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Modulation der Genexpression durch das virale
Interleukin-6 in PEL Zellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Nadine Rohland
aus Bad Langensalza
2
Als Dissertation genehmigt von der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 11.06.2010
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Lars Nitschke
Zweitberichterstatter: PD Dr. Frank Neipel
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Inhaltsverzeichniss
1 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 4
2 Einleitung ....................................................................................................................................... 7
2.1 Das Humane Herpesvirus-8 .................................................................................................. 7
2.2 Das viruskodierte Interleukin-6 ........................................................................................... 10
2.3 RNA-Interferenz ................................................................................................................... 13
3 Material und Methoden .............................................................................................................. 16
3.1 Zellkulturverfahren .............................................................................................................. 16
3.2 Rekombinante DNA Methoden ............................................................................................ 17
3.3 Transfektion eukyoter Zellen ............................................................................................... 19
3.4 Promotor-Analysen durch Luziferase-Assay ....................................................................... 20
3.5 Hemmmung der Genexpression durch RNAi ....................................................................... 21
3.6 RNA-Nachweis ..................................................................................................................... 23
3.7 Proteinnachweis .................................................................................................................. 25
3.8 Expression und Aufreinigung von rekombinanten vIL-6 ..................................................... 28
3.9 Bestimmung der Zellproliferation ....................................................................................... 29
4 Ergebnisse .................................................................................................................................... 30
4.1 Expression des endogenen vIL-6 in PEL Zellen .................................................................. 30
4.2 Biologische Aktivität des rekombinaten vIL-6 ..................................................................... 32
4.3 Effekte der vIL-6 Inhibierung durch RNA-Interferenz in PEL Zellen .................................. 34
4.4 Induktion der hIL-6 Expression durch RTA ......................................................................... 40
4.5 Aktivierung der Genexpression durch RTA in PEL Zellen .................................................. 42
4.6 Rekonstitution der RNAi bedingten Effekte in PEL Zellen .................................................. 43
4.7 Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 in PEL Zellen ........................................... 45
5 Diskussion .................................................................................................................................... 48
6 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 56
7 Literaturverzeichnis.................................................................................................................... 59
Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ............................................................................ 65
Lebenslauf ............................................................................................................................................. 67
Danksagung ........................................................................................................................................... 68
Zusammenfassung
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1 Zusammenfassung Das Humane Herpesvirus-8 (HHV-8), auch Kaposi-Sarkom assoziiertes Herpesvirus
genannt (KSHV), ist bisher der einzige identifizierte, humanpathogene Vertreter der
Rhadinoviren. Seit seiner Entdeckung 1994 konnte HHV-8 mit allen Formen des Kaposi`s
Sarkoms (KS) sowie dem Primären Effusionslymphom (PEL) und der Multizentrischen
Castleman-Erkrankung (MCD) assoziiert werden. Ein wichtiges Merkmal vieler
Herpesviren ist, dass sie im Lauf der Evolution mehrere zelluläre Gene in ihr Genom
integriert haben. Besonders deutlich wird diese sogenannte molekulare Mimikry an dem
durch HHV-8 kodierten viralen Interleukin-6 (vIL-6), welches Homologie zum zellulären
Interleukin-6 (hIL-6) aufweist. hIL-6 ist ein essentieller Wachstumsfaktor für eine
Vielzahl B-lymphoider Tumore und spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der
HHV-8 assoziierten Erkrankungen. Dies legt die Vermutung nahe, dass auch das vIL-6
von pathogener Bedeutung sein könnte. Wie bisherige Studien belegten, induzieren
sowohl vIL-6 als auch hIL-6 dieselben Signaltransduktionswege. Des Weiteren konnten
die Expression beider Zytokine in allen mit HHV-8 assoziierten Erkrankungen
nachgewiesen werden. Trotzdem ist die relative Bedeutung der beiden verwandten
Zytokine für die Pathogenese der HHV-8 Infektion im Einzelnen nicht vollständig geklärt.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion des vIL-6 mit Hilfe der RNA-Interferenz
(RNAi) in PEL Zellen untersucht werden. Da HHV-8 infizierte PEL Zellen die IL-6
induzierte Signaltransduktion für eine uneingeschränkte Proliferation benötigen, führte
die effiziente Hemmung der vIL-6 Expression zu einer zwar geringen aber dennoch
signifikanten Verminderung des Wachstums. Zudem konnte eine erhöhte Produktion des
hIL-6 in den vIL-6 knock-down Zellen nachgewiesen werden, was auf eine verstärkte
Expression des viruskodierten replication and transcription activator (RTA), dem
Hauptregulator der lytischen HHV-8 Replikation, zurückgeführt werden konnte. Die
Induktion der lytischen Genexpression konnte durch den Nachweis des viralen
Glykoproteins K8.1 bestätigt werden. Erst die gleichzeitige Inhibierung des viralen und
zellulären Zytokins führte zu einer starken Reduzierung der Proliferation dieser PEL
Zellen. Um die Spezifität der beobachteten Effekte nachzuweisen, wurden die vIL-6
knock-down Zellen mit rekombinant aufgereinigten vIL-6 (rvIL-6) oder hIL-6 (rhIL-6)
behandelt. Die externe Zugabe von rvIL-6 resultierte im Gegensatz zu rhIL-6 in einer
Rekonstitution des durch die vIL-6 Suppression bedingten Phänotyps. Diese Daten
deuteten auf einen negativen Rückkopplungmechanismus des vIL-6 in den verwendeten
Zusammenfassung
5
PEL Zellen hin. Zudem führte die Behandlung der PEL Zellen mit rvIL-6 zur Hemmung
der lytischen HHV-8 Genexpression, während die Zugabe des rhIL-6 eine Induktion zur
Folge hatte. Zusammenfassend weisen diese gegensätzlichen Wirkungen des zellulären
und viruskodierten Zytokins auf eine - zumindest in PEL Zellen - teilweise
unterschiedliche Signaltransduktion hin.
Zusammenfassung
6
Summary
The human herpesvirus-8 (HHV-8) also termed Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus
(KSHV) is the first known human member of the genus rhadinovirus. Since its discovery
in 1994 KSHV is known to be associated with all forms of Kaposi´s sarcoma (KS) as well
as primary effusion lymphoma (PEL) and multicentric Castleman disease (MCD). A
hallmark of many herpesviruses is the incorporation of cellular genes in the genome
during evolution. This so called molecular mimicry is especially obvious by the virus
encoded interleukin-6 (vIL-6), a protein with homology to human interleukin-6 (hIL-6).
As hIL-6 acts as an essential growth factor in several B-lymphoid malignancies and has
also been implicated in the pathogenesis of KS, the viral interleukin-6 (vIL-6) is likely to
be of pathogenetic importance. However, as signal transduction cascades induced by vIL-
6 and hIL-6 are thought to be essentially identical and both cytokines are produced in
KSHV-associated malignancies, the relative importance of these related cytokines in
KSHV-induced malignancies is still not clear. In the present work, RNA-interference was
used to examine the function of vIL-6 in primary effusion lymphoma (PEL) cells.
Because PEL cells are dependent on (v)IL-6 induced signal transduction, a nearly
complete knock-down of vIL-6 expression was accompanied by a moderate, but
significant reduction of PEL cell proliferation. In addition, expression of both KSHV lytic
genes (RTA and gpK8.1) and of hIL-6 was increased. Inhibition of both vIL-6 and hIL-6
resulted in a marked decrease of cell proliferation. The specificity of the observed effects
could be proven by the addition of recombinant vIL-6 and/or hIL-6 to the cell culture
media. Addition of rvIL-6, but not rhIL-6 resulted in a reconstitution of the siRNA-
mediated phenotype. At least in KSHV-infected PEL cells, a negative feed-back loop
exists for vIL-6, but not hIL-6 expression. In addition, whereas vIL-6 reduced the
expression of vIL-6 and RTA thus promoting KSHV latency, addition of hIL-6 resulted in
increased gene expression from lytic viral promoters. In summary, although both vIL-6
and hIL-6 signal via the same cellular receptor, the signal cascades induced in PEL cells
are - at least in part - distinct.
Einleitung
7
2 Einleitung
2.1 Das Humane Herpesvirus-8
Das Humane Herpesvirus-8 (HHV-8) wurde erstmals 1994 in den Gewebeproben eines an
einem Karposi-Sarkom (KS) erkrankten AIDS Patienten nachgewiesen 1. Die Endeckung
erfolgte durch Isolierung und Amplifikation viraler DNA-Fragemente mit Hilfe der
representational difference analysis (RDA), einem auf der Polymerase-Kettenreaktion
basierenden Verfahren 2. Seitdem belegen zahlreiche Publikationen einen
epidemiologischen Zusammenhang zwischen einer HHV-8 Infektion und dem Auftreten
eines KS 1, 3. Aus diesem Grund wird das HHV-8 auch als Kaposi-Sarkom-assoziiertes
Herpesvirus (KSHV) bezeichnet.
HHV-8 gehört wie das Epstein-Barr Virus (EBV) zur Gruppe der humanpathogenen γ–
Herpesviren. Allerdings zeigte eine Analyse der HHV-8 Sequenz, dass dieses Virus näher
mit Herpesvirus saimiri (HVS), einem klassischen Vertreter der Rhadinoviren, verwandt
ist und daher als γ2-Herpesvirus eingeordnet werden muss 4, 5.
HHV-8 trägt als tumorassoziiertes Virus zu den weltweit 15-20 % der Krebserkrankungen
viralen Ursprungs bei. Die Übertragung erfolgt vermutlich über Körperflüssigkeiten wie
Samenflüssigkeit und Speichel 6, während die parenterale Übertragung des Virus durch
Blut eher selten ist 7. Des Weiteren belegte eine Studie von Barozzi 8 die Möglichkeit der
HHV-8 Infektion nach Organtransplantation.
Beim Menschen sind verschiedene maligne Erkrankungen bekannt, bei denen HHV-8
regelmäßig nachgewiesen werden kann: neben allen Formen des KS 1 betrifft dies das
Primäre Effusionslymphom (PEL) 9 und die plasmablastische Variante der
Multizentrischen Castleman-Erkrankung (MCD) 10, 11, 12.
KS ist ein multifokaler Tumor endothelialen Ursprungs, der besonders durch dunkle, stark
pigmentierte Hautregionen charakterisiert ist. Neben den typischen Spindelzellen finden
sich im KS Gewebe auch infiltrierende inflammatorische Zellen und Endothelzellen bei
ausgeprägter Neovaskulierung 13. Im frühen Stadium des KS sind nur ca. 10 % der
Spindel- und Endothelzellen HHV-8 positiv. Dies deutet auf die Beteiligung eines
parakrinen Mechanismus in der Progression dieser Erkrankung hin 14. Im späten Stadium
kann in bis zu 90 % der Spindelzellen die virale DNA nachgewiesen werden, was einen
Wachstumsvorteil der infizierten Zellen nahe legt 15, 16. Neben diesen Hautläsionen kann
Einleitung
8
sich der Tumor auch in zahlreichen inneren Organen manifestieren. Epidemiologisch
kann man vier verschiedene Formen des KS unterscheiden: Das klassische KS tritt
gehäuft bei Männern aus dem mediteranen Raum nach dem 50. Lebensjahr auf. Diese
ohne klare Immunsuppression auftretende Form des KS schreitet nur langsam, über
mehrere Jahre fort und bleibt zunächst meist auf die unteren Extremitäten beschränkt 17.
Das endemische KS betrifft Patienten aller Altersgruppen aus Zentral- und Ostafrika und
ist deutlich aggressiver. Es befällt oft die Lymphknoten sowie die inneren Organe und ist
mit einer erhöhten Sterblichkeit verbunden 18. Eine dritte Form, das iatrogene KS, wurde
bei Transplantationspatienten und Immunsuppression beschrieben 19. Das sogenannte
AIDS-assoziierte oder epidemische KS ist die aggressivste Form. Die Manifestation der
Tumore in den inneren Organen tritt besonders häufig auf und führt zu schweren
Komplikationen. Durch die Behandlung der HIV-Infektion mit hoch-aktiver anti-
retroviraler Therapie (HAART) hat das Auftreten des AIDS-assoziierten KS in den
westlichen Staaten abgenommen 20.
PEL, auch als body cavity based lymphoma (BCBL-1) bezeichnet, ist eine seltene
hochmaligne B-lymphoproliferative Erkrankung, die zu den Non-Hodgkin-Lymphomen
zählt und vor allem immunsupprimierte Patienten betrifft. Es manifestiert sich als maligne
Effusionen der pleuralen, perikardialen und peritonealen Körperhöhlen. Im Gegensatz
zum KS ist das PEL mono- oder polyklonalen Ursprungs 21. Aufgrund des Nachweises
von Immunglobulinketten-Umlagerungen sowie der Expression von typischen Markern
der späten B-Zelldifferenzierung wird vermutet, dass PEL Zellen phänotypisch als
Plasmazellen eingestuft werden müssen 22, 23. Bei der Hälfte der Fälle findet man in den
PEL Zellen gleichzeitig das Genom des EBV.
MCD ist eine atypische, lymphoproliferative Erkrankung, die mit HHV-8 assoziiert wird
und ebenfalls vorrangig bei HIV-infizierten Patienten auftritt 10. Charakteristisch für
MCD sind vergrößerte Lymphknoten, die Infiltration von Plasmazellen sowie
Wucherungen der Gefäße und Fieber. Des Weiteren konnte in den Keimzentren der
hyperplastischen Lymphknoten von Patienten, die an MCD erkrankt sind eine erhöhte
Konzentration des multifunktionellen IL-6 nachgewiesen werden. Da hIL-6 die
Differenzierung von B-Zellen stimuliert, lieferte die Überexpression dieses Zytokines eine
Erklärung für die große Anzahl an Plasmazellen in diesen Lymphknoten.
Wie die anderen Herpesviren ist HHV-8 ein umhülltes DNA Virus mit einem
ikosaedrischen Kapsid. Es besitzt ein 165 kb großes, doppelsträngiges DNA-Genom.
Dieses besteht, analog zum Genom anderer Rhadinoviren, aus einem zentralen
Einleitung
9
kodierenden Bereich mit niedrigem GC-Gehalt (L-DNA, 53,5 % GC), flankiert von zwei
Tandem-Repititionen mit hohem GC-Gehalt (H-DNA, 84,5 % GC). Die H-DNA besteht
aus einer variablen Anzahl (5–20) an 801 bp langen Elementen in Tandem-Orientierung 5.
Bis heute wurden in der L-DNA 89 open reading frames (ORF) identifiziert, von denen
die meisten homolog zu den ORFs anderer Herpesviren sind. Diese konservierten
Bereiche sind durch HHV-8 spezifische Genomabschnitte unterbrochen. Die meisten in
diesen Abschnitten vorhandenen Gene sind homolog zu zellulären Genen. Dies lässt
vermuten, dass im Laufe der Evolution einige zelluläre Gene in das Virusgenom integriert
wurden 24. Soweit bisher untersucht, kodieren diese Gene für funktionelle Agonisten der
zellulären Homologen. Gerade diesen Wirtszell-homologen Genen wird eine wichtige
Rolle in der Pathogenese von HHV-8 zugeschrieben, da sie es dem Virus ermöglichen in
die zellulären Signaltransduktionkaskaden der Immunantwort, Zellzyklusregulation und
Apoptose einzugreifen.
HHV-8 kann durch die Expression verschiedener Proteine sowohl das angeborene als
auch das adaptive Immunsystem beeinflussen. Die Makrophagen-inflammatorischen
Proteine vMIP-I, vMIP-II und vMIP-III (ORF K6, K4, K4.1) kodieren für Chemokine der
CC-Chemokin-Familie. Sie wirken als spezifische Agonisten der Wirtszell-
Chemokinrezeptoren und führen zu einer Verschiebung der zellulären TH1- zur
Antikörper-dominierten TH2-Immunantwort, welche für die Bekämpfung intrazellulärer
Pathogene weniger effektiv ist 25, 26. Des Weiteren exprimiert HHV-8 auch einen
Chemokinrezeptor aus der CXC-Chemokinrezeptor-Familie 27. Dieser virale G-Protein-
gekoppelte Rezeptor (vGPCR; ORF 74) besitzt die größte Ähnlichkeit zum Interleukin-8
Rezeptor. Er wird nur von wenigen Zellen während der lytischen HHV-8 Replikation
exprimiert 28 und fördert die Angiogenese des Tumors durch Sekretion des vascular
endothelial growth factors (VEGF) 29. Die viralen Proteine MIR1 und MIR2 (ORF K3,
K4) bewirken eine Herunterregulierung des Haupthistokompatibilitätskomplex I (MHCI),
einem zellulären Oberflächenrezeptor der die Erkennung und Vernichtung virusinfizierter
Zellen durch zytotoxische T-Zellen vermittelt. Diese Inhibierung der Antigenpräsentation
beruht auf einer erhöhten Endozytoserate, gefolgt von der Degradierung des Rezeptors
über den Ubiquitinweg 30, 31. Die Funktion der Killerzellen kann zusätzlich durch das
viruskodierte FADD-like IL-1 converting enzyme (FLICE)-inhibitorische Protein (vFLIP,
ORF K13) beeinflusst werden. Es fungiert als dominant-negativer Kompetitor des
zellulären FLICE und verhindert somit die Fas-Rezeptor vermittelte Apoptose 32. Zudem
fördert vFLIP das Tumorwachstum und aktiviert den nuclear factor of κB (NFκB) 33.
Einleitung
10
Weitere anti-apoptotisch wirkende Proteine sind das virale B-Zell-Lymphomprotein-2
(vBcl-2, ORF 16) sowie der virale inhibitor of apoptosis (vIAP, ORF K7). Analog zum
zellulären Bcl-2 inhibiert das viruskodierte Protein das pro-apoptotische Protein Bax 34,
welches die Freisetzung von Zytochrom C aus den Mitochodrien vermittelt. In diesen
sogenannten intrinsischen Apoptoseweg greift auch vIAP durch Hemmung von Caspase-3
ein 35. Zudem kodiert HHV-8 für Proteine, die den p53-indizuzierten Apoptoseweg
inhibieren. Das Latenz-assoziierte nukleäre Antigen-1 (LANA-1, ORF 73) interagiert mit
dem Tumorsuppressor p53 und inhibiert dessen Aktivität 36. Des Weiteren verankert
LANA-1 die zirkuläre, virale DNA während der Interphase und Mitose mit dem
zellulären Chromatin und ist somit, als latent exprimiertes Gen, für die Aufrechterhaltung
des viralen Episoms verantwortlich 37. Ein weiteres während der Viruslatenz exprimiertes
Gen ist das virale Cyclin (vCyc, ORF72). Als Homolog des zellulären Cyclin D greift es
in die Zellzyklusregulation ein. vCyc hemmt irreversibel den G1-S Kontrollpunkt, da es
von den cyclin dependent kinase (CDK) Inhibitoren nicht reguliert werden kann 40.
