Микробиом:современныйвзгляд
КафарскаяЛюдмилаИвановнаЕфимовБорисАлексеевичРНИМУим.Н.И.Пирогова
Кафедрамикробиологииивирусологии
Для изучения микробиоты на протяжении долгих лет использовались классические бактериологические методы. Значительные успехи в области изучения микробиотыв последние годы во многом связаны с использованием молекулярно - генетических технологий. В 2013 завершены Крупные международные многопрофильные проекты Human Microbiome Project (HMP) и metaHIT initiatives, 13 институтов из 8 стран В РФ «Метагеномный анализ биоценоза ЖКТ», выполняется в рамках консорциума «Русский метагеном» Реализуются новые направления – метагеномика, метаболомика, метатранскриптомика, протеомика.
Микробиота
Микробиота
• В на с тоящее время микробио та(нормальная микрофлора) кишечникарассматривается как дополнительный( в и р т у а л ь ный ) м н о г о к л е т о ч ныйметаболически активный «орган»с а м о в о с с т а н а в л и в ающи й с я п р иизменениях, вызванных внешнимифакторами.
Концентрациямикроорганизмовв1фекалийот107втонкойкишке,до1012-14втолстой.
Наборгенов,входящихвсоставбактериальногометагенома,всторазпревышаетнаборгеновчеловеческогоорганизма.
ВДНКчеловекаидентифицировано23000генов.
Вмикробиоме—более10млнгенов.Около 60% фекальных масс составляет бактериальнаяпопуляция. Более 95% бактерий у взрослого человека, принадлежат коблигатныманаэробам;700-800могутбытьвыделеныкультуральнымиметодами.
Методы изучения микробиоты
Культуральныеметоды.Выделениеиидентификациямикроорганизмов
Некультуральные методы – молекулярно-генетические
Методы изучения микробиоты
• Культуральные методы вмикробиологии остаютсяважными для изучениямикробногоразнообразия,д л я с е л е к т и в н о г ов ы д е л е н и япредставителей основныхфункциональных групп, втом числе патогенныхмикроорганизмов.
• Ме т о ды т р у д о ем к и ,д л и т е л ь н ы е ,дорогостоящие.
Методы изучения микробиоты • К у л ь т и в и р о в а н и е
облигатных анаэрбов. А к т и в н ы е ф о р м ы к и сл орода обладают высокой реакционной способностью, вызывают инактивацию ферментов, повреждают молекул ДНК, перекисное окисление липидов.
• К у л ьт и в и р о в а н и е в анаэробных условиях, в
• микроанаэростатах. • С р е д ы Ш е д л е р а , Колумбийский агар с кровью
Методы изучения микробиоты• Насосаудаляетсявоздухинакачиваетсябескислороднаягазоваясмесь,содержащая80%N2,10%CO2и10%H2.
• ПалладиевыекатализаторыкатализируютсвязываниеO2сH2.
• ВозможенпосевоблигатныханаэробовначашкиПетри
Методы изучения микробиоты• Для культивирования облигатных
(особострогих)анаэробов• Пробирки Хангейта, которые
закрываются завинчивающимисяпластиковыми крышками совставкойизрезины.
• П р и п о с т о я н н о м п о т о к ебескислородногогазаразливаетсяп о п р о б и р к а м Х а н г е й т аагаризованнаяпитательнаясреда,проводитсяавтоклавирование
• Посев в незастывшую средуосуществляется путём уколастерильным шприцом сквозьрезиновую вставку, с помощьювращения пробирки добиваютсяравномерного распределениясредыпоеёстенкам.
Биохимическаяидентификация
Методы изучения микробиоты• «Классическаямикробиология»-фенотипическиеметодыидентификации
• Отсутствиеединойконцепцииэволюцииисистематикибактерий
«Новаямикробиология»
• Основананагеносистематике• Физико-химическиеметодыанализа
Методы изучения микробиоты
• М а с с - с п е к т р о м е т р и я — м е т о дидентификации молекул путем измеренияо тношения и х ма с сы к з аряду вионизированномсостоянии.
• M A L D I ( M a t r i x A s s i s t e d L a s e rDesorpson' Ion izason) — ионизациявещества с помощьюматрицыи лазерногоизлучения.TOFMS(TimeOfFlightMass-Spectrometry)—времяпролетнаямасс-спектрометрия.
