Grundlagen der Bioprozesstechnik791.104
Bakkalaureatsstudium LBT (217)Prozesskontrolle
(K. Bayer)
Sommersemester 2005Version 25.04.05
Themen Dauer Vortragender
Anwendung der Bioprozesstechnik(Backhefe, Starterkultur, Antibiotika, Enzyme, Zitronensäure, Antikörper, Vakzine,Alkohol, Abwasser/Abluft)
(3 h) KB
Grundelemente des Bioprozesses(Upstream, Fermentation, Downstream), die Vielfältigkeit der Mikro-organismen),Produkt, Transformation (Umweltbiotechnologie, Biokatalye)
(3 h) KB
Fermentationsstrategien 4 KB
Biologische Grundlagen (4 h) RB
Wachstum der MikroorganismenRein- und Mischkulturen
(6 h) RB
ProzesskontrolleAnalyse, Mess- und Regeltechnik
(6 h) KB
Kultivierung der Mirkoorganismen im technischen MaßstabDimensionierung (Design) von Bioreaktoren, Spezialreaktoren, nicht homogeneReaktortypen (z.B. Immobilisierung, Fliessbett)
(10 h) HK
Maßstabsvergrößerung, Steriltechnik (6 h) HK
AufarbeitungEigenschaften von FermentationsbrühenKonzentration Produkt, Biomasse, Viskosität DichteZellabtrennungZentrifugation, Mikrofiltration, FlockulationZellaufschluss(Extraktion)Adsorptive ReinigungChromatographieExpanded bed
(8 h) AJ
Prozessauslegung (5 h) AJ, HK, KB
PROCESS CONTROL and AUTOMATION
outline
• Bioprocess control
• Sensors
• chemical/physical
• biosensors
• flow injection analysis
• Application of neural networks
• Process control
• process control systems
• requirements due to quality management
UPSTREAMPROCESSING
DOWNSTREAMPROCESSINGFERMENTATION
BIOPROCESS
BIOPROCESS OPERATION
Bioprocess (Fermentation)
„black box“
Substrate
Process operation:empirical
„more an art than science“
Product
Biomass
End productswater, CO2
Mass balance
Substrate + O2 Biomass + Product + H2O + CO2 + heat
Impact of process control in bioprocessing
Efficiency (yield) of a bioprocess is determined by• performance of the cell factory• environmental parameters
maintenance of process conditions
Goal: optimal utilisation of biological features• biosynthesis • transformation • degradation
PROCESS CONTROL and AUTOMATION
PROCESS CONTROL and AUTOMATION
Main characteristics of a Bioprocess• complex• highly interactive• parallel• non linear
monitoring- controlquality management
documentation
Key issues+
Product isolation(Downstream-
processing)
biosynthesis
Zur Nutzung des Potentials von Mikroorganismen oder Zellenmuß die bio-, chemische und physikalische Umgebungkontinuierlich analysiert (monitoring) und kontrolliert werden(control).
Sensoren und Systeme zur Überwachung, Steuerung undRegelung komplexer Vorgänge = Prozeßleitsysteme(Prozeßrechner)
Aufgaben: Steuern Regeln Dokumentation
Bio-Prozessführung (Bioprocess control)
Definitionen
• Prozess: System in dem die Transformation und/oder derTransport von Materialien, Energie und/oder Informationabläuft
• Prozessleitung (Control) Steuerung Regelung
• Monitoring (Prozessbeobachtung, -überwachung)
• Automatisierung: Ablauf von Prozessen ohnemenschlichen Eingriff
PROZESSLEITUNG und AUTOMATISIERUNG
Reasons for an increasing need for automation anduse of computers in bioprocessing
process level• process regimes became far more complex and sophisticated e.g. (batch fedbatch)• continuous increase of variables to be monitored• increasing complexity of variables
level of quality management• demands related to quality management increased dramatically (hidden plant, makes approx. 35% (up to 70%) of costs)
LV Automatisierung von Bioprozessen
Meßverstärkerund ReglerRückfluss-
kühler
Stutzen f. Messsonden
SteuerungSPS
Labor-Bioreaktor mit Meß-und Regeltechnik
Kommunikationmit PC
(Visualisierung,Konfigurierung)
SignalconverteramplifierpH,pO ,
2Temp.,stirrer,
weight (volume), air flow
pH RIC
Temperature, RIC
pO RI2
stirrer RIC
ADC Fermenter
Process control systemVisualisation
weight RIC
DAC
Signalconverteramplifierweight (volume),conductivity, pH
ADC Peripherie
Exhaust gas analysis
O2 CO
2
Interface
Substrate-feedtank
weight RIC
weight RIC
Pump
base
Pump
Measurement signalsControl
Media stream
Säure
Cooling water
Hot watersteam
weight RICweight RIC
weight RIC
weight RIC
weight RIC
Airflowcontroller
Outflowwater
air-filter
Air in
anti-foam
sensor
antifoam RIC
R...recordI....indicateC..control
Feed IC
ADC Analog to Digital Converter
DAC Digital to Analog Converter
Conductivity RIpH RIC
MONITORING and CONTROL Signal-Flow and Media stream
Process control needs in different fermentation strategies
• Batch cultivation:
Monitoring of state variables (pH, pO2, temperature, rpm...)
