JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
37
[REVIEW] PRODUKSI PROTEIN HBsAg MENGGUNAKAN SISTEM EKSPRESI
Pichia pastoris UNTUK PENGEMBANGAN VAKSIN HEPATITIS B
Patricia Gita Naully
Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Jenderal Achmad Yani Cimahi
_________________________________________________________________________
Abstrak
Hepatitis B adalah peradangan hati yang disebabkan oleh Virus Hepatitis B (VHB). Penyakit ini
sudah menjadi masalah dunia. Pengobatan penyakit hepatitis B tergolong mahal dan tidak selalu
tersedia di negara berkembang. Oleh sebab itu, penyakit ini perlu dicegah menggunakan vaksin
hepatitis B yang mengandung protein permukaan VHB (HBsAg). Vaksin tersebut sudah lama
ditemukan, namun hingga saat ini berbagai penelitian masih dilakukan untuk menemukan
sistem ekspresi yang paling efisien dalam memproduksi protein HBsAg. Sistem ekspresi Pichia
pastoris memiliki banyak keunggulan jika dibandingkan dengan sistem ekspresi yang lain. P.
pastoris menyediakan banyak pilihan promoter yang kuat dan dapat diregulasi. Sudah banyak
strain dan vektor ekspresi yang dikembangkan untuk mempermudah proses produksi protein
rekombinan di P. pastoris. Selain itu, beberapa hasil penelitian membuktikan bahwa P. pastoris
mampu memproduksi protein HBsAg dengan struktur protein yang sesuai. Sistem ekspresi P.
pastoris pun mudah dimanipulasi sehingga tersedia berbagai macam cara untuk meningkatkan
produksi protein HBsAg. Oleh karena itu, sistem ekspresi P. pastoris dapat dijadikan alternatif
untuk memproduksi protein HBsAg.
Kata Kunci: HBsAg, Ekspresi, Pichia pastoris, Vaksin, Hepatitis B
Abstract
Hepatitis is an inflammation of the liver that is caused by hepatitis B virus (HBV) infection.This
disease has become a worldwide problem. Treatment for hepatitis B is relatively expensive and
not always available in developing countries. Therefore, this disease needs to be prevented
using a vaccine containing hepatitis B surface antigen (HBsAg). Such vaccine has long been
found, but the most suitable expression system to produce HBsAg protein is still being
developed. Pichia pastoris is one choice of expression system which has several advantages,
compared to other expression systems. P. pastoris provides many strong promotors that can be
regulated. Numerous strains and expression vectors have been developed to simplify the process
of recombinant proteins production using P. pastoris. In addition, some studies show that P.
pastoris is capable of producing HBsAg protein with an appropriate protein structure. P.
pastoris expression system is capable to be manipulated in various ways to increase the
production of HbsAg protein. It can be concluded that the P. pastoris expression system can be
used as an alternative to producing protein of HBsAg.
Key words: HBsAg, Expression, Pichia pastoris, Vaccine, Hepatitis B
________________________________________________________________________
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
36
PENDAHULUAN
Penyakit hepatitis B adalah
peradangan hati yang disebabkan oleh
Virus Hepatitis B (VHB). Penyakit tersebut
telah tersebar luas di dunia. Sebanyak 2
miliar manusia diperkirakan telah terinfeksi
oleh virus tersebut, 350 juta diantaranya
telah berkembang menjadi infeksi kronis
yang menghasilkan 600.000 kematian
setiap tahunnya (WHO, 2012). Data
statistik menunjukkan bahwa penyakit
hepatitis B masuk ke dalam 10 besar
penyakit yang menyebabkan kematian,
bahkan 80% kanker hati di dunia
disebabkan oleh penyakit hepatitis B
(WHO, 2009). VHB dapat ditularkan
melalui pemaparan mukosa terhadap darah
atau cairan tubuh lain yang terinfeksi
termasuk cairan semen dan vaginal. Infeksi
VHB kronis dapat menyebabkan kematian
prematur yang disebabkan penyakit terkait
VHB seperti sirosis hati, dan kanker
hepatoseluler (Hilman et al., 2002).
Hepatitis B dapat diobati dengan
pemberian interferon dan senyawa antiviral,
namun pengobatan tersebut membutuhkan
biaya besar dan tidak selalu tersedia di
negara berkembang. Selain itu, lamanya
waktu pengobatan dapat menyebabkan
virus menjadi resisten terhadap berbagai
obat yang digunakan (Shu et al., 1987).
