•Lebensmittelgewinnung und –verarbeitung: Problem der Kreuzkontamination (Listerien)
Institut für Milchhygiene, Milchtechnologie und Lebensmittelwissenschaft; Department für Nutztiere und Veterinary Public Health, Veterinärmedizinische Universität, Veterinaerplatz 1, 1210 Wien
BfR Symposium Risken entlang von Lebensmittelwarenketten, Berlin, 18.02.2016 – 19.02.2016
Martin Wagner, Kathrin Rychli, Beatrix Stessl, Stephan Schmitz-Esser
PROMISE Protection of Consumers by Mitigation of Segregation of Expertise
Zu allererst: Danke für die Anregungen und gute Zusammenarbeit
Kontaminationswege sind multipel
Personal
Kontaktmaterialen
Wasser
Ventilation
Rohmaterial
Produkt
Packaging material
Prozessumgebungen
Dr. Martin Wagner
Wie ähnlich sind korrespondierende mikrobielle Ökosysteme (Model Abfluss)?
Dzieciol et al., 2016 Front. Microbiol.
Wieso das Thema Kreuzkontamination und Listerien?
Ausbrüche an Listeriose vorwiegend in Ländern mit differenzierter Produktionstechnologie und hohem Hygienestandard (in den letzten 5 Jahren: Österreich, Belgien, Dänemark, Schweiz, Deutschland)
Steigende Listeriose-Inzidenz in vielen EU 28 MS
Viele Zoonoseerreger haben einen Lifestyle außerhalb der Kette, der wenig erforscht ist (Trennung LMH-Ökologie)
L. monocytogenes zeigt viele Features, die ihn als Pathogen moderner Produktionssysteme vermuten lassen
Food safety violation
Contamination of food
Legal consequences
Abiotic and biotic vectors
Genetic setting
Persistencephenomenon
Habitat specific prevalence
Competiveness of food producers
Increased hygiene risk
Decreased detection probability
Mechanisms ConsequencesHazards
Food processing environment
Environment Food chain
Mikrobielle Persistenz erleichtert Kreuzkontamination
Larsen et al., 2014, Food Control
food industry equipment and
• Persistenz: Wie zu definieren?• Wie schauen Verbreitungsmodelle in Produktionsumfeldern aus?
• Sind persistente Isolate “toleranter” gegen Desinfektionsmitteln? • Sind persistente Isolate “resistenter” gegen Stressoren (zB.
Nährstofflimitation)? • Persistente Listerien und Biofilmbildung? Können Kommensalen die
Biofilmbildung stimulieren?8. Co• Persistente Isolate und Virulenz?
Review - Persistence of Listeria monocytogenes in food industry equipment and premises (Brigitte Carpentier, Olivier Cerf IJFM 145, 2011, 1-8)
Listerien sind „Klassiker“ für Kreuzkontaminationsphänomene
Muhterem-Uyar et al., 2015 Food Control
FörderbänderSlicerUtensilien
SchläucheMattenDrains
Nischen des Keimübertrags: Listeria monocytogenes
Verbreitungsschemata für Listerien in Prozessumfeldern
X = Positive =negative
S1: Disseminierte Kontamination
S2: Gerichtete Kontamination
S3: Hot Spots
S3 S2
Persistenz von L. monocytogenes: wie messen?
Wagner et al., JFP 1996
(1) (5) Kuenne et al. (2013) BMC Genetics; (2) Verghese et al. (3) Müller et al. (2014) PlosOne; (4) El‐Hanafi et al., (2010), AEM (5) Gilmour et al. (1996) AEM.
(1) (5) Kuenne et al. (2013) BMC Genetics; (2) Verghese et al. (3) Müller et al. (2014) PlosOne; (4) El‐Hanafi et al., (2010), AEM (5) Gilmour et al. (1996) AEM.
• Das PAN-GENOME von L. monocytogenes ist hoch stabil. Interessantsind hyper variable hotspots (accessory genome).
• Mobile Elemente (wie ZB comK prophage) treiben die nischen-spezifischeAdaptation, Persistenz, und Transmission bei L. monocytogenes.
Die „Gretchen“ Frage: Ist Persistenz genetisch encodiert?
Genepool bei persistierenden L. monocytogenes and L. innocua (n=30) weitgehend homolog.