Выборколониидляидентификации Нанесениематериалаизколониинаслайд
Внесениеподготовленногослайдавприбордляполученияспектрабелковиидентификациибактерии(1минута/образец)
Нанесениематрицынаобразец(1μlαСHCA-коричнаяк-та)
СхемаиспользованияVitecMSPlusдляидентификациимикроорганизмоввклиническоймикробиологическойлаборатории
СхемаработыMALDI-TOF-MSанализатора
• На подложку масс-спектрометра наносят биоматериал из колонии бактерий, смешивается с раствором матрицы, и при испарении растворителя образуется совместный кристалл из них
• Образец помещают в прибор, в котором создается вакуум и подвергают воздействию лазерных импульсов, испаряются кристаллы матрицы содержимое микробных клеток ионизируется
• Под дейс т вием эле к тричес к о го поля ионизированные белки движутся к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам
Масспектрометрия
9 . 0 0 1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 0 1 5 . 0 0 1 6 . 0 0
1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 0
1 e + 0 7
1 . 1 e + 0 7
1 . 2 e + 0 7
1 . 3 e + 0 7
1 . 4 e + 0 7
1 . 5 e + 0 7
1 . 6 e + 0 7
1 . 7 e + 0 7
1 . 8 e + 0 7
1 . 9 e + 0 7
2 e + 0 7
2 . 1 e + 0 7
2 . 2 e + 0 7
2 . 3 e + 0 7
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : K A F - 3 - 2 - 1 . D
Программное обеспечение прибора оценивает время пролетачастиципреобразует этуинформациюв спектрмолекулярныхмасс (масс-спектр).Масс-спектр сравнивается со спектрами избазыданных,происходитидентификациямикроорганизмов наоснованиисведенийомассаххарактеристическихбелков.
Стандартныйвидрабочегоокнамониторавпроцессевыполнениямасс-спектрометрическогоисследованияприработеVitecMSPlus
Масспектрометрия
• Точность:достовернаяидентификациядоуровняподвидов.• Скорость:автоматическаяидентификацияклиническихизолятоввтечениенесколькихминут.• Универсальность:единыйпротоколпробоподготовкидлявсехмикроорганизмов.
ПЦР в реальном времени
• Молекулярно-генетическиеметоды
• При проведении Real-TimeП Ц Р о д н о в р е м е н н опроисходят амплификация,детекция и количественноеопределениеспецифическойпоследовательности ДНК вобразце, автоматическаяр е г и с т р а ц и я иинтерпретация полученныхрезультатов
Секвенирование• Общее название физико-химических методов определения аминокислотных остатков в белках и последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.
• Секвенирование гена 16S рРНК – использует данные о нуклеотидных последовательностях выделенных чистых культур
• Ген 16S рРНК выбран как универсальный маркер для видовой идентификации: он имеется в геномах всех прокариот и о б л а д а е т т н о с и т е л ь н о м а л о й изменчивостью.
Секвенирование• Пр оч т е н и е п о с л ед о в а т ел ь н о с т и осуществляется с помощью постановки ПЦР с праймерами под ген 16S рРНК с п о с л е д у ю щ е й о ч и с т к о й Д Н К и секвенированием.
• Далее последовательность сравнивается с к о м п ь ю т е р н о й б а з о й д а н н ы х с использованием алгоритма BLAST.
• Методсеквенированиягена16SрРНКявляется«золотым стандартом» точности видовойидентификациибактерий.
Типысеквенированияразличаются:
• –Маркерныегены(16SrRNAидр.) • –Полногеномное(shotgun=whole-genome=WGS) • •Попроизводительности
• –ПоСенгеру(метод«обрывацепи») • –Высокопроизводительное(high-throughputsequencing)–Illumina,SOLiD,454,IonTorrent,…
• •Подлинеридов(ДНК-прочтений) • –Длинные(400-1000пн) • –Короткие(35-100пн)
СеквенированиеДНКпоСангеру• Э т о т м е т о д б ы л
использован в проектахпо секвенированиюг е н о м а ч е л о в е к а ,бактерийивирусов.
• Н е п о д х о д и т д л ябыстрого рутинногос е к в е н и р о в а н и ягеномов в клиническихцелях,дорогостоящее.