Wie bei anderen Herpesviren ist die virale Genexpression stark reguliert. Da ein
geeignetes Zellkultursystem für die Transformation durch HHV-8 fehlt, wurden die
meisten in vitro Studien in von PEL-abgeleiteten Zelllinien durchgeführt. Diese Zellen
sind latent mit HHV-8 infiziert und können mit Hilfe verschiedender Chemikalien wie
Natriumbutyrat (NaB) oder dem Phorbolester 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Azetat
(TPA) zur Induktion des lytischen Replikationzyklus stimuliert werden. Basierend auf der
Expression der HHV-8 Gene in nichtinduzierten und chemisch induzierten PEL Zellen
können diese in drei Kategorien unterteilt werden: Klasse I (konstitutiv exprimiert),
Klasse II (konstitutiv exprimiert, aber hochreguliert nach Induktion) und Klasse III (nur
nachweisbar nach Induktion) 41. Bislang wurden nur vier HHV-8 Gene eindeutig der
latent exprimierten Klasse I zugeordnet: vFLIP, vCyc, LANA-1 und -2. Nach dem
gängigen Modell der Transformation, wie für EBV angenommen, bewirken vor allem die
latenten Gene die genetischen Veränderungen, welche für das Tumorwachstum
verantwortlich sind. Des Weiteren tragen sowohl Zytokine als auch angiogenesefördernde
Faktoren zur Tumorprogression und der beteiligten Entzündungsreaktion bei.
2.2 Das viruskodierte Interleukin-6
Die sogenannte molekulare Mimikry im HHV-8 Genom wird besonders deutlich durch
das virale Interleukin-6 (vIL-6, ORF K2). Es besitzt 24,7 % Sequenzidentität auf
Aminosäureebene zum humanen Interleukin-6 (hIL-6) 42. hIL-6 ist ein Zytokin mit einem
Einleitung
11
weiten Spektrum an biologischen Aktivitäten. Es induziert die Differenzierung von B-
Zellen zu Antikörper sezernierenden Plasmazellen 43 und wirkt als Wachstumsfaktor für
Plasmazytom- und Myelomzellen 44, 45. Darüber hinaus ist hIL-6 an der Regulation der
Akute-Phase-Protein-Synthese 46, 47, der Hämatopoese 48 und der Differenzierung von
Makrophagen 49 beteiligt. Produziert wird das zelluläre Zytokin hauptsächlich von
Fibroblasten, Endothelzellen und Monozyten/Makrophagen. Schon vor der Entdeckung
des HHV-8 bestand die Annahme, dass hIL-6 in der Pathogenese des KS und der
lymphoproliferativen Erkrankungen, welche heute klar mit HHV-8 assoziiert werden
können, eine wichtige Rolle spielt. Studien belegen, dass hIL-6 das Wachstum von
kultivierten KS Zellen verstärkt und es in erhöhten Konzentrationen im Serum von MCD
Patienten nachweisbar ist. Bei MCD konnten außerdem die hIL-6 Expressionslevel mit
der Schwere der Erkrankung korreliert werden 50, 51, 52, 53. Zahlreiche Publikationen
belegen bisher, dass vIL-6 ähnliche biologische Aktivitäten wie hIL-6 aufweist. Beide
Zytokine spielen eine wichtige Rolle für das Wachstum und Überleben von murinen und
humanen Myelomzellen (z.Bsp: INA-6, B9) 54, 42, 55. Des Weiteren induziert vIL-6 die
entzündungsfördernde Zytokinproduktion in kultivierten KS Zellen 56 und stimuliert
sowohl Angiogenese als auch Hämatopoese im Mausmodell 57. Studien in PEL-
abgeleiteten Zelllinien beweisen, dass vIL-6 vor allem während des lytischen
Replikationzyklus von HHV-8 exprimiert wird 58. Im Gegensatz dazu kann die vIL-6
Expression aber auch ohne die RTA-abhängige, lytische Replikation durch den zellulären
Faktor Notch induziert werden 59. Zudem ist vIL-6 in Gewebeproben von an PEL oder
MCD erkrankten Patienten in Abwesenheit anderer viraler Gene, welche typischerweise
während der lytischen Replikation exprimiert werden, nachweisbar: In vivo exprimieren
10-20 % der PEL und MCD Zellen vIL-6 60. Diese Daten deuten darauf hin, dass vIL-6 in
der HHV-8 Pathogenese auch ohne Reaktivierung der produktiven Virusreplikation eine
Rolle spielen könnte.
Wie die anderen Zytokine aus der IL-6 Familie, vermitteln sowohl vIL-6 als auch das
hIL-6 die Signaltransduktion über die gp130 Untereinheit des Interleukin-6 Rezeptors (IL-
6R) 61. Dieser besteht, neben der signalübertragenden 130 kDa großen β-Kette (gp130, IL-
6Rβ) aus einer zweiten 80 kDa großen α-Kette (gp80, IL-6Rα). Im Verlauf der
Signaltransduktion durch gp130 kommt es zur Phosphorylierung der Janus Kinase (JAK).
Dies führt zur Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 und 3 sowie zur
Aktivierung des Ras-Map-Kinase Signalwegs. Das hIL-6 kann erst im Komplex mit dem
löslichen gp80 an die gp130 Untereinheit des IL-6R binden 62. Im Gegensatz zum
Einleitung
12
zellulären Homolog bildet vIL-6 auch in Abwesenheit von gp80 einen Komplex mit
gp130 und aktiviert die Signaltransduktion 63, 64 (Abb. 1).
Abbildung 1: IL-6R Signalübertragung vIL-6 und hIL-6 aktivieren den IL-6R durch Bildung eines tetrameren gp80:gp130 Komplexes, während vIL-6 die Signaltransduktion auch durch Bildung eines hexameren gp130:gp130 Komplexes alleine induzieren kann. Beide Rezeptorkomplexe führen zur Phosphorylierung der STAT-Transkritionsfaktoren und zur Aktivierung des Ras-MAPK Wegs. Diese Signaltransduktionswege resultieren in der Translokation der TF in den Zellkern und führen zur Induktion der Genexpression. JAK = Janus Kinase STAT = signal transducers and activators of transcription MAPK = mitogen-activated protein kinase
TF = Transkriptionsfaktor
Einige Studien belegen zudem, dass vIL-6 nicht an die gp80 Untereinheit des IL-6R
bindet 57, 65, während eine Vielzahl von Veröffentlichungen diese Bindung eindeutig
belegen 63, 66, 67, 58, 68. Allerdings konnte nur in einer Studie eine Hemmung der vIL-6
Aktivität durch Blockierung des gp80:vIL-6 Interaktion gezeigt werden 54. Da die
Signalübertragung durch die gp130 Untereinheit des IL-6R erfolgt, wurden bislang in
Zellen welche beide Rezeptorketten exprimieren keine Unterschiede in der durch vIL-6
und hIL-6 induzierten Signaltransduktion gefunden 69. Eine kürzlich veröffentlichte
Arbeit der Gruppe um J. Nicholas zeigte allerdings, dass sich die Signaltransduktion im
Vergleich zu Zellen, welche nur die gp130 Untereinheit des IL-6R exprimieren, nach
Bindung von vIL-6 an gp80 verändert 66. Für kultivierte PEL Zellen ist die Aktivierung
der Signaltransduktion via gp130 überlebenswichtig 70, 54, 71, 72. Da diese Zellen sowohl
vIL-6 als auch hIL-6 produzieren, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden, welches
der beiden Zytokine für die uneingeschränkte Proliferation von Bedeutung ist. Einige
Studien belegen die Abhängigkeit der PEL Zellen von hIL-6, was zudem auch im
Einleitung
13
Tiermodell nachgewiesen werden konnte 70, 71. Im Gegensatz dazu zeigten andere
Veröffentlichungen die Wachstumsabhängigkeit der kultivierten Zellen von vIL-6 72, 73, 74.
Neben diesen proliferationsfördernden Eigenschaften kann vIL-6 zugleich latent mit
HHV-8 infizierte Zellen vor der Interferon-α (IFN-α) induzierten Apoptose schützen.
IFN-α ist ein antiviral wirkendes Zytokin, das zu einer Inhibierung der gp80 Expression
auf der Zelloberfläche führt und somit die hIL-6 vermittelte Signaltransduktion hemmt.
Da vIL-6 auch in Abwesenheit von gp80 einen Komplex mit der signalvermittelten gp130
Untereinheit des IL-6R bilden kann, führt dies zu einer partiellen Blockierung der
antiviralen Funktionen von IFN-α 75.
Obwohl klar gezeigt werden konnte, dass HHV-8 ein funktionelles Zytokin mit ähnlichen
biologischen Eigenschaften zum hIL-6 kodiert, ist die Bedeutung des vIL-6 in der
Pathogenese der HHV-8 Infektion noch nicht geklärt. Zudem sind die publizierten Daten
aufgrund der verwendeten experimentellen Systeme teilweise widersprüchlich. Da bisher
kein Zellkultur- oder Tiermodellsystem für die de novo Transformation durch HHV-8 zur
Verfügung steht, war die Überexpression einzelner Gene in verschiedenen, meist HHV-8
negativen, Zellkultursystemen oder transgenen Mäusen die einzige Möglichkeit, die
Funktionen der Gene zu untersuchen. Seit Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) steht
aber eine neue Methode zur Verfügung, um einzelne HHV-8 Gene in HHV-8 infizierten
PEL Zellen auszuschalten und somit deren Funktion zu untersuchen.
2.3 RNA-Interferenz
Das Phänomen der RNA-Interferenz (RNAi) wurde erstmals 1998 in dem Nematoden
Caanorhabditis elegans als zelluläre Antwort auf fremde, doppelsträngige (ds) RNA
entdeckt 76. Sie dient seitdem als wirkungsvolle Methode, um gezielt die Expression
bestimmter Gene auf Ebene der mRNA zu inhibieren. Nach einem gängigen Modell 77
wird der Mechanismus der RNAi durch ein hochkonserviertes Mitglied der RNase III
Ribonuklease Familie, dem sogenannten DICER, initiiert. Dieses Enzym erkennt und
bindet lange ds RNA-Moleküle und prozessiert diese in 21 - 23 Nukleotide lange short
interfering RNAs (siRNAs). Die Spaltung erfolgt in einer ATP-abhängigen Reaktion. Die
so prozessierten siRNAs sind am jeweiligen 5`-Ende phosphoryliert und können so in den
Multiproteinkomplex, genannt RNA-induced silencing complex (RISC) inkorporiert
werden. Nach Aktivierung der Helikaseaktivität des RISC-Komplexes unter Verbrauch
von ATP erfolgt die Entwindung des RNA-Doppelstrangs. Mit Hilfe des antisense
Strangs der siRNA bindet der RISC-Komplex an die komplementäre mRNA-Sequenz,
Einleitung
14
was zur Degradation der mRNA und somit zur Inhibierung der Expression des
kodierenden Proteins führt (Abb. 2) 77, 78, 79.
Abbildung 2: Mechanismus der RNAi. (A) Struktur einer siRNA. siRNAs sind 21 - 23 nt lange ds RNA-Moleküle, welche von einem phosphorylierten 5 `-Ende und einem zwei nt langen und ungepaarten, nichtphosphorylierten 3`-Überhang flankiert werden. Dieser 3`-Überhang ist charakteristische für ein RNase III Spaltprodukt. (B) RNAi Reaktionsweg. Lange ds RNAs werden durch die Ribonuklease DICER erkannt und in einer ATP-abhängige Reaktion in siRNAs gespalten. Diese siRNAs werden in den RISC-Komplex inkorporiert. Nach Aktivierung der Helikaseaktivität des RISC-Komplexes durch Spaltung von ATP erfolgt die Entwindung der siRNAs. Der nichtkodierende Strang der siRNA dient dem RISC-Komplex als Zielsequenz für die endonukleolytische Spaltung der komplementären Ziel-mRNA. (modifiziert aus Dykxhoorn 77)
Experimentell kann dieser Mechanismus auf verschiedene Weise genutzt werden. Um die
Expression bestimmter Gene für kurze Zeit zu inhibieren, kommt vorrangig die transiente
Transfektion von Zellen mit in vitro synthetisierten siRNAs zur Anwendung. Diese
führen im Gegensatz zu längeren ds RNA-Molekülen (mehr als 30 nt) in Säugetierzellen
in der Regel nicht zu einer Induktion des Interferonsystems 80, 81. Um Proteine mit langen
Halbwertszeiten oder zellulären Regulationsmechanismen zu untersuchen ist ein
dauerhaftes Abschalten der Zielgene durch die stabile Expression der siRNAs notwendig.
Dies kann durch die Verwendung sogenannter short haipin RNAs (shRNAs), welche sich
aus einer 19 nt lange komplementären Stammsequenz und einer kurzen Schleifensequenz
zusammensetzen, erreicht werden. Mit Hilfe eines Vektors können die shRNAs unter der
Kontrolle eines RNA-Polymerase II oder III Promotors in den Zielzellen exprimiert
Einleitung
15
werden. Diese shRNAs werden ebenfalls durch das DICER-Enzym erkannt und in
funktionelle siRNA-Moleküle prozessiert 82. Da sich gerade die Transfektion lymphoider
Zellen als schwierig erweist, kann die shRNA-Expressionskassette durch Verwendung
eines retroviralen Vektorssystems stabil in das Genom der Zielzelle integriert werden.
Zielstellung
Um die pathogene Bedeutung des vIL-6 in den HHV-8 transformierten PEL Zellen zu
untersuchen, sollte in der vorliegenden Arbeit die Expression des viralen Zytokins mit
Hilfe der RNAi unterdrückt werden. Nach Etablierung eines effizienten knock-downs des
viruskodierten Zytokins, sollten die resultierenden Effekte auf den Phänotyp der PEL
Zellen, wie Veränderungen im Wachstumsverhalten, in den Signaltransduktionswegen
sowie der zellulären und viralen Genexpression näher charakterisiert werden.
Material und Methoden
16
3 Material und Methoden
3.1 Zellkulturverfahren
Zellkulturbedingungen. Die Suspensionszellen BJAB, Akata, INA-6, BCBL-1, JSC-1 und
BC-3 wurden alle zwei bis drei Tage 1:3 bis 1:5 mit dem entsprechenden
Zellkulturmedium verdünnt (Tab. 1).
Zelllinie Beschreibung Medien Referenz
HEK293T Humane, embryonale Nierenfibroblastenzelllinie, die durch Adenovirus Typ 5 transformiert wurde; enthält ein Expressionsplasmid für SV40 (Simian
Virus 40) T Antigen
DMEM, Glu, Pen/Strep, 10 % FKS
83, 84
GP2-293 HEK293-abgeleitete Verpackungszelllinie (Clontech); Zellen produzieren stabil ein von MMULV abgeleitetes gag-pol und ein amphotrophes Hüllprotein
DMEM, Glu, Genta, 10 % FKS
85
INA-6 IL-6 abhängige, humane Myeloma-Zelllinie RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 10 % FKS, hIL-6 (Strathmann)
50
BJAB HHV-8 und EBV negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie
RPMI 1640, Genta, β-ME, NaB, 10 % FKS,
86
Akata HHV-8 und EBV negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie
RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 10 % FKS
87
BCBL-1 HHV-8 positive und EBV negative, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie
“ 88
LCL EBV transformierte, lymphoblastoide Zelllinie (Kinderklinik, Erlangen)
„ 89
JSC-1 HHV-8 und EBV positive, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie
RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 20 % FKS
90
BC-3 HHV-8 positive und EBV negative, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie
“ 91
U937 EBV transformierte, hematopoetische Zelllinie RPMI 1640, Glu, Genta, 15 % FKS
92
Tab. 1: Beschreibung der verwendeten Zelllinien und Kulturmedien. DMEM: Dulbecco`s Modified
Eagle Medium (Invitrogen, Karlsruhe); RPMI 1640: Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (Invitrogen, Karlsruhe); Glu: L-Glutamin; Pen/Strep: Streptomycin/Penicillin (Invitrogen, Karlsruhe); Genta: 100 µg/ml Gentamycin; β-ME: (Invitrogen, Karlsruhe); NaB: Natrium-butyrat (Invitrogen, Karlsruhe); FKS: fötales Kälberserum (Gibco, Karlsruhe); hIL-6: 500 U/ml humanes Interleukin-6 (Strathmann Biotech GmbH, Hamburg)
Die adhärent wachsenden Zelllinien HEK293T und 293-GP wurden alle zwei bis drei
Tage durch Abschaben von der Zellkulturflasche bzw. durch Trypsinieren gelöst und 1:5
bis 1:10 mit Medium verdünnt. Fötales Kälberserum (FKS), als Bestandteil der
Material und Methoden
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Zellkulturmedien, wurde grundsätzlich eine halbe Stunde bei 56 °C inaktiviert. Alle
Zelllinien wurden im Brutschrank bei 37 °C, 7 % CO2 und 80 % relativer Luftfeuchtigkeit
kultiviert. Zur längeren Aufbewahrung der Zellen wurden Einfrierkulturen angelegt.
Hierzu wurden die Zellen (4 °C, 250 g, 5 min) abzentrifugiert und in 1,2 ml kalten FKS
aufgenommen. Nach zehnminütiger Inkubation auf Eis erfolgte die Zugabe von 800 µl
Einfriermedium (RPMI 1640, 12 % Glukose (w/v), 40 % DMSO (v/v)). Anschließend
wurde die Zellsuspension bei – 80 °C gelagert.