Microarray data: Genetische Variationen nur in Regionen, wo Phagen insertiert sind
Biomarker für Desinfektionsmitteltoleranz: Tn6188 (und Tn554-ähnliche Transposone)
Staphylococcus lentus
Staphylococcus aureus
Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecium
Sind persistente Isolate “resistenter” gegen Stressoren (zB. Nährstofflimitation)?
Drei persistierende Isolate (6179/IRE, 4423/AT, 479a/DK) und Kontrolle: exposition gegen milden Nährstofflimitierung
Stress response (secreted proteins): gemessen durch exoproteomischer Ansatz
Nährstofflimitierung führt zu Resistenz gegen alkalinen Stress
L.m. EGDe vs4423
NamA
lmo2637
Persister strains versus EGDe:8 protein spots upregulated/16 protein spots downregulated
NADPH dehydrogenase NamAHomology in Bacillus subtilis involved in oxidative stress, detoxification process. Lmo2637:
Membrane anchored lipoprotein
Können Kommensalen die Biofilmbildung von Listerien stimulieren?
Figure 5: Stainless Steel Flowcell Model
L. monocytogenes sind die schwächsten Biomasse-produzenten im Vergleich zu kälteadaptierte Species
Monokultur
Pseudomonaden fördern die L. monocytogenes Biofilmbildung (10°C; Flotation)
8,07 ±11,57% L. mono.
6,31 ±9,05% L. mono.
20,10 ±8,06% L. mono.
17,30 ±10,98% L. mono.
20,70 ±6,77% L. mono.
20,21 ±11,94% L. mono.
Persistente Genotypen und Virulenz (ST121)
L. monocytogenes MLST 121 Isolate hoch prävalent in Produktionsumfeldern (Ragon et al., 2008 Plos Pathog; Parisi et al. Food Micro, 2010; Hein et al., 2011 Appl Environ Microb.)
ST121 L. monocytogenes sind niedrig virulent in epithelialen Zellenkulturen
EGDeRO01
RO02 RO03RO04
RO05
RO06
RO07
RO08
RO09
RO10 RO11
RO12
RO13
RO14RO15
EGDeRO01RO02RO03
RO04
RO05
RO06
RO07
RO08
RO09RO10
RO11
RO12
RO13
RO14
RO15
‐5
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Intracelllu
lar G
rowth Coe
ficient
Invasion efficiency, %
THP‐1Caco‐2
Strain Food source Serotype MLST ‐typeRO01 Mackerel 1/2a 20RO02 Marinated fish 1/2a 8RO03 Smoked herring 1/2a 20RO04 Raw‐ dry salami 1/2a 20RO05 Smoked salmon 1/2a 155RO06 Anchovy 1/2a 20RO07 Fish with spices 1/2a 155RO08 Smoked sprat 1/2a 20
RO09 Fish in oil with herbs 1/2a 155
RO10 Butter 1/2a 121RO11 Poultry 1/2a 121RO12 Lard 1/2a 8RO13 Herring with spices 1/2a 155RO14 Pork rind 1/2c 9RO15 Herring with spices 4b 2
Ciolacu et al., 2015 IJFM
ST121 haben truncated inlA und bapL Gene (biofilm formation)
EGDe
1 kbp
6179 inlA* lmo0435/bapL*
4423 inlA* lmo0435/bapL*
N53-1 inlA* lmo0435/bapL*
LM_1880
inlA* lmo0435/bapL*
Schmitz-Esser, 2015 Front. Microbiol.
ST 121(multiple origin): Genetischer Hintergrund ist klonal
6179 RHS protein
4423
N53-1
LM_1880
ST121 Genome zeigen Marker, die wahrscheinlich in Kompetitionsmechanismen mit anderen Bakterien
involviert sind
RHS protein
RHS protein
RHS protein
kptA codiert für eine RNA 2` phosphotransferase (WapA schneidet RNA und tRNA)
3056 bp protein 29 rearrangement hotspot repeats (Strain competition)
Take home message: Persistenz ist ein Eckstein in Listeria Kreuzkontaminationsszenarien
Sanitation inappropriate
Habourage in abiotic niches
Persistence
Sanitation approriate
Habourage in biotic niches
Erradication
Tolerance
Fitness
Abundance elevated
Poor adaption
Adaptation
Growth
Erradication
Systemic Event specific
Input Strain features Consequence Input Consequence
Low virulent Virulent RISK
Strain features
Food processing environment Food processed
Survival