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MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER VERERBUNG
1. Bakterien und Viren als genetische Forschungsobjekte
Bakterium:
Plasmide (kleine Zusatzchromosömchen)
ringförmige DNA, das s. g. „Bakteriumchromosom“
Versuch von Griffith 1928
Pneumokokken: Erreger der Lungenentzündung
S-Stamm: smooth, Kapsel aus Schleim vorhanden, virulent
R-Stamm: rough, Kapsel aus Schleim nicht vorhanden, nicht virulent
Versuch von Avery 1944 (in vitro)
S-Stamm R-Stamm
Pathogen nicht pathogen
Abkochen zum
Abtöten der Bakterien
R-Stamm: keine schützende Schleimhülle,
daher nicht virulent keine Erkrankung
R-Stamm: lebendig
Aber ungefährlich !!
Pneumokokken – Transformationsexperiment
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Die DNA des S-Stamms muss in den lebenden R-Stamm übergegangen sein, dort eingebaut & realisiert wor-
den sein.
= Übertragung von Erbanlagen durch reine blanke DNA
Bei solchen Experimenten arbeitet man oft mit s.g. Mangelmutanten; das sind Mutanten, die die Fähigkeit
zur Herstellung oder Verwertung eines bestimmten Stoffes verloren haben. Sie sind auxotroph in Bezug auf
diesen Stoff.
Gewinnung von Mangelmutanten
Transformation
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Schema der Stempeltechnik
zur Suche nach Mangelmutanten
ohne Lysin
lys-
ohne Leucin
leu-
ohne Valin
val-
Transformation bei Bacillus subtilis
Die Zellen einer Wildtyp-Kultur werden künstliche lysiert.
Mit Phenol werden die Proteine denaturiert.
Das Lysat wird mit Chloroform geschüttelt.
Zentrifugation
Die DNA wird aus der wässrigen Phase gewonnen !!!
Bakterien-
lysat
wässrige Phase
mit DNA
Chloroform-Phase
mit Protein
Bacillus subtilis
auxotropher Stamm im
Vollmedium
Keine Kolonien auf einer
Minimalmedium-
Agarplatte
Bacillus subtilis
auxotropher Stamm im
Vollmedium + DNS aus
Wildtypzellen
Koloniebildung
auf einer Minimalmedium-
Agarplatte
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Ablauf der Transformation
Voraussetzung für die Aufnahme reiner DNA einer Spenderzelle ist ein bestimmter Stoffwechselzustand der
Empfängerzelle, d.h. sie ist kompetent (empfangsbereit). In diesem Zustand werden Rezeptoren auf der
Zellwand gebildet oder aktiviert. Die Spender-DNA muss doppelsträngig vorliegen und eine bestimmte Mo-
lekülgröße aufweisen, damit die Aufnahme durch Endozytose (winzige fingerförmige Einstülpungen der
Zellmembran schnüren kleine mit der aufzunehmenden Substanz gefüllte Bläschen ab, die ins Zellinnere
wandern) in die Empfängerzelle möglich ist.
1. Endozytose
Ein Einzelstrang der Spender-DNA wird mit dem homologen Einzelstrangabschnitt der Empfänger-DNA
verbunden. Bei der anschließenden Integration verdrängt dieser Einzelstrang der Spender-DNA den entspre-
chenden Abschnitt der Empfänger-DNA, der dann ausgeschnitten und abgebaut wird.
2. Integration
Bei der folgenden Replikation wird der eingebaute Spender-DNA-Einzelstrang verdoppelt und bildet eine
durchgehende Doppelhelix, während der nun ungepaarte Empfänger-DNA-Einzelstrang abgebaut wird.
3. Replikation
Vorteile von Bakterien für genetische Untersuchungen:
- Einfach strukturiert, 1 ringförmiges Chromosom (DNA) + Plasmide
Mutation erscheint meist sofort im Phänotyp
- Geringer Aufwand für Kultivierung
- Rasche Vermehrung
- Viele nachkommen statistisch haltbare Ergebnisse
- Keine ethisch-moralischen Bedenken
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Vergleich von VIREN und ZELLEN
VIREN ZELLEN
Nucleinsäuren DNA oder RNA DNA RNA
Fähigkeit zur Mutation vorhanden vorhanden
Stoffwechsel ---- vorhanden
Vermehrung lässt sich vermehren,
nur in Wirtszellen möglich
vermehrt sich selbst
mitotisch oder meiotisch;
Spaltung bei Bakterien
Begrenzende Membran fehlt Vorhanden
Genübertragung und Genaustausch (= Rekombination) bei Bakterien
Bei höheren Lebewesen erfolgt die Rekombination durch Meiose und Befruchtung. Bei Bakterien gibt es
hierfür andere Vorgänge, man nennt sie parasexuell.
1. GENAUSTAUSCH = REKOMBINATION
Versuch: 1946 mit 2 Doppelmutanten von E. coli:
1. A-B
- , d.h. Synthese von Aminosäuren A und B nicht möglich
2. C-D
- , d.h. Synthese von Aminosäuren C und D nicht möglich
Minimalmedium ohne A,B,C,D
Rekombination hat stattgefunden !!!
„Geheilte“ Mangelmutanten (Rekombinanten) erkennt man im Experiment daran, dass sie
Auf Minimalagar wieder Kolonien bilden können!!
Problem:
Wie gelangen die Gene von einer Bakterienzelle in die andere, d.h. wie erfolgt der Gentransfer, die Gen-
übertragung?
2. GENTRANSFER = GENÜBERTRAGUNG
a) Konjugation
Bakterien, die auf einem Plasmid den sog. F+-Faktor (= Fertilitätsfaktor) haben, sind in der Lage,
dünne Röhren auszubilden und damit Kontakt zu F--Zellen aufzunehmen. Es kann zur Ausbildung
von Plasmabrücken kommen, über diese können Gene transferiert werden!
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Transferiert werden können Kopien
eines ganzen Plasmids (z.B. mit
F+-Faktor) oder Kopien von Stücken
der Spender-DNS !!!