Oleh sebab itu, penyakit hepatitis B perlu
dicegah dengan pemberian vaksin (WHO,
2012). Vaksin hepatitis B mengandung
protein permukaan VHB (HBsAg). HBsAg
adalah subpartikel yang disekresikan oleh
sel inang selama proses infeksi
berlangsung. Adanya HBsAg yang
berbentuk Virus Like Particle (VLP) di
dalam darah dapat menginduksi
pembentukan antibodi untuk mengeliminasi
VHB (Lunsdorf et al., 2011).
Vaksin hepatitis B sudah ditemukan
sejak tahun 1981 (Moticka, 2015). Sampai
saat ini, vaksin tersebut sudah mengalami
banyak perkembangan terkait dengan cara
produksi protein HBsAg. Oleh karena itu,
artikel ini bertujuan untuk mengulas tiga
poin bahasan yang meliputi perkembangan
vaksin hepatitis B, sistem ekspresi P.
pastoris, dan ekspresi gen pengkode protein
HBsAg pada P. pastoris.
Perkembangan Vaksin Hepatitis B
Vaksin hepatitis B pertama kali
diproduksi dengan cara mengisolasi HBsAg
dari plasma darah karier VHB. Cara ini
hanya bertahan selama sepuluh tahun
karena memiliki banyak kelemahan, yaitu
adanya potensi kontaminasi, keterbatasan
plasma karier VHB, dibutuhkan prosedur
purifikasi serta inaktivasi agar vaksin yang
dihasikan terbebas dari virus dan agen lain
yang mungkin terdapat di dalam plasma
(Lunsdorf et al., 2011). Hal tersebut
menyebabkan biaya produksi HBsAg cukup
tinggi sehingga harga plasma derived
vaccine kurang terjangkau terutama untuk
negara berkembang yang pada umumnya
memiliki tingkat prevalensi tinggi terhadap
penyebaran VHB (Steephen, 1988).
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
37
Selanjutnya HBsAg diproduksi
dengan cara yang lebih aman, yaitu dengan
teknologi DNA rekombinan. Cara ini masih
bertahan sampai sekarang walaupun terjadi
beberapa kali perubahan sistem ekspresi.
Sistem ekspresi yang pertama kali
digunakan untuk memproduksi HBsAg
rekombinan adalah sel eukariot. Ekspresi
HBsAg di sel China Hamster Ovary (CHO)
telah berhasil dilakukan, namun jumlah
HBsAg yang diproduksi sangat sedikit.
Selain itu, CHO membutuhkan perlakuan
yang cukup rumit sehingga tidak efektif
digunakan dalam skala industri (Porro et
al., 2005; Liu et al., 2009).
Oleh karena itu pemilihan sistem
ekspresi beralih ke bakteri Escherichia coli.
Sistem ekspresi E. coli menawarkan sistem
yang sederhana dan mudah dimanipulasi,
namun ternyata tidak berdampak positif
pada produksi HBsAg. Penelitian yang
dilakukan oleh Fujisawa et al (1983)
menunjukkan bahwa E. coli yang membawa
gen pengkode HBsAg mengalami inhibisi
pertumbuhan dan memproduksi antigen
dengan level yang sangat rendah. Hasil
deteksi secara langsung menggunakan
immunoassay menunjukkan bahwa HBsAg
yang diproduksi berinteraksi lemah dengan
anti-HBsAg. Hal ini terjadi karena HBsAg
yang diproduksi E.coli tidak mengalami
glikosilasi (Mackay et al, 1981).
Mikroorganisme prokariot seperti E.coli
tidak menyediakan proses modifikasi
protein paska translasi seperti yang terjadi
pada sel eukariot.
Untuk mengatasi permasalahan ini,
industri mulai menggunakan sistem
ekspresi Saccharomyces cerevisiae.
Ekspresi protein HBsAg di S. cerevisiae
telah berhasil dilakukan, namun masih
terdapat beberapa kekurangan. Tingkat
ekspresi HBsAg di S. cerevisiae cukup
rendah (Balamurugan et al., 2007) dan
HBsAg yang diproduksi mengalami
hiperglikosilasi sehingga menyebabkan
perbedaan imunogenisitas (Grinna &
Tschopp, 1989). Selain itu, dalam penelitian
Yang et al (2000), dibuktikan bahwa
plasmid yang digunakan pada sistem
ekspresi S. cerevisiae tidak cukup stabil
sehingga sulit untuk memperoleh kultur
dengan densitas yang besar dan
membutuhkan biaya yang mahal dalam
proses produksi skala besar.