3.2 Rekombinante DNA Methoden
Klonierungen. Die stabile Expression der shRNAs erfolgte mit Hilfe des Vektors
pSIREN-EGFP-RetroQ, welcher zuvor aus den Plasmiden pSIREN-RetroQ und pIRES2-
EGFP (Clontech, Saint.-Germain-en-Lay, France) konstruiert wurde 93. Je zwei
komplementäre Oligonukleotide (Tab. 2), welche für die entsprechenden shRNAs
kodieren, wurden nach dem Anealing bei 95 °C über die EcoRI und BamHI
Restriktionsschnittstellen in den Ausgangsvektor pSIREN-EGFP-RetroQ kloniert. Die
resultierenden shRNA-exprimierenden Vektoren wurden pSIREN-EGFP-RetroQ-shvIL-6
und –shN genannt (Tab. 3). Die Expression der shRNA erfolgt durch den U6 RNA-
Polymerse III Promotor. Des Weiteren kodiert dieser Vektor ein Puromyzinresistenzgen
als Selektionsmarker und EGFP. Die Sequenz der als Kontrolle dienenden Nonsense-
shRNA (shN), weist keine Homolgie zur mRNA eines bekannten zellulären oder viralen
Gens auf.
Oligonukleotid Bezeichnung Sequenz
shN shNBamHI shNEcoRI
fwd 5`GATCCCGACTACCGTTGTATAGGTGTTCAAGAGA CACCTATACAACGGTAGTTTTTTTG3` rev 5`AATTCAAAAAAACTACCGTTGTATAGGTGTCTCT TGAACACCTATACAACGGTAGTCGG3`
shvIL-6 shvIL-6BamHI shvIL-6EcoRI
fwd 5`GATCCGTTGGATGCTATGGGTGATCTTCAAGAGA GATCACCCATAGCATCCAATTTTTTGG3` rev 5`AATTCCAAAAAATTGGATGCTATGGGTGATCTCT CTTGAAGATCACCCATAGCATCCAACG 3
vIL-6 vIL-6BamHI vIL-6HindIII
fwd 5`AGCTGGATCCATGTGCTGGTTCAAGTTGTGGTC3` rev 5`AGCTAAGCTTACTTATCGTGGACGTCAGGAGTCAC3`
hIL-6 Promotor hIL-6pHindIII hIL-6pXmaI
fwd 5`GGAAAGCTTCTCCTGCAAGAGACACCATCCTGAG3` rev 5`CGGCCCGGGAGGGCAGAATGAGCCTCAGAGACAT3`
Tab. 2: Für die Klonierung verwendeten Oligonukleotide. Komplementäre Sequenzen der shRNA-Sequenzen sind unterstrichen, die entsprechenden Restriktionsschnittstellen sind fett hervorgehoben.
Zur Klonierung des vIL-6 Expressionsplasmid wurde aus einer Phagenbibliothek mittels
PCR ein DNA Fragment amplifiziert, welches für das vIL-6 kodiert (Tab. 2). Die
Material und Methoden
18
Phagenbibliothek enthält die genomische DNA des HHV-8 einer KS-Gewebeprobe.
Anschließend wurde das vIL-6 kodierende DNA-Fragment über die BamHI und HindIII
Restriktionsschnittstellen in den Ausgangvektor pcDNA3.1myc/his(A) ligiert. Das
entstandene vIL-6 Expressionsplasmid wird im Folgenden pcvIL-6myc/his genannt (Tab.
3). Um Analysen am hIL-6 Promotor durchführen zu können, wurde ein Luziferase-
Reporterplasmid hergestellt. Dazu wurde aus genomischer BCBL-1 DNA mittels PCR ein
1,2 bp großes Fragment amplifiziert, welches die gesamte Sequenz des hIL-6 Promotors
kodiert 94 (Tab. 2) und über die HindIII und XmaI Restriktionsschnittstellen in den
promotorlosen Luziferasevektor p19Luc-basic (StratageneInc., La Jolla, USA) ligiert. Das
resultierende Plasmid wurde als phIL-6pLuc bezeichnet (Tab. 3).
Plasmid Beschreibung
pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-shN
Eukaryotes Expessionsplasmid, welches eine shRNA gegen kein zelluläres oder virales Gen exprimiert
pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-shvIL-6
Eukaryotes Expessionsplasmid, welches eine shRNA gegen vIL-6 exprimiert
pcvIL-6myc/his Eukaryotes Expessionsplasmid, mit der DNA-Sequenz des vIL-6 phIL-6pLuc Eukaryotes Expessionsplasmid, mit der DNA-Sequenz des hIL-6
Promotors vor dem firefly-Luziferasegen Tab. 3: In der vorliegenden Arbeit klonierten Plasmide Für alle Klonierungs-PCRs wurde die Expand High Fidelity DNA-Polymerase (Roche,
Mannheim) verwendet, da sie eine proofreading-Funktion besitzt und somit Mutationen
vermieden werden können. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung der amplifizierten
DNA-Fragmente im Agarosegel erfolgte die Reinigung mit Hilfe des Perfect Prep Gel
Cleanup Kit (Eppendorf, Hamburg). Durch Restriktionsverdau mit den entsprechenden
Restriktionsenzymen ((New England Biolabs, Frankfurt) konnten die DNA-Fragmente in
den jeweiligen Ausgangvektor ligiert werden (TaKaRa-DNA-Ligation-Kit, BioWhittaker,
Taufkirchen). Dies war möglich, da die in der PCR verwendeten Oligonukleotide die
entsprechenden Restriktionsschnittstellen enthielten. Die Expressionsplasmide für RTA
und LANA-1 (cDNA-Sequenz des jeweiligen Gens in pcDNA3.1myc/his(A)) wurden
freundlicherweise von der Arbeitsgruppe M. Stürzl zur Verfügung gestellt 95.
Sequenzierung. Zur Kontrolle der erhaltenen Vektoren wurden die ligierten DNA-
Fragemente im Anschluß sequenziert um Mutationen ausschließen zu können. Die
Sequenzierung nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode nach Sanger 96 wurde mit
Vektor-spezifischen Oligonukleotiden (Tab. 4) anhand des BigDye Terminator v3.1 Cycle
Material und Methoden
19
Sequenzing Kit (Applied Biosystems, Weiterstadt) auf einem Kapillar-Sequenziergerät
(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt. Die
Bearbeitung der Sequenzrohdaten und Sequenzvergleiche erfolgte mittels Phred/
Phrap/Consed (University of Washington) und Vector NTI (Invitrogen).
Oligonukleotid Bezeichnung Sequenz
pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ
pSIREN_78 pSIREN_6370
fwd 5`GAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGC3` rev 5`CTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG3`
pcDNA3.1myc/his(A) pcDNA3.1_T7 pcDNA3.1_1045
fwd 5`TTAATACGACTCACTATAGGG3` rev 5`AGGGGCAAACAACAGATGGCTG3`
p19Luc-basic p19Luc_905 p19Luc_226
fwd 5`AGAAAGTAAAGGAAGAGTGG3` rev 5`TCAAAGGAGGACCTTGTGGC3`
Tab. 4: Für die Sequenzierung verwendeten Oligonukleotide.
Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien. Die Plamid-DNA-Präparationen erfolgten
aus 250 ml LBAmp-Übernachtkulturen (LB-Medium: 1 % NaCl (w/v); 1 % Bacto-Trypton
(w/v); 0,5 % Hefeextrakt (w/v), pH 7,0) mit Hilfe des PureLinkTM HiPure Plasmid
Maxiprep Kit (Invitrogen, Karlsruhe). Diese Methode beruht auf einer modifizierten
alkalischen Lyse. Die Plasmid-DNA wurde hierbei zuerst unter Niedrigsalzbedingungen
an eine Silica-Anionenaustauschsäule gebunden und nach mehreren Waschschritten unter
Hochsalzbedingungen eluiert. Anschließend erfolgte die Fällung der Plasmid-DNA mit
Isopropanol und ein Waschschritt mit 70 %-tigem Ethanol. Nach Lösen der DNA in H2O
wurde diese photometrisch gemessen.
3.3 Transfektion eukyoter Zellen
Lipid-basierte Transfektionen. HEK239T Zellen wurden mittels Lipofektamin und Plus
Reagenz (Qiagen, Hilden) transfiziert. Hierzu wurden die Zellen am Vortag in 12-Loch-
Schalen ausgesät, so dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Wachstumsdichte von 70
% aufwiesen. Pro Ansatz wurden zwischen 0,2 µg und 2 µg DNA eingesetzt. Zur
vorgelegten DNA wurde der Transfektionsmix I, bestehend aus jeweils 50 µl Optimem
und 2 µl Plus Reagenz pro Ansatz zugesetzt und anschließend für 15 min bei
Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Zugabe des Transfektionmix II, bestehend aus
jeweils 50 µl Optimem (Gibco, Karlsruhe) und 2 µl Lipofektamin erfolgte eine erneute
Inkubation für 15 min bei RT. Während dieser Inkubationsschritte wurde das Medium der
HEK293T Zellen durch vorgewärmtes Optimem ausgetauscht. Nach Zugabe von 300 µl
Optimem zum Transfektionsansatz wurde dieser vollständig, nach Abziehen des
Material und Methoden
20
Waschmediums, auf die HEK293T Zellen pipettiert. Anschließend erfolgte eine
Inkubation im Brutschrank für 3 Stunden mit folgender Zugabe von 400 µl
Zellkulturmedium mit 20 % FKS. Am Tag nach der Transfektion wurde ein
Mediumwechsel durchgeführt und nach 48 h die Zellen für weitere Analysen geerntet.
Kalzium-Phosphat-Transfektion. Zur Herstellung pseudotypisierter Retroviren oder des
rvIL-6 wurden die entsprechenden Zellen am Tag vor der Transfektion in 10 cm
Zellkulturschalen ausgesät, so dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine optimale Dichte
von 60-70 % aufwiesen. Die benötigten Puffer und Reagenzien wurden vor der
Transfektion auf RT gebracht. Kurz vor der Transfektion erfolgte ein Austausch des
Zellkulturmediums gegen Chloroquin-haltiges Medium, welches eine Endkonzentration
von 25 µM Chloroquin (Sigma, Taufkirchen) aufwies. Da bei dieser
Transfektionsmethode die Aufnahme der DNA über Endozytose erfolgt, erhöht die
Zugabe von Chloroquin die DNA-Stabilität und somit die Transfektionseffizienz. Die
jeweiligen Expressionsplasmide wurden mit 500 µl CaCl2 (2 M CaCl2 in PBSo ) und
500 µl HBS-Puffer (0,28 M NaCl; 0,05 M HEPES; 1,5 mM Na2HPO4 pH 7,05) vermischt
und nach einer 15-minütigen Inkubation tropfenweise zu den Zellen gegeben. Am Tag
nach der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h wurde der
Zellkulturüberstand geerntet.
Elektroporation. Die Transfektion der HHV-8 infizierten PEL Zellen erfolgte durch
„Nukleofektion“ mittels Amaxa-Nukleofektionstechnik (Nucleofector II, Amaxa, Köln).
Pro Ansatz wurden jeweils 2x 106 Zellen mit 10 µg des RTA Expressionsplasmids bzw.
des Leervektors pcDNA3.1myc/his(A) (Invitrogen, Karlsruhe) entsprechend der
Anleitung des B cell line Nucleofactor Kits V (Amaxa, Köln) mit dem Programm Q-01
elektroporiert. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 10 µg des Plasmids
pmaxEGFP (Amaxa, Köln) „nukleofektiert“. Dieses Plasmid kodiert für das enhanced
green fluorescent protein, wobei die Fluoreszenz 48 h nach Transfektion im FACS
gemessen wurde. Am Tag nach Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h
wurden die Zellen für weitere Analysen geerntet.
3.4 Promotor-Analysen durch Luziferase-Assay
Mit Hilfe des Luziferase-Assays wurde die Aktivität des hIL-6 Promotors (hIL-6p) unter
den Einfluß der viralen Proteine RTA und LANA-1 analysiert. Die Analysen erfolgten
Material und Methoden
21
durch transiente Transfektion von HEK293T Zellen mittels Lipofektamin und Plus
Reagenz (Invitrogen, Karlsruhe). Hierzu wurden jeweils 200 ng des Reporterkonstrukts
phIL-6pLuc mit 1 µg des RTA oder LANA-1 Expressionsplasmids bzw. dem Leervektor
pcDNA3.1myc/his (A) kotransfiziert.
Puffer und Lösungen Zusammensetzung
Lysispuffer 100 mM Tris pH 7,8; 1M DTT; 0,139 % DCTA (w/v); 2 % Triton X-100 (v/v); 20 % Glycerol (w/v)
ATP-Lösung 100 mM rATP; 18,2 % 1 M Tris pH 8,8; D-Luziferinstock D-Luiferin (PJK, Kleinbittersdorf) gelöst in 770 µl Assaypuffer KPO4-Lösung 1 M KPO4 pH 4,3 und 1 M KPO4 pH 9,1 eingestellt auf pH 1 Assaypuffer 100 mM KPO4-Lösung ; 15 mM MgSO4 ; 5 mM rATP Luziferinlösung 2 % D-Luziferinstock in Assaypuffer
Tab. 5: Für den Luziferase-Assay verwendete Puffer und Lösungen Die Transfektionsansätze wurden 48 h nach der Transfektion geerntet, mit PBSo
gewaschen und in Lysispuffer (Tab. 5) resuspendiert. Nach anschließender Zentrifugation
für 5 min bei 4 °C (10000 g) wurden die Lysate in eine Luminometer-96-Loch Platte
überführt und ständig auf Eis gehalten. Die Luziferaselösung (50 µl) und der Assaypuffer
(50 µl) wurden vor der Messung durch das Orion Microplate Luminometer (Berthold
Technologies GmbH & Co KG, Bad Wildbad) zugeführt und gemessen. Die Messung der
Proteinkonzentration in dem jeweiligen Lysat erfolgte mit Hilfe des BioRad Protein Assay
(BioRad, München). Die Luziferase-Aktivität der einzelnen Transfektionsansätze wurde
auf die entsprechende Proteinkonzentration abgeglichen und ist als Vielfaches der
Kontrolltransfektion (phIL-6pLuc kotransfiziert mit pcDNA3.1myc/his(A)) dargestellt.
3.5 Hemmmung der Genexpression durch RNAi
Retrovirale Transduktion von shRNAs. Zur Herstellung pseudotypisierter Retroviren
wurden 293-GP Zellen mit je 10 µg des jeweiligen pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-
Konstrukts und 5 µg des vesikulären Stomatitis Virus (VSV)-G Expressionsplasmids
(pVSG-G, Clontech, Saint.-Germain-en-Lay, France) durch die Kalzium-Phosphat-
Methode transfiziert. Nach 48 h wurde der Viren-enthaltende Zellkulturüberstand
geerntet, mittels FKS-abgesättigter Filter (0,45 µM Porengröße) gefiltert und durch
Ultrazentrifugation (Beckmann L755 Ultrazentrifuge, SW28-Rotor, 24000 rpm, 4 °C, 2 h)
konzentriert. Das Zentrifugationssediment wurde anschließend in 2 ml Zellkulturmedium
unter Zusatz von 2 µg/ml Polybren resuspendiert. Polybren ist ein kationisches Polymer,
dass die Ladungsabstoßung zwischen Zellmembran und Virushülle verringert und somit
Material und Methoden
22
die Transduktionseffizienz erhöht. Das Viruskonzentrat wurde genutzt, um jeweils 1x 106
PEL Zellen zu infizieren. Nach 48 h wurde die Transduktionseffizienz anhand der EGFP-
Expression mittels FACS-Analyse bestimmt und die infizierten Zellen durch Zugabe von
2 µg/ml Puromyzin (Sigma, Taufkirchen) für 10 Tage selektioniert bis ca. 90 % der
Zellen EGFP positiv waren. Mit diesen einheitlich infizierten PEL Zellen wurden die
weiteren Analysen durchgeführt.
Fluorescence activated cell sorter (FACS)-Analysen. Zur Bestimmung der Effizienz
retroviral transduzierter bzw. mit synthetischen siRNAs transfizierter PEL Zellen wurden
jeweils 500 µl der jeweiligen Zellsuspension entnommen und für 5 min bei 4 °C (250 g)
abzentrifugiert.
Parameter Einstellung
FSC: 10-1; Verstärkung 3,86
SSC: 335
FL1: (grün) 505
FL2: (rot) 458
Kompensation: FL2 – 36,3 % FL1
FL1 – 0,9 % FL2
Tab.5: FACS Einstellungen
Alle folgenden Schritte erfolgten bei 4 °C. Nach zweimaligen Waschen in FACS-Puffer
(PBSo, 5 % FKS) wurden die Zellpellets in 500 µl FACS-Puffer resuspendiert, mit 25 µl
einer 0,1 mg/ml konzentrierten Propidiumjodidlösung (PI; Sigma, Taufkirchen) versetzt
und in Falcon-2052 Röhrchen überführt. Da sich PI in toten Zellen einlagert, kann anhand
dieser Färbung die Anzahl der lebenden Zellen bestimmt werden. Nach Inkubation der
Zellsuspension für 10 min auf Eis wurden diese der FACS Analyse unterzogen und
jeweils die rote (FL-2) und die grüne (FL-1) Fluoreszenz detektiert. Die Messung der
Proben erfolgte am Durchflußzytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg)
und die Auswertung anhand des Programms FACS-Express V3.
Transfektion synthetischer siRNAs. Um gleichzeitig die Expression zweier verschiedener
Gene zu inhibieren, kamen synthetische siRNA Oligonukleotide (Tab. 6, IBA, Göttingen)
zur Anwendung. Die Transfektion von PEL Zellen mit diesen siRNAs erfolgte mit Hilfe
Material und Methoden
23
des HiPerFect Transfektionsreagenz (Qiagen, Hilden) anhand den Angaben des
Herstellers. Hierzu wurden die Zellen im voraus zwei bis drei Tage bei einer Dichte von
200000 Zellen/ml gehalten.
Bez. Sequenz
siN sense 5`GACUACCGUUGUAUAGUAGdTdT3` antisense 5`CUACUAUACAACGGUAGUCdTdT3`
sivIL-6 (597) sense 5`UUACUUAUCGUGGACGUCAtt3` antisense 5`UGACGUCCACGAUAAGUAAtt3`
sihIL-6 (863) sense 5`GCUGAGUUAAUUUAUGUAAtt3` antisense 5`UUACAUAAAUUAACUCAGCtt3`
Tab. 6: Überblick über die verwendeten synthetischen siRNAs Pro Ansatz wurden je 10 µl der entsprechenden siRNA, 8 ml HiPerfect und 300 µl
Optimem (Gibco, Karlsruhe) vermischt und 10 min bei RT inkubiert. Im Anschluss
erfolgte die Transfektion von jeweils 1x 106 Zellen resupendiert in 500 µl Otimem mit
diesem Reaktionsmix. Als Kontrolle wurde ein Ansatz mit einer EGFP markierten siRNA
mitgeführt und die Transfektionseffizienz nach 48 h im FACS ermittelt. Am Tag nach
Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h wurden die Zellen für weitere
Analysen geerntet.
