
51
06
111
14
28
41
83
14
81
33
15
82
17
118
229
199
60
801
00
120
14
01
601
80
200
220
24
0
m/z
020406080100
EI
MS
MS
18
8
63
12
65
618
87
811
015
21
236
91
44
17
71
06
88
96
51
127
Abb. 7.31: Massenspektren von Nor Nitrogen Mustard
8 Validierung der entwickelten Methoden 122
8 Validierung der entwickelten Methoden
Im Zuge von GLP (Gute Labor Praxis) und Qualitätssicherung beschäftigt sich dieses Kapitel
mit der Validierung der Methoden und der erhaltenen Analysenergebnisse. Nach Bosshardt und
Schorderet wird unter der Validierung die Gesamtheit aller sich über Planung, Ausführung und
Dokumentation erstreckenden Maßnahmen, die die Gültigkeit einer analytischen Methode
beweisen, verstanden [165].
Das System der Analytischen Qualitätssicherung (AQS) schreibt neben einer Vorbereitungsphase,
die sich unter anderem mit der Auswahl geeigneter Untersuchungsverfahren und der
Bestimmung interner Verfahrenskenndaten beschäftigt, eine interne und externe
Qualitätssicherung vor. Abschließend ist eine Auswertung und Dokumentation des
Untersuchungsvorhabens vorzunehmen. Im folgenden werden die im speziellen auf die GC-MS-
Untersuchungen bezogenen Ergebnisse vorgestellt.
8.1 Interne Qualitätssicherung
Zur internen Qualitätssicherung gehören im Bezug auf Untersuchungsvorhaben mit GC-MS-
Komponenten in erster Linie gerätespezifische Kontrollen. Um reproduzierbare
Analysenergebnisse zu erhalten, war es notwendig, mindestens einmal pro Woche oder bei
Veränderungen am System (Reinigung mit damit verbundenem vollständigen Verlust von
Vakuum, Trennsäulen-, Ion volume-Wechsel u.a.) das Massenspektrometer zu tunen, also die
zum optimalen Speichern und Detektieren der Ionen notwendigen Spannungen der Elektronen-
Linsen und der Ionenfalle einzustellen, den sogenannten Tune-Report auszudrucken und in
einem Journal für Qualitätssicherung abzuheften. Eine darauffolgende Überprüfung der
Retentionszeiten bedingte das wiederholte Injizieren entsprechender Standardlösungen.
Um die Nachweisstärke des Massenspektrometers und damit auch die Ergebnisse der Analysen
vergleichbar zu machen, wurde in regelmäßigen Abständen eine Spezifikationslösung mit 100pg
Decafluorbenzophenon vermessen und das entsprechende Signal/Rausch-Verhältnis mit einem
in der Gerätesoftware vorhandenen Algorithmus berechnet. Laut Gerätehersteller muß dieser
Parameter mindestens einen Wert von 250 haben. Es wurden in der Praxis jedoch auch noch
Verhältnisse von 100 akzeptiert.
8 Validierung der entwickelten Methoden 123
Eine weitergehende und in den Richtlinien für eine interne Qualitätssicherung vorgeschlagene
Überprüfung durch das Vermessen methanolischer Lösungen der Analyten konnte mangels
ensprechender zertifizierter Standards nicht durchgeführt werden.
In den folgenden Abschnitten werden nun die weiteren substanzbezogenen Punkte der internen
Qualitätssicherung wie Kalibrierung der Methoden, Wiederfindungsraten sowie
Standardabweichungen dargestellt. Hierfür wurde Oberflächenwasser, das in Stichproben aus vier
verschiedenen Teichen auf dem Gelände der Ruhr-Universität Bochum, aus dem Kemnader
Staussee sowie der Ruhr gezogen wurde, verwendet. Die aus dem Freiland stammenden Proben
unterlagen naturgemäß jahreszeitlichen und witterungsbedingten Schwankungen im Aufkommen
von Matrixbelastungen.
8.1.1 Kalibrierung
Aus Meßsignalen werden analytische Informationen, in der Regel Massen- bzw.
Konzentrationsdaten erhalten. Die Abhängigkeit eines Meßsignals von der Konzentration eines
Analyten wird als Analysenfunktion bezeichnet und experimentell auf dem Wege der
Kalibrierung bestimmt. Im Falle linearer Abhängigkeit der Signale vom Analysenwert stellt die
Steigung der Kalibriergeraden die Empfindlichkeit des Verfahrens dar.
Bei der Präparation der Lösungen zur Kalibrierung wurden jeweils 500mL Oberflächenwasser in
einem Vorratsbehältnis vorgelegt, mit Pufferlösung auf die entsprechenden pH-Werte eingestellt
und mit internem Standard im zu erwartenden Konzentrationsbereich des Analyten versetzt. Bis
auf die Bestimmung der Validierungsdaten von Nor Nitrogen Mustard, bei dem Ifosfamid
Mustard zum Einsatz kam, wurden alle Untersuchungen bezüglich der Validierungsdaten mit
dem isotopenmarkierten Cyclophosphamid (d4-Cyclophosphamid, d4-CP) durchgeführt. Um die
oben erwähnten Inhomogenitäten in Material und Proben sowie Abweichungen im Gerätesystem
zu kompensieren, wurden diese Untersuchungen mit einem internen Standard vorgenommen.
Diese auch Surrogat-Standard genannte Substanz wurde schon der Originalprobe hinzugegeben,
um die Effektivität einzelner Aufarbeitungsschritte überprüfen zu können. Diese Verbindung
darf naturgemäß nicht im Untersuchungsmaterial enthalten sein und sollte sich grundsätzlich
chromatographisch und chemisch ähnlich wie die zu untersuchenden Komponenten verhalten.
8 Validierung der entwickelten Methoden 124
Von der Verwendung eines externen Standards wurde deshalb abgesehen, weil hierbei schon
geringe Veränderungen bei der Injektion und im Massenspektrometer erhebliche Auswirkungen
auf das Ergebnis haben.
Generell wurden bei allen quantitativen Untersuchungen nach dem Vermessen der Lösungen die
Konzentrationen der Analyten mit dem Peakflächenverhältnis F(Analyt) zu F(IS) in Relation
gesetzt. Das Höhenverhältnis der Peaks kann nur bei Peaks mit nahezu Gaußschen Konturen
[166] zum Einsatz kommen, da diese dann annähernd gleiche Halbwertsbreiten haben. Kommt
es bei einem der Peaks zu Tailing bzw. Fronting oder eluieren die Peaks mit stark
unterschiedlichen Retentionszeiten, so ist es notwendig, die Kalibrierung über die Flächen
unterhalb der jeweiligen Peaks vorzunehmen.
8.1.2 Wiederfindungsrate
Zur quantitativen Charakterisierung eines Anreicherungsverfahrens soll im Rahmen der internen
Qualitätssicherung stets eine sogenannte Wiederfindungsrate angegeben werden, worunter das
Verhältnis der Konzentrationen nach und vor der Anreicherung verstanden wird, das über einen
möglichst großen Bereich konzentrationsunabhängig sein sollte.
Die wäßrigen und gepufferten Proben wurden vor der Anreicherung mit dem gewünschten
Volumen eines oder mehrerer Zytostatika versetzt und die Analyten mit den optimierten
Parametern der Probenvorbereitung aus der Vorlage extrahiert und anschließend analysiert. Zur
Bestimmung der Wiederfindungsrate wurde parallel die gleiche Absolutmenge an Analyt in einer
EtOAc-Lösung geringen Volumens ohne Anreicherung derivatisiert und mit der GC-MS
vermessen.
Um auch hier Fehler durch das System auszuschließen, aber auch um die Verluste durch die
Anreicherung bestimmen zu können, wurden nach der Extraktion entsprechende Mengen an
dem in der Probenmatrix nicht vorhandenen Standard d4-Cyclophosphamid respektive Ifosfamid
Mustard zur organischen Phase gegeben. Zur Auswertung wurden nach der Messung die
Verhätnisse der jeweiligen Chromatogramm-Flächen der Zytostatika und des Standards gebildet
(Formel 8.1). Die Quantifizierung der Wiederfindungsrate erfolgte anschließend über den
Vergleich ebendieser Verhältnisse von Probe und Standard.
8 Validierung der entwickelten Methoden 125
Es gilt:
%100)()(
)()(
Prtan
tanPr ∗∗
∗=ISFAnalytF
ISFAnalytFWFR
obedardS
dardSobe (Formel 8.1)
mit FProbe(Analyt, IS): Chromatogrammfläche der Probenlösung
FProbe(Analyt, IS): Chromatogrammfläche der Standardlösung
8.1.3 Standardabweichung
Die Standardabweichung S ist ein Maß für die Größe des Zufallsfehlers in einer Meßreihe [167]
und kann somit als Anhaltspunkt für die erreichte Präzision dienen. Für das Gesamtverfahren
wurde sie stets mit sechs verschiedenen Proben gleicher Konzentration bestimmt.
Es gilt nach [168]:
S nx xi m
i
n
=−
−−∑1
12
1
( ) (Formel 8.2)
mit S: Standardabweichung
xi - xm: Absolute Abweichung der Einzelwerte vom Mittelwert
n: Anzahl der Meßwerte
Für die Ermittlung der Standardabweichungen der Zytostatika und ihrer Metabolite wurden
wiederum 500mL Oberflächenwasser vorgelegt, gepuffert, mit internem Standard (Surrogat-
Standard) versetzt und anschließend mit dem in den Kapiteln 7 und 8 beschriebenen optimierten
Verfahren analysiert. Die Berechnung der Zahlenwerte der Standardabweichung erfolgte durch
Bildung des Verhältnisses der Chromatogramm-Flächen der Analyten und des internen Standards
und dem abschließenden Einsetzen der ermittelten Daten in die obige Gleichung.
8 Validierung der entwickelten Methoden 126
8.1.4 Bestimmungsgrenze
Der kleinste, mit ausreichend statistischer Sicherheit erfaßbare Meßwert hängt von der
Empfindlichkeit des Verfahrens, das heißt von der Steigung der Kalibriergeraden, vom Blindwert
und von dessen Streuung ab. Es wird festgelegt, daß die Entscheidungsgrenze so zu ziehen ist,
daß das kleinste von der Substanz detektierbare Signal deutlich von einem Blindwert
unterschieden werden kann. Um falsch-positive Aussagen der Analysen zu vermeiden, wurden
bei jeder Kalibrierung und Quantifizierung diese substanzfreien Proben mit verarbeitet. Vor
allem im Bereich der Bestimmungs- oder Nachweisgrenzen erschien dies indiziert, da schon eine
geringe Verschleppung aus vorangegangenen Analysen einen falschen Befund erbringen kann.