Sistem Ekspresi Pichia pastoris
Sistem ekspresi P. pastoris dapat
digunakan sebagai alternatif untuk
menghasilkan protein rekombinan. P.
pastoris memiliki beberapa keunggulan,
yaitu tingkat ekspresi protein tinggi dengan
media pertumbuhan yang relatif murah
(Balamurugan et al., 2007), mudah untuk
diskalakembangkan (Cereghino & Cregg,
2000), mampu melakukan modifikasi
protein paska translasi (Vassileva et al.,
2001;), dan menyediakan promotor yang
sangat kuat sehingga memiliki tingkat
ekspresi tinggi baik secara ekstraseluler
maupun intraseluler (Awan, 2008). Protein
rekombinan yang diproduksi oleh P.
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
38
pastoris tidak mengalami hiperglikosilasi
seperti pada S. cerevisiae. P. pastoris hanya
menambahkan sekitar 8-14 residu manosa
per sisi rantai sedangkan S. cerevisiae
menambahkan 50-150 redisu manosa
(Balamurugan et al., 2007).
1. Karakteristik Umum Pichia pastoris
P. pastoris adalah ragi metilotropik
yang dapat menggunakan metanol sebagai
sumber karbon tunggal. Metabolisme
metanol pada P. pastoris diawali dengan
proses oksidasi metanol oleh enzim alcohol
oksidase (AOX) menjadi formaldehid dan
hidrogen peroksida. Menurut Yurimoto et
al (2011), metabolisme metanol diregulasi
melalui dua cara yaitu represi dan aktivasi
gen spesifik metanol. Proses represi terjadi
ketika P. pastoris tumbuh pada medium
yang mengandung glukosa dan mengalami
aktivasi ketika tumbuh pada medium yang
mengandung metanol.
Berdasarkan kemampuan
menggunakan metanol dan keberadaan gen
AOX1 dan AOX2 pada kromosom, fenotip
P. pastoris terbagi menjadi tiga, yaitu
methanol utilization plus (Mut+), methanol
utilization slow (Muts), dan methanol
utilization minus (Mut-) (Cereghino &
Cregg, 2000). P. pastoris Mut+ dapat
tumbuh dengan laju tinggi pada medium
yang mengandung metanol karena masih
memiliki gen AOX1 dan AOX2. P. pastoris
Mut-
tidak memiliki kedua gen AOX
sehingga tidak dapat tumbuh pada medium
yang mengandung metanol. P. pastoris
Muts masih memiliki salah satu gen AOX
sehingga laju pertumbuhan pada medium
yang mengandung metanol lebih rendah
dibandingkan dengan kelompok Mut+.
2. Strain dan Promoter
P. pastoris memiliki beberapa jenis
strain seperti pada tabel 1. Setiap strain
memiliki karakteristik yang berbeda. Strain
P. pastoris yang umum digunakan untuk
produksi protein rekombinan adalah GS115
dan KM71. Kedua strain ini telah
mengalami mutasi pada gen histidinol
dehidrogenase (his4) yang bertanggung
jawab untuk mensintesis asam amino
histidin (Balamurugan et al., 2007).
Strain Mutasi Fenotip Referensi
GS115 Delesi gen his4 Mut+ dan His
- Balamurugan et
al., 2007
KM71 Delesi gen AOX1 dan hi4 Muts dan His
- Romanos, 1995
X-33 Tidak ada Mut+ dan His
+ Araya et al., 2012
MC100-3 Delesai gen AOX1 dan
AOX2
Mut- Cereghino &
Cregg, 2000
SMD1163, SMD
1165, SMD 1168
Delesi gen pep4 Defisiensi protease Higgins & Cregg,
1998
Tabel 1. Daftar Strain P. pastoris
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
39
P. pastoris memiliki beberapa
promoter pada sistem ekspresinya seperti
terangkum dalam tabel 2. Promoter AOX1
yang kuat, dapat diregulasi dan diinduksi
oleh metanol. Promoter GAP memiliki
tingkat ekspresi yang tinggi pada medium
yang mengandung gliserol, glukosa, dan
metanol, namun promoter ini tidak dapat
direpresi (Jahic, 2006). Promoter FLD1
dapat diinduksi dengan metanol atau
metilamin pada medium yang mengandung
glukosa (Higgins & Cregg, 1998). Promoter
PEX8 dapat induksi metanol, namun tingkat
ekspresinya rendah pada medium yang
mengandung glukosa (Cereghino & Cregg,
2000). Promoter YPT1 memiliki tingkat
ekspresi rendah pada medium glukosa,
metanol, atau manitol (Balamurugan et al.,
2007).