3.6 RNA-Nachweis
Isolierung gesamtzellulärer RNA und Reverse Transkription. Gesamtzelluläre RNA
wurde mit Hilfe des NukleoSpin RNA II Kit (Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren)
anhand den Angaben des Herstellers isoliert. Dabei erfolgt die Aufreinigung der RNA
über eine Silica-Säule. RNA-Degradation durch die Aktivität von RNAsen ist aufgrund
des hohen Anteils an chaotropen Salzen im Lysispuffer minimiert. Unter Hochsalz-
Bedingungen wurden die Nukleinsäuren (DNA, RNA) an die Säulen gebunden und die
DNA mittels DNase I-Inkubation verdaut. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die
Elution der RNA in RNAse-freien Wasser. Zum spezifischen Nachweis der Expression
verschiedener Gene wurde die RNA mit Hilfe der SuperscriptTM
II Reversen
Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) in cDNA umgeschrieben. Im ersten Schritt wurden
je 1 µg der isolierten RNA, 1 µl Random-Hexamer-Oligonukleotid (Bioline,
Luckenwalde) und 1 µl 10 mM dNTPs (Bioline, Luckenwalde) eingesetzt und 5 min bei
65 °C inkubiert. Nach Abkühlen des Reaktionsansatz für 2 min auf Eis erfolgte die
Zugabe von 4 µl 5x First-Strand-Puffer und 2 µl 0,1 M DTT (Invitrogen, Karlsruhe) und
eine weitere Inkubation für 2 min bei 25 °C. Anschließend wurden dem Reaktionsansatz
Material und Methoden
24
100 U SuperscriptTM
II Reversen Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) zugesetzt, gefolgt
von einer Inkubation von 10 min bei 25 °C. Die Reverse Transkription erfolgte bei 42 °C
für 50 min. Nach Inaktivierung des Reaktionsansatzes für 15 min bei 72 °C wurde die
synthetisierte cDNA photometrisch gemessen und 1:5 in DEPC Wasser verdünnt.
Quantitative realtime-PCR. Um die mRNA-Expression der viralen (vIL-6, RTA, K8.1,
LANA-1) und zellulären (hIL-6) Gene exakt quantifizieren zu können, wurde eine
realtime-PCR unter Verwendung genspezifischer Oligonukleotide und dem DNA-
Farbstoff SYBR green in einem ABI PRISM 7500 Thermocycler (Applied Biosystems,
Foster City, USA) durchgeführt. In die realtime-PCR-Reaktionen wurde jeweils 10 µl der
verdünnten cDNA eingesetzt. Der Reaktionsansatz beinhaltete 0,2 µM Rox-K Puffer (6-
carboxy-X-rhodamine, Invitrogen, Karlsruhe), 0,6-fach Puffer II (100 mM Tris-HCl
pH8,3; 500 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP (2,5 mM, Bioline, Luckenwalde),
0,1-fach SYBR green (1:1000 in Puffer II verdünnt, Invitrogen, Karlsruhe), je 10 pmol fwd
und rev Oligonukleotid (Biomers, Ulm; Tab. 7) und 0,25 µl Taq-Polymerase (3 U) in
einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Quantifizierung der jeweiligen Transkripte erfolgte
anhand von Standardeichgeraden. Diese wurden durch Verdünnungen von
Expressionsplasmiden (cDNA der zu analysierenden Gene im Vektor
pcDNA3.1myc/his(A)) oder aufgereinigter PCR-Fragmente (PCR aus BCBL-1 cDNA,
Tab. 2) mit bekannter Konzentrationen und Kopienzahl hergestellt.
Oligonukleotid Sequenz
β-Aktin fwd 5`CCATCTACGAGGGGTATGC3` rev 5`CGTGGCCATCTCTTGCTC3`
β-Aktin Standard fwd 5`CCATCTACGAGGGGTATGC3` rev 5`CGTGGCCATCTCTTGCTC3`
vIL-6 fwd 5`GTTTGAAAAGGATCTTCTCATTCAGA3` rev 5`CAGAGGTCGCGGAAGCA3`
vIL-6 Standard fwd 5`TGTGGTCTATCTTGCTGGTAG3` rev 5`AGATGAAAAATAGCAGCGGG3`
RTA fwd 5`GGTACAGACCCGGCGTTTATT3` rev 5`CGGTGGATGTGTTGTACACCAT3`
K8.1 fwd 5`CCACACAGATTCGCACAGAAA3` rev 5`GGCACGCCACCAGACAA3`
LANA-1 fwd 5`CCAGGAAGTCCCACAGTGTTC3` rev 5`GCCACCGGTAAAGTAGGACTAGAC3`
hIL-6 fwd 5`GTACATCCTCGACGGCATCTC3` rev 5`GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC3`
hIL-6 Standard fwd 5`TTCTGCCCTCGAGCCCACCG3` rev 5`GCAGCTTCGTCAGCAGGCTG3`
Tab. 7: Überblick der in den realtime-PCRs verwendeten Oligonukleotide
Material und Methoden
25
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 5 min (initiale Denaturierung); 45
Zyklen: 95 °C für 15 sec (Denaturierung), 60 °C für 35 sec (Annealing), 72 °C für 30 sec
(Extension). Die Auswertung der realtime-PCR erfolgte mit Hilfe der 7000 System SDS
Software (Applied Biosystems, Foster City, USA).
3.7 Proteinnachweis
Gewinnung von gesamtzellulären Protein. Für die Analyse der endogenen Expression
viraler und zellulärer Proteine wurden jeweils 2x 106 der PEL Zellen 5 min bei 4°C
abzentrifugiert (250 g) und das Zellpellet in 100 µl Lysispuffer (Tab. 9) resuspendiert. Zur
Hemmung von Proteasen und Phosphatasen wurde dem Lysispuffer zuvor die in Tab. 8
aufgelisteten Inhibitoren zugesetzt.
Inhibitor Zielenzym Stammlösung Endkonzentration
PMSF Serinproteasen 100 mM in Ethanol 1 mM
Leupeptin Cysteinproteasen 1 mg/ml 10 µg/ml
Pepstatin Aspartatproteasen 1 mg/ml 1 µg/ml
Aprotinin Serinproteasen 1,4 mg/ml 10 µg/ml
NaVO3 / Na3VO4 Tyrosinphophatasen 1 M 10 mM
Tab. 8: Überblick über die verwendeten Protease- und Phosphataseinhibitoren
Nach einer Inkubation für 30 min auf Eis erfolgte die Sonifizierung der Proteinlysate mit
Hilfe des Branson Sonifier® (Emerson, London) für 3 min bei 4 °C. Die
Proteinkonzentration wurde anschließend photometrisch mit Hilfe des BioRad Protein
Assay (BioRad, München) am BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt.
Puffer und Lösungen Zusammensetzung
Lysispuffer 0,5 NaCl; 1 % Triton X-100 in PBSo; 10 mM EDTA SDS-Probenpuffer 120 mM Tris/HCl pH 6,8; 20 % Glycerin (w/v); 4 % SDS (v/v); 10
% β-ME (v/v); 0,1 mg/ml Bromphenolblau PBSo 137 mM NaCl; 2,68 mM KCl; 7,3 mM Na2PO4; 1,47 KH2PO4 Proteingel-Laufpuffer 25 mM Tris; 250 mM Glycin; 0,1 % SDS (v/v) Transferpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20 % Methanol (v/v) Stripp-Puffer 6,25 % Tris pH 6,6; 2 % SDS (v/v), 0,8 % β-ME (v/v) Blocklösung 5 % Magermilchpulver (w/v); 0,3 % Tween20 (v/v) in PBSo ECL-Lösung: SolA SolB H2O2
0,1 M Tris pH 8,6; 25 % Luminol 0,11 % Parahydroxycoumarinsäure 30 % H2O2
Tab. 9: Zur Isolierung gesamtzellulärer Proteine und im Immunblot verwendete Puffer und Lösungen
Material und Methoden
26
Immunblot. Mit Hilfe des Immunblots können die isolierten Proteine gelelektrophoretisch
anhand ihrer Größe aufgetrennt und durch Antikörper spezifisch nachgewiesen werden.
Jeweils 50 µg der gemessenen Proteinkonzentration wurden mit SDS-Probenpuffer (Tab.
9) versetzt, bei 95 °C für 5 min denaturiert und auf ein 10 %- bzw. 12 %-iges SDS-
Polyacrylamidgel bei 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Zusätzlich wurde ein
Molekulargewichtsstandard in Form einer vorgefärbten Proteinleiter aufgetragen
(Prestained Protein Ladder, Fermentas Life Science, St. Leon Rot).
Antikörper Isotyp/Ursprung Referenz Verdünnung
vIL-6 IgG monoklonal/Kaninchen Tebu-Bio, Offenbach 1:1000
K8.1 (BS555) IgG monoklonal/Maus Biotest AG, Dreieich 1:1000
P-STAT1 (Tyr 701) IgG polyklonal/Kaninchen New England Biolabs; Frankfurt am Main
1:1000
STAT1 IgG monoklonal/Kaninchen New England Biolabs; Frankfurt am Main
1:1000
P-STAT3 (Tyr 705) IgG monoklonal/Maus Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg
1:1000
STAT3 IgG polyklonal/Kaninchen Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg
1:1000
Aktin IgG monoklonal/Maus Sigma, Taufkirchen 1:5000
Tubulin IgG monoklonal /Maus Sigma, Taufkirchen 1:1000
anti-Maus IgG/Ziege, HRP-markiert DAKO, Hamburg 1:1000
anti-Kaninchen IgG/Ziege, HRP-markiert DAKO, Hamburg 1:1000
Tab. 10: Im Immunblot verwendete Antikörper
Nach dem Gellauf erfolgte der Transfer der Proteine mittels Elektroblot auf eine Protran®
Nitrozellulose-Transfer-Membran (0,2 µM Porengröße; Hartenstein, Würzburg). Um freie
Bindestellen auf der Membran abzusättigen, wurde diese 1 h bei RT in Blocklösung
(Tab. 9) inkubiert. Anschließend erfolgte eine weitere Inkubation der Membran mit dem
spezifischen Primärantikörper (Tab. 10) für 1 h bei RT oder über Nacht (ü. N.) bei 4 °C.
Nach dem Waschen der Membran mit PBSo wurde diese mit dem horseradish peroxidase
(HRP)-gekoppelten Sekundärantikörper (Tab. 10) für 1 h bei RT inkubiert. Im Anschluss
erfolgte ein wiederholtes Waschen der Membran mit PBSo und die Detektion der
gebundenen Antikörper mittels Chemolumineszenz. Mit Hilfe des ECLTM-Systems (Tab.
9, Amersham Pharmacia Biotechnologies, Freiburg) konnte die Chemolumineszenz im
Fuji LAS-1000 Image Reader (Fujifilm, Tokio) nachgewiesen werden. Die Auswertung
erfolgte mit Hilfe des Adobe Photoshop CS (Adobe Systems GmbH, München). Danach
wurden die gebundenen Antikörper durch eine 30-minütige Inkubation der Membran in
Material und Methoden
27
Stripp-Puffer (Tab. 9) entfernt, um in weiteren Immunreaktionen andere Proteine
spezifisch nachweisen zu können.
Silberfärbung. Es wurde die modifizierte Silberfärbung nach Yan verwendet 97.
Enzyme-linked-immunosorbent Assay (ELISA). Die humane IL-6, IL-1β und IFN-α
Sekretion in das Zellkulturmedium der PEL Zellen wurde mittels eines kommerziell
erhältlichen ELISA Kits (BD Biosciences, Heidelberg) anhand den Angaben des
Herstellers gemessen. Eine 96-Loch Mikrotiterplatte (MaxiSorb ELISA Mikrotiterplatte,
NuncTM) wurde mit dem entsprechenden Capture-Antikörper beschichtet und über Nacht
bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Mikrotiterplatte mit Assay-Puffer
blockiert und anschließend die Standardverdünnungen bzw. die zu messenden
Zellkulturüberstände aufgetragen. Nach Zugabe der Detektions-Antikörper-Enzymlösung,
der Substratlösung und der Stopplösung konnten die einzelnen Reaktionsansätze in der
Mikrotiterplatte im ELISA-Reader (E-Max precisionmicroplate reader, MWG Biotech
AG, Ebersberg) bei einer Wellenlänge von 450 - 560 nm gemessen werden. Zwischen den
einzelnen, zugegebenen Lösungen erfolgten Waschschritte.
Immunfluoreszenz (IF). Zum Nachweis der endogenen Expression und zellulären
Lokalisation viraler Proteine erfolgte mit Hilfe der IF. Hierzu wurden PEL Zellen durch
Zentrifugation (RT, 250 g, 5 min) geerntet, zweimal mit PBSo gewaschen, in 100 - 200 µl
PBSo aufgenommen und auf markierte Objekträger aufgetropft. Nach kurzem Antrocknen
der Zellen erfolgte die Fixierung mittels 3 % PFA in PBSo (w/v) für 10 min bei RT.
Anschließend wurden die Objektträger mit PBSo gewaschen, die Zellen mit Hilfe von
0,2 % Triton X-100 in PBSo (v/v) permeabilisiert und für 1 h mit der Blockierlösung (1 %
BSA (v/v), 5 % FKS (v/v) in PBSo) inkubiert. Nach Zugabe des spezifischen
Primärantikörpers (Tab. 11), erfolgte die Inkubation der Objektträger über Nacht bei RT
in einer feuchten Kammer. Der entsprechende Farbstoff-konjugierte Sekundärantikörper
(Tab. 11) wurde nach Waschen der Objektträger mit PBSo zugegeben und eine 1 h bei RT
unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Im Anschluss wurde der Objektträger erneut
mit PBSo gewaschen, die Waschpufferrückstände mit Hilfe einer Vakuumpumpe entfernt
und der Objektträger mit Eindeckmedium (Vectashield mit DAPI, Vector Laboratories)
eingedeckt. Nach Trocknen der Objektträger ü. N. erfolgte die Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop.
Material und Methoden
28
Antikörper Isotyp/Ursprung Referenz Verdünnung
vIL-6 IgG monoklonal/Kaninchen Tebu-Bio, Offenbach 1:1000
K8.1 (BS555) IgG monoklonal/Maus Biotest AG, Dreieich 1:1000
LANA-1 IgG polyklonal/Ratte Tebu-Bio, Offenbach 1:1000
anti-Maus IgG/Ziege, Cy3-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200
anti-Kaninchen IgG/Ziege, Alexa555-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200
anti-Ratte IgG/Ziege, Alexa488-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200
Tab. 11: In der IF verwendete Antikörper
3.8 Expression und Aufreinigung von rekombinanten vIL-6
Zur Herstellung des rekombinanten vIL-6 (rvIL-6) wurden HEK293T Zellen in 10 cm
Zellkulturschalen ausgesät und anhand der Kalzium-Phosphat-Methode mit 10 µg des
vIL-6 Expressionsplasmids transfiziert. Die Zellen wurden anschließend für vier Tage
kultiviert, wobei täglich ein Mediumwechsel erfolgte und die Zellkulturüberstände von
Tag 2 bis 4 gesammelt und bei – 20 °C gelagert wurden. Ein Aliquot jedes Überstandes
wurde mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt, über SDS-PAGE aufgetrennt und die
Expression des vIL-6 im Westernblot mittels eines gegen das myc-Epitop gerichteten
Antikörpers überprüft. Im Anschluss wurden die gesammelten Überstände
zusammengegeben, für 10 min bei 4 °C zentrifugiert (800 g), das Sediment verworfen und
der Überstand steril filtriert (Porengröße 0,22 µm). Anschließend erfolgte die Einstellung
des pH-Wertes durch Zugabe von 1 M Tris Puffer (maximale Endkonzentration: 10 mM
Tris). auf pH 8. In einem ersten Schritt zur Aufreinigung des myc/his-gekoppelten
Proteins wurde der Überstand durch Affinitätschromatographie über eine 1 ml HisTrap-
Säule (GE Healthcare) unter Verwendung des Äkta high performance liquid
chromatography (HPLC) Systems (GE Healthcare) gereinigt. Da nach diesem
Reingungsschritt kein rekombinantes Protein gewonnen werden konnte, erfolgte eine
zweite Aufreinigung des vIL-6-haltigen Durchflusses mittels Zugabe von 7 ml Ni-
nitrilotriacetic (NTA) Agarose (Qiagen, Hilden) und einer Inkubation unter leichten
Schütteln für 2 Tage bei 4 °C. Anschließend wurde die Matrix geerntet und in ein
Omniprep-Säulchen (Biorad) überführt, mit 30 ml PBS und 30 ml 500 mM NaCl und 10
mM Tris pH 8 gewaschen. Das rekombinante vIL-6 wurde im Anschluss durch Zugabe
eines Puffers (500 mM Imidazol; 200 mM NaCl; 10 mM Tris pH 8) in 5 ml Fraktionen
eluiert. Aus jeder Fraktion wurden 10 µl mit SDS-Probenpuffer versetzt,
gelelektrophoretisch über ein 12 %-iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und
Material und Methoden
29
anschließend mit Hilfe einer Silberfärbung oder eines Immunblots analysiert. Die
Fraktionen, die das rvIL-6 enthielten, wurden zusammengegeben und mittels eines
Amicon-Filters (Milipore; Molekulargewichtdurchlass von 3 kDa ) gegen 1 M HEPES-
Puffer dialysiert. Die Lagerung des aufgereinigten, rvIL-6 mit einer Konzentration von 1
mg/ml erfolgte in 50 µl Aliquots bei - 80°C.