Eine Substanz gilt als detektiert, wenn das Substanzsignal ein bestimmtes Vielfaches der
Rauschbreite übersteigt. Dieser Wert für die Nachweisgrenze wurde hier willkürlich auf 3
angesetzt und wird stets in der Substanzdomäne (ng/L oder µg/L) angegeben.
Bei der Bestimmungsgrenze handelt es sich ebenfalls um eine Substanzmenge oder
Konzentration in der Substanzdomäne. Sie ist im Gegensatz zur Nachweisgrenze statistisch
abgesichert und gibt die untere Grenzkonzentration an, die eindeutig quantitativ erfaßt werden
kann und sich signifikant vom Blindwert unterscheidet. Übertragen auf das Signal/Rausch-
Verhältnis wurde dies mit einem Wert von 10 festgelegt.
8.1.5 Ergebnisse
Im folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Bestandteile der internen Qualitätssicherung
jeweils für eine Substanz zusammenfassend tabellarisch aufgeführt. Die Vertrauensbereiche der
Kalibrierfunktion sind mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit α von 0,05 - also 5% - bestimmt
worden.
8 Validierung der entwickelten Methoden 127
8.1.5.1 Cyclophosphamid
Abb. 8.1: Kalibrierfunktion von Cyclophosphamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100ng/L
y-Achsenabschnitt a: 0,025
Konfidenzbereich für a: 0,308
Steigung b: 0,039
Konfidenzbereich für b: 0,005
Korrelationskoeffizient r: 0,999
Wiederfindungsrate (100 ng/L): 94,7 % (d4-CP: 93,0 %)
Standardabweichung (100 ng/L): 10,7 % (d4-CP: 6,7 %)
Bestimmungsgrenze: 1 ng/L
Nachweisgrenze: 500 pg/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 128
8.1.5.2 Ifosfamid
Abb. 8.2: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Ifosfamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100ng/L
y-Achsenabschnitt a: 0,013
Konfidenzbereich für a: 0,056
Steigung b: 0,008
Konfidenzbereich für b: 0,005
Korrelationskoeffizient r: 0,999
Wiederfindungsrate (100 ng/L): 111,3 %
Standardabweichung (100 ng/L): 17,1 %
Bestimmungsgrenze: 5 ng/L
Nachweisgrenze: 1 ng/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 129
8.1.5.3 4-Keto-Cyclophosphamid
Abb. 8.3: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von 4-Keto-Cyclophosphamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: 0,506
Konfidenzbereich für a: 13,335
Steigung b: 0,751
Konfidenzbereich für b: 0,233
Korrelationskoeffizient r: 0,995
Wiederfindungsrate (10 µg/L): 77,6 %
Standardabweichung (10 µg/L): 12,5 %
Bestimmungsgrenze: 5 µg/L
Nachweisgrenze: 1 µg/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 130
8.1.5.4 4-Keto-Ifosfamid
Abb. 8.4: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von 4-Keto-Ifosfamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: -1,480
Konfidenzbereich für a: 6,810
Steigung b: 0,342
Konfidenzbereich für b: 0,119
Korrelationskoeffizient r: 0,993
Wiederfindungsrate (10 µg/L): 72,4 %
Standardabweichung (10 µg/L): 16,5 %
Bestimmungsgrenze: 1 µg/L
Nachweisgrenze: 500 ng/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 131
8.1.5.5 Carboxyphosphamid
Abb. 8.5: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Carboxyphosphamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: 0,121
Konfidenzbereich für a: 0,283
Steigung b: 0,018
Konfidenzbereich für b: 0,005
Korrelationskoeffizient r: 0,996
Wiederfindungsrate (10 µg/L): 61,3 %
Standardabweichung (10 µg/L): 31,7 %
Bestimmungsgrenze: 10 µg/L
Nachweisgrenze: 5 µg/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 132
8.1.5.6 Carboxyifosfamid
Abb. 8.6: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Carboxyifosfamid in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: 0,149
Konfidenzbereich für a: 0,817
Steigung b: 0,129
Konfidenzbereich für b: 0,014
Korrelationskoeffizient r: 0,999
Wiederfindungsrate (10 µg/L): 66,2 %
Standardabweichung (10 µg/L): 16,2 %
Bestimmungsgrenze: 5 µg/L
Nachweisgrenze: 1 µg/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 133
8.1.5.7 Ifosfamid Mustard
Abb. 8.7: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Ifosfamid Mustard in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 1, 25, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: 0,029
Konfidenzbereich für a: 0,066
Steigung b: 0,002
Konfidenzbereich für b: 0,001
Korrelationskoeffizient r: 0,980
Wiederfindungsrate (10 µg/L): 103,6 %
Standardabweichung (10 µg/L): 18,6 %
Bestimmungsgrenze: 5 µg/L
Nachweisgrenze: 1 µg/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 134
8.1.5.8 Nor Nitrogen Mustard
Abb. 8.8: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Nor Nitrogen Mustard in Oberflächenwasser
Kalibrierpunkte: 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100 µg/L
y-Achsenabschnitt a: 0,096
Konfidenzbereich für a: 0,157
Steigung b: 0,056
Konfidenzbereich für b: 0,003
Korrelationskoeffizient r: 0,999
Wiederfindungsrate (1 µg/L): 110,9 %
Standardabweichung (1 µg/L): 9,9 %
Bestimmungsgrenze: 500 ng/L
Nachweisgrenze: 100 ng/L
8 Validierung der entwickelten Methoden 135
8.2 Externe Qualitätssicherung
Eine Möglichkeit zur Überprüfung und Absicherung der entwickelten Anreicherungs- und
Bestimmungsverfahren sowie der Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse bietet die
Durchführung von Ringversuchen. Es handelt sich hierbei um ein Experiment, bei dem mehrere
Laboratorien ein identisches Material auf die gleiche Meßgröße hin untersuchen und die Resultate
vergleichend beurteilen. Ringversuche dienen dazu, die Qualität von Analysenmethoden oder
Laboratorien zu beurteilen und sind somit ein wichtiger Bestandteil der externen
Qualitätssicherung. Sie unterscheiden sich im Hinblick auf die Zielsetzung sowie die Art und
Weise der Teilnahme und der Teilnehmer. So können Ringversuche zum Ziel haben, Verfahren
zu standardisieren oder der Laborüberwachung zu dienen. Der Kreis der Laboratorien kann
national begrenzt sein, oder aber der Ringversuch kann auf internaltionaler Ebene stattfinden
[169-171]
In den beiden vorliegenden Fällen, an denen der Autor zwecks Überprüfung der
Leistungsfähigkeit der entwickelten Methoden teilgenommen hat, handelte es sich um
Ringversuche, die durchgeführt wurden, um sowohl eine geeignete Gerätekonfiguration für die
Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid in physiologischen und Umweltmatrices zu
eruieren als auch eine Auswahl der teilnehmenden Laboratorien für entsprechende Monitoring-
Untersuchungsvorhaben zu treffen.
8.2.1 Ringversuch – Urin
Dieser vom Institut und der Poliklinik für Arbeits- und Umweltmedizin der Ludwig-Maximilians-
Universität München durchgeführte Ringversuch fand im Rahmen eines dortigen
Untersuchungsvorhabens mit dem Titel „Untersuchung einer möglichen Gesundheitsgefährdung
durch berufliche Exposition gegenüber Zytostatika“, das u.a. vom Bundesministerium für
Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie gefördert wurde, statt. Ziel dieser Studie war
die quantitative Erfassung einer Gesundheitsgefährdung von Mitarbeitern in der zentralen
Zytostatikazubereitung von Apotheken und vom Pflegepersonal auf onkologischen Stationen.
Zur Quantifizierung der Exposition wurde bei 100 Probanden mehrfach ein Biomonitoring
durch fraktionierte Sammlung der jeweiligen 24-Stunden-Urine durchgeführt.
8 Validierung der entwickelten Methoden 136
Im Zuge der Validierung der Methoden wurde ein Ringversuch mit fünf Teilnehmern aus drei
europäischen Ländern (Frankreich, Niederlande, Deutschland) durchgeführt. Die Extraktion
einer Cyclophosphamid-Konzentration von 1µg/L Urin mittels Flüssig/Flüssig-Extraktion und
die analytische Bestimmung durch eine GC-MS-Kopplung wurde vorgeschrieben. Die
zugesandten zwei Urin-Proben und eine entsprechende Kalibrierung (Abb.8.8, r=0,993) mit
dotiertem, vorher auf den Blindwert getesteten Eigenurin im angegebenen
Konzentrationsbereich wurden wie folgt analysiert:
Es wurden 500µL der Urinprobe in einem 2,0mL-Safe-Lock-Präparateglas vorgelegt, mit
ebenfalls 0,5mL einer auf pH 4 eingestellten Pufferlösung (0,01M KH2PO4/P4O10) versetzt und
eine Minute mit dem Vortex-Mixer geschüttelt. Die sich daran anschließende dreimalige
Extraktion erfolgte mit jeweils 0,5mL Ethylacetat. Nach fünf Minuten Schütteln und
zehnminütiger Zentrifugation bei 13.000 Umin-1 wurde die obere organische Phase mit einer
Pipette abgetrennt. Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt. Die vereinigten EtOAc-Phasen
wurden mit Hilfe der Gasbrücke in einem Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) bis zur Trockne
eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100µL EtOAc aufgenommen und mit der gleichen Menge
an Trifluoressigsäureanhydrid versetzt. Die einstündige Derivatisierung erfolgte bei 70°C im
Thermoschüttler. Nach dem erneuten Abblasen der überschüssigen Lösungsmittel wurde 1µL
dieser Lösung injiziert und in einem SIM-Lauf mit dem GCQ-Massenspektrometer analysiert.