3. Vektor Ekspresi dan Strategi
Integrasi
Vektor ekspresi yang umum
digunakan untuk P. pastoris (tabel 3)
adalah vektor yang mengandung urutan
nukleotida AOX1 di ujung 3’, urutan
promotor AOX1 di ujung 5’ dan gen
penanda HIS4 (Li et al., 2007). Sampai saat
ini belum ada vektor episomal stabil yang
berhasil dikembangkan untuk P. pastoris.
Oleh karena itu, DNA sisipan biasanya
diintegrasikan pada kromosom P. pastoris
untuk mendapatkan sistem ekspresi yang
stabil. DNA sisipan dapat diintegrasikan ke
dalam kromosom P. pastoris dengan dua
strategi, yaitu rekombinasi homolog pada
satu sisi (single crossover) dan rekombinasi
homolog pada dua sisi (double crossover
atau disebut juga gene transplacement)
(Burdychova et al., 2002).
Strategi integrasi pertama adalah
single crossover dimana integrasi hanya
akan terjadi pada salah satu ujung 3’ urutan
Promoter Induser Referensi
AOX1 Metanol Awan, 2008
GAP Gliserol, Glukosa, Metanol Jahic, 2006
FLD1 Metanol dan Metilamin Higgins & Cregg, 1998
PEX8 Metanol Cereghino & Cregg, 2000
YPT1 Gliserol, Metanol, Manitol Balamurugan et al., 2007
Nama Plasmid Keunggulan Referensi
pPICZ A, B, C Resisten zeocin Higgins & Cregg, 1998
pPIC9K
dan pPIC3.5K
Multi kaset, Resisten ampisilin dan
kanamisin
Romanos, 1995
pAO815 Multi kaset, Resisten ampisilin Cereghino & Cregg, 2000
Tabel 3. Daftar Vektor dalam Sistem Ekspresi P. pastoris
Tabel 2. Daftar Promoter pada Sistem Ekspresi P. pastoris
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
40
nukleotida AOX atau pada gen penanda
HIS4 (Balamurugan et al., 2007). Strategi
ini diawali dengan memasukkan DNA
sisipan ke dalam mutan auksotrof (mutan
his4). Fragmen DNA akan menstimulasi
terjadinya rekombinasi homolog pada satu
sisi (single crossover) dengan frekuensi
tinggi (50-80% transforman His+) (Li et al.,
2007). Rekombinasi homolog pada strategi
ini tidak terjadi pada lokasi yang spesifik
sehingga dapat menyebabkan terjadinya
rekombinasi berulang. Peristiwa tersebut
mengakibatkan adanya perbedaan jumlah
salinan gen target pada vektor ekspresi
dengan jumlah salinan gen target yang
terintegrasi pada kromosom (Burdychova et
al., 2002). Walaupun melalui strategi ini
integran multi salinan mudah didapatkan,
banyak integran yang hanya mengandung
sisi homolog tetapi tidak mengandung
keseluruhan kaset ekspresi (promoter, gen
sisipan, dan terminator) sehingga tidak
menghasilkan protein target. Hanya 5-30%
integran yang memiliki fenotip Muts.
Fenotip P. pastoris yang paling baik
digunakan dalam produksi protein
rekombinan adalah Muts karena P. pastoris
tersebut dapat menghasilkan jumlah protein
lebih tinggi dibandingkan dengan sel yang
berfenotip Mut+. Selain itu, sel yang
berfenotip Muts membutuhkan jumlah
metanol yang lebih sedikit dibandingkan
Mut+ sehingga berguna untuk produksi
dalam skala industri (Li et al., 2007).
Strategi yang kedua adalah gene
transplacement. Pada strategi ini, vektor
ekspresi P. pastoris direstriksi sehingga
menghasilkan fragmen DNA yang
mengandung kaset ekspresi dan gen
penanda (HIS4) yang diapit dengan urutan
AOX1 pada ujung 5’ dan 3’ (Li et al.,
2007). Hal ini dapat menstimulasi
terjadinya gene transplacement pada urutan
nukleotida AOX1. Gen AOX1 akan
terdelesi dan digantikan oleh kaset ekspresi
dan gen penanda. Metode ini akan
menghasilkan 10-20% integran yang
bersifat histidin fototrofik (His+). Karena
adanya gangguan terhadap gen AOX1,
integran ini hanya bergantung pada gen
AOX2 yang ditranskripsikan secara lemah
untuk tumbuh pada metanol dan memiliki
fenotip Muts (Romanos, 1995).
