Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
Teil 1: Grundlagen, Präanalytik
http://www.mh-hannover.de/Lichtinghagen.html
Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover
Institut für Klinische ChemieTel.: 0511-532-3940
LaboratoriumsmedizinDisziplinen
• Immunologie• Immunhämatologie• Hämatologie• Hämostaseologie (Gerinnung)• Klinische Chemie• Molekularbiologie, Genetik• Mikrobiologie• Virologie
Vorlesungsthemen
• Grundlagen, Präanalytik, Analytik• Leber, Pankreas• Kardiale Marker• Diabetes mellitus• Fettstoffwechsel• Nierendiagnostik• Elektrolyt- und Wasserhaushalt• Säure-/ Basenhaushalt• Entzündungs- und Tumordiagnostik• Immunhämatologie (Blutgruppen)• Hämostaseologie• Molekularbiologische Diagnostik
Der Weg zum Laborbefund
Untersuchungs- und Beurteilungsablauf ausmehreren Teilschritten:
Präanalytische, analytische und postanalytische Phase
Einsender (Arzt, Station):Vorbereitung des Patienten zur Probennahme, Probennahme, TransportLabor:Lagerung, Aufarbeitung zur Analytik
Fehler in der Präanalytik (>60%) sind die häufigste Ursache für unplausible Laborbefunde!!!
Diagnose, Prognose
Technische Ebene
Biologische Ebene
Nosologische Ebene
Analysenergebnis
Befund
Interpretierter Befund
PlausibilitätskontrolleLongitudinalbeurteilungTransversalbeurteilungBeurteilung von Einflussgrößen
QualitätskontrolleAnalytische BeurteilungBeurteilung von Störfaktoren
Zuordnung zum MorbusDiff.-diagnostische BeurteilungBewertung von EinflussgrößenPathophysiologische Beurteilung
Der Weg zum Laborbefund
Messgröße
Einflussgrößen und Störfaktoren
Einflussgröße: führt in vivo zu Veränderungen an der Konzentration der zu bestimmenden Messgröße (vor Probennahme, Ausnahme: in vitro-Einflussgröße), sie ist unabhängig vom Analysenverfahren.
Störfaktor: bewirkt in vitro (nach und während der Probennahme) eine Veränderung des Messergebnisses, er ist nicht immer unabhängig vom Analysenverfahren.Unterscheidung zwischen :
körpereigene Störfaktorenkörperfremde Störfaktoren
Einflussgrößen
Durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen
Diabetes mellitus: C-(Kapillar)-GlucoseP-(Plasma)-GlucoseS-(Serum)-Glucose
Niereninsuffizienz: S-HarnstoffS-KreatininS-Kalium
Pankreatitis: S-α−AmylaseU-(Urin)-α−AmylaseS-Lipase
Einschub: Systembezeichnungen
Serum SSerumwasser S(W)Plasma PPlasmawasser P(W)Blut BBlutwasser B(W)Kapillarblut CArterielles Blut Avenöses Blut VErythrozyten ERCUrin ULiquor LFaeces FKonkrement KSchweiss SUSpeichel SPSonst. Material Y
Einflussgrößen
durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen
durch diagnostische und therapeutische Maßnahmen
i.m. Injektion, Muskelbiopsie: S-Creatinkinase (CK)S-Myoglobin
Prostata-Palpation: S-PSA(prostataspezifisches Antigen)
Gabe vieler Medikamente: diverse Messgrößen
Einflussgrößendurch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen
durch diagnostische und therapeutische Maßnahmen
Alter, Geschlecht, Rasse,genetische Unterschiede
Für viele Messgrößen gelten eigene Referenzbereiche für Frauen und Männer!
♀ ♂
Altersabhängigkeit diverser Messgrößen
Für viele Messgrößen sind alterabhängige Referenzbereiche wünschenswert!