Abb. 8.8: Kalibrierfunktion für die Bestimmung von Cyclophosphamid in Urin
8 Validierung der entwickelten Methoden 137
Die Proben wurden dreimal auf die gleiche Weise im Abstand einiger Tage aufgearbeitet, und die
Ermitllung durch Einsetzen in die Kalibrierfunktion ergab folgende Ergebnisse:
Tab. 8.1: Ergebnisse des Ringversuchs „Cyclophosphamid in Urin“ (1999) in ng/L
Probe 1 Probe 2
Messung 1 4,0 0,9
Messung 2 4,1 1,0
Messung 3 3,9 0,9
Labor-Mittelwert 4,0 0,9
Standardabweichung 2 % 13 %
Referenzwert 4,1 0,9
Sollwert 4,9 1,1
8.2.2 Ringversuch – Abwasser
Die Validierung einiger Nachweisverfahren für die Analyse von Umweltrealproben erfolgte durch
die Teilnahme am Ringversuch „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“, der von
der Bund-Länder-Arbeitsgemeinschaft Chemikaliensicherheit (BLAC) durchgeführt wurde. Im
Rahmen des Untersuchungsvorhabens „Verhalten von Zytostatika in der Umwelt, insbersondere
in Abwässern, Gewässern und Kläranlagen“, an dem auch der Autor teilnahm, wurde zur
externen Qualitätssicherung vom Bayrischen Landesamt für Wasserwirtschaft dieser aufwendige
Ringversuch zur Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid in Oberflächengewässern
und verschiedenen kommunalen Abwässern als Teil eines Vorhabens, das noch weitere
Pharmazeutika größerer Anzahl umfaßt, initiiert. Es nahmen sieben Laboratorien aus dem
gesamten Bundesgebiet teil.
Neben der Vorgabe, daß die Anreicherung der Analyten durch eine Festphasen-Extraktion und
das analytische Bestimmungsverfahren mit einer GC-MS erfolgen sollte, waren die wäßrigen,
teilweise stark matrixbelasteten Proben vor der Extraktion mit einem Glasfilter Nr. 8
aufzureinigen, während der Rückstand nicht erneut mit einem Lösungsmittel eluiert werden
sollte. Des weiteren mußten für die unterschiedlichen Matrices folgende Bestimmungsgrenzen
erreicht werden:
8 Validierung der entwickelten Methoden 138
Tab. 8.2: Zu erreichende Bestimmungsgrenzen
Probe Zu erreichende Bestimmungsgrenzen
Standardprobe gelöst in Methanol/1-15% ACN 1 µg/L
Oberflächenwasser (aufgestockt) 25 ng/L
Kommunales Abwasser 50 ng/L
Kommunales Abwasser (aufgestockt) 50 ng/L
Die Aufarbeitung der wäßrigen Proben erfolgte mit dem optimierten Verfahren, das im Anhang
(Kapitel 11) in Form einer Arbeitsanweisung zusammengefaßt ist.
Zur Quantifizierung wurde bei den verschiedenen Matrices differenziert vorgegangen. Während
beim Oberflächenwasser eine Vier-Punkt-Kalibrierung für die beiden Analyten vorgenommen
wurde, war dies bei den Abwasserproben aufgrund erheblicher Unterschiede in der Belastung
und mangels undotierter Matrix nicht möglich. Der zu geringe Umfang der Probe verhinderte
eine Konzentrationsermittlung mit dem Standardadditionsverfahren.
In diesem Fall kam der sogenannte Responsefaktor zum Einsatz, der es ermöglicht, mit geringem
Aufwand akzeptable Ergebnisse zu liefern. Es handelt sich hierbei um einen
Proportionalitätsfaktor für die Umwandlung von Peakflächen in Mengenwerte einzelner
Komponenten. Es wird davon ausgegangen, daß sich das Verhältnis der Fläche des Analyten und
der eingesetzten Menge an Substanz in einem kleinen Konzentrationsbereich proportional zum
entsprechenden Verhältnis eines Standards verhält (Formel 8.3). Somit gilt:
AnalytdardS
dardSAnalyt
MF
MFf
∗∗
=tan
tan
(Formel 8.3)
Ist dieser Faktor für den erwarteten Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt und die
Realprobe mit der gleichen Menge an Standard vermessen worden, so ist es möglich, durch
Verwendung des Responsefaktors und der obigen Gleichung die Menge an vorliegendem
Analyten zu beziffern. Die Ergebnisse der Untersuchungen im Rahmen dieses Ringversuches
sind den Tabellen 8.3 und 8.4 zu entnehmen.
8 Validierung der entwickelten Methoden 139
Tab. 8.3: Ergebnisse des Ringversuchs „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“ (2000) für
Cyclophosphamid
Oberflächenwasser
KommunalesAbwasser
KommunalesAbwasser
(aufgestockt)Standardlösung
Bestimmung überKalibriergerade 56 ng/L / / /
Bestimmung überResponsefaktor 58 ng/L < 10ng/L 284 ng/L 154 µg/L
Referenzwert 55 ng/L 0 ng/L 160 ng/L 150 µg/L
Sollwert 82 ng/L 139 ng/L 253 ng/L 188 µg/L
Tab. 8.4: Ergebnisse des Ringversuchs „Arzneimittel-Wirkstoffe in der aquatischen Umwelt“ (2000) für
Ifosfamid
Oberflächenwasser
KommunalesAbwasser
KommunalesAbwasser
(aufgestockt)Standardlösung
Bestimmung überKalibriergerade 113 ng/L / / /
Bestimmung überResponsefaktor 126 ng/L < 10ng/L 93 ng/L 113 µg/L
Referenzwert 95 ng/L 0 ng/L 80 ng/L 100 µg/L
Sollwert 101 ng/L 0 ng/L 103 ng/L 122 µg/L
Der Referenzwert gibt die vom Veranstalter des Ringversuches hinzugesetzte Dotierung der
jeweiligen Komponenten an, während es sich bei dem Sollwert um einen empirischen Wert
handelt, genauer um den Mittelwert der von sieben teilnehmenden Laboratorien abgegebenen
positiven Befunde.
8 Validierung der entwickelten Methoden 140
8.3 Diskussion
Die Durchführung einer umfassenden internen und externen Qualitätssicherung bezüglich der
Bestimmung pharmazeutischer Substanzen und deren Stoffwechselprodukte in aquatischen
Umweltkompartimenten ist notwendig, um zu zeigen, daß es sich bei den entwickelten
Analysemethoden um genaue und robuste Verfahren handelt. Hierzu wurden für die Validierung
der entwickelten Verfahren eine Reihe von Untersuchungen in den beiden oben stehenden
Kapiteln durchgeführt.
Der fortlaufende Einsatz der verwendeten Methoden für die Aufbereitung und Bestimmung zur
Analyse einer großen Zahl Proben verschiedenster Art stellt die Robustheit der Verfahren unter
Beweis. Die für die Entwicklung und Validierung der Methoden verwendeten Probenmatrices
wurden zu verschiedenen Zeiten im Jahr und an verschiedenen Orten gezogen, was eine teils
starke jahreszeitlich und umweltbedingte Varietät dieser Matrix erzeugt.
Zur Quantifizierung der Zytostatika-Gehalte wurden mittels internem Standard 4- bis 6-Punkt-
Kalibriergeraden erstellt, deren Funktionen zur Bestimmung verwendet werden konnten. Hierbei
handelt es sich um Kalibrierungen, die die gesamte Aufbereitung und die chromatographische
Auswertung beinhalten. Es ist nicht möglich, bezüglich zu derivatisierender Verbindungen nur
die Linearität der gaschromatographischen Analyse zu betrachten, da auf jeden Fall auch die
Verluste der Derivatisierung mit einfließen. Hier sei festgehalten, daß im allgemeinen die durch
die Anreicherung und Derivatisierung verursachten Fehleranteile wesentlich größer sind als die
der gaschromatographischen Analyse, da die Probenvorbereitung aus einer Vielzahl einzelner
Schritte besteht. Es zeigte sich eine durchweg gute Linearität der Zusammenhänge zwischen
Verbindungskonzentration und erzeugtem Signal, was den jeweiligen Linearitätskoeffizienten in
Tabelle 8.5 zu entnehmen ist. Der lineare Bereich erstreckt sich je nach Verbindung über zwei
oder drei Größenordnungen, zumeist noch weiter, jedoch ist eine Ermittlung der Linearität in
Bereichen von über 100µg/L nicht notwendig, da derart hohe Zytostatika-Konzentrationen in
Realproben nicht zu erwarten sind.
Die Wiederfindungsraten liegen bei der Anwendung der optimierten Verfahren bei dotierten
Oberflächenwasserproben im Bereich von 61 bis 111%, wodurch belegt wird, daß sie sich gut
dazu eignen, die Verbindungen aus ebendieser Matrix zu bestimmen. Es zeigten sich nur geringe
Einflüsse der Matrixbelastung der Proben und der damit verbundenen Verluste.
8 Validierung der entwickelten Methoden 141
Die Schwankungen in den Werten für die Wiederfindungsraten gehen auf das unterschiedliche
Verhalten der Verbindungen vor allem bei der Probenvorbereitung zurück.
Vor allem die Carboxy-Komponenten verändern sich im Laufe der Extraktion und
Derivatisierung, daß heißt, sie werden hydrolysiert oder bauen sich weiter zu den entsprechenden
Mustard-Verbindungen ab. Des weiteren sind auch eine unvollständige Festphasen-Extraktion
oder nicht umfassende Derivatisierungsreaktionen mögliche Gründe. Die Ursachen für eine
Wiederfindungsrate von über 100% liegen eher in der chromatographischen Analyse; so können
z.B. koeluierende Matrixbestandteile zu größeren Werten führen.
Die gleichen Gründe gelten auch für die teils merklichen Differenzen in den ermittelten
Standardabweichungen. Auch hier kommt es zu einer Abweichung bei Carboxyphosphamid.
Während bei den Muttersubstanzen, den Keto- wie den Mustardverbindungen die bei einer
solchen Matrixbelastung zu erwartenden Abweichungen von 10-20% erreicht wurden, liegt dieser
Wert mit 32% erheblich darüber, was auf den möglicherweise nicht reproduzierbaren Ringschluß
während des chromatographischen Prozesses zurückzuführen ist, denn das strukturisomere
Ifosfamid-Analogon zeigt weder ein derartiges chemisches Verhalten noch werden solch
abweichende Werte für die Wiederfindungsrate gefunden.
Die Resultate der beiden Ringversuche als Bestandteil der externen Qualitätssicherung zeigen
ganz deutlich die Möglichkeit zur Anwendung dieser Methoden für die Ermittlung von
Spurenkonzentrationen der Muttersubstanzen Cyclophosphamid und Ifosfamid im Harn eines
Menschen und in den beiden aquatischen Kompartimenten Oberflächenwasser und Abwasser.
Die Untersuchung des aufgestockten Abwassers bildet eine Ausnahme, zeigt sich doch hierbei
eine starke Abweichung vom Referenzwert. Der Grund für diese Differenz liegt vermutlich in
einem Fehler bei der Dotierung oder in einem erheblichen Blindwert der Abwasserprobe, denn
der Sollwert von 253 ng/L zeigt, daß viele der an dem Ringversuch teilnehmenden Laboratorien
ebenfalls einen Betrag in dieser Größenordnung ermittelt haben.