• Fed batch cultivation -
growth control by exponential substrate feed
Monitoring of state variables(pH, pO2, temperature,rpm...)
Substrate feed to maintainconstant growth rate
Process control needs in different fermentation strategies
• Continuous cultivation: Monitoring of state variables (pH, pO2, temperature, rpm...)
Feed and volume control (dilution rate D)
• STATE VARIABLES (MONITORING)
• on line: pH, pO2, temperature, rpm, biomass etc.
• off line (biomass, product, residual substrate, etc.)
• CONTROL VARIABLES: feed rate (exponential feed), temperature, rpm etc.
• QUALITY VARIABLES:• rates (qP, OUR, CER, RQ) (material balancing)• amount and physiological activity of biomass• key metabolites
Zuordnung der wichtigsten Prozessgrössen in derFermentation
Stellgrössen
Zustands-grössen
ZielgrössenDrehzahl
Säure/Lauge
Induktor
Precursor
Zuluftmenge
Heiz/Kühlmittel
Dosagen
Substrat
Produktion Biomasse
RespirationsquotientO2/CO2
Leistungsaufnahme
Wachstumsrate
Verbrauch Substrat
Produkt/-bildungsrate
Ausbeute
Pro
tein
, RN
A, D
NA)
pH Subs
trat
Visk
ositä
tDru
ck
O 2-A
bgas
CO2-A
bgas
Prod
uktk
onz.
Biom
asse
pO2
Met
abol
ite
Tem
pera
tur
Begriffsdefinitionen für Sensoren und Geräte in derProzessanalytik
on-line - off-line
on-line: Messgrössen können unmittelbar erfasst werden, z.B. pH Messung im Bioreaktor
off-line: Probe entnommen und in externem Gerät analysiert Probenaufbereitung, Verzögerung, z.B. Restsubstrat mittels HPLC
in-situ - ex-situ
in-situ: Sensor im Bioreaktor
ex-situ: Probe zur Analyse in externes Gerät transferiert
Wunsch: on-line, in-situ
Messung physikalischer Größen:
Temperatur:Arrhenius Gleichung - Temperatur beeinflußt direkt dieReaktionskinetik.
k = GeschwindigkeitskonstanteT = Temperatur in oKR = GaskonstanteA = KonstanteE = Konstante für Aktivierungsenergie
Meßprinzip: Messung des elektrischen Widerstandes (z.B. Pt100)
Gewichtsmessung:Auf Grund des Zweiphasensystems (Gas-Flüssigkeit) und der sichändernden Dichte ist die Gewichtsmessung der Volumsmessungvorzuziehen. Zugabe bestimmter Nährstoffkomponenten auch überGewichtsmessung.
Meßprinzip: piezoresistiver Effekt - der Widerstand bestimmterMaterialien ändert sich mit dem Druck - „Dehnungsmessstreifen -Gewichtsmessdosen“.
dR/R = Wiederstandsänderungρ= spez. elektr. Widerst.l = LängeF = Querschnitt
Hottinger Baldwin
Durchflußmessung
Thermische Massenflußmessung
Durchflußmeßsystem beruhend aufCoriolis Effekt:Einer entlang einer rotierenden Kugel nachaußen bewegter Körper beschreibt eine ent-gegen der Rotationsrichtung gekrümmte Bahn= Corioliskraft, bzw. -beschleunigung
Das im Sensor strömende Medium verändert durch die daraufeinwirkenden Coriolis Kräfte das Schwingungsverhalten. Verdrehungdes Sensorrohres ist proportional zum Massefluß und zur Dichte desMediums, Genauigkeit liegt bei 0,1%.
Bestimmung chemischer ParameterIonenselektive Elektroden
pH-Messung: Sterilisierbare pH Elektroden druckbeauf-schlagbar oder mit Gelelektrolyt befüllt (verhindernEindringen von Nährlösung während der Sterilisation)
Weitere ionenselektiveElektroden für Na, K, NH4,meist aber nicht sterilisierbar
pO2-Messung (Clark Elektrode)Der Gelöst-O2 gibt Aufschluß über denfür die Zelle verfügbaren SauerstoffAmperometrische Messung:Aktivitätsmessung beruht auf Strom-messungElektrochemische Vorgänge: Kathodeund Anode durch Elektrolyten elek-trisch leitend verbunden,Polarisationsspannung (600 - 750 mV)Sauerstoff an der Kathode reduziert
Reaktion an der Kathode:
O2 + 2H2O + 4e- 4 OH-
Reaktion an der Anode:
4Ag + 4OH- 4Ag2O + H2O + 4e-
Diffusionsgrenzstrom (ID) vom O2-Partialdruck und Löslichkeitdes O2 in der Membran, nicht aber von der Löslichkeit in derMeßlösung (Konzentration), abhängig.Treibende Kraft für die Diffusion ist das Partialdruckgefälle
k = KonstanteDm = Diffusionskonstante des Gases d. gasperm. Membrana = Löslichkeit des Gases in gaspermeabler MembranA = Oberfläche der Arbeitselektroded = Dicke der gasperm. Membrana.Dm = P = PermeabilitätpGas = Partialdruck des elektroaktiven Gasesn= Anzahl der übertragenen ElektronenF = Faraday Konstante
Abgasanalyse
Kenntnis der Abgaszusammensetzung (O2/CO2) zur Erstellungvon Massenbilanzen über Wachstum und/oder Produktbildung
Substrat + O2 Biomasse + (Produkt) + CO2 + H2O + Wärme
• Ermittlung der Biomasse durch Komponentenbilan- zierung• Rückschlüsse auf Stoffwechsel, z.B. Crabtree Effekt• Berechnung des spezifischen O2 Bedarfs für Reaktorauslegung
Abgasanalyse O2-Analysatoren
Bestimmung des Sauerstoffs aufgrund para- und thermomagnetischer Eigenschaften
Para- und Diamagnetismus:
• bahnmagnetisches Moment: Bewegungen der Elektronen im Raum um den Atomkern
• kernmagnetisches Moment: Rotation um die eigene Achse
• spinmagnetisches Moment:Rotation der ProtonenMagnetische Moment eines Moleküls oder Ions ist Vektorsummeder Teilmomente• Diamagnetische Stoffe: resultierendes Moment von null, richten sich quer zu den Kraftlinien aus, schwächen Intensität des Feldes ab• Paramagnetische Stoffe: magnetisches Moment verschieden von null, orientieren sich in Richtung des Feldes, verstärken es da- durch.