Einflussgrößendurch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen
durch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede
Nahrungsaufnahme, Diät,Rauchen, Genussgifte
Manche Referenzbereiche (z.B. für P-Glucose) gelten nur für 12stündige Nahrungskarenz
Einfluss von Alkohol(C2-toxisch)
Einfluss des Rauchens
Andere Entscheidungsgrenzen für Raucher bei diversen Markern?(z.B. S-CEA)
S-γGT: klassischer (wenn auch unspezifischer) Surrogatmarkerbei chronischem Alkoholabusus
Nahrungsaufnahme, Diät, Rauchen, Genussgifte
Einflussgrößen
circadiane Rhythmik
Bei vielen Messgrößen ist die Tageszeit der Blutentnahme entscheidend für eine bessere Vergleichbarkeit von Messwerten
durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungendurch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede
Nahrungsaufnahme, Diät, Rauchen, Genussgifte
Einflussgrößen
circadiane Rhythmik
durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungendurch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede
Stauen der Vene, Einfluss der Körperlage
Anreicherung hochmolekularer bzw.daran gebundener Substanzen, deshalb Stauzeit < 2 min.
Änderung der Körperlage:Anstieg der Plasma-konzentration vom Wechsel von der liegenden in die aufrechte Position.
Unterschiede abhängig von der Konstitution des Patienten,verstärkt bei Patienten mit Herzinsuffizienz.
In vitro-EinflussgrößenVeränderung durch Lagerung, Metabolismus der Blutzellen
4°C
23°C
30°C
4°C
23°C
30°C
Substanzen, die in Leukozyten in hoher Konzentration vorhanden sind, werden falsch-hoch gemessen (z.B. Kalium)
Der Metabolismus von Blutzellen führt zu veränderten Plasma-konzentrationen von Messgrößen (z.B. Glucose)
StörfaktorenBei der Blutentnahme:•Falsche Monovette•Blut ist mit Infusionslösung vermischt (Elektrolyte, Glucose, Proteine, Lipide)•Zu starke Aspiration: Hämolyse (Zerstörung der Erythrozyten, Freisetzung von Hämoglobin)
Störfaktoren aus Patienten:
•Patienten mit einer Hämolyse (erhöhtes P-Hämoglobin, rote Farbe des Serums)
•Patienten mit einer Lipämie (erhöhte-Blut-Fettwerte, milchiges Serum)•Patienten mit Ikterus (erhöhtes Bilirubin färbt Serum bräunlich)
Bsp.: Eine Monovette enthält K2-EDTA zur klinisch-chemischen AnalytikFehlermöglichkeiten u.a.: S-Kalium falsch-hoch (Werte >9,5 mmol/l
sind nicht mit dem Leben vereinbar)S-Calcium, S-Magnesium falsch niedrig (Komplexbildung)
Interferenzen bei diversen Messmethoden
Einschub: Monovetten-TypenZusatz Einsatzbereich
Serum: Kaolin Klinische Chemie (KC)(als Gerinnungsaktivator)
Plasma: Lithium-Heparin KCAmmonium-Heparin KCKalium-EDTA HämatologieNatrium-Citrat Gerinnung
(als Antikoagulanzen)Natrium-Fluorid KC
(als Glykolyse-Hemmer)
Die Verwendung ungeeigneter Monovetten kann zu extremen Abweichungen bei verschie-denen Messgrößen führen.
Bei der Wahl verschiedener Probenmaterialien (Serum vs. Plasma) resultieren bei manchen Messgrößen unterschiedliche Referenzbereiche.
Referenzintervall
2,5. – 97.5. Perzentileeines gesunden Kontrollkollektives bezogen auf die Werteverteilung bei einer Messgröße.
Es ist das Intervall zwischen zwei Referenzgrenzen und schließt diese Grenze mit ein.
5% der Gesunden sind definitionsgemäß oberhalb (2,5%) bzw. unterhalb (2,5%) des Intervalles und haben somit einen pathologischen Messwert.