Durch diese Verfahren zur Qualitätssicherung konnte gezeigt werden, daß eine genaue und
robuste Bestimmung von Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren Metaboliten im Spuren-
und Ultraspurenbereich in den entsprechenden Umweltmatrices sehr gut möglich ist.
9 Untersuchung von Realproben 142
9 Untersuchung von Realproben
9.1 Herkunft des Probenmaterials
Die erste Probennahme der Klinikabwässer erfolgte im Rahmen des Untersuchungsvorhabens
„Verhalten von Zytostatika in der Umwelt, insbesondere in Abwässern, Gewässern und
Kläranlagen“, das vom Ministerium für Umwelt, Raumplanung und Landwirtschaft gefördert und
in dessen Rahmen ein Teil dieser Arbeit erstellt wurde. Es wurden Krankenhäuser mit
ausgewiesenen onkologischen Stationen, also mit einem potentiellen Aufkommen der
untersuchten Verbindungen, ausgewählt. Es handelte sich hierbei um zwei Universitätskliniken
mit jeweils 1600 Betten und ein städtisches Krankenhaus mit ca. 400 Betten. Bei jeder der drei
Kliniken wurden die Proben durch Personal der jeweils zuständigen staatlichen Umweltämter an
den Hauptsammlern der Krankenhausabwässer, den Zu- und Abläufen der angeschlossenen
kommunalen Kläranlagen sowie den zugehörigen Vorflutern in Form von Schöpf- oder
Stichproben gezogen.
Eine weitere Probenahmekampagne wurde bei 15 Krankenhäusern in Nordrhein-Westfalen
durch Mitarbeiter der Stadtentwässerungsbetriebe Düsseldorf vorgenommen. Die Kliniken
wurden an bis zu acht verschiedenen Zuläufen der Klinikabwässer in die kommunalen
Abwässerkanäle ein- bzw. zweimal beprobt. Es kamen mehrere Probenahme-Techniken zum
Einsatz. Mittels qualifizierter Stichproben – einer Methode, bei der innerhalb von 10 Minuten bis
2 Stunden alle 2 Minuten ein Aliquot gezogen und anschließend gemischt wird – wurden 24, mit
einer einfachen Schöpfprobe 1 und mit der zeitproprtionalen 24-Stunden-Mischprobenahme 8
Proben gezogen.
Nach Abschluß der Probenahme wurden alle Proben, die jeweils im Schnitt ein Volumen von 2
Litern hatten, ohne weitere Behandlung umgehend in Kunststoffflaschen bei –38°C tiefgefroren
und erst kurz vor der Aufarbeitung bei Raumtemperatur aufgetaut.
9 Untersuchung von Realproben 143
9.2 Beschaffenheit der Probenmatrix Abwasser
Unter dem aquatischen Kompartiment Abwasser wird nach DIN 4045 ein „durch Gebrauch
verändertes abfließendes Wasser und jedes in die Kanalisation gelangendes Wasser“ verstanden.
Diese allgemeine Formulierung der Begriffsbestimmung weist auf starke quantitative und vor
allem qualitative Unterschiede hin. Die Verschmutzung von Abwasser kann auf anorganische
Stoffe wie Salze, Schleifstoffe u.a. oder auf organische Komponenten (Erde, Kohlenhydrate,
Fette, Eiweiße und deren Abbauprodukte) zurückgeführt werden. Je nach Herkunft, Tages- und
Jahreszeit, Wetter und anderen Faktoren ist das Abwasser sehr unterschiedlich beschaffen. So
beinhaltet normales häusliches Abwasser andere Ingredienzien und Konzentrationen als die
gezogenen und für diese Arbeit untersuchten Proben klinischer Abwässer.
Die analysierten Proben zeigten ein weites Spektrum an Verunreinigungen. Während manche
noch Papierreste und andere Schwebstoffe in starkem Ausmaß enthielten, hatten andere Proben
die Qualität eines Oberflächengewässers. Das war naturgemäß auch stark vom Probenahmeort
abhängig. So waren Wasserproben, die aus dem Effluenten einer kommunalen Kläranlage
genommen wurden, zumeist sensorisch ohne Befund und zeigten erheblich weniger Störungen
im Chromatogramm der Analyse als Aliquote, die zu einem früheren Zeitpunkt im
Abwasserreinigung-Prozeß gezogen wurden wie zum Beispiel in den Zuläufen oder den
Hauptsammlern der Anlagen.
9.3 Messung der Zytostatika-Konzentrationen in realen Klinkabwässern
9.3.1 Beschreibung des verwendeten Verfahrens
Die tiefgefrorenen Proben wurden langsam in einem Wasserbad bei Raumtemperatur aufgetaut
und zwei Aliquote von je 500mL nach vorherigem Absetzen der Schwebstoffe im
Vorratsbehältnis entnommen. Eine getrennte Betrachtung von Nor Nitrogen Mustard ist wegen
des Abbaus des bei allen anderen Analyten verwendeten internen Standards d4-Cyclophosphamid
zu ebendiesem und der unterschiedlichen, optimierten Parameter für die Probenvorbereitung
notwendig.
9 Untersuchung von Realproben 144
Die Probevorlage für die Bestimmung der Zytostatika der Gruppe 1 wurde mit der
entsprechenden Pufferlösung auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und mit d4-Cyclophosphamid
versetzt, so daß sich eine Gesamtkonzentration dieses internen Standards von 1 µg/L ergibt,
während die Probelösung für die Ermittlung der Substanzkonzentration von NNM auf pH 7
eingestellt und mit 1-Chlor-Naphthalin als Surrogat- und Extraktionsstandard versehen wurde.
Eine vorhergehende Filtration blieb aus, da die noch in der Lösung vorhandenen Schwebstoffe
auf der Fritte der Festphasen-Scheibe zurückgehalten und gesammelt wurden. Des weiteren
konnten dadurch an dem Feststoff adsorbierte Substanzspuren mit Hilfe der eingesetzten
organischen Lösungsmittel zusätzlich eluiert werden.
Die sich daran anschließende Extraktion lief bis auf unterschiedliche Festphasen-Materialien (C18
für Gruppe 1, C18 Polar Plus für NNM) gleich. Nach Konditionierung der Phasen erfolgte die
Probenaufgabe per Hand oder über Adaptoren. Hierbei zeigte sich ein großer Einfluß einer
gegebenen starken Matrixbelastung. Trotz der Möglichkeit hoher Durchflußraten stark
partikelbelasteter Volumina bei Verwendung scheibenartiger Festphasen-Kartuschen verringerte
sich im Laufe einer Extraktion häufig die Durchlaufgeschwindigkeit, so daß der von der
Membranpumpe erzeugte Unterdruck erhöht werden mußte, um vergleichbare
Extraktionsbedingungen für alle untersuchten Proben zu schaffen und somit mögliche
Abweichungen in der Wiederfindungsrate zu verhindern.
Aufgrund der auf der Fritte verbliebenen Rückstände war es notwendig, die Trocknung der
Fasern zu verlängern, um weitere Wasserreste zu entfernen, die in diesen Resten eingeschlossen
waren. Die Elution verlief, wie im Kapitel 6 dargestellt, in drei Gaben von jeweils 5mL
Acetonitril. Die anschließend bis zur Trockne eingeengten Eluate (bis auf die Bestimmung von
NNM aus den in Kapitel 6 erwähnten Gründen) zeigten starke Verunreinigungen, die sich in
unterschiedlichster Färbung und Konsistenz der Lösungen äußerte. Wegen dieses erhöhten
Aufkommens an störenden Bestandteilen wurden die Mengen der Derivatisierungsmittel
Trifluoressigsäureanhydrid und Diazomethan in einer Etherlösung verdoppelt, um gerade bei der
Methylierung Verluste durch quantitative Reaktion mit den Matrixbestandteilen zu verhindern.
Es wurde jeweils 1 µL der Injektionslösungen auf den Gaschromatgraphen gegeben, wo die
Trennung der Komponenten auf einer DB-XLB-Kapillartrennsäule stattfand. Der Gehalt an
Zytostatika wurde mittels der in Kapitel 8.3 aufgeführten MS/MS-Methode bestimmt.
9 Untersuchung von Realproben 145
9.3.2 Ergebnisse der Messungen und Diskussion
Bis auf Schwierigkeiten, die im Hinblick auf das Konstanthalten der Durchflußraten bei der
Festphasen-Extraktion auftraten, konnten die entwickelten Methoden zur Probenaufbereitung
und spurenanalytischen Bestimmung der Stickstofflost-Derivate ohne weitere Komplikationen
auf die Analyse der Klinikabwässer angewendet werden. Die zur Überprüfung der Extraktion
sowie der Wiederfindung des zudotierten internen Surrogatstandards konnten in allen Fällen in
guter Reproduzierbarkeit wiedergefunden werden, so daß von einer korrekten
Probenaufbereitung ausgegangen werden kann. Die bei jedem Probenzyklus vorhandenen nicht
belasteten Abwässer fungierten als Blindwerte, womit verhindert werden konnte, daß falsch-
positive Aussagen bezüglich der Substanzkonzentrationen gemacht wurden. Es zeigt sich in
diesen Chromatogrammen, daß es trotz des erheblichen Aufkommens an Matrix bei der Analyse
von Abwasserproben bei Zuhilfenahme der Tandem-Massenspektrometrie nur zu geringen
beeinflussenden Interferenzen durch Bestandteile aus dem Abwasser kommt.
Von den untersuchten 45 Proben waren 5 teilweise stark mit einem oder zwei verschiedenen
Substanzen kontaminiert. Vor allem die beiden Muttersubstanzen wurden in erheblichen
Konzentrationen von teilweise über 1µg/L Abwasser gefunden. Aber auch der kanzerogene
Metabolit Nor Nitrogen Mustard konnte mit 200 respektive 1600 ng/L weit oberhalb der
Nachweisgrenze bestimmt werden. Zur Bestätigung der Ergebnisse wurden die Proben, die ein
Substanzaufkommen oberhalb der Nachweisgrenzen zeigten, noch zwei weitere Mal analysiert,
um zu einer verstärkten Absicherung der Resultate zu gelangen. Zwei weitere Kontaminationen
durch KIF und NNM konnten festgestellt, aber durch erneute Messungen nicht bestätigt werden,
was auf eine mögliche Verschleppung der Substanzen oder eine eventuelle Abbaureaktion in
dieser sehr aktiven Matrix schließen läßt.
