Immunologisches Labor
Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV
1
2
Facharztweiterbildung Nuklearmedizin
Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in ...
… der nuklearmedizinischen in-vivo- und in-vitro-Diagnostik unter Verwendung von organ-/zielgerichteten Radiodiagnostika …
… der Radiochemie und der gebietsbezogenen Immunologie
und Radiopharmakologie
3
Juristische Voraussetzungen
Laborrichtlinien KBV 5/1994Nuklearmediziner : RIA (entspr. Weiterbildung/Zeugnis)
Bei NON-RIA : Prüfung Fachkommission
Schriftwechsel KBV 2005 Immunologische Parameter unabhängig von Methode
( RIA , LIA , FIA etc ) durch Nuklearmediziner abzurechnen ,
falls Weiterbildung vorliegt
4
Fachliche Aspekte
Laborkolloquiumvon der KV eingesetztes Gremium
3-4 Mitglieder
( mind. 1 Laborarzt )
Fragenkatalog
Angaben von Kollegen
Inhalt Kolloquium
Immunologische MethodenRIA, LIA, FIA
Immunologisches Testprinzip
Interpretation der Ergebnisse
Rili-BÄK Qualitätsmanagement
Qualitätssicherung
41. Jahrestagung des BDN
Immunologische Messmethoden
Nürnberg, September 2012
In Kooperation mit:Euro-Labor-Freiburg
6
Dr. Hermann Butz,Drei-G-Consulting
Empfohlene Literatur
Sokolowski/Wood: Radioimmunoassay in Theorie und Praxis: nur noch antiquarisch erhältlich
L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage,gebraucht ca. 100 € bei Amazon, Kapitel 52.1: Immunchemische Techniken (S. 1915 – 1936)
Packungsbeilagen der jeweiligen Teste
Ausführlicheres Vortragsscript:
Euro-Labor Freiburg [email protected]
oder [email protected]
7
Klassisches Anwendungsgebiet von Immunoassays: Hormonanalytik
Hormonanalytik von Körperflüssigkeiten (in-vitro, ohne Probenaufbereitung)
Spezifischer Nachweis von Hormonkonzentrationen in Anwesenheit vieler anderer, zum Teil sehr ähnlicher Moleküle: hohe Spezifität gefordert Schlüssel-Schloss-Prinzip von Antigen-Antikörper-Reaktionen
Nachweis extrem niedriger Konzentrationen (10-6 bis 10-16 mol): hohe Signalstärke gefordert = hohe „spezifische Aktivität“ des
Signalträgers gefordert 125J (später weitere Signalträger: Enzyme, Fluoreszenz, Luminesz.)
• Erster Immunoassay: R. Yalow/S. Berson (1959): Nobelpreis 1977 Insulin-RIA, (kompetitiver IA, homogen)
• Heutiger Standard-IA: Sandwich-Immunoassay (nicht-kompetitiver IA, heterogen)
8
„Teilnehmer“ eines Immunoassay
Antigene (Analyte = zu bestimmende Substanz): Hormone (Proteohormone, Steroidhormone,...), Medikamente, ....
Antikörper: Y-Form mit Fab-Teil (Antigenspezifisch) und Fc-Teil (Speziesspezifisch), bindet spezifisch an „Ziel“-Antigene
Antigene und Antikörper bilden Ag-Ak-Komplexe nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip
Ag-Ak-“Reaktionen“ folgen dem Massenwirkungsgesetz (Ag-Ak)
Ag + Ak Ag-Ak Affinitätskonstante K = ------------------- (Ag) x (Ak)
hohe Affinitätskonstante = feste Bindung von Ag und Ak Hohe Analytische Sensitivität möglich
9
Bestandteile eines (Sandwich-)Immunoassays
Gesucht: variable Konzentration eines Ag
Messbar über:
• konstante Zahl von Ak im Immunoassay • Markierung des Ak AkÜberschuss
• Komplexbildung: Ag + AkÜberschuss Ag-Ak + Ak
• Trennung von gebundener Phase Ag-Ak und freier Phase Ak
gesuchte Antigenkonzentration = Menge des Signals in der gebundenen Phase = Ag-Ak
10
Moderne, heterogene IA: Vorwegnahme der Trennung von freier und gebundener Phase durch Kopplung eines Ak an eine Festphase
Festphase (Solid Phase): • Röhrchenwand • Kaverne einer Mikrotiterplatte• Kügelchen• Magnetische Partikel, Latex-Partikel, Glas-Partikel,....
Je kleiner und „beweglicher“ die Festphase, umso kürzer die Inkubationszeit
Wash
Freie Phase
Gebundene Phase
11
Markierung eines Ak mit geeignetem Signalträger
Signalgeber (Tracer): • Radioaktivität (125J, 3H: Gammacounter; 1-10 Minuten)• Enzyme (farblose Substrate farbige Produkte: Photometer (Lambert-Beer‘sches Gesetz; 10-20 Min.))• Lumineszenz (Acridiniumester, Luminol, (Enzym: Alkalische Phosphatase katalysiert Lichtreaktion): Luminometer; 1- 60 sec.)• Fluoreszenz (Fluorophore: Fluorometer; 1 sec.)
Wash
12
Signalarten
_
Farblose Substrate
Farbige Produkte
10 – 20 Minuten
RIA, IRMA,
_
_
E
MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium
AEH2O2 + NaOH
EIA, IEMA
LIA, ILMA
AE‘ + Licht (1-2 sec.)
_LIA, ILMA
TRAnregende Elektrode
Licht
Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....)
Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott
Elektro-CL: Roche
(MPO)
125J Wash Gammacounter
13
Signalarten
_
Farblose Substrate
Farbige Produkte
10 – 20 Minuten
RIA, IRMA,
_
_
E
MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium
AEH2O2 + NaOH
EIA, IEMA
LIA, ILMA
AE‘ + Licht (1-2 sec.)
_LIA, ILMA
TRAnregende Elektrode
Licht
Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....)
Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott
Elektro-CL: Roche
(MPO)
125J Wash Gammacounter
Keine der verschiedenen Signalarten (125J, Enzym,
Fluorophor, Luminophor) ist in der Summe aller Eigenschaften
der anderen eindeutig überlegen
14
EIA oder LIA oder FIA vs. RIA
Was unterscheidet einen RIA von den anderen IA
NUR die Signalart, sonst ist alles gleich !!!
Wer eine RIA abarbeiten und die Ergebnisse im klinischen Kontext bewerten kann, der kann auch mit nicht-Radioaktiven IA korrekt umgehen.
Welche konstruktiven Varianten von IA (RIA, EIA, LIA, FIA) gibt es ?
Nicht-Kompetitive IA vs. Kompetitive IA = IRMA vs. RIA
15
Bestandteile eines IA, Ablauf
„Standard“-Sandwich-Immunoassay: IRMA (Immun-RadioMetrischer Assay)• Ak1 an Festphase• Ak2 mit Signalträger (125J, andere Signalträger: analog)• Inkubation mit Probenantigenen• Waschschritt• Messung
Wash
16
Darstellung der Ag-Ak-Komplexe
Y
Y Vereinfachte Darstellung
Bisherige Darstellung
17
YY
YY
Y.............
SP-AK1 im Überschuss
.............
Signal-AK2 im Überschuss
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Wash
0 1 2 3 4 5 6
Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
18
YY
YY
Y.............
SP-AK1 im Überschuss
.............
Signal-AK2 im Überschuss
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Analyt im Unterschuss
Wash
0 1 2 3 4 5 6
Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
Relative untere Nachweisgrenze: 1
Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)
19
YY
YY
Y.............
SP-AK1 im Überschuss
.............
Signal-AK2 im Überschuss
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Analyt im Unterschuss
Wash
0 1 2 3 4 5 6
Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
Relative untere Nachweisgrenze: 1
Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)
20
YY
YY
Y.............
SP-AK1
.............
Signal-AK2Analyt
Wash
.............
Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
Maximales Signal
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
0 1 2 3 4 5 6
6 5 4 3 2 1 0
Relative untere Nachweisgrenze: 1
Linear und proportional ansteigendeStandardkurve (Steigung: 1)
21
Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Störung eines IRMA: High-Dose-Hook-Effekt
YY
YY
Y.............
SP-AK1 im Unterschuss
.............
Signal-AK2 im Unterschuss
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
0 1 2 3 4
6 5 4 3 2 1 0
Analyt im hohen Überschuss
.............
Wash
.............
.. ..
Maximales Signal
Bei extremen Analytkonzentrationen (z.B. hCG bei Blasenmole) steigt die Zahl von „einzelnen“ AK-Ag-Komplexen (vgl. Heidelberger Kurve) = eine steigende Anzahl von Ag-Signal-Ak-Komplexen wird weggewaschen. Das Mess-Signal (SP-AK1-Ag-Signal-Ak2) sinkt trotz steigender Analytkonzentration. Ein Signal (hier: relatives Signal „3“) kann zu mehreren Konzentrationen gehören (relative Konzentration „3“ oder zu einer extrem hohen Konzentration x).Hilfe: Wash nach SP-Ak1-Ag-Inkubation oder Verdünnungen herstellen und vermessen
x
22
Sandwich-Technik für alle Antigene geeignet ? NEIN !!!
Bestimmung von Steroiden oder Schilddrüsenhormonen ?
Östradiol: MG 272,3 Da
T4: MG 776,9 Da
Sehr kleine Analyte haben nur 1 Epitop, Bindung eines zweiten (Signal-) Antikörpers
an den Analyten ist nicht möglich andere Assaytechnik ist gefordert Markierung des Antigens (Assay-Ag: Ag ) kompetitive Immunoassays
Solid Phase
23
Kompetitive Immunoassays:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
SP-AK
Gesucht: Konzentration des Analyten in der Probe via Ag
Prinzip: Proben-Antigen und markiertes Assay-Antigen konkurrieren um die Bindungsplätze am Antikörper und belegen sie entsprechend ihrer Konzentrationsverhältnisse.Das Messsignal ist am höchsten, wenn kein Probenantigen vorhanden ist. Mit steigender Anzahl von Probenantigen werden immer mehr markierte Assay-Antigene verdrängt und das Messignal sinkt: Konzentrationsbestimmung möglich!
24
Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
SP-AK
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
0 1 2 3 4 5 6SP-AK im Unterschuss
Markierter Analyt im Überschuss
25
Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
SP-AK
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
0 1 2 3 4 5 6
Wash
SP-AK im Unterschuss
Markierter Analyt im Überschuss
26
Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
SP-AK im Unterschuss
Markierter Analyt im Überschuss
Analyt in der Probe
0 1 2 3 4 5 6
Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3
Ag-Probe Ag-Assay
27
Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
SP-AK im Unterschuss
Markierter Analyt im Überschuss
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Analyt in der Probe
0 1 2 3 4 5 6
Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3
Wash
Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!)
28
Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell:Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung
YY
YY
SP-AK im Unterschuss
Markierter Analyt im Überschuss
Analyt in der Probe
Konzentrationsverhältnis: 18 : 6 = 3 : 1
0 1 2 3 4 5 6
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision)
Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!)
Wash
29
Sandwich-IA vs. kompetitiver IA = IRMA vs. RIA
0 1 2 3 4 5 6
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
6 5 4 3 2 1 0
Relatives Signal
Relative Konzentration:Standards (Analyt)
0 1 2 3 4 5 6
6 5 4 3 2 1 0
IRMA: • Relative untere Nachweisgrenze: 1 • Linear und steil ansteigende Standardkurve (= sehr gute Präzision)• Breiter Messbereich (Ak1,2-Erhöhung) mit sehr guter Präzision
RIA: • Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) • flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision)• eingeschränkter Messbereich mit akzeptabler Präzision
30
Zusammenfassung:
• Sehr gute Sensitivität• Sehr gute Präzision• Sehr weiter Messbereich• Sehr gute Spezifität• Sehr schnell
• Gute Sensitivität• Gute Präzision• Weiter Messbereich• Gute Spezifität• Schnell
Ist der Analyt ein Hapten:Kompetitiv = RIA
Ist der Analyt groß genug:Nicht-Kompetitiv = IRMA
RIA‘s unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA
Verschiedene (+/- gleichwertige) Signalarten
31
Vielen Dank für
Ihre Aufmerksamkeit !
32
33
Rili-BÄK
Aktuell = 4. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (gültig seit 15.02.2008)
Sie gilt für jeden, der analytische Messungen durchführt und stellt eine Vielzahl komplexer Anforderungen an das Management und das Personal in Laboren und Praxen!
Der heutige Fokus liegt auf Teil A und Teil B1 der Rili-BÄK:
Teil A betrifft die grundlegenden Anforderungen an die Qualitätssicherung
Teil B1 die QS quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen
34
Rili-BÄK
Teil A der Richtlinie fordert die Erstellung eines umfassenden Qualitätsmanagement-Systems zur Regelung der folgenden Bereiche:
1. Struktur (Organigramm, Zuständigkeiten…)2. Technische- und Personelle Ressourcen (Räume, Ausrüstung…)3. Präanalytik (Gewinnung, Transport, Vorbereitung Probenmaterial…)4. Analytik (Standardisierte Arbeitsanleitungen, Validierte
Untersuchungsverfahren…)5. Postanalytik (technische und medizinische Validation, Laborbericht…)6. Qualitätsmanagementhandbuch (QM-Ziele & Strategien,
Arbeitsprozesse…)7. Dokumentenlenkung (Versions-Nr., Freigabe, Schulung…)8. Umgang mit Beschwerden (Dokumentation, Korrekturmaßnahmen…)9. Fremdlaboratorien (Versanddokumentation, Kontrolle…)10.Fehlerhaften Untersuchungsergebnisse (Verfahrensbeschreibung…)
35
Rili-BÄK
Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS
Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a
1 lfd.
2 Analyt
3 Zulässige relative Abweichung des Einzelwertes bzw. des relativen quadratischen Mittelwertes
4 Gültigkeitsbereich der Spalte 3 und 5
5 Zulässige relative Abweichung beim Ringversuch
6 Zielwertart beim Ringversuch
von bis Einheit
57 Thyreotropes Hormon TSH
13,5 % 0,1 40 mU/l 24,0 % SW
59 freies Thyroxin fT4 14,0 % >20 >26
85 109
ng/l pmol/l
24,0 % SW
15,0 % 2 2,6
≤ 20 ≤ 26
ng/l pmol/l
63 freies Trijodthyronin fT3
14,5 % 1 1,5
25 39
ng/l pmol/l
24,0 % SW
SW = messmethodenspezifischer Sollwert
36
Rili-BÄK
Interne QS: alle vom medizinischen Laboratorium durchgeführten quantitativen Untersuchungen unterliegen der internen Qualitätskontrolle
Tabelle B1 Parameter
Non-B1 Parameter
Festgelegte Fehlergrenze gem. Tabelle B1/Sp3
Ermittlung der laborinternen FehlergrenzeMessung von mind. 15 Kontrollprobenwerten an 15 Tagen; zwischenzeitlich gelten die Herstellergrenzen
Retrospektiv: Nach Beendigung des Kontrollzyklus ist der relative quadratische Mittelwert der Messabweichung
(QMDM) zu errechnen
Zeitnah: Kontrollprobeneinzelmessung
37
Rili-BÄK
Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS
Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a
1 lfd.
2 Analyt
3 Zulässige relative Abweichung des Einzelwertes bzw. des relativen quadratischen Mittelwertes
4 Gültigkeitsbereich der Spalte 3 und 5
5 Zulässige relative Abweichung beim Ringversuch
6 Zielwertart beim Ringversuch
von bis Einheit
57 Thyreotropes Hormon TSH
13,5 % 0,1 40 mU/l 24,0 % SW
59 freies Thyroxin fT4 14,0 % >20 >26
85 109
ng/l pmol/l
24,0 % SW
15,0 % 2 2,6
≤ 20 ≤ 26
ng/l pmol/l
63 freies Trijodthyronin fT3
14,5 % 1 1,5
25 39
ng/l pmol/l
24,0 % SW
SW = messmethodenspezifischer Sollwert
38
Rili-BÄK
Konsequenz bei nicht Einhaltung der zulässigen relativen Abweichung
Überschreitet ein Kontrollprobeneinzelmesswert die vorgegebene Fehlergrenze, ist das Messverfahren vorläufig gesperrt; es muss nach der Ursache der Abweichung gesucht und diese beseitigt werden; die Messung wird wiederholt.
Überschreitet der relative quadratischen Mittelwert der Messabweichung (QMDM) einer Kontrollprobe, den in Tabelle B1a-c/Sp3 angegebenen oder den laborintern ermittelten Wert, ist das Untersuchungsverfahren für weitere Messungen von Patientenproben zu sperren. Das Messverfahren kann erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Funktionsfähigkeit des Verfahrens durch geeignete Maßnahmen festgestellt wurde.
Alle QS- Maßnahmen müssen lückenlos dokumentiert werden.
39
Rili-BÄK
Externe Qualitätssicherung (Ringversuche)
Für alle durchgeführten Analysen, der in Tabelle B1 a-c aufgeführten Parameter, ist die Teilnahme an einem Ringversuch pro Quartal Pflicht.
Die vollständige Richtlinie (incl. Tabelle B1a bis c) erhalten Sie auf der Homepage der Bundesärztekammer unter www.bundesaerztekammer.de
Für weitere Informationen und/oder die Zusendung des Scripts können Sie gerne Frau Regina Clotten (QMB euro-labor) unter der E-Mail Adresse: [email protected] kontaktieren.
40
Kooperations-Möglichkeiten
Kostenbetrachtung
Reduzierung der Vergütung für SD-Parameter (GKV-EBM) 2000 und 2006 um je 30-60 !!!
„Herstellungskosten“ für Immunologische Parameter konstant / steigend (Personal, Geräte, Miete...)
Rili-BÄK – Zusätzliche Kosten!!!
Teil A: Qualitätsmanagemant (Handbuch etc.)
Teil B: Interne + Externe Qualitätskontrollen
z.B. 15-20 SD-Patienten/Tag >> 20 – 30.000,- € Kosten/Jahr
41
Kooperations-Möglichkeiten
Optimale Teste für SD-Parameter (unabh. Von Methode, Preis etc.)
> Eigenständiges Immunologisches Labor
> Mehrere Analysegeräte für unterschiedliche SD-Parameter
> Kontroll-Möglichkeiten für jeden einzelnen einsendenden Arzt
> Auswahl nach aktueller Qualität
(Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Ablauf etc.)
Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t
42
Kooperations-Möglichkeiten
Immunologische Laboratorium-Untersuchung
I Ärztlich Untersuchungsentscheidung (Indikation)
III Laboratoriumsmedizinische Analyse
II Präanalytik
IV ärztliche Beurteilung
43
Kooperations-Möglichkeiten
Immunologische Laboratorium-Untersuchung
Indikationsstellung, Präanalytik (Schritt I+II)
Qualitätsprüfung (Korrelation mit anderen Parametern, Verlauf, Therapiebeeinflußung etc.)Befundung (Schritt IV)
Immunologische Laboratorium-Untersuchung
in eigener Praxis
44
Kooperations-Möglichkeiten
Immunologische Laboratorium-Untersuchung
Technische Leistung (Schritt III) =
Laboratoriumsmedizinische Analyse
(zentral erbracht)
Immunologische Laboratorium-Untersuchung
„im ausgelagertem Labor“
45
Kooperations-Möglichkeiten
Eigenständiges Abrechnen
Modell „Immunologie Freiburg“
Erste von der KV genehmigte überörtliche Leistungserbringergemeinschaft zur Erbringung immunologischer Untersuchungen in Deutschland
Schritte I, II, IV in eigener Praxis
Schritt III in Rahmen „Immunologie Freiburg“
46
Kooperations-Möglichkeiten
eigenständiges Abrechnen
Systematik des §15 Abs. 3 BMW-Ä:
Die Leistung wird als eigene Leistung desjenigen Arztes abgerechnet, wenn Schritt 1, 2, 4 in eigener Praxis und Schritt 3 in Rahmen der Leistungserbringergemeinschaft „Immunologie Freiburg“ im Auftrag des Arztes durch einen anderen erbracht wird.
Mitgliedschaft in „Immunologie Freiburg“ bedeutet eigenständige Leistungserbringung!