Der dauerhafte Einbau von Spender-Genen in die Empfänger-DNS erfolgt über Crossing over Pro-
zesse und kann z.B. so erfolgen:
Empfängerbakterium: a-b
-c
- (Genotyp)
Dreifachmutante!!
Einbaumöglichkeiten (Rekombinationsmöglichkeiten)
Rekombinante:
A+B
+c
-
Aufgabe:
1. Kann auch der „Wildtyp“ wieder entstehen?
Ja, wenn alle 3 eingebaut werden A+B
+C
+ ; aber zwar Rekombinante
2. Gibt es weitere Rekombinanten? Nennen Sie alle möglichen neuen Genotypen!!
A+b
-c
- ; a
-B
+c
- , a
-b
-C
+ , A
+b
-C
+ , a
-B
+C
+
Konjugation = Übertragung von genetischem Material mit Ausbildung einer Plasmabrücke
b) Transduktion
Transduktion = Übertragung von genetischem Material durch Vieren
Vieren werden als „Gentaxis“ oder „Genfähren“ benutzt!
Sie nehmen z.B. bakterielle Gene wie Passagiere auf und laden sie irgendwo wieder ab, dies kann
auf zwei unterschiedliche Weise geschehen!
1. Allgemeine Transduktion
Lytischer Vermehrungszyklus
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Gen a (defekt)
Gen a (defekt) ausgebaut
Mangelmutante ist genetisch geheilt!
2. Spezielle Transduktion (Modell für gezielte Gentransplantation)
T4 – Bakteriophage
HIV-Virus
Wenn in einem phagenbefallenen Wildtyp-
bakterium die vermehrte Phagen-DNS in die
Kopfhüllen verpackt wird, kann versehentlich
ein Stück Bakterien-DNS in den Kopf gelan-
gen. Injiziert ein solcher Phage die DNS in
eine Mangelmutante, kann er zufällig das
Gen A mitbringen, das bei der Mangelmutan-
te zu a mutiert ist. Durch einen Paarungs- und
Rekombinationsvorgang (crossing over) kann
das defekte Gen a gegen das intakte Gen A
ausgetauscht werden.
Gefesselter Prophage nimmt bei seinem Austritt
aus dem Bakterienchromosom benachbarte Gene
mit und wird vermehrt. In alle Phagenköpfe, die
im Bakterium hergestellt werden, gelangt eine
Kopie desselben bakteriellen Gens!
Befallen diese transduzierten Phagen einen be-
züglich dieses Gens mutierten Bakterienstamm,
erfolgt mit hoher Erfolgsrate dessen Heilung durch
Austausch des defekten Gens.
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Bakterien und Viren als Forschungsobjekte
2. Vorkommen, Struktur und Replikation von Nucleinsäuren
Vorkommen: DNA: chromosomal Bestandteil der Chromosomen
extrachromosomal Platiden und Mitochondiren
RNA: in und außerhalb des Zellkerns
Cytoplasma
Ribosomen
Mitochondrien und Plastiden
Struktur: Wenn man DNA durch Kochen mit Säure hydrolisiert, so kann man im Hydrolysat stets folgende Be-
standteile nachweisen:
1. BESTANDTEILE:
Phosphorsäure P
Zucker (Desoxyribose, Ribose) Z
Organische Basen B
Purinbasen Pyrimidinbasen
Adenin A - - - - - - - T Thymin (U = Uracil bei RNA)
Guanin G - - - - - - - C Cytosin
Basenpaarung
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2. MONOMERE (= Bausteine) der Nucleinsäuren
Nucleotid:
3. POLYNUCLEOTID = Nucleinsäuren
einsträngig
doppelsträngig 2 Stränge,
paralleler und antiparalleler Polynucleotidstrang mit komplementärer Basenpaarung
aus 1 – 3
4. WATSON-CRICK-STRUKTURMODELL DER DNA
Strickleiterprinzip:
Basenpaare = Sprossen der Leiter
Zucker-Phosphatketten = Holme der Leiter
Komplementarität der Stränge ! (= Basen ergänzen sich gegenseitig)
Raumstruktur: Die beiden Stränge sind um eine gemeinsame (gedachte) Achse gewunden und bil-
den so eine sog. Doppelhelix (Doppelschraube).
Nach je 10 Basenpaaren ist eine vollständige Schraubenwindung durchlaufen.
5‘-Ende (bezogen auf
das Zucker-
molekül)
3‘-Ende
Der Faden hat
einen Rich-
tungssinn (Pola-
rität) !!
Reihenfolge der Basen
im Molekül
= Basensequenz
Komplementäre Polynucleotidstränge!
zwischen den Basen:
Wasserstoffbrücken!
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Tertiärstruktur der DNA
Doppelhelix
Raumstruktur der DNA = WATSON-CRICK-Modell
Kurzschreibweisen
Nukleinsäuren (Nicht für die Prüfungen besonders relevant)
1. Bestandteile
a) Phosphorsäure
b) Zucker: Desoxyribose Ribose
c) Organ Basen
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2. Monomere der Nukleinsäuren
a) Bildung eines Nucleosids:
Thymin 𝜶-Thymidin
(Nukleosid)
N-glykosidische Bindung
b) Bildung eines Nucleotids:
Esterbindung
𝛼-Thymidin-5‘-monophosphat = 𝜶TMP
3. Polynukleotide = Nukleinsäuren
Primärstruktur der Desoxiribonukleinsäure (DNS =
DNA)
einsträngig: Richtungssinn des Fadens (Polarität)
Sekundärstruktur der DANN: doppelsträngig
Anordnung der beiden Polynukleotidfäden
„antiparallel“
5‘ Ende 3‘ Ende
Guanin Cytosin
Adenin Thymin
Cytosin Guanin
3‘ Ende 5‘ Ende
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4. Wasserstoffbrückenbindung, Basenpaarung „Komplementäre“ Polynukleotidstränge
Identische Verdoppelung der DNS
Denkmöglichkeiten:
Wenn von Zellteilung zu Zellteilung keine genetische Information verlorengeht, muss vor jeder Teilung eine identische
Verdoppelung der Erbsubstanz erfolgen. Das Strukturmodell der DNS von Watson und Crick bietet hierfür durch das
Prinzip der komplementären Basenpaarung eine verblüffend einfache Modellvorstellung an.