Die Tabelle 9.1 stellt die Ergebnisse der Realproben-Messungen zusammenfassend dar. Hierbei
sind die Krankenhäuser, deren Abläufe beprobt worden sind, mit Buchstaben und die
dazugehörigen verschiedenen Probenahmestellen mit der ersten fortlaufenden Nummer
versehen.Wie häufig innerhalb des Probenahmezeitraums ein Aliquot gezogen wurde, ist mit der
zweiten Zahl kenntlich gemacht. Dieser Auflistung ist zu entnehmen, daß es bei den Messungen
der Realproben zu einer hohen Anzahl an positiven Befunden für die Bestimmung der
Zytostatika kommt.
9 Untersuchung von Realproben 146
Tab. 9.1: Ergebnisse der Messungen von realen Klinikabwasserproben (Angaben in ng/L) mit
QS: Qualifizierte Stichprobe, SP: Schöpf- oder Stichprobe, MP: Mischprobe
/: Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze
Krankenhaus Probe Art derProbenahme
ProbenpH-Wert CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM
A 1.1 QS 7,1 2000 / / / / / / 1600*
1.2 QS 8,5 / / / / / / / /
2.1 QS 7,5 / / / / / / / /
2.2 MP 8,0 / / / / / / / /
3.1 QS 8,1 / / / / / / / /
3.2 MP 8,1 / / / / / / / /
4.1 QS 8,4 / / / / / / / /
5.1 QS 8,3 / / / / / / / /
5.2 QS 7,0 / / / / / / / /
6.1 QS 9,3 / / / / / / / /
6.2 QS 7,9 / / / / / / / /
7.1 QS 6,4 / / / / / / / /
8.1 MP 7,8 / / / / / / / 200
B 1.1 QS 8,1 / / / / / / / /
C 1.1 QS 9,0 / / / / / / / /
D 1.1 SP 8,7 / / / / / / / /
E 1.1 QS 8,5 / / / / / / / /
2.1 MP 7,7 / / / / / / / /
F 1.1 QS 9,5 / / / / / / / /
G 1.1 MP 7,9 / / / / / / / /
H 1.1 QS 8,1 / / / / / / / /
2.1 QS 8,1 / / / / / / / /
I 1.1 QS 8,3 / / / / / / / /
9 Untersuchung von Realproben 147
Tab. 9.2: Ergebnisse der Messungen von realen Klinikabwasserproben (Angaben in ng/L) mit
QS: Qualifizierte Stichprobe, SP: Schöpf- oder Stichprobe, MP: Mischprobe
/: Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze
Krankenhaus Probe Art derProbenahme
ProbenpH-Wert CP IF KCP KIF CCP CIF IPM NNM
J 1.1 QS 8,5 / / / / / / / /
2.1 QS 8,2 / / / / / / / /
K 1.1 QS 8,7 / / / / / / / /
2.1 MP 7,8 / / / / / / / /
3.1 QS 8,5 / / / / / / / /
L 1.1 QS 7,9 / / / / / / / /
M 1.1 MP 8,4 / / / / / / / /
N 1.1 QS 8,2 160 / / / / / / /
2.1 QS 8,3 / / / / / / / /
O 1.1 MP 8,3 / / / / / / / /
P 1.1 SP 6,4 / / / / / / / /
2.1 SP 6,4 / / / / / / / /
3.1 SP 6,1 30 1200 / / / / / /
4.1 SP 6,0 / / / / / / / /
Q 1.1 SP 6,8 / / / / / / / /
2.1 SP 6,6 / / / / / / / /
3.1 SP 6,7 / / / / / / / /
4.1 SP 6,9 / / / / / / / /
R 1.1 SP 7,6 / / / / / / / /
2.1 SP 7,2 / / / / / / / /
3.1 SP 7,2 / 2300 / / / / / /
4.1 SP 7,3 / / / / / / / /
9 Untersuchung von Realproben 148
Als Beispiele seien im folgenden einige Chromatogramme hoch belasteter Proben aufgeführt.
Abb. 9.1: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe A 1.1
Diese Probe wurde an einer von acht Stellen auf dem Gelände einer großen Klinik gezogen, die
vermutlich in erheblichen Mengen Zytostatika zur Chemotherapie und Immunsuppresion
einsetzt. Sowohl Cyclophosphamid (Retentionszeit tR=13,13 min) als auch der Metabolit Nor
Nitrogen Mustard (tR=6,66 min) wurden in Konzentrationen von 2 respektive 1,6 µg/L in einem
der Zuläufe des Krankenhauses in die kommunalen Abwasserkanäle detektiert und anhand ihrer
Massenspektren identifiziert.
Da diese Probe insgesamt dreimal aufgearbeitet und vermessen worden ist, konnte festgestellt
werden, daß die vom eluierten Cyclophosphamid erzeugte Fläche im Chromatogramm und damit
die absolute Menge sukzessiv abnahm. Die erste Bestätigungsmessung wurde umgehend am
folgenden Tag durchgeführt, die zweite hingegen erst zwei Wochen später. Während bei der
ersten Bestimmung nur eine geringe Veränderung gegenüber der vorangegangenen ermittelt
werden konnte, wurde bei der zweiten Analyse ein klarer Abbau der Muttersubstanz und eine
Erhöhung der NNM-Konzentration ersichtlich. Eine Umwandlung von Cyclophosphamid in
seinen aktiven Metaboliten scheint in diesem Fall möglich.
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Time (min)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
1006,66
13,13
m/z= 62,5-63,5 F: + c SRM ms2 188,00@0,50 [ 60,00-188,00] MS
m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-307,00] MS
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z
100
0
50
8
0
5
63
188
126 168
212
20020116-01#242 RT: 6,64 AV: 1 NL: 3,71E4 F: + c SRM ms2 188,00@0,50 [ 60,00-188,00]
20011219-01#1257 RT: 13,13 AV: 1 NL: 4,39E5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-307,00]
9 Untersuchung von Realproben 149
Abb. 9.2: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe P 3.1.1
Abb. 9.3: Chromatogramm und die entsprechenden Massenspektren der Probe R 3.1.1
5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1007,40
m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 145,00-310,00]
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310
m/z
0
20
40
60
80
100212
269248158 254170
5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1007,30
7,63
m/z= 211,5-212,5 F: + c SRM ms2 307,00@0,70 [ 200,00-310,00]
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310
m/z
0
20
40
60
80
100212
307
9 Untersuchung von Realproben 150
Die Abbildungen 9.2 und 9.3 zeigen zwei Massenchromatogramme der Proben P 3.1 und R 3.1,
die in zwei Hauptsammelbecken kommunaler Kläranlagen genommen wurden, welche u.a. die
Abwässer zweier Krankenhäuser mit ausgewiesenenen onkologischen Stationen behandeln. Diese
Proben zeigen ebenfalls eine starke Belastung durch die beiden Ausgangssubstanzen, vor allem
durch Ifosfamid (tR=7,30 bzw. 7,40 min) mit Konzentrationen bis zu 2,3 µg/L. Bei diesen
Proben zeigte sich kein mit dem oben erwähnten Abbau vergleichbarer Prozeß, was eine
Interpretation desselbigen erschwert.
Die Quantifizierung der detektierten Substanzmengen erfolgte durch externe Kalibrierungen.
Jedoch kann hier nur von einer Abschätzung der Konzentrationen gesprochen werden, da die
jeweiligen Kalibrierfunktionen stets aus einer Ethylacetat-Standardlösung bestimmt wurden und
die Bestimmung in einer weitaus komplizierteren Matrix erfolgte. Es kann also davon
ausgegangen werden, daß die real vorliegenden Konzentrationen weitaus höher liegen als die
durch die erfolgte Kalibrierung errechneten.
10 Zusammenfassung 151
10 Zusammenfassung
Die als antineoplastische Humanpharmaka in der Chemotherapie krebskranker Patienten
eingesetzten Stickstoff-Lost-Derivate Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie deren aktive
Stoffwechselprodukte stellen wegen ihrer toxischen, mutagenen und teilweise nachgewiesenen
kanzerogenen Eigenschaften ein hohes Gefährdungspotential für unterschiedliche
Umweltmedien dar. In der vorliegenden Arbeit wurden neben diesen beiden Leitsubstanzen
zusätzlich die Metaboliten 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid, Cyclophosphamid
Mustard, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid und Ifosfamid Mustard in das
Untersuchungsvorhaben mit einbezogen, um auch das Vorkommen der im Laufe des
Stoffwechsel im Körper des Patienten entstehenden Metaboliten in wäßrigen Matrices erfassen
zu können. Aufgrund des Verbrauchs der Muttersubstanzen, deren Ausscheidungsraten, der
Toxizität aller Verbindungen sowie der jeweilig möglichen Umweltgefährdungspotentiale schien
es indiziert, das Vorkommen dieser Komponenten in der Umwelt zu untersuchen.
Im Zuge dessen wurden in der vorliegenden Arbeit für diese acht Zytostatika leistungsfähige
spurenanalytische Bestimmungsmethoden für die Konzentrationsermittlung in wäßrigen Medien
entwickelt oder von Methoden für die Zytostatika-Bestimmung in anderen Matrices adaptiert und
optimiert. Um die zu erwartenden Substanzkonzentrationen im Spuren- und Ultraspurenbereich
detektieren zu können, waren hohe Anreicherungsfaktoren und somit die Verwendung der
Festphasen-Extraktion notwendig. Die sich im Analysenverfahren daran anschließende
Derivatisierung der Moleküle wurde im Hinblick auf die Detektion mittels eines
Massenspektrometers auf eine möglichst hohe Selektivität und Sensitivität hin optimiert. Die
Trennung der Verbindungen erfolgte mit Hilfe eines temperaturprogrammierten
gaschromatographischen Verfahrens auf einer schwach polaren Kapillartrennsäule (DB-XLB,
J&W Scientific, 30m x 0,25mm x 0,25µm).
Zur Identifizierung der Zytostatika wurden Full Scan- und MS/MS- Massenspektren verwendet,
während die Quantifizierung dieser Verbindungen in den teils stark matrixbelasteten
Kompartimenten ausschließlich mit der Technik der Tandem-Massenspektrometrie erfolgten.
Hierdurch konnte ein hohes Maß an Selektivität und Sensitivität erreicht werden. Durch die
Verwendung sogenannter Scanevents war es möglich, auch koeluierende Verbindungen wie
Ifosfamid und sein Keto-Metabolit ohne Schwierigkeiten zu quantifizieren, wodurch eine weitere
Optimierung des Temperaturgradienten entfiel.