Keine Normalverteilung
Transversalbeurteilung
Vergleich eines Messwertes mit dem entsprechenden Referenzintervall:
Referenzbereich
S-Bilirubin [µmol/l]: 25 + bis 17 S-Protein [g/l]: 15 - 65-80
Longitudinalbeurteilung
Wichtiger Bestandteil einer Plausibilitätskontrolle.
Überprüft die zeitliche Folge von Ergebnissen aus Primärproben desselben Patienten.
Aus biologischen Halbwertszeiten und Erkenntnissen über typische Veränderungen der Messgröße bei definierten Erkrankungen kann die Plausibilität solcher Zeitreihen beurteiltwerden.
BeispielTag 1 Tag 2 Tag 3 Ref.bereich
S-Kalium [mmol/l] 4,4 7,8 4,6 3,6-5,4
Diagnostische Wertigkeit von Markern
Gesund KrankMarkerkonzentration
Häu
figke
it
„Idealer Test“
Keine falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnisse
Positives Ergebnis beweisend für gesuchte Erkrankung
„Realer Test“
Diagnostische Sensitivität und Spezifität <100%
Prävalenz der Erkrankung muss berücksichtigt werden
cut-off-Wert
Konzentration des Markers
Häu
figke
it
richtig negativ
Patient hat nicht die Erkrankung,die der Marker nachweisen soll
Cut o
ff-W
ert
fp
fn
Patient hat die Erkrankung,die der Marker nachweisen soll
richtig positiv
Eine Entscheidungsgrenze dient zur Diskriminierung zweier verschiedener Kollektive mit Hilfe eines entsprechenden (geeigneten) Markers.
Diagnostische Sensitivität und Spezifitätbessere bessereSensitivität Spezifität
Ents
chei
dung
sgre
nze
KonzentrationMarker
Diagnostische Sensitivität und Spezifität eines Markers in Bezug auf den Nachweis einer Erkrankung sind über die Festlegung einer Entscheidungsgrenzemiteinander verbunden!
Diagnostische Wertigkeit von Markern
Sicherheit, mit der Kranke erkannt werden
Sicherheit, mit der Nicht-Kranke ausgeschlossen werden
Wahrscheinlichkeit für Nicht-Krankheit bei normalem Messwert(Zunahme mit Zahl der Nicht-Kranken)
Wahrscheinlichkeit für Krankheit bei pathologischem Messwert(Zunahme mit Krankheitsprävalenz)
Diagnostische Wertigkeit von Markern
Rechenbeispiel:
50 Kranke auf 100.000 Personen (Prävalenz 0,05%)
Testeigenschaften: Sensitivität 50%Spezifität 95%
Restresultat: 25 Kranke entdeckt25 Kranke übersehen
5000 Gesunde mit Verdacht auf Erkrankung!
Weitere Diagnostik bei 5% der Patienten (Faktor 100:1)
Diagnostische Wertigkeit von Markern
Blutnachweis im Stuhl / Colon-Ca
Prävalenz Colon-Ca 0,72%Diagn. Sensitivität 80%Diagn. Spezifität 98%
Bei n=10.00058 Kranke Test-positiv, 14 Kranke Test-negativ200 Gesunde Test-positiv (falsch-positiv)
Pos. prädiktiver Wert 22,5%Neg. prädiktiver Wert 99,9%
Weitere Diagnostik bei 2,6% der Patienten (Faktor 3:1Gesund/Krank))
Quantitative Messung: Einheiten, SI-Konformität
Stoffmenge: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse bekannt ist, in mol beziffert.
Substanzkonzentration: mol/l, mmol/l, µmol/l…
1 Mol jedes Stoffes enthält 6,023 x 1023 Teilchen (Avogadro-Konstante)Beispiel: 1 Mol Wasser sind 18 g (1x16 (O) + 2x1 (H))
Substanzmasse: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse unbekannt ist, in kg (bzw. abgeleiteten Größen) beziffert.