• Пр е им уще с т в о – с е к в е н и р у е т с я длинный участок ДНК
Пиросеквенирование
• Roche/454LifeSciences. • В с е п л а т ф о рмы 4 5 4 т и п а
используютпиросеквенирование,• Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК, основанный на принципе « с е к в е н и р о в а н и е п у т е м синтеза» . При включении нуклеотида происходит детекция в ы с в о б о ж д а ю щ и х с я п и р оф о сф а т о в , к о т о р ы й с в я з ы в а е т с я с б е л к о м лю ц иф е р а з о й ( б ел о к и з светлячков)
Секвенатор
Высокопроизводительное секвенирование
• Высокопроизводительное секвенирование • Ion Torrent Методология секвенирования: п о с л е д о в а т е л ь н о е у д л и н е н и е ол и г о н у к л е о т и д н о й з а т р а в к и ДНК -полимеразой с одновременной регистрацией л о к а л ь н о г о и з м е н е н и я р Н н а полупроводниковом микрочипе.
Метагеномика• Метагеномика – наука, изучающая совокупность всего генетического материала, полученного из биологического материала или окружающей среды
• Основным отличием при использовании мета геномно го подхода является учет некультивируемых микроорганизмов наряду с культивируемыми.
• Задачи метагеномики: • О п р е д е л и т ь т а к с о н о м и ч е с к о е
( филогенетическое) положение микроорганизмов – « Кто они?»
• Определить функциональное состояние микробиоты, как осуществляют взаимодействие друг с другом «Что делают?»
Классификациямикроорганизмов• Eukaryota- наличие ядра, внутренних мембранных
структур, сложный цитоскелет, наличие процессовмитозаимейоза.
• Bacteria –отсутствие ядра, внутренних мембранныхструктур. В составе клеточной стенки пептидогликан,отсутствиеэндоцитозаиэкзоцитоза.
• Archaea- особый химический состав мембран: онипостроенынаосновепростыхэфировфосфоглицеролаитерпеновыхспиртов.
• Несодержатпептидогликанавклеточнойстенке,имеютособоестроениерибосомирибосомальныхРНК.
Микробиота(нормальнаямикрофлора)–совокупностьвсехмикроорганизмов,населяющихэкологическуюнишу
• Бактерии• Археи• Вирусы• Эукариоты(микроскопическиегрибы)
Микробиота
Все клеточные формы жизни на основании сравнительного анализапоследовательностиих16SрДНКидругихфундаментальныхразличий(аппараты трансляции и транскрипции, организация генетического материала идругое)разделенына
3домена
ВacteriaArchaeaEucaria(Eubacteria-истинныебактерии)Группированына27типов,вт.ч.:ProteobacteriaFirmicutesAc0nobacteriaBacteroidetesSpirochaetesChlamydiaeTenericutesCyanobacteria(сине-зеленыеводоросли)
• Основнойсостав• микробиотыинтестинального
тракта• Представлен7основными• Типами(филами)• Микроорганизмов• Firmicutes,• Bacteroidetes,• Ac0nobacteria,• Proteobacteria• Verrucomicrobia• Fusobacteriа,• Spirochaetes
Микробиота
Микробиота• Низкоесодержаниебактерийвжелудкеи12-перстнойкишке103КОЕ/мл.
• Увеличениеконцентрациив• jejunumиileum104–108КОЕ/мл.• Максимальнаяконцентрациядостигаетсявтолстойкишке109–1013КОЕ/мл.
Микробиота• Б а к т е р и а л ь н а я э к о с и с т е м а пищеварительного тракта усиливает метаболические возможности хозяина, расщепляя сложные растительные полисахариды, в результате образуются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) –ацетат, пропионат и бутират.
• Бутират – масляная кислота, стимулирует рост и пролиферацию энтероцитов, является основным энергетическим субстратом для клеток кишечника.
•
Микробиота• Ацет а т – у кс усн ая к и слот а , метаболит многих индигенных бактерий кишечника проходит через печ ень , пос т у п а е т в к ровь , с т а н о в и т с я э н е р г е т и ч е с к им субстратом для клеток тканей и органов: мышечной ткани, сердца, почек.