3.9 Bestimmung der Zellproliferation
Die Messung der Wachstumsrate verschiedener Zellen erfolgte mit Hilfe der 3H-
Tyhmidin-Markierung. Hierzu wurden die entsprechenden Zellen dreimal mit sterilem
PBSo gewaschen, im jeweiligen Zellkulturmedium aufgenommen und 5x 104 Zellen in
eine 96-Loch Platte mit rundem Boden überführt. Es wurden jeweils
Dreifachbestimmungen der einzelnen Ansätze durchgeführt. Anschließend erfolgte die
Zugabe von 2 µCi 3H-Thymidin (Amersham, Braunschweig) verdünnt in 48 µl
Zellkulturmedium pro Ansatz (Endkonzentration 0,5 µCi pro Ansatz). Nach einer
Inkubation für 16 h im Brutschrank wurden die markierten Zellen auf einen Glasfaserfilter
mit Hilfe eines Multi-Harvester überführt und mit einer Szintillatorplatte (Wallac Oy,
Turku) bei 95 °C überschichtet. Der 3H-Thymidin-Einbau in die zelluläre DNA wurde mit
Hilfe eines MicroBeta TriLux Zählers (Perkin Elmer, Wellesley) gemessen.
Ergebnisse
30
4 Ergebnisse
4.1 Expression des endogenen vIL-6 in PEL Zellen
PEL Zelllinien wurden von primären Effusionslymphomen oder sog. body cavity-based
lymphoma (BCBL) etabliert. Diese Zellen können unbegrenzt kultiviert werden und sind
stets mit HHV-8 infiziert. In etwa 50 % der PEL Zelllinien findet man darüberhinaus das
Genom des EBV. Charakteristisch für die überwiegend latente Infektion der PEL Zellen
ist das Vorhandensein des HHV-8 Genoms als Episom im Zellkern, sowie die Expression
einer begrenzten Anzahl viraler Gene. Nur ein geringer Prozentsatz der HHV-8 positiven
Zellen geht spontan in die lytische Replikationsphase des Virus über. Erst durch die
Behandlung mit TPA und NaB 88, 98, kann die lytische Genexpression in einem größeren
Prozentsatz der PEL Zellen induziert werden. Das vIL-6 wird von den meisten Autoren
als ein frühes, lytisches HHV-8 Gen eingestuft. Die Expression dieses Gens ist zwar in
latenten PEL Zellen nachweisbar, wird aber durch die Induktion der lytischen Replikation
drastisch erhöht 55, 60. Um die Expression und zelluläre Lokalisation von vIL-6
nachzuweisen, erfolgte eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) von vIL-6 in Kombination mit
einem typischen latenten HHV-8 Gen (LANA-1) und einem späten, lytischen Gen (K8.1)
in der PEL-abgeleiteten Zelllinie BCBL-1. Hierzu wurden die BCBL-1 Zellen für zwei
Tage mit 0,3 M NaB und 25 ng/ml TPA induziert. Als Kontrolle dienten nichtstimulierte
BCBL-1 Zellen sowie HHV-8 und EBV-negative Akata Zellen. Die Expression des
viralen Zytokins war sowohl in nichtinduzierten (Abb. 3A Reihe 4), als auch in TPA und
NaB induzierten BCBL-1 Zellen mittels IF nachweisbar (Abb. 3A Reihe 1).
Allerdings war die Anzahl der vIL-6 positiven Zellen durch die chemische Induktion der
lytischen Replikation um das Dreifache erhöht (Abb. 3A Reihe 1 vgl. mit Reihe 4).
Gleichzeitig konnte in den vIL-6 positiven Zellen auch die Expression des Glykoprotein
K8.1 detektiert werden (Abb. 3B). Die Expression dieser lytischen, viralen Proteine
erfolgte sowohl im Zytoplasma als auch am endoplasmatischen Retikulum (ER) der
induzierten BCBL-1 Zellen 95. Bei den BCBL-1 Zellen, die auch ohne vorherige
Induktion mit TPA und NaB, vIL-6 und K8.1 positiv sind, handelt es sich um die 1 % der
kultivierten PEL Zellen, welche spontan den lytischen Replikationszyklus durchlaufen.
Ergebnisse
31
Ergebnisse
32
Abbildung 3: Expression und zelluläre Lokalisation von endogenem vIL-6 in latent oder lytisch infizierten BCBL-1 Zellen. Nichtinduzierte, für 48 h mit TPA und NaB induzierte BCBL-1 Zellen und HHV-8 negative Akata Zellen wurden mit PFA fixiert und mittels IF untersucht. Die Bilder jeder horizontalen Reihe stellen jeweils den selben Bildabschnitt dar. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen einem repräsentativen Versuch. (A) Die Färbung der Zellkerne mit DAPI (blau) ist in der ersten Spalte dargestellt. Die zweite Spalte repräsentiert den Nachweis von LANA-1 mit einem Alexa 488-konjugierten Zweitantikörper (grün). Die dritte Spalte zeigt die Detektion des vIL-6 mit einem Alexa 555-gekoppelten Zweitantikörper (rot). Ganz rechts ist jeweils der Overlay der drei Bilder dargestellt. Die Bilder entsprechen einer 20-fachen Vergrößerung, während die mit I und II gekennzeichneten Bilder eine 40-fache Vergrößerung des markierten Bildabschnitts darstellen. (B) Die erste Spalte repräsentiert die Färbung der Zellkerne mit DAPI (blau). In der zweiten Spalte ist der Nachweis von K8.1 mit einem Cy5-konjugierten Zweitantikörper (gelb) dargestellt. Die dritte Spalte zeigt die Detektion des vIL-6 mit einem Alexa 555-gekoppelten Zweitantikörper (rot). Ganz recht ist jeweils der Overlay der drei Bilder dargestellt. Die Bilder entsprechen einer 20-fachen Vergrößerung, während die mit I gekennzeichneten Bilder eine 40-fache Vergrößerung des markierten Bildabschnitts darstellen.
Mit der Immunfluoreszenz war das latent exprimierte LANA-1 Protein als unregelmäßig
geformte, punktartige Strukturen im Zellkern nachweisbar (Abb. 3A Reihe 4). Bei
Reaktivierung des lytischen Zyklus der HHV-8 Genexpression wich diese diskrete
nukleäre Anfärbung einer diffusen sowohl nukleären als auch zytoplasmatischen
Verteilung (Abb. 3A Reihe 1).
4.2 Biologische Aktivität des rekombinaten vIL-6
Die RNA-Interferenz ist eine sehr effektive Methode um spezifisch die Expression
bestimmter Gene zu hemmen und dadurch deren Funktion in der Zelle zu untersuchen.
Um mögliche unspezifische Nebeneffekte der verwendeten siRNAs ausschließen zu
können, ist die Rückführung des beobachteten Phänotypes durch die Expression einer
resistenten Form des entsprechenden Zielgens eine wichtige Kontrolle 99. Als Kontrolle
der siRNA-Experimente in dieser Arbeit wurde ein rekombinant produziertes vIL-6
verwendet. Wie verschiedene Veröffentlichungen belegten, ist das aus Bakterienzellen
gewonnene vIL-6 überwiegend nicht korrekt gefaltet und weist daher eine stark
verminderte funktionelle Aktivität auf 54, 73. Aus diesem Grund erfolgte die Expression
des vIL-6 in der vorliegenden Arbeit in eukaryotischen Zellen. Nach transienter
Transfektion von HEK293T Zellen mit einem myc- und hexahistidine-gekoppelten vIL-6
Expressionsplasmid (pcDNA3.1vIL-6myc/his(A)) konnte die Sezernierung des viralen
Zytokins in den Zellkulturüberstand mittels Westernblot nachgewiesen werden. Die
anschließende Reinigung erfolgte mit Hilfe einer modifizierten Ni-NTA
Affinitätschromatographie. Eluiert wurde das gereinigte Protein in einen imidazolhaltigen
Puffer. In Abb. 4A ist das Ergebnis der Reinigung dargestellt. Sowohl in der
Silberfärbung als auch der Westernblot Analyse des aufgereinigten Proteins zeigte sich
Ergebnisse
33
eine Doppelbande von 24 bis 28 kDa. Dies ist vermutlich auf unterschiedliche
Glykosilierungsformen des viralen Zytokins zurückzuführen und wurde schon von
anderen Arbeitsgruppen beobachtet 65. Des Weiteren konnte eine zusätzliche
Doppelbande bei ca. 72 kDa nachgewiesen werden, die anhand der Größe einem vIL-6
Dimer entspricht. Wie aus dem in Abb. 4A dargestellten Silbergel (I) ersichtlich ist, war
das gereinigte rekombinante vIL-6 (rvIL-6) weitgehend frei von Kontaminationen. Nach
Dialyse des analysierten Proteins gegen 1 M HEPES-Puffer wurde die Konzentration des
gereinigten rvIL-6 bestimmt.
Abbildung 4: Expression und Charakterisierung des rekombinanten vIL-6 (rvIL-6). (A) Die Expression des myc/his-gekoppelten rvIL-6 erfolgte in HEK293T Zellen mit anschließender Reinigung über eine modizierte Ni-NTA Affinitätschromatographie. Zur Überprüfung der Reinheit des Proteins wurden jeweils 2 µg über ein 12 % SDS-Poylacrylamid-Gel aufgetrennt und einer Silberfärbung (I) oder einer Westernblot Analyse (II) mit einem gegen das myc-Epitop gerichteten Antikörpers unterzogen. (B) Induktion der Proliferation von INA-6 Zellen durch Zugabe von rhIL-6 und rvIL-6. INA-6 Zellen wurden unter Zusatz von ansteigenden Konzentrationen von rhIL-6 (I; Strathmann Biotech) oder rvIL-6 kultiviert. Die Messung der Wachstumsrate erfolgte durch 3H-Thymidine-Markierung der Zellen. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen einem repräsentativen Experiment.
Um die biologische Aktivität des rekombinant hergestelltem vIL-6 zu überprüfen, wurde
die IL-6 abhängige Myelomzelllinie INA-6 unter Zugabe von ansteigenden Mengen an
viralen bzw. humanen IL-6 kultiviert und die Zellvermehrung anhand der 3H-Thymidin-
Markierung ermittelt. Wie in Abb. 4B zu sehen ist, wachsen INA-6 Zellen bei einer hIL-6
Konzentration von weniger als 1 ng/ml (I), wohingegen zwischen 50 und 100 ng/ml des
Ergebnisse
34
gereinigten rvIL-6 (II) nötig waren, um vergleichbare Proliferationsraten zu erzielen.
Diese relativ geringe spezifische Aktivität des vIL-6 stimmt sehr gut mit den Ergebnissen
mehrerer anderer Arbeitsgruppen überein 100, 73, 65.
4.3 Effekte der vIL-6 Inhibierung durch RNA-Interferenz in PEL Zellen
Wie viele andere Post-Keimzentrum B-Lymphozyten benötigen PEL Zellen zum
Überleben und zum Wachstum unter anderem die Signaltransduktionswege, welche durch
die Zytokine der IL-6 Familie aktiviert werden 71. Um die biologische Rolle des durch
HHV-8 kodierten Zytokins für die PEL Zellen zu bestimmen, wurde die Expression des
endogenem vIL-6 mit Hilfe der RNAi gehemmt. Um eine dauerhafte Expression der
shRNAs in den PEL Zellen zu gewährleisten wurden BCBL-1 Zellen mit einem
pseudotypisierten Retrovirus transduziert. Der selbstinaktivierende, retrovirale Vektor
pSIREN-EGFP-RetroQ ist vom Murinen-Leukemie-Virus (MLV) abgeleitet. Nach
Transduktion der Zellen können diese über die retroviral exprimierte Puromyzinresistenz
selektioniert werden. Die Kontrolle der Transduktionseffizienz erfolgte mit Hilfe der
EGFP Expression. Die Ergebnisse einer repräsentativen FACS-Analyse sind in der Abb.
5A dargestellt. Die initiale Transduktionseffizienz der BCBL-1 Zellen lag bei ca. 20 %.
Durch Kultivierung dieser Zellen in puromyzinhaltigen Nährmedium ab dem zweiten Tag
nach der Transduktion für zehn Tage konnte die Anzahl der EGFP-exprimierenden Zellen
auf nahezu 100 % gesteigert werden. Alle folgenden Experimente wurden mit diesen
selektionierten BCBL-1 Zellen durchgeführt.
Wachstumsminderung der BCBL-1 Zellen und Induktion von K8.1. Die Proteinexpression
des vIL-6 in den transduzierten BCBL-1 Zellen wurde mittels Westernblot nachgewiesen.
Ein Teil der Zellen wurde zuvor für 48 h mit TPA und NaB behandelt um den lytischen
Replikationszyklus von HHV-8 zu induzieren. Wie in Abb. 5B zu sehen ist, war die
Detektion der vIL-6 Expression im Westernblot nur nach vorangegangener, chemischer
Induktion des lytischen Zyklus möglich. Im Vergleich dazu konnte die Expression des
viralen Zytokines in den nichtinduzierten BCBL-1 Zellen mittels Westernblot nicht
nachgewiesen werden. Dies war jedoch mit der sensitiveren realtime-PCR auf der Ebene
der Transkription möglich (Abb. 12). Auch mit der Immunfluoreszenz konnte die
Expression des vIL-6 in Kulturen nichtinduzierter PEL Zellen nachgewiesen werden
(Abb. 3). BCBL-1 Zellen, welche mit der vIL-6 spezifischen shRNA (shvIL-6)
transduziert wurden, zeigten eine effiziente Reduzierung der vIL-6 Expression im
Ergebnisse
35
Vergleich zu den mit einer unspezifischen shRNA (shN) transduzierten bzw.
unbehandelten Zellen.
Abbildung 5: Inhibierung der vIL-6 Expression induziert K8.1 und reduziert das Wachstum von BCBL-1 Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit dem shRNA exprimierenden, retroviralen Vektor pSIREN-EGFP-RetroQ transduziert und ab Tag 2 nach Infektion mit Puromyzin selektioniert. (A) Repräsentative Analyse der EGFP Expression durch FACS-Analyse. 48 h nach Transduktion der BCBL-1 Zellen waren ca. 20 % EGFP positiv. Dieser Prozentsatz steigerte sich unter Puromyzinselektion schnell bis zehn Tage nach Infektion fast alle BCBL-1 Zellen EGFP positiv waren. Diese einheitlich transduzierten BCBL-1 Zellen wurden in den weiteren Experimenten verwendet. (B) Westernblot Analyse der BCBL-1 Zellysate, die zuvor mit den shRNA exprimierenden Vektor transduziert wurden. Da die geringe konstitutive Expression des vIL-6 in den BCBL-1 Zellen mittels Westernblot nicht nachgewiesen werden konnte, wurden die Zellen zuvor mit TPA und Natriumbutyrat für 48 h induziert. Akata Zellen und nichtinduzierte BCBL-1 Zellen dienten als Negativkontrollen. Oberer Blot: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Mittlerer Blot: Monoklonale Anti-K8.1 Antikörper (BS555) zum Nachweis der lytischen Replikation nach chemischer Induktion der BCBL-1 Zellen mit TPA und Natriumbutyrat. Unterer Blot: Anti-β-Aktin Antikörper um eine gleichmäßige Proteinbeladung nachzuweisen. Ein repräsentativer Blot aus 5 unabhängigen Versuchen wurde dargestellt. (C) Messung der Wachstumsrate der transduzierten BCBL-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen wurden für 24 h mit jeweils 10 µg/ml rvIL-6, 100 ng/ml rhIL-6 oder einer entsprechenden Menge an 1 M HEPES-Puffer behandelt. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten und Standardfehler von 6 unabhängigen Experimenten (* T-Test mit verbundenen Stichproben).
Ergebnisse
36
Überraschenderweise führte der knock-down von vIL-6 zu einer verstärkten Induktion des
späten, lytischen Glykoproteins K8.1, wohingegen das Expressionsniveau des zellulären
Aktins unverändert blieb. Wie in Abb. 5C dargestellt, ist die starke Reduktion der vIL-6
Expression in den mit shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen mit einer leichten, aber
signifikanten Wachstumsverminderung dieser Zellen verbunden. Im Vergleich dazu
wachsen sowohl die mit shN transduzierten als auch die nichttransduzierten BCBL-1
Zellen unvermindert weiter. Die exogene Zuführung von rvIL-6 oder rhIL-6 zu den vIL-6
reprimierten Zellen konnte die Wachstumsminderung vollständig aufheben (Abb. 5C).
Diese Rekonstitution zeigt, dass die Wachstumsreduktion in shvIL-6 exprimierenden
Zellen tatsächlich auf die Reduktion der vIL-6 Expression und nicht auf unspezifische
oder sogenannten off-target Effekte zurückzuführen ist.
Phosphorylierung der STAT1/3 Transkriptionsfaktoren. vIL-6 vermittelt, ähnlich wie das
zelluläre Gegenstück hIL-6, die Signaltransduktion über die gp130 Untereinheit des
Interleukin-6 Rezeptors 100. Dies führt unter anderem zur Aktivierung der
Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 69. Es ist bekannt, dass die Phosphorylierung
von STAT3 eine wichtige Rolle für das Überleben von PEL Zellen spielt 101. Um den
Effekt der vIL-6 Suppression auf die Phosphorylierung dieser Transkriptionsfaktoren zu
untersuchen, wurde das gesamtzelluläre Protein der transduzierten BCBL-1 mittels
Westernblot analysiert (Abb. 6A).
Abbildung 6: Reduktion von vIL-6 in BCBL-1 Zellen induziert Phosphorylierung von STAT1 (A) Westernblot Analyse retroviral transduzierter BCBL-1 Zellen zum Nachweis der Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 (P-STAT1Tyr705) und STAT3 (P-STAT3Tyr701). Als Kontrollen wurden jeweils die Proteine STAT1 bzw. STAT3 detektiert. Zur Demonstration einer gleichmäßigen Proteinbeladung erfolgte der Nachweis des zellulären β–Aktin. Gezeigt ist ein repräsentativer Blot aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Messung der IFN-α Konzentration im Zellkulturüberstand der transduzierten BCBL-1 Zellen 24 h nach Mediumwechsel mittels ELISA. Dargestellt ist ein Kontrollexperiment.
Ergebnisse
37
Die mit shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen zeigten im Vergleich zu shN
transduzierten oder unbehandelten Zellen einen Anstieg der STAT1-Phosphorylierung bei
unveränderter STAT1 Expression. Im Gegensatz dazu blieb die Phosphorylierung des
Transkriptionsfaktors STAT3 weitgehend unverändert. Um auszuschließen, dass die
verstärkte Aktivierung des STAT1 Transkriptionsfaktors durch eine unspezifische
Induktion des Interferonsystems hervorgerufen wurde, erfolgte die Messung der IFN-α
Konzentration im Überstand der retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen. Die vIL-6
knock-down Zellen wiesen aber im Vergleich zu den Kontrollzellen keine erhöhte
Sekretion von IFN-α auf (Abb. 6B).