Massenkonzentration: kg/l, g/l, mg/l…
Katalytische Aktivität eines Enzyms: U/l1 Unit (U) ist die Enzymmenge, die 1 µmol Substrat pro Minute bei gegebener Temperatur und Reaktionsbedingungen umsetzen kann.
nicht SI-konform (SI: Système internationale d‘ Unités)
Analytik im Überblick
Nachweisgrenze: Mindestkonzentration eines Analyten, die sicher von Null unterschieden werden kann
Mehrfachmessung analytfreier Probe: Nachweisgrenze = Mittelwert + 3 x SD
Linearitätsgrenze: Messbereich zwischen Nachweisgrenze und Linearitätsgrenze (Verdünnungsgrenze)
Analytische Sensitivität: Maß für Nachweisvermögen einer Methode.Bedeutet auch die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereichs, die sicher unterschieden werden kann.Kritische Differenz = 3 x SD (der Methode)
Analytische Spezifität: das Vermögen des analytischen Verfahrens in der Probe nur die gesuchte Messgröße zu erfassen
SD: Standardabweichung
Qualitätskontrolle im Überblick
Ziele:Kontrolle der zufälligen Fehler.Kontrolle der systematischen Fehler über den gesamten klinisch-relevanten Messbereich.Kontrolle jeder Analysenserie (umfasst längstens acht Stunden).Anwendbarkeit in allen Laboratorien.
Vorschriften zur Durchführung der Qualitätskontrolle in med. Laboratorien und Anforderungen bzgl. Güte der Messungen für 87 Messgrößen festgelegt in Richtlinien der Bundesärztekammer (RILIBÄK): Maximal zulässige Unpräzision(Anlage 1, Spalte 5), Maximal zulässige Unrichtigkeit (Anlage 1, Spalte 6), Maximal zulässige Abweichung des Einzelwertes (Anlage 1, Spalte 7)
Qualitätskontrolle im Überblick
Richtigkeitskontrolle: Abweichungen von einem definierten Zielwert, lässt systematische Fehler erkennen (Unrichtigkeit).
Präzisionskontrolle: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Messung, Erkennung grober und zufälliger Fehler.Auch mittels Labor-EDV errechenbar aus RichtigkeitskontolldatenMittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient (VK)
Ringversuche: externe Richtigkeitskontrolle, zentral durch Ringversuchsleiter (Referenzinstitition der DGKL, INSTANT...), Erlangung von RV-Zertifikaten.
Qualitätskontrolle im Überblick
Kontrollen: Es werden zur Überwachung von Richtigkeit und Präzision ausschließlich Richtigkeitskontrollen verwendet.
Kalibratoren:primärer Standard: Kalibrationsstandard aus abgewogener (ideal) Reinsubstanz gelöst in reinem Lösungsmittel.
Material soll keine Komponenten enthalten,die einen unspezifischen Beitrag zum Messsignalliefern.
sekundärer Standard: Masse kann nur indirekt durch chem. Analyse ermittelt werden, wenn exakte Einwaage nichtmöglich ist (z.B. bei konstanter Restfeuchte (Albumin))Matrixhaltig: enthält die gleichen Haupt- und Nebenbestandteile wie die Patientenproben
Dokumentation laborinterner Qualitätskontrolle
(105,6-103) : 3 = 0,87 = 1SDSDx100/103 = 0,84 = %VK max. Impräzision: Mittelwert + 3 SD
Dokumentation externer Qualitätskontrolle
YOUDEN-Diagramm zur Darstellung aller Teilnehmerergebnisse.Zielwerte im Zentrum des Diagramms.Quadrat zeigt die Bewertungsgrenzen nach RILIBÄK an.Zertifikate der Referenzinstitution nur für Teilnehmer innerhalb dieses Quadrates.