Der Doppelstrang öffnet sich wie ein Reißverschluss. An die frei werden-
den Basen lagern sich in jedem Strang einzelne Nucleotide mit den jeweils
komplementären Basen an, die miteinander verknüpft werden.
Die angedockten Nucleotide werden über Phosphor-Esterbindungen mi-
teinander verknüpft. Dadurch entstehen zwei neue Doppelstränge von
DNS mit genau derselben Aufeinanderfolge von Basenpaaren.
Nach dieser Modellvorstellung besteht jeder Doppelstrang zur Hälfte aus
altem, zur anderen Hälfte aus neuem Material.
Den experimentellen Nachweis für die semikonservative Replikation der
DNA lieferten MESELSON und STAHL 1958. Einfachste Schema der identischen Ver-
Doppelung der DNS
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Markierungsexperiment von Meselson und Stahl 1958
15
N = schwerer Stickstoff
Eichungsschritt
1 halbschwere Bande Ausschluss des Konserva-
tiven Mechanismus
1 halbschwere und 1 leichte
Bande Ausschluss des Dispersi-
ven Mechanismus
SEMIKONSERVATIVER MECHANISMUS !!!
Diese sogenannte semikonservative Art der DNS-Verdoppelung oder DNS-
Replikation konnte durch Isotopen-Markierungsversuche bestätigt werden.
Escherichia coli-Bakterien werden während mehrerer Replikations- und Tei-
lungszyklen in einem Nährmedium gehalten, das in seinen Stickstoffverbin-
dungen das „schwere“ Isotop 15
N enthält. Dabei wird 15
N über die Purin-
und Pyrimidinbasen schließlich in beide Stränge der DNS eingebaut.
In einer sogenannten analytischen Ultrazentrifuge ist es möglich, 15
N-haltige,
„schwere“ DNS von 14
N-haltiger, „leichter“ DNS, sowie „halbschwerer“ 15
N/14
N-haltiger DNS als Banden optisch zu unterscheiden.
Bakterien mit 15
N-haltiger DNS werden in 14
N-haltiges Medium überführt und
dort für die Zeit eines Replikationszyklus belassen. Isoliert man dann die DNS
aus diesen Bakterien und untersucht sie in der Ultrazentrifuge, so erweist sie
sich als „halbschwer“. Untersucht man die Bakterien-DNS nach zwei Replika-
tionen in normalem Medium, so findet man leichte und halbschwere DNS im Verhältnis 1:1, in Übereinstimmung mit
der Modellvorstellung der semikonservativen Art der Replikation.
1. Replikationszyklus
auf Nährboden mit 14N
2. Replikationszyklus
auf Nährboden
mit 14N
Kontrollversuch
Nach 3 Replika-
tionszyklen auf
Nährboden mit 14N
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Ablauf der DNS-Verdoppelung
DNS-Doppelhelix wird enzymatisch entdrillt und geöffnet.
Komplementäre Nucleotide lagern sich an
(liegen als energiereiche Nucleosidtriphosphate vor: PPP-Z-B, Abspaltung von PP liefert Energie nur Nucleotid-
verknüpfung)
DNS-Polymerase kann Nucleotide nur in 3‘ 5‘-Richtung des Mutterstranges verknüpfen, deshalb erfolgt die
Ergänzung zum Doppelstrang an beiden Ästen der Replikationsgabel unterschiedlich:
an einem Strang kontinuierlich von der Gabelungsstelle weg,
am anderen Ast diskontinuierlich (nach und nach) in kleinen Stücken (Okazaki-Fragmente), die dann von DNS-
Ligase verbunden werden.
DNS-Reparatur-Polymerase korrigiert fehlerhafte Basenpaarungen.
DNS-Polymerase kann DNS-Synthese nur fortsetzen, nicht beginnen; ein Primer (ein kurzes RNS-Stück), von
Primase aufgebaut, startete den Vorgang.
DNS-Polymerase braucht am Leitstrang nur 1 Primer, für die Synthese jedes Okazaki-Fragmentes einen eigenen
Primer.
(Okazaki-Fragmente bei Eukaryonten: 100 – 200 Nucleotide, bei Prokaryonten: 1000 – 2000 Nucleotide).
Die Replikation der Bakterien-DNS erfolgt von einem Startpunkt aus. Zur Anlagerung der Nucleotide ist Entspira-
lisierung notwendig. Die Bakterienzelle besitzt 3 × 105 Windungen.
Verdoppelung ca. alle 40 Minuten 3 × 105 : 40 = 7500 Umdrehungen pro Minute = mittelschwere Zentri-
fuge!
Problem weitgehend ungeklärt, müsste eigentlich für die Zelle verheerende Folgen haben. Heute weiß man, dass
DNS-Topoisomerasen DNS entwinden können, ohne die Doppelhelix dabei zu drehen: die „Holme“ der verdrillen
„Leiter“ werden an vielen Stellen durchtrennt, entflochten und anschließend wieder repariert.
Die Verdoppelung der DNS erfolgt bei Eukaryonten an mehreren Startpunkten gleichzeitig.
Startstelle = Replikationsursprung (spezi-
fische Nucleotidsequenz), wird von be-
stimmtem Enzym erkannt und leitet Repli-
kation ein.
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ATP – Adenosintriphosphat Adenin + Desoxyribose + P P P
GTP – Guanosintriphosphat
CTP – Cytidintriphosphat
TTP – Thymidintriphosphat
Vergleich DNA und RNA
DNA RNA
Aufbau
Zucker: Desoxiribose
Phosphat
Basen: A , T , C , G
Zucker: Ribose
Phosphat
Basen: A , U , C , G
Form
Doppelstrang
Helix (spiralig gewunden)
Einzelstrang
nicht gewunden
Arten
Kern – DNA
Mitochondriale DNA
Plastiden – DNA
messenger-RNA: langgestreckt
ribosomale RNA: Kleeblattstruktur
transfer-RNA: Kleeblattstruktur
Vorkommen
Kern
Mitochondrien
Plastiden (Chloro-, Chromo-, Leuko-
plasten)
Kern
Plasma
Mitochondrien
Plastiden
Ribosomen
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Eiweißverbindungen (Proteine und Peptide)
Bedeutung: Baustoffe und Wirkstoffe
1. Strukturproteine: Substanzen, die den Körper aufbauen (Faserprotein Kollagen, Muskelproteine Aktin
und Myosin).