Induktion der hIL-6 Expression. Sowohl in vitro als auch in vivo konnte für PEL Zellen
gezeigt werden, dass hIL-6 und vIL-6 in das umgebende Zellkulturmedium bzw. Gewebe
sezerniert wird 71, 102. Wie in Abb. 5C dargestellt, hatte die Verminderung der vIL-6
Expression nur eine geringe Wachstumsminderung zur Folge. Eine mögliche Erklärung
zeigt die Messung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand der transduzierten
Zellen mittels ELISA in Abb. 7A.
Abbildung 7: Knock-down des vIL-6 in BCBL-1 Zellen induziert hIL-6. Zeitabhängige Akkumulierung des hIL-6 (A) und hIL-1β (B) in den Zellkulturüberständen von retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen. Das Zellkulturmedium wurde zum Zeitpunkt 0 vollständig ausgetauscht und nach 3, 6, 12 und 24 h geerntet. Die Messung der Zytokinspiegel erfolgte mit Hilfe eines ELISA. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten und SE aus 4 unabhängigen Experimenten (A) bzw. einem Kontrollexperiment (B).
In den BCBL-1 Zellen, welche die shRNA gegen das virale Zytokin exprimieren (shvIL-
6) und somit in ihrer vIL-6 Expression gehemmt waren, kam es zu einem 2,5-fachen
Anstieg der Produktion von hIL-6 im Vergleich zu unbehandelten (Mock) oder mit der
Kontroll-shRNA (shN) transduzierten BCBL-1 Zellen (Abb. 7A). Die externe Zugabe des
gereinigten rvIL-6 konnte die verstärkte hIL-6 Sekretion auf das Ausgangsniveau
zurückführen (shvIL-6 + rvIL-6). Des Weiteren konnte eine Kreuzreaktion, des für hIL-6-
spezifischen ELISA mit dem viruskodierten Zytokin ausgeschlossen werden, da die
Ergebnisse
38
Zugabe von rvIL-6 nicht zu einem weiteren Anstieg der hIL-6 Konzentration im
Zellkulturüberstand führte (Abb. 7A, shvIL-6 + rvIL-6). Das Auftreten einer
Kreuzreaktion wurde aufgrund der geringen Sequenzidentität beider Zytokine, welche auf
Aminosäureebene nur 24,8 % beträgt 104, auch nicht erwartet. Die Expression eines
anderen, entzündungsspezifischen Zytokins, wie die des humanen Interleukin-1β (hIL-
1β), war durch keine der verwendeten shRNAs beeinflusst (Abb. 7B).
Abbildung 8: Effekte des vIL-6 knock-downs in JSC-1 Zellen JSC-1 Zellen wurden mit dem shRNA exprimierenden retroviralen Vektor pSIREN-EGFP-RetroQ transduziert und ab Tag 2 nach Infektion mit Puromyzin selektioniert. (A) Westernblot Analyse der JSC-1 Zellysate 48 h nach Transduktion. Zum Nachweis der vIL-6 Expression wurden die Zellen für 48 h mit TPA und NaB stimuliert. Oberer Blot: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Unterer Blot: Anti-β-Aktin Antikörper um eine gleichmäßige Proteinbeladung nachzuweisen. Dargestellt wurde ein repräsentativer Blot aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Messung der Wachstumsrate der transduzierten JSC-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert und Standardfehler von drei unabhängigen Versuchen. (C) Nachweis der zeitabhängigen hIL-6 Produktion im Zellkulturüberstand der transduzierten Zellen mittels ELISA. Dargestellt wurden die Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen Experimenten
Die Stimulierung der hIL-6 Expression nach vIL-6 Suppression in PEL Zellen sowie die
leichte Reduktion der Wachstumsrate konnte auch in der sowohl HHV-8 als auch EBV
positiven PEL-Zelllinie JSC-1 nachgewiesen werden (Abb. 8).
Gleichzeitige Inhibierung der vIL-6 und hIL-6 Expression mittels RNAi. Um zu
überprüfen, ob die kompensatorische Produktion des hIL-6 die Ursache für die geringe
Wachstumshemmung in den vIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen ist, wurde im folgenden
Experiment die Expression der beiden Zytokine einzeln und in Kombinantion mittels
Ergebnisse
39
RNAi gehemmt. In Vorversuchen zeigte sich, daß die simultane Inhibition beider
Zytokine ab besten nach Transfektion zweier synthetischer siRNAs in geringen
Konzentrationen erreicht werden konnte. Durch Verwendung fluoreszenzmarkierter
siRNA Oligonukleotide und Bestimmung der Fluoreszenz der PEL Zellen mittels FACS-
Analyse konnte eine Transfektions-Effizienz von mehr als 90 % nachgewiesen werden
(Daten nicht gezeigt).
Abbildung 9: Gleichzeitige Inhibierung von vIL-6 und hIL-6 in BCBL-1 Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit synthetischen siRNAs gegen vIL-6 (si597), hIL-6 (si863) oder beiden siRNAs gleichzeitig (si597 / si863) transfiziert und für 48 h kultiviert. Als Kontrollen wurden unbehandelte und mit einer Kontroll-siRNA transfizierte (siN) BCBL-1 Zellen mitgeführt. Ein Teil der vIL-6 und hIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen wurden gleichzeitig für 48 h mit 10 µg/ml rvIL-6 (si597 / si863 + rvIL-6) bzw. der entsprechenden Menge an 1 M HEPES (si597 / si863) behandelt. (A) Westernblot Analyse der BCBL-1 Zellysate 48 h nach Transfektion. Zum Nachweis der vIL-6 Expression wurden die Zellen für 48 h mit TPA und NaB stimuliert. Nichtinduzierte BCBL-1 und HHV-8 negative Akata Zellen dienten als Negativkontrolle. Obere Hälfte: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Untere Hälfte: Anti-β-Aktin Antikörper zur Überprüfung der Proteinbeladung. Die Abbildung zeigt einen repräsentativer Immunblot von insgesamt 3 unabhängigen Experimenten. (B) Nachweis der hIL-6 Produktion im Zellkulturüberstand der transfizierten Zellen mittels ELISA. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus 3 unabhängigen Experimenten. (C) Messung der Wachstumsrate der transfizierten BCBL-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die angegebenen Werte entsprechen den Mittelwert und Standardfehler von 3 unabhängigen Versuchen.
BCBL-1 Zellen wurden mit den synthetischen siRNAs gegen vIL-6 (si597), hIL-6 (si863)
oder beiden siRNAs (si597 / si863) transient transfiziert. Als Kontrollen wurden
unbehandelte und mit einer Nonsense-siRNA (siN) transfizierte BCBL-1 mitgeführt.
Zeitgleich wurde den mit beiden siRNAs transfizierten BCBL-1 Zellen jeweils 10 µg/ml
Ergebnisse
40
rvIL-6 (si597 / si863 + rvIL-6) oder die entsprechende Menge an 1 M HEPES (si597 /
si863) zum Zellkulturmedium zugesetzt. Nach zweitägiger Kultivierung der Zellen
erfolgte die Messung der Wachstumsrate sowie die Bestimmung der hIL-6 Konzentration
im Zellkulturüberstand. Um die Expression des vIL-6 im Westernblot nachweisen zu
können, wurde ein Teil der transfizierten Zellen für 48 h mit TPA und NaB induziert. Wie
im Westernblot (Abb. 9A) zu sehen, führte die Transfektion der synthetischen si597 allein
oder in Kombination mit si863 zu einer starken Reduktion der vIL-6 Expression. Die
Zugabe des rvIL-6 hatte keinen Einfluss auf die Reduktion der vIL-6 Transkripte durch
RNAi. Nach Transfektion der synthetischen siRNA gegen hIL-6 (si863) oder siN konnte
wie in den unbehandelten BCBL-1 Zellen keine Hemmung der vIL-6 Expression
nachgewiesen werden. Die Expression des als interne Kontrolle verwendeten β-Aktin
blieb in allen Ansätzen im Wesentlichen unverändert.
Der Nachweis der Inhibierung des zellulären Zytokins erfolgte anhand der Messung der
hIL-6 Konzentration im Überstand der Zellen mittels ELISA (Abb. 9B). Die Transfektion
von si597 führte, ähnlich der retroviral exprimierten shRNA, zu einem Anstieg der hIL-6
Produktion. Im Vergleich dazu hatte die Transfektion der gegen hIL-6 gerichteten si863
einzeln und in Kombination mit si597 eine Verminderung der hIL-6 Sekretion zur Folge.
Dies konnte auch durch Zugabe des rvIL-6 nicht rekonstituiert werden (Abb. 9B). Der
knock-down von vIL-6 bzw. hIL-6 alleine resultierte jeweils in einer mäßigen
Wachstumsminderung im Vergleich zu unbehandelten oder mit siN- transfizierten Zellen
(Abb. 9C). Dagegen hatte die gleichzeitige Suppression beider Interleukine eine starke
Wachstumsstörung der Zellen zur Folge, die durch Zugabe des rvIL-6 wieder aufgehoben
werden konnte.
4.4 Induktion der hIL-6 Expression durch RTA
Wie bereits veröffentlicht kann sowohl das Latenz-assozierte nukleäre Antigen-1 (LANA-
1) 105 als auch der replication and transcription activator (RTA), der Hauptregulator der
lytischen HHV-8 Replikation 94, den hIL-6 Promotor transaktivieren. Basierend auf der
Veröffentlichungen von Deng et al. 94 erfolgte die Herstellung eines Reporterkonstruktes,
welches das firefly-Luziferasegen unter der Kontrolle des hIL-6 Promotors enthält (phIL-
6pLuc). Dieses Reporterkonstrukt wurde zusammen mit einem Expressionsplasmid für
LANA-1 bzw. RTA in HEK293T Zellen transfiziert und im Anschluß einem Luziferase-
Aktivitätstest unterzogen.
Ergebnisse
41
Abbildung 10: RTA induziert die Expression von hIL-6 (A) Aktivierung des hIL-6 Promotors durch die viralen Gene LANA-1 und RTA. HEK293T Zellen wurden mit 0,2 des phIL-6pLuc Reporterkonstruktes und je 1 µg der Expressionsplasmiden für LANA-1- oder RTA kotransfiziert und einem Luziferase-Aktivitätstest unterzogen. Die gezeigten Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten mit SE aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Quantitative realtime-PCR Analyse zum Nachweis der RTA (I) und LANA-1 (II) Expression in mit retroviralen Vektoren transduzierten (shN: nonsense shRNA; shvIL-6: shRNA gegen vIL-6) oder unbehandelten (Mock) BCBL-1 Zellen. Angegeben ist die relative Kopienzahl (shN = 100 %), welche durch Abgleich der RTA und LANA-1 Transkripte auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Die Werte entsprechen den Mittelwerten mit SE aus 3 unabhängigen Experimenten.
Wie in Abb. 10A dargestellt führt die Expression von LANA-1 zu einer 12-fachen
Induktion des hIL-6 Promotors, während die Expression von RTA in einer 150-fachen
Aktivierung resultiert. Aufgrund dieser starken Wirkung auf den hIL-6 Promotor sowie
der Beobachtung, dass die Inhibition von vIL-6 mit einer verstärkten Induktion des
späten, lytischen Glykoproteins K8.1 verbunden war (5B), wurde vermutet, dass die RTA
Expression als Reaktion auf die Verminderung der vIL-6 Expression ansteigt.
Aus diesem Grund erfolgte mit Hilfe der realtime-PCR eine Bestimmung der RTA- und
LANA-1 Expressionslevel in den transduzierten BCBL-1 Zellen (Abb. 10B). Während
die RTA mRNA Transkripte in den Zellen, welche unbehandelt waren oder die Kontroll-
shRNA exprimierten, weitgehend unverändert waren, stieg die Expression des RTA nach
der Inhibierung des vIL-6 an (Abb. 10B I). Im Vergleich hierzu blieben die LANA-1
Expressionslevel in allen Zellen gleich (Abb. 10B II).
Ergebnisse
42
4.5 Aktivierung der Genexpression durch RTA in PEL Zellen
Die Ergebnisse unter Abs. 4.4 führten zu der Hypothese, dass die erhöhte RTA
Expression in den vIL-6 supprimierten Zellen für die Induktion des hIL-6 verantwortlich
ist. Um nachzuweisen, dass RTA zu der verstärkten Expression des hIL-6 sowie der
lytischen viralen Gene vIL-6 und K8.1 führt, wurde RTA in PEL Zellen überexprimiert.
Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurde ein Ansatz mit einem EGFP
Expressionsplasmid mitgeführt. Die Rate der EGFP-exprimierenen Zellen wurde nach 48
h mit Hilfe des FACS bestimmt. Durch Verwendung der „Nukleofektion“ konnte auch bei
PEL Zellen eine Transfektionsrate von ca. 80 % erreicht werden (Daten nicht gezeigt).
Ebenfalls 48 h nach der Transfektion wurden mit der quantitativen realtime-PCR die
Transkripte von RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 gemessen (Abb. 11A). Die Überexpression
von RTA in BCBL-1 Zellen resultierte in einer verstärkten Expression des hIL-6 im
Vergleich zur Vektorkontrolle. Gleichzeitig wurden auch die beiden viralen, lytischen
HHV-8 Gene vIL-6 und K8.1 hochreguliert. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass der
Regulator der lytischen HHV-8 Replikation, RTA, auch in PEL Zellen zu einer Induktion
der hIL-6 Expression führt. Eine ähnliche hIL-6 Stimulierung konnte ebenfalls nach der
Behandlung verschiedener PEL Zelllinien mit TPA und NaB für 48 h nachgewiesen
werden. Nach Messung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand mit Hilfe eines
ELISA wurde im Vergleich zu unstimulierten Zellen eine erhöhte Sekretion des zellulären
Zytokins nachgewiesen (Abb. 11B).
Abbildung 11: RTA aktiviert hIL-6 und die lytischen HHV-8Gene vIL-6 und K8.1 (A) BCBL-1 Zellen wurden jeweils mit 10 µg des RTA Expressionsplasmids pAB45(ORF50)myc/his (A) bzw. dem Leervektor pcDNA3.1myc/his (A) elektroporiert. Nach 48 h Inkubation der Zellen erfolgte die Isolation der gesamtzellulären RNA und die Bestimmung der mRNA-Transkriptlevel für RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 mit Hilfe der quantitativven realtime-PCR. Angegeben wurden relative mRNA-Transkriptlevel der verschiedenen Gene bezogen auf nur mit dem Leervektor (pcDNA3.1myc/his(A) = 1) transfizierte Zellen. Bei der Berechnung erfolgte zunächst ein Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten mit Standardfehler aus 2 unabhängigen Experimenten. (B) Die HHV-8 positiven Zelllinien BCBL-1, BC-3 und JSC-1 sowie die HHV-8 negativen BJAB Zellen wurden für 48 h mit frischem Medium kultiviert bzw. mit TPA und NaB-haltigen Medium induziert. Die Bestimmung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand erfolgte mittels ELISA. Die gezeigten Werte entsprechen einem Versuch.
Ergebnisse
43
4.6 Rekonstitution der RNAi-bedingten Effekte in PEL Zellen
Obwohl RNAi eine effektive Methode zum Ausschalten bzw. Herunterregulieren
gewünschter Zielgene ist, besteht potentiell die Gefahr gleichzeitig unspezifische
Nebeneffekte zu induzieren. Um die Spezifität der beobachteten Effekte zu überprüfen, ist
ein wichtiges Kontrollexperiment die Rekonstitution des RNAi-bedingten Phänotypes 99.
Die Spezifität der beobachteten Effekte in der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe des
rekombinant hergestellten, gereinigten rvIL-6 überprüft. Wie bereits in Abs. 4.3 erläutert,
konnte sowohl die Reduktion des Wachstums (Abb. 5C) als auch die Induktion der hIL-6
Produktion (Abb. 7A) nach Inhibierung des endogenem vIL-6 durch die externe Zugabe
des rvIL-6 aufgehoben werden. Im folgenden Experiment sollten die Spezifität der
shRNA- bedingten Effekte auf die virale und zelluläre Genexpression in BCBL-1 Zellen
durch die Behandlung mit gereinigteem rvIL-6 bzw. rhIL-6 untersucht werden. Hierzu
wurde ein Teil der transduzierten BCBL-1 Zellen für 48 h mit TPA und NaB inkubiert,
während der andere Teil der Zellen unstimuliert blieb. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte
die Zugabe von 20 µg/ml des rvIL-6, 100 ng/ml des rhIL-6 bzw. die entsprechende
Menge Puffer. Anschließend wurde die gesamte zelluläre RNA isoliert, mit Hilfe der
Reversen Transkriptase in die komplementäre cDNA Sequenz umgeschrieben und mittels
realtime-PCR quantifiziert (Abb. 12). Die Expression der gegen vIL-6 gerichteten shRNA
(shvIL-6) führte im Vergleich zu unbehandelten (Mock) und mit einer shN transduzierten
BCBL-1 Zellen zu einer wesentlichen Reduktion der vIL-6 Expression (Abb. 12, Reihe
1). Dies konnte sowohl in nichtinduzierten als auch in TPA und NaB induzierten Zellen
nachgewiesen werden. Die Behandlung der vIL-6 supprimierten Zellen mit rvIL-6 oder
rhIL-6 hatte keinen Einfluss auf das Niveau der vIL-6 Transkription. Der knock-down von
vIL-6 führte zu einer erhöhten Expression von RTA, K8.1 und hIL-6 (Abb. 12) sowohl in
latent infizierten (Abb. 12, linke Spalte) als auch und lytisch induzierten BCBL-1 Zellen
(Abb. 12, rechte Spalte). Diese Aktivierung der viralen und zellulären Genexpression
durch den vIL-6 knock-down konnte durch den Zusatz von rvIL-6 zum Zellkulturmedium
der shvIL-6 transduzierten Zellen (shvIL-6 + rvIL-6) wieder auf die ursprünglichen Werte
zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung dieser Zellen mit rhIL-6
(shvIL-6 + rhIL-6) eher einen verstärkenden Effekt auf die Expression von RTA, K8.1
und hIL-6. Diese Ergebnisse bestätigten auf der einen Seite die Funktionalität des
rekombinant produzierten vIL-6, auf der anderen Seite demonstriert die Rekonstitution
Ergebnisse
44
der shRNA-bedingten Effekte durch die Behandlung mit rvIL-6 die Spezifität des
beobachteten Phänotypes.