2
Abgasanalyse O2-AnalysatorenSauerstoff stark paramagnetisch, Stickstoffdioxid, Stickoxid undChloroxid schwach paramagnetisch, fast alle Gase schwachdiamagnetisch
1 Vergleichsgas Eingang2 Drosseln3 Vergleichsgaskanäle4 Mikroströmungsfühler für Meß- und Störsignal5 Meßgang Eingang6 Meßkammer7 Paramagnetischer Meßeffekt8 Elektromagnet mit wechselnder Flußstärke9 Meßgas- und Vergleichsgas-Ausgang10 Mikroströmungsfühler
Paramagnetischer SauerstoffanalysatorSauerstoff aufgrund paramagnetischer Eigen-schaften in Meßkammer stärker gebunden
Druckanstieg, über Mikroströmungsfühler (4)erfasst
5
6
7 8
2
1
3
3
9
10
4
Abgasanalyse O2-Analysatoren Ringkammeranordnung
Zur Messung des O2-Gehaltesnutzt man, dass paramagne-tische Eigenschaften mitzunehmender Temperaturverlorengehen
Suszeptibilität (= Empfänglich-keit) ist indirekt proportional T2
1 Strahlungsquelle2 optischer Filter3 Strahlungsteiler4 Antrieb Blendenrad5 Blendenrad6 Meßküvette7 Vergleichsküvette, gefüllt mit N2 (nicht infrarot aktives Gas)8 Empfängerkammer rechts9 Empfängerkammer, links10 Mikroströmungsfilter
CO2 AnalysatorInfrarotspektrometrische Messung: Kohlenstoffhältige Gase zeigen imInfrarotbereich Absorption, dadurch nimmt das Gas Energie auf wird inWärme umgewandelt und in beiden Empfängerkammern (8 und 9)entstehen unterschiedliche Drücke, Druckausgleich über Mikro-strömungsfühler erfaßt.
Massenspektrometrie: zur AbgasanalyseMoleküle im Hochvakuum mit Elektronen beschossen, dadurch ionisiertund in der Folge in elektrischen und magnetischen Feldern nachMassenzahl (m/e m= Massezahl, e= Ladung) getrennt.
Quadrupol MS: 4 Stabelektroden, an denen Gleich- oder Wechsel-spannung anliegt, zu analysierenden Substanzen im Mittelpunkteingeschossen
Probleme bei der Abgasanalyse:
CO2, N2 und O2 liefert folgende Bruchstücke:
CO2 44, 28, 16, 12 Matrix aufbauen aus
N2 28, 14 mehreren Eichgasen
O2 32,16
Messung biologischer Größen
• Methoden zur Erfassung der Biomasse
• Substrate, physiologisch wichtige Metaboliten oder Endprodukte des Stoffwechsels
Bestimmung der Biomasse• Wichtigste Messgrösse in der Bioprozeßtechnik• Kenntnis der physiologischen Aktivität meist wichtiger als die Dichte der Biomasse
Methoden: Indirekte Methoden:
Material- und Energiebilanzen, Massenerhaltung, Stöchiometriebiochemischer Reaktionen oder Materialbilanz ausgewählterSchlüsselkomponenten, wie z.B. Atmung, Wärmeproduktionoder O2-Verbrauch, CO2-Bildung u.a.