4. Penggunaan Metanol sebagai Induser
Penggunaan metanol dengan
konsentrasi tinggi pada tahap induksi tidak
dianjurkan karena dapat menyebabkan
akumulasi produk beracun seperti
formaldehida dan hidrogen peroksida yang
dapat membahayakan kelangsungan hidup
sel dan produktivitas. Beberapa penelitian
melaporkan bahwa metanol dengan
konsentrasi di atas 2% dapat menghambat
pertumbuhan. Oleh karena itu, konsentrasi
metanol yang direkomendasikan adalah 0.4-
0.6% (Higgins & Cregg, 1998).
Ekspresi Gen Pengkode HbsAg Pada
Pichia pastoris
Beberapa penelitian membuktikan
bahwa P. pastoris dapat memproduksi
protein HBsAg. HBsAg tersebut tidak
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
41
mengalami hiperglikosilasi dan memiliki
struktur protein yang sesuai (Romanos,
1995; Higgins & Cregg, 1998;
Balamurugan et al., 2007). P. pastoris dapat
memproduksi HBsAg dalam jumlah banyak
tanpa membutuhkan waktu yang lama dan
biaya produksi yang tinggi. Gurammkonda
et al, (2009) membuktikan bahwa P.
pastoris mampu memproduksi protein
HBsAg sebanyak 6-7 g/L hanya dalam
waktu 90-160 jam.
Ekspresi gen pengkode HBsAg
diawali dengan pemilihan strain dan
promoter yang sesuai. Strain yang paling
sering digunakan oleh para peneliti dan
terbukti berhasil memproduksi HBsAg
adalah GS115 sedangkan promoter yang
paling kuat dan dapat diregulasi adalah
promoter AOX (Ottone et al., 2007; Liu et
al., 2009; Vassileva et al., 2001; Lunsdof et
al., 2011; Giri-Rachman et al., 2015).
GS115 memiliki fenotip Mut+ namun
proses integrasi gen pengkode HBsAg pada
kromosomnya mengakibatkan P. pastoris
GS115 berubah menjadi Muts. Gen AOX1
pada GS115 digantikan oleh gen pengkode
HBsAg. Dengan menggunakan strain
GS115, peneliti dapat memproduksi HBsAg
dengan cara menginduksi promoter AOX1
dan mendapatkan jumlah biomassa yang
banyak karena P. pastoris GS115 masih
memiliki gen AOX2 yang bertanggung
jawab dalam proses metabolisme metanol.
Pemilihan vektor ekspresi
tergantung pada strain P. pastoris, jenis
seleksi yang dinginkan, dan jumlah salinan
gen yang akan diinsersikan. Jika
menggunakan strain GS115 maka vektor
ekspresi yang dipilih harus mengandung
gen his4 untuk sistem seleksi. Vektor
ekspresi yang mengandung gen his4 dan
sering digunakan dalam penelitian adalah
plasmid pAO815 (Vassileva et al., 2001;
Giri-Rachman et al., 2015) dan pPIC3.5K
(Ottone et al., 2007; Liu et al., 2009).
Kedua plasmid ini dapat digunakan untuk
mengonstruksi multi salinan kaset ekspresi
gen HBsAg. Plasmid pPIC3.5K
menyediakan sistem seleksi yang lebih
banyak dari pAO815, yaitu ampisilin dan
kanamisin (Romanos, 1995).
Ekspresi gen sHBsAg pada P.
pastoris GS115 dapat ditingkatkan dengan
beberapa cara, salah satunya dengan
meningkatkan jumlah salinan kaset ekspresi
yang diintegrasikan di dalam kromosom.
Giri-Rachman et al (2015), berhasil
meningkatkan produksi HBsAg dengan cara
mengintegrasikan empat salinan kaset
ekspresi gen pengkode HBsAg. Bahkan
sebelumnya Vassileva et al (2001), berhasil
mengintegrasi delapan salinan kaset
ekspresi gen pengkode HBsAg pada
kromosom P. pastoris GS115. Pada kedua
penelitian tersebut dibuktikan bahwa
jumlah protein HBsAg yang diproduksi
semakin tinggi seiring meningkatkan
jumlah salinan kaset ekspresi yang
diintegrasikan.
Strategi integrasi yang
direkomendasikan untuk mengekspresikan
multi kaset ekspresi gen HBsAg adalah
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
42
gene transplacement. Metode tersebut
memungkinkan beberapa salinan gen
terintegrasi pada lokus yang sama sehingga
terjadi pengulangan gen pada kromosom
secara berurutan. Tetapi menurut Wang et
al (1996), metode integrasi gene
transplacement dapat menyebabkan
rekombinasi eksisional sehingga gen asing
dapat terlepas dari kromosom (looped out).