Abbildung 12: Wiederherstellung der RTA, K8.1 und hIL-6 Expressionslevel nach Inhibierung des vIL-6 durch Zugabe von rvIL-6. Die retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen verblieben unbehandelt (linke Spalte) oder wurden für 48 h mit TPA und NaB stimuliert (rechte Spalte). Die vIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen wurden zusätzlich mit 20 µg/ml rvIL-6 (shvIL-6 + rvIL-6), 100 ng/ml rhIL-6 (shvIL-6 + rhIL-6) oder der entsprechenden Menge 1 M HEPES (shvIL-6) für 24 h inkubiert. Anschließend erfolgte die Isolierung der gesamtzellulären RNA, die reverse Transkription in cDNA und die Bestimmung der vIL-6, RTA, K8.1 und hIL-6 Expression mit Hilfe der realtime-PCR. Angegeben wurden relative mRNA-Transkriptlevel der einzelnen Gene (shN = 1), welche durch Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus 3 unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
45
4.7 Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 in PEL Zellen
Die Ergebnisse von Abs. 4.6 deuteten darauf hin, dass die Expression des viralen
Zytokins in PEL Zellen über eine negative Rückkopplung reguliert wird. Im Vergleich
dazu konnte für das zelluläre Homolog in Übereinstimmung mit anderen Arbeitsgruppen
eine postive Rückkopplung nachgewiesen werden 50. Um die unterschiedlichen Effekte
beider Zytokine näher zu untersuchen, wurde zunächst den Zellkulturmedien HHV-8
positiver und negativer B-Zelllinien entweder das rekombinante vIL-6 oder hIL-6
zugesetzt und die Zellen für 24 h kultiviert. Anschließend erfolgte eine Bestimmung der
hIL-6 Expressionslevel mittels realtime-PCR und ein Westernblot zum Nachweis der
Phosphorylierung von STAT1 und STAT3 (Abb. 13).
Abbildung 13: Effekt von rvIL-6 und rhIL-6 in verschiedenen B-Zelllinien Den angegebenen HHV-8 positiven B-Zellen BC-3 und BCBL-1 und die HHV-8 negativen BJAB, INA-6, U937 und LCL Zellen wurde jeweils 10 µg/ml rvIL-6 oder 100 ng/ml rhIL-6 zum Zellkulturmedium zugesetzt. Als Negativkontrolle wurden die jeweiligen Zellen mit der entsprechenden Menge an Puffer (1 M HEPES) behandelt (Mock). (A) Bestimmung der hIL-6 mRNA-Transkripte mittels realtime-PCR. Nach Kultivierung der Zellen für 24 h erfolgte die Isolierung der gesamtzellulären RNA und Transkription in cDNA. Die angegebenen Werte zeigen die relative hIL-6 Expression (Mock = 1) in der jeweiligen Zelllinie, welche durch Abgleich der hIL-6 Transkriptmengen auf die des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt ist ein Experiment. (B) Westernblot von BC-3 Zelllysaten zum Nachweis der Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 (P-STAT1Tyr705) und STAT3 (P-STAT3Tyr701). Als Kontrollen wurden die endogenen Expressionlevel von STAT1 und STAT3 detektiert. Zur Demonstration einer gleichmäßigen Proteinbeladung erfolgte der Nachweis des zellulären β–Aktins.
Wie in Abb. 13A dargestellt, führte die Zugabe des viralen Zytokins – aber nicht des
humanen Homologs - in den beiden getesteten, HHV-8 positiven PEL Zelllinien BCBL-1
und BC-3 zu einer verminderten Expression von hIL-6. Darüber hinaus konnte nach
Zugabe des rvIL-6 zum Zellkulturmedium der BC-3 Zellen im Westernblot eine leichte
Verminderung der Phosphorylierung STAT1 und STAT3 nachgewiesen werden, während
die rhIL-6 Behandlung besonders bei STAT3 zu einen Anstieg der Phosphorylierung
führte (Abb. 13B). Für die HHV-8 negative humane Leukemiezelllinie U937 konnte eine
Ergebnisse
46
verstärkte hIL-6 Expression nach Behandlung mit rvIL-6 und hIL-6 nachgewiesen
werden, wie bereits von Mori et al. beschrieben 103. Der Zusatz von rvIL-6 und rhIL-6
hatte bei allen anderen getesteten B-Zellen keinen Einfluss auf die hIL-6 Produktion
(Abb. 13A).
Abbildung 14: Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 auf die virale und zelluläre Genexpression in PEL Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen von rhIL-6 (A), rvIL-6 (B) oder rFC (C) behandelt und für 24 h inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit der entsprechenden Menge an Puffer (1 M HEPES) behandelt (Mock). Nach Isolation der gesamtzellulären RNA und Umschreibung in cDNA erfolgte eine quantitative realtime-PCR zur Bestimmung der RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 mRNA Expression. Angegeben wurden die relativen mRNA-Level der einzelnen Gene (Mock = 1), welche durch Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler aus 4 unabhängigen Experimenten (A, B ausgenommen qRT-PCR für K8.1) bzw. einem Versuch (C).
Des Weiteren wurden die Auswirkung ansteigender Konzentrationen beider Zytokine in
der PEL-abgeleiteten Zelllinie BCBL-1 untersucht. Nach einer 24-stündigen Inkubation
der Zellen erfolgte die Messung der endogenem Expression von RTA, vIL-6, hIL-6 und
K8.1 mittels realtime-PCR. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 14 dargestellt.
Die exteren Zugabe des rhIL-6 führte zu einer dosisabhängigen Induktion der Expression
Ergebnisse
47
aller vier Gene (Abb. 14A). Im Gegensatz dazu führte die ansteigende Konzentration des
rvIL-6 zu einer Reduktion der RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 Expression (Abb. 14B). Die
Zugabe des rekombinanten Fc-Kontrollproteins (rFc) hatte auch in höheren Mengen
keinen Einfluß auf die Transkriptionslevel der vier untersuchten Gene (Abb. 14C). Wie
bereits in Abs. 4.2 erläutert, resultierte die bis zu 100-fach höhere Konzentration an
eingesetzten rvIL-6 aus der geringeren, spezifischen Aktivität des viralen Zytokins im
Vergleich zu rhIL-6 73, 100, 54
Diskussion
48
5 Diskussion Das vIL-6 steht seit seiner Entdeckung unter dem Verdacht, zur Pathogenese aller HHV-8
assoziierten Erkrankungen beizutragen. 42. Bereits vor der Entdeckung des HHV-8
erschienene Publikationen wiesen auf eine mögliche Beteiligung des pro-
inflammatorischen hIL-6 an der Pathogenese von KS und MCD hin. Obwohl das
viruskodierte Zytokin nur eine geringe Sequenzähnlichkeit zum zellulären Pendant
aufwies, zeigte es vergleichbare biologische Aktivitäten 54, 64, 55. Da die beiden
verwandten Zytokine sowohl in HHV-8 assoziierten Erkrankungen als auch von in
Zellkultur gehaltenen PEL Zellen auf hohen Niveau exprimiert werden, ist die Bedeutung
der zusätzliche Expression eines viruskodierten IL-6 unklar. Bemerkenswert sind die
unterschiedlichen Rezeptorbindungseigenschaften. Während das vIL-6 auch ohne die
lösliche gp80 Untereinheit an die signalvermittelnde gp130 Untereinheit des IL-6R bindet 63, 64, kann das hIL-6 nur im Komplex mit gp80 die Signaltransduktion aktivieren 62. Im
Gegensatz zu gp80, dessen Expression auf wenige Zelltypen beschränkt ist, wird die
gp130 Kette des IL-6R auf nahezu allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert. Des
Weiteren wird die Expression der gp80 Untereinheit durch Typ I Interferone (IFN-α, -β)
herunterreguliert. Aufgrund dessen kann vIL-6 im Vergleich zu hIL-6 auf ein breiteres
Spektrum an Zelltypen wirken und bedingt zumindest teilweise eine Resistenz der HHV-8
infizierten Zellen gegenüber der IFN-induzierten Apoptose 75.
Da bisher kein geeignetes Zellkultursystem oder Tiermodell zur Untersuchung der de
novo Transformation durch HHV-8 zur Verfügung steht, wurden die meisten in vitro
Studien in den von PEL-abgeleiteten Zelllinien durchgeführt. Diese latent mit HHV-8
infizierten B-Zellen exprimieren sowohl beide Untereinheiten des IL-6R als auch das
virale und zelluläre IL-6. Des Weiteren kann in den kultivierten PEL Zellen keine
detektierbaren Mengen an Typ I Interferonen nachgewiesen werden. Trotzdem belegen
eine Reihe von Publikationen, dass vIL-6 für das uneingeschränkte Wachstum der PEL
Zellen von Bedeutung ist 70, 72, 73.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher die Funktion des vIL-6 in den PEL
Zellen näher charakterisiert und von der Wirkung des zellulären IL-6 abgegrenzt werden.
Hierzu wurde die Expression sowohl des viralen als auch des zellulären Zytokins mit
Hilfe der RNAi supprimiert und die daraus resultierenden Effekte in Bezug auf
Proliferation, Signaltransduktion sowie Genexpression untersucht. Um zunächst die
Diskussion
49
endogene Expression und zelluläre Lokalisation des vIL-6 in den vorwiegend
verwendeten BCBL-1 Zellen nachzuweisen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung
durchgeführt. Die Expression des viralen Zytokins war sowohl in latenten als auch zur
lytischen Replikation stimulierten BCBL-1 Zellen nachweisbar. Nach Induktion konnte
jedoch eine deutlich erhöhte Anzahl vIL-6 positiven Zellen beobachtet werden. Dies
korreliert zumindest teilweise mit der bestehenden Einstufung des vIL-6 als frühes,
lytischen HHV-8 Gen 55, 60. Die Kofärbung mit dem viralen Glykoprotein K8.1, einem
späten lytischen HHV-8 Gen, zeigte zudem, dass es sich bei den vIL-6 postiven BCBL-1
Zellen ohne vorherige chemische Stimulation um jene wenigen PEL Zellen handelt, die
spontan den lytischen Replikationszyklus durchlaufen. Eine Gegenfärbung mit dem latent
exprimierten HHV-8 Gen LANA-1 bestätigte diese Beobachtung. Die typische
punktartige, nukleäre Expression von LANA-1 in den latenten BCBL-1 Zellen 106 war in
den lytisch induzierten Zellen nicht mehr nachweisbar.
Die Hemmung der endogenen vIL-6 Expression erfolgte zunächst mit Hilfe der
Transduktion eines pseudotypisierten Retrovirus, welches eine shRNA-
Expresssionskassette in das Genom der Zelle einschleust. Dies ermöglichte die stabile
Expression der shRNA. Der verwendete Vektor enthielt zudem sowohl ein Puromyzin-
Resistenzgen, um die Zellen nach der Infektion zu selektionieren, als auch einen
Fluoreszenzmarker, um die Tranduktionseffizienz abschätzen zu können. Daneben kam
die transiente Transfektion synthetischer siRNAs zum Einsatz. Mit Hilfe beider Methoden
konnte eine Suppression des viralen Zytokins von bis zu 90 % in verschiedenen PEL-
abgeleiteten Zelllinien (BCBL-1, JSC-1) erreicht werden. Interessanterweise korrelierte
der effiziente knock-down des vIL-6 nicht mit einer starken Wachstumsminderung der
Zellen, sondern war mit einer erhöhten Expression des zellulären Homologs hIL-6
verbunden. Zudem zeigte sich, dass die shRNA-bedingte Inhibierung des vIL-6 keinen
Einfluß auf die Aktivierung von STAT3 hatte, aber im Vergleich zu den Kontrollen in
einer erhöhten Phosphorylierung von STAT1 resultierte. Beide Transkriptionsfaktoren
können sowohl durch Bindung des vIL-6 als auch des hIL-6 an den IL-6R über die
signalvermittelte gp130 Untereinheit aktiviert werden, wobei die konstitutive
Phosphorylierung von STAT3 eine wichtige Rolle für das Überleben der PEL Zellen
spielt 101. STAT1 stellt gleichzeitig einen bedeutenden Transkriptionsfaktor dar, der an
der zellulären Interferonantwort vom Typ I und II beteiligt ist 107. Die verstärkte
Aktivierung von STAT1 konnte nach Ausschluß einer unspezifischen Aktivierung des
Diskussion
50
Interferonsystems durch Bestimmung der IFN-α Werte im Zellkulturüberstand auf die
erhöhte hIL-6 Produktion in den vIL-6 knock-down Zellen zurückgeführt werden. Einen
vergleichbaren Effekt der Suppression des vIL-6 mit Hilfe von RNAi bezogen auf das
Wachstum der PEL Zellen konnte auch in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung
der Gruppe von J. Nicholas nachgewiesen werden 108.
Diese Beobachtungen erschienen zunächst widersprüchlich im Hinblick auf bereits
publizierte Daten von K. Jones 72 und A. Kovaleva 73. Beide Gruppen verwendeten
Antikörper um die Aktivität des viralen Zytokins in kultivierten PEL Zellen zu
neutralisieren, was in beiden Arbeiten einem weitaus stärkeren hemmenden Effekt auf das
Wachstum der Zellen hatte. Diese offensichtliche Diskrepanz der Ergebnisse kann auf die
unterschiedliche Kinetik der Neutralisation des vIL-6 mit Hilfe von Antikörpern im
Vergleich zum knock-down der vIL-6 Expression durch die Verwendung von siRNAs
bzw. shRNAs zurückgeführt werden. Während ein neutralisierender Antikörper in einer
sofortigen, vollständigen Blockierung des vorhandenen vIL-6 resultiert, inhibiert die
siRNA-vermittelte Gensuppression nur die de novo Biosynthese des viralen Zytokins.
Aufgrund dessen verbleibt den Zellen genügend Zeit, um mit einer verstärkten hIL-6
Produktion auf die verringerten vIL-6 Proteinlevel zu reagieren und der
Wachstumsminderung entgegenzuwirken. Erst die gleichzeitige Suppression des viralen
und zellulären Zytokin durch Transfektion synthetischer siRNAs resultierte in einer
starken Wachstumsstörung der Zellen. Diese Beobachtung zeigte klar, dass beide
Zytokine für das Wachstum der HHV-8 infizierten Zellen von Bedeutung sein können.
Dies steht im Kontrast zu einer Veröffentlichung von Zhang 74. In dieser Arbeit genügte
die Inhibierung des vIL-6 durch modifizierte Antisense-Oligonukleotide, um eine starke
Wachstumsbeeinträchtigung der PEL Zellen hervorzurufen. Zudem führte die
Suppression des viralen Zytokins zu einer reduzierten Expression des hIL-6. Da die
verwendeten Oligonukleotide in ihrer Sequenz aber mehrere CpG Motive enthielten, kann
eine unspezifische Induktion des Interferonsystems als Ursache für die von Zhang et al.
beobachteten Effekte nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurden in früheren
Arbeiten unter Verwendung derselben Technik gegenteilige Ergebnisse veröffentlicht 70.
Die kompensatorische Induktion des hIL-6 nach Suppression des vIL-6 steht nur
scheinbar im Gegensatz zu bereits veröffentlichten Daten. Sowohl für das zelluläre 109, 110
als auch das virale IL-6 103 wurde von anderen Arbeitsgruppen die Existenz eines
positiven Rückkopplungsmechanismus in Bezug auf die Expression des hIL-6 gezeigt.
Diese positive Rückkopplung wurde aber ausschließlich in HHV-8 negativen Zelllinien
Diskussion
51
nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass vIL-6 in PEL Zellen
sowohl die eigene Expression als auch die des zellulären IL-6 inhibiert. Um zunächst die
Ursache für die Induktion des hIL-6 in den vIL-6 knock-down Zellen aufzuklären, wurde
die Aktivierung eines Reporterkonstruktes, welches das firefly-Luziferasegen unter der
Kontrolle des hIL-6 Promotors enthielt, in HEK293T Zellen untersucht. Wie bereits in der
Literatur beschrieben, bewirkten sowohl LANA-1 105 als auch RTA 94 eine Induktion des
hIL-6 Promotors. Nach Bestimmung der RTA und LANA-1 Expressionslevel in den vIL-
6 supprimierten PEL Zellen mittels realtime-PCR, konnte die erhöhte hIL-6 Produktion
eindeutig auf eine verstärkte RTA Expression zurückgeführt werden. Dies deutet darauf
hin, dass vIL-6, im Unterschied zu hIL-6, die Aktivität des RTA Promotors inhibiert. Auf
diesem Weg reduziert vIL-6 die Expression des zellulären Zytokins in den latent mit
HHV-8 infizierten Zellen, aber nicht in Zellen, die das virale Genom nicht besitzen. Da
RTA auch als der Hauptregulator der lytischen HHV-8 Replikation bekannt ist, lieferte
dieses Ergebnis auch eine Erklärung für die Induktion des späten, lytischen HHV-8 Gens
K8.1 nach Inhibierung des vIL-6 durch RNAi. Nach Überexpression von RTA in PEL
Zellen konnte zudem gezeigt werden, dass dieses Protein sowohl die Expression der
lytischen, viralen Gene K8.1 und vIL-6 als auch des zellulären hIL-6 induziert. Eine
Stimulierung der hIL-6 Produktion in PEL Zellen kann des Weiteren auch durch die
Behandlung mit TPA und NaB erreicht werden. Im Überstand dieser chemisch
induzierten PEL Zellen wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen, erheblich höhere
Konzentrationen des zellulären Zytokins nachgewiesen. Dies ist auf die Aktivierung des
RTA Promotors nach Induktion der PEL Zellen mit TPA zurückzuführen 111.