RV nicht bestanden?Überprüfung der Berechnung/ProtokolleÜberprüfung der internen Qualitätskontr.Abschätzung des Fehlertyps(grob/systematisch aus graphischer Auswertung)Vergleich mit anderen TeilnehmernDurchführung verstärkter interner Qualitätskontrolle
Zum Nachdenken
z.B. S-ChloridWert [mmol/l]
Tag 1 100
Tag 2a 102Tag 2b 105
Max. Impräzision der Methode beträgt 2,5%
Anstieg des S-Chloridoder nicht im Fall a oder b?
Kritische Differenz = 2 √2 x SD (3 x SD)
Trennmethoden in der Klinischen ChemieBeispiel Prinzip
Ausfällung Ausfällen von Proteinen Erzeugung von unlöslichen durch Trichloressigsäure Niederschlägen
Sedimentation Abtrennung der Blutkörperchen Höhere rel. Dichte der suspendiertenvom Plasma Teilchen
Zentrifugation Abtrennung der Blutkörperchen Beschleunigung dervom Plasma Sedimentationsgeschwindigkeit (2000g)
UltrazentrifugationTrennung von Zellkomponenten hohe Beschleunigung der Sed.geschw.(z.B. 100.000-500.000 g)
Filtration Klären von trübem Urin Abtrennung von festen Partikelndurch Filter
Ultrafiltration Proteinanreicherung im Urin, Liquor Abtrennung gelöster makromolekul.Stoffe von niedermolekularen
Elektrophorese Trennung von Proteinen Unterschiedliche Wanderungs-geschwindigkeit im elektr. Feld
Chromatographie Auftrennung von Proteinen, Auftrennung von Stoffgemischen durch Pharmaka, Drogen.... unterschiedliche Verteilung in mobiler
und stationärer Phase
Extraktion Abtrennung hydrophober von Löslichkeit in organ. Lösungsmittelnhydrophilen Substanzen
ChromatographieUnterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei verschiedenen Phasen, genauer gesagt an den Phasengrenzflächen dera) stationären (unbeweglichen) Phase, b) mobilen (beweglichen) Phase
Voraussetzung: Beide Phasen sind nicht mischbar
Man unterscheidet zwischen:Dünnschichtchromatographie, PapierchromatographieSäulenchromatographie
Trennprinzipien:• Adsorptionschromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Gelchromatographie• Affinitätschromatographie
Rf-Wert:Laufstrecke der Substanz ab StartlinieLaufstrecke der Lösungsmittelfront ab Startlinie
Dünnschichtchromatographie
Stationäre Phase:meist polares Adsorbens in Solvathülle (dünne Wasserschicht)(z.B. Kieselgel, Al2O3)
Mobile Phase (Fließmittel):Gemisch organischer Lösungsmittel
Messgröße zur Auswertung:Retentionswert Rf
SäulenchromatographiePrinzip Ionenaustausch
Man unterscheidet:AnionenaustauscherKationenaustauscher
Stationäre Phase:org. Ionenaustauscherharze, tragen elektrostatisch gebundene OH-- bzw H+-Ionen
Mobile Phase (Fließmittel):Wässrige Lösung, Säure bzw. Lauge zur Regeneration
SäulenchromatographiePrinzip Gelchromatographie
Je größer ein Teilchen ist, umso schneller wandert es bei der Gelchromatographie durch die Säule (umgekehrter Siebeffekt)
Stationäre Phase:Poröse (schwammartige) Trägermaterialien von einheitlichen Durchmesser (z.B. aus Polydextran, Agarose, Polyacrylamid)
Mobile Phase (Fließmittel):z.B. wässriger Puffer
hochmolekulare Substanzen im Ausschussvolumen V0niedermolekulare Substanzen im Totalvolumen Vt