10 Zusammenfassung 152
Somit gelang die Analyse der zwei Muttersubstanzen sowie der sechs Metaboliten in Matrix mit
den optimierten Parametern der gaschromatographischen Separierung und der
massenspektrometrischen Detektion in weniger als 15 Minuten (Abb. 10.1).
Abb. 10.1: Massenchromatogramme der acht untersuchten Zytostatika und des internen Standards
Um die Ergebnisse der analytischen Messungen bewerten zu können, wurde eine große Anzahl
von Maßnahmen ergriffen, die der internen wie externen Qualitätssicherung dienten. Die im
Zuge dieser Validierung ermittelten statistischen Parameter wie Standardabweichung,
Wiederfindungsrate oder Regression zeigten, daß es sich bei den entwickelten Methoden um
nachweistarke, selektive und ausreichend präzise Verfahren zur Konzentrationsermittlung dieser
Zytostatika in den behandelten wäßrigen Matrices handelt. Der Konzentrationsbereich ist für die
jeweiligen Komponenten mit Korrelationskoeffizienten von stets größer als 0,99 ausreichend
linear. Die bestimmten Wiederfindungsraten liegen mit Werten von 60 bis 110% im Bereich der
in der Literatur angegebenen Zahlen für die Bestimmung in physiologisch-diagnostischen
Flüssigkeiten. Auch die Standardabweichungen, die sich mit einer Ausnahme alle im Bereich von
10 bis 20% bewegen, zeigen, daß es sich bei diesen Verfahren um ausreichend robuste und
präzise Methoden handelt.
Die Ergebnisse der Ringversuche, an denen für die beiden Muttersubstanzen als Mittel der
externen Qualitätskontrolle teilgenommen wurde, belegen die Leistungsfähigkeit (Genauigkeit)
der entwickelten Verfahren für die Konzentrationsbestimmung dieser Verbindungen.
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)
0
1000
1000
1000
1000
100%
0
1000
1000
100 Nor Nitrogen Mustard6,13
Ifosfamid Mustard9,68
Ifosfamid Cyclophosphamid12,19
12,94
4-Keto-Ifosfamid12,23
Carboxyifosfamid12,63
d4-Cyclophosphamid12,94
Carboxyphosphamid13,34
4-Keto-Cyclophosphamid13,80
10 Zusammenfassung 153
Bei allen Ringversuch-Proben konnten die realen Substanzmengen mit sehr geringen
Abweichungen in den vorgegebenen Matrices (Standardlösungen, Oberflächen- und Abwasser,
Urin), also auch mit problemorientierten und den realen Untersuchungsfällen angepaßten Proben
bestimmt werden.
Tab. 10.1: Bedingungen, Bestimmungs- und Nachweisgrenzen der entwickelten Bestimmungsverfahren
Substanz VerwendeteSorbentien
Detektion(Vorläufer-/Tochterion)
Nachweis-/Bestimmungsgrenze
Oberflächenwasser[µg/L]
Nachweis-/Bestimmungsgrenze
Abwasser[µg/L]
Cyclo-phosphamid
Baker BondC18
307 / 212 0,0005 / 0,001 0,005 / 0,01
4-Keto-Cyclophosphamid
Baker BondC18
239 / 209 1 / 5 5 / 10
Carboxy-phosphamid
Baker BondC18
317 / 231 10 / 50 30 / 100
Nor NitrogenMustard
Baker BondC18
Polar Plus188 / 63 0,1 / 0,5 0,2 / 1
Ifosfamid Baker BondC18
307 / 212 0,001 / 0,005 0,01 / 0,03
4-Keto-Ifosfamid Baker BondC18
335 / 281 0,5 / 1 2 / 5
Carboxy-ifosfamid
Baker BondC18
324 / 158 1 / 5 5 / 20
IfosfamidMustard
Baker BondC18
187 / 110 1 / 5 5 / 20
Die vorgestellten Analyseverfahren eignen sich hiernach für die Anreicherung, Trennung und
Bestimmung der untersuchten Verbindungen aus Matrices wie den unterschiedlichsten
Oberflächen- und Abwässern. Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für ebendiese
Kompartimente konnten für die Substanzen gegenüber früheren Arbeiten, falls vorhanden, teils
stark verbessert werden (Tab. 10.1). Der Vergleich dieser Werte mit den potentiell in
Klinkabwasser- und Oberflächenwasserproben auftretenden Substanzkonzentrationen zeigt, daß
die Erfassung der Belastungen in diesen Medien bei Verwendung der hier diskutierten Methoden
für alle untersuchten Komponenten außer Carboxyphosphamid möglich ist.
10 Zusammenfassung 154
Des weiteren wurden die entwickelten Analyseverfahren zur Untersuchung des Vorkommens der
ausgewählten Zytostatika in realen Klinikabwasser- und verschiedenen Oberflächenwasserproben
eingesetzt. Um möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, wurden Proben von insgesamt
18 Universitätsklinken und städtischen Krankenhäusern an verschiedenen Stellen im
Abwasserstrom (Zuleitung ins öffentliche Abwassernetz, Zu- und Abläufe sowie Vorfluter
kommunaler Kläranlagen) teilweise mehrfach genommen. Diese Realproben-Untersuchung zeigte
deutlich, daß die Abwasserströme teils stark mit den Stickstoff-Lost-Derivaten belastet sind.
Mehr als 11% aller untersuchten Proben waren zumeist hoch mit einem oder zwei dieser
Zytostatika kontaminiert. Hierbei handelte es sich um die beiden auch schon an anderen Stellen
im Klinikabwasser gefundenen Cyclophosphamid (0,03 bis 2µg/L) und Ifosfamid (1,2 und
2,3µg/L). Erstmals konnte auch ein Metabolit des Cyclophosphamids – das Nor Nitrogen
Mustard (NNM) (0,2 und 1,6µg/L) – in zwei Abwasserproben eines Unversitätsklinikums und
eines städtischen Krankenhauses in Konzentrationen weit oberhalb der Bestimmungsgrenzen
nachgewiesen werden. Falsch-positive Aussagen können ausgeschlossen werden, da bei jedem
Analysengang Blindwerte mit vermessen wurden und ein positiver Befund stets durch zwei
weitere Messungen bestätigt wurde. Das Auftreten des zytotoxischen NNM zeigt, daß auch
Metaboliten zur Mutagenität klinischer Abwässer beitragen und möglicherweise wegen ihrer
Polarität und damit verbundenen Mobilität in der wäßrigen Phase auch die Kläranlagen ohne
Abbau passieren und die Oberflächengewässer belasten. Eine weitere Untersuchung des
Abbauverhaltens der Metaboliten von Cyclophosphamid und Ifosfamid sowie im speziellen von
Nor Nitrogen Mustard erscheint sinnvoll und angebracht.
In den beprobten Oberflächengewässern wurden weder die Muttersubstanzen noch die
Metaboliten in Konzentrationen oberhalb der jeweiligen Bestimmungsgrenzen gefunden.
Aufgrund der Menge an belasteten Proben, der Kontaminationshöhe sowie des bekannten
mutagenen und kanzerogenen Potentials der gefundenen Substanzen ist von einer starken
umweltgefährdenden Belastung der untersuchten Medien auszugehen. Eine Untersuchung von
Klinikabwässern im Allgemeinen in Form eines Umweltmonitorings ist somit notwendig und
kann mit Hilfe der durch die vorliegende Arbeit nun vorhandenen Möglichkeiten durchgeführt
werden. Ebenso können die hier vorgestellten Analyseverfahren im Hinblick auf den
Arbeitsschutz im Bereich der klinischen Analytik Verwendung finden, wie durch die externe
Qualitätssicherung mittels des Urin-Ringversuchs gezeigt werden konnte.
11 Anhang 155
11 Anhang
11.1 Eigenschaften der untersuchten Substanzen
11.1.1 Cyclophosphamid (CP)
Allg. Bemerkung: Liegt als Cyclophosphamid Monohydrat vor.