Die Anwendung der RNAi stellt eine sehr effektive Methode dar um die Expression der
viralen Gene und deren Funktion innerhalb der latent mit HHV-8 infizierten Zelle zu
untersuchen. Um unspezifische Nebeneffekte der verwendeten siRNAs auszuschließen, ist
die Rekonstitution des RNAi-bedingten Phänotyps eine wichtige Kontrolle. Da die
Expression eines, in der siRNA-Zielsequenz mutierten, vIL-6 in den PEL Zellen nicht in
ausreichenden Mengen möglich war, wurde die Spezifität der beobachteten Effekte mit
Hilfe eines rekombinant hergestellten vIL-6 überprüft. Wie verschiedene Arbeiten
belegen, besitzt ein in Bakterienzellen exprimiertes vIL-6 im Vergleich mit eukaryont
exprimiertem vIL-6 nur eine um den Faktor 10 bis 100 verminderte spezifische Aktivität 54, 73. Aus diesem Grund erfolgte die Gewinnung des rvIL-6 in der vorliegenden Arbeit
aus eukaryonten Zellen. Die Reinigung aus dem Zellkulturüberstand erfolgte unter nicht-
Diskussion
52
denaturierenden Bedingungen mit Hilfe einer modifizierten Ni-NTA
Affinitätschromatographie. Die Reinheit des rvIL-6 konnte durch Westernblot und
Silberfärbung bestätigt werden. Die biologische Aktivität des aufgereinigten Zytokins
wurde anhand von Wachstumsraten der IL-6 abhängigen Myelomzelllinie INA-6 nach
Zugabe von rvIL-6 im Vergleich zu einem kommerziell erworbenen rhIL-6 ermittelt. Um
eine vergleichbare Proliferation der INA-6 Zellen zu erreichen, musste das virale Zytokin
in 50 bis 100-fach höherer Konzentration als das zelluläre IL-6 eingesetzt werden.
Ähnliche Ergebnisse wurden in bereits bestehenden Veröffentlichungen anderer
Arbeitsgruppen belegt 73, 65, 100 und sprechen sowohl für eine korrekte Faltung als auch für
die Funktionalität des in der vorliegenden Arbeit verwendeten Proteins. Die externe
Zugabe dieses rvIL-6 zum Zellkulturmedium der vIL-6 supprimierten PEL Zellen hatte
keinen Einfluß auf die RNAi-bedingte Inhibierung der vIL-6 Transkription. Allerdings
konnte die Reduktion des Wachstums der Zellen sowie die verstärkte Produktion des hIL-
6 nach dem knock-down des endogenem vIL-6 aufgehoben werden. Ein weiterer Effekt
der vIL-6 Suppression mittels RNAi war die erhöhte Expression der viralen (RTA, K8.1)
und zellulären (hIL-6) Gene auf Ebene der mRNA sowohl in latenten als auch durch TPA
und NaB stimulierten PEL Zellen. Durch die Behandlung dieser vIL-6 knock-down Zellen
mit dem aufgereinigten rvIL-6 konnte die erhöhte Expression dieser Gene wieder auf die
ursprünglichen Werte zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu resultierte die externe
Zugabe des rhIL-6 zu kultivierten PEL Zellen in einer erhöhten Expression dieser Gene..
Diese Ergebnisse demonstrieren auf der einen Seite die Spezifität des RNAi-bedingten
Phänotyps in den PEL Zellen. Auf der anderen Seite weisen sie für vIL-6, im Gegensatz
zu hIL-6, auf das Vorhandensein eines negativen Regulationsmechanismus in den latent
mit HHV-8 infizierten Zellen hin. Zudem sind diese Befunde der erste klare Anhaltspunkt
dafür, dass vIL-6 auch über andere Signaltransduktionswege wirken kann als das zelluläre
Homolog.
Um die unterschiedlichen Effekte des viralen und zellulären Zytokins näher zu
untersuchen, wurden sowohl die HHV-8 positiven PEL Zellen als auch verschiedene
HHV-8 negative B-Zelllinien mit rvIL-6 oder rhIL-6 behandelt. Anhand der hIL-6
Expressionlevel, welche mit Hilfe der quantitativen realtime-PCR ermittelt wurden, sind
die Auswirkungen der beiden, verwandten Zytokine in den verschiedenen Zellen sehr
deutlich zu erkennen. Während die Behandlung der PEL-abgeleiteten Zelllinien BCBL-1
und BC-3 mit rvIL-6 zu einer verminderten Expression des hIL-6 führte, hatte der Zusatz
Diskussion
53
von rhIL-6 den gegenteiligen Effekt. Diese unterschiedliche Wirkungweise der beiden
verwandten Zytokine in den BC-3 Zellen konnte auch in Bezug auf die Phosphorylierung
der Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 nachgewiesen werden. Während die
Zugabe des vIL-6 zu einer leichten Verminderung der Phosphorylierung von STAT1 und
STAT3 führte, hatte der Zusatz von hIL-6 eine Aktivierung besonders von STAT3 zur
Folge. Diese Beobachtungen stehen in Kontrast zu einer Publikation der Gruppe um J.
Nicholas. In der Studie konnte gezeigt werden, dass die Zugabe des vIL-6 zu einer
verstärkten und länger anhaltenden Phosphorylierung von STAT1 im Vergleich zu hIL-6
führt 64. Allerdings wurden die Untersuchungen wiederum in HHV-8 negativen Zellen
durchgeführt. Der inhibierende Effekt des viralen Zytokins auf diese STAT
Transkriptionsfaktoren in PEL Zellen könnte durch eine verstärkte Aktivierung von
zellulären Inhibitoren des JAK-STAT Signaltransduktionswegs, wie SOCS3 112, 113
hervorgerufen werden. Im Vergleich zu den PEL Zelllinien bewirkten sowohl vIL-6 als
auch hIL6 in der HHV-8 negativen humanen Leukämiezelllinie U937 eine Induktion der
hIL-6 Expression. Letzteres ist in guter Übereinstimmung mit publizierten Daten der
Arbeitsgruppe um Y. Mori 103. Des Weiteren konnte in den latent mit HHV-8 infizierten
PEL Zellen eine dosisabhängige Suppression der viralen (RTA, vIL-6, K8.1) und
zellulären (hIL-6) Genexpression nach Behandlung der Zellen mit ansteigenden
Konzentrationen an rvIL-6 nachgewiesen werden, während rhIL-6 zu einer Induktion
dieser Gene führte. Das als Kontrolle dienende und in den gleichen Konzentrationen wie
rvIL-6 eingesetzte Fc-Protein hatte keinen Effekt auf die Genexpression.
Basierend auf diesen Ergebnissen kann folgende Schlußfolgerung gezogen werden.
Während für die beiden verwandten Zytokine in HHV-8 negativen Zellen ein positiver
Rückkopplungsmechanismus nachweisbar ist, liegt in den latent mit HHV-8 infizierten
PEL Zellen ein inhibierender Effekt des vIL-6 auf die Expression einiger viraler und
zellulärer Gene vor. Im Gegensatz dazu induziert hIL-6 auch in HHV-8 infizierten Zellen
die Transkription dieser Gene. Die unterschiedliche Wirkungweise des vIL-6 in den
verschiedenen Zelllinien ist dabei auf das Vorhandensein des HHV-8 Genoms
zurückzuführen. Dem positiven Rückkopplungsmechanismus, welcher normalerweise
durch die gp130 Untereinheit des IL-6R vermittelt wird, wirkt in diesen Zellen eine
Inhibierung des viralen RTA über einen bisher unbekannten Signalweg entgegen (Abb.
15). Die verminderte Expression des starken Transaktivators RTA wiederum vermittelt
die reduzierte Expression sowohl lytischer viraler Gene als auch des zellulären IL-6.
Diskussion
54
Zudem deuten die Ergebnisse der untersuchten Signaltransduktionswege auf eine
Beteiligung des STAT1 Transkriptionsfaktors hin. Die Bedeutung dieses negativen
Regulationsmechanismus für HHV-8 kann wie folgt erklärt werden: eine Aktivierung der
viralen und zellulären Genexpression, wie es für hIL-6 beschrieben ist, würde zu einer
verstärkten Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes und einer Reaktivierung des
Virus in den benachbarten Zellen führen. Dies wäre mit der starkt regulierten, latenten
HHV-8 Infektion, welche in allen Zellen und Geweben besteht, nicht vereinbar. Die
Modulierung der gp130 Signalübertragung des IL-6R und Beeinflußung des RTA
Promotors durch vIL-6 ermöglicht es dem Virus dagegen, dem positiven
Rückkopplungsmechanismus entgegenzuwirken. Dadurch kann vIL-6 sowohl die
Aktivierung der lytischen HHV-8 Replikation als auch des zellulären Immunsystems
unterbinden und somit zur Aufrechterhaltung der latenten Infektion und dem Überleben
der HHV-8 infizierten Zellen beitragen.
Abbildung 15: Modulation der Genexpression durch hIL-6 and vIL-6 (A) Das hIL-6 bindet nur im Komplex mit der löslichen gp80 Untereinheit an die signalübertragende gp130 Untereinheit des IL-6R. Dies führt durch Signaltransduktion über den STAT und MAPK Weg zur Induktion der viralen und zellulären Promotoren. (B) Das vIL-6 kann in Abwesenheit des gp80 unter Bildung eines tetrameren Komplex mit gp130 oder wie hIL-6 durch Formation eines hexameren Komplexes, welcher gp80 enthält, den IL-6R aktivieren. Beide Komplexe können zur Induktion der STAT und Ras-MAPK Signaltransduktion führen, aber über eine bisher unbekannten Mechanismus kommt es zu einer Hemmung der RTA induzierten Aktivierung der zellulären und viralen Promotoren.
Diskussion
55
Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals klare Unterschiede zwischen vIL-6 und hIL-6
in Bezug auf die virale und zelluäre Genexpression in den latent mit HHV-8 infizierten
PEL Zellen gezeigt. Allerdings ist der zugrunde liegende Mechanismus noch nicht
vollständig aufgeklärt. Teilweise könnten diese Unterschiede auf die unterschiedlichen
Rezeptorbindungseigenschaften der beiden verwandten Zytokine zurückgeführt werden.
vIL-6 ist das bisher einzige bekannte Zytokin der IL-6 Familie, welches nur über die
gp130 Untereinheit des IL-6R die Signaltransduktion aktivieren kann. Im Hinblick auf die
in dieser Arbeit gezeigten gegensätzlichen Effekte des humanen und viralen Zytokins in
den HHV-8 transformierten PEL Zellen, muss in folgenden Studien der Einfluss der
Unterschiede in der induzierte Signaltransduktion auf die Regulierung des viralen RTA
Promotors näher untersucht werden. Zudem wären weitere Analysen der
Signaltransduktion, besonders der Inhibitoren des JAK-STAT Signalweges, durch vIL-6
in PEL Zellen wichtig um die Bedeutung dieses viruskodierten Zytokins in den HHV-8
infizierten Zellen vollständig aufzuklären.
Abkürzungsverzeichnis
56
6 Abkürzungsverzeichnis AIDS acquired immunodeficiency syndrome
Amp Ampizilin
AS Aminosäure
BCBL-1 body cavity based lymphoma
Bcl2 B-Zell-Lyphomprotein-2
Bez. Bezeichnung
β-ME β-Mercaptoethanol
bp Basenpaar(e)
CDK cyclin-dependent kinase
cDNA copy DNA
Cyc Cyclin
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosid (Adenin, Zytosin, Guanosin, Thymidin)-Triphosphat
DTT 1,4-Dithiotreithol
EBV Epstein Barr Virus
ECL enhanced chemiluminescence
EGFP enhanced green fluorescent protein
ER Endoplasmatisches Retikulum
FACS fluorescence activated cell sorter
FKS fötales Kälberserum
FLICE FADD-like IL-1 converting enzyme
fwd forward
Genta Gentamyzin
Glu L-Glutamin
GPCR G-Protein gekoppelte Rezeptor
HAART hoch-aktive antiretrovirale Therapie
H-DNA High density DNA
HHV-8 humanes Herpesvirus-8
hIL-6 humanes Interleukin-6
Abkürzungsverzeichnis
57
HRP horseradish peroxidase
HVS Herpesvirus saimiri
IF Immunfluoreszenz
IAP inhibitor of apoptosis
IL Interleukin
IL-6R Interleukin-6 Rezeptor
IFN Interferon
JAK Janus Kinase
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KS Kaposi`s Sarkom
KSHV Kaposi`s Sarkom assoziiertes Herpesvirus
LANA Latenz-assoziierte nukleäre Antigen
LB Luria Bertani-Medium
MAPK mitogen-activated protein kinase
MCD Multizentrische Castleman-Erkrankung
MIP Makrophagen inflammatorisches Protein
mRNA messenger RNA
NaB Natriumbutyrat
NF-κB nuclear factor of κB
ORF open reading frame
PAA Polyacrylamid
PBS phosphat buffered saline
PBSo phosphat buffered saline ohne Mg2+- und Ca2+-Ionen
PCR polymerase chain reaction
PEL primäres Effusionslymphom
PFA Paraformaldehyd
PI Propidiumiodid
PMSF Phenylmethylsulfoxid
rev reverse
RNA Ribonukleinsäure
RNAi RNA interference
RPMI1640 Roswell Park Memorial Institut 1640-Medium
RT Raumtemperatur
Abkürzungsverzeichnis
58
RTA replication and transcription activator
SDS Sodiumdodecylsulfat
shRNA short hairpin RNA
siRNA short interfering RNA
STAT signal transducers and activators of transcription
Strep/Pen Streptomyzin/Penicillin
Tab. Tabelle
TF Transkriptionsfaktor
TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Azetat
Tris Trishydroxymethylaminomethan
ü. N. über Nacht
VEGF vascular endothelial growth factor
vIL-6 virale Interleukin-6
VSV-G vesikuläres Stomatitisvirus Protein G
Literaturverzeichnis
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Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
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Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
Eigene Veröffentlichungen Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., Neipel F. Oppossed effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. (Journal of Virology, in Revision) Wies E., Hahn A., Viehbahn C., Rohland N., Lux A., Schellhorn T., Holzer A., Jung J.U., Neipel F. The Kaposi-sarcoma associated herpesvirus encodes vIRF-3 inhibits the transcriptional activity of cellular IRF-5. (Journal of Biological Chermistry, im Druck)
Kongressbeitäge Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., & Neipel F. Antagonistic effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. 33
rd Annual International Herpesvirus Workshop, July
25 – August 1, 2008, Estoril, Portugal. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) interacts with cellular interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and inhibits its transcriptional activity. 33
rd Annual
International Herpesvirus Workshop, July 25 – August 1, 2008, Estoril, Portugal. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) interacts with cellular interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and inhibits its transcriptional activity. Keystone Symposia on
Molecular and Cellular Biology, April 13-18, 2008, Victoria, BC, Canada. Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., & Neipel F. Antagonistic effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, March 5-8, 2008, Heidelberg, Germany. Rohland N., Hahn A., Wies E., Fleckenstein B., & Neipel F. Differential effects of viral and human interleukin-6 on human herpesvirus-8 transformed primary effusion lymphoma cells. Third European Congress of Virology, September 1-5, 2007, Nürnberg, Germany. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) is required fort he proliferation of infected primary effusion lymphoma cells and counteracts cellular IRF-5. Third European
Congress of Virology, September 1-5, 2007, Nürnberg, Germany. Rohland N., Hahn A., Wies E., Fleckenstein B., & Neipel F. Differential effects of viral and human interleukin-6 on human herpesvirus-8 transformed primary effusion lymphoma cells. 10
th International Workshop on Kaposi`s Sarcoma Associated
Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, August 1-5, 2007, Portland, OR, USA.
Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
66
Wies E., Chaipan C., Rohland N., Fleckenstein B., & Neipel F. Knock-down of K10.5 expression in cultured primary effusion lymphoma cells induces apoptosis. 8
th
International Workshop on KSHV and Related Agents, August 21-25, 2005, Wildbad Kreuth, Germany.
Lebenslauf
67
Lebenslauf Persönliche Daten
Name: Nadine Rohland
Geboren am: 12.01.1981
Geburtsort: Bad Langensalza (Thüringen)
Beruflicher Werdegang
Seit 06/05 Anstellung als wissenschaftliche Angestellte in der Arbeitsgruppe
von PD Dr. med. Frank Neipel zur Forschung am Kaposi`s
sarkoma assoziierten Herpesvirus (Virologisches Institut –
Klinische und Molekulare Virologie, Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg)
Themenschwerpunk der Promotion:
Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin-6 in
PEL Zellen
06/05 - 05/08 GK1071 Stipendium der DFG in Kooperation mit Harvard Medical
School
Studium
10/99 - 02/05 Friedrich-Schiller-Universität Jena
Diplomstudiengang Biologie
Hauptstudium mit Schwerpunktfächern Mikrobiologie,
Medizinische Mikrobiologie und Genetik
Diplomarbeit:
„Charakterisierung der protektiven Nutzung von Vakzinen gegen
Influenza-A-Virus-Infektionen“
Schulbildung 09/90 – 07/90 Salza-Gymnasium Bad Langensalza
Abschluß: Allgemeine Hochschulreife mit den Leistungskursen
Mathematik und Biologie
09/86 – 07/90 Wiebeck-Grundschule Bad Langensalza
Danksagung
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Danksagung
Herrn Prof. Dr. Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit am
Virologischen Institut durchführen zu können, sowie für die hervorragenden
Arbeitsbedingungen.
Bei Herrn Prof. Dr. Nitschke möchte ich mich für die großzügige Bereitschaft bedanken,
diese Dissertation seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-
Nürnberg zu vertreten.
Mein besonderer Dank geht an meinen Arbeitsgruppenleiter PD Dr. Frank Neipel für die
gute wissenschaftliche Anleitung und Betreuung dieser Arbeit.
Für ihre Unterstützung, Diskussionsbereitschaft und vor allem für ihre Freundschaft weit
über den Laboralltag hinaus, möchte ich mich ganz herzlich bei Effi Wies, Alexander
Hahn, Katharina Schmidt und Angela Holzer bedanken.
Auch den Arbeitsgruppen Grassmann und Biesinger-Zwosta, den Mitgliedern des GK
1071 und allen anderen Mitarbeitern des Instituts möchte ich mich für die angenehme
Arbeitsatmosphäre und die großzügige Hilfsbereitschaft recht herzlich bedanken.
Ganz besonders liegt es mir am Herzen, mich an dieser Stelle bei meiner Familie für ihre
geduldige Unterstützung, Vertrauen und Motivation während meiner gesamten
Ausbildungszeit bedanken. Für die Hilfe meiner Freundinnen Isabelle, Ulrike und Luisa
möchte ich mich hiermit ganz herzlich bedanken und dass sie trotz der Entfernung immer
für mich da waren.
Bei meinem Freund Nenad möchte mich ganz besonders für seine Liebe, Geduld und die
vielen anderen Dinge während der letzten Phase meiner Promotion bedanken.