ChromatographieEine Automatisierung chromatographischer Methoden führt generellauch zu einer Ankopplung an ein analytisches Nachweisverfahren hierbei in Form eines entsprechenden Detektorssolche chromatographischen Systeme können folgendermaßen benannt sein:HPLC High Performance Liquid ChromatographyLC Liquid ChromatographyGC Gas ChromatographyBei der Vielzahl möglicher Detektionsformen spielt vor allem die Massenspektroskopie (MS) ein besondere Rolle.In Kombination mit GC: GC-MSDurch Elektronenstoß entstehen bei der MS positiv geladene Fragmente einer Substanz, die in charakteristische Größe und Anzahl auftreten (molek. Fingerabdruck)
Elektrophorese: SerumelektrophoreseWanderung in Lösung befindlicher Teilchen beim Anlegen einer Gleichspannung
Geschwindigkeit der Moleküle ist proportional der Feldstärkeund der Molekülladung und umgekehrt proportional der Molekülgröße
Serumelektrophoreseauf Celluloseacetatfolie als Trägermaterial
Elektrophorese: SDS-PAGE
PAGE: Polyacrylamid-GelelektrophoreseSDS: Natrium-Dodecylsulfat, amphophile Substanz, die sich mit zu untersuchenden Proteinen verbindet, negative Außenladung, Wanderungsgeschwindigkeit nur noch von Molekülmasse abhängig
Analytische Verfahren in der Klinischen Chemie
Beispiel Prinzip
Potentiometrie pH-Messung Potentialmessung
Coulometrie Coulometrische Chlorid-Bestimmung Messung der Strommenge
Kryoskopie Osmolalität von Serum/Urin Gefrierpunktserniedrigung
Optische Messmethoden
Photometrie Protein-Bestimmung mit Messung der Absorbance(Spektrometrie) Biuretreagenz
Flammenphotom. Natrium im Serum/Urin Messung der Lichtemission
Atomabsorptions- Kupfer im Urin Messung der atomarenspektrometrie Absorption
Densitometrie Elektrophoreseauswertung Messung der Lichtdurchlässigkeit
Turbidimetrie Immunglobulin-Bestimmung Trübungsmessung
Nephelometrie Streulichtmessung
Fluorimetrie DNA/RNA-Bestimmung Fluoreszenzmessung
Proteinbindung Tumormarker-Bestimmung Enzymimmunoassay
Empfindlichkeit analytischer Verfahren
Spektroskopie: Photometer (Grundbausteine)
Spektroskopie: (Geräteaufbau eines Einstrahlphotometers)
SpektroskopieLichtquellen
man unterscheidetzwischen:LinienstrahlerKontinuumstrahler
Ziel ist die Generierung monochromatischen Lichtes
Vom Photometer …
…zur modernen Laborstraße
Spektroskopie: Lambert-Beersches Gesetz
Absorbance A hat Messbereich von Null bis UnendlichI = I0 A = 0I = 0 A = Unendlich
Transmission T (I/I0) hat Messbereich von 0 bis 1
log 1/T = A
I = I0 T = 1 (%T = 100)I = 0 T = 0
log Io/I = A = ac x c x d
A: Absorbance (im Deutschen früher Extinktion E)(spektrales dekadisches Absorptionsmaß)
ac: Proportionalitätsfaktor (Extinktionskoeffizient)c: Schichtdicke in cmd: Konzentration in mol/l
Photometrie: Prinzipien
Direkte Photometrie Substanz ist farbig oder absorbiert im UV-Bereich: z.B. Neugeb.-Bilirubin, freies Hb
Indirekte Photometrie Analyt wird in Messreaktion zu photometrisch messbarem Produkt (z.B.enzymatisch) umgewandelt.(Glucose, Lactat, Ethanol...)