Summenformel: C7H15Cl2N2O2P ∙ H2O
Molekulargewicht: 279,1 g/mol
CAS-Nr.: [50-18-0]
Strukturformel:
O NH
P
O
N
ClCl
Zytostatika-Typ: Alkylans, Stickstofflost-Derivat, Muttersubstanz
Namen: N,N'-bis(2-chloroethyl)tetrahydro-2H-1,2,3-oxazaphosphorin-2-amin-2-
oxid, 2-[Bis(2-chloroethyl)amin]-2H-1,2,3-oxazaphosphinan-2-oxid
Handelsnamen: Cyclo-cell (cell pharm), Cyclophosphamid-biosyn (biosyn), Cyclostin
(Pharmacia & Upjohn), Endoxan (Asta Medica)
Indikationen: Akute und chronische lymphatische und myeloische Leukämien, maligne
Lymphome, Paraproteinämien (z.B. Plasmozytom, Morbus Waldenström),
maligne und metastatisierende solide Tumore (Ovarial-, Mamma-,
Bronchialkarzinom), postoperative Zusatzbehandlung bei chemosensiblen
Tumoren, Autoimmunkrankheiten, Organ- und Knochenmarktransplanta-
tionen
Nebenwirkungen: Kopfschmerzen, Brechreiz, Übelkeit, Haarausfall, Absinken der Leukozyten
und Thrombozyten, Unterdrückung der Immunreaktion, Störung der
Keimdrüsenfunktion, Blasenentzündung, Störungen der Leber-, Nieren-
Lungenfunktion, Veränderungen des Blutbildes und der Spermatogenese,
kardiotoxisch, teratogen, kanzerogen, mutagen, embryo- und fetotoxisch
11 Anhang 156
Dosierung: - Täglich:
3 bis 6 mg/kg Körpergewicht
- Intervalltherapie:
10 bis 15 mg/kg Körpergewicht in Abständen von 2 bis 5 Tagen
- Hochdosierte Intervalltherapie:
20 bis 50 mg/kg Körpergewicht in Abständen von 10 bis 20 Tagen
Pharmakokinetik: - Mittlere Halbwertszeit im Serum t1/2 4 bis 10 Stunden
- Nachweisbare Konzentrationen von Cyclophosphamid und Metaboliten
noch nach 72 Stunden
- Ausscheidung: 6-65% im Urin, 3,5% über Galle
Wirkmechanismus: Bifunktional alkylierend, zellphasenunspezifisch
IARC-Einstufung: Gruppe 1, erwiesenermaßen kanzerogen beim Menschen
R-/S-Sätze: R 45-46-61-41-48/23/24/25
S 53-15-26-45
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzbereich: 49-53°C
- Siedepunkt: Exotherme Zersetzung bei 90°C
- Dampfdruck: 3,3∙10-5 hPa (bei 20°C, bestimmt mit Dampfdruckwaage)
- Löslichkeit: 40g/L Wasser, leicht löslich in Ethanol, schwer löslich in
Diethylether
- In Wasser stabil
Toxizität: - LD50 (Ratten) = 160mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion
- Chronische Gabe toxischer Dosen führt zu Leberverfettung mit
anschließender Nekrose
- Mutagenität nachgewiesen (Ames-Test, S. typhimurium/E. coli positiv,
Mikrokerntest, Maus, positiv)
- Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität aufgrund epidemiologischer
Studien und von Einzelberichten sowie tierexperimenteller Befunde sehr
wahrscheinlich
11 Anhang 157
11.1.2 Keto-Cyclophosphamid (KCP)
Summenformel: C7H13Cl2N2O3P
Molekulargewicht: 275,1 g/mol
CAS-Nr.: [27046-19-1]
Strukturformel:
O NH
P
O
N
ClCl
O
Zytostatika-Typ: Metabolit von Cyclophosphamid
Namen: 2-[Bis(2-chloroethyl)amin]tetrahydro-2-oxid-4H-1,2,3-oxazaphosphorin-4-
on, 4-Oxo-Cyclophosphamid, Oxo-Endoxan
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzpunkt: Zersetzung
- Löslichkeit: 1g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, >1% in
DMSO
- Stabil bei Temperaturen unter –20°C
Toxizität: LD50 (Ratten) >800mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen Injektion
Abbauprodukt des Zytostatikums Cyclophosphamid
11 Anhang 158
11.1.3 Carboxycyclophosphamid (CCP)
Summenformel: C7H15Cl2N2O4P
Molekulargewicht: 293,1 g/mol
CAS-Nr.: [22788-18-7]
Strukturformel:
O NH2
P
O
N
ClCl
O
OH
Zytostatika-Typ: Metabolit von Cyclophosphamid
Namen: 3-((Amino-[bis(2-chloroethyl)amino]phoshpinyl)oxy)-propanoic acid,
Carboxyphosphamid
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzpunkt : 116-117°C
- Löslichkeit: 1g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, 100g/L in
Ethanol
- Stabil bei Temperaturen unter –20°C
Toxizität: LD50 (Ratten) >800mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen Injektion
Abbauprodukt des Zytostatikums Cyclophosphamid
11 Anhang 159
11.1.4 Cyclophosphamid Mustard (CPM)
Summenformel: C4H11Cl2N2O2P
Molekulargewicht: 221,0 g/mol
CAS-Nr.: [10159-53-2]
Strukturformel:
HO NH2
P
O
N
ClCl
Zytostatika-Typ: Metabolit von Cyclophosphamid
Namen: N,N-bis(2-chloroethyl)-phosphorodiamidic acid, Phosphamid Mustard
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzpunkt : Zersetzung
- Löslichkeit: <100mg/L Wasser und Ethylacetat, >100mg/L pH7-
Phosphatpuffer
- Temperaturen unter –20°C sind unabdingbar
Toxizität: LD50 (Ratten) 70mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen respektive
61mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion, zytostatisch,
alkylierendes Agens, möglicherweise teratogen und kanzerogen wirkend,
zytotoxische Aktivität in vitro: 20μg/mL (2h-Inkubation)
Abbauprodukt des Zytostatikums Cyclophosphamid
11 Anhang 160
11.1.5 Ifosfamid (IF)
Summenformel: C7H15Cl2N2O2P
Molekulargewicht: 261,1 g/mol
CAS-Nr.: [3778-73-2]
Strukturformel:
O N
P
O
NH
Cl
Cl
Zytostatika-Typ: Alkylans, Stickstofflost-Derivat, Muttersubstanz
Name: 3-(2-Chlorethyl)-2-[(2-chlorethyl)amino-2H-1,3,2-oxazaphosphinan-2-oxid
Handelsnamen: Holoxan (Asta Medica)
Indikationen: Inoperable maligne, Ifosfamid-empfindliche Tumore: Bronchial- und
Ovarialkarzinome, Hodentumore, Mammakarzinome, Weichteilsarkome,
Pankreaskarzinome, Hypernephrome, Endometriumkarzinome, maligne
Lympome
Nebenwirkungen: Übelkeit, Erbrechen, Haarausfall, Diarrhöe, Knochenmarkschädigungen mit
Absinken der Leukozyten und Thrombozyten, Unterdrücken der
Immunreaktion, Blasenentzündung, Störung der Keimdrüsenfunktionen,
Störungen der Nierenfunktion (Erhöhung des Blutharnstoffs und der
Serum-Creatininwerte, vermehrte Ausscheidung von Eiweiß, Zucker,
Phosphat im Urin, Fanconi-Syndrom bei Kindern), Störung der
Leber- und Herzfunktion, Desorientierung, Verwirrungszustände,
kardiotoxisch, teratogen, kanzerogen, mutagen, embryo- und fetotoxisch
11 Anhang 161
Dosierung: - Regelfall:
Intravenöse Gabe von 50-60 mg/kg Körpergewicht an fünf aufeinander
folgenden Tagen oder 80 mg/kg Körpergewicht an 2 bis 3 aufeinander
folgenden Tagen
- Hochdosis-Therapie:
5g/m2 Körperoberfläche in einer 24-Stunden-Infusion
Pharmakokinetik: - In vitro inaktiv, in vivo hochwirksam
- Aktivierung in der Leber durch mikrosomale mischfunktionelle
Oxidasen
- Mittlere Halbwertszeit im Serum t1/2 4 bis 7 Stunden
- Elimination der Muttersubstanz und der Metabolite über Urin
Wirkmechanismus: Bifunktional alkylierend an nukleophilen Zentren in der Zelle, zytotoxische
Aktivität in der späten S- und frühen G2-Phase
IARC-Einstufung: Gruppe 2
R-/S-Sätze: R 45-46-61-36-48/23/24/25
S 53-15-26-45
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines, geruchloses Pulver
- Flammpunkt: Exotherme Zersetzung bei 152°C
- Schmelzbereich: 48-51°C
- Dampfdruck: 1,4∙10-5 hPa (bei 20°C, bestimmt mit Dampfdruckwaage)
- Löslichkeit: 100g/L Wasser, leicht löslich in Ethylacetat
- In Wasser stabil
Toxizität: - LD50 (Ratten) = 568 mg/kg in einer einzelnen Injektion
- Mutagenität nachgewiesen (Ames-Test, S. typhimurium/E. coli positiv,
Mikrokerntest, Maus, positiv)
- Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität aufgrund epidemiologischer
Studien und von Einzelberichten sowie tierexperimenteller Befunde sehr
wahrscheinlich
11 Anhang 162
11.1.6 4-Keto-Ifosfamid (KIF)
Summenformel: C7H13Cl2N2O3P
Molekulargewicht: 275,1 g/mol
CAS-Nr.: [42436-20-4]
Strukturformel:
O N
P
O
NH
Cl
O
Cl
Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid
Namen: 3-(2-Chlorethyl)-2-[(2-chlorethyl)amino]tetrahydro-2-oxid-4H-1,2,3-
oxazaphosphorin-4-on, 4-Oxo-Ifosfamid, 4-Keto-Isophosphamid,
Oxo-Holoxan
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzbereich: 113-115°C
- Löslichkeit: 10g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat, >5% in
Methanol und Ethanol
- Stabil bei Temperaturen unter –20°C
Toxizität: LD50 (Ratten) >800mg/kg in einer einzelnen intraperitonealen Injektion
Abbauprodukt des Zytostatikums Ifosfamid
11 Anhang 163
11.1.7 Carboxyifosfamid (CIF)
Allg. Bemerkung: Liegt als Cyclohexylamin-Salz vor.
Summenformel: C7H15Cl2N2O4P + C6H14N
Molekulargewicht: 392,3 (292,1 + 100,2) g/mol
CAS-Nr.: [53459-52-2]
Strukturformel:
O NH
P
O
NH
Cl
O
OH
Cl
Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid
Namen: 3-((Bis(2-chloroethylamino)phoshinyl)oxy)-propanoic acid cyclohexylamin
Salt, Carboxyisophosphamid
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzbereich: 111-113°C
- Löslichkeit: 100g/L Wasser, sehr gut löslich in Ethylacetat
- Stabil bei Temperaturen unter –20°C
Toxizität: LD50 (Ratten) = 200mg/kg in einer einzelnen intravenösen Injektion
Abbauprodukt des Zytostatikums Ifosfamid
11 Anhang 164
11.1.8 Ifosfamid Mustard (IPM)
Summenformel: C4H11Cl2N2O2P
Molekulargewicht: 221,0 g/mol
CAS-Nr.: [31645-39-3]
Strukturformel:
HO NH
P
O
NH
Cl
Cl
Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid, Wirkform
Namen: N,N'-bis(2-chloroethyl)-phosphorodiamidic acid, Isophosphamid Mustard
Phys. Eigenschaften: - Weißes, kristallines Pulver
- Schmelzpunkt: 112-114°C
- Löslichkeit: <100mg/L Wasser und Ethylacetat, >100mg/L pH7-
Phosphatpuffer
- Temperaturen unter –20°C sind unabdingbar, in Lösung ist IPM nicht
stabil und zerfällt in 2-Chloroethylamin
Toxizität: LD50 (Ratten) 113mg/kg in einer einzelnen in einer einzelnen intravenösen
Injektion, zytostatisch, alkylierendes Agens, möglicherweise teratogen und
kanzerogen wirkend, zytotoxische Aktivität in vitro: 10μg/mL (2h-
Inkubation), Abbauprodukt der Zytostatika Ifosfamid und Glufosfamid
11 Anhang 165
11.1.9 1,3-Oxazolidin-2-on (OXAZ)
Summenformel: C3H5NO2
Molekulargewicht: 87,1 g/mol
CAS-Nr.: [497-25-6]
Strukturformel:
OHN
O
Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid
Name: 2-Aminoethylchlorid-hydrochlorid
Phys. Eigenschaften: - Farblose Kristalle
- Schmelzbereich: 85-89°C
- Löslichkeit: >1g/L Wasser und Ethylacetat
Toxizität: Es liegen keine Daten zur Toxizität vor.