• Уксусная и молочная кислота регулируют уровень РН, моторную и секреторную активность кишечника
Микробиота• Бутират регулирует экспрессию генов, связанных
с процессами пролиферации, дифференциации и
апоптоза эпителиальных клеток
• Бутират индуцирует в эпителиальных клетках
кишечника продукцию антимикробных пептидов,
обладает и прямой антимикробной активностью
• Стимулирует синтез муцина и секрецию слизи
• Усиливает процессы репарации поврежденной
слизистой путем ускорения клеточной миграции,
участвуют в общем обновлении слизистого слоя
Анализ результатов секвенированиябиблиотек 16S рРНК и метагеномовбактериальных популяций, населяющихкишечникздоровыхлюдейразныхвозрастовпоказал высокий уровень встречаемостицелого ряда умеренно представленных,н о вых б а к т е ри ал ьных фило т ипо в ,относящихся в основном к трем филумам –Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, и(Wylieetal.,2012).
Микробиота
Микробиота• Преобладающими в интестинальном трактечеловекаследуетсчитать
• Firmicutes(49.%),• Bacteroidetes(30%)• Proteobacteria(3%),• Ac0nobacteria(0.4-1%)• Низкое содержание факульта тивноанаэробных энтеробактерий обусловленорядом факторов, в т.ч. строго анаэробнойсредойтолстойкишки
Микробиота• ТипFirmicutes• ПорядокClostridiales,• Наиболее часто представлен семействамиLachnospiraceae(23.5%)
• Ruminococcaceae(13.6%).• Clostridiaceae(2%)• Микроорганизмы, представители первых 2-хс е м е й с т в с п о с о б н ы э ф ф е к т и в н оферментировать пектин и целлюлозу-важнейшие пищевые волокна, которыеспособны расщепляться только ферментамибактерийвтолстойкишке
Микробиота
• Около 30% от общей численности бактерий,населяющихтолстыйкишечникздоровоговзрослогочеловека принадлежат к порядку BacteroidalesфилумаBacteroidetes(Arumugametal.,2011).
• Данная таксономическая группа включает в свойсоставоблигатно-анаэробные,неспорообразующие,неподвижные, Грам-отрицательные бактерии, восновномсферментирующимтипомметаболизма.
• В последние полтора десятилетия достижения вмолекулярной филогении привели к существеннымизменениямвтаксономиипорядкаBacteroidales.
•
Микробиота• Множествовидов,ранееотносившихсякродуBacteroides были реклассифицированы вновые роды и семейства внутри порядкаBacteroidales (Rauso et al., 2003; Sakamoto &Benno,2006;Hardhametal.,2008).
• Былооткрытоиописанобольшоечислоновыхродовивидов,включаяроды–представителисемейств Porphyromonadaceae (Petrimonas,Barnesiella, Macellibacteroides) и Rikenellaceae(AlisKpes) (Grabowski et al., 2005; Sakamoto etal.,2007;Jabarietal.,2012).
Микробиота• Тип Bacteroidetes • Порядок Bacteroidales (грамнегативные облигатные анаэробы, неспорообразующие, с ферментативным типом метаболизма).
• Семейства: • Bacteroidaceae (12.6 %), • Prevotellaceae (6.6 %) • Porphyromonadaceae (6%) • Rickenellaceae (3.6%).
Микробиота• Семейство Bacteroidaceae • Род Bacteroides
B. ovatus, B.vulgatus, B. fragilis,
• B. thetaiotaomicron. • Не к от о рые штаммы B .
fragilis, • продуцируют энтеротоксин- ф р а г и л и з и н - ц и н к с о д е р ж а щ а я металлопротеиназа,
• н а р у ш а е т с т р у к т у р н о -функциональные контакты между э п и телиоци тами кишечника (Е -кадхерин ) , вызывая их эксфолиацию и гиперсекрецию жидкости.
Микробиота• Продукция фрагилизина кодируется геном (bft)
• У пациентов с колоректальным раком чаще обнаруживался B. fragilis,
• имеющий гены bft, чем в контрольной популяции.
• Возможность B. fragilis длительно поддерживать воспалительный процесс
Микробиота
• Сем. Prevotellaceae • Род Prevotella, • P. melaninogenica
Микробиота
• Сем. Porphyromonadaceae • Род Porphyromonas gingivalis • Porphyromonas endodontales • Barnesiella viscericola • Petrimonas • Coprobacter fastidiosus новый род в 2013 году впервые описан на кафедре микробиологии РНИМУ
• Coprobacter secundus – новый вид в 2015 впервые описан на кафедре микробиологии РНИМУ
Микробиота• Rickenellaceae • Rikenella • Alistipes finegoldii • Alistipes inops новыйвидв2015впервыеописаннакафедремикробиологииРНИМУ
Микробиота
• Наиболее широко представлены с ем е й с т в а R u m i n o c o c c a c e a e , Lachnospiraceae и Clostridiaceae (Firmicutes phylum) и Bacteroidaceae, Rikenellaceae, Porphyromonadaceae and Prevotellaceae (Bacteroidetes phylum)
Факторы,влияющиенасоставмикробиоты
• Изменение состава микрофлоры кишечника у детей раннего возраста связано со многими факторами , основными являются постепенные изменения в диете при переходе от естественного вскармливания к продуктам детского питания и продуктам, характерным для взрослых , а также созреванием иммунной системы под влиянием антигенной стимуляции.
Результаты метагеномного севенирования фекалий ребенка на протяжении 2,5 лет
• Филогенетическое разнообразие микробиомы проявляется постепенно по мере взросления ребенка.
• Гены, функционирование которых связано с метаболизацией углеводовов, содержащихся в продуктах растительного происхождения появлялись в микробиоме ребенк а находящегося исключительно на грудном вскармливании, еще до введения прикорма
Результаты метагеномного севенирования фекалий ребенка на протяжении 2,5 лет
• На фоне лихорадочного состояния в метагеноме регистрировали гены вирусов и грибов.
• Введение раститительной пищи, в к люч ающей г о р о х и б о б о вые с п о с о б с т в о в а л о п о в ы ш е н и ю численности порядка Bacteroidales, повышало концентрацию КЖК
Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке
• П р о в е д е н о с е к в е н и р о в а н и е (высокопроизводительное 454 Roche) гена 16S рнк
• 94% всех образцов принадлежали к доминирующим у всех людей типам Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,
• and Proteobacteria. • Значительные различия выявлены в соотношении этих типов.
Микробиота детей, в возрасте 1-6 лет проживающих в Западной Европе и Африке
• Prevotel la, Xylanibacter (Bacteroidetes) абсолютно доминировали в БФ (Африка) 53% и 20% соответственно.
• Firmicutes в Африканской стране (БФ) составляли лишь 12% (Acetitomaculum, Faecalibacterium, Subdoligranulum).
• Микробиота детей в странах Европы – доминировали Firmicutes 51%
Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке
• Диета играет очень важную роль и определяет состав микробиоты.
• Пищевые продукты употребляемые в Африканских странах содержат клетчатку, бобовые, растительные полисахариды – преимущественно вегетарианская пища. При этом низкое содержанием жира и животного белка.
• Диета с высоким содержанием волокон способствует увеличению «полезной» фракции микробиоты и ее разнообразию
Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке
• Западная диета характеризуется высоким содержанием животного белка, жира, у г л е в о д о в , к р а х м а л а и н и з к и м содержанием волокон.
• Способствует росту неинфекционных кишечных заболеваний ( НЯК, б-нь Крона).
• Оказывает влияние географическое положение страны, уровень гигиены
Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке
Микробиота детей, проживающих в Западной Европе и Африке
• П р о в е д е н о с е к в е н и р о в а н и е (высокопроизводительное 454 Roche) гена 16S рнк
• 94% всех образцов принадлежали к доминирующим у всех людей типам Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,
• and Proteobacteria. • Значительные различия выявлены в соотношении этих типов.
Задачиисследования
•• Исследовать образцы фекалий от здоровыхлюдейразличноговозрастасиспользованиемвысокопроизодительного секвенированиябиблиотекгенов16SрРНК.
• • И с с л е д о в а т ь т е ж е о б р а з ц ы сиспользованиембактериологическогометода
• •Охарактеризовать штаммы бактерий,относящихся к новым видам путем изученияих хемотаксономических признаков исеквенированиягеномныхДНК.
• •Описатьновыебактериальныевиды.
Результаты бактериологического исследования • Всего от 12 человек выделено 836 штаммов анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий. • Среди них определены 121 вид, 48 родов, 11 порядков, 10 классов, 5 филумов домена Bacteria. • Cреди них определены 7 кандидатов в новые виды бактерий (роды Alistipes, Coprobacter, Bacteroides, Prevotel la, семейство Porphyromonadaceae, семейство Ruminococcaceae, Lachnospiraceae), каждый из которых представлен 1-2 штаммами
• Спасибозавнимание