PCR
• von Kary B. Mullis entwickelt (1985)
• eigentlich im Mai 1983 bei einer nächtlichen
Autofahrt
• erstes erfolgreiches Experiment am 16.12.1983
• Nobelpreis für Chemie 1993
„Genisolierung in 2 Stunden“:
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Kary B. Mullis
Nobelpreis 1993
„...surfer and scientist...“
Kleppe et al. (1971) J. Mol. Biol. 56:341
Prinzip der PCR
Vervielfältigung der DNA-Abschnitte nach dem Prinzip der
Replikation
Der PCR-Zyklus
1. Denaturierung (94-98°C, 1-60 sec)
2. Primerbindung (50-65°C, 1-60 sec), ca. 5°C unter Tm der Primer
3. DNA-Synthese (72°C, 1 sec bis 12 min u.mehr)
Minimale Sequenzinformation für die PCR:
Beiderseits des zu amplifizierenden Abschnitts
müssen kurze Sequenzabschnitte bereits bekannt
sein, um dort die Bindung definierter Primer
zu ermöglichen!
PCR
Polymerase Kettenreaktion
3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘
5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘
3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘
TTCGA
GATCG
5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘
PCR
Polymerase Kettenreaktion
3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘
TTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT
GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCG
5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘
Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz
• 35-40 Zyklen sinnvoll
Praktische Hinweise zum Primerdesign
• 18-25mere, 40-60% GC, „gut gemischte“ Sequenz
• keine Teile von Repeats: Spezifität über Datenbank-
suchen überprüfen
• 3‘Ende bevorzugt ein G od. C
• keine 3‘ End-Komplementarität der zwei Primer!
(sonst u.U. Primer-Dimer-Bildung)
• keine internen Homopolymer-Runs (>4) oder
„simple sequences“
• keine internen Inverted repeats (>3 Nt im Stamm)
Schmelztemperatur von Primer
• Tm = 4 * ( Anzahl G+C) + 2 * ( Anzahl A+T)
Polymerase
Zunächst: Klenow-Fragment der DNA-
Polymerase aus E. coli
thermolabil, d.h. Zugabe nach jedem Zyklus
Reaktion sehr aufwendig und teuer
Hybridisierung und Polymerisation bei 37°C
Folge: durch Fehlhybridisierung der Primer viele Nebenprodukte
Produktlänge auf 200 Bp beschränkt
Taq DNA Polymerase
aus Thermus aquaticus
T. aquaticus Stamm YT-1,
gesammelt von T. Brock 1967
im Yellowstone Natl. Park
• 892 As, 94 kD
• pH opt. 8,3-8,8
• prozessiv : 60 Nt/sec bei 72°C; 1,5Nt/sec bei 37°C
> 1kb pro Minute synthetisiert
• keine proofreading Aktivität!
Eigenschaften thermostabiler Polymerasen
Mutationsraten verschiedener hitzestabiler
DNA-Polymerasen
1,6 8 20 x 10-6
Pfu
Vent
Taq
Ca. 1 Fehler pro
1 kb - Molekül nach
35 Zyklen
...weitere experimentelle Bedingungen
• Primerkonzentration: ca. 0,5µM; d.h. bis 1013 Moleküle
• Matrize: 0,1-1 µg Genom-DNA; 10 ng Plasmid
• dNTPs: 200 µM Endkonz. (genug für 6 µg DNA)
• Denaturierung: 94-98°C (abhängig von Matrize+Enzym)
• Annealing: 5 bis 10°C niedriger als Tm des Templates
(meist: 52-68°C)
• Extension: ca. 1 min pro kb
Spielarten der PCR
• XL-PCR
• Nested-PCR
• RT-PCR (Reverse Transkriptase + PCR)
• Quantitative PCR
– klassisch oder real-time RT-PCR
• Quantitative PCR
• RACE (rapid amplification of cDNA ends)
• inverse PCR (PCR von flankierenden Regionen)
• In situ PCR
• Mutagenese und Nachweis von bekannter Punktmutationen
• Sondenherstellung
RT-PCR
1. Schritt: Reverse Transkription von mRNA, es entsteht
sogenannte cDNA (complementary DNA)
2. Schritt: PCR
Zielsetzung: welches Gen ist in einer bestimmten Zelle
aktiv
Quantitative PCR
• eine Methode zur Quantifizierung der
Ausgangsmenge an Template in einer Lösung
Voraussetzung : während der exponentiellen Phase der
Amplifikation verläuft die DNA-
Vermehrung linear
Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz
• 35-40 Zyklen sinnvoll
Quantitative PCR
• Prinzip: Vergleich zu
einem Standard-DNA-
Molekül
Real-Time PCR
Quantitative PCR
• Hauptanwendung: Quantifizierung von mRNA z.B.
zum Vergleich von Genexpressionsraten in
verschiedenen Geweben (z.B. zwischen gesunden und
pathogenen Gewebeproben)
Race - rapid amplification of cDNA ends
• Ziel: Vervollständigung
der 5´ bzw. 3´ Ende von
cDNA-Klonen
Inverse PCR
„Long range“ / XL - PCR
• herkömmliche Taq Pol amplifiziert nur ineffizient
Moleküle größer 5-6 kb
• Grund: sich akkumulierende Fehleinbauten am 3‘OH-
Ende können nicht entfernt werden und verhindern
weitere Polymerisierung
• Lösung: Kombination einer prozessiven Taq Pol mit
anderer thermostabiler Pol mit proof-reading-Funktion
> ermöglicht Amplifikation von bis zu > 20 kb
weitere PCR- basierende Methoden
• LM-PCR (Ligation-mediated PCR unter Verwendung
anligierter Linker)
• multiplex PCR (mehrere Amplikons parallel)
• Nested PCR
• hotstart PCR (verbessert Spezifität)
• ...und sehr viele mehr...
Anwendungen der PCR
• Medizinische und mikrobiol. Diagnostik
• Herstellung von Genbanken aus limitierendem Material
• Isolierung von Transkripten (RT-PCR)
• Bestimmung von Transkriptionsstart/endpunkten
• Isolierung von DNA-Abschnitten
• Quantifizierung von DNA und RNA
• „ancient DNA“
• Mutagenese von DNA-Molekülen
• Markierung von Sonden für die Hybridisierung
• Etc...
PCR in der Nahrungsmitteldiagnostik
Rin
d B
4
Mar
ker
Lyo
ner
281 Bp
257 Bp
226 Bp
910 Bp
659 Bp
521 Bp
403 Bp
Rin
d-D
NA
Sch
wei
n-D
NA
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ativ
-K.
PCR-Ansatz
• auf Eis pipettieren!:
• 1 µl genomische DNA (ca. 10-100ng)
• 5 µl 10x PCR-Puffer
• 1 µl 10 mM dNTP-Mix (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)
• 1 µl Primer 1 (10 pmol/µl)
• 1 µl Primer 2 (10 pmol/µl)
• 40 µl A. bidest
• 1 µl Taq-(DNA)-Polymerase (1-2,5 U)
• 50 µl Gesamtvolumen
• mischen, kurz anzentrifugieren, zurück auf Eis
• 1. Denaturierung 94°C 120 sec 1x
• 2. Denaturierung 94°C 30 sec
• 3. “Annealing” 55°C 30 sec 35x
• 4. Elongation 72°C 90 sec
• 5. finale Elongation72°C 6 min 1x
• 4°C ∞
PCR-Programm