Ketidakstabilan integrasi gen pada
kromosom P. pastoris akibat rekombinasi
eksisional dapat meningkat karena adanya
metanol dalam medium (Zhu et al., 2009).
Di sisi lain, Giri-Rachman et al (2015)
membuktikan bahwa integrasi empat
salinan kaset ekspresi gen pengkode
HBsAg masih bersifat stabil sampai 100
generasi. Hasil penelitian Naully (2015)
juga membuktikan bahwa kestabilan
integrasi multi kaset ekspresi gen HBsAg
pada kromosom P. pastoris bukan hanya
dipengaruhi oleh strategi integrasi dan
keberadaan metanol, namun dipengaruhi
pula oleh jumlah salinan kaset ekspresi gen
pengkode HBsAg, konsentrasi metanol, dan
volume kultur yang digunakan. Tingginya
jumlah salinan kaset ekspresi gen pengkode
HBsAg harus diimbangi dengan rendahnya
konsentrasi metanol dan volume kultur.
Selain dengan meningkatkan
salinan gen, produksi HBsAg pada P.
pastoris dapat ditingkatkan dengan
menggunakan metanol sebagai induser
dengan konsentrasi yang optimum.
Konsentrasi metanol optimum pada setiap
produksi protein rekombinan dapat
berbeda-beda. Untuk produksi beberapa
protein rekombinan, konsentrasi metanol
yang tinggi justru dapat berdampak negatif
bagi P. pastoris (Murray et al., 1989;
Jimenez et al., 1997). Untuk produksi
HBsAg, Naully (2014) dan Giri-Rachman
et al (2015) membuktikan bahwa metanol
dengan konsentrasi 2% justru berdampak
positif bagi tingkat ekspresi HBsAg dan
pertumbuhan P. pastoris. Penelitian
tersebut juga membuktikan bahwa semakin
lama waktu induksi semakin banyak pula
protein HBsAg yang dihasilkan.
Banyak para peneliti
mempertanyakan imunoreaktivitas HBsAg
yang diproduksi oleh P. pastoris. HBsAg
yang digunakan sebagai vaksin hepatitis B
harus berbentuk virus like particle (VLP)
agar bersifat imunoreaktif. Dalam
penelitian Lunsdorf et al (2011),
keberadaan dan lokasi HBsAg selama
produksi diamati dengan mikroskop
elektron dan pelabelan immunogold.
Terdapat perbedaan antara sel P. pastoris
yang tumbuh pada medium gliserol dan sel
yang telah terpapar metanol. Sel yang telah
terpapar metanol membentuk peroksisom
berisi enzim yang berguna dalam jalur
metabolisme metanol dan irregular cloud-
shape area. Penelitian lebih lanjut
menunjukkan bahwa irregular cloud-shape
area tersusun dari lamela berlapis. Hasil
pelabelan immunogold menunjukkan
bahwa HBsAg diproduksi di dalam lamela
berlapis. Ekspresi HBsAg pada P. pastoris
menyebabkan terjadinya translokasi protein
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
43
ke retikulum endoplasma dan membentuk
perpanjangan retikulum endoplasma.
Perpanjangan retikulum endoplasma ini
yang membentuk lamela berlapis.
Protein HBsAg asli memiliki sinyal
sekresi N-terminal yang mengarahkan
protein pada sel mamalia bertranslokasi ke
retikulum endoplasma tanpa pembelahan
sekuen N-terminal. Sinyal sekresi ini
dikenali juga oleh P. pastoris sehingga
HBsAg mengalami translokasi ke lumen
retikulum endoplasma tetapi tidak diproses
di jalur sekretori (Lunsdorf et al., 2011).
Pada sel mamalia, partikel HBsAg atau
VLP diproses melalui jalur sekretori dan
disekresikan ke lingkungan eksternal. Pada
sel mamalia, VLP terbentuk di retikulum
endoplasma namun prosesnya berlangsung
lambat. Ada beberapa faktor pada mamalia
yang menyebabkan terjadinya disfungsi
jalur sekretori yang mengakibatkan
gagalnya perakitan VLP. Oleh karena itu,
tetap lebih baik mengekspresikan HBsAg di
P. pastoris karena dapat memproduksi
protein HBsAg dengan cepat walaupun
tidak membetuk VLP. VLP dapat dibentuk
secara in vitro melalui proses hilir seperti
purifikasi dan penggabungan lisat dengan
detergen.
SIMPULAN
P. pastoris adalah ragi metilotropik
yang menawarkan sistem ekspresi dengan
banyak keunggulan. P. pastoris sudah
terbukti dapat memproduksi protein HBsAg
dengan struktur protein yang benar. Jumlah
HBsAg yang diproduksi oleh P. pastoris
dapat ditingkatkan dengan cara
menggunakan promoter AOX,
meningkatkan jumlah salinan gen HBsAg
yang diintegrasikan pada kromosom, dan
menggunakan metanol sebagai induser
dengan konsentrasi yang optimum.
DAFTAR PUSTAKA
Awan, A.R. 2008. Expression study of Pre-
S2 REgion of hepatitis B virus in
Pichia pastoris. University of
Punjab. Lahore. P 98-99.
Araya, G.J.M., Feijoo, S.l., Rosa, D.S.F.,
Veiga, C.P., Villa, T.G. 2012.
“Construction of new Pichia
pastoris X-33 strains for production
of lycopene and b-carotene”. Appl
Microbiol Biotechnol. 93(6): 2483-
2492.
Balamurugan, V., Reddy, G.R.,
Suryanarayana, V.V. S. 2007.
“Pichia pastoris: a notable
heterologous expression system for
the production of foreign proteins
vaccines”. Indiana Journal of
Biotechnology. 6:175-186.
Burdychova, R., Ruzicka, V. Bartos, M.
2002. “PCR-based method for
identification of integration events
in the Pichia pastoris genome”.
Biotechniques. 33: 1214-1218.
Cereghino, J.M. dan Cregg, J.M. 2000.
“Heterologous protein expression
in the methylotrophic yeast Pichia
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
44
pastoris”. FEMS Microbiology
Review. 24: 45-66.
Fujisawa, Y., Ito, Y., Sasada, R., Ono, Y.,
Igarashi, K., Marumoto, R.,
Kikuchi, M., Sugino, Y. 1983.
“Direct expression of hepatitis B
surface antigen gene in E.coli”.
Nucleic Acids Res. 11(11): 3581-
3591.
Giri-Rachman, E.A., Utami, I.W.,
Kusumawardani, S., Retnoningrum,
D.S., Natalia, D., Nurfitriani,
Nadia, G., Naully, P.G., Nurainy,
N. 2015. “Construction, expression
and characterization of multi
cassettes encoding indonesian small
hepatitis B surface antigen (s-
HBsAg) in methylotropic yeast
Pichia pastoris”. Biotechnology. 14
(5): 225-232.
Grinna, I.S dan Tschopp, J.F. 1989. “Size
distribution and general structural
features of N-linked
oligosaccharides from the
methylotrophic yeast Pichia
pastoris”. Yeast. 5: 107- 115.
Gurramkonda, C., Adnan, A., Gabel, T.,
Lunsdorf, H., Ross, A., Nemani, S.
K., Swaminathan, S., Khanna, N.,
Rinas, U. 2009. “Simple high-cell
density fed-batch technique for
high-level recombinant protein
production with Pichia pastoris:
application to intracellular
production of hepatitis b surface
antigen”. Microbial Cell Factories.
8:13.
Higgins, D.R dan Cregg, J. M. 1998. Pichia
Protocols. Humana Press Inc.
New Jersey. P78-80.
Hilman, K., Djajadiredja, S.H., Prasetya, E.,
Meilianau. 2002. “Penatalaksanaan
Hepatitis B Kronik”. Jurnal
Kedokteran Maranatha. 1(2): 1-8.
Jahic, M. 2006. “Process technology for
production and recovery of
heterologous proteins with Pichia
pastoris”. Biotechnol. Prog. 22 (6):
1465-1473.
Jiménez, E.R., Sánchez, K., Roca, H.,
Delgado, J.M. 1997.”Different
methanol feeding strategies to
recombinant Pichia pastoris
cultures producing high level of
dextranase”. Biotechnol Tech.
11:461-466.
Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G.,
Illangovan, K.K., Suzara, V.V.,
Duzgunes, N., Renugopalakrishnan,
V. 2007. “Expression of
recombinant protein in Pichia
pastoris”. Applied Biochemistry
and Biotechnology. 142: 105-124.
Liu, R., Lin, Q., Sun, Y., Lu, X., Qiu, Y.,
Li, Y. 2009. “Expression,
purification, and characterization of
hepatitis B virus surface antigens
(HBsAg) in yeast Pichia pastoris”.
Apply Biochemistry Biotechnology.
158: 432-444.
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
45
Lunsdorf, H., Gurramkonda, C., Adnan, A.,
Khanna, N., Rinas, U. 2011.
“Virus-like Particle production with
yeast: ultrastructural and
immunocytochemical insights into
Pichia pastoris producing high
level of the hepatitis B surface
antigen”. Microbial Cell Factories.
10:48.
Mackay, P., Lees, J., Murray, K. 1981.
“The conversion of hepatitis B core
anitigen synthesised in E. coli into
e antigen”. Journal of Medical
Virology. 8: 237-243.
Moticka, E. 2015. A Historical Perspective
On Evidence-Based Immunology.
1st Ed. Elsevier. New York. P 59.
Murray, W.D., Duff, S.J.B., Lanthier, P.H.
1989. “Induction and stability of
alcohol oxidase in the
methylotrophic yeast Pichia
pastoris”. Appl Microbiol
Biotechnol. 32:95-100.
Naully, P.G. 2014. “Pengaruh Konsentrasi
Metanol Terhadap Pertumbuhan
dan Ekspresi Empat Salinan Kaset
Ekspresi Gen sHBsAg pada Pichia
pastoris GS115”. Skripsi. Program
Studi Mikrobiologi. Institut
Teknologi Bandung. P 30-35.
Naully, P.G. 2015. “Uji Stabilitas dan
Penentuan Jumlah Salinan Kaset
Ekspresi Gen sHBsAg yang
Terintegrasi pada Kromosom
Pichia pastoris GS115. Tesis.
Program Studi Bioteknologi.
Institut Teknologi Bandung. P 38-
43.
Ottone, S., Nguyen, X., Bazin, J., Berard,
C., Jimenez, S., Letourneur, O.
2007. “Expression of hepatitis B
surface antigen major subtypes in
Pichia pastoris and purification for
in vitro diagnosis”. Protein
Expression and Purification. 56:
177-188.
Porro, D., Sauer, M., Branduardi, P.,
Mattanovich, D. 2005. “Review :
recombinant protein production in
yeast”. Molecular Biotechnology.
31: 245-259.
Romanos, M. 1995. “Advances in the Use
of Pichia pastoris for high-level
gene expression”. Current Opinion
in Biotechnology. 6: 527-533.
Shu, L., Toujzian, N., Nan, D., Kushner, N.,
Strong, A.J., Zeping, W. 1987.
“Selective synthesis and secretion
of particles composed of the
hepatitis B virus midle surface
protein directed by a recombinant
vaccina virus : induction of
antibodies to Pre-S and S epitopes”.
American Society for Microbiology.
61: 1286-1290.
Steephen, J. 1988. “Recombinant versus
plasma-derived hepatitis B vaccines
: issues of safety, immunogenicity
and cost effectiveness”. Vaccine. 6:
299-303.
Vassileva, A., Chugh, D.A., Swaminathan,
S., dan Khanna, N. 2001. “Effect of
JSTFI
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Vol.VI, No.1, Januari 2017
46
copy number on the expression
levels of hepatitis B surface antigen
in the methylotrophic yeast Pichia
pastoris. Prot Expres Purif. 21: 71-
80.
Wang, X., Wang, Z., Da Silva, N. A. 1996.
“G418 selection and stability of
cloned genes integrated at
chromosomal delta sequences of
Saccharomyces cerevisiae”.
Biotechnol Bioeng. 49:45–51.
WHO. 2012. “Hepatitis B”. World Health
Organization. 204: 1-5.
WHO. 2009. “Hepatitis B vaccine”. Weekly
Epidemiological Record. 84: 405-
420.
Yang, J.Y., Hui, J.Y., Li, G.D., Wang, Y.,
Yuan, H.Y. 2000.”Expression of
the recombinant hepatitis B virus
surface antigen carrying preS
epitopes in Pichia pastoris” Sheng
Wu Hua Hseueh Yu Sheng Wu Wu
Li Xue Pao. 32: 139- 144.
Yurimoto, H., Oku, M., Sakai, Y. 2011.
“Yeast methylotrophy: metabolism,
gene regulation and peroxisome
homeostasis”. International
Journal of Microbiology. 2011:1-8.
Zhu, T., Guo, M., Sun, C., Qian, J., Zhuang,
Y., Chu, J., Zhang, S. 2009. “A
systematical investigation on the
genetic stability of multi-copy
Pichia pastoris strains”. Biotechnol
Lett. 31:679-684.