Berechnung erfolgt nach Lambert-Beer-Gesetz (ac=A/c x d) mittels Standard mit bekannter Konzentration
c(Probe) = A(Probe)/A(Standard) x c(Standard)
oder aus einer KalibrationskurveCAVE: Gültigkeit nur innerhalb des linearen Messbereichs
Konzentration Extinktion0,4 0,0671,2 0,1982,0 0,3293,2 0,5514,0 0,702
Photometrie: Prinzip
Photometrie: Prinzip
Gültigkeit des Lambert-Beer-Gesetzes nur für stark
verdünnte Lösungen: Keine gegenseitige
Beeinflussung chromo-phorer Gruppen
verschiedener Moleküle
Photometrie: Prinzipien
Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H.Im Gegensatz zu NAD(P)+ hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm
Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion:
Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP
Indikatorreaktion:
Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+
Hexokinase
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Absorption bei 340 nm korreliert mit gebildetem NADPH und mit Glucosekonzentration
FlammenphotometrieBestimmung von Natrium, Kalium Calcium, Lithium
Färbung einer nicht leuchtenden Flamme durch Alkali- und Erdalkalisalze aufgrund thermischer Anregung von Valenzelektronen. Freiwerdende Energie als Licht mit elementspezifischen Wellenlängen
Verwendung des Prinzips rückläufig im Vergleich zur Potentiometrie
a: Lösungsmittel verdampftorg. Verbindungen verbrennend: Zerfall von NaCl in freie Atome,die thermisch angeregt werden
Je mehr Atome in der Flamme vorhanden sind, umso intensiver ist die Flammenfärbung und damit die Emissionsstrahlung
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)Bestimmung von z.B. Kupfer, Selen, Zink, Schwermetalle
Hohlkathodenlampen (gibt es für ca. 60 Elemente) erzeugen elementspezifisches Licht
Atomisiertes Probenmaterial (aus Flamme, Graphitrohr)absorbiert monochromatisches für das zu bestimmende Element spezifisches Licht
Absorption als Maß für die Konzentration des entsprechenden Elementes in der Messlösung
PotentiometrieBeispiel der Glaselektrode zur pH-Messung
Messanordnung für Potentiometrie
(Ionen-sensitiv)
Messung eines Potentials erfolgt fast stromlosals Potentialdifferenz bezogen auf das Potential einer ReferenzelektrodePotentiometrische Messung erfordert somit:Messelektrode und Referenzelektrode mit ionenselektiver Membran.
Einstab-Glaselektrodemit H+-sensitiver Glasmembran
PotentiometrieDie ISE-Einheit zur Bestimmung von Natrium, Kalium und Chlorid
In nahezu jedem klinisch-chemischen Analysengerät befindet sich eine sogenannte ISE-Einheit.Diese Elektroden können aufgrund z.B. der Beschaffenheit ihrer Membran spezifisch die Ionenaktivität von Ionen wie Kalium, Natrium, Chlorid und im Bedarfsfall auch Calciummessen. Wichtigste Methode zur Bestimmung dieser Messgrößen.
z.B. Kalium-Elektrode mit spezieller ionenselektiver Kunstoffmembran, in welche das Antibiotikum Valinomycin eingebettet ist (bindet spezifisch Kalium-Ionen).
Indirekte ISE: Probe wird zuerst pipettiert und vorverdünnt (z.B. 1:20) in der ISE-Einheit gemessen.
Direkte ISE:Anwendung in Blutgasgeräten zurMessung aus Vollblut, keine Vorverdünnung
ISE- Chipmodul
Immunologische VerfahrenAntikörper
80%)
IgG IgM IgA IgD IgEProzent. Anteil am Serum Ig-Pool 70-75 10 15-20 <1 SpurenMolekulargewicht (x1000) 150 970 385(Dimer)
SerumelektrophoreseInformation aus densitometrischer Auswertung
polyklonal
monoklonal
IgG, IgA und IgM mit unterschiedlicher Verteilung
Immunologische VerfahrenImmunelektrophorese/ Immunfixation
Qualitative Methodezum Nachweis vonmonoklonalenImmunglobulinen
mittels monospezifischenAntiseren gegen
Anti-IgGAnti-IgAAnti-IgMAnti-KappaAnti-Lambda
Immunologische VerfahrenNephelometrie/ Turbidimetrie
Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α1-Mikroglobulin).
Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A)
Turbidimetrie: Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B)
(A) (B)
Immunologische VerfahrenHeidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen
Antigenüberschuss:Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus alle AG zu verküpfen.
Antikörperüberschuss:Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist.
Immunologische VerfahrenImmunoassay zur Messung zahlreicher Analyten (Proteine, Pharmaka...)
z.B. ELISAEnzyme linked immuno-adsorbent assay(photometrisches Detektionsprinzip)
Alternative Detektionsprinzipen(z.T. deutlich sensitiver als der enzymatische Substratumsatz):z.B.FluoreszenzChemiluminiszenz (LIA)Elektrochemiluminiszenz (ECLIA)
Immunologische VerfahrenSandwich-Assay
Einsatz eines „Capture“-Antikörpers und eines markierten ZweitantikörpersArt der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)
Immunologische Verfahrenkompetitiver ELISA
Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um BindungsstellenArt der Markierung gibt Detektionsprinzip vor
EnzymkinetikAnwendung in der Diagnostik von Erkrankungen
von Leber, Herz, Pankreas...
Für die Diagnostik und Verlaufskontrolle zahlreicher Erkrankungen werden in der Klinischen Chemie Aktivitätsbestimmungen von zahlreichen Enzymen durchgeführt.
Biochemische GrundlageEnzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktion durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie. Ohne Enzyme würden biochemische Reaktionen im Organismus nicht in nennenswertem Umfang ablaufen.
E + S ES E + P
Enzyme verlassen die katalysierte Reaktion unverändert.
Für den Einsatz in der Labordiagnostik ist weniger die biochemische Grundlage von Bedeutung als vielmehr der Bildungsort im Organismus und innerhalb der einzelnen Zelle und damit die Art der Freisetzung eines Enzyms.
Kinetischer TestErfassung der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umwandlung zur Bestimmung der Enzymaktivität. Messung der Enzymaktivität in U/l.
k1
k2
k3
Bedingungen für enzymatische Tests
Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich
Optimale SubstratkonzentrationOptimaler pH-WertOptimale CoenzymkonzentrationOptimale Konzentration von Aktivatoren
Definierte Temperatur (37°C)
Veränderung der Temperatur um 1° C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10%
Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit
Enzymkinetik nach Michaelis-Menten
Michaeliskonstante1)
2)
3)
Mit steigender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) zu1) Wenig Substrat, Enzymmoleküle vorwiegend noch frei2) Zunahme des Substrats, Hälfte der Enzyme frei, halbmaximale v3) Hohe Substratkonzentration, kein Enzym mehr zur Verfügung, maximale v.
weitere Substratzugabe erhöht v nicht
Messung der Enzymaktivität
Aufnahme einer Absorptions-Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit
Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH)
Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+
Messung der Absorptionszunahme (∆A) pro Zeiteinheit bei 340 nm (Zunahme der NADH-Konzentration)
LDH
Besonderheiten enzym. Tests
Der optische Test nach Warburg beruht auf der Oxidation von NADH bzw. der Reduktion von NAD+
Man unterscheidet: Einfacher optischer Test: z.B. LDH-Bestimmung
Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion:Direkte Messung der enzymatischen Reaktion ist nicht möglich(z.B. ALT)
L-Alanin + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Pyruvat
Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+
Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm (Abnahme von NADH)
LDH
ALT
Besonderheiten enzym. Tests
Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion:Direkte Kopplung von enzymatischer Reaktion und Indikatorreaktion nicht möglich (z.B. Creatinkinase (CK))
Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP
Hilfsreaktion
Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP
Indikatorreaktion
Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+
Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADPH)
CK
Hexokinase
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase