Tierärztliche Hochschule Hannover
Zentrum für Infektionsmedizin
Institut für Mikrobiologie
Identifizierung neuer virulenzassoziierter
Faktoren von Haemophilus parasuis und
Entwicklung einer Multiplex-PCR
INAUGURAL - DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
- Dr. med. vet. -
vorgelegt von
Meike Sack
aus Wilhelmshaven
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. N. Baltes
1. Gutachten: Prof. Dr. N. Baltes
2. Gutachten: PD Dr. I. Hennig-Pauka
Tag der mündlichen Prüfung: 4. November 2008
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Akademie für Tiergesundheit (AfT).
"Gehör ich doch zu den Narren,
die nach inwendig gucken,
wo bekanntermaßen nur spärlich beleuchtet wird."
Wilhelm Busch
Folgende Teile der vorliegenden These wurden bereits publiziert:
Sack, M. und Baltes, N. (2008) Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis Jahrestagung der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“ 25.-27. Juni 2008, Braunschweig, Deutschland
Sack, M. und Baltes, N. (2008) Identification and Characterization of New Virulence Associated Factors of Haemophilus parasuis, 108th General Meeting of the American Society for Microbiology 01.-05. Juni 2008, Boston, USA
Inhalt
A Einleitung ............................................................................................................13
B Schrifttum ...........................................................................................................14
1 Haemophilus parasuis ....................................................................................14
1.1 Allgemeine Eigenschaften ....................................................................... 14
1.2 Charakterisierung des Erregers ............................................................... 15
1.2.1 Nachweis des Erregers ...................................................................16
1.2.2 Virulenzfaktoren ..............................................................................18
1.2.2.1 Neuraminidase ............................................................................. 18
1.2.2.2 Eisenrezeptoren ........................................................................... 18
1.2.2.3 Fimbrien ....................................................................................... 20
1.2.2.4 Kapsel .......................................................................................... 20
1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide ..................................... 20
1.2.2.6 Toxine .......................................................................................... 21
1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren .......................................... 22
1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren ....................................................................................... 22
1.2.3 Typisierung von H. parasuis ............................................................24
1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden .......................................... 24
1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden ........................................ 27
1.2.3.3 Serologische Methoden ............................................................... 29
1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden ........................................... 30
1.2.4 Tiermodelle ......................................................................................31
2 Ziel der Studie .................................................................................................35
C Material und Methoden .......................................................................................36
1 Material ...........................................................................................................36
1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien ............................................. 36
1.2 Lösungen und Puffer ............................................................................... 36
1.3 Bakterienstämme ..................................................................................... 36
Inhalt
2 Methoden ........................................................................................................36
2.1 Mikrobiologische Methoden ..................................................................... 36
2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen .....................................36
2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen............................................36
2.2 Molekularbiologische Methoden .............................................................. 37
2.2.1 Arbeiten mit DNA .............................................................................37
2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA ................................................ 37
2.2.1.2 Plasmidpräparationen .................................................................. 38
2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion .......................................................... 39
2.2.1.3.1 Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR .................41
2.2.1.4 Primer .......................................................................................... 42
2.2.1.5 Agarosegel-Elektrophorese .......................................................... 42
2.2.1.6 Polyacrylamidgel-Elektrophorese ................................................. 42
2.2.1.7 Koloniegel .................................................................................... 43
2.2.1.8 Klonierung .................................................................................... 43
2.2.1.8.1 Restriktionsenzymverdau ......................................................43
2.2.1.8.2 Ligation ..................................................................................44
2.2.1.9 Transformation ............................................................................. 44
2.2.1.10 Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen .............................. 45
2.2.1.11 Repräsentative Differenzanalyse ................................................. 45
2.2.1.12 Markieren von Gensonden mit 32P-dCTP ..................................... 48
2.2.1.13 Southern Blot ............................................................................... 48
2.2.1.14 Southern Transfer ........................................................................ 48
2.2.1.15 Southern Hybridisierung ............................................................... 49
2.2.1.16 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse .................................. 50
2.2.2 Arbeiten mit RNA .............................................................................50
2.2.2.1 Präparation von RNA ................................................................... 50
Inhalt
2.2.2.2 Reverse Transkriptase-PCR ........................................................ 50
2.2.3 Arbeiten mit Proteinen .....................................................................51
2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ............. 51
2.2.3.2 Ganzzelllysate .............................................................................. 51
2.2.3.3 Massenspektrometrie ................................................................... 52
2.2.3.4 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry ...................................................................... 53
2.2.3.5 Electro-Spray Injection Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry ................................................................................ 54
2.3 Infektionsversuche an Schweinen ........................................................... 55
2.3.1.1 Zeitplan ........................................................................................ 55
2.3.1.2 Herkunft und Unterbringung der Schweine .................................. 55
2.3.1.3 Präparation der Bakterien für die Infektion ................................... 56
2.3.1.4 Aerosolinfektion............................................................................ 56
2.3.1.5 Intratracheale Infektion ................................................................. 57
2.3.1.6 Überwachung während des Experiments ..................................... 57
2.3.1.7 Euthanasie und Sektion ............................................................... 57
2.3.1.8 Reisolation von H. parasuis ......................................................... 58
2.3.1.9 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ........................................ 59
D Ergebnisse .........................................................................................................60
1 Isolierung H. parasuis spezifischer Fragmente mittels Repräsentativer Differenzanalyse .............................................................................................60
1.1 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente ...................................... 61
1.2 Homologiesuche und PCR ...................................................................... 62
1.3 Vorkommen der H. parasuis Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) –spezifischen Fragmente in Referenz- und Feldstämmen ......................... 66
2 Proteomanalysen mittels SDS-PAGE .............................................................76
3 Proteomuntersuchungen mittels Massenspektrometrie ..................................78
3.1 MALDI-TOF-Analysen ............................................................................. 79
Inhalt
3.2 Q-TOF-Analysen ...................................................................................... 82
4 Entwicklung einer Multiplex-PCR ....................................................................84
4.1 Primerkonstruktion ................................................................................... 84
4.2 Überprüfung der Spezifität ....................................................................... 84
4.3 Optimierung der PCR-Bedingungen ........................................................ 86
4.4 Interne Kontrolle ...................................................................................... 86
4.5 Überprüfung der Referenzstämme .......................................................... 87
4.6 Überprüfung der aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämme ..... 89
1.1 Überprüfung der systemisch isolierten Feldstämme ................................ 90
1.1 Überprüfung der nasal isolierten Feldstämme ......................................... 91
4.7 Überprüfung weiterer Feldstämme .......................................................... 92
5 Infektionsversuch am Schwein mit H. parasuis ...............................................95
5.1 Infektion mit dem Referenzstamm für Serotyp 12 .................................... 95
5.2 Klinische Symptome in den belasteten Tieren ......................................... 95
5.3 Pathomorphologische Veränderungen .................................................... 96
5.4 Reisolierung von H. parasuis, Referenzstamm für Serotyp 12 ................ 98
5.5 PCR-Untersuchungen der reisolierten Stämme ....................................... 99
5.5.1 Untersuchung der reisolierten Stämme mittels Multiplex-PCR ......101
E Diskussion ........................................................................................................102
1 Identifizierung von virulenzassoziierten Genen .............................................102
2 Entwicklung einer Multiplex-PCR ..................................................................107
3 Identifizierung von Stamm spezifischen Proteinen .......................................111
4 Infektionsversuch ..........................................................................................115
F Zusammenfassung ...........................................................................................121
G Summary ..........................................................................................................123
H Literaturverzeichnis ..........................................................................................125
I Anhang .............................................................................................................137
Inhalt
1 Verbrauchsmittel und Chemikalien ...............................................................137
2 Lösungen und Puffer.....................................................................................142
3 Eingesetzte Stämme .....................................................................................147
4 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der PCR-Untersuchungen ...........................................................................................149
5 Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchungen ........................158
6 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse des Tierversuchs ............160
7 Tabellenverzeichnis ......................................................................................163
8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................165
Abkürzungen
Abkürzungsverzeichnis
® registered trademark (eingetragenes Warenzeichen) (v/v) volume per volume (Volumen pro Volumen) (w/v) weight per volume (Gewicht pro Volumen) A. Actinobacillus Abb. Abbildung Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. circa cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) Ci Curie dCTP 2‘-Desoxy-Cytosin-5‘-Triphosphat ddRT-PCR differential display reverse transcription PCR DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2‘-Desoxy-Nucleotid-5‘-Triphosphat dUTP 2‘-Desoxy-Uridin-5‘-Triphosphat E. coli Escherichia coli et al. et alii (und andere) g Erdbeschleunigungskonstante H. Haemophilus HAD Haloacid Dehalogenase k kilo kb Kilobasenpaare (103 Basenpaare) KBE Kolonie bildende Einheiten kDa Kilodalton LOS Lipooligosaccharide LPS Lipopolysaccharide M Molarität (mol/l) M. Mannheimia min. Minuten mM millimolar (mmol/l) NAD Nikotinamidadenindinukleotid nm Nanometer OD optische Dichte P. Pasteurella PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) RDA Repräsentative Differenzanalyse RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
(Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR s. siehe SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese sek. Sekunden
Abkürzungen
SPF spezifisch pathogenfrei ssp. subspecies (Subspezies) Tab. Tabelle U unit UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen
A Einleitung 13
A Einleitung
Haemophilus (H.) parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit, einer fiebri-
gen Allgemeinerkrankung von Schweinen, die im klassischen Erscheinungsbild mit
einer Polyserositis, Meningitis und Arthritis einhergeht. Weitere Erscheinungsformen,
z. B. Pneumonie oder perakute Septikämie, wurden beschrieben und auch symptom-
lose Besiedlungen des oberen Respirationstraktes kommen vor. H. parasuis-Infek-
tionen treten weltweit auf und sind verantwortlich für große wirtschaftliche Verluste,
die vor allem Betriebe mit hohen Hygienestandards betreffen. Trotz einer nahezu
vollständigen Durchseuchung der Herden mit H. parasuis kommt es durch Stress
oder den Eintrag eines anderen Stammes zu Krankheitsausbrüchen.
H. parasuis ist ein gramnegatives, NAD abhängiges Stäbchen der Familie der
Pasteurellaceae. Für die 15 beschriebenen Serotypen konnte eine Korrelation
zwischen Serotyp und Virulenz bislang nicht nachgewiesen werden, und einzelne
Stämme derselben Serotypen verhalten sich äußerst heterogen. Die Diagnostik wird
dadurch erschwert, dass in einer Herde oder sogar von Einzeltieren oftmals die
Isolation mehrerer Stämme gleichzeitig gelingt. Über die Virulenzfaktoren und Patho-
genitätsmechanismen des Erregers ist bislang wenig bekannt.
Zum jetzigen Zeitpunkt ist zwar eine Speziesdiagnose möglich, nicht jedoch die Aus-
sage über das Virulenzpotenzial einzelner Stämme. Daher beschäftigt sich diese
Studie mit der Identifizierung möglicher neuer Virulenzfaktoren von H. parasuis, wel-
che zur Entwicklung einer diagnostischen Multiplex-PCR verwendet wurden. Diese
ermöglicht sowohl den Speziesnachweis als auch den Nachweis dreier virulenzasso-
ziierter Gene. Zur Identifizierung geeigneter Kandidatengene wurde eine Repräsen-
tative Differenzanalyse mit den Referenzstämmen der Serotypen 5 und 11 sowie ein
Vergleich des Proteinexpressionsmusters verschiedener Stämme durchgeführt.
Da für eine funktionelle Charakterisierung der identifizierten Gene in vivo-Unter-
suchungen notwendig sind, wurden erste Versuche zur Etablierung eines Tiermo-
dells mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 im Schwein unternommen.
B Schrifttum 14
B Schrifttum
1 Haemophilus parasuis
1.1 Allgemeine Eigenschaften
H. parasuis ist der Erreger der Glässerschen Krankheit (auch Glässer’s disease,
Transportkrankheit, Glässersyndrom oder „porcine polyserositis and arthritis“), wel-
che 1910 zum ersten Mal von Glässer als fibrinöse Pleuro-Perikardio-Peritonitis be-
schrieben wurde (GLÄSSER 1910) und als deren Verursacher seit 1943 H. suis galt
(HJÄRRE u. WRAMBY 1943). Die Beobachtung, dass nicht alle Stämme von H. suis
Hämin (X-Faktor) für ihr Wachstum benötigen, führte 1963 zur Abgrenzung des
Erregers Haemophilus parasuis (BIBERSTEIN et al. 1963), welcher nur NAD-abhän-
gig ist (V-Faktor). Eine erste Beschreibung erfolgte 1969 durch Biberstein und White
(BIBERSTEIN u. WHITE 1969).
Die Glässersche Krankheit ist weltweit verbreitet, so wurde beispielsweise über Fälle
in Deutschland (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), Dänemark (ANGEN et
al. 2004), Spanien (RUBIES et al. 1999), USA (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004; RAPP-
GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), Kanada (RAPP-GABRIELSON u.
GABRIELSON 1992), Japan (MOROZUMI u. NICOLET 1986a) und Australien
(BLACKALL et al. 1996) berichtet. Es handelt sich um eine infektiöse Fakto-
renkrankheit, die entweder gemeinsam mit anderen Erregern von Atemwegserkran-
kungen als Mischinfektion, jedoch auch als Monoinfektion auftritt (KIELSTEIN et al.
1991b). Nahezu alle Schweinebetriebe sind mit H. parasuis infiziert und im Zusam-
menhang mit Stress (z.B. durch das Absetzen, Umstallen oder Transportieren) kann
es zu akuten Krankheitsausbrüchen kommen, die z. T. mit hohen wirtschaftlichen
Verlusten einhergehen. Zudem verursacht der Erreger in Betrieben mit einem hohen
Hygienestatus zunehmend Probleme, wenn naive Tiere mit Keimträgern gemeinsam
aufgestallt werden oder durch Zukauf von Tieren ein neuer Stamm eingetragen wird.
Bei dem typischen Krankheitsbild der Glässerschen Krankheit handelt es sich um
eine fiebrige Allgemeinerkrankung von Schweinen, die mit serofibrinösen Entzün-
B Schrifttum
15
dungen der serösen Häute einhergeht. Häufig betroffen sind Pleura und Peritoneum,
aber auch das Perikard. Weitere Erscheinungsformen sind nichteitrige Entzündungen
der Meningen mit entsprechenden neurologischen Symptomen, Arthritis mit Bewe-
gungsunlust und Lahmheit, Husten und Dyspnoe und in akuten Fällen auch eine
Septikämie, gefolgt von plötzlichen Todesfällen (AMANO et al. 1994; RAFIEE et al.
2000; SMART et al. 1993). Vornehmlich betroffen sind Ferkel, deren Empfänglichkeit
mit steigendem Alter sinkt (BAK u. RIISING 2002). Da eine klinische Erkrankung
durch Stress begünstigt wird, kommt es häufig bei Absetzern zu Ausbrüchen.
H. parasuis gilt jedoch nicht als obligat pathogen, da er häufig auch bei klinisch
gesunden Tieren aus den oberen Atemwegen isoliert werden kann (MOLLER u.
KILIAN 1990). Da die Pathogenitätsmechanismen des Erregers bislang weitgehend
ungeklärt sind und das Virulenzpotenzial einzelner Stämme derzeit nicht definiert
werden kann, ist die Rolle von H. parasuis im Zusammenwirken mit anderen fakul-
tativ pathogenen Keimen bei Erkrankungen ungeklärt.
Im Falle eines Krankheitsausbruches erfolgt eine antibiotische Behandlung der Tiere
zumeist mit Penicillin (MEISTERMANN 2006), zur Prophylaxe steht in Deutschland
eine auf Serotyp 5 basierende Vakzine zur Verfügung (Porcilis® Glässer, Intervet).
Desweiteren werden ebenfalls bestandsspezifische Vakzine verwendet.
1.2 Charakterisierung des Erregers
H. parasuis gehört zur Familie der Pasteurellaceae. Es handelt sich um gramne-
gative, kokkoide, unbewegliche Stäbchen mit gelegentlicher Fadenbildung. Bakos
beschrieb eine Neigung zur Dissoziation, wobei es bei den einzelnen Formen zur
Bildung einer Kapsel kommen kann, deren Nachweis z.B. durch eine Kapselfärbung
erfolgt (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955). Die M-Form (mukoid) weist große und
schleimige Kolonien auf, die teilweise konfluieren und eine glänzende Oberfläche
zeigen. Die Bakterien haben eine vollständige Kapsel. Die S-Form (smooth) zeigt
sich anhand von kleinen, feinen und nicht konfluierenden Kolonien und wird noch
einmal in die S1-Form (Kapsel teilweise vorhanden) und die S2-Form (keine Kapsel)
unterteilt. Die R-Form (rough) hat die größten Kolonien mit teilweise gezackten
Rändern, eine Kapsel kommt nicht vor. Laut Bakos (BAKOS et al. 1952) besteht kein
B Schrifttum 16
Zusammenhang zwischen der Herkunft der Stämme und ihrer Morphologie. Münch
(MÜNCH 1993) hingegen stellte fest, dass kleinere Kolonien vor allem von Stämmen
gebildet werden, die aus Tieren mit Glässerscher Krankheit isoliert wurden, und
größere Kolonien vor allem aus klinisch gesunden Tieren.
Bis 1992 wurde der Erreger anhand von verschiedenen unabhängigen Untersu-
chungen in die Serovare A-D (BAKOS 1955), Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a),
1-7 (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) und ND1-ND5 (RAPP-GABRIELSON u.
GABRIELSON 1992) eingeteilt. Diese wurden dann jedoch nach dem Kielstein-
Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema zu 15 Serotypen zusammengefasst (KIELSTEIN
u. RAPP-GABRIELSON 1992). Tierversuche mit dem jeweiligen Referenzstamm
ergaben für die Serotypen 1, 5, 10, 12, 13 und 14 eine hohe Virulenz (Tod der Tiere),
für 2, 4 und 15 mittlere (Polyserositis), für 8 eine schwache und für 3, 6, 7, 9 und 11
keine Virulenz (s. B1.2.4). Eine Untersuchung von 290 Stämmen aus der ehemaligen
DDR ergab, dass 1992 Serotyp 5 (23,8 %) und 4 (17,2 %) die höchste Prävalenz
aufweisen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Dieses stimmt mit Ergeb-
nissen aus den USA und Kanada überein, wo sie mit einer Häufigkeit von 24,3 und
16,1 % vorkommen (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992), sowie Dänemark
(36 % und 22 %) (ANGEN et al. 2004) und Spanien (18,4 bzw. 16 %) (RUBIES et al.
1999). Da ein großer Teil der nach dem KRG-Schema untersuchten Stämme nicht
typisiert werden kann (26,2 % der Isolate der ehemaligen DDR), ist die Existenz von
weiteren Serotypen nicht ausgeschlossen.
1.2.1 Nachweis des Erregers
Der Nachweis von H. parasuis erfolgt zum einen kulturell auf NAD haltigen Nähr-
böden (Kochblutagar mit NAD-Zusatz oder Blutagar mit einer beta-hämolysierenden
Staphylokokken-Amme), die Isolierung ist jedoch schwierig und oft nicht erfolgreich
(CALSAMIGLIA et al. 1999). Aufgrund seines langsamen Wachstums wird der Keim
häufig durch andere Keime überwachsen, so dass der Nachweis auf molekularer
Ebene gerade aus stark kontaminiertem Probenmaterial (Nasen- oder Tonsillen-
tupfer) sinnvoll ist (CALSAMIGLIA et al. 1999). Obwohl allgemein angenommen wird,
dass ein einzelner Stamm für den jeweiligen Ausbruch verantwortlich ist, wird die
B Schrifttum
17
Diagnostik zusätzlich dadurch erschwert, dass in einem Betrieb oder sogar aus
einem Tier oftmals mehrere Stämme isoliert werden (OLVERA et al. 2006). Zur
Abgrenzung von anderen Spezies der Gattung Haemophilus des oberen Respi-
rationstraktes sind biochemische Untersuchungen notwendig, da sie sich in ihrer
Kulturmorphologie nicht ausreichend voneinander unterscheiden. H. parasuis ist
Katalase positiv, Indol und Urease negativ, anhämolysierend und kann Galaktose,
Glukuronsäure, Mannose, Maltose und Saccharose verwerten (MOLLER u. KILIAN
1990).
Eine von Oliveira (OLIVEIRA et al. 2001) entwickelte PCR amplifiziert mit den
Primern Hps-f und -r ein 821 bp großes Fragment aus der 16S rDNA von H. para-
suis. Die Methode weist eine hohe Sensitivität auf, zeigte aber auch Kreuzreaktionen
mit einigen Stämmen von Actinobacillus (A. indolicus, A. porcinus und A. minor).
Eine zweite PCR (ANGEN et al. 2007) amplifiziert mit drei Primern (HP1F3, HP2F2
und HP-Revx) ebenfalls aus der 16S rDNA ein 1086 bzw. 1090 bp großes Fragment.
Sie weist je nach Untersuchungsmaterial im Vergleich zur PCR von Oliveira zwar
eine niedrigere Sensitivität auf (kein Unterschied mit aufgereinigter DNA, jedoch eine
10 x niedrigere Sensitivität bei der Anwendung von Reinkulturen), hat sich jedoch als
100 % speziesspezifisch erwiesen.
Ein etwas aufwändigerer Erregernachweis gelingt mit einem Capture Plate
Hybridisation Assay (CALSAMIGLIA et al. 1999). Hierfür wird zunächst per PCR mit
universellen Bakterienprimern eine Gensequenz aus der 16S rDNA aller sich in der
Probe befindenden Bakterien amplifiziert. Hierbei wird das Amplifikat markiert, da
sich unter den zugefügten Nukleotiden auch mit Digoxigenin-11 markiertes dUTP
befindet. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten werden mit biotinylierten Oligo-
nukleotiden vorinkubiert, die die speziesspezifischen 16S rDNA Sequenzen von
H. parasuis beinhalten. Wird das PCR-Amplifikat auf diese Platten gegeben, binden
die H. parasuis spezifischen Anteile; diese werden mittels Peroxidase markierter
Antikörper gegen das Antidigoxigenin visuell sichtbar gemacht.
B Schrifttum 18
Alle drei PCR-Methoden ermöglichen zwar einen Speziesnachweis, nicht aber die
Detektion von virulenzassoziierten Faktoren.
Auch der Nachweis mittels Immunhistochemie (SEGALES et al. 1997) erlaubt nur
den Speziesnachweis und lässt ebenfalls keine Aussage über das Virulenzpotenzial
des jeweiligen Stammes zu, zudem treten Kreuzreaktionen mit A. pleuropneumoniae
auf. Aufgrund seiner Komplexität und des damit verbundenen Zeit- und Kostenauf-
wandes eignet sich diese Methode vor allem für wissenschaftliche Untersuchungen,
nicht jedoch für diagnostische Zwecke.
1.2.2 Virulenzfaktoren
1.2.2.1 Neuraminidase
Bislang ist wenig über die Virulenzfaktoren von H. parasuis bekannt. Lichtensteiger
und Vimr konnten 1997 eine Neuraminidaseaktivität nachweisen (LICHTENSTEIGER
u. VIMR 1997), da der Erreger aus Sialoglykokonjugaten Sialinsäure hydrolysiert,
welche er für sein Wachstum benötigt. Die Rolle des Enzyms in der Virulenz ist
bislang ungeklärt, möglicherweise dient es der Bereitstellung von Kohlenstoff und
Stickstoff, demaskiert Rezeptoren als Voraussetzung zur Adhäsion und Invasion
oder behindert die angeborene Immunabwehr des Wirtes (LICHTENSTEIGER u.
VIMR 2002). Bei Bacteroides fragilis und Streptococcus pneumoniae wurde beob-
achtet, dass die Inaktivierung der Neuraminidase zu abgeschwächter Virulenz führt
(GODOY et al. 1993; TONG et al. 2000) und es sich bei diesem Enzym um ein
protektives Antigen handelt (IFEANYI u. BAILIE 1992). Es gelang Lichtensteiger
2002 die Neuraminidase aus der Membranfraktion von H. parasuis aufzureinigen und
das Enzym zu reaktivieren (LICHTENSTEIGER u. VIMR 2002), das kodierende Gen
wurde bislang jedoch nicht identifiziert.
1.2.2.2 Eisenrezeptoren
Weitere bekannte Virulenzfaktoren sind transferrinbindende Proteine (TbpB und
TbpA, CHARLAND et al. 1995), die zu den Proteinen der äußeren Membran zählen
(OMPs, outer membrane proteins). Auch unter den Pasteurellaceae enthält die Grup-
pe der OMPs zahlreiche virulenzassoziierte oder -vermittelnde Moleküle. Hierbei
B Schrifttum
19
handelt es sich häufig um eisenregulierte OMPs (IROMPS, iron-regulated outer
membrane proteins). Diese spielen während einer Infektion eine wichtige Rolle, da
im Wirt kaum ungebundenes Eisen vorkommt und der Erreger dieses Defizit mittels
Rezeptoren ausgleicht, welche eisenhaltige Moleküle, z.B. das Transferrin des Wir-
tes, Hämoglobin oder mikrobielle Siderophoren, binden können. Transferrinbindende
Proteine sind streng wirtsspezifisch, so bindet der Tbp-Rezeptor von A. pleuro-
pneumoniae ausschließlich porzines Transferrin (GONZALEZ et al. 1995). Morton
and Williams zeigten, dass auch H. parasuis porzines Transferrin binden kann
(MORTON u. WILLIAMS 1989) und Charland et al. vermuteten, dass diese Fähigkeit
auf zwei potentielle Polypeptide zurück geht (CHARLAND et al. 1995), welche zwar
porzines Tansferrin, jedoch kein an porzines Lactoferrin gebundenes Eisen binden.
Del Río et al. wiesen in H. parasuis analog zu A. pleuropneumoniae eine TonB-
Region mit den Genen tonB, exbBD und tbpBA und eine verstärkte Expression der
transferrinbindenden Proteine unter Eisenmangelbedingungen nach (DEL RIO et al.
2005a). A. pleuropneumoniae besitzt zusätzlich einen Ferrichrom-Rezeptor, über
welchen er Siderophore aufnehmen kann: die Synthese eigener Siderophore konnte
bislang jedoch nicht nachgewiesen werden (MIKAEL et al. 2003). Allerdings zeigte
eine isogene Mutante für den Ferrichromrezeptor FhuA keine abgeschwächte Viru-
lenz (BALTES et al. 2003). Auch H. parasuis scheint einen solchen Rezeptor zu be-
sitzen, der mittels kreuzreaktiver polyklonaler Antikörper gegen FhuA von A. pleu-
ropneumoniae nachgewiesen wurde (DEL RIO et al. 2006b). Die DNA-Sequenzen
der entsprechenden Gene stimmen zu 99-100 % überein, über die Bedeutung des
Rezeptors ist jedoch bislang nichts bekannt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass
das Protein konstitutiv exprimiert und durch Anzucht unter Eisenmangelbedingungen
nicht hochreguliert wird. Zusätzlich zum Ferrichromrezeptor FhuA exprimiert A. pleu-
ropneumoniae den Hämoglobinrezeptor HgbA (SHAKARJI et al. 2006). Im Gegen-
satz zu der fhuA-Mutante weist die hgbA-Mutante eine abgeschwächte Virulenz auf.
Die Existenz eines solchen Hämoglobinrezeptors bei H. parasuis wurde bislang nicht
beschrieben. Da transferrinbindende Proteine vermutlich bei allen Stämmen von
H. parasuis vorkommen, eignen sie sich nicht zur Identifizierung von virulenten Stäm-
men (METCALF u. MACINNES 2007).
B Schrifttum 20
1.2.2.3 Fimbrien
1992 entdeckte Münch die Existenz von Fimbrien bei H. parasuis (MUNCH et al.
1992). Es handelt sich hierbei um filamentöse Strukturen, die bei anderen Pasteu-
rellaceae häufig an der Adhäsion an Wirtszellen beteiligt sind. Die Ausbildung dieser
Strukturen findet bei H. parasuis nur sehr schwach statt, wenn die Kultur auf Agar-
platten gezogen wurde, und in größerer Menge, wenn der Erreger in Kontakt zu
Wirtsgewebe steht, z.B. zu der Chorioallantoismembran eines embryonierten
Hühnereis (MUNCH et al. 1992). Fimbrien kommen vermutlich ebenfalls in allen
Stämmen von H. parasuis vor (METCALF u. MACINNES 2007).
1.2.2.4 Kapsel
Für diverse Gattungen der Familie der Pasteurellaceae ist die Ausbildung einer Kap-
selstruktur bekannt. Polysaccharidhaltige Kapseln dienen einerseits dem Schutz des
Bakteriums und zur Adhäsion von Nährstoffen, andererseits aber auch der Adhäsion
an Wirtsstrukturen und der Abschirmung vor der Immunabwehr des Wirtes. Für 12
Serotypen von A. pleuropneumoniae (Biotyp 1, NAD abhängig) ist die Bildung einer
Kapsel beschrieben, und eine unbekapselte Mutante von Serotyp 1 erwies sich im
Tierversuch als avirulent (RIOUX et al. 2000). Untersuchungen zur Ausbildung einer
Kapsel von H. parasuis fanden schon früh statt (CHANDLER et al. 1939), sie wurden
zunächst im Zusammenhang zur Kolonieform gesehen (BAKOS 1955). Kielstein und
Rosner isolierten 1991 (ROSNER et al. 1991) aus Tieren mit Glässerscher Krankheit
häufiger unbekapselte Stämme als aus klinisch gesunden Tieren und sahen somit
eine fehlende Bekapselung als Hinweis auf Virulenz.
1.2.2.5 Lipopolysaccharide, Lipooligosaccharide
Ebenfalls eine Rolle als Virulenzfaktoren bei anderen Mitgliedern der Familie der
Pasteurellaceae spielen Lipopolysaccharide (LPS) und Lipooligosaccharide (LOS)
als Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. Beide bestehen aus
drei Regionen: dem Lipid A als Anker in der Membran, einer Kernzone und dem
O-Antigen, welches aus Polysaccharidketten besteht; und erschweren die Phago-
zytose durch Abwehrzellen des Wirts. Mittels Bildung spezifischer Antikörper ist der
B Schrifttum
21
Wirt zwar in der Lage diesen Mechanismus aufzuheben, allerdings verändert sich bei
einigen Pasteurellaceae die Oberflächenstruktur (Phasenvariation). Zur Phagozytose
des Erregers ist in diesem Falle erneut die Bildung spezifischer Antikörper vonnöten.
Untersuchungen zur Phasenvariation von LOS von H. somnus konnten zeigen, dass
die innere Kernregion hoch konserviert ist, die äußeren Kernepitope jedoch eine
hohe Heterogenität und Phasenvariation aufweisen (ST. MICHAEL et al. 2005). Die
Kernregion des LPS spielt bei A. pleuropneumoniae eine Rolle in der Adhäsion der
Bakterien an den Zellen des Respirationstraktes (RIOUX et al. 1999).
Geht gleichzeitig eine hohe Anzahl gramnegativer Bakterien zugrunde (z. B. durch
den Einsatz von Antibiotika), haben LPS und LOS zudem eine Toxinwirkung („Endo-
toxin“). Da es sich bei H. parasuis um ein gramnegatives Bakterium handelt, sind
LPS und LOS ebenfalls Bestandteil seiner äußeren Membran. In Versuchen mit
verschiedenen Antiseren gegen LOS konnten Zucker et al. auch nach mehreren
Kulturpassagen keine Variationen in den Reaktionen beobachten, zudem ergab sich
keine Korrelation zwischen Virulenz und den ermittelten LOS-Gruppen (ZUCKER et
al. 1996).
1.2.2.6 Toxine
Über die Sekretion von Toxinen durch H. parasuis ist bislang nichts bekannt, obwohl
dieses für andere Pasteurellaceae beschrieben wurde. Pasteurella (P.) multocida
produziert das Pasteurella multocida-Toxin (PMT) und verursacht in einer Misch-
infektion mit Bordetella bronchiseptica das Krankheitsbild der Rhinitis atrophicans im
Schwein. Diese ist gekennzeichnet durch den Abbau der Knochensubstanz der
Nasenmuscheln. PMT beeinflusst hierbei Signalkaskaden in den Wirtszellen, wo-
durch neben verschiedenen anderen Wirkungen (mitogene Wirkung) verstärkt
Kalzium mobilisiert und der Knochen abgebaut wird (PULLINGER et al. 2001).
Andere Gattungen produzieren sogenannte RTX-Toxine (repeats in toxin), welche
Ähnlichkeiten in ihrer Synthese und Sekretion sowie ihrer biologischen Wirkung
aufweisen. An ihrem N-Terminus bestehen sie aus verschiedenen lipophilen Regio-
nen und formen Poren oder andere Membrandefekte. Durch osmotische Schwellung
kommt es zum Absterben der empfänglichen Zelle (BROWN et al. 1997). Hierzu
B Schrifttum 22
gehört das Leukotoxin (LKT) von Mannheimia (M.) haemolytica, welches an bovine
Leukozyten bindet und in diesen Apoptose vermittelt (BROWN et al. 1997). Auch die
schwache hämolytische Aktivität von M. haemolytica ist auf die Wirkung des LTKs
zurückzuführen (MURPHY et al. 1995). Ebenfalls zu dieser Toxingruppe gehören die
APX-Toxine I-IV von A. pleuropneumoniae. Neben der direkten Schädigung durch
Porenbildung kommt es hier auch zu einer massiven Freisetzung wirtseigener
inflammatorischer Mediatoren, welche ebenfalls gewebezerstörend wirken (BOSSE
et al. 2002).
1.2.2.7 Sonstige virulenzassoziierte Faktoren
Viele andere Pasteurellaceae sezernieren Enzyme, welche als Virulenzfaktoren die-
nen. Für H. influenzae und A. pleuropneumoniae ist beispielsweise eine IgA-Protea-
se beschrieben, welche die Fähigkeit zur Spaltung von Immunkomplexen besitzt
(KILIAN et al. 1979). Einige Stämme von P. multocida weisen eine Sialidaseaktivität
auf. Diese wird für die vermehrte Besiedlung des Respirationstrakts und die Ent-
stehung von Läsionen während der Infektion verantwortlich gemacht. Es handelt sich
hierbei um ein glykolytisches Enzym, welches dem Bakterium Kohlenstoff aus wirts-
eigenen Zuckerverbindungen zugänglich macht (SANCHEZ et al. 2004). Neben der
Neuraminidaseaktivität (s. B1.2.2.1) sind für H. parasuis keine weiteren Enzyme mit
einem möglichen Zusammenhang zur Virulenz bekannt.
1.2.2.8 Vergleichsstudien zur Identifizierung von virulenzassoziierten Faktoren
Mit dem Ziel, anhand von Stammdifferenzen die Ursache für unterschiedliche Viru-
lenzeigenschaften zu identifizieren, wurden verschiedene Vergleichsstudien einzel-
ner Stämme durchgeführt. Da eine vollständige Genomsequenz von H. parasuis bis-
lang nicht vorliegt, handelt es sich um Methoden, die ohne bekannte Sequenzen
durchführbar sind.
Die erste umfassende Studie zur Identifizierung von Virulenzfaktoren suchte mittels
Differential Display Reverse Transcription (ddRT) -PCR nach Unterschieden im
Transkriptom eines virulenten H. parasuis Stammes von Serovar 5 (HILL et al. 2003).
Dieser wurde unter verschiedenen Bedingungen kultiviert (35 °C, 40 °C, mit und
B Schrifttum
23
ohne Zugabe von hitzeinaktiviertem Schweineserum) und cDNA der einzelnen An-
sätze wurde als Template in einer ddPCR eingesetzt. Diese wurde unter unspezi-
fischen Bedingungen mit mehr als 20 verschiedenen Kombinationen willkürlicher
Primer durchgeführt. Nach der Analyse der PCR-Produkte per SDS-PAGE wurde
basierend auf den unterschiedlich transkribierten Genfragmenten eine zweite PCR
der cDNA mit spezifischen Primern durchgeführt und zur Quantifizierung der Trans-
kription genutzt. Sieben unterschiedlich transkribierte Genfragmente konnten identi-
fiziert werden, der Nachweis für einen Zusammenhang mit der Virulenz von H. para-
suis Stämmen konnte bislang nicht geführt werden. Da die Sequenzen in allen
Referenzstämmen der 15 Serotypen nachgewiesen wurden, eignet sich keines der
Fragmente auf genetischer Ebene für eine diagnostische Methode zur Unterschei-
dung von virulenten und avirulenten Stämmen von H. parasuis. Ein zweiter Ansatz
einer ddRT-PCR wurde ebenfalls mit einem virulenten Stamm von Serotyp 5 durch-
geführt, die Anzucht erfolgte parallel unter Eisenmangel bzw. dem Zusatz von porzi-
ner Cerebrospinalflüssigkeit (METCALF u. MACINNES 2007). Der Ansatz unter Ei-
senmangel ergab zehn, der unter Zusatz von Cerebrospinalflüssigkeit neun hochre-
gulierte Gene, bei denen es sich überwiegend um Stoffwechselgene handelte. Die
Untersuchung der Referenzstämme auf das Vorhandensein der 19 Sequenzen
zeigte, dass auch diese Gene in allen Referenzstämmen der Serotypen vorhanden
waren. Allerdings exprimierten nur fünf virulente Stämme (vier Feldstämme von
Serotyp 4, 5 und 12, sowie Stamm Nagasaki) ein Protein mit Homologien zu einer
Hydrolase der Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie. Eine nähere Charakteri-
sierung erfolgte bislang nicht.
Im Jahr 2005 verglichen del Río et al. mittels Repräsentativer Differenzanalyse
(RDA) den Referenzstamm von Serotyp 2 (ein Serotyp mit einer hohen Prävalenz in
Spanien) mit den Referenstämmen von Serotyp 1, 5 (beide hochvirulent) und 3
(schwach virulent). Die Methode geht auf Lisitsyn et al. zurück (LISITSYN et al.
1993) und sieht die Herstellung einer repräsentativen Probe des genetischen
Materials beider Genome und einen PCR-Schritt vor, um die Komplexizität der
Genome herabzusetzen und die Größe der Fragmente einzuschränken. Die Detek-
tion der Differenzen geschieht durch mehrere sich abwechselnde Schritte aus Sub-
B Schrifttum 24
traktion und anschließender selektiver Amplifizierung der unterschiedlichen Frag-
mente. Del Rio et al. verwendeten eine modifizierte Form der RDA, in der auf den
initialen PCR-Schritt verzichtet und nur ein Subtraktionsschritt mit anschließender
Amplifikation durchgeführt wurde (DEL RIO et al. 2005b). Diese Modifikation wurde
vorher bereits erfolgreich von Strommenger et al. angewendet (STROMMENGER et
al. 2001). Del Rio et al. wiesen ein Fragment nach, welches spezifisch für den
Referenzstamm von Serotyp 2 ist und Homologien zu einer Dihydropteroat-Synthase
(dhps) von Shigella sonnei aufweist. Dhps-Gene stehen im Zusammenhang mit einer
Sulfonamidresistenz, befinden sich bei anderen gramnegativen Erregern jedoch vor
allem auf Plasmid-DNA (RADSTROM et al. 1991). Da im Referenzstamm von Sero-
typ 2 keine solchen Plasmide nachgewiesen werden konnten, der Stamm diese Re-
sistenz jedoch besitzt, postulieren die Autoren eine chromosomale Variante des
Gens.
1.2.3 Typisierung von H. parasuis
Da die bisherige Einteilung in Serotypen keine Auskunft über die Virulenz einzelner
Stämme gibt und eine Klassifizierung von virulenten und avirulenten Stämmen
anhand von Virulenzfaktoren bislang nicht möglich ist, beschäftigten sich zahlreiche
Studien mit der Identifikation anderer Typisierungsmerkmale, die eine solche Aus-
sage zulassen. Die Schwerpunkte lagen hier auf der Identifizierung genetischer Un-
terschiede einzelner Stämme oder dem Nachweis abweichender Proteinexpression.
Durch Vergleiche mit der klinischen Erkrankung der Tiere, von denen die Isolate ge-
wonnen wurden, ergaben sich Rückschlüsse auf die Eignung der jeweiligen Methode
zur Beurteilung der Virulenz eines Stammes.
1.2.3.1 DNA-basierte Typisierungsmethoden
Bei der Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -PCR wird mittels spe-
ziesspezifischer Primer ein Fragment amplifiziert und im Anschluss mit Restriktions-
enzymen geschnitten. Die entstehenden Bandenmuster werden miteinander ver-
glichen und zur Einteilung der Stämme in Gruppen verwendet. 2002 wurde diese
Methode am tbpA Gen angewendet (DE LA PUENTE REDONDO et al. 2003). Die
Untersuchung der Referenzstämme der 15 Serotypen ergab, dass die Serovare 5,
B Schrifttum
25
12, 14 und 15 das gleiche Muster zeigen, alle anderen Serovare jedoch voneinander
unterschieden werden können. Klinische Isolate wiesen eine hohe Heterogenität auf
und es wurden zahlreiche neue Muster identifiziert. Der Vergleich zwischen RFLP-
Gruppe und Serotyp ergab keine Korrelation. Eine zweite Studie wendete die gleiche
Methode an, nutzte jedoch ein Amplikon aus dem Gen aroA, einem Enzym der
Biosynthese von aromatischen Aminosäuren (DEL RIO et al. 2006a). Neben den 15
Referenzstämmen der Serotypen von H. parasuis wurden auch verschiedene Arten
der Gattung Actinobacillus (A.) untersucht. Der Versuch ergab sieben unter-
schiedliche Gruppen. Die Serovare 1, 2, 4-6 und 8-15 von H. parasuis gehören der
ersten Gruppe an, außerdem auch die beiden Stämme von A. porcinus und A. ureae.
Serotyp 3 und 7 von H. parasuis bilden mit den Serotypen 1, 4, 5, 9, 11 und 12 von
A. pleuropneumoniae die zweite Gruppe. Die restlichen Bakterien verteilen sich auf
die Gruppen III-VII. Die Methode ermöglicht eine Unterscheidung von verschiedenen
Isolaten, eine Aussage über das Virulenzpotenzial eines Stammes ist jedoch nicht
möglich.
Die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) -PCR basiert auf der
Amplifikation repetitiver Konsensussequenzen und dem Abgleich des entstandenen
Bandenmusters mittels Gelelektrophorese. Sie bietet die Möglichkeit genetische Un-
terschiede zwischen einzelnen Isolaten darzustellen, jedoch keine Unterteilung von
virulenten und avirulenten Stämmen. Laut einer Untersuchung durch Rafiee et al.
ergaben alle 15 Referenzstämme ein unterschiedliches Muster und ließen sich somit
voneinander unterscheiden (RAFIEE et al. 2000). Zwölf Feldstämme von vermutlich
zusammenhängenden Ausbrüchen der Glässerschen Krankheit ergaben ein einheit-
liches Muster, dieses entsprach jedoch keinem Muster der Referenzstämme. Ruiz et
al. verwendeten ebenfalls eine ERIC-PCR und verglichen deren Ergebnisse mit dem
Bandenmuster aus präparierten Membranproteinen in der SDS-PAGE (RUIZ et al.
2001). Oliveira et al. verwendeten die ERIC-PCR in Kombination mit der Serotypi-
sierung mittels Immunodiffusion zur Untersuchung von Clusterbildung und Prävalenz.
Sie fanden potenziell virulente Stämme unter den Serovaren 1, 2, 4, 5, 12, 13 und
14, bzw. unter den nicht typisierbaren Stämmen und wiesen eine hohe genetische
Heterogenität unter den Stämmen nach (OLIVEIRA et al. 2003a).
B Schrifttum 26
Smart et al. verglichen 1987 verschiedene Stämme mittels Restriction Endonuclease
Fingerprinting (REF), welches mittels Gelelektrophorese das Bandenmuster ver-
schiedener Stämme vergleicht, deren extrahierte DNA vorher mit Restriktionsenzy-
men verdaut wurde (SMART et al. 1988). Die untersuchten Referenzstämme (nach
dem KRG-Schema Serotyp 1-9) ließen sich zwar voneinander abgrenzen, die Feld-
isolate konnten jedoch anhand ihres Musters keinem dieser Serotypen zugeordnet
werden. Die Herden wiesen überwiegend mehr als einen Stamm auf, wobei stets ein
Stamm dominierte, und wenige Einzeltiere trugen mehr als einen Stamm. Die Auto-
ren treffen keine Aussage über einen beobachteten Zusammenhang zwischen Viru-
lenz und dem Bandenmuster. Auch diese Methode ermittelt genetische Unterschiede
zwischen einzelnen Stämmen, nicht jedoch ihr Virulenzpotenzial.
Eine weitere PCR-basierte Untersuchungsmethode ist das MLST (Multi Locus Se-
quence Typing), bei welcher Gensequenzen von housekeeping Genen einzelner
Stämme sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen werden. Anhand der
Daten können Gemeinsamkeiten und Unterschiede analysiert, Clusteruntersuchun-
gen durchgeführt, einzelne Stämme in Sequenztypen eingeteilt und Verwandt-
schaftsgrade der Stämme untereinander errechnet werden. So werden die gene-
tischen Unterschiede verschiedener Stämme untersucht, ein Zusammenhang zu
ihrer Virulenz ergibt sich daraus jedoch nicht. Diese Methode wurde 2006 von Olvera
et al. durchgeführt (OLVERA et al. 2006), indem sie Primer für verschiedene konser-
vierte Gene verwendeten, die anhand von bekannten Sequenzen von H. influenzae
oder homologer Bereiche anderer Bakterien der Familie der Pasteurellaceae kon-
struiert wurden. In dieser Studie konnte erneut die große genetische Heterogenität
des Erregers belegt werden, da eine hohe Anzahl von Sequenztypen ermittelt wurde
und nur selten der gleiche Typ in mehreren Betrieben vorkam. Im Gegensatz zu
anderen Bakterien, wo bestimmte virulenzassoziierte Klone gehäuft auftreten
(SMITH et al. 2000), herrschten bei H. parasuis keine dominanten Klone vor. Neben
der Isolation verschiedener Stämme aus einem Bestand bzw. von Einzeltieren, wur-
den auch mehrere Stämme in derselben systemischen Läsion nachgewiesen. Dieses
führte die Autoren zu der Theorie, dass der Ausbruch einer Krankheit möglicherweise
B Schrifttum
27
auch durch mehrere Stämme gleichzeitig verursacht wird und nicht, wie allgemein
angenommen, nur auf einen Stamm zurückzuführen ist.
1.2.3.2 Proteinbasierte Typisierungsmethoden
Ebenfalls eine hohe Diversität unter Isolaten von H. parasuis ergab die Studie von
Blackall et al., die mittels Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) acht Referenz-
und 40 Feldstämme untersuchten (BLACKALL et al. 1997). Für die MLEE werden
lösliche Proteine präpariert und in einem Stärkegel aufgetrennt. Horizontale Schnitte
dieses Gels werden mit den Substraten verschiedener Enzyme inkubiert und die je
nach Enzymaktivität entstehenden Bandenmuster miteinander verglichen. Durch den
Vergleich der einzelnen Enzymnachweise und deren Laufweite im Gel konnten
Rückschlüsse auf die genetischen Unterschiede geschlossen und Elektrophorese-
typen (ET) eingeteilt werden. Es entstanden zwei Gruppen, Gruppe 1 enthielt alle
Isolate von Serotyp 4 und 5, darunter auch zwei Referenzstämme für Serotyp 5,
einige von Serotyp 13 und zwei nicht typisierbare Isolate. Gruppe 2 enthielt Feld-
stämme von Serotyp 1, 2, 7, 9, 10 und 13 sowie die Referenzstämme von Serotyp 1,
2, 3, 4, 8 und 9. Die Serovare 4 und 13 verhielten sich somit uneinheitlich und ließen
sich beiden Gruppen zuordnen. Ein Zusammenhang zwischen der Gruppeneinteilung
und Virulenz konnte nicht beobachtet werden, da sich in beiden Gruppen Isolate von
Tieren befanden, die Septikämie oder respiratorische Symptome aufwiesen. Diese
Ergebnisse decken sich mit denen einer Studie von Rapp-Gabrielson et al. (RAPP-
GABRIELSON et al. 1992a), welche ebenfalls mittels MLEE die Diversität von H. pa-
rasuis Isolaten aus Nordamerika zeigten. Viele ETs bestanden nur aus einem Isolat
und es konnte kein Zusammenhang zwischen genetischen Eigenschaften und der
Virulenz eines Stammes beobachtet werden.
Mehrere Studien beschäftigten sich mit der Methode des PAGE-Typings. In einer
älteren Untersuchung ergaben die Ganzzelllysate von acht Stämmen (zwei Isolate
aus an Pneumonie erkrankten Tieren, sechs aus Tieren mit Glässerscher Krankheit)
in SDS-PAGE-Gelen zwei unterschiedliche Proteinmuster, PAGE-Typ I und II
(NICOLET et al. 1980). Typ II wurde durch die Anwesenheit eines 37 kDa großen
Proteins definiert, Typ I über dessen Abwesenheit. Alle aus an Glässerscher Krank-
B Schrifttum 28
heit erkrankten Tieren isolierten Stämme gehörten Typ II an, woraus ein Zusam-
menhang zwischen dem Protein und der Virulenz der Stämme geschlossen wurde.
Auf dem selben Schema basierend analysierten Morozumi et al. weitere Feldstäm-
me, darunter Proben aus den Nasenhöhlen gesunder Tiere sowie aus Tieren mit
Pneumonie und Polyserositis (MOROZUMI u. NICOLET 1986a). Von den aus Na-
senhöhlen isolierten Stämmen gehörten sechs PAGE-Typ I an, die restlichen vier
Typ II. Sämtliche Isolate aus Läsionen konnten PAGE-Typ II zugeordnet werden. Aus
diesen Ergebnissen wurde erneut ein Zusammenhang zwischen dem 37 kDa großen
Protein und Virulenz geschlossen.
Rosner et al. hingegen konnten keine Korrelation zwischen PAGE-Typ und Virulenz,
bzw. Isolationsort und Virulenz ausmachen (ROSNER et al. 1991). Sie untersuchten
Feldstämme von H. parasuis und teilten sie anhand des Musters in sieben PAGE-
Typen ein, welche auf der Kombination bestimmter Proteinbanden basieren: Typ I
(29, 37, 39 und 51 kDa), Typ IIa (27 und 45 kDa), Typ IIb (47 kDa), Typ IIIa (45 kDa),
Typ IIIb (27 und 39 kDa), Typ IV (32 und 51 kDa) und Typ V (39 und 45 kDa).
Virulente Isolate befanden sich in den Typen I, IIa, IIb, IIIa und IIIb, avirulente Stäm-
me gehörten den Typen IIa, IV oder V an.
In einer Studie von Oliveira et al. wurde das Proteinprofil von 98 Feldstämmen un-
tersucht und computergestützt analysiert (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Die Stämme
entstammten dem oberen Respirationstrakt, pneumonischen Lungen und syste-
mischen Lokalisationen (Perikard, Pleura, Gelenk, Gehirn und Lymphknoten). Es
konnten sechs Cluster ermittelt und in zwei unterschiedliche PAGE-Typen eingeteilt
werden, die anhand von Anwesenheit oder Abwesenheit von markanten Protein-
banden im Größenbereich von 36-38 kDa definiert wurden. Eine Identifizierung der
Proteine erfolgte nicht. Cluster 1 entsprach PAGE-Typ II und enthielt 77 Isolate, die
jeweils eine markante Bande aufwiesen. Es handelte sich hauptsächlich um Stäm-
me, die aus erkrankten Tieren isoliert wurden, darunter 29 Isolate aus Tieren mit
Pneumonie und 39 Isolate aus systemischen Lokalisationen. PAGE-Typ I enthielt die
Cluster 2-6, repräsentiert durch 21 Isolate, welche sämtlich keine dieser markanten
Banden des entsprechenden Größenbereichs zeigten. Vier der 21 Proben wurden an
B Schrifttum
29
systemischen Lokalisationen isoliert, sechs aus Lungen mit Pneumonie und zehn
Proben entstammten dem oberen Respirationstrakt von gesunden Schweinen.
PAGE-Typ II beinhaltete 27 unterschiedliche Muster, die Stämme entsprachen den
Serotypen1, 2, 4, 5, 7, 12, 13 und 14. Dazu kamen nach dem KRG-Schema nicht
typisierbare Isolate. In PAGE-Typ I waren bis auf Serotyp 3 die anderen oben ge-
nannten Serotypen ebenfalls vorhanden, insgesamt handelte es sich um 14 ver-
schiedene Proteinmuster aus fünf unterschiedlichen Clustern. In Typ I zeigten die
Stämme demnach eine größere genetische Heterogenität als in Typ II. Die Ergeb-
nisse dieser Studie zeigen anhand der Verteilung der Stämme einen möglichen Zu-
sammenhang zwischen dem Auftreten dieser markanten Proteinbanden im Größen-
bereich von 36-38 kDa und dem Virulenzpotenzial eines Stammes, jedoch keinen
zwischen PAGE-Typ und Serotyp.
Eine kombinierte Untersuchung von DNA und Proteinmuster unternahmen Ruiz et al.
(RUIZ et al. 2001). Sie präparierten von 84 Feldstämmen Membranproteine und
untersuchten diese in der SDS-PAGE. Zudem führten sie mit allen Stämmen eine
ERIC-PCR durch. Die Ergebnisse beider Untersuchungen verglichen sie mit den
bekannten Daten der Isolate über Isolationsort und Krankheitsbild. Ihre Studien
ergaben ein homogeneres Muster für systemisch isolierte Stämme, dies galt sowohl
für die SDS-PAGE als auch für das DNA-Profil. Daraus schlossen die Autoren eine
Korrelation mit der Virulenz eines Stammes, auch wenn sie beide Parameter für
unabhängig voneinander hielten, da Stämme des gleichen Genotyps unterschied-
liche Proteinmuster aufwiesen.
1.2.3.3 Serologische Methoden
Die ersten Versuche zu den antigenen Eigenschaften von H. parasuis wurden von
Bakos et al. (BAKOS et al. 1952; BAKOS 1955) mittels Präzipitationstests durch-
geführt und ergaben vier unterschiedliche Serotypen (A-D).
Morozumi und Nicolet (MOROZUMI u. NICOLET 1986b) führten 1986 eine Immuno-
diffusion mittels Agargel-Präzipitation mit Kaninchenseren durch und klassifizierten
die Serotypen 1-7 (NICOLET et al. 1986). Mit der gleichen Methode identifizierten
B Schrifttum 30
Kielstein et al. zusätzlich die Serotypen Jena 6-12 (KIELSTEIN et al. 1991a) und
Rapp-Gabrielson et al. ND1-5 (RAPP-GABRIELSON u. GABRIELSON 1992).
Kielstein et al. vereinheitlichten die Einteilung anhand der Untersuchungen weiterer
Isolate mit der gleichen Methode und entwickelten die heutige Einteilung in 15
Serotypen nach dem sogenannten Kielstein-Rapp-Gabrielson- (KRG-) Schema
(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Alle anderen zum damaligen Zeitpunkt
bekannten Serotypen wurden in dieses Schema eingegliedert.
Del Rio et al. verglichen 2003 die bekannte Immunodiffusionsmethode mit einem von
ihnen angewandten indirekten Hämagglutinations- (IHA-) und einem Koagulations-
test (DEL RIO et al. 2003). Der Koagulationstest zeigte diverse Kreuzreaktionen, der
IHA jedoch führte zu spezifischen Ergebnissen und bis auf eine Ausnahme wurden
durch IHA und Immunodiffusion alle untersuchten Stämme den gleichen Serotypen
zugeordnet. Zusätzlich konnte die IHA 80 % der 25 als per Immunodiffusion nicht
typisierbar einsortierten Stämme einem Serotypen zuordnen. Die gleiche Methode
wurde 2004 von Angen et al. an dänischen Isolaten durchgeführt und nur drei Isolate
ergaben in der IHA und der Immunodiffusion unterschiedliche Ergebnisse (ANGEN et
al. 2004). Auch in diesem Versuch gelang mit der IHA die Typisierung von einigen
Stämmen, die mit der Immunodiffusion misslang.
1.2.3.4 Vergleich der Typisierungsmethoden
Alle beschriebenen Methoden können einzelne Stämme voneinander abgrenzen. Je
nach angewandter Methode werden die Stämme in unterschiedlich viele Gruppen
eingeteilt, was entweder durch eine besonders sensitive Untersuchungsmethode
bedingt ist oder durch eine geringe Anzahl untersuchter Proben. Je sensitiver die
Methode, desto besser ist sie z.B. für epidemiologische Studien geeignet.
Sämtliche Methoden vermögen es jedoch nicht, einen virulenten Stamm von einem
avirulenten zu unterscheiden. Zwar wurde in den ersten Studien mittels PAGE-
Typing ein Zusammenhang zwischen Proteinmuster und Virulenz vermutet, weitere
Ergebnisse aus Untersuchungen mit dieser Methode konnten diesen jedoch nicht
bestätigen.
B Schrifttum
31
1.2.4 Tiermodelle
Verschiedene in vivo Versuche mit H. parasuis sind in der Vergangenheit durch-
geführt worden. Sie unterschieden sich im Ziel der Studie, dem Tiermodell und der
Wahl der Inokulationsroute.
Die ältesten Pathogenitätsstudien mit den Referenzstämmen der heute gültigen
Serotypen führten Kielstein et al. 1992 durch (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON
1992), indem sie primäre SPF-Tiere intraperitoneal mit 5 x 108 KBE der 15 Refe-
renzstämme inokulierten. Die mit Serotyp 1, 5, 10 12, 13 und 14 infizierten Tiere
verstarben innerhalb von vier Tagen oder waren moribund. Tiere, die mit den Sero-
typen 2, 4 und 15 infiziert waren, litten unter Polyserositis, der Referenzstamm 8
verursachte nur milde Symptome. Mit den Serotypen 3, 6, 7, 9 und 11 traten keine
Symptome oder pathologische Veränderungen auf. Die Zuordnung eines Stammes
zu einem Serotypen ermöglicht allerdings keine Zusage bezüglich seiner Virulenz, da
sich die Isolate einer Serogruppe nicht einheitlich verhalten (OLIVEIRA u. PIJOAN
2004).
Auch durch andere Inokulationsrouten konnten Tiere erfolgreich infiziert werden. So
verwendeten Nielsen et al. die intranasale Route (NIELSEN 1993), Blanco et al.
infizierten die Versuchstiere intratracheal (BLANCO et al. 2004) und Miniats et al.
führten eine aerosolisierte Belastung durch (MINIATS et al. 1991).
Die Manifestation einer Erkrankung wird durch den Immunstatus der Versuchstiere
beeinflusst (BLANCO et al. 2004; NIELSEN 1980), weshalb die große Verbreitung
des Erregers für die Durchführung von Versuchen zunehmend Probleme bereitet, da
sie den Erwerb H. parasuis freier Tiere erschwert. Aus diesem Grund beschäftigten
sich einige Studien mit der Austestung von alternativen Modellen.
1991 führten Morozumi et al. Versuche mit Mäusen und Meerschweinchen durch
(MOROZUMI et al. 1982). Die Tiere wurden vergleichend intraperitoneal, intramusku-
lär und intrapulmonal infiziert. Die Mäuse überlebten überwiegend und wiesen in der
Sektion keine H. parasuis typischen Veränderungen auf, wohingegen die Mehrzahl
der Meerschweinchen mit Septikämie, Serositis und Meningitis Symptome der klas-
B Schrifttum 32
sischen Glässerschen Kranktheit zeigte und verstarb. Die Empfindlichkeit von Meer-
schweinchen gegenüber H. parasuis bestätigten Rapp-Gabrielson et al. (RAPP-
GABRIELSON et al. 1992b). Sie stellten fest, dass Meerschweinchen bei intraperi-
tonealer Infektionsroute innerhalb von 24 Stunden verstarben, Unterschiede in der
Virulenz eines Stammes waren jedoch nur bei intratrachealer Infektion zu beob-
achten.
Neben Labornagern kommen als alternatives Tiermodell auch künstlich aufgezogene
Schweine in Betracht. Diese werden nach oder bereits während der Geburt von der
Muttersau separiert und erhalten wahlweise porzines, bovines oder gar kein Ko-
lostrum. So verwendeten Smart et al. in ihren Protektionsstudien Tiere aus einer H.
parasuis freien Herde, die mittels Kaiserschnitt entbundener Tiere aufgebaut wurde
(SMART u. MINIATS 1989), und Miniats et al. setzten Gnotobioten ein (MINIATS et
al. 1991). Hierbei handelt es sich um per Kaiserschnitt geborene Tiere, die keimfrei
aufgezogen werden. Eine andere Form sind natürlich geborene, aber künstlich
aufgezogene Ferkel (OLIVEIRA et al. 2003b) und sogenannte CDCD-Tiere (cesa-
rean derived colostrum deprived), die der Bezeichnung nach per Kaiserschnitt gebo-
ren und ohne Kolostrumgabe, nicht aber steril aufgezogen werden (VAHLE et al.
1997). Alle diese Modelle haben den Vorteil, dass die Studien am Wirtstier durch-
geführt werden können, weil die Tiere naiv gegenüber H. parasuis sind. Nachteilig ist
allerdings, dass sie ein äußerst schwaches Immunsystem besitzen und Versuche mit
derart immunsupprimierten Tieren oftmals mit hohen Verlusten vor Versuchsbeginn
einher gehen. In einer Studie, die die Eignung von natürlich geborenen und künstlich
aufgezogenen Ferkeln als Tiermodell für H. parasuis untersuchte, erlebten nur 50 %
der Tiere den Versuchsbeginn, obwohl sie ersatzweise bovines Kolostrum und eine
Antibiotikatherapie erhalten hatten (OLIVEIRA et al. 2003b). Der hohe Haltungsauf-
wand für solche empfindlichen Tiere und die Tierverluste machen Versuche mit
immunsupprimierten Tieren sehr kostenintensiv. Eine aus solchen Tieren aufgebaute
Herde stellt zwar optimale Versuchsbedingungen her, ist jedoch ebenfalls mit hohen
Kosten verbunden.
B Schrifttum
33
Andere in vivo-Versuche beschäftigten sich mit Immunisierungsstudien gegen H. pa-
rasuis. Hierfür wurden z.B. die Route per Aerosol (NIELSEN 1993), per subkutaner
(SMART u. MINIATS 1989) und intramuskulärer Injektion durchgeführt (BAK u.
RIISING 2002).
Zur Untersuchung möglicher Kreuzimmunitäten zwischen den einzelnen Stämmen
immunisierten Nielsen et al. Schweine mit einer Kultur der apathogenen Stämme 2,
3, 4 oder 7 und beobachteten eine Resistenz gegenüber einem dänischen Feld-
stamm von Serotyp 5 (NIELSEN 1993). Dahingegen stellten Takahashi et al. fest,
dass eine monovalente Immunisierung mit einem Feldstamm von Serotyp 2 oder
dem Referenzstamm von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) zwar gegen eine homologe,
nicht jedoch gegen eine heterologe Belastung schützt (TAKAHASHI et al. 2001). Im
Gegensatz zu Nielsen et al. setzten sie einen sogenannten Bakterinimpfstoff, das
heisst eine formalininaktivierte Ganzzellvakzine ein. Unvollständige Kreuzimmunität
bestätigten auch Miniats et al., die Versuche an Gnotobioten durchführten (MINIATS
et al. 1991). Sie immunisierten drei Tiergruppen mit verschiedenen Bakterinimpf-
stoffen, denen jeweils ein anderer Feldstamm zugrunde lag (zwei virulente Stämme
V1 und V2, ein avirulenter Stamm AV), je ein Drittel jeder Gruppe wurde per Aerosol
mit Lebendkulturen der drei Stämme belastet. Eine Vakzinierung mit den virulenten
Impfstämmen V1 oder V2 schützte sämtliche Tiere vor einer Belastung mit allen drei
Testisolaten, wohingegen die Impfung mit dem avirulenten Stamm AV zwar gegen
den einen virulenten V2, jedoch nicht gegen eine Belastung mit dem anderen viru-
lenten Stamm V1 schützte. Kreuzimmunitäten konnten demnach nachgewiesen wer-
den, ein vollständiger Schutz gegen alle Stämme wird jedoch nicht erlangt.
Versuche, die die Rolle maternaler Antikörper im Zusammenhang zu einem Impf-
schutz untersuchten, ergaben deutlich reduzierte Krankheitssymptome in Ferkeln,
deren Mütter vor der Geburt gegen H. parasuis (Serotyp 5) geimpft wurden
(SOLANO-AGUILAR et al. 1999). Miniats et al. immunisierten Ferkel unterschied-
lichen Alters mit einem Bakterinimpfstoff, um den optimalen Zeitpunkt für eine Vakzi-
nierung herauszufinden. Sie stellten keinen Unterschied zwischen Tieren fest, die in
der zweiten und vierten Lebenswoche geimpft wurden und denen, die in der dritten
B Schrifttum 34
und fünften, bzw. vierten und sechsten Lebenswoche geimpft wurden (MINIATS u.
SMART 1988).
Die in Dänemark (Glassinord®) und Deutschland (Porcilis® Glässer) zugelassenen
Impfstoffe der Firma Intervet sind auf Serotyp 5 basierende Totimpfstoffe, die sich in
dem verwendeten Adjuvans unterscheiden. Versuche mit Porcilis® Glässer haben er-
geben, dass die Tiere zuverlässig gegen eine homologe Belastung geschützt sind,
sich die Wirkung gegenüber einer heterologen Belastung mit Stämmen aus Serovar
1, 12, 13 und 14 jedoch als unvollständig erwiesen hat (BAK u. RIISING 2002). In
Deutschland werden deshalb häufig bestandsspezifische Bakterinimpfstoffe ver-
wendet.
Zusammenfassend ist es bisher zwar gelungen, klinische Erkrankungen durch
Vakzinierung der Tiere gegen H. parasuis zu verhindern, ein übergreifender Schutz
gegen heterologe Belastung wurde bislang jedoch nicht erreicht. Zudem ist die Un-
terscheidung von geimpften und infizierten Tieren mit den bisher erhältlichen Vakzi-
nierungsmethoden nicht möglich.
B Schrifttum
35
2 Ziel der Studie
Bei H. parasuis handelt es sich um einen Keim, der gerade in Betrieben mit hohen
Hygienestandards zunehmend Probleme bereitet. Über seine Virulenzfaktoren und
Pathogenitätsmechanismen ist bislang wenig bekannt, so dass derzeit keine Aus-
sage darüber möglich ist, ob ein Stamm das Potenzial besitzt Erkrankungen hervor-
zurufen oder ob es sich um einen avirulenten Kommensalen des oberen Respira-
tionstraktes handelt.
Kenntnisse über die Virulenzfaktoren des Erregers sind für die Entwicklung diag-
nostischer Methoden notwendig, welche neben dem Speziesnachweis auch Auskunft
über das Virulenzpotenzial eines Stammes geben. Langfristig können diese Daten
auch zur Entwicklung eines serovarübergreifenden Impfstoffes verwendet werden.
Als Voraussetzung für die Untersuchung potenzieller Virulenzfaktoren ist ein zuver-
lässiges Tiermodell notwendig.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb, neue Virulenzfaktoren von H. para-
suis zu identifizieren und mit der Etablierung eines geeigneten Tiermodells zu be-
ginnen.
C Material und Methoden 36
C Material und Methoden
1 Material
1.1 Geräte, Verbrauchsmittel und Chemikalien
Die in dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmittel und Chemikalien sind in Anhang
I1 aufgelistet, die Geräte in den Fußnoten angegeben.
1.2 Lösungen und Puffer
Eine Auflistung der verwendeten Lösungen und Puffer findet sich in Anhang I2 auf-
gelistet. Sie wurden soweit notwendig autoklaviert oder sterilfiltriert.
1.3 Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit eingesetzten Bakterienstämme sind in Anhang I3 aufgeführt.
2 Methoden
2.1 Mikrobiologische Methoden
2.1.1 Kultivierung von Escherichia coli Stämmen
Escherichia (E.) coli Stämme wurden in Luria-Bertani (LB) Medium kultiviert (s. An-
hang Tab. 11), welchem bei Bedarf Antibiotika zugesetzt wurden (100 µg Ampicillin).
Die Bebrütung der Bakterien erfolgte über Nacht aerob bei 37 °C im Brutschrank1
oder im Schüttelinkubator2.
2.1.2 Kultivierung von H. parasuis Stämmen
Die H. parasuis Stämme wurden als Flüssigkultur in Brain Heart Infusion (BHI) Me-
dium (s. Anhang Tab. 11) unter Zusatz von 5 % Pferdeserum und 1 x Ersatz-Isovita-
lex (EIVX) kultiviert. Die Bebrütung erfolgte für 24-48 Stunden bei 37 °C unter mikro-
aerophilen Bedingungen (5 % CO2)3. Bei der Anzucht im Schüttelinkubator wurde
das Medium zur Anreicherung mit CO2 vorher bei 37 °C über Nacht vorinkubiert. Zur
1 Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland
2 innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA
3 CO2-AUTO-ZERO, Heraeus, Hanau, Deutschland
C Material und Methoden 37
Anzucht auf Agarplatten wurde in der Regel Kochblutagar mit Nicotinamid (NAD) -
Zusatz verwendet, je nach Bedarf wurden aber auch Schafsblut- oder Schweineblut-
Agar mit einer Staphylococcus aureus-Amme, PPLO-Agar oder Columbia Sheep
Blood (CSB) -Agar eingesetzt.
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Arbeiten mit DNA
2.2.1.1 Präparation chromosomaler DNA
Zur Präparation chromosomaler DNA von H. parasuis wurde ein Protokoll verwendet,
welches einen Aufreinigungsschritt mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur
Abtrennung von Proteinen und Polysacchariden beinhaltet (AUSUBEL et al. 1987).
An Tag 1 wurde ein fraktionierter Ausstrich des entsprechenden Stammes vorge-
nommen. Mit einem angefeuchteten Tupfer wurde an Tag 2 das Material von der
Platte entnommen und in insgesamt 3-4 Aliquots TEN-Puffer (s. Anhang Tab. 12)
resuspendiert (je 275 µl). Nach Zugabe von 10 µl RNAse (10 mg/ml) und 275 µl
Aqua dest. inkubierten die Ansätze für 30 Minuten im Wasserbad4 bei 37 °C. Im An-
schluss folgte ein Zusatz von 15 µl 20 %igem SDS und 10 µl Proteinase K (20
mg/ml). Die Probe wurde gründlich gemischt, erneut bei 37 °C für eine Stunde im
Wasserbad inkubiert und währenddessen das CTAB (s. Anhang Tab. 12) auf 50 °C5
erwärmt. Dem Ansatz wurden zunächst 125 µl 4M NaCl zugegeben, wieder gründlich
gemischt, danach 80 µl CTAB hinzugegeben, erneut gemischt und für zehn Minuten
im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Die Fällung begann mit der Zugabe von 780 µl
Chloroform/Isoamyl (24:1). Nach gründlichem Mischen erhielt die Lösung ein homo-
gen milchiges Aussehen. Durch einen Zentrifugationsschritt über fünf Minuten bei
12.000 g6 wurden drei unterschiedliche Phasen sichtbar, ausschließlich der Über-
stand wurde in ein zweites Eppendorf-Reagiergefäß überführt und der Rest verwor-
fen. Nach Zugabe von 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamyl (25:24:1) wurde erneut
4 1004, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland
5 Labtherm
®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland
6 mini Spin plus
®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland
C Material und Methoden 38
gemischt, zentrifugiert (fünf Minuten bei 12.000 g), der Überstand zurück behalten
und der Rest verworfen. Die Präzipitation der DNA geschah durch Hinzufügen von
500 µl Isopropanol, vorsichtiges Mischen und erneutes Zentrifugieren (30 Minuten
bei 12.000 g). Ein nachfolgender Waschschritt des Pellets beinhaltete nach der
Zugabe von 500 µl 80 %igem Ethanol noch eine Zentrifugation für fünf Minuten bei
12.000 g. Nach dem Abnehmen des Alkohols wurde das Pellet für zehn Minuten an
der Luft getrocknet und anschließend in ca. 50 µl Aqua dest. oder TE-Puffer über
Nacht im Kühlschrank resuspendiert. Die Lagerung der chromosomalen DNA erfolgte
bei -20 °C im Gefrierschrank.
2.2.1.2 Plasmidpräparationen
Zur Präparation kleinerer Mengen Plasmid-DNA wurde das modifizierte Alkalilysis
Verfahren nach Birnboim angewendet (BIRNBOIM u. DOLY 1979). Hierfür wurden
am Vortag 3 ml Medium mit dem gewünschten E. coli-Stamm beimpft, über Nacht bei
37 °C im Schüttler inkubiert und am nächsten Tag abzentrifugiert7 (10 min, 8.000 g).
Die Resuspension des Bakterienpellets erfolgte in 300 µl Tris-EDTA-Puffer (50 mM
Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml RNAse). Nach Zugabe von 300 µl NaOH-
SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1 % SDS) wurde die Lösung bis zur Lyse der Bakterien,
maximal jedoch für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurden 300 µl K-Acetat-Puffer 3,2 M (pH 5,5) hinzugefügt, die Probe für zehn
Minuten bei 12.000 g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reagiergefäß
überführt. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol.
Einer Inkubation von fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur folgte ein letzter
Zentrifugationsschritt (10 min, 12.000 g). Nach Abnahme des Überstands wurde das
Pellet an der Luft für zehn Minuten getrocknet und dann in 25 µl Aqua dest.
resuspendiert.
Für einen analytischen Verdau wurden maximal 5 µl der Präparation verwendet.
7 Sorvall
® RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
C Material und Methoden 39
2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion
In der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) werden durch
das Enzym Taq-DNA-Polymerase DNA-Abschnitte amplifiziert (MULLIS et al. 1986).
Sämtliche für alle Ansätze identisch eingesetzten Reagenzien wurden gemäß Proto-
koll als Mastermix zusammen pipettiert und in Probengefäße aliquotiert. Es folgte
dann für jedes Gefäß einzeln die Zugabe jener Reagenzien, in denen sich die An-
sätze unterschieden, bis überall das erwünschte Gesamtvolumen (25 oder 50 µl)
erreicht wurde. Als Template diente chromosomale DNA, resuspendiertes Kolonie-
material oder Plasmid-DNA, die eingesetzte Menge betrug 10-20 ng/µl. Um die
Reaktionen zu überprüfen wurden stets mindestens eine Positivkontrolle und eine
Negativkontrolle mitgeführt. Zur Durchführung der PCR wurde ein Thermocycler8 ver-
wendet, wobei die zu durchlaufenden Programme den einzelnen Primern und Frau-
gestellungen angepasst wurden (s. Tab. 1). Die Standardpufferbedingungen: 1 x
PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM pro Nucleotid, 0,5 µmol pro Primer, 1,0 bis 2,5
Einheiten Taq-DNA-Polymerase® oder Gotaq®, Template in variabler Menge.
Die Analyse der PCR-Produkte geschah mittels Agarosegel-Elektrophorese unter
Mitführung eines Größenmarkers (2log Ladder®). Zur Aufreinigung von PCR-Produk-
ten wurde das NucleoSpin® Extract II-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
nach Anweisung des Herstellers verwendet.
8 primus 96 advanced
®, peQLab, Erlangen, Deutschland
C Material und Methoden 40
Tab. 1 In dieser Arbeit verwendete Primer
Primerpaar Beschreibung Quelle
RBgl12 RBgl24
5’-GATCTGCGGTGA-3’ 5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’ Oligonukleotide für den Einsatz in der RDA (Adaptoren und Primer) PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 35 x (94 °C/1:00 min, 58 °C/1:00 min, 72 °C/3:00 min), 72 °C/10:00 min
(LISITSYN et al. 1993)
oMP_A1 oMP_A2
5’-GGTTCTAGTTCACAAACAGCCAATAC-3’ 5’-GATATTTACCCCTGCCTTCATTGTATC-3’ Produktgröße 964 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers hhdA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
oMP_B1 oMP_B2
5’-ATCTTGCCCTGATTAGAGAGTAGGAGT-3’ 5’-GTGAATATAGCCCTTATCCAAATAGGC-3’ Produktgröße 557 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers hhdB PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
oMP_CirA1 oMP_CirA2
5’-GTATGCAGAATAAAGCCCTGCTAAAC-3’ 5’-AAAGAGCCGAGAAATATCGTAGATGTG-3’ Produktgröße 161 bp Primer zum Nachweis des Virulenzmarkers cirA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
oPhage13_1 oPhage13_2
5’-GCTTGCGGGTAATCTGTTGT-3’ 5’-AGAATCAACCTCAGCCGAAA-3’ Produktgröße 301 bp Primer zur gleichzeitigen Überprüfung auf das Vorhandensein der beiden phagenassoziierten Gene PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
oPhage8_1 oPhage8_2
5’-GATCTCACCCGAGCATCAC-3’ 5’-GCTGGGGTGTACGATAATGC-3’ Produktgröße 266 bp Primer zur Überprüfung auf das Vorhandensein auf Gen des hypothetischen Proteins HPS_09285 PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
oHhdA4 oHhdB1
5’-TTACACTGGGATTTGTCACC-3’ 5’-ATAATCCCTCGCCTGCTGTT-3’ Produktgröße 3368 bp Bindungsstellen in den Genen hhdBA PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/4:00 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
Hps-f Hps-r
5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’ 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’ Produktgröße 821 bp Primer zum Speziesnachweis von H. parasuis
PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 59 °C/0:45 min, 72 °C/1:00 min), 72 °C/10:00 min
(OLIVEIRA et al. 2001)
C Material und Methoden 41
Primerpaar Beschreibung Quelle
5_8SR LR7
5’-TCGATGAAGAACGCAGCG-3’ 5’-TACTACCACCAAGATCT-3’ Produktgröße variabel Universelle Primer zur Spezifitätsüberprüfung der Primer für die Multiplex-PCR, basierend auf der 60S rDNA von Eukaryoten PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 53 °C/0:45 min, 72 °C/2:00 min), 72 °C/10:00 min
http://www.biology.duke.edu/ fungi/mycolab/ primers.htm
oRNA_1 oRNA_2
5’-TGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3’ 5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAG-3’ Produktgröße 892 bp Universelle Primer zur Spezifitätsüberprüfung der Primer für die Multiplex-PCR, basierend auf der 16S rDNA von Bakterien PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 57 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
tbpA33 tbpA 55
5’-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3’ 5’-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3’ Produktgröße 1,9 kb Primer zum Einsatz in der RFLP-PCR (Amplifzierung eines Produktes aus dem Gen tbpA) PCR-Programm: 94 °C/10:00 min, 36 x (94 °C/1:00 min, 50 °C/0:45 min, 72 °C/2:30 min), 72 °C/10:00 min
(DEL RIO et al. 2006a)
M13 forward M13 reverse
5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ Bindestelle in Plasmiden, Amplifizierung des Inserts aus einem Plasmid PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/3:00 min), 72 °C/10:00 min
Amersham Bioscience
oPorin1 oPorin2
5’-TCAACAGGTGGTCACACTAA-3’ 5’-TAGCACCTAACGTCAAACCT-3’ stammabhängige Produktgröße (ca. 350-430 bp) Primer mit der Bindestelle im Gen des OMP P2 Proteins von H.parasuis PCR-Programm: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 55 °C/0:45 min, 72 °C/0:30 min), 72 °C/10:00 min
diese Arbeit
2.2.1.3.1 Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR
In der Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -PCR wurde mittels H. pa-
rasuis speziesspezifischer Primer (tbpA33 und tbpA55, DE LA PUENTE REDONDO
et al. 2000) ein 1,9 kb großes Fragment aus dem Gen tbpA amplifiziert. An-
schließend erfolgte ein Verdau mit dem Restriktionsenzym RsaI sowie ein Vergleich
des entstandenen Bandenmusters in der Gelelektrophorese.
C Material und Methoden 42
2.2.1.4 Primer
Die Primerauswahl erfolgte mit der Internet-Software „Primer3“ (http://fokker.wi.mit.
edu/primer3/input.htm, Version 0.4.0). Die Primer wurden von Invitrogen® oder bio-
mers.net GmbH bzogen.
Die vergewendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet.
2.2.1.5 Agarosegel-Elektrophorese
Die optische Darstellung von DNA erfolgte im Agarosegel per Elektrophorese
(SAMBROOK et al. 1989). Für analytische Zwecke wurden Gele in der gewünschten
Agarosekonzentration (größere Fragmente ab 1000 bp mit 0,8 %, kleinere Fragmen-
te unter 1000 bp mit 1,5 % oder 2 % Agarose) mit 0,5 x TBE-Puffer (s. Anhang Tab.
13) verwendet. Pro ml Gel bzw. Laufpuffer wurden 200 ng Ethidiumbromid zugesetzt.
Je nach gewünschter Laufgeschwindigkeit und -weite variierten die elektrischen
Spannungen sowie die Laufzeiten, in der Regel betrugen sie 180 V und 60 Minuten9.
Die Dokumentation erfolgte mit dem Gerät Gel Doc® und der Software Quantity One®
(Version 4.6.1) von BioRad (München, Deutschland), die anschließende Bildbear-
beitung mit dem Picture Manager® von Microsoft (Unterschleißheim, München,
Deutschland).
2.2.1.6 Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Bei sehr geringen Fragmentgrößen (Herstellung der Adaptoren: Länge bis 24 bp)
wurde die Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) verwendet (s. Anhang Tab. 14).
Die Kammer10 wurde mit 1 x TBE-Puffer aufgefüllt und die DNA-Fragmente bei 120 V
und 80 mA über 90 Minuten aufgetrennt. Die Färbung des Gels erfolgte mit
Ethidiumbromid (200 ng/ml TBE-Puffer), die Dokumentation analog zur Agarosegel-
Elektrophorese (s. C2.2.1.5).
9 Gelsystem Maxi M
®, peQLab, Erlangen, Deutschland
10 Minigel-Twin
®, Biometra, Göttingen, Deutschland
C Material und Methoden 43
2.2.1.7 Koloniegel
Für Koloniegele wurde Koloniematerial in 30 µl vorgewärmtem Lysepuffer (40-45 °C)
resuspendiert (s. Anhang Tab. 15), für fünf Minuten bei derselben Temperatur
erwärmt und anschließend fünf Minuten auf Eis gestellt. Nach einem einminütigen
Zentrifugationsschritt bei 14.000 g erschien der Detritus als Pellet. Vom Überstand
wurden 15-30 µl auf ein TBE-Gel aufgetragen.
2.2.1.8 Klonierung
Bei Standard-Klonierungen von PCR-Produkten wurde das StrataClone PCR Cloning
Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) nach Anweisung des Herstellers verwendet.
Für Klonierungen ohne Zuhilfenahme eines Kits wurde nach Anzucht einer ent-
sprechenden Zelllinie zunächst das gewünschte Plasmid mittels Alkalilysis-Verfahren
(s. C2.2.1.2) präpariert. Nach Linearisierung durch einen Restriktionsenzymverdau
(s. C2.2.1.8.1) und Behandlung des Vektors mit alkalischer Phosphatase (Antarctic
Phosphatase®) wurde das DNA-Fragment durch T4-DNA-Ligase® in den Vektor
integriert (s. C2.2.1.8.2) und dieser in chemisch kompetente Zellen transformiert (s.
C2.2.1.9).
2.2.1.8.1 Restriktionsenzymverdau
Der Verdau von DNA durch Restriktionsenzyme erfolgte nach der Methode von
Sambrook in Ansätzen von bis zu 100 µl (SAMBROOK et al. 1989). Pro 100 µl
Ansatz wurden maximal 10 µg DNA eingesetzt und die Restriktionsenzyme mit dem
entsprechenden Puffer nach Angaben des Herstellers verwendet. Anschließend
wurde das Volumen mit Aqua dest. auf 100 µl aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte für
drei bis vier Stunden oder über Nacht bei der durch das Enzym vorgegebenen
Temperatur. Der Erfolg des Verdaus wurde per Agarosegel-Elektrophorese überprüft
und die DNA im Anschluss gegebenenfalls aufgereinigt (NucleoSpin® Extract II-Kit,
Macherey-Nagel, Düren, Deutschland).
C Material und Methoden 44
2.2.1.8.2 Ligation
Mittels T4-DNA-Ligase® wurden doppelsträngige DNA-Abschnitte mit zueinander
komplementären überstehenden Enden (3‘- mit 5‘-Ende) kovalent verbunden
(SAMBROOK et al. 1989). Hierbei handelte es sich entweder um lineare DNA oder
um einen zirkulären Vektor, in welchen gezielt Fremd-DNA eingebracht wurde. Ein
25 µl-Ansatz bestand aus maximal 2,5 µg DNA, 2,5 µl 10 x Ligasepuffer und 0,75 µl
Ligase und wurde mit Aqua dest. aufgefüllt. Zur Insertion eines Fragments in einen
Vektor wurde dieser vorher per Restriktionsenzymverdau linearisiert und mit
Antarctic Phosphatase® behandelt. Das Mengenverhältnis von Vektor- und Insert-
DNA betrug in einem ersten Ansatz ca. 1:2, in einem zweiten Ansatz ca. 1:5. Ein
dritter Ansatz wurde ohne Insert mitgeführt, um die Behandlung mit alkalischer
Phosphatase zu überprüfen, in einem vierten Ansatz fehlte die T4-DNA-Ligase®, um
den Restriktionsenzymverdau zu kontrollieren.
Die Inkubation geschah über Nacht bei 16 °C im Wasserbad11. Zur Transformation in
E. coli wurde die Hälfte des Ligationsansatzes eingesetzt.
2.2.1.9 Transformation
In dieser Arbeit wurden Plasmide mit der Methode der chemischen Transformation in
E. coli Zellen eingebracht (SAMBROOK et al. 1989). Bei Arbeiten mit dem Strata-
Clone PCR Cloning Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) wurde der Transformations-
schritt nach Anweisung des Herstellers durchgeführt.
Für Transformationen ohne Cloning Kit wurden chemokompetente E. coli Zellen auf
Eis aufgetaut und der 25 µl Ligationsansatz (Vektor mit Insert) zu mindestens 100 µl
Zellsuspension gegeben. Die Komponenten wurden vorsichtig vermischt und für 60
Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 °C für drei Minuten12
wurden sie erneut für ein bis zwei Minuten auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 200 µl
LB-Medium regenerierten die Zellen für 60 Minuten bei 37 °C im Schüttelinkubator13
11
RE104, Lauda GmbH & CO. KG, Lauda-Königshofen, Deutschland
12 Labtherm
®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland
13 innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA
C Material und Methoden 45
und exprimierten die auf dem Plasmid befindlichen Antibiotika-Resistenzmarker. Das
Ausplattieren erfolgte auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikazusatz.
2.2.1.10 Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen
Zur Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen nach der Methode von Sam-
brook wurde zunächst der gewünschte Stamm auf LB-Agar ausplattiert und über
Nacht bei 37 °C bebrütet (SAMBROOK et al. 1989). Eine Einzelkolonie diente am
Folgetag darauf als Ausgangsmaterial zur Beimpfung von 1,5 ml LB-Flüssigmedium.
Dieses wurde als Standkultur erneut bei 37 °C über Nacht bebrütet. Gleichzeitig
wärmten über Nacht 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 auf 37 °C vor. Diese
größere Menge Medium wurde am nächsten Tag mit der Standkultur beimpft und als
Schüttelkultur bei 37 °C bis zu einer OD66014 von 0,3-0,4 bebrütet. Die Probe wurde
nun 1-2 min auf Eis gestellt und anschließend in der vorgekühlten Zentrifuge (4 °C)
pelletiert (10 min, 7.000 g). Nach Verwerfen des Überstandes erfolgte die Resuspen-
sion des Pellets in 5 ml eisgekühlter TFB1-Lösung (s. Anhang Tab. 16). Einer
Inkubation auf Eis für mindestens 90 Minuten folgte ein erneutes Pelletieren bei 4 °C
(10 min, 7.000 g) und eine Resuspension des Pellets in 5 ml eiskalter TFB2 Lösung
(s. Anhang Tab. 16). Nach einer Inkubation auf Eis von maximal 30 Minuten wurde
die Lösung in ebenfalls auf Eis stehende Reagiergefäße aliquotiert (jeweils ca. 250 µl
pro Gefäß) und bei -70 °C eingefroren.
2.2.1.11 Repräsentative Differenzanalyse
In dieser Arbeit wurde eine modifizierte Form der 1993 von Lisitsyn et al. veröf-
fentlichten Methode angewendet (s. Abb. 1), um das Genom eines H. parasuis
Referenzstammes von dem eines zweiten zu subtrahieren, spezifische Sequenzen
des letzteren zu erhalten und selektiv zu amplifizieren (LISITSYN et al. 1993). Hierfür
wurden Referenzstämme mit unterschiedlichen Eigenschaften ausgewählt und das
Genom des als apathogen geltenden Serotyps 11 („Driver“) vom Genom der inva-
siven Stämme 5 bzw. 12 („Tester“) subtrahiert.
14
Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland
C Material und Methoden 46
Chromosomale DNA beider Stämme wurde in getrennten Ansätzen einem Restrik-
tionsenzymverdau mit einer Kombination aus den Enzymen DpnI und DpnII unter-
zogen. Die generierten Fragmente wiesen einen 5’-GATC-Überhang auf. Die Präzipi-
tation der DNA erfolgte durch Zugabe von 1/10 Vol. 3M Natrium-Acetat (v/v), pH 5,2
und 2,5 Vol. 96 %igem Ethanol (v/v) mit anschließendem Kühlstellen bei -20 °C für
mindestens zwei Stunden. Die DNA wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten
abzentrifugiert (16.000 g), mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen, erneut für zehn
Minuten bei 16.000 g zentrifugiert und ebensolange luftgetrocknet. Die Resuspension
erfolgte in ca. 50 µl Aqua dest..
Aus Oligonukleotiden wurden teilweise doppelsträngige Adaptoren hergestellt, um
sie an die DNA-Fragmente zu ligieren. Jeweils 20 µl der 100 µM konzentrierten
Primer RBgl12 und RBgl24 wurden mit 10 µl 10 x Ligasepuffer vermischt und hybri-
disierten im Thermocycler. Dieser senkte die Temperatur in 10 minütigen Intervallen
von 94 °C, über 67 °C, 42 °C, 37 °C und 22 °C auf 16 °C ab. Das korrekte Annealing
der komplementären Primerbereiche wurde in einem 18 %igen TBE-Acrylamidgel (s.
Anhang Tab. 14) überprüft. Das überhängende 5‘-Ende des 12mer Primers war kom-
plementär zu dem durch den Restriktionsenzymverdau entstandenen Überhang der
chromosomalen DNA, die restlichen acht Basen waren komplementär zum 3‘-Ende
des 24mer Primers.
Für die Ligation der Adaptoren an die Tester-DNA wurden jeweils 25 µl Adaptor mit
25 µl aufgereinigtem Verdau gemischt und 2 µl 25 mM ATP und 1 µl T4-DNA-Liga-
se® zugefügt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C, die Präzipitation durch
Zugabe von Natrium-Acetat und Ethanol (s.o.). Je 2,5 µl des Ansatzes dienten als
Template für eine PCR mit RBgl24 (s. Tab. 1). Die DNA-Taq-Polymerase® wurde erst
nach Erwärmen im Thermocycler15 auf 72 °C hinzugefügt und zunächst für fünf Mi-
nuten bei dieser Temperatur inkubiert, um ein Auffüllen der 5‘-Überhänge zu ermög-
lichen. Nach Beendigung der PCR wurden die Ansätze gepoolt und einer Natrium-
Acetat-Ethanol-Präzipitation (s. o.) unterzogen. Die Resuspension erfolgte in 100 µl
Aqua dest.
15
primus 96 advanced®, peQLab, Erlangen, Deutschland
C Material und Methoden 47
Ein Gemisch aus 20 µg Driver und 20 bzw. 200 ng Tester wurde nach einer Natrium-
Acetat-Ethanol-Präzipitation in 4 µl PCR-Puffer resuspendiert. Nach Überschichtung
mit Mineralöl wurde die Probe im Thermocycler auf 95 °C erhitzt, dann um 1 µl einer
5 M NaCl-Lösung ergänzt und für 20 Stunden bei 67 °C im Thermocycler inkubiert.
Nach Zugabe von 20 µl Aqua dest. dienten 2,5 µl des Ansatzes und dessen Ver-
dünnungen (1:10, 1:100 und 1:1000) als Template in einer PCR mit RBgl24. Die
Analyse der Produkte erfolgte in einem 1,5 %igen Agarosegel.
Verdau mit Sau3A1Driver (11) Tester (5)
Ligation von Adaptoren
Mischen,
Denaturieren
& Inkubieren
Auffüllen der Enden und PCR mit
testerspezifische Fragmente
Abb. 1 Schemazeichnung Repräsentative Differenzanalyse (modifiziert)
C Material und Methoden 48
2.2.1.12 Markieren von Gensonden mit 32P-dCTP
Zur radioaktiven Markierung von DNA wurde 32P-dCTP verwendet (FEINBERG u.
VOGELSTEIN 1983). Die eingesetzten 20-30 ng DNA wurden in 15,5 µl Aqua dest.
resuspendiert, für fünf Minuten bei 100 °C denaturiert und anschließend auf Eis ge-
stellt. Bei den weiteren Reagenzien handelte es sich um 5 µl OLB (s. Anhang Tab.
17), 1 µl acetyliertes BSA (10 mg/ml), 1 µl T4-DNA-Polymerase® (Klenow-Fragment)
und 2,5 µl des Isotops (32P-dCTP, 3000 Ci/mmol). Der Ansatz inkubierte für vier bis
fünf Stunden bei Raumtemperatur, bevor ihm 100 µl Stopp-Lösung (s. Anhang Tab.
17) hinzugefügt wurden. Vor Benutzung der Gensonde erfolgte ein Aufkochen für
fünf Minuten bei 100 °C16 mit anschließendem Herunterkühlen auf Eis für ca. eine
Minute. Pro Hybridisierung wurden 50-70 µl der Sonde eingesetzt.
2.2.1.13 Southern Blot
Im Southern Blot wird zunächst die in einem Agarosegel aufgetrennte DNA auf eine
positiv geladene Nylonmembran transferiert (Southern Transfer) und diese an-
schließend zur Detektion spezifischer DNA-Sequenzen mit einer Gensonde inkubiert
(Southern Hybridisierung).
2.2.1.14 Southern Transfer
Der Southern Transfer überträgt mittels Gelelektrophorese aufgetrennte DNA von
einem TBE-Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran.
Das Agarosegel wurde zur Denaturierung der DNA für eine Stunde in drei- bis vier-
mal gewechselter Lösung 1 (1,5 M NaCl, 0,5 NaOH) geschwenkt. Das Gesamt-
volumen der eingesetzten Schwenkflüssigkeit betrug ca. das Zehnfache des Gelvolu-
mens. Die Neutralisation erfolgte für eine Stunde in Lösung 2 (1 M Tris-HCl, pH 8.0,
1,5 M NaCl), welche in der gleichen Gesamtmenge eingesetzt und ebenfalls drei- bis
viermal ausgewechselt wurde. Der Aufbau der Transfereinrichtung bestand aus ei-
nem Unterbau, welcher in eine Plastikschale gelegt wurde. Diesen bedeckten zwei
Lagen Filterpapier, wovon eine über den Unterbau hinaus bis in die Schale reichte.
16
Multi Block® Heater, LAB-LINE, Kleinfeld-Labortechnik GmbH, Gehrden, Deutschland
C Material und Methoden 49
Die Schale wurde mit 10 x SSC-Puffer befüllt (Laufpuffer) und das Gel mit der
Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt. Als nächstes wurde die mit Aqua
dest. angefeuchtete Nylonmembran luftblasenfrei auf das Gel gelegt, bedeckt von
zwei weiteren Schichten trockenem Filterpapier. Die obersten Lagen wurden durch
ein 3-5 cm dickes Kissen aus Papierhandtüchern gebildet, welches das Saugkissen
darstellte und mit einem Gewicht (ca. 500 g) beschwert wurde. Die Blottingdauer war
abhängig von der Anzahl der zu erzeugenden Membranen: Für eine Membran wurde
der Blot über Nacht angesetzt, bei zwei Membranen wurde die erste nach zwei
Stunden gewechselt und die zweite über Nacht in der Vorrichtung belassen, bei drei
Membranen wurde die erste Membran nach zwei Stunden gegen die zweite aus-
getauscht, die zweite nach einer weiteren halben Stunde und die dritte verblieb über
Nacht. Die Entnahme der Membranen begann jeweils mit dem Entfernen der Auf-
lagen und der gemeinsamen Abnahme von Gel und Membran. Nach dem Umdrehen
des Gels wurden die Taschen mit Bleistift auf der Membran vermerkt und diese dann
vom Gel abgezogen. Als zusätzliche Markierung fehlte sämtlichen Membranen die
linke untere Ecke. Die Membran wurde für fünf Minuten in 5 x SSC geschwenkt und
in Papierhandtüchern getrocknet. Das anschließende Backen erfolgte für eine Stun-
de bei ca. 90 °C17.
2.2.1.15 Southern Hybridisierung
Die Membran eines Southern Transfers wird in der Southern Hybridisierung mit einer
radioaktiv markierten Gensonde inkubiert (SAMBROOK et al. 1989; SOUTHERN
1975).
Die im Southern Transfer erzeugte Membran wurde in einer Glasflasche bei stän-
diger Rotation für zwei Stunden bei 60 °C mit ca. 50 ml Hybridisierungspuffer (s.
Anhang Tab. 18) prähybridisiert18. Nach dem Abgießen der Flüssigkeit erfolgte die
Zugabe einer frischen Menge (50 ml) Hybridisierungspuffer, 50-70 µl frisch dena-
turierter Gensonde und der Positivkontrolle. Die Hybridisierung erfolgt bei 60 °C über
Nacht, ebenfalls bei sich stets drehendem Rotor. Am nächsten Tag wurde die Mem-
17
Hitzeofen, Boskamp GmbH, Hersel, Deutschland
18 Mini Hybridisation Oven, Appligene, Heidelberg, Deutschland
C Material und Methoden 50
bran nach Abgießen der Flüssigkeit zunächst zwei Mal für 30 Minuten mit einer Lö-
sung aus 3 x SSC und 0,5 % SDS gewaschen. Nach der Überprüfung der Strah-
lungsintensität wurde entweder mit anderer Stringenz erneut gewaschen (1 x SSC,
0,5 % SDS oder 0,1 x SSC, 0,5 % SDS) oder sofort ein Röntgenfilm exponiert. Die
Beschriftung der Membran erfolgte mit einem Radiographiestift. Die Membran wurde
zuunterst in eine Röntgenfilmkassette gelegt, darauf der bei Rotlicht eingelegte Rönt-
genfilm und zuoberst eine Verstärkerfolie. Die Exposition fand bei -70 °C statt. Die
Zeitdauer hing von der Aktivität des Blots ab und betrug ca. drei bis 48 Stunden.
2.2.1.16 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
Die Sequenzierung von DNA-Proben wurde durch die Firma Seqlab aus Göttingen,
Deutschland, an einem ABIPRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Ketten-
abbruchmethode nach Sanger (SANGER et al. 1977) durchgeführt. Zur Sequen-
zierung größerer Abschnitte wurde „Primer-Walking“ verwendet. Die Analyse der Da-
ten geschah mittelst BLASTx, BLASTn und dem Alignprogramm der Homepage des
National Centre for Biotechnology Information (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,
Version 2.2.18+).
2.2.2 Arbeiten mit RNA
2.2.2.1 Präparation von RNA
H. parasuis wurde in einer Schüttelkultur (BHI-Medium mit Serumzusatz und EIVX, s.
C2.1.2) bei 37 °C bis zu einer OD60019 von 0,4 inkubiert. Die RNA wurde mit dem
RNeasy Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus 5 ml der Kultur nach den Anwei-
sungen des Herstellers präpariert. Zur DNAse Behandlung wurde Turbo-DNAse® (s.
Anhang Tab. 9) verwendet.
2.2.2.2 Reverse Transkriptase-PCR
Der Mastermix für die RT-PCR enthielt 5 µg RNA und 50 pmol Random-Hexamer-
Primer. Er wurde auf zwei Ansätze verteilt, wovon nur einem Reverse Transkriptase
zugegeben wurde. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 60 Minuten wurde eine PCR
19
Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland
C Material und Methoden 51
durchgeführt, wofür das cDNA-Template sowie der Kontrollansatz in einer 1:100-
Verdünnung mit Aqua dest. verwendet wurden. Die eingesetzten Primer waren spe-
zifisch für die zu überprüfenden RDA-Fragmente (s. Tab. 1). Die PCR wurde mit 0,25
Units GoTaq® und über 30 Zyklen durchgeführt, dabei wurden 5 µl der angesetzten
Verdünnungen als Template eingesetzt (PCR-Bedingungen: 94 °C/3:00 min, 30 x [94
°C/0:30 min, 55 °C/1:00 min, 72 °C/1:30 min], 72 °C/10:00 min). Alle Ansätze wurden
in dreifacher Ausführung durchgeführt.
2.2.3 Arbeiten mit Proteinen
2.2.3.1 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Zur Darstellung von Proteinen wurden diese in einem 10 %igen Polyacrylamidgel
(eindimensionale SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, SDS-PAGE) aufgetrennt
(LAEMMLI 1970). Die Herstellung des Gels sowie des Laufpuffers erfolgte nach dem
Rezept im Anhang, Tabelle 19. Die Slots wurden mit 15-20 µl Probe (s. C2.2.3.2)
beladen und der Laufpuffer 1 x eingesetzt. Als Größenstandard wurden 2-3 µl des
Pageruler Protein Ladder® (gefärbt oder ungefärbt) mitgeführt. Zur Ansammlung der
Proteine im Sammelgel erfolgte initial ein 20 minütiger Lauf bei 80 V, gefolgt von
einem 60-80 minütigen Lauf bei 130 V zur Auftrennung der unterschiedlichen
Proteinfraktionen. Die Färbung der Gele erfolgte mit einer Coomassie-Blau-Färbung
(s. Anhang Tab. 19). Das Gel wurde den Glasplatten entnommen und in einer
Plastikschale für ca. eine Stunde mit der Färbelösung auf dem Schütteltisch20 inku-
biert. Nach Abgießen der Lösung folgte ein Schwenken in Entfärberlösung (s. An-
hang Tab. 19), wobei diese drei- bis viermal gewechselt wurde. Die Dokumentation
der Gele erfolgte mittels Durchlichtscanner, die Feststellung der Bandengrößen mit
der Analysesoftware Quantity One® (Version 4.6.1, BioRad, München, Deutschland).
2.2.3.2 Ganzzelllysate
Zur Vorbereitung der Proben von Ganzzelllysaten wurde eine ca. stecknadelkopf-
große Menge Koloniematerial einer über Nacht bei 37 °C bebrüteten Kochblut-NAD-
Platte (5 % CO2) in 100 µl Wasser resuspendiert und eine Teilmenge anschließend
20
Landgraf Hannover, Deutschland
C Material und Methoden 52
1:1 mit 2 x Spaltpuffer (s. Anhang Tab. 19) versetzt. Nach einer Erhitzung für zwei
Minuten auf 100 °C21 waren die Proben ladefertig.
2.2.3.3 Massenspektrometrie
Die Probenaufbereitung erfolgte für beide Formen der Massenspektrometrie ein-
heitlich nach der Methode nach Wilm und Mann (SHEVCHENKO et al. 1996). Alle
flüssig verwendeten Chemikalien wurden in Millipore-Wasser resuspendiert. Zu-
nächst wurden die gewünschten Proteinbanden mit einem Skalpell aus dem Pro-
teingel geschnitten und dabei möglichst wenig des umgebenden Gels mit entfernt.
Um die Oberfläche zu erhöhen, wurde das Gelstück in möglichst kleine Stücke
zerschnitten und in ein Eppendorf-Reagiergefäß überführt. Zur vollständigen Entfär-
bung erfolgte ein erster Waschschritt mit ca. 500 µl 50-100 mM Ammoniumbicar-
bonat, die Waschlösung wurde anschließend verworfen. Es folgten zwei weitere
Waschungen mit ca. 500 µl 50 nM Ammoniumbicarbonat/50 % Acetonitril mit jeweils
30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und drei- bis viermaligem Vortexen22. Die
Waschlösungen wurden ebenfalls verworfen. Die Gelstücke wurden nun mit 100 µl
100 % Acetonitril überschichtet und für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Von den nun geschrumpften und weißlichen Gelstücken wurde die Flüssigkeit abge-
nommen und verworfen. Durch Inkubation bei 37 °C oder Behandlung in der Vaku-
umzentrifuge23 wurde die vollständige Trocknung der Gelstücke erreicht. Zur Redu-
zierung des Cysteins erfolgte nach Zugabe von 30 µl eines 10 mM DTT/100 nM
Ammoniumbicarbonat-Puffers eine Inkubation im Wasserbad bei 56 °C für 60 Minu-
ten. Anschließend kamen zur Alkylierung der Cysteinreste 30 µl einer 55 mM Iod-
acetamid/100 mM Ammoniumbicarbonat-Lösung hinzu und die Probe wurde im Dun-
keln bei 25 °C für 45 Minuten inkubiert. Die Lösungen wurden abgenommen und
verworfen. Ein weiterer Waschschritt erfolgte bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit
100 µl 50 mM Bicarbonat, welches im Anschluss wieder abgenommen wurde. Die
Trocknung der Proben erfolgte durch Zugabe von Acetonitril und einer Speedvac-
21
Labtherm®, Liebisch, Bielefeld, Deutschland
22 lab dancer, IKA
® GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland
23 DNA Speed Vac
® DNA 110, Savant Instruments Inc., New York, USA
C Material und Methoden 53
Behandlung analog zu den oben beschriebenen Schritten. Die Schritte der Bicarbo-
natwaschung und der Trocknung wurden noch einmal wiederholt, bevor die Proteine
durch Zugabe einer 20 µg/ml Trypsin enthaltenden und in 25 mM Ammoniumbi-
carbonat gepufferten Lösung verdaut wurden. Die Menge war abhängig davon, wie
viel Flüssigkeit die Gelstücke aufsaugten (3-15 µl). Nach fünf Minuten Inkubation
wurde noch einmal so viel 25 mM Bicarbonat-Lösung dazugegeben, dass die Proben
vollständig bedeckt waren, die Gefäße dann verschlossen, mit Parafilm abgedichtet
und für 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der Überstand wurde aufbewahrt und die
Gelstücke mit einer Lösung aus 0,5 % Ameisensäure und steigenden Acetonitrilkon-
zentrationen im Ultraschallbad24 inkubiert. Im ersten Schritt enthielt die Lösung 20 %,
im zweiten 50 % und im dritten 80 % Acetonitril. Zugegeben wurden jeweils 30-50 µl
und die Inkubationsdauer betrug pro Konzentration 30 Minuten. Vor dem Abnehmen
der Überstände wurden die Proben stets gevortext und anzentrifugiert. Die Überstän-
de der Extraktionsschritte wurden mit dem ersten Überstand vereint und in einem
Reagiergefäß in der Speedvac getrocknet.
2.2.3.4 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry
Die massenspektrometrische Untersuchung mittels Matrix Assisted Laser Desorp-
tion/Ionisation Time-of-Flight-Mass Spectrometry (MALDI-TOF, Voyager-DE® Pro,
Applied Biosystems, Forster City, USA) wurde am Institut für Mikrobiologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Bei dieser Analyse werden
Probe und Matrix mit einem Laserstrahl beschossen, wobei die Matrix verdampft und
die Probenmoleküle mitreißt. Letztere wird bei diesem Vorgang ionisiert und die
Masse der Ionen anhand ihrer Flugzeit durch ein elektronisches Feld berechnet.
Für Untersuchungen mittels MALDI-TOF-MS wurden die aufgereinigten und ver-
dauten Proben zusammen mit einer Matrix auf einen Probenträger aufgetragen. Die
Matrix (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, ACHC) wurde zunächst in 50 % Acetonitril/0,1
% Trifluoressigsäure in der Konzentration von 10 mg/ml angesetzt, ca. fünf Minuten
gevortext und zur Entfernung eventueller Verunreinigungen noch einmal für fünf
24
3210 Branson, G. Heinemann, Schwäbisch-Gmünd, Deutschland
C Material und Methoden 54
Minuten abzentrifugiert. Die obere Hälfte des Überstandes wurde im Anschluss auf 5
mg/ml verdünnt. Der Größenstandard bestand aus 1 µl Kalibriermix (CalMix1® und
CalMix2®) und 24 µl Matrix, wovon jeweils 0,5 µl neben jeder einzelnen Probe auf-
getragen wurden. Die eingedampften Proben wurden in 3 µl 50 % Acetonitril/0,1 %
Ameisensäure/50 % Aqua dest. resuspendiert und eine Teilmenge 1:1 mit der Matrix
verdünnt (maximal 2 µl Gesamtmenge) und zügig auf den Probenträger aufgetragen.
Nach dem Auskristallisieren der Proben wurden die Messungen mithilfe des Pro-
gramms Voyager Control Panel® durchgeführt. Pro Probe wurden zunächst drei Mes-
sungen mit dem Standard durchgeführt und addiert, dann zehn Messungen der
Probe.
Die Korrektur und Analyse der Spektren erfolgte mit dem Programm Data Explorer®
V 4.8 (Applied Biosystems, Forster City, USA), welches die Spektren zunächst korri-
gierte (Entfernung des Hintergrundrauschens, Herausrechnen des hinzugefügten
Trypsins, Zusammenfügen der Mehrfachdaten einzelner Isotope eines Peptids, Kali-
brierung anhand des mitgemessenen Größenstandards) und Listen mit Peptidmas-
sen ausgab. Diese Angaben wurden über den Peptide Mass Fingerprint Algorithmus
der Mascot Homepage (www.matrixscience.com) mit der NCBI Datenbank abge-
glichen. In den Einstellungen wurde die Datenbank NCBI festgelegt und keine ausge-
lassenen Schnittstellen durch das Trypsin erlaubt. Durch die Aufbereitung der Pro-
ben ergaben sich die Einstellungen der Modifikationen: als feste Modifikation wurde
„Carbamidomethyl (C)“ eingestellt, hierbei handelte es sich um eine durch den Iod-
acetamidschritt bedingte Methylierung des Cysteins. Als variable Modifikation wurde
„Oxidation (M)“ gewählt, da eine Oxidierung des Methionins nicht regelmäßig statt-
fand. Die Peptidtoleranz wurde auf 0,2 festgesetzt.
2.2.3.5 Electro-Spray Injection Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry
Die Untersuchungen der Proteinproben mittels Electro-Spray Injection Quadrupole
Time-of-Flight Mass Spectrometry25 (ESI Q-TOF MS) wurden am Institut für Mikro-
biologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule durchgeführt. Hierbei werden zunächst
25
Q-TOF Ultima®, Waters, Milford, USA
C Material und Methoden 55
die Peptide der Proben ionisiert und ihre Masse anhand ihrer Fluggeschwindigkeit
detektiert. Optional erfolgt in einem zweiten Schritt ein Beschuss mit Argon, wodurch
die Peptide fragmentieren und ihre Aminosäuresequenz ermittelt werden kann. Zur
Identifikation der Proteine wurde das Programm des ProteinLynx Globals Server®
(Waters) verwendet, welches Vergleiche mit der Datenbank des NCBI anstellt.
2.3 Infektionsversuche an Schweinen
In dieser Studie wurde ein Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp
12 an fünf Wochen alten Ferkeln durchgeführt und dabei die intratracheale Infektion
mit der per Aerosol verglichen.
2.3.1.1 Zeitplan
Tag -4: Ankunft der Ferkel, Wiegen, Markieren und Gruppeneinteilung
Tag -3: Entnahme von Blutproben zur Untersuchung auf Antikörper gegen H. parasuis sowie von Nasentupfern und Tonsillenkratzproben zur Unter-suchung auf H. parasuis
Tag 0: Infektion der Ferkel mit H. parasuis, Referenzstamm Serotyp 12
Tag 8: Euthanasie und Sektion der Kontrollgruppe
Tag 9: Euthanasie und Sektion der beiden Versuchsgruppen
2.3.1.2 Herkunft und Unterbringung der Schweine
Von den zwölf eingesetzten Ferkeln waren sechs weiblich und sechs männlich. Die
männlichen Tiere stammten von einer vor sechs Monaten aus Frankreich zugekauf-
ten Sau ab, welche zu diesem Zeitpunkt frei von H. parasuis war. Seit Ankunft im Be-
trieb wurde sie nach vierwöchiger Quarantäne in den eigenen Bestand integriert. Die
weiblichen Ferkel stammten von einer in dem Betrieb selbst gezogenen Sau ab. Alle
Ferkel wiesen zum Zeitpunkt der Infektion keine Antikörper gegen H. parasuis auf (s.
C2.3.1.9). Die Einteilung der Tiere in drei Gruppen erfolgte zufällig, jede Gruppe be-
stand aus vier Tieren. Die intratracheal infizierten Tiere waren zusammen mit den
aerosolinfizierten Tieren untergebracht, die Kontrollgruppe in einer separaten Bucht.
Beide Räume wurden getrennt voneinander belüftet, geheizt und betreut. Die Hal-
tung fand in Übereinstimmung mit dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz
C Material und Methoden 56
der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere
(ETS 123) statt.
2.3.1.3 Präparation der Bakterien für die Infektion
Zwei Tage vor der Infektion wurde der Belastungsstamm aus dem Gefrierstock auf
einer Platte Kochblutagar mit NAD-Zusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C
bebrütet (5 % CO2). Nach 24 Stunden wurden zur Absicherung gegen eventuelle
Kontamination zwei Schüttelkulturen mit je 40 ml Medium (s. C2.1.2) mit drei bis vier
Einzelkolonien beimpft und über Nacht als Standkultur bebrütet (37 °C, 5 % CO2-
Zusatz). Gleichzeitig wurden zwei Kolben mit je 200 ml Medium im selben Brut-
schrank (37 °C, 5 % CO2-Zusatz) vorinkubiert. Am Tag der Infektion wurde diesen je
40 ml Medium als Negativkontrolle entnommen und die restlichen 160 ml mit den
Standkulturen beimpft. Die Inkubation der vier Schüttelkulturen26 erfolgte aerob bei
37 °C und 200 rpm. Bei einer OD66027 von 0,5 wurden die Kulturen für zehn Minuten
auf Eis gestellt und während dieser Zeit eine Gramfärbung durchgeführt. Bei Vor-
liegen ausschließlich gramnegativer kokkoider Keime wurde durch Zugabe von eis-
gekühlter NaCl-Lösung die gewünschte Verdünnung der Keimsuspension hergestellt.
Die Lagerung der Lösung erfolgte auf Eis.
2.3.1.4 Aerosolinfektion
Die Infektion der Aerosolgruppe wurde in einer Aerosolkammer28 basierend auf den
Beschreibungen von Jacobsen et al. (JACOBSEN et al. 1996a) durchgeführt. Die
Kammer ermöglicht die gleichzeitige Infektion von vier Ferkeln eines Alters von 7-12
Wochen. Das Dach der Kammer besteht aus einem Acrylfenster, so dass die Tiere
während der Exposition gut beobachtet werden können. Zwei mit Filtern bestückte
Ventile ermöglichen den Luftaustausch, wovon das eine mit einem Kompressor
verbunden ist. Sämtliche Schläuche bestehen aus autoklavierbarem Silikon oder Tef-
lon®. Die Bakteriensuspension wird mittels komprimierter Luft29 durch eine Düse30
26
innova 4300, NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC, Edison, USA
27 Ultraspec III, Pharmacia LKB, Freiburg, Deutschland
28 Impfstoffwerk Thornau Dessau, Dessau, Deutschland
29 Linde, Hannover, Deutschland
C Material und Methoden 57
aerosolisiert. Alle vier Ferkel der Aerosolgruppe wurden zusammen in die Kammer
getrieben. Die Düse wurde auf „5“ eingestellt, was eine große Sprühweite des Aero-
sols durch die Kammer erzeugte. Die Einstellung des den Durchfluss regulierenden
Ventils betrug „75“. Die Belastungsdosis wurde über einen Zeitraum von ca. zwei
Minuten bei einem Druck von 2 bar aerosolisiert und für zehn Minuten in der Kammer
belassen. Nach Öffnung des Frischluftventils erfolgte das Abpumpen des Aerosols
über eine Zeitspanne von 20 Minuten, was dem zehnfachen Luftvolumen der
Kammer entspricht. Die Ferkel wurden im Anschluss wieder zurück in ihren Stall
getrieben.
2.3.1.5 Intratracheale Infektion
Die intratracheale Belastung erfolgte an anästhesierten Ferkeln (Stresnil® und Urso-
tamin®, intramuskuläre Gabe von 2 mg Azaperon/kg KGW und 20 mg Ketamin/kg
KGW). Mittels eines Laryngoskops wurde den Tieren eine Ernährungssonde in die
Trachea eingeführt und die Belastungsdosis über eine Spritze appliziert.
2.3.1.6 Überwachung während des Experiments
Die Tiere wurden mindestens einmal, bei Bedarf auch mehrmals am Tag auf kli-
nische Anzeichen einer H. parasuis-Infektion untersucht. Dazu wurde die Rektaltem-
peratur jedes Tieres gemessen und adspektorisch das Allgemeinbefinden anhand
von Fressverhalten und Anteilnahme an der Umwelt beurteilt. Zusätzlich wurde auf
spezifischere Symptome wie Husten und Dyspnoe, Aufkrümmung des Rückens,
übermäßige Gelenkfüllung, Lahmheit oder Verhaltensweisen, die auf Störungen des
Zentralen Nervensystems hinweisen, geachtet.
2.3.1.7 Euthanasie und Sektion
Nach einer intramuskulär verabreichten Anästhesie (Stresnil® und Ursotamin®,
s. C2.3.1.5) wurde sämtlichen Tieren aus der Vena jugularis externa eine Blutprobe
entnommen und intravenös 4 ml Eutha® 77 verabreicht. Die Tiere wurden gewogen
und anschließend seziert.
30
Model Nr. 97058, Schlick Duesen, Untersiemau, Deutschland
C Material und Methoden 58
Es wurden sterile Tupferproben aus der Nasenhöhle, Bauch- und Brustraum, Peri-
kard, einem Kniegelenk und den Meningen des Großhirns entnommen, außerdem
Organproben aus den Tonsillen, der Lunge und einem Lungenlymphknoten. Die ad-
spektorische Untersuchung erfolgte nach vollständiger Eröffnung der jeweiligen Kör-
perregion.
2.3.1.8 Reisolation von H. parasuis
Das Ausplattieren der Tupfer- und Organproben erfolgte parallel auf vier verschiede-
nen Nährböden: Kochblutagar mit NAD-Zusatz, Blut- und Gassner- sowie CSB-Agar.
Die Kochblut- und CSB-Platten wurden bei 37 °C mit 5 % CO2-Zusatz inkubiert, die
Blut- und Gassnerplatten aerob bei 37 °C. Nach 24 Stunden erfolgte eine erste
Durchsicht mit Subkultivierung verdächtiger Kolonien (glattrandig, feucht, weiß-grau
und transparent) auf Blutplatten mit einer Staphylococcus aureus-Amme und Koch-
blutplatten mit NAD-Zusatz. Zusätzlich wurde von den Kochblut- und CSB-Platten mit
einem Trockentupfer eine Hälfte des dicken Impfstrichs abgenommen, in Aqua dest.
resuspendiert und bei -20 °C eingefroren. Nach 48 Stunden Bebrütungsdauer wur-
den noch einmal verdächtige Kolonien subkultiviert. Insgesamt wurden alle Platten
72 Stunden inkubiert.
Alle NAD-abhängig wachsenden Stämme wurden mittels PCR mit den Primern Hps-f
und -r (OLIVEIRA et al. 2001) überprüft und bei Entstehung eines 821 bp großen
Amplifikats als H. parasuis eingruppiert. Die positiven Stämme wurden als Gefrierkul-
tur konserviert, indem Kulturmaterial von einer über Nacht bebrüteten Agarplatte (5
% CO2) in 500 µl Medium (LB oder PPLO-Medium) resuspendiert und mit derselben
Menge 50 %igem Glycerin versetzt wurde. Die Aufbewahrung der Gefrierkulturen er-
folgte bei -80 °C.
C Material und Methoden 59
2.3.1.9 Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Die Untersuchungen auf Antikörper gegen H. parasuis mittels Enzyme Linked Im-
munosorbent Assay (ELISA) wurden durch die Gesellschaft für Innovative Veteri-
närdiagnostik mbH (IVD GmbH, Hannover, Deutschland) durchgeführt. Der verwen-
dete Test Swinecheck® HPS der Firma Biovet® (Auckland, New Zealand) basiert auf
nicht näher bezeichneten spezifischen Antigenen von H. parasuis.
D Ergebnisse 60
D Ergebnisse
1 Isolierung H. parasuis spezifischer Fragmente mittels Reprä-sentativer Differenzanalyse
In dieser Arbeit wurde eine modifizierte Form der Repräsentativen Differenzanalyse
(RDA) durchgeführt, bei der auf die initiale Amplifizierung der Fragmente mittels PCR
verzichtet wurde. Als Driver und Tester dienten die Referenzstämme zweier Sero-
typen, welche unterschiedliche Eigenschaften bezüglich ihrer Virulenz aufweisen. Als
Driver wurde der Referenzstamm von Serotyp 11 eingesetzt, welcher sich im Tierver-
such als avirulent erwiesen hatte, wohingegen der als Tester verwendete Refe-
renzstamm von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) eine hohe Virulenz aufwies und syste-
mische Läsionen verursachte (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der An-
satz wurde an Fragmenten chromosomaler DNA aus einem Restriktionsenzym-
verdau mit DpnI und DpnII durchgeführt (s. Abb. 2).
Abb. 2 PCR des RDA-Ansatzes mit dem Primer RBgl24 Ansatz in verschiedenen Verdünnungen als Template eingesetzt: 1:1 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), Kontrollansätze mit Tester (4), Driver (5) und Aqua dest. (6)
Das Amplifikat wurde mittels StrataClone® PCR Cloning Kit (Stratagene, La Jolla,
USA) nach den Angaben des Herstellers in den Vektor pSC-A kloniert und in den
mitgelieferten E. coli-Stamm (chemokompetent) transformiert, welcher ein Screening
durch Blau-Weiß-Selektion ermöglicht. 85 Klone wurden gepickt und in einer PCR
mit den Primern M13 forward und reverse eingesetzt, die Analyse der Produkte er-
folgte auf einem 1,5 % Agarosegel (s. Abb. 3).
D Ergebnisse 61
500 bp1000 bp
M Klone 1-41
M Klone 42-82
M 83-85
500 bp1000 bp
500 bp
1000 bp
Abb. 3 PCR von 85 RDA-Klonen mit den Primern M13 forward und reverse
1.1 Überprüfung der Spezifität der RDA-Fragmente
Die Überprüfung der Spezifität aller 85 PCR-Produkte erfolgte zunächst im Southern
Blot. Die im Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkte wurden mittels Southern
Transfer auf positiv geladene Nylonmembranen übertragen, wobei von jedem Gel
zwei Membranen angefertigt wurden. Die Hybridisierung der ersten Membran erfolg-
te mit einer radioaktiv markierten Gensonde aus einem Verdau chromosomaler
Tester-DNA mit DpnI und DpnII, die der zweiten Membran mit einer Sonde aus
ebenfalls mit DpnI und DpnII verdauter chromosomaler Driver-DNA. Als Positiv-
kontrolle wurde jedem Ansatz noch eine Membran hinzugefügt, auf welche Proben
der jeweils zur Sondenherstellung verwendeten DNA in drei Verdünnungsstufen
aufgetropft wurde. Aus dem Vergleich der Bindungsmuster beider Sonden ergab sich
die Spezifität der Produkte: Bei testerspezifischen Produkten band die Sonde aus
Tester-DNA um ein Vielfaches stärker, als die Sonde aus Driver-DNA (s. Abb. 4).
Von den 85 untersuchten Proben wurden 29 als spezifisch eingestuft, sequenziert
und einer Homologiesuche per Datenbankabgleich unterzogen. Für eine Auswahl an
Sequenzen wurden Primer konstruiert und weitere Stämme auf dieses Fragment hin
untersucht.
D Ergebnisse 62
Abb. 4 Southern Blot der 85 PCR-Produkte aus den RDA-Klonen mit M13-Primern A: Inkubation mit einer markierten Gensonde aus dem Verdau chro-mosomaler DNA von Serotyp 5, Nr. 1-29: Kennzeichnung der Proben für die Sequenzierung B: Inkubation mit einer markierten Gensonde aus dem Verdau chro-mosomaler DNA von Serotyp 11 eingesetzte Kontrollen: zur Sondenherstellung eingesetzte DNA in drei Verdünnungsstufen (200 ng, 20 ng und 2 ng/µl)
1.2 Homologiesuche und PCR
Die im Southern Blot spezifischen Fragmente für den Referenzstamm von Serotyp 5
wurden sequenziert und die Daten nach Bereinigung um die Adaptorsequenzen einer
Datenbankrecherche unterzogen. Die 29 sequenzierten Produkte waren zwischen
152 und 768 bp groß und ergaben 18 unterschiedliche Suchergebnisse. Tabelle 2
D Ergebnisse 63
gibt eine Übersicht über Sequenzen, für die zur erneuten Spezifitätsüberprüfung per
PCR Primer konstruiert wurden.
Sechs sich überschneidende Sequenzen wiesen Ähnlichkeiten mit einem hypothe-
tischen Protein von H. parasuis auf (HPS_09285, identische Aminosäuren = 69/102
[67 %], ähnliche Aminosäuren = 75/102 [73 %], ZP_02479249), zeigten zusätzlich
aber auch Homologien zu dem Protein gp 229 des Bakteriophagen SFi18 von Strep-
tococcus thermophilus (identische Aminosäuren = 68/109 [62 %], ähnliche Amino-
säuren = 75/109 [68 %], AF158601).
Ermittelt aus einem einzigen RDA-Klon ergaben sich zwei Sequenzen, die Homo-
logien mit hypothetischen Proteinen von H. parasuis zeigten (HPS_08882: identische
Aminosäuren = 40/43 [93 %], ähnliche Aminosäuren = 42/43 [97 %], ZP_02477853;
HPS_08887: identische Aminosäuren = 65/69 [94 %], ähnliche Aminosäuren = 68/69
[98 %], ZP_02477854). Diese finden sich in einem Teil der unvollständigen Genom-
sequenz von H. parasuis (NZ_ABKM01000009) und liegen direkt hintereinander
(HPS_08882: 34.385-34.747, HPS_08887: 34.757-35.068). Es zeigten sich aber
auch Ähnlichkeiten zu Proteinen von A. pleuropneumoniae, da HPS_08882 Ähnlich-
keiten zu einer phagenassoziierten Restriktionsendonuklease aufwies (identische
Aminosäuren = 32/43 [74 %], ähnliche Aminosäuren = 36/43 [83 %], YP_001968611)
und HPS_08887 zu einem putativen Protein zum Verpacken von Phagen-DNA (iden-
tische Aminosäuren = 55/69 [79 %], ähnliche Aminosäuren = 64/69 [92 %],
YP_001968612).
Zwei Sequenzen zeigten Übereinstimmungen mit einem Hämolysin: die eine war
identisch mit einem möglichen Hämolysinvorläufer (HhdA) von H. parasuis (iden-
tische Aminosäuren = 134/134 [100 %], ähnliche Aminosäuren = 134/134 [100 %],
AAZ67675), die zweite ähnelte dem Vorläufer der Untereinheit HhdB des ent-
sprechenden Proteins von H. ducreyi (identische Aminosäuren = 64/145 [44 %], ähn-
liche Aminosäuren = 101/145 [69 %], AAC43537). Beide Sequenzen fanden sich in
der unvollständigen Genomsequenz von H. parasuis wieder (NZ_ABKM00000000,
Position 125-1.912 und 1.948-2.640), in welcher mit dem Programm BPROM
(http://linux1.softberry.com/berry.phtml) kurz vor dem Beginn der Sequenz von hhdB
D Ergebnisse 64
die wahrscheinlichste Promotorregion identifiziert wurde (Promotorposition: 66, -10
Box an Position 31 und -35 Box an Position 51).
Das letzte Suchergebnis zeigte einerseits Homologien zum Protein CirA von M. hae-
molytica (identische Aminosäuren = 59/77 [76 %], ähnliche Aminosäuren = 68/77 [88
%], YP_088507), andererseits zu einem hypothetischen ATP bindenden ABC-Trans-
porter-Protein von A. pleuropneumoniae (identische Aminosäuren = 59/77 [76 %],
ähnliche Aminosäuren = 65/77 [84 %], ZP_00134583), einem TonB-abhängigen Si-
derophoren-Rezeptor von A. succinogenes (identische Aminosäuren = 49/77 [63 %],
ähnliche Aminosäuren = 64/77 [83 %], YP_001344473) sowie zu einem putativen
TonB abhängigen Rezeptorprotein von Neisseria meningitidis (identische Amino-
säuren = 47/75 [62 %], ähnliche Aminosäuren = 54/75 [72 %], YP_975298). Auch
diese Sequenz findet sich in einem Teil der unvollständigen Genomsequenz von
H. parasuis wieder (NZ_ABKM01000010, Position 26.558-26.890), in diesem Bereich
ist jedoch bislang kein putatives Protein vermerkt.
Von den 29 sequenzierten Proben wurden für fünf Sequenzen Primer konstruiert, um
erneut die Spezifität des Gens für den Referenzstamm von Serotyp 5 zu überprüfen:
oMP_A1 und 2 für das putative Hämolysin von H. parasuis, oMP_B1 und 2 für die
Untereinheit HhdB von H. ducreyi, oPhage8_1 und 2 für das Fragment mit den
Homologien zu dem Phagen von Streptococcus thermophilus, oPhage13_1 und 2
übergreifend für die Sequenz mit den Übereinstimmungen zu zwei phagenasso-
ziierten Genen von A. pleuropneumoniae und oMP_CirA1 und 2 für das Fragment
mit den Ähnlichkeiten zum Protein CirA von M. haemolytica.
In der PCR erwiesen sich die Gene hhdA, hhdB, cirA und die beiden phagenasso-
ziierten Gene mit der Homologie zu A. pleuropneumoniae als spezifisch (s. D1.3).
D Ergebnisse 65
Tab. 2 Ergebnisse der Homologiesuche spezifischer Sequenzen für Serotyp 5
Sequenz (Klonnummer)
Protein identische Amino-säuren
ähnliche Amino-säuren
Fehlerwahr-scheinlichkeit
GenBank accession number (Protein)
1 (A 3, A 7, B 6, B 10, C 10, F 7)
hypothetisches Protein HPS_09285
69/102 (67 %)
75/102 (73 %)
5e-31
ZP_02479249
gp 229, Bakteriophage SFi18 von Streptococcus thermophilus
68/109 (62 %)
75/109 (68 %)
1e-28
AF158601
2 (A 11)
hypothetisches Protein HPS_08882
40/43 (93 %)
42/43 (97 %)
7e-18
ZP_02477853
hypothetisches Protein HPS_08887
65/69 (94 %)
68/69 (98 %)
9e-32
ZP_02477854
hypothetisches Bakteriophagenprotein von A. pleuropneumoniae
32/43 (74 %)
36/43 (83 %)
2e-11
YP_001968611
hypothetisches Bakteriophagenprotein von A. pleuropneumoniae
55/69 (79 %)
64/69 (92 %)
2e-26
YP_001968612
3 (C 3) putativer Hämolysinvorläufer (HhdA) von H. parasuis
134/134 (100 %)
134/134 (100 %)
3e-58
AAZ67675
4 (C 9)
Vorläufer der Untereinheit HhdB eines Hämolysins von H. ducreyi
64/145 (44 %)
101/145 (69 %)
3e-24
AAC43537
5 (C 8)
CirA von M. haemolytica
59/77 (76 %)
68/77 (88 %)
2e-27
YP_088507
hypothetisches ATP bindendes ABC-Transporterprotein von A. pleuropneumoniae
59/77 (76 %)
65/77 (84 %)
3e-26
ZP_00134583
TonB-abhängiger Siderophoren-Rezeptor von A. succinogenes
49/77 (63 %)
64/77 (83 %)
8e-23
YP_001344473
putatives TonB abhängiges Rezeptorprotein von Neisseria meningitidis
47/75 (62 %)
54/75 (72 %)
4e-18
YP_975298
D Ergebnisse 66
1.3 Vorkommen der H. parasuis Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) –spezifischen Fragmente in Referenz- und Feldstämmen
Für Fragmente, die sich in der PCR nochmals als spezifisch für den Tester (Refe-
renzstamm 5) erwiesen haben, wurde das Vorkommen per PCR in allen 15 Refe-
renzstämmen überprüft. Falls Amplifikate überwiegend in als virulent bekannten Re-
ferenzstämmen auftraten, wurden zusätzlich weitere Feldstämme untersucht. Hierbei
handelte es sich um zwölf nasal isolierte Stämme von klinisch gesunden Tieren (s.
Anhang Tab. 23), 16 aus der Lunge isolierten Stämmen von Tieren, die zwar an
Pneumonie erkrankt waren, für die jedoch nicht sicher feststeht, ob der hochgradig
und in Reinkultur nachgewiesene Stamm von H. parasuis für die Erkrankung
verantwortlich war (s. Anhang Tab. 21). Dazu kamen zehn weitere Isolate, die aus
systemischen Läsionen gewonnen wurden und deren Trägertiere auch die ent-
sprechenden klinischen Symptome aufwiesen (s. Anhang Tab. 22). Übersichten der
Verteilung der Gene in den Referenzstämmen und Feldisolaten finden sich in den
Tabellen 3, 4, 5 und 6.
Zudem wurde für diese Fragmente ein zweiter Southern Blot durchgeführt, in wel-
chem chromosomale DNA aller 15 Referenzstämme mit dem Enzym DpnI und II ver-
daut und auf eine positiv geladene Nylonmembran geblottet wurde. Zur Erzeugung
der Sonde wurde das PCR-Produkt aus der Nachweis-PCR verwendet, welches
auch als Positivkontrolle diente. Zusätzlich wurde für die Gene hhdA, hhdB und cirA
mittels RT-PCR untersucht, ob sich Transkripte des jeweiligen Bereichs nachweisen
lassen (s. Abb. 13).
Mit den Primern oMP_A1 und 2 wurde ein 964 bp großes PCR-Produkt amplifiziert,
für welches die Referenzstämme 5, 12, 13, 14 und 15 positiv waren (s. Abb. 5). Die
Primer oMP_B1 und 2 amplifizierten in den gleichen Referenzstämmen ein PCR-
Produkt von 557 (s. Abb. 7). Die Verteilung in diesen Stämmen wurde durch
Southern Blots bestätigt, allerdings war in diesen Untersuchungen der Referenz-
stamm für Serotyp 13 für beide Fragmente negativ (s. Abb. 5 und 7). Die Bin-
dungsstellen beider Gensonden befanden sich auf unterschiedlich großen DNA-
Fragmenten (hhdA: 350 und 2000 bp; hhdB: 300 bis 1500 bp). Von zwölf getesteten
D Ergebnisse 67
nasal isolierten Feldstämmen waren sechs positiv für hhdA (s. Abb. 6) und hhdB (s.
Abb. 8), von den 16 getesteten aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämmen
waren sechs positiv für hhdA (s. Abb. 6). Für hhdB waren davon sechs Stämme
deutlich positiv und drei weitere schwach (s. Abb. 8). Von den zehn systemisch
isolierten Feldstämmen waren vier deutlich und einer schwach positiv für hhdA (s.
Abb. 6), für hhdB war nur ein Stamm deutlich positiv und zwei weitere schwach (s.
Abb. 8). Mittels RT-PCR wurden Transkripte von beiden Sequenzen nachgewiesen
(s. Abb. 13).
Aus einer Kombination fragmentspezifischer Primer beider Fragmente (oHhdA4 und
oHhdB1) ergab sich ein 3368 bp großes Fragment, aus dem sich die Organisations-
struktur HhdBA ableiten ließ (keine Abbildung).
D Ergebnisse 68
Abb. 5 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPA_1 und 2 (964 bp)
Abb. 6 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in Feldisolaten mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen
D Ergebnisse 69
Abb. 7 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp)
Abb. 8 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in Feldisolaten mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen
D Ergebnisse 70
Mit den Primern oMP_CirA1 und 2 wurde ein 161 bp großes Produkt nachgewiesen,
für welches die Referenzstämme der Serotypen 3 (schwach), 5, 12, 13, 14 und 15
positiv waren (s. Abb. 9). Im Southern Blot waren die Stämme 3, 5, 8, 9, 10, 12, 14
und 15 positiv, die Bindungsstellen der Gensonde befanden sich auf DNA-Sequen-
zen der Größe 350 bis 1500 bp (s. Abb. 9). Von den zwölf getesteten nasal isolierten
Feldstämmen waren dieselben sechs positiv wie bei hhdA und hhdB, allerdings
ergaben vier weitere Stämme schwache Banden (s. Abb. 10). Von den 16 getesteten
Feldstämmen aus pneumonischen Lungen waren sechs deutlich positiv und acht
weitere schwach positiv (s. Abb. 10). Von den zehn systemisch isolierten Feldstäm-
men waren fünf deutlich positiv und einer schwach positiv (s. Abb. 10). In Re-
ferenzstamm 5 konnten per RT-PCR Transkripte der Sequenz gezeigt werden (s.
Abb. 13).
Die Primer oPhage13_1 und 2 amplifizierten ein 301 bp großes Produkt in den
Referenzstämmen 2, 5 und 12, dieses Ergebnis wurde im Southern Blot noch um die
Referenzstämme 14 und 15 erweitert (s. Abb. 11). Die Gensonde band auf DNA-
Sequenzen der Größe 550 bis 1200 bp. Von den 16 aus Lungen isolierten Feld-
stämmen waren drei positiv sowie einer der zehn systemisch isolierten Feldstämme
(s. Abb. 12). Von den zwölf aus der Nase isolierten Stämmen ergaben vier in der
PCR deutliche Banden und einer eine schwache Bande (s. Abb. 12).
D Ergebnisse 71
Abb. 9 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in den Refe-renzstämmen 1-15. A: PCR mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp)
Abb. 10 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in Feldisolaten mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen
D Ergebnisse 72
Abb. 11 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenassoziierten Gene in den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp). A: PCR mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) B: Southern Blot mit verdauter chromosomaler DNA der Referenz-stämme 1-15, inkubiert mit einer Gensonde aus dem markierten PCR-Produkt aus Referenzstamm 5 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp)
Abb. 12 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenassoziierten Gene in Feldisolaten mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B: zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Lokalisationen
D Ergebnisse 73
Abb. 13 RT-PCR mit Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) zum Nachweis der Transkription der Serotyp 5 spezifischen DNA-Se-quenzen aus der RDA und einem Genfragment der 16S rDNA aus der PCR zum Nachweis von H. parasuis (1, 5, 9): Überprüfung der Transkription von hhdA mit den Primern oMP_A1 und 2 mit Reverser Transkriptase (RT) (1), ohne RT (5), Posi-tivkontrolle mit chromosomaler DNA (9) (2, 6, 10): Überprüfung der Transkription von hhdB mit den Primern oMP_B1 und 2 mit RT (2), ohne RT (6), Positivkontrolle mit chromo-somaler DNA (10) (3, 7, 11): Überprüfung der Transkription des Fragments aus der 16S rDNA mit den Primern Hps-f und -r mit RT (3), ohne RT (7), Positiv-kontrolle mit chromosomaler DNA (11) (4, 8, 12): Überprüfung der Transkription von cirA mit den Primern oMP_C1 und 2 mit RT (4), ohne RT (8), Positivkontrolle mit chromoso-maler DNA (12) (13): Negativkontrolle mit Aqua dest.
D Ergebnisse 74
Tab. 3 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der Referenzstämme 1-15
Referenzstämme der 15 Serotypen (Ergebnisse der Southern Blots)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
hhdA - - - - + - - - - - - + - + +
hhdB - - - - + - - - - - - + - + +
cirA - - + - + - - + + + - + - + +
phagen-assoz. Gene
- + - - + - - - - - - + - + +
Tab. 4 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zwölf nasal isolier-ten Feldstämme
Isolation aus der Nase (PCR-Ergebnisse)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
HhdA - - - - - + + + - + + +
HhdB - - - - - + + + - + + +
CirA - (+) (+) (+) - + + + (+) + + +
phagen-assoz. Gene
(+) + + + + - - - - - - -
Tab. 5 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der 16 aus pneumo-nischen Lungen isolierten Feldstämme
Isolation aus der Lunge (PCR-Ergebnisse)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
HhdA - - + + + - - + - - - + + - - -
HhdB - - + + + (+) - + - (+) - + + - - -
CirA - - + + + (+) (+) + (+) (+) (+) + + (+) (+) (+)
phagen-assoz. Gene
- - (+) - - - - + - - (+) - (+) - - -
D Ergebnisse 75
Tab. 6 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zehn systemisch isolierten Feldstämme
Isolation systemisch (PCR-Ergebnisse)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
HhdA - - - - + - + + (+) +
HhdB - - - - (+) - - (+) - +
CirA - - - - + - + + (+) +
phagen-assoz. Gene
- - - - - + - - (+) -
D Ergebnisse 76
2 Proteomanalysen mittels SDS-PAGE
In der SDS-PAGE wurden Ganzzelllysate aller 15 Referenzstämme sowie von 16
aus pneumonischen Lungen isolierten Stämmen und neun aus systemischen Lokali-
sationen gewonnenen Isolaten untersucht. Sämtliche Proben wiesen sehr ähnliche
Bandenmuster auf (s. Abb. 14). Unterschiede ergaben sich einerseits durch eine
Gruppe von Banden im Größenbereich 32 bis 42 kDa, andererseits durch An- oder
Abwesenheit eines Proteins von >200 kDa. Unterschiedliche Bebrütungszeiten der
Ausgangskulturen veränderten die Ausprägung der Banden nicht. Pro Stamm
existierte nur je eine markante Proteinbande im Bereich 32 bis 42 kDa. Innerhalb der
Referenzstämme wiesen 3, 6, 8, 9 und 10 mit 38-40 kDa die größten dieser Banden
auf, die kleinsten mit etwa 32 kDa zeigten die Referenzstämme 2, 5 und 7. Die
Proteinbande von >200 kDa trat ausschließlich bei den Referenzstämmen 3, 6, 9 und
10 zu Tage. Von den untersuchten Feldstämmen wies keiner der aus pneumo-
nischen Lungen isolierten Stämme das Protein der Größe >200 kDa auf, wohl aber
die systemisch isolierten Stämme 2 und 3 (entspricht Maas 2 und 3). Beide Stämme
(42 kDa) zeigen gemeinsam mit Stamm 9 (Ahlem 847, 40 kDa) die größte markante
Bande im Größenbereich 32 bis 42 kDa der systemisch isolierten Stämme, die
Stämme 1, 5 und 8 (Maas 1, Ahlem 332 und 751) hingegen mit ca. 33-35 kDa die
kleinsten. Auch bei den pneumonisch isolierten Stämmen variiert die Größe der
markanten Bande in diesem Bereich von 33 bis 39 kDa (Stamm 12 und 13 bzw. 10,
entspricht Ahlem 684 und 696 bzw. 621).
D Ergebnisse 77
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
30 kDa
40 kDa
200 kDa
I
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16
30 kDa
40 kDa
200 kDa
II
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
30 kDa
40 kDa
200 kDa
III
Abb. 14 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Commassie gefärbt (I) Referenzstämme 1-15 (II) 16 Feldstämme aus pneumonischen Lungen (III) 9 invasive Feldstämme Maas 1-3, Baums 1 und Ahlem 332, 532,
549, 751 und 847
D Ergebnisse 78
3 Proteomuntersuchungen mittels Massenspektrometrie
Aus den Proteingelen der Ganzzelllysate von Referenzstamm 1 bis 15 wurden 14
Banden für weitere Untersuchungen ausgewählt, für die 16 aus pneumonischen
Lungen isolierten Stämme sechs Banden (s. Abb. 15). Alle 20 Proben wurden für
massenspektrometrische Untersuchungen aufbereitet, was einen tryptischen Verdau
zur Aufspaltung der einzelnen Peptide beinhaltete.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
30 kDa
40 kDa
200 kDa
12
56
7
84
9 10
1112 14 15
3
I
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16
30 kDa
40 kDa
200 kDa
162019
21
1718
II
Abb. 15 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Coomassie gefärbt (I) Referenzstämme 1-15 (II) 16 Feldstämme aus pneumonischen Lungen
Mittels Massenspektrometrie untersuchte Banden sind mit Pfeilen ge-kennzeichnet (Probe 13 fehlt).
D Ergebnisse 79
3.1 MALDI-TOF-Analysen
Alle 20 Proben wurden per MALDI-TOF-Massenspektrometrie untersucht. Anhand
der ermittelten Massenzahlen einzelner Peptide wurde für jede Probe ein Spektrum
ausgegeben. Da sich die Spektren einiger Proben stark ähnelten bzw. nahezu iden-
tisch waren, wurde eine Einteilung in 2 Gruppen vorgenommen. Gruppe 1 bestand
aus 14 Proben (1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20 und 21) aus dem Bereich 32
bis 39 kDa (s. Abb. 16).
Abb. 16 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 1 (Probe 6) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.
Die zweite Gruppe umfasste die Proben 7, 9, 10 und 13, hierbei handelte es sich um
die Banden >200 kDa (s. Abb. 17). Die Spektren von Nummer 3 und 15 wiesen
keinerlei Ähnlichkeiten mit anderen Proben auf (s. Abb. 18 und 19), obwohl Nummer
3 im Proteingel nicht von den anderen Proteinen der zweiten Gruppe zu unter-
scheiden war und Nummer 15 nicht von denen der ersten. Das Spektrum von Probe
11 hatte eine zu schlechte Qualität, um es einer Gruppe zuordnen zu können,
aufgrund der Gesamtproteinmasse gehörte es jedoch zu Gruppe 1 (keine Ab-
bildung).
D Ergebnisse 80
Abb. 17 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 2 (Probe 7) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.
Abb. 18 Spektrum Probe 3 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.
D Ergebnisse 81
Abb. 19 Spektrum Probe 15 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) aus der massenspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF.
Die den Spektren zugrunde liegenden Peptidmassen wurden zum Datenbankableich
verwendet (Peptide Mass Fingerprint Algorithmus der Mascot Homepage
[www.matrixscience.com], Abgleich mit der NCBI Datenbank). Zehn der 14 Proben
aus Gruppe 1 wiesen auf den Vorläufer eines P2 Proteins der äußeren Membran
(MOMP, major outer membrane protein) von H. parasuis hin, von welchem eine
Sequenz von 359 Aminosäuren (ZP_02477753) bzw. 1080 bp veröffentlicht ist. Mit
den Primern oPorin1 und 2 wurde mittels PCR die Verteilung des Gens in den
Referenzstämmen 1-15 untersucht (s. Abb. 20). Sämtliche Stämme ergaben zwar ein
Produkt, welches jedoch anstatt der erwarteten Produktgröße von 394 bp je nach
Stamm um bis zu ca. 40 bp abwich. Die Größenverteilung entsprach hierbei an-
nähernd der aus dem Proteingel, das heisst die Referenzstämme 3 und 4 sowie 8, 9
und 10 wiesen sowohl im Proteingel als auch in der PCR vergleichsweise große
Banden im entsprechenden Größenbereich auf, die Stämme 5 und 7 zeigten hin-
gegen in beiden Untersuchungen vergleichsweise kleine Banden. Für die Proben aus
Gruppe 2 konnten keine Homologien gefunden werden.
D Ergebnisse 82
Abb. 20 PCR mit den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPorin1 und 2 zur Überprüfung auf das Vorkommen der Gensequenz des OMP P2 Proteins von H. parasuis.
3.2 Q-TOF-Analysen
Es wurden ebenfalls alle 20 Proben mit der Q-TOF-Massenspektrometrie untersucht.
Die Analyse setzte sich aus der Detektion der Peptidmassen, der durchgeführten de
novo Sequenzierung von Probe 7 (Aminosäuresequenz, s. Anhang Tab. 35) sowie
aus dem Datenbankabgleich mit der NCBI-Datenbank zusammen. Letzteres geschah
über das Programm des ProteinLynx Globals Server (Waters). Ein beispielhaftes
Spektrum der Detektion der Peptidmassen findet sich in Abbildung 21, die Peptidliste
der de novo Sequenzierung befindet sich in Tabelle 35.
Alle 16 Proben aus Gruppe 1 wurden mittels Q-TOF-Massenspektrometrie eindeutig
identifiziert, da sie mit zwei (Probe 18) bis neun Peptiden (Probe 19) mit einem sich
in der Datenbank befindenden Protein von H. parasuis identisch waren (s. Anhang
Tab. 32 und 33). Es handelt sich um den Vorläufer eines P2 Proteins der äußeren
Membran (OMP P2) und ist identisch mit dem mittels MALDI-Massenspektrometrie
identifizierten Protein (ZP_02477753). Bei einem Teil der Proben derselben Gruppe
(Probe 2, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 16, 17, 19, 20 und 21) existiert jeweils eine Überein-
stimmung mit einem zweiten Protein (je ein Peptid). Dieses weist in der Datenbank
insgesamt nur eine Länge von 21 Aminosäuren auf und ergibt in der BLAST-Suche
eine Homologie zu demselben OMP P2-Protein (identische Aminosäuren = 20/21 [95
%], ähnliche Aminosäuren = 20/21 [95 %]). Bei einem beschriebenen OMP P2
Protein von H. influenzae (AAA24993) handelt es sich um ein Porin. Im Vergleich
beider Proteine weisen sie 130 von 381 (34 %) identische sowie 196 von 381 (51 %)
ähnliche Aminosäuren auf.
D Ergebnisse 83
Aus Gruppe 2 (Bandengröße >200 kDa) ergaben nur Probe 3 und 7 Überein-
stimmungen. Probe 3 wies ein identisches Peptid mit dem hypothetischen Protein
HPS_03084 (ZP_02479473) von H. parasuis auf, von welchem in der Datenbank 154
Aminosäuren bzw. 465 bp vorliegen, jedoch kein Hinweis auf eine mögliche Funk-
tion. Aus Probe 7 war ein Peptid identisch mit der größeren Untereinheit der Pseudo-
uridin-Synthase B (ribosomal large subunit pseudouridine synthase B) von H. pa-
rasuis (ZP_02477992). Die in der Datenbank verfügbare Sequenz beträgt 339
Aminosäuren (s. Anhang Tab. 34).
Abb. 21 Beispielhaftes Spektrum der massenspektrometrischen Untersuchung mittels Q-TOF (Probe 6)
D Ergebnisse 84
4 Entwicklung einer Multiplex-PCR
Mit dem Ziel, zukünftig in einer diagnostischen PCR virulente von avirulenten H. pa-
rasuis Stämmen unterscheiden zu können, wurden Fragmente, die spezifisch für
Serotyp 5 waren und zudem in überwiegend als virulent bekannten Referenz-
stämmen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992) vorkamen, zur Entwicklung
einer Multiplex-PCR ausgewählt. Hierbei handelte es sich um hhdA, hhdB und cirA.
Als Kontrolle, ob es sich bei der zu untersuchenden Probe tatsächlich um H. parasuis
handelte, wurden Primer für ein Genfragment, welches für die 16S rDNA kodiert
(OLIVEIRA et al. 2001), mit in die PCR integriert.
4.1 Primerkonstruktion
Für drei der zu integrierenden Sequenzen wurden Primer konstruiert (Programm
Primer3, http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm, Version 0.4.0). Als Kriterien wur-
de ein Größenunterschied der PCR-Produkte von mindestens 100 bp festgelegt, um
sie in der Gelelektrophorese gut voneinander abgrenzen zu können, eine maximale
Größe von 1000 bp und eine minimale Produktgröße von 120 bp. Zudem betrug die
geforderte optimale Annealingtemperatur 62 °C, um eine hohe Spezifität zu er-
reichen.
Für das Genfragment der 16S rDNA existierten bereits Primer (Hps-f und -r,
(OLIVEIRA et al. 2001), welche ein PCR-Produkt von 821 bp amplifizieren. Diese
wurden unverändert eingesetzt. Für das Fragment hhdA wurden die Primer oMP_A1
und 2 benutzt (Fragmentgröße 964 bp), für hhdB die Primer oMP_B1 und 2 (557 bp)
und für cirA die Primer oMP_CirA1 und 2 (135 bp). Die gewählten PCR-Bedingun-
gen: 94 °C/3:00 min, 32 x (94 °C/1:00 min, 62 °C/0:45 min, 72 °C/1:30 min), 72
°C/10:00 min..
4.2 Überprüfung der Spezifität
Sämtliche Primerpaare wurden in der PCR anhand von Ganzzelllysaten anderer
Bakterien bzw. Eukaryoten (je ein Stamm von Candida albicans, Mucor ssp., E. coli
DH5-α, Klebsiella pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida,
Histophilus somni, A. minor, A. indolicus und A. suis sowie zwei Stämme von A. por-
D Ergebnisse 85
cinus, s. Anhang Tab. 25) auf ihre Spezifität überprüft (s. Abb. 22). In keinem der
Ansätze entstand ein Amplifikat. Zum Nachweis des DNA-Gehaltes in allen Bak-
terienproben wurden universelle Primer erstellt (oRNA_1 und oRNA_2, basierend auf
der 16S rDNA) und in einer PCR mit den Bakterien eingesetzt. Alle Proben ergaben
ein 892 bp großes Amplifikat. Für die Eukaryoten wurde eine PCR mit den univer-
sellen Primern 5_8SR und LR7 durchgeführt (http://www.biology.duke.edu/fungi/
mycolab/ primers.htm), welche auf der großen Untereinheit ribosomaler DNA (60S)
von Eukaryoten basieren und eine unterschiedliche Produktgröße ergeben (C. albi-
cans ca. 1,7 kb, Mucor ssp. ca. 950 bp, s. Abb. 22).
Abb. 22 PCR zum Nachweis des DNA-Gehalts mittels universeller Primer (A) mit Eukaryoten (I) und Bakterien (II), bzw. Multiplex-PCR zur Spezifitätsun-tersuchung der eingesetzten Primer (B), A: (I) (1) Candida albicans, (2) Mucor ssp., (B) H. parasuis, Referenz-stamm von Serotyp 5, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest.; (II) (1) E. coli DH5-α, (2) Klebsiella pneumoniae, (3) Bordetella bronchiseptica, (4) Pasteurella multocida, (5) A. minor, (6) A. indolicus, (7) A. suis, (8, 9) A. porcinus, (10) Histophilus somni, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest., (+) Positivkontrolle mit H. parasuis, Referenzstamm von Serotyp 5 B: (I) (1) Candida albicans, (2) Mucor ssp., (+) Positivkontrolle mit der internen Kontrolle, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest.; (II) (1) E. coli DH5- α, (2) Klebsiella pneumoniae, (3) Bordetella bronchiseptica, (4) Pasteurella multocida, (5) A. minor, (6) A. indolicus, (7) A. suis, (8, 9) A. porcinus, (10) Histophilus somni, (-) Negativkontrolle mit Aqua dest., (+) Positivkontrolle mit der internen Kontrolle Universelle Primer für A: 5_8SR, LR7 (60S rDNA) Universelle Primer für B: P7-f/r (16S rDNA)
D Ergebnisse 86
4.3 Optimierung der PCR-Bedingungen
Da die Primer PCR-Produkte von unterschiedlichen Größen amplifizierten, wiesen
sie von groß nach klein zunehmende Amplifikationsraten auf, wenn sämtliche Primer
in gleicher Konzentration eingesetzt wurden. Um gleich starke Banden zu erhalten,
wurden deshalb die Primerpaare in unterschiedlicher Konzentration eingesetzt, bis
sich ein einheitliches Bild ergab (s. Abb. 23). Hierbei wurde nach dem Prinzip der
Endpunkt-PCR vorgegangen, das heisst die Primer für die kleineren und in der PCR
bevorzugt amplifizierten Fragmente wurden in so geringer Menge hinzugegeben,
dass sie nach Erreichen der gewünschten Bandenstärke aufgebraucht waren und
danach die größeren Fragmente amplifiziert wurden, bis auch sie die gewünschte
Bandenstärke erreicht hatten. Von den Primern oMP_A1 und 2 wurden pro Ansatz je
3,2 µl (40 pmol) eingesetzt, von Hps-f und -r je 2,8 µl (20 pmol), oMP_B1 und 2 4,0 µl
(5 pmol) und von den Primern oMP_CirA1 und 2 je 2,5 µl (5 pmol).
Zum Einstellen der Konzentrationen wurde eine Verdünnung chromosomaler DNA
des Referenzstammes 5 verwendet, da diesem die den Primern zugrunde liegenden
Sequenzen entstammen.
4.4 Interne Kontrolle
Um sicherzustellen, dass zwischen falsch negativen und richtig negativen Proben
unterschieden werden kann, wurde eine interne Kontrolle entwickelt (s. Abb. 23).
Falsch negative Ergebnisse entstehen vor allem durch Hemmstoffe im eingesetzten
Probenmaterial, welche die Entstehung eines Amplifikats sowohl im Probenansatz,
als auch im Kontrollansatz verhindern. Hierfür wurde in vier verschiedenen Ansätzen
mit den vier Primerpaaren das entsprechende PCR-Produkt amplifiziert und mit dem
StrataClone PCR Cloning Kit® (Stratagene, La Jolla, USA) zunächst in den Vektor
pSC-A kloniert und dann in die dazu gehörigen kompetenten Zellen transformiert.
Aus einer Schüttelkultur mit 3 ml Medium wurde für jede Probe eine Plasmid-
präparation durchgeführt und deren DNA-Gehalt auf einem TBE-Gel überprüft.
Anschließend erfolgte die Mischung zu gleichen Teilen. Da bei der Verwendung einer
Mischung von Plasmiden als PCR-Template ebenfalls die kleineren Inserts bevorzugt
amplifiziert werden, das Ziel jedoch eine möglichst gleichmäßige Amplifikation der
D Ergebnisse 87
Fragmente war, wurde eine Feinjustierung der Plasmidverhältnisse durch Zugabe
einzelner Plasmidfraktionen und/oder Verdünnungsschritte vorgenommen. Als inter-
ne Kontrolle wurde die 1:50-Verdünnung einer Stocklösung mit folgender Endkon-
zentration eingesetzt: 0,03 µg Plasmid oMP_A1 und 2/µl, 0,001 µg von Plasmid Hps-
f und -r/µl, 0,003 µg Plasmid oMP_B1 und 2/µl und 0,001 µg Plasmid oMP_CirA1
und 2/µl. Die PCR-Bedingungen und Primerkonzentrationen wurden aus den An-
sätzen mit chromosomaler DNA übernommen.
Der Einsatz der internen Kontrolle erfolgte derart, dass jeder Ansatz einer zu unter-
suchenden Probe doppelt ausgeführt wurde. Der erste Ansatz enthielt ausschließlich
Probenmaterial, dem zweiten wurde 1 µl des Plasmidgemisches hinzugefügt und
enthielt somit die zur Amplifikation jeder Bande notwendige DNA. Eine optisch sicht-
bare Bande wurde unabhängig von ihrer Stärke als positiv beurteilt.
500 bp
1000 bp
500 bp
1000 bp
I II
M M
Abb. 23 Multiplex-PCR mit chromosomaler DNA von Serotyp 5 (I) und der in-ternen Kontrolle (II) Hierbei handelt es sich um ein Plasmidgemisch, welches als Inserts Template für alle vier eingesetzten Primerpaare enthält.
4.5 Überprüfung der Referenzstämme
Die Anwendung der entwickelten Multiplex-PCR wurde zunächst an aufgereinigter
DNA der Referenzstämme der 15 Serotypen durchgeführt. Die Verteilung innerhalb
dieser Stämme in der Monoplex-PCR ist aus Tabelle 3 ersichtlich, eine Übersicht der
Ergebnisse aus dem Multiplex-Ansatz gibt Abbildung 24. Jede Probe wurde im Dop-
D Ergebnisse 88
pelansatz durchgeführt, dem zweiten Ansatz wurde zusätzlich zum Gesamtvolumen
1 µl der internen Kontrolle zugefügt.
Alle Referenzstämme ergaben ein Produkt mit den Primern Hps-f und -r, für 1-4 und
6-11 handelte es sich um die einzige Bande. Die Referenzstämme 5, 12 und 14
zeigten mit allen vier Primerpaaren ein deutliches Amplifikat, 13 und 15 wiesen
neben der deutlichen Bande für die Fragmente hhdA und cirA nur ein schwaches
Produkt mit den Primern oMP_B1 und 2 auf.
Im Vergleich zur Untersuchung der Referenzstämme mit den Primern oMP_A1 und
2, oMP_B1 und 2 und oMP_CirA1 und 2 im Monoplex-Ansatz zeigte sich, dass die
Ergebnisse für oMP_A1 und 2 und oMP_B1 und 2 übereinstimmten, bei Probe 3 in
der Multiplex-PCR jedoch keine Bande mit den Primern oMP_CirA1 und 2 entstand,
wohingegen im Monoplex-Ansatz eine schwache Bande auftrat.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in tabellarischer Form findet sich im Anhang
in Tabelle 26.
D Ergebnisse 89
Abb. 24 Multiplex-PCR der Referenzstämme 1-15, im zweiten Ansatz (+) jeweils mit Zusatz von 1 µl Interner Kontrolle (-) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle mit Interner Kontrolle, zur Überprüfung auf das Vorhandensein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA.
4.6 Überprüfung der aus pneumonischen Lungen isolierten Feld-stämme
Bei der Untersuchung der Feldstämme wurde auf den Einsatz der internen Kontrolle
für jede einzelne Probe verzichtet und diese beispielhaft für alle Ansätze neben der
Negativkontrolle mitgeführt. Die Multiplex-PCR der 16 aus pneumonischen Lungen
isolierten Feldtämme wurde mit Bakterienlysat durchgeführt, neun Isolate ließen nur
den Speziesnachweis zu und wiesen keine Produkte für virulenzassoziierte Gene auf
(s. Abb. 25). Vier Stämme zeigten zusätzlich eine Bande für das Produkt aus den
Primern oMP_A1 und 2 und oMP_CirA1 und 2 und nur zwei Isolate wiesen für alle
vier Primerpaare ein Produkt auf.
Der Vergleich beider PCR-Ansätze (Mono- und Multiplex-PCR) ergab für die aus
pneumonischen Lungen isolierten Feldstämme die größten Abweichungen. Aus
Probe 1 wurde mit den Primern oMP_A1 und 2 in der Multiplex-PCR ein sehr
schwaches Amplifikat erzeugt, welches im Monoplex-Ansatz nicht vorhanden war.
Die Primer oMP_B1 und 2 ergaben im Monoplex-Ansatz ein deutliches Produkt für
D Ergebnisse 90
die Stämme 4 und 5. Im Multiplex-Ansatz fehlte die Bande für Probe 4 komplett, für
Probe 5 war sie sehr schwach. Auch in Probe 6, 10 und 14 wurde das Gen im
Monoplex-Ansatz mit einer schwachen Bande nachgewiesen sowie in Probe 8, 12
und 13 mit einer deutlichen. Alle diese Stämme zeigten in der Multiplex-PCR kein
Amplifikat. Für das Gen cirA stimmten die Ergebnisse für die Proben 3-5, 8, 12 und
13 überein, welche alle im Monoplex-Ansatz eine starke Bande ergeben hatten. Die
Proben 6, 7, 9-11 und 14-16 wiesen im selben Ansatz nur ein schwaches Amplifikat
auf und waren im Multiplex-Ansatz negativ.
Eine Übersicht der Ergebnisse befindet sich im Anhang (s. Anhang Tab. 27).
1.1 Überprüfung der systemisch isolierten Feldstämme
Fünf der zehn überprüften systemisch isolierten Stämme wiesen in der PCR mit
Bakterienlysat ausschließlich die Bande für den Speziesnachweis auf (Hps-f und -r)
(s. Abb. 25). Die anderen fünf Isolate zeigten zusätzlich Amplifikate für die virulenz-
assoziierten Marker hhdA und cirA. Für den Marker hhdB waren sämtliche Stämme
negativ.
Im Multiplex-Ansatz ergaben die Primer oMP_A1 und 2 mit der Probe Maas 1 im
Gegensatz zum Monoplex-Ansatz eine Bande. Dieses Resultat konnte bei wieder-
holten Ansätzen jedoch nicht reproduziert werden, da die Ergebnisse beider PCR-
Ansätze für diese Probe stets übereinstimmten. Probe 9 ergab im Monoplex-Ansatz
eine schwache Bande, in der Multiplex-PCR jedoch keine. Im Multiplex-Ansatz ergab
keine Probe eine Bande mit den Primern oMP_B1 und 2, in der Monoplex-PCR
ergaben jedoch die Stämme 5, 8 und 10 eine schwache Bande. Auch für das
Primerpaar oMP_CirA1 und 2 ergaben sich abweichende Ergebnisse, da der Multi-
plex-Ansatz für Stamm 1 eine Bande ergab, die im Monoplex-Ansatz nicht vorkam,
und der umgekehrte Fall trat bei Probe 9 auf.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in tabellarischer Form findet sich im
Anhang, Tabelle 28.
D Ergebnisse 91
1.1 Überprüfung der nasal isolierten Feldstämme
Die Hälfte der nasal isolierten Stämme zeigten in der PCR mit Bakterienlysat nur das
speziesspezifische PCR-Produkt mit den Primern Hps-f und -r, vier andere wiesen
für alle vier Primer ein Amplifikat auf (s. Abb. 25). Zwei Isolate hatten nur ein Produkt
mit den Primern oMP_A1 und 2 und oMP_CirA1 und 2, nicht jedoch mit den Primern
oMP_B1 und 2.
Der Vergleich zwischen Monoplex- und Multiplex-Ansatz ergab, dass die Stämme 11
und 12 in der Multiplex-PCR keine Bande für das Gen hhdB aufwiesen, in der Mono-
plex-PCR jedoch schon. Zudem ergaben die Stämme 2, 3, 4 und 9 im Monoplex-
Ansatz schwache Banden mit den Primern oMP_CirA1 und 2, nicht jedoch im Multi-
plex-Ansatz.
Eine Tabelle zur Übersicht der Ergebnisse befindet sich im Anhang (s. Anhang Tab.
29).
D Ergebnisse 92
Abb. 25 Multiplex-PCR der Feldstämme zur Überprüfung auf das Vorhanden-sein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA. A: 16 Isolate aus pneumonischen Lungen B. zwölf nasale Isolate C: zehn Isolate aus systemischen Läsionen (-) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle mit interner Kontrolle
4.7 Überprüfung weiterer Feldstämme
Eine Anzahl von 214 weiteren Feldstämmen wurde ebenfalls anhand von Bakterien-
lysaten mittels der entwickelten Multiplex-PCR untersucht (s. Abb. 26 und 27).
Hierbei handelt es sich um die Stammsammlung eines diagnostischen Labors
D Ergebnisse 93
welche sich aus eingesandten Proben des norddeutschen Raumes zusammensetzt.
Der überwiegende Teil der Stämme wurde mit den Daten des Einsenders übermittelt,
so dass eine Aussage zur Klinik des jeweiligen Tieres oder dem Isolationssort des
Stammes in unterschiedlicher Ausführlichkeit möglich war. Offen blieb oftmals je-
doch, um welchen isolierten Stamm es sich bei dem Gefrierstock handelte, wenn der
Erreger in mehreren klinischen Materialien desselben Tieres nachgewiesen wurde.
Die auf Kochblutagar mit NAD-Zusatz ausgestrichenen Isolate wiesen unterschied-
liche Koloniemorphologien auf. Die Größe reichte von ca. 0,5 bis 1,5 mm Durch-
messer, zudem variierten die Kolonien in Farbe (grau, weiß oder selten auch leicht
gelb) und Transparenz. Diese Erscheinungsbilder fanden sich in Einzelfällen auch
innerhalb eines einzigen Isolates wieder, dieses hatte jedoch keinen Einfluss auf die
Ergebnisse des Stammes in der Multiplex-PCR, das heisst diese waren für alle Mor-
phologieformen eines Isolates identisch.
Eine Tabelle mit den einzelnen Ergebnissen der Stämme findet sich im Anhang
(s. Anhang Tab. 30), eine Übersicht der Verteilung der Gene bzw. ihrer nachge-
wiesenen Kombinationen findet sich in den Abbildungen 26 und 27.
Jeder der 214 Feldstämmen ergab in der Multiplex-PCR eine Bande für den Spe-
ziesnachweis (Primerpaar Hps-f und -r), bei 141 Isolaten (65,9 %) handelte es sich
um die einzige Bande. Insgesamt konnte für 71 Stämme (33,2 %) zusätzlich das Gen
hhdA nachgewiesen werden, für zehn Stämme (4,7 %) das Gen hhdB und für 73
Stämme (34,1 %) das Gen cirA. 61 Stämme (28,5 %) trugen gleichzeitig die Gene
hhdA und cirA, und zehn (4,7 %) Stämme ergaben zusätzlich auch ein Amplifikat für
das Gen hhdB. Bei zwei Stämmen wurde neben dem Speziesnachweis ausschließ-
lich ein Produkt mit den Primern oMP_CirA1 und 2 ermittelt, wohingegen kein Stamm
nur für die Primer oMP_A1 und 2 oder oMP_B1 und 2 ein Amplifikat ergab.
Eine Gruppe von 20 Stämmen lässt gemäß Vorbericht einen invasiven Stamm
vermuten, da es sich z. B. um Tiere mit ZNS-Läsionen oder Gelenkschwellung han-
delt, bzw. Betriebe mit gehäuften plötzlichen Todesfällen. Der Erregernachweis er-
folgte jedoch nicht oder nicht eindeutig aus systemischen Läsionen. 15 dieser Stäm-
me zeigen ausschließlich ein Amplifikat mit den Primern Hps-f und -r, vier ergaben
D Ergebnisse 94
zusätzlich eine Bande für die Gene hhdA und cirA, und ein Stamm wies Amplifikate
mit allen vier Primerpaaren auf. Bei den anderen neun Stämmen, bei denen alle vier
Gene nachgewiesen wurden, handelte es sich in vier Fällen um Kümmerer, in einem
Fall um ein Tier mit Atemwegsproblemen und bei drei Tieren fehlten die Angaben zur
Klinik des Tieres.
Abb. 26 Vorkommen der identifizierten Gene hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldstämmen verschiedener Lokalisationen, Angaben in Prozent. In 66 % der Stämme wurde kein putativer Virulenzmarker nachgewie-sen.
Abb. 27 Ermittelte Kombinationen der putativen Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldisolaten unterschiedlicher Lokalisation, Anga-ben in Prozent. In 66 % der Stämme wurde kein putativer Virulenzmarker nachgewie-sen.
D Ergebnisse 95
5 Infektionsversuch am Schwein mit H. parasuis
Mit dem Ziel, die Virulenz einzelner Stämme von H. parasuis überprüfen zu können,
wurde ein Infektionsversuch zur Entwicklung eines Tiermodells am Schwein vorge-
nommen. Eine tabellarische Übersicht der Ergebnisse findet sich im Anhang I6.
Die zwölf Ferkel wurden in drei Gruppen zu je vier Tieren aufgeteilt, bei Gruppe zwei
und drei handelte es sich um die Versuchsgruppen, bei Gruppe 1 um die Kontroll-
gruppe. Allen Tieren wurde am Tag nach der Ankunft Blut zur Untersuchung auf
Antikörper gegen H. parasuis entnommen, welcher bei sämtlichen Tieren negativ
ausfiel. Zudem wurden bei den Tieren eine Tonsillenkratzprobe und ein Nasentupfer
zur kulturellen Untersuchung entnommen. Der Erreger konnte kulturell bei sechs
Tieren gering- bis mittelgradig nachgewiesen werden, per PCR sogar bei allen zwölf
Tieren. Als PCR-Template diente hier resuspendiertes Koloniematerial der Tonsillen-
tupferproben.
5.1 Infektion mit dem Referenzstamm für Serotyp 12
Zum Zeitpunkt der Infektion zeigte kein Tier klinische Symptome einer Erkrankung
oder Antikörper gegen H. parasuis. Die Kontrollgruppe (Tier 1, 4, 7 und 8) wurde
intratracheal mit 5 ml Kochsalzlösung belastet, Gruppe 2 (Tier 2, 5, 11 und 12)
bekam intratracheal 2 x 108 Bakterien (Gesamtvolumen 5 ml) des Referenzstammes
von Serotyp 12 verabreicht und für Gruppe 3 (Tier 3, 6, 9 und 10) wurden 1,1 x 1010
Keime desselben Stammes in der Aerosolkammer vernebelt (Gesamtvolumen 15
ml).
5.2 Klinische Symptome in den belasteten Tieren
Die Tiere wurden über acht Tage täglich überwacht. Die Tiere der Kontrollgruppe
zeigten zu keinem Zeitpunkt Lethargie, Husten, Dyspnoe, Appetitmangel, neurolo-
gische Symptome oder einen aufgekrümmten Rücken. Die gemessene Rektaltempe-
ratur lag im gesamten Untersuchungszeitraum zwischen 38,6 und 40,1 °C, einmalig
auch 40,5 °C.
D Ergebnisse 96
Tier 2 der intratracheal belasteten Gruppe wies über den gesamten Beob-
achtungszeitraum keine Krankheitssymptome auf. Bei den Tieren 5 und 12 waren
geringgradige respiratorische Symptome in Form von Husten und Niesen zu beob-
achten. Dieses begann am ersten Tag nach der Belastung und dauerte bis zum ach-
ten Tag (Tag der Euthanasie) an, die Ausprägung blieb jedoch konstant. Ihre Tempe-
raturen schwankten zwischen 38,1 und 39,7 °C, bei Tier 12 wurde an Tag 5 jedoch
ein kurzer Anstieg auf 40,8 °C gemessen. Beide Tiere zeigten zu keiner Zeit ein
beeinträchtigtes Allgemeinbefinden. Bei Tier 11 wurde am Abend des zweiten Tages
nach der Infektion eine Temperatur von 40,6 °C gemessen, die bereits am nächsten
Morgen auf 39,2 °C gesunken war. Jedoch fiel das Tier an Tag 3 mit zunächst
gering- und später mittelgradigem Appetitmangel auf, welcher sich bis zum Tag der
Sektion fortsetzte. An Tag 5 und 6 post infectionem wurde eine Temperatur von 41,0
bzw. 40,4 °C gemessen, an Tag 6 kamen Bewegungsunlust mit einem geringgradig
aufgekrümmten Rücken und geringgradiger Lethargie hinzu (s. Abb. 28). Bis zum
Sektionstag hatte sich der Zustand normalisiert und das Tier zeigte keine Symptome
mehr.
In der aerosolbelasteten Gruppe zeigte keines der vier Tiere ein beeinträchtigtes
Allgemeinbefinden. Tier 6 zeigte während des gesamten Beobachtungszeitraums
keinerlei Symptome. Jedoch fielen die anderen drei Tiere mit geringgradigem Husten
und Niesen auf, wovon Tier Nr. 3 zusätzlich gelegentlich geringgradigen Appetit-
mangel aufwies und Nr. 10 an Tag 2 post infectionem eine Rektaltemperatur von
40,3 °C. Die Rektaltemperaturen schwankten ansonsten zwischen 38,2 und 40,1 °C.
5.3 Pathomorphologische Veränderungen
An Tag acht bzw. neun wurden die Ferkel nach einer intramuskulären Anästhesie
(Stresnil® und Ursotamin®, intramuskuläre Gabe von 2 mg Azaperon/kg KGW und 20
mg Ketamin/kg KGW) intravenös mit 4 ml Eutha® 77 euthanasiert.
Pathomorphologisch waren acht Tiere vollkommen unauffällig. Der Lungenanschnitt
von Tier 3 ergab gering- bis mittelgradige Eiteransammlungen in den Bronchien der
rechten Lunge, zudem waren der rechte und linke Spitzenlappen mittelgradig atelek-
tatisch. Ebenfalls atelektatisch waren 2/3 des Lobus accessorius von Tier 10 und ein
D Ergebnisse 97
ca. 1 cm2 großer Bereich im rechten Spitzenlappen von Tier 12. Tier 11 wies Ver-
klebungen über mehrere cm2 zwischen Lunge und Brustwand auf, die sich jedoch
ohne Substanzverlust lösen ließen. Die Lunge des Tieres war insgesamt gering-
gradig vergrößert und zeigte mittelgradige Fibrinauflagerungen. Im Anschnitt der
rechten Lunge wurde ein etwa erbsengroßer Abszess sichtbar, das restliche Lun-
gengewebe war unauffällig. Auch im Herzbeutel befand sich eine mittel- bis hoch-
gradige Fibrinansammlung. In der Bauchhöhle fanden sich auf Leber und Darm
ebenfalls mittelgradige Fibrinauflagerungen, die Milz quoll leicht über die Schnitt-
fläche empor (s. Abb. 28).
I
II
III
IV
V
Abb. 28 Tier 11 nach der Infektion mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 (I) Klinische Symptome: Aufgekrümmter Rücken
Sektionsbefunde: (II) Fibrinauflagerungen in der Bauchhöhle, hier auf der Milz (III) Perikarditis (IV) Verklebungen zwischen Lunge und Brustwand (V) Aufsicht der Lunge mit Fibrinauflagerungen
Die Reisolierung ergab M. hyorhinis.
D Ergebnisse 98
5.4 Reisolierung von H. parasuis, Referenzstamm für Serotyp 12
Während der Sektion wurden bei allen zwölf Tieren Tupferproben aus der Nasen-
höhle, dem Brust- und Bauchraum, dem Herzbeutel, einem Kniegelenk und von den
Meningen des Großhirns entnommen, zudem Organproben von Lunge, Lungen-
lymphknoten und Tonsillen. Sämtliche Proben wurden parallel auf Kochblutplatten
mit NAD-Zusatz, Blut- und Gassneragar sowie CSB-Agar ausgestrichen. Die Bebrü-
tung der Blut- und Gassnerplatten erfolgte aerob, die der Kochblut- und CSB-Platten
unter Zusatz von 5 % CO2. Verdächtige Kolonien (glattrandig, feucht, weiß-grau und
transparent) wurden auf Blutplatten mit einer Staphylococcus aureus-Amme subkul-
tiviert, NAD-abhängig wachsende Stämme mittels PCR überprüft (s. Anhang Tab.
31). Die Verteilung der reisolierten Proben bei den einzelnen Tieren sowie die Stärke
des Befalls gehen aus der Tabelle im Anhang hervor (I6).
Zusammenfassend wurde aus elf von zwölf Tieren nach der Infektion kulturell H. pa-
rasuis nachgewiesen und bei allen elf Tieren war der Nasentupfer positiv. Bei sieben
von elf positiv getesteten Tieren wurde der Erreger zusätzlich aus der Lunge isoliert,
bei drei von elf Tieren aus der Tonsille, bei zwei Tieren im Herzbeutel bzw. von den
Meningen und bei einem Tier von der Pleura. Von den sieben aus der Lunge
isolierten Proben stammten eine aus der Kontrollgruppe, drei aus der intratracheal
und drei aus der per Aerosol belasteten Gruppe. Die drei positiven Proben aus der
Tonsille gingen auf je ein Tier aus jeder Gruppe zurück, die beiden aus dem Herz-
beutel isolierten Proben kamen beide von Tieren aus der Kontrollgruppe. Die Proben
von den Meningen entstammten einem Tier aus der aerosol- und einem Tier aus der
intratracheal belasteten Gruppe, die Probe aus dem Pleuratupfer von einem Tier der
intratrachealen Gruppe. Insgesamt wurden 58 reisolierte Stämme von H. parasuis als
Gefrierkultur konserviert. Davon stammten 34 aus Nasentupfern, 14 aus Lungen-
proben, vier von Perikardtupfern, eine aus einem Pleuratupfer, zwei aus Meningen-
tupfern und drei aus Tonsillenproben.
Die Tupferproben von Bauch- und Brusthöhle der Tiere, die in der PCR-Unter-
suchung auf Mycoplasma (M.) hyorhinis positiv waren (s. Anhang Tab. 38) wurden
eine Woche nach Probenentnahme durch die diagnostische Abteilung des Instituts
D Ergebnisse 99
für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover auch kulturell auf
M. hyorhinis untersucht. Die Proben von Tier Nummer 11 waren positiv.
5.5 PCR-Untersuchungen der reisolierten Stämme
Neben der kulturellen Untersuchung wurde von den Kochblut- und Blutplatten der
Nasentupfer und Tonsillenprobe Koloniematerial in Aqua dest. resuspendiert und mit
den Primern Hps-f und -r in der PCR untersucht. Die Proben der Nasentupfer waren
bei allen Tieren positiv, die Organproben der Tonsillen bei neun Tieren.
Zusätzlich wurden in der Sektion von jedem Tier Sammelproben der serösen Häute
von Bauch- und Brusthöhle in Form von Trockentupfern sowie ein Stück Lunge
entnommen und durch die IVD GmbH mittels PCR auf H. parasuis und M. hyorhinis
untersucht. Für H. parasuis war Tier 7 aus der Kontrollgruppe im Sammeltupfer posi-
tiv, gleiches gilt für die Tiere 10 (Aerosolgruppe) und 11 (intratracheale Belastung).
Die Tiere 11 und 12 aus der intratracheal belasteten Gruppe waren in der PCR aus
Lungenmaterial für H. parasuis positiv. Bei den Untersuchungen auf M. hyorhinis
waren die Sammeltupfer der Kontrolltiere negativ, die Sammeltupfer der Tiere 5 und
11 (intratracheale Belastung) sowie 10 (Aerosolgruppe) waren jedoch positiv.
Um die einzelnen reisolierten Stämme näher zu charakterisieren wurde eine RFLP-
PCR mit den für H. parasuis speziesspezifischen Primern tbpA33 und tbpA55 (DE LA
PUENTE REDONDO et al. 2003) durchgeführt (s. Abb. 29). Von den 58 unter-
suchten Stämmen ergab einer zwar ein Produkt in der PCR mit den Primern Hps-f
und -r, aber keines mit den Primern der RFLP-PCR. Bei den restlichen 57 Stämmen
glich das Bandenmuster von 51 Stämmen dem von Serotyp 5, 12, 14 und 15 (DE LA
PUENTE REDONDO et al. 2003), sechs Stämme zeigten einheitlich ein Muster,
welches bislang noch nicht beschrieben wurde (s. Abb. 29). Die Stämme mit diesem
Muster wurden aus Nasentupfern, Lunge und Tonsillenproben reisoliert. Von sieben
Stämmen, die von systemischen Lokalisationen reisoliert wurden (Hirn, Perikard und
Pleura), gehörten sechs dem RFLP-Muster von Serotyp 5, 12, 14 und 15 an, bei dem
siebten handelte es sich um jenen Stamm, welcher kein Amplifikat ergab.
D Ergebnisse 100
Unter den zwölf Stämmen, welche bereits vor der Infektion aus der Nase isoliert
wurden, war ebenfalls einer, der sich zwar mit den Hps-Primern als H. parasuis ein-
stufen ließ, jedoch kein Produkt mit den RFLP-Primern ergab. Sechs der restlichen
elf Stämme wies das gleiche Fragmentmuster wie der Referenzstamm von Serotyp
12 auf, die übrigen fünf zeigten das bislang nicht beschriebene Muster.
Abb. 29 RFLP-PCR mit den isolierten Feldstämmen der Versuchstiere (I) vor der Belastung (A) (II) nach der Belastung, intratracheale Infektion (III) nach der Belastung, Infektion per Aerosolkammer (IV) nach der Belastung, Kontrollgruppe
Die Amplifikate einer PCR mit Bakterienlysat und den Primern tbpA33 und tbpA55 (1,9 kb) wurden mit dem Enzym RsaI verdaut und das Schnittmuster mit dem der Referenzstämme verglichen. Das sich aus Serotyp 12 (Belastungsstamm) ergebende Muster ist in Bild I (B) er-sichtlich.
D Ergebnisse 101
Zusätzlich wurde an den zwölf vor der Infektion aus Nasentupfern reisolierten
Stämmen sowie den 58 Stämmen nach der Infektion eine PCR mit den Primern
oPhage13_1 und 2 durchgeführt. Die vor der Infektion aus den Versuchstieren
isolierten Stämme waren in sechs Fällen schwach positiv, hierbei handelte es sich
um die Stämme, welche das gleiche RFLP-Muster wie die Serotypen 5, 12, 14 und
15 aufwiesen. Von den nach der Infektion isolierten Stämmen waren 18 deutlich
positiv und vier weitere schwach positiv. Alle positiven Stämme gehörten der glei-
chen RFLP-Gruppe an wie Serotyp 12. Von den insgesamt 22 positiven Stämmen
post infectionem wurden zehn aus Lungenproben reisoliert, elf aus Nasentupfern und
einer aus der Tonsille.
Eine Übersicht der reisolierten Proben, ihre RFLP-Gruppen sowie das Ergebnis der
PCR mit den Primern oPhage13_1 und 2 findet sich im Anhang (s. Anhang Tab. 31).
5.5.1 Untersuchung der reisolierten Stämme mittels Multiplex-PCR
53 von 58 reisolierten Proben wiesen in der Multiplex-PCR mit Bakterienlysat eine
Bande mit den Primern Hps-f und -r auf, die restlichen fünf zeigten dieses nur in der
Monoplex-PCR. 51 Proben (87,9 %) zeigten eine Bande für das Gen hhdA, 48
(82,7 %) für das Gen hhdB und 49 Proben (84,5 %) für das Gen cirA. 48 Stämme
(82,7 %) wiesen alle drei Virulenzmarker auf, fünf Stämme keinen (9,4 %). Ein
Stamm zeigte zwar eine Bande für die Gene hhdA und cirA, nicht aber für hhdB. Alle
Stämme, die ein Amplifikat mit den Primern oMP_B1 und 2 ergaben, zeigten auch
eines für die beiden anderen Virulenzmarker. Fünf von sechs systemisch isolierten
Stämmen trugen alle drei virulenzassoziierten Gene, der sechste zeigte für keins der
Gene ein PCR-Produkt (keine Abbildung). Eine Übersicht der PCR-Ergebnisse findet
sich im Anhang, Tabelle 31.
E Diskussion 102
E Diskussion
1 Identifizierung von virulenzassoziierten Genen
H. parasuis ist als Verursacher der Glässerschen Krankheit und anderer Erkrankun-
gen für große wirtschaftliche Verluste in der Schweinefleischproduktion verantwort-
lich. Es sind vor allem Betriebe mit einem hohen Hygienestatus betroffen, wenn Fer-
kel nach dem Absetzen umgestallt oder aufgrund unterteilter Produktionseinheiten
nach dem Transport einem anderen Keimspektrum ausgesetzt werden.
Der Erreger ist weltweit verbreitet und nahezu alle Betriebe sind infiziert. Er wird
sowohl bei klinisch unauffälligen Tieren aus der Nasenhöhle isoliert, als auch bei
erkrankten Tieren aus der Lunge oder systemischen Lokalisationen, wie Gelenken,
Meningen und der Bauch- oder Brusthöhle, weshalb er als fakultativ pathogener
Keim gilt. Bislang ist unbekannt, worin die variablen Auswirkungen einer Infektion
begründet sind. Als Ursachen kommen grundsätzlich Unterschiede in der gene-
tischen Ausstattung einzelner Stämme, ihrer Proteinexpression sowie dem Immun-
status des Wirts infrage. In dieser Studie wurde daher sowohl auf genetischer Ebene
als auch auf der Ebene der Proteinexpression nach Unterschieden zwischen Isolaten
mit unterschiedlichem Virulenzpotenzial gesucht. Da eine Voraussage über die
Virulenz eines Isolats in der diagnostischen Untersuchung derzeit nicht möglich ist,
wurden die Gene, welche als spezifisch für virulente Stämme identifiziert wurden, für
die Entwicklung einer diagnostischen Multiplex-PCR verwendet. Die Eignung der
Methode, virulente Stämme anhand von drei Virulenzmarkern zu ermitteln, wurde an
insgesamt 240 Feldstämmen untersucht. Da das Virulenzpotenzial eines Isolates
sicher nur durch eine Überprüfung am Tier ermittelt werden kann, wurde zudem ein
Infektionsversuch zur Etablierung eines Tiermodells im Schwein vorgenommen.
Die Identifizierung genetischer Unterschiede erfolgte mittels Repräsentativer Diffe-
renzanalyse (RDA). Hierbei handelt es sich um eine Methode, welche durch sub-
traktive Schritte selektiv jene Abschnitte der DNA zweier engverwandter Genome
amplifiziert, die den eingesetzten Testkeim (Tester) vom Vergleichskeim (Driver)
E Diskussion 103
unterscheiden. Die Durchführung erfolgte in dieser Studie aufgrund der Annahme,
dass der Referenzstamm für Serotyp 5 (eingesetzt als Tester), welcher sich im Tier-
versuch als hochvirulent und invasiv erwiesen hatte (KIELSTEIN u. RAPP-
GABRIELSON 1992), Gene für Virulenzfaktoren aufweist, die dem avirulenten
Referenzstamm für Serotyp 11 (eingesetzt als Driver) fehlen. Die Methode wurde
anstatt in der ursprünglich veröffentlichten Form (LISITSYN et al. 1993) in einer
modifizierten Variante eingesetzt, die initial auf einen PCR-Schritt zum Anreichern
von DNA-Fragmenten im optimalen Größenbereich verzichtet. Mit dieser Abwand-
lung wurden vorher bereits erfolgreich Unterschiede in den Genomen von Myco-
bacterium avium ssp. paratuberculosis und Brachyspira hyodysenteriae nachge-
wiesen (ROTHKAMP et al. 2002; STROMMENGER et al. 2001). In dieser Studie
wurden nach Durchführung der RDA und einer nachfolgenden Transformation 85
Klone im Southern Blot auf ihre Spezifität überprüft und 29 Proben sequenziert, die
deutlich stärker mit einer 32P-markierten Gensonde aus Tester-DNA reagierten, als
mit einer Gensonde aus Driver-DNA. Für Sequenzen, deren Abgleich mit der Daten-
bank Homologien zu Proteinen ergab, die im Zusammenhang mit der Virulenz eines
Erregers stehen, wurde mittels PCR erneut die Spezifität der Fragmente überprüft,
gleichzeitig aber auch die Verteilung innerhalb der 15 derzeit bekannten Serotypen
von H. parasuis ermittelt. Da für diese 15 Stämme aus Tierversuchen das Virulenz-
potenzial bekannt ist (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992), war aus den Er-
gebnissen ersichtlich, ob das Fragment vorwiegend in virulenten oder avirulenten
Stämmen vorkommt. Aus den 29 sequenzierten Proben wurden fünf bislang bei
H. parasuis unbeschriebene Gene identifiziert, deren Expression im Referenzstamm
für Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte.
Hierbei handelt es sich um ein putatives Hämolysin und seine Transporteinheit,
HhdBA, ein mögliches Protein des Eisenstoffwechsels, CirA, eine putative phagen-
assoziierte Restriktionsendonuklease und ein mögliches Protein zum Verpacken von
Phagen-DNA.
Die Sequenz des putativen Hämolysins weist Homologien zu den Untereinheiten
HhdB und HhdA eines Hämolysins von H. ducreyi auf (AAC43537). Für das Gen
hhdA von H. parasuis wurde in der Datenbank bereits eine Sequenz von 1521 bp
E Diskussion 104
(AAZ67675) bzw. 1788 bp (ZP_02479316) hinterlegt, wovon erstere 31 % identische
und 55 % ähnliche Aminosäuren zur Untereinheit HhdA von H. ducreyi aufweist. Die
Übereinstimmung bzw. Ähnlichkeit des Sequenzabschnittes mit der Untereinheit
HhdB betrug 44 bzw. 69 %. Bei der Untereinheit HhdA von H. ducreyi handelt es sich
um den funktionsgebenden Bereich, da aufgereinigtes HhdA hämolytische Aktivität
aufweist (DUTRO et al. 1999), zudem besteht eine Homologie zu der funktionellen
Untereinheit shlA eines Hämolysins von Serratia marcescens (PALMER u.
MUNSON, JR. 1995). Da die Untereinheit shlB von Serratia marcescens für die
Sekretion und Aktivierung von ShlA zuständig ist (BRAUN et al. 1993), wird diese
Funktion auch für die Untereinheit HhdB von H. ducreyi angenommen (WOOD et al.
1999).
Die Rolle des Hämolysins in der Virulenz von H. ducreyi ist nicht abschließend
untersucht. Deletionsmutanten für hhdBA erwiesen sich in Studien am Menschen im
ersten Infektionsstadium als nicht attenuiert, weshalb diesen Proteinen zumindest zu
Beginn der Infektion vermutlich keine Hauptrolle in der Ausbildung der Erkrankung
(weicher Schanker, Ulcus molle) zukommt (THROM u. SPINOLA 2001). Andere
Untersuchungen ergaben, dass das Hämolysin von H. ducreyi die Fähigkeit zur Lyse
einer Vielzahl verschiedener menschlicher Zellarten besitzt, am stärksten betroffen
sind Makrophagen und T- Lymphozyten, gefolgt von Fibroblasten und Epithelzellen
(WOOD et al. 1999). Zudem konnte in der gleichen Studie gezeigt werden, dass die
Expression des Hämolysins die Invasion bestimmter Zellen (HEp-2) für H. ducreyi
erleichtert, nicht aber für andere Keime. Aus diesen Ergebnissen leiten die Autoren
eine wichtige Rolle des Proteins in der Pathogenese der Erkrankung ab, z.B. der
Ausbildung der Ulzerationen (Zerstörung von Gewebezellen), der Invasion von Epi-
thelzellen bzw. dem Ausweichen der Immunantwort des Wirts (Lyse von Immun-
zellen). Dutro et al. wiesen nach, dass alle von ihnen untersuchten Stämme von
H. ducreyi Homologe der Gene hhdA und hhdB aufwiesen, hämolytische Aktivität
zeigten und immunogen waren (DUTRO et al. 1999). Im Gegensatz zu H. ducreyi
zeigt H. parasuis weder auf Schafsblut-, noch auf Schweineblutagar hämolytisches
Wachstum. Falls es sich bei dem identifizierten Gen tatsächlich um ein Hämolysin
E Diskussion 105
handelt, ist dieses möglicherweise nur im Wirt funktionell, eine nähere Charakteri-
sierung des Proteins ist jedoch für die Beurteilung der Funktion notwendig.
In der Familie der Pasteurellaceae sind bereits andere Toxine beschrieben, z. B. das
PMT von P. multocida oder die RTX-Toxine, zu denen das Leukotoxin von M. hae-
molytica und die APX-Toxine von A. pleuropneumoniae gehören. Da das in H. para-
suis identifizierte Gen jedoch außer zu dem Hämolysin von H. ducreyi keinerlei
Homologien zu den für diese Toxine kodierenden Genen aufweist, stellen Vermu-
tungen über eine andere Toxinwirkung reine Spekulation dar. Die Verteilung des
Gens innerhalb der 15 Referenzstämme lässt einen Zusammenhang mit der Virulenz
vermuten, da sich alle Stämme, in denen das Gen nachgewiesen werden konnte, im
Tierversuch als virulent erwiesen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Da
das Gen mit den verwendeten Primern umgekehrt jedoch nicht in allen virulenzasso-
ziierten Referenzstämmen nachgewiesen wurde (ein Nachweis erfolgte nicht für die
hochpathogenen Referenzstämme der Serotypen 1 und 10), scheint die Abwesenheit
eines PCR-Amplifikats nicht gleichbedeutend mit einem avirulenten Stamm zu sein.
Diese Ergebnisse wiederholten sich auch in den Untersuchungen von zehn Feld-
stämmen, die aus systemischen Lokalisationen (ZNS, Gelenk, Perikard) von erkrank-
ten Tieren isoliert wurden. Das Vorkommen des Gens hhdA konnte zwar in 50 % der
Stämme gezeigt werden, für die zweite Hälfte der Stämme konnte der Nachweis
jedoch nicht geführt werden. Der PCR-Nachweis für hhdB war sogar nur in drei
Fällen positiv. Dieses könnte entweder auf eine weniger wichtige Rolle des Gens in
der Invasion hindeuten bzw. auf eine Kompension seiner Funktion durch andere
Gene, möglich wäre jedoch auch eine abweichende Gensequenz innerhalb der
einzelnen Isolate, so dass das Gen zwar im Genom vorhanden ist, aber der Nach-
weis mittels PCR und Southern Blot nicht gelingt. Dieses könnte auch die Diskrepanz
zwischen dem Vorkommen von hhdA und hhdB sowie die unterschiedlichen Größen
der DNA-Sequenzen mit Bindungsstellen für die Gensonde im Southern Blot erklä-
ren. Für die gut untersuchten Untereinheiten ShlA und ShlB des Hämolysins von
Serratia marcescens konnte gezeigt werden, dass bei Deletionsmutanten für shlB
das Protein ShlA weder sekretiert wird noch in seine aktive Form übergeht (BRAUN
et al. 1992). Das Protein besitzt somit nur noch 0,1 % der Aktivität des
E Diskussion 106
normalerweise sekretierten und aktivierten Proteins (BRAUN et al. 1993). Deshalb
wäre das gleichzeitige Vorkommen beider Untereinheiten des Proteins innerhalb
eines Genoms wahrscheinlich, falls es sich bei den Genen hhdA und hhdB
tatsächlich um jene Untereinheiten handelt. Unterschiede in den Allelen
verschiedener Isolate derselben Bakterienart sind auch von anderen
Pasteureallaceae bekannt. So tragen die Serotypen 4 und 7 von A. pleuropneu-
moniae ein anderes Allel für den Ferrichromrezeptor fhuA als die anderen Serotypen
(BALTES et al. 2003; MIKAEL et al. 2002).
Die dritte testerspezifische Sequenz (NZ_ABKM01000010, Position 26.558-26.857)
zeigte Homologien zu dem Protein CirA von M. haemolytica (YP_088507) und einem
Rezeptor der äußeren Membran von A. pleuropneumoniae, welcher vermutlich eine
Funktion im Eisentransport aufweist (3141 bp, ZP_00134583). Das Gen konnte in
der Untersuchung mittels PCR sowie im Southern Blot neben den hochvirulenten und
überwiegend invasiven Referenzstämmen für Serotyp 5, 10, 12, 13, 14 und 15 auch
in den schwach virulenten bzw. avirulenten Stämmen 3, 8 und 9 nachgewiesen
werden. In Serotyp 1 (hochvirulent) gelang der Nachweis hingegen nicht. In einer
Untersuchung von 16 aus pneumonischen Lungen isolierten Feldstämmen mittels
PCR zeigten sechs Stämme eine deutliche Bande und acht eine schwache, weshalb
auch bei diesem Fragment die Vermutung nahe liegt, dass unter den Stämmen
Sequenzunterschiede bestehen. Diese wird zusätzlich durch die unterschiedliche
Größe der DNA-Sequenzen mit Bindungsstellen für die Gensonde im Southern Blot
unterstützt. Das bei M. haemolytica nicht genauer beschriebene Protein CirA wird als
Rezeptorprotein der äußeren Membran erwähnt und weist eine Länge von 2174 bp
auf, in E. coli ist es 1926 bp lang. Als Hauptfunktion beschrieben Nikaido et al. bei E.
coli die Wiederaufnahme von Enterobaktin, einem Siderophor gramnegativer
Bakterien (NIKAIDO u. ROSENBERG 1990). Gleichzeitig wiesen sie nach, dass CirA
ebenfalls als Rezeptor für bestimmte Antibiotika (Catechol und Catechol substituierte
Cephalosporine) dient. Untersuchungen der Proteinexpression von E. coli ergaben,
dass CirA bei einer erhöhten Umgebungstemperatur von 37 °C und Eisenmangel
hochreguliert wird, wobei die Regulation über die Temperatur von der durch Eisen
übersteuert wird (WHITE-ZIEGLER et al. 2007). Da während einer Infektion im Wirt
E Diskussion 107
freies Eisen nur begrenzt verfügbar ist, steht die Fähigkeit, wirtseigenes Eisen
aufzunehmen, bei vielen Bakterien in engem Zusammenhang zur Virulenz (BALTES
et al. 2002).
Die Sequenz mit Homologien zu zwei phagenassoziierten Proteinen von A. pleuro-
pneumoniae war ausschließlich in virulenzassoziierten Referenzstämmen nachweis-
bar (2, 5, 12, 14 und 15), unter den Feldstämmen mit drei von 16 (pneumonisch
isoliert) bzw. einer von zehn (systemisch isoliert) allerdings seltener vertreten als die
anderen identifizierten Gene. Von den zwölf nasal isolierten Stämmen aus gesunden
Tieren war die Hälfte schwach positiv für dieses Gen, was erneut ein Hinweis für
Sequenzunterschiede zwischen einzelnen Stämmen sein kann. Ohne eine komplette
Sequenz der Gene sind Aussagen über ihre Funktion nicht möglich, jedoch ist
bekannt, dass Phagen an der Virulenz vieler Erreger beteiligt sind. Beispiele hierfür
sind das Shigatoxin von E. coli sowie das Choleratoxin von Vibrio cholerae, welche
unter der Kontrolle eines Repressorsystems solange als Prophage im Ruhezustand
verbleiben, bis Signale der Wirtszelle sie aktivieren (WALDOR u. FRIEDMAN 2005).
Da sämtliche Hypothesen zu der Funktion der Proteine bislang nur auf der Existenz
von Homologien zu besser bekannten Proteinen anderer Bakterien sowie in silico
Analysen beruhen, sind weitere Untersuchungen notwendig, um ihre mögliche Rolle
in der Virulenz des Erregers beurteilen zu können. Eine Möglichkeit hierfür wäre die
Konstruktion von Deletionsmutanten eines hochvirulenten Stammes und die Über-
prüfung der Auswirkungen des defekten Gens im Tierversuch.
2 Entwicklung einer Multiplex-PCR
Die Gene hhdA, hhdB und cirA, für die der Datenbankabgleich und die Verteilung
innerhalb der Referenzstämme einen Hinweis auf eine mögliche Beteiligung an der
Virulenz des Erregers ergab, wurden zur Entwicklung einer Multiplex-PCR einge-
setzt, um über den Nachweis einer oder mehrerer Virulenzmarker eine Aussage über
das Virulenzpotenzial eines Stammes treffen zu können. Dieses gelingt für Strepto-
coccus suis mit dem Nachweis von vier Genen, welche für virulenzassoziierte
Faktoren kodieren (Unterscheidung von vier Kapselstrukturen bzw. cps-Typen, Nach-
weis des extrazellulären Faktors EF [epf], des durch Muraminidase freigesetzten Pro-
E Diskussion 108
teins MRP [mrp], einem Hämolysin SLY [sly] und der Arginin-Deiminase [arcA]) sowie
einem housekeeping Gen zum Speziesnachweis (SILVA et al. 2006). Die anhand der
bekannten Genfragmente von H. parasuis konstruierten Primer wurden auf ihre
Spezifität hin an zwölf verschiedenen Bakterien bzw. Eukaryoten untersucht, welche
häufig in klinischen Proben aus dem oberen Respirationstrakt vorkommen (je ein
Feldstamm von Candida albicans, Mucor ssp., E. coli DH5-α, Klebsiella pneumoniae,
Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Histophilus somni, A. minor, A. in-
dolicus und A. suis sowie zwei Feldstämme von A. porcinus). Keines der unter-
suchten Isolate ergab Amplifikate in der PCR, somit erwiesen sich alle eingesetzten
Primer als spezifisch für H. parasuis.
Zum Ausschluss falsch negativer Resultate in der PCR, z. B. durch die Anwesenheit
von Hemmstoffen, wurde eine interne Kontrolle entwickelt (HOORFAR et al. 2004).
Diese bestand aus einem Gemisch der vier zu amplifizierenden PCR-Produkte,
welche in den Vektor pSC-A (Stratagene, La Jolla, USA) kloniert wurden. Zur Unter-
suchung der Referenzstämme erfolgte der Einsatz der Kontrolle so, wie er auch in
einer diagnostischen Untersuchung notwendig ist, das heisst: Jede Probe wurde in
einem Doppelansatz angesetzt und jeweils dem zweiten Ansatz 1 µl der internen
Kontrolle zugefügt. Da der Kontrollansatz somit Template-DNA für jedes Primerpaar
enthält, zeigt das Fehlen einer Bande einen Reaktionsausfall an.
Die Verteilung der drei eingesetzten Virulenzmarker innerhalb der Referenzstämme
und den pneumonisch und systemisch isolierten Feldstämme wurde bereits in Kapitel
D1.3 anhand von PCR-Untersuchungen im Monoplex-Ansatz erläutert. Der Vergleich
von Mono- und Multiplex-PCR ergab für die Referenzstämme nahezu vollkommene
Übereinstimmung. Allein die Primer oMP_CirA1 und 2 ergaben für den
Referenzstamm 3 im Multiplex-Ansatz kein PCR-Produkt, wohingegen im Monoplex-
Ansatz eine schwache Bande entstand. Mittlere Abweichungen ergaben sich hin-
gegen in den ebenfalls parallel untersuchten Feldstämmen aus systemischen und
pneumonischen Isolaten, für die der Einsatz der internen Kontrolle gesammelt in
einem Kontrollansatz durchgeführt wurde. Es blieben im Multiplex-Ansatz über-
wiegend jene Amplifikate aus, welche im Monoplex-Ansatz bereits nur schwach
E Diskussion 109
ausgeprägt waren. Eine mögliche Ursache hierfür könnten Sequenzunterschiede
sein, da vergleichsweise schlechter bindende Primer im Multiplex-Ansatz in der Am-
plifikation verstärkt benachteiligt sind. Ein Reaktionsausfall kann zwar über eine
vollständige interne Kontrolle ausgeschlossen werden, diese enthält jedoch Plas-
mide, deren Inserts aus PCR-Produkten der verwendeten Primer bestehen, so dass
alle Paare in der Kontrolle optimal binden können. Je nach Sequenz ist das nicht in
jeder untersuchten Probe der Fall.
Eine Sammlung von 214 Feldstämmen verschiedener Isolationsorte wurde bisher
ausschließlich im Multiplex-Ansatz untersucht. Der Speziesnachweis war für sämt-
liche Stämme erfolgreich, für 141 Stämme (65,9 %) konnte keiner der drei Virulenz-
marker nachgewiesen werden. Obwohl das Gen cirA innerhalb der Referenzstämme
deutlich häufiger nachgewiesen wurde als hhdA, waren sie in dieser Gruppe Feld-
stämme nahezu gleich verteilt. Bei 61 Stämmen (28,5 %) konnten gleichzeitig die
Gene hhdA und cirA gezeigt werden, nur zwei Stämme trugen zwar das Gen cirA,
nicht aber hhdA. Das auffallend häufige gemeinsame Auftreten könnte entweder auf
einen funktionellen Zusammenhang beider Gene hindeuten, möglicherweise besitzt
ein virulenter Stamm aber auch unabhängig voneinander wirkende Virulenzfaktoren.
Nur insgesamt zehn Stämme trugen das Gen hhdB, hierbei handelte es sich stets
um Isolate, bei denen auch die anderen beiden Virulenzmarker nachgewiesen
wurden. Vermutlich liegt dieser Tatsache eine hohe genetische Heterogenität zu-
grunde, wodurch sich auch das wie bei den systemischen Feldstämmen beobachtete
unterschiedlich häufige Vorkommen der beiden Untereinheiten hhdB und hhdA er-
klären ließe.
Der Umfang der übermittelten Angaben zu den 214 Feldstämmen weicht stark von-
einander ab, insbesondere zum klinischen Status des jeweils beprobten Tieres liegen
unterschiedlich ausführliche Daten vor. Soweit als möglich wurden PCR-Ergebnis
und Gesundheitszustand miteinander verglichen. Beobachtungen ergaben, dass die
Isolation von Stämmen mit allen drei Virulenzmarkern sowohl aus gesunden Tieren
(Routineuntersuchungen) bzw. Tieren mit lokalen Veränderungen (Atemtrakt) gelang,
wie auch aus Tieren mit systemischen Läsionen. Bei den letzteren handelte es sich
E Diskussion 110
überwiegend um Kümmerer mit unspezifischer Symptomatik. Umgekehrt trugen auch
Stämme, die laut Vorbericht mit einer klinischen Erkrankung im Zusammenhang
standen, keinen der drei Virulenzmarker. Dieses wurde auch bei 50 % der unter-
suchten systemisch isolierten Stämme beobachtet. Ohne die Überprüfung des Viru-
lenzpotenzials der isolierten Stämme im Tiermodell kann über einen Zusammenhang
zwischen dem PCR-Ergebnis und der Virulenz eines Stammes nur spekuliert
werden. Da zu keinem der Tiere der Durchseuchungsgrad des Herkunftsbetriebes
bekannt ist, muss davon ausgegangen werden, dass die jeweilige Herde mit einem
oder mehreren Stämmen von H. parasuis infiziert ist. Demnach ist unklar, ob es sich
bei einer klinischen Erkrankung bei dem vorliegenden Stamm auch um den verur-
sachenden Keim handelt. Fest steht einerseits, dass offensichtlich nicht jeder mit
allen drei untersuchten Virulenzfaktoren ausgestattete Stamm stets auch eine Er-
krankung auslöst. Möglicherweise ist für den Ausbruch einer Erkrankung eine
Prädisposition des Wirtes notwendig. Andererseits kann aus einem fehlenden
Nachweis der drei eingesetzten virulenzassoziierten Gene nicht automatisch auf die
Avirulenz des Stammes geschlossen werden. Denkbar wäre, dass aufgrund einer
hohen Heterogenität innerhalb der Gensequenzen nicht alle vorkommenden Viru-
lenzmarker detektiert werden, Sequenzunterschiede deuteten sich ja bereits in ande-
ren PCR-Untersuchungen an. Zudem können neben den bisher identifizierten Genen
weitere Faktoren an der Virulenz eines Stammes beteiligt sein.
Zur Fortführung der Studien ist einerseits ein Tiermodell notwendig, um virulente und
avirulente Stämme voneinander abgrenzen und die Bedeutung des Vorkommens der
identifizierten Gene sicher auswerten zu können. Andererseits werden zur Optimie-
rung der Primer weitere Informationen über die Gensequenz mehrerer Isolate an den
entsprechenden Bindungsstellen benötigt, damit die Erzeugung von Amplifikaten in
der PCR bei Vorhandensein des entsprechenden Gens zuverlässig erfolgt.
In wenigen Fällen wurden in der Anzucht der Feldstämme auf Kochblutagar unter-
schiedlich große Kolonien beobachtet, hierbei handelt es sich vermutlich um Phasen-
variationen, wie sie bereits von Bakos (BAKOS et al. 1952) beschrieben wurden.
E Diskussion 111
Fünf Stämme aus den Reisolaten des Tierversuchs ergaben im Multiplex-Ansatz
wiederholt kein Amplifikat für die Primer Hps-f und -r, es wurden jedoch
Virulenzmarker nachgewiesen. Im Monoplex-Ansatz ergaben alle fünf Isolate eine
Bande mit dem entsprechenden Primerpaar. Da sich die anderen drei eingesetzten
Primerpaare in der Überprüfung anhand von anderen Bakterienspezies/-gattungen
als spezifisch für H. parasuis erwiesen haben, ist der Speziesnachweis auch bei Aus-
bleiben eines Amplifikats mit den Primern Hps-f und -r gegeben. In Zweifelsfällen
kann ein Isolat zusätzlich im Monoplex-Ansatz überprüft werden.
Die entwickelte Multiplex-PCR hat sich als wirksame Methode erwiesen, Feldstämme
gleichzeitig auf das Vorkommen von drei potenziell virulenzassoziierten Faktoren zu
screenen. Es handelt sich um eine schnelle und kostengünstige Methode zur Bear-
beitung großer Probenmengen, auch wenn vereinzelt durch Sequenzunterschiede
falsch negative Ergebnisse auftreten. Die mit aufgereinigter DNA durchgeführten
Ansätze der Referenzstämme stimmten überwiegend mit den Ergebnissen der
Monoplex-Ansätze überein, nur für die Primer oMP_CirA1 und 2 blieb im Multiplex-
Ansatz eine Bande aus, während im Monoplex-Ansatz ein Amplifikat aufgetreten war.
Diskrepanzen traten beim Einsatz von Bakterienlysat aus Reinkulturen (Stämme aus
pneumonischen Lungen und systemisch isolierte Stämme) auf. Deshalb muss in
Einzelfällen die Verwendung von aufgereinigter DNA in Betracht gezogen werden,
um die Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse zu minimieren. Für den Ein-
satz von klinischen Proben, das heisst Tupferproben oder Organmaterial, muss das
Verhältnis der eingesetzten Primer bzw. der Plasmide der internen Kontrolle unter
Umständen wegen möglicher Hemmstoffe neu abgestimmt werden. Falls in Zukunft
mehr Daten bezüglich der Gensequenz verschiedener Stämme vorliegen, sollten die
Primer überprüft und eventuell optimiert werden, um falsch negative Ergebnisse
weiter zu minimieren.
3 Identifizierung von Stamm spezifischen Proteinen
Neben der Identifizierung von genetischen Unterschieden wurde in dieser Studie
außerdem die Proteinexpression von H. parasuis Stämmen mit verschiedenen Viru-
lenzeigenschaften untersucht, da diese Stämme möglicherweise zwar die gleiche
E Diskussion 112
genetische Ausstattung besitzen, jedoch verschiedene Proteine exprimiert werden.
Mit diesem Ansatz beschäftigten sich bereits zahlreiche Studien, die heute einge-
teilten Referenzstämme wurden bislang jedoch nicht berücksichtigt. So teilten Nicolet
et al. (NICOLET et al. 1980) acht Stämme unbekannter Herkunft in zwei PAGE-Type-
Gruppen ein, welche durch die An- oder Abwesenheit eines Proteins von 37 kDa
gekennzeichnet waren, und stellten fest, dass die Stämme aus Tieren mit Glässer-
scher Krankheit dieses Protein exprimierten. Die Ergebnisse wurden durch weitere
Studien bestätigt (MOROZUMI u. NICOLET 1986a). Rosner et al. hingegen teilten
ihre untersuchten Stämme in sieben verschiedene PAGE-Type-Gruppen ein, welche
auf der Kombination verschiedener Proteinbanden im ähnlichen Größenbereich (29-
51 kDa) basierten, konnten durch ihre Ergebnisse aber keinen Zusammenhang
zwischen Proteinmuster und Virulenz erkennen (ROSNER et al. 1991). Oliveira et al.
teilten die von ihnen untersuchten Stämme wiederum in zwei Gruppen ein und
bezogen sich auf markante Proteinbanden im Größenbereich von 36-38 kDa, aus
deren Auftreten sie einen Zusammenhang zu virulenten Stämmen schlossen
(OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). In keiner dieser Studien wurden die entsprechenden
Proteine identifiziert.
Auch in den Untersuchungen der vorliegenden Studie wurden markante Banden im
erwähnten Größenbereich nachgewiesen. Es wurden Proteingele von allen 15 Refe-
renzstämmen und 25 Feldstämmen (16 aus pneumonischen Lungen und neun aus
systemischen Läsionen) angefertigt und beurteilt. Dabei zeigten sämtliche Stämme
jeweils ein Protein mit einer Masse zwischen 32 und 42 kDa, Isolate ohne solche
Proteine wurden nicht beobachtet. Der Vergleich der Bandengröße virulenter und
avirulenter Referenzstämme ergab, dass virulente Stämme überwiegend kleinere
Proteinbanden trugen (32-36 kDa), avirulente vor allem größere (39-40 kDa). In bei-
den Gruppen traten jedoch Ausnahmen auf, da der hochvirulente Referenzstamm für
Serotyp 10 ein Protein von 38 kDa aufwies und der avirulente Serotyp 7 eine Pro-
teinbande von 33,5 kDa. Auch die Ergebnisse der systemisch und pulmonal isolier-
ten Feldstämme lassen keinen Zusammenhang zwischen der Virulenz eines Stam-
mes und der Größe dieser Proteine erkennen, da sowohl unter den pneumonisch als
auch den systemisch isolierten Stämmen kleinere und größere Proteine auftreten
E Diskussion 113
(minimale Größe 33 kDa, maximale Größe 42 kDa). 16 dieser Proteinbanden wurden
mittels massenspektrometrischer Untersuchung mit zwei unterschiedlichen Verfahren
(MALDI- und Q-TOF-Massenspektrometrie) identifiziert. Alle Proben ergaben, dass
es sich um ein P2 Protein der äußeren Membran (OMP P2) handelt. Mit Primern für
das Gen des P2 Proteins wiederholten sich die unterschiedlichen Größen auf gene-
tischer Ebene, da die Bandengröße in der Untersuchung der Referenzstämme um
bis zu ca. 80 bp voneinander abwich. Das Muster aus größeren und kleinen Ampli-
fikatbanden entsprach dem Muster der einzelnen Stämme aus verschieden großen
Proteinbanden. Ein OMP P2 Protein mit stammspezifischer Größe ist auch für H. in-
fluenzae beschrieben (SIKKEMA u. MURPHY 1992). Dort handelt es sich um ein
Porin, welches in unterschiedlichen nicht typisierbaren Stämmen eine Größe von 36
bis 42 kDa aufweist. Diese Abweichungen sind auf einzelne Bereiche großer
genetischer Heterogenität zurückzuführen. Damit steht in Verbindung, dass es sich
zwar um ein immunogenes Protein handelt, es aber nicht zur Ausbildung eines
kreuzreaktiven Schutzes führt und somit durch Infektion mit einem anderen Stamm
erneut Krankheitsausbrüche vorkommen können. Auch bei H. parasuis kommt es
nicht zur Ausbildung einer kreuzeraktiven Immunität und trotz nahezu vollständiger
Durchseuchung der Bestände kommt es bei Neuinfektion mit einem anderen Isolat
(z. B. durch Tiertransporte) häufig zu Erkrankungen. Zudem ist es bislang durch den
Einsatz von Vakzinen zwar gelungen, Tiere gegenüber einer homologen Belastung
zu schützen, zuverlässige Protektion gegenüber einer heterologen Belastung wurde
bisher jedoch nicht erreicht. Dieses zeigt, dass auch bei H. parasuis stammspe-
zifische Unterschiede immunogener Strukturen vorkommen.
Den deutlichsten Stammunterschied im Proteingel machte eine bislang unbe-
schriebene Bande von >200 kDa aus, welche nur bei den avirulenten Referenz-
stämmen der Serotypen 3, 6 und 9, dem hochvirulenten Referenzstamm von Serotyp
10 sowie den systemisch isolierten Feldstämmen Maas 2 und 3 zu erkennen war.
Die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proben war nicht in allen Fällen
erfolgreich, da Proteine dieser Größe aufgrund der Gitterstruktur im SDS-Gel oftmals
nicht mit ins Trenngel hinübertreten und somit keine vollständige Auftrennung erfolgt.
Die Untersuchung mittels Massenspektrometrie benötigt jedoch exakt aufgereinigte
E Diskussion 114
Proben, da ein Gemisch aus Peptiden verschiedener Proteine im Datenbankabgleich
keine sinnvollen Ergebnisse liefert. So konnten die Proben 9 und 10 (Referenzstamm
9 und 10) nicht identifiziert werden. Probe 3 aus dem Referenzstamm für Serotyp 3
wies ein identisches Peptid mit einem hypothetischen Protein von H. parasuis auf
(ZP_02479473), es ergaben sich jedoch keine Hinweise auf eine mögliche Funktion.
Zudem liegt in der Datenbank nur eine Sequenz von 154 Aminosäuren vor, so dass
es sich entweder nicht um das vollständige Protein oder um eine Kontamination
handelt. Probe 7 aus Serotyp 6 ergab ein identisches Peptid mit der größeren Unter-
einheit der Pseudouridin-Synthase B (ribosomal large subunit pseudouridine
synthase B) von H. parasuis (ZP_02477992). Pseudouridin-Synthasen wandeln Uri-
din in Pseudouridin um (LEPPIK et al. 2007). Pseudouridine sind die häufigsten
Modifikationen in stabilen RNA-Molekülen und werden sowohl in der kleinen, als
auch der großen Untereinheit ribosomaler RNA von Prokaryonten und Eukaryonten
gefunden (WRZESINSKI et al. 1995). Bakin et al. wiesen 1994 für das einzige Pseu-
douridin der kleinen Untereinheit der ribosomalen RNA von E. coli eine Funktion in
der Kodonerkennung nach (BAKIN et al. 1994). Da dieses Gen bei E. coli jedoch nur
eine Größe von 945 bp besitzt, ist fraglich, ob es sich bei dem Protein von H. para-
suis tatsächlich um eine Pseudouridinsynthase handelt.
Zukünftig können durch Sequenzuntersuchungen und -vergleiche des OMP P2 Gens
verschiedener Isolate die den Größenunterschieden zu Grunde liegenden Bereiche
identifiziert werden. Möglicherweise gibt es bei H. parasuis ähnlich konservierte und
variable Bereiche wie bei H. influenzae. Auch wenn die jetzigen Ergebnisse keine
eindeutige Verbindung zwischen Proteingröße und Virulenzpotenzial zulassen, er-
scheint eine nähere Untersuchung lohnenswert: Einer der beiden Ausreißer, der als
hochvirulent geltende Referenzstamm von Serotyp 10, weist zwar im Vergleich zu
anderen virulenten Stämmen nur eine kleine Proteinbande auf, dieses Isolat wurde
jedoch aus der Nasenhöhle eines gesunden Schweines isoliert und erwies sich erst
bei intraperitonealer Inokulation als virulent (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON
1992). Durch Western Blots mit Seren rekonvaleszenter Tiere kann die Immunogeni-
tät des Proteins ermittelt und durch die Konstruktion von Deletionsmutanten seine
Funktion näher charakterisiert werden.
E Diskussion 115
4 Infektionsversuch
Um die Funktion einzelner Gene oder Proteine bezüglich ihres Zusammenhangs mit
der Virulenz eines Stammes einschätzen zu können, sind Stämme mit einem
definierten Virulenzpotenzial notwendig. Eine Aussage anhand der klinischen
Symptome des beprobten Tieres oder des Isolationsortes ist unsicher, da bereits
hochvirulente Stämme aus der Nasenhöhle gesunder Tiere gewonnen wurden
(Referenzstamm Serotyp 10), ein einzelnes Tier oftmals mehrere unterschiedliche
Stämme trägt und der genaue Immunstatus des beprobten Tieres in vielen Fällen
nicht bekannt ist. Daher sind Versuche am Tier notwendig, um einzelne Stämme
unter definierten Bedingungen bezüglich ihres Virulenzpotenzials testen zu können.
Für die in dieser Studie verwendeten Stämme ist das Virulenzpotenzial aus-
schließlich für die 15 Referenzstämme im Tierversuch definiert worden (KIELSTEIN
u. RAPP-GABRIELSON 1992), weshalb die Untersuchungsergebnisse dieser Stäm-
me stärker gewichtet wurden. Zur Etablierung eines Tiermodells im Schwein für die
Überprüfung weiterer Stämme wurde ein erster Infektionsversuch mit dem als hoch-
virulent bekannten Referenzstamm von Serotyp 12 vorgenommen.
Aufgrund einer nahezu vollständigen Durchseuchung der Betriebe mit H. parasuis ist
die Verwendung von spezifisch pathogenfreien (SPF-) Schweinen kaum zu reali-
sieren. Andere Studien berichten zwar über den Einsatz von Tieren aus einer SPF-
Herde (SMART u. MINIATS 1989), aus wirtschaftlichen Gründen wurde auf eine
Anlieferung solcher Tiere jedoch verzichtet. Stattdessen wurden in dieser Studie
sechs Ferkel verwendet, deren Muttersau durch den Zulieferer aus einem H. para-
suis freien Bestand importiert wurde, und sechs Ferkel einer im selben Zuliefer-
betrieb gezogenen Muttersau. Die importierte Sau wurde zusammen mit den Tieren
des restlichen Bestandes gehalten, so dass sie Kontakt zu dem gesamten Keim-
spektrum des Betriebes hatte.
Bei Ankunft der fünf Wochen alten Ferkel wurden alle Tiere per Nasentupfer und
Tonsillenkratzprobe auf H. parasuis getestet sowie eine Blutprobe serologisch auf
Antikörper gegen den Erreger untersucht. Bei sämtlichen Tieren ergab die PCR zum
Speziesnachweis ein Amplifikat, aus sieben Tieren wurden kulturell zusätzlich ins-
E Diskussion 116
gesamt zwölf Stämme isoliert, es konnten jedoch bei keinem Tier Antikörper nachge-
wiesen werden. Es handelte sich demnach um serologisch negative Tiere, die bereits
Kontakt zu H. parasuis hatten. Die RFLP-PCR der in Reinkultur isolierten Stämme
ergab zwei verschiedene Restriktionsmuster, von denen eins dem Muster der viru-
lenten Referenzstämme 5, 12, 14 und 15 glich und das andere bislang nicht be-
schrieben wurde. Drei von fünf Stämmen mit dem neu identifizierten Muster waren in
der PCR-Untersuchung für die in dieser Studie identifizierten putativen Virulenz-
marker für das Gen cirA positiv. Die sechs Stämme mit dem gleichen Muster wie die
Referenzstämme 5, 12, 14 und 15 trugen die Gene hhdA, hhdB und cirA, zudem
konnten in einer zweiten PCR auch die beiden phagenassoziierten Gene nachge-
wiesen werden, für das die Stämme mit dem bislang unbekannten Restriktions-
muster durchgehend negativ waren. Ein einziger Stamm ergab zwar ein Amplifikat
mit den Primern Hps-f und -r zum Speziesnachweis, jedoch keines mit den Primern
der RFLP-PCR. Möglicherweise handelt es sich bei diesem Stamm nicht um H. pa-
rasuis, da mit der PCR nach Oliveira et al. in Einzelfällen auch falsch positive
Ergebnisse auftreten (ANGEN et al. 2007). Bereits vor der Infektion hatten die Ferkel
demnach Kontakt mit mindestens zwei verschiedenen Stämmen von H. parasuis,
wovon der eine genetische Ähnlichkeit mit virulenten bzw. hochvirulenten Referenz-
stämmen aufweist und auch sämtliche in dieser Studie identifizierten putativen
Virulenzmarker trägt.
Die künstliche Infektion wurde mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 durchgeführt.
Vergleichend wurden zwei verschiedene Inokulationsrouten eingesetzt: einerseits die
bereits häufig beschriebene und erfolgreich eingesetzte intratracheale Infektion, an-
dererseits die Infektion in einer Aerosolkammer nach dem Protokoll von Jacobsen et
al. (JACOBSEN et al. 1996b). Die Vorteile der Infektion in der Kammer bestehen
zum einen in der für die Versuchstiere vollkommen stressfreien Durchführung,
welche ohne eine Anästhesie auskommt. Zum anderen nehmen die Tiere in der
Kammer den Erreger gleichzeitig über mehrere Wege auf, da sie diesen sowohl über
das Aerosol einatmen, als auch oral über sich niederschlagende Feuchtigkeit auf
Futterpartikeln und Artgenossen aufnehmen. Die Infektion in der Aerosolkammer
E Diskussion 117
kommt der natürlichen Infektionsroute des Erregers daher deutlich näher als die
intratracheale Inokulation.
In Anlehnung an andere Infektionsversuche bekam die Gruppe der intratracheal
belasteten Tiere 2 x 108 Bakterien verabreicht (BLANCO et al. 2004), in der Aero-
solkammer wurden 1,1 x 1010 Keime desselben Stammes vernebelt. Im Vergleich zu
Miniats et al., die 1991 eine aerosolisierte Infektion mit 8 x 109 KBE durchführten,
handelte es sich um eine verhältnismäßig hohe Infektionsdosis (MINIATS et al.
1991). Die Tiere der Kontrollgruppe, welche intratracheal eine Kochsalzlösung erhiel-
ten, zeigten über den kompletten Versuchsverlauf keine Anzeichen einer klinischen
Erkrankung. In der per Aerosol infizierten Gruppe wurde bei zwei Tieren gering-
gradiges Husten und Niesen ohne Störung des Allgemeinbefindens beobachtet, die
restliche Gruppe wies keinerlei klinische Symptome auf. Die Tiere der intratracheal
belasteten Gruppe waren ebenfalls überwiegend gesund, das heisst auch hier zeig-
ten zwei Tiere geringgradiges Husten und Niesen bei unbeeinträchtigtem Allgemein-
befinden, und bei einem weiteren Tier wurden überhaupt keine Symptome beob-
achtet. Das vierte Tier der aerosolbelasteten Gruppe war allerdings geringgradig le-
thargisch, zeigte ab Tag 3 nach der Infektion Appetitmangel, ab Tag 5 Fieber, einen
aufgekrümmten Rücken und Bewegungsunlust. Obgleich es sich hier um eher un-
spezifische Symptome handelt, treten diese typischerweise während einer Pleuritis
bzw. Peritonitis auf, wie sie durch H. parasuis verursacht wird. In der Sektion zeigte
das Tier fibrinöse Auflagerungen in Brust- und Bauchhöhle sowie dem Perikard und
Verklebungen zwischen Lunge und Brustwand. Aus diesen Läsionen gelang jedoch
keine Reisolation von H. parasuis, sondern nur aus Nasen- und Tonsillentupfer.
Allerdings ergaben Bauch- und Brusthöhlentupfer in der PCR-Untersuchung auf
M. hyorhinis ein starkes Amplifikat und auch eine Woche nach Probenentnahme
konnte der Erreger noch kulturell aus den Tupfern isoliert werden. Auch wenn ein
Nachweis von H. parasuis selbst bei hochgradigen Veränderungen oft nicht erfolg-
reich ist, ist in diesem Fall eine M. hyorhinis Infektion des Tieres wahrscheinlich.
Hierbei handelt es sich um eine der zu beachtenden Differentialdiagnosen von
H. parasuis, da es ebenfalls zu einer Polyserositis kommt (FRIIS u. FEENSTRA
1994). Palzer et al. stellten in Feldstudien eine signifikante Assoziation beider
E Diskussion 118
Erreger fest und gehen von einer gegenseitigen Beeinflussung aus, da Tiere mit
einer Koinfektion höhere klinische Scores erreichten als bei einer Monoinfektion
(PALZER et al. 2006).
Die restlichen Tiere waren in der Sektion unauffällig, zwei Tiere zeigten jedoch kleine
atelektatische Bereiche in der Lunge, welche ebenfalls durch Mykoplasmen verur-
sacht worden sein können. Die PCR-Untersuchung ergab diesbezüglich jedoch für
beide Tiere kein positives Ergebnis.
Neben der Isolation von H. parasuis aus Nasen- und Tonsillentupfern gelang diese in
allen drei Versuchsgruppen auch aus der Lunge (sechs Tiere) und aus systemischen
Lokalisationen (Perikard: zwei Tiere, Pleura: ein Tier, Meningen: zwei Tiere). Ein
Zusammenhang zwischen Infektionsroute und Isolationsort konnte somit nicht
beobachtet werden. Da H. parasuis zudem auch von Tieren der Kontrollgruppe aus
systemischen Lokalisationen isoliert werden konnte, weist einer der Stämme, den die
Tiere bereits vor der künstlichen Infektion trugen, offensichtlich Potenzial zur inva-
siven Besiedlung auf. Aufgrund der großen Ähnlichkeiten zwischen Belastungs-
stamm und etwa der Hälfte der vor der Infektion isolierten Stämme ist eine Unter-
scheidung kaum möglich, mit 19 von 58 Reisolaten ergeben 32,8 % der Stämme
nach der Infektion in der Multiplex-PCR, der RFLP-PCR und der Test-PCR auf die für
die beiden phagenassoziierten Proteine kodierenden Gene dasselbe Ergebnis wie
der Referenzstamm von Serotyp 12. Ob es sich bei dem bereits im Herkunftsbetrieb
vorkommenden Keim möglicherweise sogar um einen Stamm von Serotyp 12 han-
delt, kann anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht beurteilt werden. Auffällig ist,
dass alle vor der Infektion reisolierten Stämme mit dem gleichen Restriktionsmuster
in der RFLP-PCR wie der Belastungsstamm in der Test-PCR auf die für die beiden
phagenassoziierten Proteine kodierenden Gene positiv waren, ebenso der
Belastungsstamm selbst. Bei allen von systemischen Lokalisationen gewonnenen
Isolaten konnte dieses Fragment jedoch nicht nachgewiesen werden. Dieses könnte
bedeuten, dass neben den vor der künstlichen Infektion isolierten Stämmen im
Herkunftsbetrieb noch weitere in der ersten Untersuchung nicht identifizierte Stämme
E Diskussion 119
von H. parasuis vorkommen. Eine andere Möglichkeit ist eine inkonstante PCR-
Untersuchung aufgrund von Hemmstoffen oder Sequenzunterschieden.
Keines der Tiere, bei denen aus systemischen Lokalisationen Keime reisoliert
wurden, zeigte Symptome der Glässerschen Erkrankung. Dieses spricht für eine
protektive Immunität der Tiere gegen den Belastungsstamm. Aufgrund der
vorliegenden genetischen Ähnlichkeiten der Stämme sind Kreuzreaktionen
wahrscheinlich. Im ELISA konnten zwar keine Antikörper gegen H. parasuis
nachgewiesen werden, allerdings könnten bei zum Belastungszeitpunkt ca. fünf
Wochen alten Ferkeln maternale Antikörper noch eine Rolle spielen, die
möglicherweise im ELISA nicht detektiert werden. Dass maternale Antikörper die
Ausbildung einer klinischen Erkrankung beeinflussen, zeigten Solano-Aguilar et al.
(SOLANO-AGUILAR et al. 1999).
Die Reisolationsergebnisse an unterschiedlichen Lokalisationen und die genetischen
Untersuchungen der Stämme ergaben aufgrund der Ähnlichkeiten zu den bereits vor-
her im Tier vorkommenden Feldstämmen keine eindeutigen Hinweise auf die Aus-
breitung des Belastungsstammes im Wirtsorganismus. Der Versuch bestätigt jedoch
erneut das Vorkommen mehrerer unterschiedlicher Stämme in einem Bestand und
die symptomlose Besiedlung von Schweinen. Zum ersten Mal konnten Stämme von
H. parasuis in klinisch gesunden Tieren auch aus systemischen Lokalisationen iso-
liert werden.
Bei der Verwendung von vermutlich immunkompetenten Tieren hat keine der beiden
gewählten Inokulationsrouten eine klinische Erkrankung ausgelöst. Auch die Ergeb-
nisse der Reisolation ermöglichen keinen Rückschluss darauf, welche Infektions-
methode geeigneter ist. Beide Formen setzten voraus, dass der Erreger zur Erzeu-
gung klinischer Symptome die Barrieren des oberen Respirationstraktes (Tonsillen,
Schleimhautepithel) überwindet. Bei der Durchführung einer intraperitonealen Infek-
tion, wie sie für die Referenzstämme durch Kielstein et al. durchgeführt wurde, wird
diese Barriere umgangen (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der Vergleich
der Ergebnisse von Pathogenitätsstudien verschiedener Stämme wird durch den
Einsatz so unterschiedlicher Inokulationsrouten erschwert. So wurde der Referenz-
E Diskussion 120
stamm von Serotyp 10 aus der Nasenhöhle eines gesunden Schweines isoliert, wur-
de jedoch nach intraperitonealer Verabreichung als hochvirulent eingestuft
(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992). Der in dieser Studie eingesetzte Be-
lastungsstamm, Referenzstamm von Serotyp 12, wurde aus der Lunge eines an
Polyserositis erkrankten Tieres isoliert und zeigte sich in der Studie von Kielstein et
al. nach intraperitonealer Verabreichung ebenfalls hochvirulent. Bislang sind keine
anderen Studien bekannt, in welcher das Virulenzpotenzial dieses Referenzstammes
über die nasale oder orale Infektionsroute überprüft wurde. Zur Ermittlung des
tatsächlichen Virulenzpotenzials von verschiedenen Stämmen sind weitere Patho-
genitätsstudien am Versuchstier notwendig.
Die Voraussetzung für Virulenzstudien an H. parasuis ist eine zuverlässige Erzeu-
gung der Glässcherschen Erkrankung in Versuchstieren, um eine abweichende Viru-
lenz in verschiedenen Stämmen beurteilen zu können. Aufgrund der schlechten
Verfügbarkeit von SPF-Tieren, der geringen klinischen Symptome in Versuchen mit
überwiegend immunkompetenten Tieren und der daraus resultierenden schlechten
Vergleichbarkeit von Studien mit Tieren unterschiedlichen Immunstatus‘ müssen
alternative Tiermodelle in Betracht gezogen werden. Miniats et al. zeigten, dass sich
Gnotobioten grundsätzlich eignen, durch ihr schwach ausgeprägtes Immunsystem
jedoch auch häufig bereits vor Versuchsbeginn hohe Tierverluste mit sich bringen
(MINIATS et al. 1991). Ähnliches gilt für mittels Kaiserschnitt geborener Ferkel, die
kolostrumfrei aufgezogen werden (VAHLE et al. 1997). Eine mögliche Option stellen
Meerschweinchen dar, welche zwar nicht dem eigentlichen Wirtstier entsprechen,
jedoch ein der Glässerschen Krankheit sehr ähnliches Krankheitsbild entwickeln
(MOROZUMI et al. 1982) und deren Unterbringung und Versorgung im Vergleich zu
empfindlichen gnotobiotischen Tieren deutlich wirtschaftlicher ist. Erst bei Vorliegen
eines etablierten Infektionsmodells können verschiedene Inokulationsrouten aussa-
gekräftig miteinander verglichen werden.
F Zusammenfassung 121
F Zusammenfassung
Sack, Meike: Identifizierung neuer virulenzassoziierter Faktoren von
Haemophilus parasuis und Entwicklung einer Multiplex-PCR
H. parasuis ist als Erreger der Glässerschen Krankheit für hohe wirtschaftliche Ver-
luste im Bereich der Schweinefleischproduktion verantwortlich. Die Virulenzfaktoren
des Erregers sind noch weitestgehend unbekannt und eine Aussage über das Viru-
lenzpotenzial eines Stammes ist bislang nicht möglich.
Zur Identifizierung möglicher virulenzassoziierter Gene wurden die Genome der
Referenzstämme von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki, virulent) und 11 (avirulent) per
Repräsentativer Differenzanalyse verglichen. Es wurden fünf Serotyp 5 spezifische
Gene identifiziert, sie kodieren für ein putatives Hämolysin und seine Transport-
einheit, HhdBA, zwei putative Phagenproteine sowie ein möglicherweise eisenab-
hängiges Rezeptorprotein der äußeren Membran, CirA. Mit den überwiegend in viru-
lenten Stämmen vorkommenden Genen hhdA, hhdB und cirA wurde eine Multiplex-
PCR entwickelt, die die gleichzeitige Überprüfung auf das Vorkommen der drei Gene
ermöglicht. In einer Untersuchung von 214 Feldstämmen waren ca. 33 % positiv für
die Gene hhdA und cirA, hhdB wurde jedoch nur in wenigen Stämmen nach-
gewiesen. Zur Beurteilung der Rolle dieser Gene in der Virulenz sind weitere Unter-
suchungen notwendig.
Vergleiche der Proteinexpression (Ganzzelllysate) und die Analyse einzelner Pro-
teine mittels Massenspektrometrie ergaben, dass sämtliche untersuchten Stämme
ein Protein der äußeren Membran (OMP P2) exprimieren, dessen Masse zwischen
32 und 42 kDa schwankt. Ein Zusammenhang zwischen Proteingröße und Virulenz
eines Isolates konnte nicht beobachtet werden. Die unterschiedlich virulenten Refe-
renzstämme 3, 6, 9 und 10 sowie zwei invasive Feldstämme exprimieren ein Protein
von >200 kDa, welches nicht identifiziert werden konnte.
F Zusammenfassung 122
In einem Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 entwickelte von
12 serologisch negativen Ferkeln nur eines klinische Symptome, aus den Läsionen
wurde jedoch Mycoplasma hyorhinis nachgewiesen. Der Belastungsstamm wies
genetisch hohe Ähnlichkeiten mit einem bereits vor der Infektion in allen Tieren
nachgewiesen Stamm auf, so dass sie vermutlich protektive maternale Antikörper
besaßen, die mittels ELISA nicht detektiert wurden.
In dieser Studie wurden fünf neue putative virulenzassoziierte Gene von H. parasuis
identifiziert. Ihre Funktion und Rolle in der Virulenz des Erregers muss nachfolgend
durch eine funktionelle Charakterisierung untersucht werden.
G Summary 123
G Summary
Sack, Meike: Identification of new virulence associated factors of
Haemophilus parasuis and development of a multiplex-PCR
H. parasuis is the etiological agent of Glasser’s disease and is responsible for high
economic losses in the production of pork. Very little is known to date about virulence
factors of H. parasuis and a prediction about the potential ability of a strain to cause
disease is currently not possible.
To identify putative virulence-associated genes the genomes of the reference strains
of serotypes 5 (strain Nagasaki, virulent) and 11 (nonvirulent) were compared by
Representational difference analysis. Five genes specific for serotype 5 were identi-
fied, coding for a putative hemolysin and its export system, HhdBA, two phage pro-
teins and a likely iron-responsive regulated receptor protein of the outer membrane,
CirA. Since they are mainly present in virulent reference strains, the genes hhdA,
hhdB and cirA were used to develop a multiplex PCR which makes it possible to
check strains simultaneously for the presence of those three genes. Testing of 214
field strains gave a positive result in 33 % of the isolates for hhdA and cirA, whereas
hhdB was detected only in a few strains. To evaluate the function of those genes in
virulence further investigations are necessary.
Comparison of protein expression of whole-cell lysates and the analysis of single
proteins by mass spectrometry revealed a protein of the outer membrane (OMP P2)
for every investigated strain which varied in mass from 32 to 42 kDa. No correlation
between mass and virulence was observed. Reference strains 3, 6, 9 and 10 and two
field strains isolated systemically express a protein of >200 kDa which could not be
identified.
In a challenge experiment with the reference strain of serotype 12, only one out of 12
serologically negative piglets developed clinical symptoms, however, Mycoplasma
G Summary 124
hyorhinis was reisolated. The strain used for challenge showed a high genetic simi-
larity to an isolate which was shown to be present in the animals before starting the
infection trial, indicating that protective maternal antibodies which were not detected
by ELISA might have been present in the piglets during the curse of infection.
In this study five new putativly virulence associated genes of H. parasuis were identi-
fied. The function and role of which in virulence of H. parasuis has to be analysed by
functional characterization.
H Literaturverzeichnis 125
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I Anhang 137
I Anhang
1 Verbrauchsmittel und Chemikalien
Tab. 7 Eingesetzte Verbrauchsmittel
Eutha® 77, Injektionslösung Essex Tierarznei, München, Deutschland
Glasperlen Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Millipore-Wasser® Merck/VWR International GmbH, Hannover, Deutschland bzw. Millipore, Schwalbach, Deutschland
Mikrotiterplatten, 96-well Tissue Culture Plate 96-Well, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Mineralöl Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Nylonmembran Roti®-Nylon plus, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
PCR-Gefäß 8-tube strip 0,2 ml, Bioplastics, Landgraaf, Niederlande
Pipettenspitzen Starlab, Ahrensburg, Deutschland
PPLO-Agar® Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Deutschland
Reagiergefäß 1,5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Röhre 13 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Röhre 50 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Röntgenfilm Kodak, Bio Max X-Rar®-Film, Stuttgart, Deutschland
Stresnil®, Injektionslösung Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland
Ursotamin® Serum-Werk-Bernburg, Bernburg, Deutschland
Columbia-Agar® Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Orange G® AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland
Blutagar Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Gassner-Agar Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Trockentupfer Wattestäbchen, Neo Lab®, Heidelberg, Deutschland
Feuchttupfer (Amies-Medium) Meus S.r.l., Piove di Sacco, Italien und
I Anhang 138
Medical Wire & Equipment, Corsham, England
Radiografiestift Glow Writer®, Diversified Biotech, Boston, USA
Tab. 8 Eingesetzte Chemikalien
[α-32P]-dCTP 3000Ci/mmol 10mCi/ml Lead, 250 µCi, PerkinElmer, Köln, Deutschland
Acetonitril Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
ACHC (α-Cyano-4-Hydroxy-Cynnamic-Säure)
Bruker Daltonics, Billerica, USA
Acrylamid Acrylamide Bis® (30 % [w/v]), SERVA, Heidelberg, Deutschland
Agar Agar Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Agarose SERVA® Agarose SERVA, SERVA, Heidelberg, Deutschland
Ameisensäure Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
APS Ammoniumperoxidsulfat (98 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Bacto® Tryptone Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Deutschland
Borsäure (99, 5 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
BSA (Fraktion V) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
BSA, acetyliert NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland
Calciumchlorid Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
Chloroform/Trichlormethan Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Coomassie-Brilliantblau R250 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide (99 %), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Cystein Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
dNTPs Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
DTT (1,4-Dithiothreitol) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
I Anhang 139
EDTA EDTA Dinatrium Dihydrat (Titrierkomplex III), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Essigsäure (100 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Ethanol 96 % unvergällt Elch-Apotheke, Hannover, Deutschland
Ethanol 96 % vergällt Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Ficoll 400 Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden
Fleischextrakt Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Glucose Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Glycerin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Hefeextrakt Yeast Extract, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Iodacetamid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
IPTG Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Isoamyl Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
L-Cystinhydrochlorid- Monohydrat Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Magnesiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
MOPS Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
NaCl (99, 8 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
NAD SERVA, Heidelberg, Deutschland
NaOH Natriumhydroxid (99 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Pepton Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland
Phenol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Polyvinylpyrrolidon Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Rubidiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Saccharose Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
Salzsäure 37 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
SDS Pellets (99 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
I Anhang 140
TEMED (99 %) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Trifluorsäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
TRIS TRIS Ultra Qualität (99, 9 %), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Bacitracin SERVA, Heidelberg, Deutschland
Lincomycin Upjohn Laboratories, Val de Reuil, Frankreich
Kristallviolett Merck, VWR International GmbH, Hannover, Deutschland
Methanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
I Anhang 141
Tab. 9 Eingesetzte Enzyme
GoTaq® Hot Start Promega, Mannheim, Deutschland
GoTaq® Flexi DNA Polymerase Promega, Mannheim, Deutschland
Klenow-Fragment T4-DNA Polymerase®, NEW ENGLAND BIOLABS Inc., Frankfurt, Deutschland
Ligase T4 DNA Ligase®, NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland
Lysozym Lysozym® aus Hühnereiweiß (kristallisiert und lyophyllisiert), Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Proteinase K Proteinase K®, lyophilisiert, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Restriktionsenzyme und ihre Puffer NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland
RNAse Ribonuclease®, salzfrei, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Taq-Polymerase Taq DNA Polymerase®, recombinant, Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland
Trypsin, Sequencing grade Promega, Mannheim, Deutschland
Antarctic Phosphatase® NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland
Turbo DNAse® Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
Reverse Transkriptase SuperscriptII®; Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland
Tab. 10 Molekulargewichtsstandards
DNA:
2-Log Ladder® NEW ENGLAND BIOLABS® Inc., Frankfurt, Deutschland
100 bp ladder® Diagonal GmbH & Co KG, Münster, Deutschland
Proteine:
Pageruler® Proteinmarker prestained/ unstained
Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland
CalMix1® und CalMix2® Applied Biosystems, Forster City, USA
I Anhang 142
2 Lösungen und Puffer
Tab. 11 Medien
LB-Medium (LURIA-BERTANI-Medium): Bacto-Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 5 g Aqua dest. ad 1000 ml
LB-Agar: LB-Flüssigmedium, Zugabe von 1,5 % Agar (w/v)
PPLO-Agar: 35 g/l PPLO®-Agar Aqua dest. ad 1000 ml
Kochblut-Agar: 39 g Columbia-Agar® 2 g Agar 100 ml Schafsblut 10 mg NAD 4 ml Aqua dest.
Columbia-Schafsblut-Agar: 39 g Columbia-Agar® 1 g Agar 50 ml Rinderblut 400 µg Bacitracin 4 µg Lincomycin 4 µg Kristallviolett 700 mg NAD
Schweineblut-Agar 1000ml Aqua dest. 5 g NaCl 10 g Pepton 10 g Fleischextrakt 1,5 ml NaOH (4 %) 12,5 g Agar 70 ml Schweineblut
BHI-Medium: 37 g/l BHI®-Agar Aqua dest. ad 1000 ml
Ersatz-Isovitalex (EIVX): 0,5 g L-Cystin-dihydrochloride in 400 ml Aqua dest. lösen mit 5 M NaOH den pH-Wert auf 9,4 einstellen 13 g Cystein 50 g Glucose mit 5 M NaOH den pH-Wert auf 6-7 einstellen 0,5 g NAD Aqua dest. ad 500 ml
I Anhang 143
Tab. 12 Präparation chromosomaler DNA
TEN-Puffer: 100 µl Lysozym (100 mg/ml) 50 µl Tris 1M (pH 8,0) 2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0) 25 µl NaCl 4M 823 µl Aqua dest.
CTAB: 4,1 g NaCl 10 g CTAB Aqua dest ad 100 ml
Tab. 13 Agarosegel-Elektrophorese
10 x TBE–Puffer: 108 g Tris 55 g Borsäure 6,72 g EDTA Aqua dest. ad 1000 ml
Laufpuffer: 2 mg/ml Orange G® 30 % Glycerin
Tab. 14 Acrylamidgelelektrophorese
18 %iges TBE-Acrylamidgel: 6 ml 30 %igem Acrylamid 1 ml 10 x TBE-Puffer 1 ml Aqua dest 10 µl TEMED 100 µl APS (10 %)
Tab. 15 Koloniegel
Lysepuffer: 2 g Saccharose 0,4 ml 5 M NaOH 0,4 ml 3 M KCl 0,2 ml 0,5 M EDTA 0,25 ml 20 % SDS 1 ml 1% Bromphenolblau
I Anhang 144
Tab. 16 Herstellung chemokompetenter Zellen
TFB-1: 0,29 g (30 mM) Kalium-Acetat 1,21 g (100 mM) Rubidiumchlorid 0,11 g (10 mM) CaCl2 0,99 g (50 mM) MnCl2
30,0 ml Glycerin, 50 %ig (v/v), pH 5,8 Aqua dest. ad 100 ml
TFB-2: 0.21 g (10 mM) MOPS 0,83 g (75 mM) CaCl2
0,12 g (10 mM) RbCl 30,0 ml Glycerin, 50 %ig (v/v), pH 6,5) Aqua dest. ad 100 ml
Tab. 17 Herstellung einer Gensonde
OLB:
Lösung O:
Lösung A:
Lösung B:
Lösung C:
OLB:
0.625 ml 2 M Tris-HCl pH 8.0 0.125 ml 1 M MgCl2
0.250 ml Aqua dest. 1 ml Lösung O
18 µl 2-Mercaptoethanol 5 µl d___TP 5 µl d___TP 5 µl d___TP (je 100 mM in 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA, pH 7)
2 M Hepes, pH 6.6 mit 4 M NaOH einstellen
Hexadeoxyribonucleotides (90 OD units/ml = 4,5 mg/ml in TE)
100 Teile Lösung A 250 Teile Lösung B 150 Teile Lösung C
Stopplösung:
20µM NaCl 20mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 mM EDTA 0,25 % SDS 1 µM des unmarkierten Nukleotids, das zur Markierung eingesetzt wurde
I Anhang 145
Tab. 18 Southern Hybridisierung
50 x Denhardt's Lösung: 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g BSA (Fraktion V)
20 x SSC: 175,3 g NaCl (3 M) 88,2 g Tri-Natriumcitrat (0,3 M) Aqua dest. ad 800 ml den pH-Wert mit Zitronensäure auf 7,0 einstellen Aqua dest. ad 1000 ml
Hybridisierungspuffer: 6 ml 20 x SSC 0.4 ml 0.5 M EDTA 2 ml 50 x Denhardt's Lösung 0.5 ml 20 % SDS Aqua dest. ad 20 ml
Tab. 19 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-Page)
Spaltpuffer (2x): 1,5 ml 0,5 M Tris (pH 6,8) 6 ml 10 % SDS 3 ml 50 % Glycerin 10 µl 1 % Bromphenolblau 1 ml 2- Mercaptoethanol
Färbelösung mit Methanol: 1,25 g Coomassie ® Brillantblau R 250 225 ml Methanol 50 ml Eisessig 225 ml Aqua dest.
Entfärber mit Methanol: 300 ml Methanol 100 ml Eisessig 600 ml Aqua dest.
Coomassie-Blau-Färbung ohne Methanol: 25 % Isopropanol 10 % Essigsäure 0,05 % Coomassie ® Brillantblau R 250
Entfärber ohne Methanol 10 % Essigsäure
Polyacrylamidgel, Trenngel: 4,68 Aqua dest. 3,0 ml 1,5 M Tris-Puffer (pH 8,8) 120 µl SDS (10 %) 12 µl TEMED 4,56 ml Acrylamid (30 %) 120 µl APS (10 %)
Polyacrylamidgel, Sammelgel: 3,66 Aqua dest. 1,5 ml 0,5 M Tris-Puffer (pH 6,8) 60 µl SDS (10 %) 12 µl TEMED
I Anhang 146
0,78 ml Acrylamid (30 %) 60 µl APS (10 %)
10 x SDS Laufpuffer 259 mM Tris 2 M Glycin 1% (w/v) SDS
I Anhang 147
3 Eingesetzte Stämme
Tab. 20 Angaben zu den Referenzstämmen 1-15
Stamm Serovar Referenzstamm Diagnose/Isolationsort Quelle
H. parasuis
1 nr. 4 gesund/Nase
(KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992)
2 SW140 gesund/Nase
3 SW114 gesund/Nase
4 SW124 gesund/Nase
5 Nagasaki Septikämie/Meningen
6 131 gesund/Nase
7 174 gesund/Nase
8 C5 unbekannt
9 D74 unbekannt
10 H555 gesund/Nase
11 H465 Pneumonie/Trachea
12 H425 Polyserositis/Lunge
13 84-17975 unbekannt/Lunge
14 84-22113 unbekannt/Gelenk
15 84-15995 Pneumonie/Lunge
Tab. 21 Angaben zu den 16 Feldisolaten aus pneumonischen Lungen
Stamm Feldstamm Isolationsort Quelle
H. parasuis
1. B0033 2. B0335 3. B0352 4. B0569 5. B0366 6. B0577 7. B0578 8. B0611 9. B0612 10. B0621 11. B0659 12. B0684 13. B0696 14. B0735 15. B1009 16. B1040
Lunge Dr. Mumme
I Anhang 148
Tab. 22 Angaben zu den zehn systemisch isolierten Feldisolaten
Stamm Feldstamm Isolation Quelle
H. parasuis
1. Maas 1 2. Maas 2 3. Maas 3
Meningen
Diagnostische Abteilung des Instituts für Mikrobiologie
4. Baums1 Gelenk Dr. Baums, Institut für Mikrobiologie
5. B1035 6. B321 7. B360 8. H5392 9. B1018
Meningen Meningen Meningen Perikard Meningen
Dr. Mumme
10. HPS-Perikard Perikard Diagnostische Abteilung des Instituts für Mikrobiologie
Tab. 23 Angaben zu den zwölf nasal isolierten Feldisolaten
Stamm Feldstamm Isolationsort Quelle
H. parasuis 1-12 Nasentupfer diese Arbeit
Tab. 24 Angaben zu den 214 Feldisolaten verschiedener Lokalisationen
Stamm Feldstamm Isolationsort Quelle
H. parasuis 1-214 Verschiedene Lokalisationen
Dr. Mumme
Tab. 25 Teststämme zur Spezifitätsprüfung der in der Multiplex-PCR eingesetzten Primerpaare
Stamm Quelle
Candida albicans Feldisolate der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Mucor ssp.
Escherichia coli DH5- α (RALEIGH et al. 1989)
Klebsiella pneumoniae
Feldstämme der diagnostischen Abteilung des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Bordetella bronchiseptica
Pasteurella multocida
Histophilus somni
A. minor
A. indolicus
A. suis
A. porcinus
I Anhang 149
4 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse der PCR-Un-tersuchungen
Tab. 26 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Referenzstämme 1-15
Serotyp/Gen hhdA* Spezies-
nachweis* hhdB* cirA*
phagen-assoz. Gene*
1 - + - - - 2 - + - - + 3 - + - - - 4 - + - - - 5 + + + + + 6 - + - - - 7 - + - - - 8 - + - - - 9 - + - - - 10 - + - - - 11 - + - - - 12 + + + + + 13 + + + + - 14 + + + + + 15 + + + + +
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)
I Anhang 150
Tab. 27 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus pneu-monischen Lungen
Bezeichnung RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
1 B0033 n. d. + + - - - 2 B0335 n. d. - + - - - 3 B0352 n. d. + + + + + 4 B0569 n. d. + + - + - 5 B0366 n. d. + + + + - 6 B0577 n. d. - + - + - 7 B0578 n. d. - + - - - 8 B0611 n. d. + + - + + 9 B0612 n. d. - + - - - 10 B0621 n. d. - + - - - 11 B0659 n. d. - + - - - 12 B0684 n. d. + + - + - 13 B0696 n. d. + + - + + 14 B0735 n. d. - + - - - 15 B1009 n. d. - + - - - 16 B1040 n. d. - + - - -
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)
Tab. 28 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus syste-mischen Läsionen
Bezeichnung RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
1 Maas 1 n. d. + + - + - 2 Maas 2 n. d. - + - - - 3 Maas 3 n. d. - + - - - 4 Baums 1 n. d. - + - - - 5 B1035 n. d. + + - + - 6 B321 n. d. - + - - + 7 B360 n. d. + + - + - 8 H5392 n. d. + + - + - 9 B1018 n. d. - + - - + 10 Perikard n. d. + + - + -
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)
I Anhang 151
Tab. 29 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der nasal isolierten Feld-isolate
Bezeichnung RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
Nasal 1 neu - + - - - Nasal 2 neu - + - (+) - Nasal 3 neu - + - (+) - Nasal 4 neu - + - (+) - Nasal 5 neu - + - - - Nasal 6 wie 12 + + + + + Nasal 7 wie 12 + + + + + Nasal 8 wie 12 + + + + +
Nasal 9 kein
Produkt - + - (+) -
Nasal 10 wie 12 + + + + + Nasal 11 wie 12 + + + (+) + Nasal 12 wie 12 + + + (+) +
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)
I Anhang 152
Tab. 30 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldstämme verschie-dener Isolationsorte
Lfd.-Nr.
Klon Nr. (Platte, Ort)
RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
1 A, A3 n. d. - + - - n. d. 2 A, A5 n. d. - + - - n. d. 3 A, A6 n. d. - + - - n. d. 4 A, A8 n. d. + + - + n. d. 5 A, A9 n. d. + + - + n. d. 6 A, A11 n. d. + + - + n. d. 7 A, A12 n. d. + + - + n. d. 8 A, B2 n. d. + + - + n. d. 9 A, B4 n. d. + + - + n. d. 10 A, B5 n. d. + + - + n. d.
11 B, A1 n. d. - + - - n. d. 12 B, A2 n. d. - + - - n. d. 13 B, A3 n. d. - + - - n. d. 14 B, A4 n. d. - + - - n. d. 15 B, A5 n. d. - + - - n. d. 16 B, A6 n. d. + + - + n. d. 17 B, A7 n. d. + + - + n. d. 18 B, A8 n. d. + + - + n. d. 19 B, A9 n. d. - + - - n. d. 20 B, A10 n. d. - + - - n. d.
21 B, A11 n. d. + + - + n. d. 22 B, A12 n. d. - + - - n. d. 23 B, B1 n. d. - + - - n. d. 24 B, B2 n. d. - + - - n. d. 25 B, B3 n. d. - + - - n. d. 26 B, B4 n. d. - + - - n. d. 27 B, B5 n. d. - + - - n. d. 28 B, B6 n. d. - + - - n. d. 29 B, B7 n. d. - + - - n. d. 30 B, B8 n. d. - + - - n. d.
31 B, B9 n. d. - + - - n. d. 32 B, B10 n. d. - + - - n. d. 33 B, B11 n. d. - + - - n. d. 34 B, B12 n. d. - + - - n. d. 35 B, C1 n. d. - + - - n. d. 36 B, C2 n. d. - + - - n. d. 37 B, C3 n. d. - + - - n. d. 38 B, C5 n. d. - + - - n. d. 39 B, C6 n. d. - + - - n. d. 40 B, C7 n. d. - + - - n. d.
41 B, C8 n. d. - + - - n. d. 42 B, C9 n. d. - + - - n. d. 43 B, C10 n. d. - + - - n. d. 44 B, C11 n. d. - + - - n. d. 45 B, C12 n. d. - + - - n. d. 46 B, D1 n. d. - + - - n. d. 47 B, D2 n. d. - + - - n. d. 48 B, D3 n. d. - + - - n. d. 49 B, D4 n. d. - + - - n. d. 50 B, D5 n. d. - + - - n. d.
I Anhang 153
Lfd.-Nr.
Klon Nr. (Platte, Ort)
RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
51 B, D6 n. d. + + - + n. d. 52 B, D7 n. d. - + - - n. d. 53 B, D8 n. d. + + - + n. d. 54 B, D9 n. d. + + - + n. d. 55 B, D10 n. d. + + + + n. d. 56 B, D12 n. d. - + - - n. d. 57 B, E1 n. d. + + - + n. d. 58 B, E2 n. d. + + - + n. d. 59 B, E3 n. d. - + - - n. d. 60 B, E4 n. d. - + - - n. d.
61 B, E7 n. d. - + - - n. d. 62 B, E8 n. d. - + - - n. d. 63 B, E9 n. d. - + - - n. d. 64 B, E10 n. d. + + - + n. d. 65 B, E12 n. d. - + - - n. d. 66 B, F1 n. d. - + - - n. d. 67 B, F2 n. d. - + - - n. d. 68 B, F3 n. d. - + - - n. d. 69 C, A1 n. d. - + - - n. d. 70 C, A2 n. d. + + - + n. d.
71 C, A4 n. d. - + - - n. d. 72 C, A5 n. d. - + - - n. d. 73 C, A6 n. d. - + - - n. d. 74 C, A7 n. d. - + - - n. d. 75 C, A8 n. d. + + + + n. d. 76 C, A9 n. d. - + - - n. d. 77 C, A10 n. d. - + - - n. d. 78 C, A11 n. d. + + + + n. d. 79 C, A12 n. d. - + - - n. d. 80 C, B3 n. d. - + - - n. d.
81 C, B4 n. d. + + - + n. d. 82 C, B5 n. d. + + - + n. d. 83 C, B6 n. d. - + - - n. d. 84 C, B8 n. d. - + - - n. d. 85 C, B9 n. d. + + + + n. d. 86 C, B10 n. d. - + - - n. d. 87 C, B11 n. d. - + - - n. d. 88 C, B12 n. d. - + - - n. d. 89 C, C2 n. d. - + - - n. d. 90 C, C3 n. d. + + - + n. d.
91 C, C4 n. d. - + - - n. d. 92 C, C5 n. d. - + - - n. d. 93 C, C6 n. d. + + - + n. d. 94 C, C7 n. d. - + - - n. d. 95 C, C8 n. d. - + - - n. d. 96 C, C9 n. d. + + - + n. d. 97 C, C11 n. d. - + - - n. d. 98 C, C12 n. d. + + - + n. d. 99 C, D1 n. d. - + - - n. d. 100 C, D2 n. d. - + - - n. d.
101 C, D3 n. d. - + - - n. d. 102 C, D4 n. d. - + - - n. d. 103 C, D5 n. d. + + + + n. d.
I Anhang 154
Lfd.-Nr.
Klon Nr. (Platte, Ort)
RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
104 C, D7 n. d. - + - - n. d. 105 C, D8 n. d. - + - - n. d. 106 C, D9 n. d. - + - - n. d. 107 C, D10 n. d. - + - - n. d. 108 C, D11 n. d. - + - - n. d. 109 C, D12 n. d. + + - + n. d. 110 C, E1 n. d. - + - - n. d.
111 C, E2 n. d. + + - + n. d. 112 C, E3 n. d. - + - - n. d. 113 C, E4 n. d. - + - - n. d. 114 C, E5 n. d. - + - - n. d. 115 C, E7 n. d. + + - + n. d. 116 C, E8 n. d. - + - - n. d. 117 C, E9 n. d. - + - - n. d. 118 C, E10 n. d. - + - - n. d. 119 C, E11 n. d. - + - - n. d. 120 C, F1 n. d. + + - + n. d.
121 C, F8 n. d. + + - + n. d. 122 C, F9 n. d. + + - + n. d. 123 C, F11 n. d. + + - + n. d. 124 C, G4 n. d. - + - - n. d. 125 C, G5 n. d. - + - - n. d. 126 C, G6 n. d. - + - - n. d. 127 C, G7 n. d. - + - - n. d. 128 C, G8 n. d. - + - - n. d. 129 C, G9 n. d. - + - - n. d. 130 C, G12 n. d. - + - + n. d.
131 C, H1 n. d. - + - - n. d. 132 C, H2 n. d. + + - + n. d. 133 C, H3 n. d. + + - + n. d. 134 C, H4 n. d. - + - - n. d. 135 C, H5 n. d. + + - + n. d. 136 C, H6 n. d. - + - - n. d. 137 C, H8 n. d. - + - - n. d. 138 C, H9 n. d. + + - + n. d. 139 D, A1 n. d. - + - - n. d. 140 D, A2 n. d. - + - - n. d.
141 D, A4 n. d. + + - + n. d. 142 D, A6 n. d. + + - + n. d. 143 E, A1 n. d. + + - + n. d. 144 E, A2 n. d. - + - - n. d. 145 E, A3 n. d. + + - + n. d. 146 E, A4 n. d. + + - + n. d. 147 E, A5 n. d. - + - - n. d. 148 E, A6 n. d. - + - - n. d. 149 E, A7 n. d. - + - - n. d. 150 E, A8 n. d. + + - + n. d.
151 E, A9 n. d. - + - - n. d. 152 E, A10 n. d. - + - - n. d. 153 E, A11 n. d. + + + + n. d. 154 E, A12 n. d. - + - - n. d. 155 E, B1 n. d. + + - + n. d. 156 E, B2 n. d. + + - + n. d.
I Anhang 155
Lfd.-Nr.
Klon Nr. (Platte, Ort)
RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
157 E, B3 n. d. - + - - n. d. 158 E, B4 n. d. - + - - n. d. 159 E, B6 n. d. + + - + n. d. 160 E, B7 n. d. - + - (+) n. d.
161 E, B8 n. d. + + - + n. d. 162 E, B9 n. d. + + - + n. d. 163 E, B10 n. d. + + - + n. d. 164 E, B11 n. d. - + - - n. d. 165 E, B12 n. d. - + - - n. d. 166 E, C1 n. d. - + - - n. d. 167 E, C2 n. d. - + - - n. d. 168 E, C3 n. d. + + - + n. d. 169 E, C4 n. d. - + - - n. d. 170 E, C5 n. d. - + - - n. d.
171 E, C6 n. d. + + - + n. d. 172 E, C7 n. d. - + - - n. d. 173 E, C8 n. d. - + - - n. d. 174 E, C9 n. d. - + - - n. d. 175 E, C11 n. d. - + - - n. d. 176 E, D1 n. d. + + - + n. d. 177 E, D2 n. d. + + - + n. d. 178 E, D3 n. d. + + + + n. d. 179 E, D4 n. d. + + - + n. d. 180 E, D5 n. d. - + - - n. d.
181 E, D6 n. d. + + - + n. d. 182 E, D7 n. d. - + - - n. d. 183 E, D8 n. d. - + - - n. d. 184 E, D10 n. d. - + - - n. d. 185 E, D11 n. d. - + - - n. d. 186 E, D12 n. d. - + - - n. d. 187 E, E1 n. d. - + - - n. d. 188 E, E2 n. d. - + - - n. d. 189 E, E3 n. d. - + - - n. d. 190 E, E4 n. d. - + - - n. d.
191 E, E5 n. d. - + - - n. d. 192 E, E6 n. d. + + + + n. d. 193 E, E9 n. d. - + - - n. d. 194 E, E10 n. d. - + - - n. d. 195 E, E11 n. d. - + - - n. d. 196 E, E12 n. d. + + + + n. d. 197 E, F1 n. d. + + - + n. d. 198 E, F2 n. d. - + - - n. d. 199 E, F3 n. d. + + - + n. d. 200 E, F4 n. d. - + - - n. d.
201 E, F5 n. d. + + + + n. d. 202 E, F6 n. d. - + - - n. d. 203 E, F7 n. d. + + - + n. d. 204 E, F8 n. d. - + - - n. d. 205 E, F9 n. d. + + - + n. d. 206 E, F10 n. d. + + - + n. d. 207 E, F11 n. d. + + - + n. d. 208 E, F12 n. d. - + - - n. d. 209 E, G1 n. d. + + - + n. d.
I Anhang 156
Lfd.-Nr.
Klon Nr. (Platte, Ort)
RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
210 E, G2 n. d. - + - - n. d.
211 E, G3 n. d. - + - - n. d. 212 E, G4 n. d. - + - - n. d. 213 E, G5 n. d. - + - - n. d. 214 E, G8 n. d. + + - + n. d.
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene)
Tab. 31 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Reisolate des Infek-tionsversuchs
Probennummer RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
1 wie 12 + + - + + 2 wie 12 + + + + - 3** wie 12 + + + + - 4** wie 12 + + + + - 5 wie 12 + + + + - 6 wie 12 + + + + + 7** wie 12 + + + + - 8 wie 12 + + + + + 9 wie 12 + + + + + 10 wie 12 + - + + +
11 wie 12 + + + + + 12 wie 12 + + + + - 13 wie 12 + + + + - 14 neu - + - - - 15 wie 12 + + + + + 16 wie 12 + + + + - 17 wie 12 + + + + - 18 wie 12 + + + + - 19 wie 12 + + + + + 20 neu - + - - -
21 wie 12 + + + + - 22 wie 12 + - + + + 23 wie 12 + - + + + 24 wie 12 + + + + + 25 wie 12 + + + + + 26 wie 12 + + + + - 27 wie 12 + + + + - 28 wie 12 + + + + - 29 wie 12 + + + + - 30 wie 12 + + + + -
31 wie 12 + + + + - 32 wie 12 + + + + - 33 wie 12 + + + + - 34 wie 12 + - - + -
I Anhang 157
Probennummer RFLP-PCR*
hhdA* Spezies-nach -weis*
hhdB* cirA* phagen-assoz. Gene*
35 neu - + - - - 36** wie 12 + - + + - 37** wie 12 + + + + - 38** wie 12 + + + + - 39 neu - + - - -
40** kein Produkt
- + - - -
41 wie 12 + + + + + 42 wie 12 + + + + - 43 wie 12 + + + + + 44 wie 12 + + + + + 45 wie 12 + + + + + 46 wie 12 + + + + - 47 neu - + - - - 48 neu - + - - - 49 wie 12 + + + + + 50 wie 12 + + + + +
51 wie 12 + + + + - 52 wie 12 + + + + + 53 wie 12 + + + + + 54 wie 12 + + + + + 55 wie 12 + + + + - 56 wie 12 + + + + + 57 wie 12 + + + + - 58 wie 12 + + + + -
*Verwendete Primer: oMP_A1 und 2 (hhdA), oMP_B1 und 2 (hhdB), oMP_CirA1 und 2 (cirA), Hps-f und -r (Speziesnachweis), tbpB33 und 55 (RFLP-PCR), oPhage13_1 und 2 (phagenassoziierte Gene) **von systemischen Läsionen isoliert
I Anhang 158
5 Ergebnisse der massenspektrometrischen Untersuchungen
Tab. 32 Mittels Q-TOF untersuchte Proben mit einer Übereinstimmung zum OMP P2 von H. parasuis
Probe Anzahl der übereinstimmenden Peptide zum OMP P2 (ZP_02477753)
18 2 2, 4, 8, 11, 12, 21 je 3 14, 15 je 4 17 5 1, 5, 20 je 6 6, 16 je 7 19 9
Tab. 33 Aminosäuresequenz des OPM P2 (ZP_02477753) von H. parasuis, übereinstimmende Peptide aus der Tabelle sind unterstrichen.
1 MKKTLVALAV AAFAASASAV TVYENEGTKV DFDGQLRLLL
41 EEQATKEKGQ SSTGGHTNLK NNGSRFGISI KHNINENLYG
81 FGRYETRLDS NSKNAAGWGD VKTKYAYVGL GGYGHEISFG
121 KQAVIGDSIG QAGFDKVYGV GTGGIKYSAN NTNKKGFDIL
161 TSDSDSAINY TYTGIEGLTL GANYNVANER DKKTGEVNVG
201 STKSGFGLGA KYTAKIAESQ SVTVAAGYTH DDYKSGSVNK
241 KDKDGVYFGL KYVNAPFTVA VDGGHGVEKT GNVKEKIDFV
281 RTGARFDVTP KSGVYGNYSY GTYKDKAYKA TAHQFMLGAD
321 YKLHKQVVTF VEGRLIKNKD SNNKKVTDQA LGVGLRVLW
I Anhang 159
Tab. 34 Probe 7: Aminosäuresequenz der größeren Untereinheit der Pseudo-uridin-Synthase B von H. parasuis (ZP_02477992), übereinstimmende Peptide sind unterstrichen.
1 MTTFRKPTAT KRSDSAKTLQ KPTQRNTRQE TQNRKPLVKK
41 SPKPTASIET ENKANDKIVG EKLQKILARA GQGSRREIEE
81 VIAAGRVSVD GKIATLGDRV QVSSSTKIRI DGNLVNLIPT
121 QKEICRVLMY YKPEGELCTR SDPEGRATVF DRLPRLTGSR
161 WIAVGRLDIN TSGLLLFTTD GELANRLMHP SREVEREYSV
201 RVFGEVNDAM IQRLRKGVQL EDGPANFKQI KAVGGTGINQ
241 WFDVTLTEGR NREVRRLWES QGIQVSRLIR IRYGNIKLEK
281 SLPRGGWEEM GLEQVNYLRE LVGLKPETET KVDVTKARRR
321 TSTRQIRKAV KQHTKYRKI
Tab. 35 Mittels Q-TOF-Massenspektrometrie ermittelte Peptidsequenzen aus Probe 7 (Referenzstamm 6)
Probe 7
APEAGTEAVPVFPGK GNAGAENAGSLAK
APEGATEAVPVFPGK GTPSGPVTPGK
APEQTEAVPVDVSK NGAGAENAGLSAK
APEQTEPVAVFPGK NGAGAENAGSLAK
APEQTEAVPVFPGK SAPSGPVTPGK AEPGSPHAGGNPK TAEPSASSMVPAK
ASPSGPVTPGK TGPSGPVTPGK
ATITLPEDK TPAPTDAVMGPR
DPFEAFAK TAPPTDAVMGPR
DVPGQGVQGPAASGGK TPAPTDAVETAR
EAPGSPGPAPNPK TAEFAGPESSPAK
EAPGSPPPAGNPK TAEPTGSSMVPAK
EAPGSPHAGGNPK TPAPTDAVMPGR
EAPGSPAPPGNPK TPAPNDTPGK
GNAGAENAGLSAK VATVSLPR
I Anhang 160
6 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse des Tierversuchs
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I Anhang 163
7 Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Verwendete Primer .................................................................................. 40
Tab. 2 Ergebnisse der Homologiesuche spezifischer Sequenzen für Sero-typ 5 ......................................................................................................... 65
Tab. 3 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der Referenz-stämme 1-15 ............................................................................................ 74
Tab. 4 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zwölf nasal isolierten Feldstämme.............................................................................. 74
Tab. 5 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der 16 aus pneu-monischen Lungen isolierten Feldstämme .............................................. 74
Tab. 6 Verteilung der spezifischen Sequenzen innerhalb der zehn syste-misch isolierten Feldstämme ................................................................... 75
Tab. 7 Eingesetzte Verbrauchsmittel ................................................................ 137
Tab. 8 Eingesetzte Chemikalien ....................................................................... 138
Tab. 9 Eingesetzte Enzyme .............................................................................. 141
Tab. 10 Molekulargewichtsstandards ................................................................. 141
Tab. 11 Medien ................................................................................................... 142
Tab. 12 Präparation chromosomaler DNA .......................................................... 143
Tab. 13 Agarosegel-Elektrophorese ................................................................... 143
Tab. 14 Acrylamidgelelektrophorese .................................................................. 143
Tab. 15 Koloniegel .............................................................................................. 143
Tab. 16 Herstellung chemokompetenter Zellen .................................................. 144
Tab. 17 Herstellung einer Gensonde .................................................................. 144
Tab. 18 Southern Hybridisierung ........................................................................ 145
Tab. 19 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-Page) ............................. 145
Tab. 20 Angaben zu den Referenzstämmen 1-15 .............................................. 147
Tab. 21 Angaben zu den 16 Feldisolaten aus pneumonischen Lungen ............. 147
Tab. 22 Angaben zu den zehn systemisch isolierten Feldisolaten ...................... 148
Tab. 23 Angaben zu den zwölf nasal isolierten Feldisolaten .............................. 148
Tab. 24 Angaben zu den 214 Feldisolaten verschiedener Lokalisationen .......... 148
Tab. 25 Teststämme zur Spezifitätsprüfung der in der Multiplex-PCR einge-setzten Primerpaare .............................................................................. 148
I Anhang 164
Tab. 26 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Referenzstämme .... 149
Tab. 27 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus pneumonischen Lungen ........................................................................ 150
Tab. 28 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldisolate aus systemischen Läsionen ......................................................................... 150
Tab. 29 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der nasal isolierten Feldisolate ............................................................................................. 151
Tab. 30 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Feldstämme ver-schiedener Isolationsorte ....................................................................... 152
Tab. 31 Zusammenfassung der PCR-Untersuchungen der Reisolate des Infektionsversuchs ................................................................................. 156
Tab. 32 Mittels Q-TOF untersuchte Proben mit einer Übereinstimmung zum OMP P2 von H. parasuis ....................................................................... 158
Tab. 33 Aminosäuresequenz des OPM P2 (ZP_02477753) von H. parasuis. .... 158
Tab. 34 Probe 7: Aminosäuresequenz der größeren Untereinheit der Pseu-douridin-Synthase B von H. parasuis (ZP_02477992) ........................... 159
Tab. 35 Mittels Q-TOF-Massenspektrometrie ermittelte Peptidsequenzen aus Probe 7 (Referenzstamm 6) ............................................................ 159
Tab. 36 Reisolate und PCR-Ergebnisse der Einzeltiere aus dem Infek-tionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 vor der Infek-tion ......................................................................................................... 160
Tab. 37 Reisolate und PCR-Ergebnisse der Einzeltiere aus dem Infek-tionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 nach der Infektion ................................................................................................. 161
Tab. 38 Ergebnisse der PCR- und ELISA-Untersuchungen der Einzeltiere aus dem Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 vor der Infektion, durchgeführt durch die IVD ........................................ 162
I Anhang 165
8 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Schemazeichnung Repräsentative Differenzanalyse .............................. 47
Abb. 2 PCR des RDA-Ansatzes mit dem Primer RBgl24 .................................... 60
Abb. 3 PCR von 85 RDA-Klonen mit den Primern M13 forward und reverse ..... 61
Abb. 4 Southern Blot der 85 PCR-Produkte aus den RDA-Klonen mit M13-Primern .................................................................................................... 62
Abb. 5 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 68
Abb. 6 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdA in Feld-isolaten mit den Primern oMP_A1 und 2 (964 bp) ................................... 68
Abb. 7 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 69
Abb. 8 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens hhdB in Feldiso-laten mit den Primern oMPB_1 und 2 (557 bp) ........................................ 69
Abb. 9 Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in den Referenz-stämmen 1-15. ......................................................................................... 71
Abb. 10 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen des Gens cirA in Feldiso-laten mit den Primern oMPCirA_1 und 2 (135 bp) ................................... 71
Abb. 11 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenasso-ziierten Gene in den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp). ................................................................... 72
Abb. 12 PCR-Überprüfung auf das Vorkommen der beiden phagenasso-ziierten Gene in Feldisolaten mit den Primern oPhage13_1 und 2 (301 bp) ................................................................................................... 72
Abb. 13 RT-PCR mit Serotyp 5 (Stamm Nagasaki) .............................................. 73
Abb. 14 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Commassie gefärbt ............................. 77
Abb. 15 SDS-PAGE mit Ganzzelllysaten, Coomassie gefärbt .............................. 78
Abb. 16 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 1 (Probe 6) .......................................... 79
Abb. 17 Beispielhaftes Spektrum Gruppe 2 (Probe 7) .......................................... 80
Abb. 18 Spektrum Probe 3 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) .................................................................................................... 80
Abb. 19 Spektrum Probe 15 (ohne Ähnlichkeiten zu den Spektren anderer Proben) .................................................................................................... 81
I Anhang 166
Abb. 20 PCR mit den Referenzstämmen 1-15 mit den Primern oPorin1 und 2 zur Überprüfung auf das Vorkommen der Gensequenz des OMP P2 Proteins von H. parasuis. ......................................................................... 82
Abb. 21 Beispielhaftes Spektrum der massenspektrometrischen Untersu-chung mittels Q-TOF (Probe 6) ............................................................... 83
Abb. 22 PCR zum Nachweis des DNA-Gehalts mittels universeller Primer (A) mit Eukaryoten (I) und Bakterien (II), bzw. Multiplex-PCR zur Spe-zifitätsuntersuchung der eingesetzten Primer (B), ................................... 85
Abb. 23 Multiplex-PCR mit chromosomaler DNA von Serotyp 5 (I) und der in-ternen Kontrolle (II) .................................................................................. 87
Abb. 24 Multiplex-PCR der Referenzstämme 1-15, im zweiten Ansatz (+) je-weils mit Zusatz von 1 µl Interner Kontrolle ............................................. 89
Abb. 25 Multiplex-PCR der Feldstämme zur Überprüfung auf das Vorhan-densein der postulierten Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA. ............... 92
Abb. 26 Vorkommen der identifizierten Gene hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldstämmen verschiedener Lokalisationen. ........................................... 94
Abb. 27 Ermittelte Kombinationen der putativen Virulenzmarker hhdA, hhdB und cirA in den 214 Feldisolaten unterschiedlicher Lokalisation. ............. 94
Abb. 28 Tier 11 nach der Infektion mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 ....... 97
Abb. 29 RFLP-PCR mit den isolierten Feldstämmen der Versuchstiere ............. 100
Danksagung
Ich danke Prof. Dr. N. Baltes für die gute Betreuung, ihre ständig neuen Ideen, ihr
offenes Ohr, ihren Optimismus und das Rezept vom Kichererbsensalat,
ich danke meiner Gutachterin PD Dr. I. Hennig-Pauka für ihr Interesse an meiner
Arbeit,
ich danke Doris Höltig und Ines Flügge aus der Klinik für kleine Klauentiere für die
Durchführung der Probennahme und Infektion beim Tierversuch, Falk Büttner für den
„Kraftakt“ am Q-TOF und Jochen Meens fürs Probenaufreinigen,
ich danke „Joerch“ Merkel für seine hilfsbereite Art mir Spyware vom Rechner zu
entfernen und die kompliziertesten und simpelsten Computerfragen zu erklären
sowie für das oft so entscheidende Stück Schokolade,
ich danke dem restlichen Institut für Mikrobiologie für das Auftreiben von
Feldstämmen (insbesondere Ute Regul, Alexander Maas und Christoph Baums), die
tolle Arbeitsatmosphäre und eine schöne Zeit, insbesondere Halina für ihre ständige
Bereitschaft, mir ihr Gehirn zu leihen und die gute und stets angenehme
Zusammenarbeit, ich danke Herrn Dr. Mumme für die Bereitstellung der Sammlung
an Feldstämmen und Eva-Lotta Schneider für den Motivationsschub.
Meinen Eltern danke ich einfach nur so und meinem Opa danke ich für meine
Tierliebe.
Für meine persönlich Finanzierung danke ich dem Institut, der Bundeswehr und vor
allem Matthias, der mich all die Jahre, ohne zu jammern und stets bereitwillig
durchgefüttert hat! Letzterem habe ich noch wegen so vielem mehr zu danken -
hoffentlich verzeiht er mir eines Tages, dass er mir kein Programm zur Berechnung
von Gelbanden schreiben durfte…