11 Anhang 166
11.1.10 2-Chlorethylamin (CEA)
Allg. Bemerkung: Es liegt als Hydrochlorid-Salz vor.
Summenformel: C2H6ClN ∙ HCl
Molekulargewicht: 116,0 (79,5+36,5) g/mol
CAS-Nr.: [870-24-6]
Strukturformel:
H2N
Cl
Zytostatika-Typ: Metabolit von Ifosfamid
R-/S-Sätze: R 36/37/38 Xi - Reizend
S 26-36
Phys. Eigenschaften: - Farblose Kristalle
- Schmelzbereich: 140-150°C
- Siedepunkt: 220°C (64mbar)
- Löslichkeit: >1g/L Wasser und Ethylacetat
Toxizität: Es liegen keine Daten zur Toxizität vor.
11 Anhang 167
11.2 Arbeitsanweisung für die Anreicherung der Substanzen
11.2.1 Gruppe 1: Cyclophosphamid, 4-Keto-Cyclophosphamid, Carboxyphosphamid,Ifosfamid, 4-Keto-Ifosfamid, Carboxyifosfamid, Ifosfamid Mustard
Vorlage: 500mL dotiertes Oberflächenwasser oder 500mL mit internem Standard
versehene Abwasserproben aus den Abläufen der untersuchten Kliniken
Probenvorbereitung: → Einstellung des pH-Wertes auf 4 mittels Gabe von Kaliumdihy-
drogenphosphat (KH2PO4) und Diphosphorpentoxid (P4O10),
→ Dotierung mit dem internen Standard d4–Cyclophosphamid
(d4-CP) entsprechend der zu erwartenden Substanzmengen
Sorbens: Extraktionsdisk: C18, 47mm (Bakerbond®, Speedisk®, J.T. Baker)
Konditionierung: → Zum Aufrichten der C18-Gruppen im Sorbens einmalige Gabe von
25mL Methanol, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Versetzen der Phase mit auf pH-Wert 4 eingestelltem Phosphat-
puffer, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Wenn notwendig, beim Durchlaufen leichtes Vakuum anlegen
Probenaufgabe: → Extraktionsdisk mit Probe befüllen
→ Entweder Adapter anschließen oder stets per Hand Probe
nachfüllen, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Probe durchsaugen, dabei Flußgeschwindigkeit durch allmähliche
Erhöhung des Unterdruckes soweit möglich konstant halten
→ Nach vollständiger Aufgabe der Probe Adapter entfernen
Waschschritt: -----
Trocknen: 15 Minuten Luft durch die Kartusche saugen
Elution: → Entsprechende Fläschchen zur Aufnahme des Elutionsmittels
einsetzen
→ Dreimal jeweils 3mL Acetonitril auf die Phase geben, 2 Minuten
einwirken lassen, dann langsam durchsaugen
11 Anhang 168
Einengen: → Eluat nach und nach in ein 2mL-Vial überführen und bei 80°C in
einem leichten Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) bis zur
Trockne einengen
Derivatisierung: → Aufnahme in 200µL etherischer Diazomethan-Lösung
→ Kurz schütteln und 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren
lassen
→ Anschließend im Inertgasstrom bis zur Trockne einengen
→ Aufnahme in 100µL Ethylacetat
→ Hinzugabe von 100µL Trifluoressigsäureanhydrid
→ Kurz schütteln und dann 1 Stunde bei 70°C reagieren lassen
→ Erneut bis zur Trockne einengen und mit 100µL Ethylacetat
aufnehmen
Analytik: 1µL der Lösung mit GC analysieren
Säule: DB-XLB (Macherey-Nagel, Polysiloxan-Gerüst mit 88% Methyl- und
12% Phenylbelegung, 30m x 0,25mm x 0,25µm)
Injektorgradient: 70°C → ° sC /16 300°C
Ofengradient: 70°C → ° min/20 C 300°C
MS-Detektion:
Substanz Vorläufer-Ion Tochter-/SIM-Ion
Cyclophosphamid 307 212
4-Keto-Cyclophosphamid 239 209
Carboxyphosphamid 317 231
Ifosfamid 307 212
4-Keto-Ifosfamid 335 281
Carboxyifosfamid 324 158
Ifosfamid Mustard 187 110
11 Anhang 169
11.2.2 Gruppe 2: Cyclophosphamid Mustard
Vorlage: 500mL dotiertes Oberflächenwasser oder Abwasserproben ohne
internen Standard aus den Abläufen der untersuchten Kliniken
Probenvorbereitung: → Einstellung des pH-Wertes auf 7 mittels Gabe von di-Kaliumhy-
drogenphosphat (K2HPO4) und Diphosphorpentoxid (P4O10)
Sorbens: Extraktionsdisk: C18 Polar Plus, 47mm
(Bakerbond®, Speedisk®, J.T. Baker)
Konditionierung: → Zum Aufrichten der C18-Gruppen im Sorbens einmalige Gabe von
25mL Methanol, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Versetzen der Phase mit auf pH-Wert 7 eingestelltem Phosphat-
puffer, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Wenn notwendig, beim Durchlaufen leichtes Vakuum anlegen
Probenaufgabe: → Extraktionsdisk mit Probe befüllen
→ Entweder Adapter anschließen oder stets per Hand Probe
nachfüllen, Scheibe nicht trockenlaufen lassen!
→ Probe durchsaugen, dabei Flußgeschwindigkeit durch allmähliche
Erhöhung des Unterdruckes soweit möglich konstant halten
→ Nach vollständiger Aufgabe der Probe Adapter entfernen
Waschschritt: -----
Trocknen: 15 Minuten Luft durch die Kartusche saugen
Elution: → Entsprechende Fläschchen zur Aufnahme des Elutionsmittels
einsetzen
→ Dreimal jeweils 3mL Acetonitril auf die Phase geben, 2 Minuten
einwirken lassen, dann langsam durchsaugen
Einengen: → Eluat nach und nach in ein 2mL-Vial überführen und bei 80°C in
einem leichten Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) einengen bis
auf einen Rückstand von etwa 10µL
11 Anhang 170
Derivatisierung: → Aufnahme in 200µL etherischer Diazomethan-Lösung
→ Kurz schütteln und 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren
lassen
→ Anschließend im Inertgasstrom einengen bis auf einen Rückstand
von etwa 10µL
→ Aufnahme in 100µL Ethylacetat
→ Hinzugabe von 100µL Trifluoressigsäureanhydrid
→ Kurz schütteln und dann 1 Stunde bei 70°C reagieren lassen
→ Erneut bis auf einen Rückstand von etwa 10µL einengen und mit
100µL Ethylacetat aufnehmen
Analytik: 1µL der Lösung mit GC analysieren
Säule: DB-XLB (Macherey-Nagel, Polysiloxan-Gerüst mit 88% Methyl- und
12% Phenylbelegung, 30m x 0,25mm x 0,25µm)
Injektorgradient: 70°C → ° sC /16 300°C
Ofengradient: 70°C → ° min/20 C 300°C
MS-Detektion:
Substanz Vorläufer-Ion Tochter-/SIM-Ion
Cyclophosphamid Mustard 188 63
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Lebenslauf
Name: Rüdiger Wolfgang Kohl
Geburtsdatum/-ort: 17. September 1972 in Essen
Nationalität: deutsch
Schulbildung
Grundschule: 1979 – 1983 Bardelebenschule, Essen
Gymnasium: 1983 – 1992 Don-Bosco Gymnasium, Essen
Abitur: Juni 1992
Wehrdienst
10/92 – 12/92: 7. Gebirgssanitätsbataillon, Kempten/Allgäu
01/93 – 09/93: Untersuchungsinstitut des Sanitätsdienstes der Bundeswehr III,
Düsseldorf
Studium der Chemie
Vordiplom: Oktober 1995
Diplomhauptprüfung: Oktober 1997
Diplomarbeit: Oktober 1997 – April 1998
„Gaschromatographische Bestimmung von Cyclophosphamid und
Ifosfamid in biologischen Matrices mit massenspektrometrischer
Detektion“, Betreuung Prof. Dr. H.-J. Götze
Promotion: Mai 1998 – April 2002
„Spurenanalytische Erfassung zytostatisch wirksamer Stickstoff-Lost-
Derivate in aquatischen Umweltkompartimenten mittels
gaschromatographischer Verfahren – Entwicklung, Optimierung,
Validierung, Realprobenmessungen“, Betreuung Prof. Dr. H.-J.
Götze
Danksagung
Eine solche Arbeit völlig ohne jegliche Unterstützung anzufertigen, erscheint im Rückblick
unmöglich und somit Dank unerläßlich. Dies jedoch birgt die Gefahr, jemandem ungewollt die
Erwähnung zu verweigern oder eine bestimmte Reihenfolge nicht einzuhalten. Anyway...
Der erste und ganz große Dank gilt meiner Mutter und meiner Schwester. Ohne ihre Liebe und
Unterstützung moralischer, finanzieller und nahrungstechnischer Natur ;-) wäre mein gesamtes
Studium und diese Arbeit schlichtweg nicht möglich gewesen. Sie litten stets und zweifelten nie.
Meiner Arbeitsgruppe – Patrick Kursawe, Oliver Lerch und Thorsten Teutenberg – sowie
Thekla Kiffmeyer und MJ Dolny danke ich zutiefst für vier unglaublich tolle Jahre in unseren
heiligen Hallen und anderswo, für den wissenschaftlichen sowie vor allem für den
unwissenschaftlichen Austausch – schlichtweg für die Freundschaft, die sie mir geschenkt haben.
Ich danke auch all meinen anderen Freunden und Bekannten, die mich im Laufe der Jahre des
Studiums und der Promotion durch so viele Freuden und Schwierigkeiten begleitet haben.
Wieviel Kraft man aus einem Anruf zur rechten Zeit oder aus der Gewißheit, willkommen zu
sein, schöpfen kann... glücklich, wer solche Freunde sein „Eigen“ nennen kann.
Der Firma Axel Semrau GmbH & Co. und hier im speziellen Herrn Dr. Andreas Bruchmann gilt
mein Dank für den stets prompten technischen Support, für die offene und freundliche
Aufnahme meinerseits als neuen Mitarbeiter in der Firma sowie für die mir gewährten Freiheiten
während meiner Promotionszeit.
Spezielle Erwähnung finden soll an dieser Stelle noch der heldenhafte Einsatz von Thorsten
Teutenberg, Oliver Lerch und meiner Mutter, die die Rohfassung dieser Dissertation lesen und
korrigieren mußten.