2. Enzyme: Biokatalysatoren, ermöglichen chemische Reaktionen im Körper
3. Membranproteine: Diese Proteine sorgen für den selektiven Stofftransport durch die Biomembran, sie die-
nen der Erkennung von zellen und sind als Rezeptormoleküle in Membranen von Ner-
venzellen an der Informationsübermittlung beteiligt.
4. Transportproteine: Hämoglobin transportiert Sauerstoff.
5. Immunproteine: Antikörper binden Krankheitserreger.
6. Regulatorproteine: Hormone sind an der Regulation von Stoffwechselreaktionen beteiligt.
Im menschlichen Körper kommen ca. 50.000 verschiedene Proteine vor. (+ Immunsystem Millionen)
Aufbau: Die Bausteine der Proteine und Peptide sind die Aminosäuren:
H
Aminogruppe H2N C COOH Säuregruppe (= Carboxylgruppe)
R
In Proteinen können 20 verschiedene (= proteinogene) Aminosäuren vorkommen, die sich in den Resten R unterschei-
den.
Es gibt unpolare lipophile Reste und polare hydrophile Reste.
H H
H2N C COOH H2N C COOH
CH3 H2C – OH
Alanin (unpolar) Serin (polar)
DIPEPTID
Aminosäure 1 Aminosäure 2
Von 1 bis 99 Aminosäuren spricht man von Peptide,
ab 100 Aminosäuren spricht man von Proteinen (Primärstruktur).
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Verknüpfung von Aminosäuren durch Peptidbdindungen
Prinzip:
Aminosäure 1 Aminosäure 2 DIPEPTID
Dipeptid Aminosäure 3 TRIPEPTID
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Allgemeine Schreibweise: H2N – AS1 – AS2 – AS3 – COOH
Aminoende Carboxylende
R1 , R2 , R3 = Aminosäurereste
Bauprinzip der Proteine
Primärstruktur (Verknüpfungsprinzip der Aminosäuren)
Der räumliche Bau und das chemische Verhalten der Proteine hängt ab von:
- Der Art der Aminosäure
- Der Anzahl der Aminosäuren
- Vor allem von der Reihenfolge der Aminosäuren
Die Aufeinanderfolge der Aminosäuren in einem Protein wird als dessen Aminosäuresequenz bzw. Primärstruk-
tur bezeichnet.
z.B. Val – His – Leu – Ser – Ala – Glu – Lys – …
Bei einem Polypeptid mit 100 Aminosäuren gibt es 20100
Möglichkeiten !!!!
Ursache für die Mannigfaltigkeit der Proteine !!!
(Im menschlichen Körper nur 5 Mio. verschiedene Proteine)
Sekundärstruktur (Raumstruktur der Peptidketten)
Verursacht durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen C O und N H
- Schrauben- oder Helixstruktur: innermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen
- Faltblattstruktur: zwischenmolekulare Wasserstoffbrückenbindungen
Ob Helix- oder Faltblattstruktur, hängt von der Primärstruktur, also von der Aminosäuresequenz des Proteins ab!
Tertiärstruktur (spezielle Raumgestalt globulärer Proteinmoleküle)
Verursacht durch spezielle kovalente Bindungen oder Kohäsionskräfte innerhalb des Makromoleküls:
Kovalente Bindung: Disulfidbrücke
Kohäsionsbindung: Ionenbindung
Wasserstoffbrückenbindung
Van der Waals-Kräfte
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Myoglobin Häm
Quartärstruktur
Ist ein Eiweißmolekül aus mehreren einzelnen Polypeptidketten, die durch Wechselwirkung (nicht durch Peptid-
bindungen) zusammengehalten werden, aufgebaut, so besitzt es eine Quartiärstruktur.
Bsp.: Hämoglobin
Viele Enzyme scheinen nach diesem Prinzip aus verschiedenen Untereinheiten bestimmter Tertiärstruktur zu
Molekülverbänden mit Quartärstruktur zusammengesetzt zu sein, wobei stets die charakteristische Quartärs-
truktur erst die typische Wirkung ermöglicht.
Hämoglobin
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Molekulare Wirkungsweise der Gene
Was tun Gene nun eigentlich genau?
Gene machen Enzyme ( Merkmale)
Beadle-Tatum Versuch
Experimentelle Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Gen und Merkmal beim roten Schimmelpilz Neurospora,
durch UV-Strahlen erzeugt.
Eine Mutante kann eine Vorstufe des Tryptophans nicht mehr bilden. Neurospora-Myzel ist haploid, man kann von
Phänotyp direkt auf den Genotyp schließen.
a Gefäß mit Minimal-Nährmedium.
Nicht mutierte Sporen keimen, das auswachsende Myzal wird durch Gift abgetötet.
Mutierte Sporen keimen nicht, bleiben somit vom Gift unbeeinflusst und kommen ins Vollnährmedium.
Neurospora gedeiht auf einem
„Minimal-Nährmedium“
(Zucker und Nährsalz)
UV-Strahlen,
können Mutationen in
den Sporen bewirken
Entwicklung einer Kolonie nur auf
Vollnährmedium (Bestandteile des Mini-
malnährmediums + Vitamine + alle Amino-
säuren)
Watte
Kein Wachstum auf
Minimalnährmedium + Vitamine
(Beweis dafür, dass durch die Mutation die
Fähigkeit zur Bildung von Aminosäuren
gestört ist)
Kolonie auf Minimalmedium + Aminosäuren
Kein Wachstum auf Minimalmedium + Aminosäure Lysin
Kolonie auf Minimalmedium + Aminosäure Tryptophan
Kolonie auf Minimalmedium + Indol (Vor-
stufe des Tryptophans
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z.B. Tryptophan als Endprodukt
Wenn Gen 3 ausfällt, kann das Enzym 3 nicht produziert
werden, was wiederum nicht zu dem Produkt Idol führt.
Somit kann die Kette nicht weiter fortgesetzt werden und es
kommt nicht zu dem Endprodukt Tryptophan.
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Genetischer Code und dessen Verwirklichung (= Proteinbiosynthese)
Überlegungen zum Dreiercode auf der DNS
1. Zucker-Phosphat-Homen der DNS
Z P Z = Aminosäure 1
P Z P = Aminosäure 2
Die Information für die Aminosäuren kann nicht durch die Zucker-Phosphat-Holmen verschlüsselt sein,
da nur 2 der 20 Aminosäuren codiert werden können.
2. Eine Base bedeutet eine Aminosäure
Code reicht nur für 4 Aminosäuren aus
3. Ein Basendoublett bedeutet eine Aminosäure
AA AC AG AT
CA CC CG CT
GA GC GG GT für zusammen 16 Aminosäuren
TA TC TG TT
4. Ein Basentriplett bedeutet eine Aminosäure
AAA AAG AAC AAT GCA GCG GCC GCT
AGA AGG AGC AGT CGA CGG CGC CGT
ACA ACG ACC ACT CCA CCG CCC CCT
ATA ATG ATC ATT CTA CTG CTC CTT
GAA GAG GAC GAT TAA TAG TAC TAT
GGA GGG GGC GGT TGA TGG TGC TGT
GTA GTG GTC GTT TCA TCG TCC TCT
CAA CAG CAC CAT TTA TTG TTC TTT
Codewort auf der DNA = Codogen 64 Möglichkeiten
Basentriplett der DNA = Codogen
z.B. AAA AAC AAG TAG
lückenloset, kommafreier Code
Basentripplet der RNA = Codons
z.B. UUU UUG UUC AUC
Code-Sonne (Code-Lexikon,
genetisches Wörterbuch)
Start
STP = Terminator-Codon
= Abbruch-Codon
Start = Starter-Codon, die am Anfang der
Translation stehen.
Aminosäuren:
Arg Arginin Leu Leucin
Asn Asparagin Lys Lysin
Asp Asparaginsäure Met Methionin
Ala Alanin Phe Phenylalanin
Cys Cystein Pro Prolin
Gln Glutamin Ser Serin
Glu Glutaminsäure Thr Rhreorin
Gly Glycin Trp Tryptophan
His Histidin Tyr Tyrosin
Ile Isoleucin Val Valin
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Der genetische Code ist UNIVERSELL !!!
d.h. ein bestimmtes Codon bedeutet bei allen bisher untersuchten Organismen die selbe Aminosäure.
64 Codons: 61 für die Bezeichnung der unterschiedlichen Aminosäuren (20) degeneriertes Codesystem
UAG UAA UGA = Abbruch Codons (= Stopp Codons)
Wenn diese Tripletts in der m-RNA (mesenger-RNA) vorkommen, erfolgt KEINE Synthese mehr bzw. eine be-
gonnene Polypeptidkette wird abgebrochen.
AUG GUG = Start Condons
Sie signalisieren den Beginn einer Polypeptidsynthese, aber nur wenn sie auf ein oder eine kleine Serie von
Stopp-Codons folgen. Ansonsten, d.h. innerhalb eines Gens, bedeuten diese Triplets normale Aminosäuren.
Entzifferung des genetischen Codes
Nirenberg, Matthei 1961
künstlich synthetisierte m-RNS
m-RNS: U-U-U-U-U-U-RNS
Zellfreies System
von E.coli
(Ribosomen, energie-
Reiche Phosphate,
Enzyme)
(Ausflockung) Filter
Trichter
Nirenberg 1965 : Synthese von m-RNS-Trinucleotiden bekannter Basenfolge
Entzifferung fast aller Codeworte
Khorana 1965: Synthese von DNS-Oligonucleotiden definierter Zusammensetzung
Endgültige Klärung des genetischen Codes
Proteinsynthese
Transkription = die Phase des Umschreibens einer bestimmten Basensequenz von der DNS in die mesenger-RNS
Protein
Translation = ist die Phase des Übersetzens der Basensequenz der m-RNS in die Aminosäuresequenz eines bestimmten
Proteins mit Hilfe der Kleeblattförmigen t-RNS (transfere-RNS)
20 Ansätze des zellfreien Systems
von E.coli mit je einer anderen
14C markierten Aminosäure
Der Ansatz mit der Aminosäure Phenylalanin zeigte gegenüber
den anderen Ansätzen eine 1000-fach gesteigerte Aktivität.
Folgerung: ein Polypeptid aus Phe* ist entstanden
Codewort UUU bedeutet Phenylalanin
Phe
Phe
Phe
Information
Gen = DNA-Abschnitt m-RNA
Speicher der genet. Information Transportform der
Information
Bausteine
Aminosäure Baustein der Proteine Aminosäure-tRNA
sorgt zusamen mit
t-RNA transportiert und aktiviert die AS der mRNA für die Reihenfolge
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Modellvorstellung vom Transkriptionsvorgang
Der Enzymkomplex der Transkriptase erkennt
Startstellen auf der DNS an einer bestimmten Ba-
sensequenz und setzt sich darauf fest. Anhand der
Basensequenz erkennt er, welcher der beiden
Stränge in welcher Richtung abgeschrieben werden
soll. Er öffnet den Doppelstrang und ermöglicht
Basenpaarung zwischen dem sog. codogenen
Strang und den Basen der viererlei Nucleotide, die
er zu m-RNS verknüpft.
Während der Transkription wandert der hohlzylin-
derförmige Enzymkomplex an der DNS entlang, bzw. diese durch ihn hindurch, wobei ein m-RNS-Strang aus ihm
herauswächst. Er enthält die Basensequenz des sog. Code-Stranges. Bestimmte Stellen erkennt der Komplex schließ-
lich als Zielstellen, wo er sich und die m-RNS ablöst.
Ein Transkriptionsabschnitt auf der DNS und damit auch eine m-RNS enthält die Information von wenigstens einem
Gen, meist von mehreren.
Über einen Transkriptionsabschnitt wandern (bei E.
coli) gleichzeitig mehrere Transkriptase-Moleküle.
Die wachsenden m-RNS-Stränge werden sofort von
Ribosomen besetzt. Auf m-RNS aufgefädelte Ribo-
somen nett man Poly-Ribosomen.
Translation – ein Protein wird „montiert“
„Vorbereitung“: Die t-RNS wirkt als Vermittler zwischen m-RNS und Aminosäuren!
Für jede Aminosäure gibt es eine spezifische t-RNS, die sie zu den Ribosomen transportiert. Die Aktivierung der Ami-
nosäure und deren Anbindung an „ihre“ t-RNS erfolgen unter Energieverbrauch durch sog. Synthetasen (Enzyme).
t-RNS-Molekül: Kleeblattstruktur
Anticodon: komplementär zu 1 bestimmten Basentriplett der m-RNA, also zu einem codon!
Die Zuordnung der passenden Aminosäure erfolgt über die Synthetasen welche die spezifische
Raumstruktur der t-RNS Moleküle abgreifen und jeweils die richtige Aminosäure auswählen und
anheften.
Aminosäureanheftestelle: immer gleich; kann daher nur anheften, aber nicht auswählen!
(immer CCA)
Synthese des Proteins
Zunächst lagern sich die beiden Untereinheiten des Ribosoms an der Starsequenz der m-RNS zu einem funktionsfähi-
gen Ribosom zusammen.
Im Ribosom paart an jedes Codon (3 Nucleotide = Triplett) der m-RNS eine t-RNS (beladen mit ihrer spezifischen
Aminosäure) mit „passendem“ Anticodon (zum Codon komplementäres Triplett).
Das Ribosom besitz zwei t-RNS-Bindestellen. Dadurch wird der Kontakt zwischen den an den beiden t-RNS hängenden
Aminosäuren hergestellt – die Peptidbindung kann geknüpft werden.
Die „vordere“, nun freie t-RNS löst sich aus dem Ribosom und macht Platz für die nächste Ankopplung einer „neuen“
beladenen t-RNS an die um ein Triplett weitergerückte m-RNS.
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Durch die Wiederholung dieses Vorgangs wird die angefangene Aminosäure-Kette um eine Aminosäure nach der ande-
ren verlängert, und zwar exakt so, wie es die Codons der m-RNS vorschreiben.
Kommt das Ribosom an ein Stop-codon der m-RNS, so endet der Translationsprozess. Das gebildete Protein wird frei
und nimmt seine funktionsfähige Raumstruktur ein.
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Analogen aus der menschlichen Sprache
4 Buchstaben des genetischen Codes A,C,G,T bzw. U entsprechen 4 anderen Buchstaben des Alphabets E, I, N, S.
Eine kurze Sequenz von Tripletts wird in die menschliche Sprache übertragen. Die Wortfolge ISS NIE EIN EIS soll
als Modell für ein Protein aus 4 Aminosäuren dienen.
Dieser Satz soll nun verändert werden:
a) Austausch eine Buchstaben (= Base) in einem Wort (=Triplett)
ISS NIE EIN SIS
Sie kann, muss aber nicht
entstellt sein.
b) Einschub eines Buchstaben (= zusätzliche Base oder Nucleotid)
INS SNI EEI NEI S
Leseraster ist verschoben;
kein Sinn mehr!
c) Ausfall eines Buchstaben
ISS …IEE INE IS
Leseraster ebenfalls ver-
schoben; kein sinn!
d) Ausfall eines ganzen Wortes (= Triplett)
… NIE EIN EIS
ISS NIE … EIS
Takt bleibt erhalten;
Sinn entstelt
Sinn bleibt
Zellverhältnisse
Codogener DNA-Strang:
m-RNA-Original:
codierte Aminosäure:
GAC
CUG
Leu
CCT
GGA
Gly
ATG
UAC
Tyr
CGT
GCA
Ala
CAC
GUG
Val
AAG
UUC
Phe
TCG
AGC
Ser
a) Basenaustausch (m-RNA):
[A gegen G in der DNA]
CUG
Leu
GGA
Gly
CAC
His
GCA
Ala
GUG
Val
UUC
Phe
AGC
Ser
liefert Fehlsinn: ein Enzym mit einer falschen Aminosäure und dadurch mehr oder weniger
Verminderte Aktivität.
b) Baseneinschub (m-RNA):
[zusätzlich G in der DNA]
CUG
Leu
GGA
Gly
CUA
Leu
CGC
Arg
AGU
Ser
GUU
Val
CAG C
Gln
liefert Unsinn: ein Protein mit völlig veränderter Aminosäuresequenz und Tertiärstruktur.
Ursprüngliche Enzymfunktion verloren.
c) Basenverlust (m-RNA)
[Wegfall von A in der DNA]
CUG
Leu
GGA
Gly
ACG
Thr
CAG
Gln
UGU
Cys
UCA
Ser
GC.
ähnlich wie bei b.
d) Verlust eines Tripletts
[Wegfall von ATG in der DNA]
CUG
Leu
GGA
Gly
GCA
Ala
GUG
Val
UUC
Phe
AGC
Ser
liefert mehr oder weniger Sinn: ein Protein, dem 1 Aminosäure fehlt und das, je nach der Bedeutung
dieser Aminosäure für die Tertiärstruktur, eine mehr oder weniger ge-
störte Enzymaktivität.
Durch energiereiche Strahlung mögliche Veränderungen der DNS:
1. Doppelstrangbruch
2. Zweistrangbruch
3. Basenveränderung
(=Punktmutation)
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Allgemeine Fehlerquellen:
- Gelegentlich bei normaler Replikation
- Mutagene (Strahlung, Chemikalien)
Reparaturenzyme beseitigen Schäden:
- Bei der Replikation meist sofort
- Durch Mutagene in kurzer Zeit, sofern nur einer der beiden DNA-Stränge betroffen ist
Reparaturmechanismus:
Das beschädigte Strangstück wird durch ein Enzym herausgeschnitten und abgebaut. Das fehlende Stück wird
neu gebildet, wobei der Komplementäre unbeschädigte Strang als Martritze dient.
Anmerkung: Wenn beide Stränge der DNA geschädigt wurden bleibende Veränderung !!!
Mutationsmechanismen (nur zur Anschauung! / erklären können!)
1. Mutagen salpetrige Säure HNO2 bzw. chemische Veränderung einzelner Basen
HNO2 setzt aus der Aminogruppe der Basen (z.B. Cytosin) Stickstoff frei.
Beispiel: Aus Cytosin entsteht Uracil
Folgen einer solchen Basenveränderung
Mutierte Form !!!
Ohne Mutation keine Evolution !!!
- Veränderungen im Erbgut einer angepassten Art sind meist negativ
- Wenn sie in seltenen Falle positiv sind, bringen sie einen Selektions-
vorteil, die Veränderungen im Erbgut führen auf lange Sicht zur Ent-
stehung neuer Arten; z. B. fliegender Fisch, Schneearten
Cytosin Uracil
HNO2 hat letztlich den Austausch des Basenpaares
gegen das Basenpaar T=A bewirkt.
Es wurde ein REPLIKATIONSFEHLER ausgelöst.
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2. Einbau von Basenanaloga
z.B. 5-Bromuracil (BU), eine dem Thymin analoge Base
Es kann nur während der DNS-Replikation anstelle von Thymin eingebaut werden und dann unter Umständen ei-
nen weiteren Basenaustausch bewirken.
Keine Folgen, wenn weiterhin Adenin als Paarungspartner verwendet wird:
Folgen, wenn Ketoform des BU in die Enolform übergeht! Diese paart mit Guanin !!!
Wurde einmal Guanin eingebaut, dann wird es stets Cytosin als Paarungspartner suchen und die Mutation ist fi-
xiert!
Aber:
EINE IN DIE DNS EINGEBAUTE BU-BASE WIRKT WIE EIN ZUFALLSGENERATOR, DER ÜBER GE-
NERATIONEN IMMER WIEDER BASENAUSTAUSCHE UND DAMIT GENMUTATIONEN BEWIRKT !!!
3. Rastermutationen: EINBAU oder VERLUST von NUCLEOTIDEN
Acridinmoleküle sind so groß wie Nucleotide. Sie können sich in die DNS einschieben und ebenso wieder ausge-
baut werden.
Möglichkeit 1: Acridineinschub in ruhende DNS,
d.h. Einbau vor der Replikation
Die Enolform kann wieder in die Ketoform übergehen, dann stellt sich in den nächsten Generation
wieder die ursprüngliche Basensequenz ein !
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Einbau vor der
Replikation
X‘ = beliebiges zusätzliches Nucleotid
Ausbau vor nächster
Replikation
Ausgangsform Einbau !
Möglichkeit 2: Acridineinbau während der Replikation, d.h. anstelle eines Nucleotids
Einbau während der Replikation
Ausstoß vor der nächsten Replikation
Ausgangsform Verlust !!
DNS-Molekül mit zusätzlichem Basenpaar !!
Folgen bei Manifestation im fertigen Protein:
Rastermutation, Verschiebung des Leseras-
ters auf DNS & RNS
Aminosäuresequenz wird verändert !!
Raumstruktur (Tertiär- & Quartiär-
struktur) es Proteins verändert !!
DNS-Molekül, dem 1 Basenpaar fehlt !!
Folgen bei Manifestation im fertigen Protein:
Rastermutation, Verschiebung des Leserasters auf
DNS & RNS
Aminosäuresequenz wird verändert !!
Raumstruktur (Tertiär- & Quartiär-
struktur) es Proteins verändert !!
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Wirkungsmechanismen von Mutagenen
Mutagene können auf vielerlei Art und Weise wirken. Dies hängt beispielsweise von der Struktur und der Reaktion
eines chemischen Mutagens mit den Basen der DNA ab. Einige Beispiele für die Wirkungsweise von Mutagenen sollen
hier dargestellt werden.
1. Chemische Änderung normaler Basen
z.B. durch salpetrige Säure HNO2: sie bewirkt den Umbau von Cytosin in Uracil:
während sich Cytosin mit Guanin paart, verbindet sich Uracil bei der Replikation mit Adenin. Nach zwei Replika-
tionen wurde wurde letztlich das Basenpaar C-G durch das Basenpaar T-A ausgetauscht.
[vgl. Daumer „Genetik“, Abb. 85.1]
2. Einbau von instabilen „Basenanaloga“ anstatt der natürlichen Basen
(Basenanaloga sind basenähnliche Stoffe, die wie normale Basen, z.B. bei der Replikation, in die DNA eingebaut
werden. Durch spontane Umlagerung können sie ihre Molekülstruktur und damit ihre Paarungseigenschaften än-
dern)
z.B. von 5-Bromuracil (BU): die Normalform ist Thymin analog, die Sonderform paart sich aber wie Cytosin mit
Guanin. Damit kommt es nach zwei Replikationen zum austausch A-T gegen G-C.
3. Veränderung der Nukleotidzahl durch zeitweiligen Einschub nukleotidähnlicher Moleküle
z.B. von Acridin (oder Teerstoffe des Zigarettenrauchs):
Es sind Moleküle mit Ringsystemen, die sich zwischen benachbarte Basenpaare der DNA schieben und eine Base
zuviel vortäuschen. Bei einer Replikation wird an diese vermeintliche Base eine beliebige andere angelagert. Je
nach dem Ort des zeitweiligen Einschubs bzw. Einbaus kommt es zum Einschub (Insertion) oder zum Verlust (De-
letion) von einem Nukleotid.
[vgl. Daumer „Genetik“, Abb. 86.1]
4. Vernetzung zweier benachbarter oder gegenüberliegender Basen der DNA
z.B. durch kurzwellige UV-Strahlung:
Am häufigsten ist die Vernetzung zweier benachbarter Thymin-Moleküle in demselben Einzelstrang, wodurch ihre
komplementäre Basenpaarung unmöglich gemacht wird. Als Folge wird die DNA nicht mehr richtig transkribiert
und repliziert.
Die hier beschriebenen Mutagene werden gewöhnlich in Laboratorien benutzt. Eine große Zahl anderer Chemikalien ist
auch Mutagen. Da wir ständig mit Stoffen in Berührung kommen, die potentielle Mutagene sein können, ist die Erfor-
schung mutagener Einflüsse und ihrer Wirkungen wichtig, um die nötigen Schutzmaßnahmen für Bevölkerung und
Umwelt treffen zu können. Dazu werden in zunehmendem Umfang Medikamente, Kosmetika, Nahrungsmittelzusätze,
Konservierungs- und Düngemittel, Insektizide, usw. durch geeignete Verfahren einem Mutagenitätstest unterzogen.
Regulation der Genaktivität
Wären alle Strukturgene (ca. 1 Million) einer Zelle gleichzeitig aktiv, so gäbe das ein fürchterliches Chaos in der Zelle.
Das ist nicht der Fall. Offenbar unterliegt die Genaktivität einer Kontrolle, die dazu führt, dass jeweils nur das produ-
ziert wird, was gerade nötig ist!
Regulation der Enzymaktivität
Das für die Regulation verantwortliche Enzym ist ein besonderes. Normale Enzyme haben 1 aktives Zentrum, also
einen Bindungsort für das Substrat.
Allosterisches Enzym ist ein regulierbares Enzym mit zwei verschiedenen, hochgradig spezifischen Bindungsorten
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Zeichenerklärung:
= ungleichsinniger Zusammenhang (je weniger, desto mehr / je mehr, desto weniger)
= gleichsinniger Zusammenhang (je mehr, desto mehr / je weniger, desto weniger)
Bei hohem Vorkommen des Endprodukt D erfolgt durch das Andocken die allosterische Konformationsänderung und
blockiert die Andockung des Stoffes A und dessen Umsetzung.
Bei mangel am Endprodukt D erfolgt Abkopplung vom Enzym und die Umsetzung kann von statten gehen.
Nun gibt es auch Stoffe, welche die Aktivität eines Enzyms beeinflussen, man nennt sie Effektoren:
Hat der Effektor hemmende Wirkung, wirkt er als Inhabitor,
hat der Effektor fördernde Wirkung, wirkt er als Aktivator.
Allosterische Enzyme können also fördernde und hemmende Einflüsse empfangen und darauf reagieren:
Feinregulierung des Stoffwechsels
Rolle beim An- und Abschalten von Genen, d.h. Regulation bei der Proteinbiosynthese
+
durch das Endprodukt gehemmter Zustand
des Enzyms
Endprodukt Aktiver Zustand des Enzyms
Bindung für das
Endprodukt
= allosterisches Zentrum
Bindungsort für das
Ausgangssubstrat
= aktives Zentrum
(findet Umsetzung statt)
allosterische
Konformationsänderung
(= Raumstrukturänderung)
des Enzyms E1
Bindungsort blockiert
Ausgangssubstrat Ausgangssubstrat
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Regulation der Genaktivität bei Bakterien
Jacob-Monod-Modell
1. Aufbauender Stoffwechsel
Abschalten er Enzymproduktion durch ein Endprodukt
Die Produktion der gesamten Enzymserie, die an einer Synthesekette beteiligt ist, wird abgestellt.
Begriffe:
Strukturgene S: Gene für die Synthesekette sind auf dem Chromosom unmittelbar benachbart.
Operator O: Ein Gen, das die Tätigkeit (Operation) einer nachfolgenden Gruppe von Strukturgenen kontrolliert,
nennt man Operator. (DNS-Abschnitt unmittelbar vor dem 1. Strukturgen der Synthesekette)
Die Steuereinheit Operatorgen + Gruppe der Strukturgene = Operon
Promoter P: Im vorderen Abschnitt des Operatorgens liegt der Startplatz für die Transkriptase
Abschalten des tätigen Operons:
Vermutung: das Endprodukt verändert irgendwie den Zustand des Operatorgens, so dass die Transkriptase die nachfol-
genden Gene nicht mehr ablesen kann. Hierzu ist ein Vermittler notwendig, das Regulatorgen.
Regulatorgen R:
Der Repressor ist aber zunächst inaktiv!!
Das Endprodukt kann aber als Effektor an den allosterischen Repressor binden
Konformation des Enzyms ändert sich
Repressor wird aktiv, d.h. er kann jetzt an das Operatorgen binden
- reguliert die Tätigkeit des Operons
- ist ein DNA-Abschnitt, der nicht in unmittelbarer Nähe des Operons liegt
- sein Genprodukt ist ein allosterisches Enzym!!! Es kann in einem bestimmten Konformationszustand an das Operatorgen bin-
den und die Transkription unterbinden (= Repressor)
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Was geschieht, wenn nun die Endproduktkonzentration durch Verbrauch sinkt?
Repressor und Corepressor trennen sich, die Blockierung des Operons wird aufgehoben, Transkription kann er-
neut durchgeführt werden (bis eben wieder genug EP vorhanden ist…)
2. Abbauender Stoffwechsel
Anschalten der Enzymproduktion durch ein abzubauendes Substrat
Kommt E.coli z.B. plötzlich in Kontakt mit Lactose, so stellt es daraufhin die nötigen Enzyme für den Abbau des Subs-
trates Lactose her. Die Lactose löst also die Bildung der zu ihrem Abbau nötigen Enzyme selbst aus!
Auslösevorgang = Induktion der Enzymsynthese
Substrat, das die Induktion bewirkt = Induktor
Lactose – Operon: enthält 3 Strukturgene
Wenn keine Lactose im Medium: Operon liegt „ausgeknipst“ vor.
Lac-Repressor (Produkt des Regulatorgens) ist aktiv, er bindet an den Operator und blockiert so die Transkription. Da
der Repressor ein allosterisches Protein ist, hat er eine zweite Bindungsstelle für das Substrat Lactose.
Wenn Lactose in die Zelle gelangt: Operon wird „eingeschaltet“
Substrat bindet an Repressor, dieser ändert dadurch seine Konformation, löst sich vom Operator ab und ist inaktiv.
Folge: Transkriptese kann ablesen, Transkription, Translation, Enzyme zum Abbau der Induktion der Genaktivität.
Die Lactose verschwindet durch den Abbau, das Lac-Operon wird wieder geschlossen, da der Repressor nach Austritt
der lactose wieder den aktiven Konformationszustand annimmt und an den Operator bindet.
(alle Abbildungen von Seite 89 bis 91 skizzieren können !!!)