• Elektrochemische Methoden
• Impedanzmessung (Wechselstromwiderstand) Zellsuspension einem sinusförmigen Wechselfeld ausgesetzt
• Kapazitätsmessung und spezifische Leitfähigkeit (Wirkleit- wert)
Monitoring of viable biomass(Aber instruments, http://www.aber-instruments.co.uk)• Intact plasma membranes of cells act as tiny capacitors under the influence of an electric field• The non-conducting nature of the plasma membrane allows a build up of charge• Resulting capacitance can be measured; cell type specific and directly proportional to the concentration of viable cells
System is responsive to viable cells andinsensitive to cells with leakymembranes, gas bubbles and celldebris.(Range 0,1 - 200 gBDM/l)
Bestimmung der Biomasse Optische Sensoren:
Nephelometrie und spektralfluorometrischen Methoden
Nephelometrie: Streulicht, Lichtstreuung in biologischen Probendurch suspendierte Zellen, Feststoffpartikel und Gasblasen,beschrieben mit Lambert Beer'schen Gesetz:
I= Intensität des LichtesIo= Intensität des Ausgangslichtesk= Extinktionskoeffizientl= Dicke der Küvettec= Konzentration
log Io/I gleich der optischen Dichte (OD)lineares Verhalten nur im Biomassebereich unter 1 g/l (= OD 0,5)- keine online Messung; z.B. bei OD = 5 nur 1/100000 deseingestreuten Lichtes vom Detektor empfangenVerbesserung durch Wechsellichtsensoren: zwei Infrarot Diodenabwechselnd ein- und ausgeschaltet,Aquasant Sonde: erfaßt reflektiertes Licht
Fluoreszenzmessungmulti-wave FluoreszenzIn-situ Fluoreszenzmessung bis bis zu120 Anregungs- und Emissionsspektrenerfassbar
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 20 40 60 80 100 120 140Meßpunkte
RFU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
BTS
(g/l)
BTS (g/l) Tryptophan Pyridoxin/Pyridoxamin NAD(P)HNAD(P)H NAD(P)H Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMNPyridoxin/Pyridoxamin Riboflavin/FAD/FMN Pyridoxin/Pyridoxamin Pyridoxin/PyridoxaminRiboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMN Riboflavin/FAD/FMNStreulicht 590 nm
Off-lineLaser flow Cyto-metrie (FACS,Cell Sorter)
Biosensoren:Prinzipieller AufbauMeßanordnung in der ein biologisches oder biochemischesSelektivitätselement (= Signalgeber) mit einem Transducer(=Signalwandler) verknüpft ist
Biologische Komponenten:Mikroorganismen, Zellen,Organellen, Enzyme, Anti-körperund Nukleinsäuren
Biochemische Reaktion erzeugt einelektronisch erfassbares undkonvertierbares Signal.
Denkbare Primärsignale: Temperatur, Konzentration, Redox,Fluoreszenz, Absorptionsverhalten und ImpedanzBiosensoren sind nicht in situ sterilisierbar Messung außerhalb desBioreaktors, meist in Fließinjektionssystemen (FIA)
Immobilisierungstechniken für biologische Komponente
• Einschluß der Biomoleküle im gelösten Zustand hinter einerinerten Membran (wird heute praktisch nicht mehr angewendet)
• Adsorption an einer Oberfläche mittels physikalischerWechselwirkungen
• Vernetzen mit bifunktionellen Agenzien
• Einschluß in einer Polymermatrix
• Kovalentes Binden an eine funktionelle Trägermatrix
Häufig ist mit der Immobilisierung ein Aktivitätsverlust verbunden.
Beispiel für einen Enzymsensor: Glukosesensor
Enzym: Glukoseoxidase (GOD)Flavoprotein, oxidiert Glucose zu Gluconolacton, aus demGluconsäure entsteht, Coenzym FAD wird zu FADH reduziert.
Durch molekularen O2 wird das Enzym reoxidiert und es entstehtH2O2, das durch anodische Oxidation bei 0.5- 0,7 V ampero-metrisch bestimmt werden kann:
H2O2 + O2 + 2H+ + 2e-
Reaktionsablauf
Möglichkeiten zur Erfassung der Glukose:
• Bestimmung der Glukonsäure: Problem Pufferkapazität der Probe
• Messung der Abnahme des pO2 - konstanter pO2 notwendig
• Amperometrische Bestimmung des H2O2: Oxidation von H2O2 an einer Pt- oder Graphitelektrode (700mV gegen Ag/AgCl in 0,1m KCl, pH 5,6) liefert Strom proportional zur Glukose- konzentration. Differentialmessung mit zwei Elektroden, eine davon mit inaktiviertem Enzym, zur Vermeidung von Interferenzen mit anderen oxidierbaren SubstanzenQuerempfindlichkeiten mit leicht oxidierbaren Substanzen, wie Ascorbinäure
Aufbau eines Glucosesensors in DünnschichttechnikEnzym ist in einer Polymermatrix immobilisiert
Redoxmediatoren (Ferrocenderivate) als künstliche Elektronenakzeptoren(Ersatz für molekularen Sauerstoff) ermöglichen geringeres Arbeitspoten-tial (220 mV gegen Ag/AgCl) zur Senkung der Querempfindlichkeiten.Reduzierter Mediator an Elektrode reoxidiert und resultierender Stromzwischen Enzymelektrode und Gegenelektrode gemessen.
Key issues for signal generation
• Transfer of substrate (analyte) to electrode surface (diffusion through membrane)
• Enzymatic conversion
• Measurement of current
• potentiometric (measurement of potential between working and reference electrode)
• amperometric (current generated by oxidation or reduction of substrates is related to concentration, conversion of analytes during measurement)
Meßanordnung für Biosensoren
Fließinjektionsanalysensysteme zur automatisierten Prozeß-kontrolle von Fermentationen (Prozeßmonitoring)
Flow Injection Analysis (FIA)
Aseptic Sampling Device (cell free)Rotating membrane
Combination of valves(whole broth)
Crossflow-filtration(cell free)
Aseptic Sampling devices
Automation of FIA System
Software structure for systems control and data processing
Data display of process monitoring system
Glu
kose
konz
entra
tion
[g/l]
bzw
. OD
0
10
20
30
40
50
06:00 08:24 10:48 13:12 15:36 18:00 20:24 22:48 01:12
0
2
4
6
8
10
12
Troc
kens
ubst
anz
[g/l]
Glukose [g/l]
OD
TS [g/l]
Application of Persep membrane sampling system coupled to Biosensor/FIA-System , monitoring E.coli K12-Fermentation in the range of 5-50g/l Glukose)
Monitoring of glucose concentration in E. coli fermentation
0 2 4 6 8 10 12 14 1610
15
20
25
30
35
40
Verw
eilz
eit
Verweilzeit
Peak Nr.
10
20
30
40
50
Brei
te b
. Hal
ber H
oehe
Halbwertsbreite
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0.055
0.060
Hoehe/ Flaeche
Höhe/Fläche
0
1
2
3
4
Tailingfaktor
TailingFaktor
Automated analysis of FIA data
• Produktanalytik - Menge und Qualität (Aktivität), Reinheitchromatographisch, immunchemisch, Elektrophorese,Glykosylierung, etc.
• Physiologische Aktivität der Zellen
• Restsubstratanalytik, NebenprodukteLaktat, NH3 in tier. Zellkultur, EtOH, Acetat in mikrobiellenFermentationen, u.a.
• Plasmidkopienzahl, %-Satz Plasmidträger, Keimzahl(cfu), etc
Inprozesskontrolle -Anforderungen von QM!
Neben den „quasi on-line“ erfassten Messgrössen, wird eine Reihevon off-line Analysen durchgeführt
State and novel trends in Bioprocess Monitoring
Availability of sophisticated biochemical proceduresproviding analysis on molecular level (DNA chips,2-D- electrophoresis, etc)
Key issues:• increase quality of information on metabolic level• deeper understanding of metabolic regulatory networks
Principle of microarrays:
Isolation of mRNA species Reverse Transcriptionusing fluorescence marked nucleotides Hybridisation
Powerful tool to screen shifts in transcription
Backlogs:• complexity of analytical procedures and assays• too low sampling frequency
Fusion of sophisticated analytical techniques with conti-nuously emerging computing facilities
i.e. exploitation of on-line data through correlation to
key variables of metabolism using mathematical modellingand simulation techniques (e.g. neural network simulations)
Hierarchical organisation of metabolic regulatory networksunit control level analytes relevance to process
controlstimulon global regulatory
networks and stressresponse
signal mole-cules, such as,ppGpp, cAMP
high
modulon co-ordination ofmetabolic subunits
activity of keyenzymes potential
operon control of single en-zymes and enzymeclusters
low
Approach to selection of significant data
Acquisition of complex data by
Solution:mathematical modelling e.g. application of neural networks
Artificial Neural Network• Information-processing systems inspired by interconnected, parallel structure of the mammalian brain
• ANNs are collections of mathematical models• properties of biological nervous systems• implementation of analogies of adaptive biological learning (training)
dentrites
cell
axon
Application of artificial neural networks
Definition
Neural network is a system composed of many simple processingelements operating in parallel (=neurons)
Neural network including connections
(between neurons)compare
Input Output
Target
Adjustweights
Training
Application of artificial neural networks
Key elements of ANNs - „neurons“
Highly interconnected processing elements analogous to neuronsare tied together with weighted connections analogous tosynapses.
Signals are trans-ferred to neurons,which are activatedwhen a threshold isexceeded.
“Knowledge“ isacquired by learningfrom data and isstored in connectionweights as distri-buted memory
Application of artificial neural networks
A neuron is a nonlinear static processing unit with several inputsand a single output.
Input signals are modifiedby multiplication with acorresponding constant
Wij to produce a totalinput signal, activated ordeactivated by activationfunction (sigmoid,hyperbolic tangens, etc.).
Application of artificial neural networks
I1
I2
I3 X=ΣWjIj
Neural network based modelling of Pasmid Copy Number(PCN) of recombinant E. coli during fed batchfermentation using on-line data (O2, CO2, KOHconsumption, OD etc.)
0
20
40
60
80
100
120
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Laufzeit (h)
PCN
PCN NN10 Modell
Start Feed Induktion
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
1
2
3
4 pO2 Biomass MF1 MF2 MF6 MF7 MF8 Tgs3 IR
Sens
or R
espo
nse
Time [h]
0
1
2
3
4
Biom
ass x
[g/l]
0
100
200
300
400
pO2 [
%]
Escherichia coli batch Fermentation
Data from Carl-Fredrik Mandenius, Univ. Linköping, S-Sence, 1999
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Estimated values for X Reference values for X Reference values for µ Estimated values for µ
Biom
ass x
[g/l]
Time [h]
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Spec
ific g
rowt
h ra
te µ
[h-1]
ANN prediction of environmental variables in E. coli
Data from Carl-Fredrik Mandenius, Univ. Linköping, S-Sence, 1999
Information in the technical area
“from data to information”
• Process control (“Prozeßleittechnik”) is the fusion of classic control technique with information technology aided monitoring and auto- mation.• Process control changed from mainly signal dominated man- machine interaction to information based man-process communi- cation.• Modern process control enables networking and precise co- ordination of individual parts of the process
PROZESSLEITUNGMaximale Effizienz biotechnologischer Prozesse durch weit-gehende Nutzung des Potentials mikrobieller oder höherer Zellen.
Dazu muß die chemische und physikalische Umgebung der Zellenkontinuierlich analysiert und kontrolliert werden.
Dazu benötigt man neben den Sensoren, Systeme mit denenkomplexe Vorgänge
• überwacht (monitoring)
• kontrolliert und (control)
• dokumentiert werden können
Prozeßleitsysteme (Prozeßrechner) (process control)
Begriffsdefinitionen Prozeßleitung - Leiten - Steuern- Regeln
Leiten (DIN 19922/1)Die Gesamtheit aller Maßnahmen, um bei Einhaltungfestgelegter Konventionen und Ziele den gewünschten Ablaufeines Prozesses zu garantieren. Dabei steht im Vordergrund dieKoordination von Daten und Signalflüssen zwischen Betreiberund Prozeß mit den Funktionen durchführen, schützen undoptimieren
Prozeßrechner, Prozeßleitsystem notwendig
Steuern (DIN 19226)
Regeln (DIN 19226)
Steuerung (DIN 19226)Vorgang bei dem eine od. mehrere Größen (Eingangsgrößen)andere Größen (Ausgangsgrößen) aufgrund der imSteuersystem festgelegten Gesetzmäßigkeiten (Algorithmus)beeinflussen
Übertragung eines Sollwertes (=Führungsgrösse) aufdenProzess zur Herstellung einer Ausgangsgrösse (Regelgrösse)
Keine Rückkoppelung Abweichungen möglich
STEUEREINRICHTUNG(Eingeben, Messen, Ver-
arbeiten, Stellen)
STEUERSTRECKEProzeß
FÜHRUNGS-GRÖSSE
STELLGRÖSSE AUSGANGS-GRÖSSE
Regelung (DIN 19226)Nachteil der Steuerung: keine automatische Reaktion aufStörungen Einführung einer Rückkoppelung zwischenSystemausgang und Systemeingang geschlossenerRegelkreis (loop)
STEUERSTRECKEProzeß
FÜHRUNGS-GRÖSSE
REGEL -GRÖSSE
STELLGRÖSSE
Rückkoppelung (feed back)
STEUEREINRICHTUNG REGLER
(Eingeben, Messen, Vergleichen, Stellen)
Vergleich Sollwert/Istwert
Regler ist das Grundelement für dieAutomatiserung der Prozeßführung
Historische Entwicklung regeltechnischer Geräte
1939 PID Regler1969 Programmierbare Regler1962 DDC (Direct Digital Control)1964 Integrierte Schaltkreise1977 Prozeßleitsysteme
Vorteil: Prozeß läuft beiAusfall eines Kreisesweiter
Nachteil: Vernetzung undVerknüpfung der Meßwertesehr beschränkt
Klassische Regelung und Steuerung einer Fermentation
Einschleifige Regel- und Steuerkreise mit manuellerSollwertvorgabe für Temperatur, pH, pO2, Drehzahl etc.
Entwicklung Computergestütze Prozeßleitung
• Einzelne Reglereinheiten programmierbare Regler =‘Speicherprogrammierbare Steuerungen’
• Messwerterfassung mit Hilfe eines Computers(Analog/Digital-Wandlung) Sollwertvorgabe durchComputer (Set point Control SPC)
• Ansteuerung der einzelen Geräte (Aktoren) direkt vomRechner (direct digital control DDC)
Arten von Signalen
• Analoge Eingangssignale (0)4-20mA; 0-1; 0-10 V (z.B.Meßwerte)
• Analoge Ausgangssignale (0)4-20mA; 0-1; 0-10 V (z.B.Steuersignale für drehzahlgesteuerte Motoren (Rührer,Pumpen))
• Digitale Ein- und Ausgangssignale +/- 5 V (z.B. Ventileauf/zu, Pumpen aus/ein)
Signale einzelner Sensoren• verstärkt,• von Analog- in Digitalwerte gewandelt Interface, AnalogDigitalConverter -ADC• auf Plausibilität geprüft• gefiltert• in ‘engineering units’ umgerechnet• in einzelnen Regelkreisen (Soll-Istwert-Vergleich) weiter verarbeitet.
Signalaufbereitung
Verfahren zur Wandlung von Analogwerten:
Vergleichsverfahren: Digitalwert wird mit Hilfe eines Generatorsso lange verändert bis Ausgangssignal des ADC dem Analog-signal entspricht.
Sägezahnverfahren: Spannung so lange erhöht bis die an einemDifferenzverstärker liegende Spannung des Meßsignals erreichtwird, Impulse werden gezählt.
Gütekriterium eines ADC ist die Auflösung (resolution):= jener Wert um den sich die Eingangsspannung ändern muß,damit die niederwertigste Stelle des Datenwortes (LSB = leastsignificant bit) verändert wird.
Wandlung von Analogwerten
Auflösung gängiger ADCs: 8 bit 1/256 (1/28)10 bit 1/1096 (1/210)12 bit 1/4096 (1/212)FSR = Endwert (Full Scale Range),
n = Anzahl der Datenbits
Set point controlRegelung einer Fermentation mit SollwertvorgabeManuelle Sollwerteinstellung durch Prozessrechner ausgeschaltet - override signal)
Direct digital Control DDC (digitale Vielfachregelung)Einzelne Aktoren (Ventile, Pumpen, etc.) direkt vom Rechner angesteuert,Reglerstrategien softwaremäßig realisiert.
Vorteile: Vernetzung einzelner Parameter, modellgestützte ProzeßführungNachteile: bei Ausfall des Rechners wird der Prozeß instabil
Anforderungen an Hardware und Betriebssystemvon Prozessleitsystemen
• Multitasking - zeitlich parallelle Verarbeitungmehrerer logischer Aufgaben (tasks)Quasi - Parallelverabeitung, d.h. Betriebs-system muss Aufgaben nach Priorität aufteilen
• Echtzeitfähigkeit - Meßwerte müssen demSystem unmittelbar zur Verfügung stehen undauch verarbeitet werden
Leistungsfähigkeit der Hardware
• Einhaltung konstanter Zykluszeiten und Abtastratennotwendig
• Aufgaben nicht mit geforderten Geschwindigkeitabgearbeitet und Regelung nicht gewährleistet
• Analyse der Einzelprozesse nach zeitkritischenAnsprüchen für den Entwurf von Prozeßleitstruk-turen notwendig
Hierarchisch organisiertes Prozeßleitsystem
• Realisierung der zeitkritischen Anforderungen durch zusätzlicheHardwarekomponenten und Auslagerung von Teilprozessen
• Jedem Fermenter eigene Prozessrechenstation zugeordnet– anfallende Daten unmittelbar verarbeitet und umgesetzt
• an nächsthöhere Ebene nur mehr reduzierte Daten weitergegeben
• Vorteile:– ausfallsicher durch verteilte Hardware– kritische Komponenten werden redundant ausgeführt und kontrollieren sich
gegenseitig z.B. Bus und CPU Karte).• Nachteile:
– höhere Kosten
Anstehende Aufgaben herkömmlich nicht realisierbar
Off-line Verarbeitung derDaten, graphische Dar-stellung, Speicherung,Auswertung
On-line Verarbeitunglangsam ändernderInformation, Eingabe off-line Daten, Modeller-stellung
Steuerung und Regelungschnell ändernderProzesse (ms Bereich)
Prozessebene, Feldebene
Hierarchie der Prozessleitung bei zeitkritischen Prozessen
Grundstruktur des am IAM in Betrieb stehenden hierarchischaufgebauten Prozessleitsystems (Honeywell TDC 3000)
Hauptelemente:HM History ModuleAM Application ModuleHG Hiway GatewayLCN Local Control Net-workUS Universal StationDH Data HiwayPR Printer
AIN Analog InputAOT Analog OutputDOT Digital Output DIN Digital Input
AMC Advanced Multi-function ControllerUWS Universal Work-station IPC Industrial Program-mable Controller
Input/Output SignalsUnit V1/SF V2 V3 V4 V5 V6 F1 F2 F3 F4 M1 U1 P1 P2 P3 TotalpH 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 18pO2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 17Temperature 3 1 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 21Pressure 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 1 1 1 23Conductivity 1 1 1 1 1 1 6Turbidity IR 1 1 1 3Magn. Stirrer 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14Mass-flow 1 6 6 6 4 2 2 27Pumps 1 1 5 5 5 3 2 2 24Diff. Pressure 1 1 1 1 1 1 1 7Niveau Sensor 1 1 1 3Top Drive 1 1 1 3
Analog Input 15 7 7 7 3 3 15 22 22 8 10 10 5 5 5 144Analog Output 1 2 2 1 10 11 11 4 4 4 1 5 1 57Digital Input 5 5 5 5 2 2 7 10 10 4 7 7 4 4 4 81Digital Output 69 46 50 49 17 17 76 76 76 21 49 48 29 29 35 687
Input/Output Signals Analog in/out, Digital in/out
Feldbussysteme• Im IAM Prozeßleitsystem zentrale Verabeitung der Signale
und Transfer zu Aktoren– hohe Leitungskosten und Störanfälligkeit (Induktivität,
Ohm’scher Widerstand etc.• Neues Konzept - Feldbussysteme
– konsequente Realisierung der hierarchischen Anordnung– Systeme sicherer, flexibler, ausbaufähiger und kostengünstiger
zu gestalten und– Signale vor Ort verarbeitet, Kommunikation untereinander nur
mehr digital– Entwicklung völlig neuartiger Sensoren (smart sensors) und
Aktoren• Analog/Digitalwandlung integriert, besitzen „eigene Intelligenz“,• Sensoren: Kalibrierdaten, Serviceintervalle• Aktoren empfangen Digitalwerte und wandeln sie vor Ort
Smart Sensor
Aktoren
Smart Aktor
digitale Steuersignale
Prozessleitsysteme in Qualitätsmanagement-Systemen
• Produktsicherheit ist wesentliches Kriterium bei der Herstellungvon (bio)-pharmazeutischen Produkten (Biologica)
• Qualitätssicherung ist notwendige Maßnahme zur Erhaltung derProduktsicherheit
• Verfahrensschritte müssen detailliert ausgearbeitet unddokumentiert sein,
• Richtlinien in „Good Manufacturing Practice (GMP)“ festgelegt.GMP ist ein Managementkonzept, enthält Maßnahmen nach demStand der Technik zur
– Sicherung der Produktqualität und des Personals einesbestimmten Hestellungsprozesses
– GMP Richtlinien verlangen Validierung der jeweiligen Verfahren, bzw.der einzelnen Schritte
Beinhaltet: dokumentierte Hygieneprogramme, Kontrollen dertechnischen Ausrüstung, geplante Inprozeßkontrollen,Überwachung des Reinheitsstatus von Räumen, Maßnahmen zurArbeitssicherheit, Einhaltung bestimmter Unit Operations, etc.
Richtlinien in übergreifenden Industrienormen (ISO 9000, 9001,9002, 9003), in Normen für den Betrieb von Qualitätskontroll-labors: EN 45001, 45002, 45003, in Kriterien für Laborzertifi-zierung EN 45011, 45012, 45013, 45014, in Guidelines der FDA
„Good Manufacturing Practice (GMP)“ Richtlinien
Definition Validierung• US Food and Drug Administration (FDA) (http://www.fda.gov/)
Guidelines on General Principles of Process Validation „...establishingdocumented evidence, which provides a high degree of assurances thata specific process will consistently produce a product meeting it’spredefined specifications and quality attributes“.
• Definition der EU: „...action of proving in accordance with the principlesof Good Manufacturing Practice, that any procedure, process,equipment, material, activity or system leads to the expected result“
• Österreich: Arzneimittelgesetzhttp://www.bmgf.gv.at/cms/site/attachments/9/9/4/CH0008/CMS1066209564174/infoblatt_einreichung_par_63_amg.pdf
• Früher wurde nur Prozeß (Verfahren) validiert, heute: geänderteSichtweise, auch von der FDA
• Einzelheiten der Verfahrensschritte und begeitende Maßnahmen (z.B.Analytik)
• niedergeschrieben in SOP’s (Standard Operation Procedures)(= Pflichtenheft) Datenblätter mit Beschreibung der Methode,verwendete Geräten, Materialien, etc.
Beispiele Kritische Punkte für Validierung:– Spezifikation der Geräte
– Bezugshinweise
– Standardsubstanzen (zugelassene Standards gemäß StraßburgerAbkommen),
– Untersuchungsmethoden,
– Nachuntersuchungsfristen u.a.m.– Analytik– Methode– Analytisches Arbeitsblatt– Probenspezifikation– Entwicklung der Methode– Validierungsaufzeichnung (Linearität, versch. Konzentrationsbereiche)– u.a.m.
Klassische Vorgangsweise Produktfreigabe• Abfassung von Protokollen (Analysen, Herstellung, Rohstoffe,
etc.)• Chargenfreigabeprotokoll• Rückstellmuster• Freigabeentscheid durch Leiter der Qualitätssicherung
Heute: Qualitätssicherung soll möglichst automatisiert ablaufenGründe:• Produktion und Analytik weitgehend automatisiert, computer-
gestützt• gestiegene Anforderungen an Qualitätssicherung (rekombi-
nante Produkte)• GMP = „hidden Plant“ (Produkt = Documents) - bis zu 70% der
Herstellungskosten Suche nach Einsparungsmöglichkeiten
Notwendigkeit der Validierung von computerisierten Produktionsanlagen
Validierung von computerisierten Produktionsanlagen• Trendwende der FDA in der Anerkennung elektronisch
gestützter Prozeßführung und Dokumentation• Software ist „Device“und daher inspektionsfähig durch FDA• Freigabeprotokolle aufgrund einer „elektronischen Unter-
schrift“ generiert• Daher Validierung von Prozeßleitsystemen notwendig
Gemäß Empfehlung der PMA (Pharmaceutical ManufacturingAssociation): Zerlegung von computerisierten Produktions-anlagen in funktionelle Einheiten
Validierung von computerisierten Produktionsanlagen
Jedes Modul einzelnvalidieren, vor Vali-dierung der Gesamt-anlage
Auch „operatingenvironment“ (off-lineAnalytik) in Validie-rung einbeziehen
Validierung von Computersysstemen = dynamischer Prozeß nach dem ‘lifecycle approach’ durchgeführt
„functional testing of hardware and software based on the specifiedperformance“,
life cycle eines neuen Systems beginnt mit• Identifikation der user requirements• Design• Integration• Qualifikation• Validierung• Maintenace• endet mit Außerbetriebnahme
Wer muß validieren: Alle Betriebe, die nach GMP arbeiten; Herstellung,Verarbeitung, Verpackung oder Haltung von Human- und Veterinär-Therapeutika oder Herstellung, Verpackung, Lagerung oder Installation vonmedizinischen GerätenVerantwortlichkeit für Durchführung der Validierung der Computersysteme:Betreiber der Anlage, bzw. End user
Validierung von computerisierten Produktionsanlagen
Allgemeine FDA Anforderungen für die Validerung von Computersystemen– Betriebssicherheit– Sicherheit gegen unbefugte oder unbeabsichtigte Eingaben– Ausreichende Dokumentation– Kontrollen integriert, dass im automatisierten Herstellungsprozeß Produkt
nach festgelegten Qualitätsstandards produziert wirdWesentliche Punkte für die Validierung von Computern• System-Definition (funktionelle Anforderungen an Soft- und Hardware)• Software Entwicklung durch qualifiziertes Personal nach
festgeschriebenen SOP’s– System Software– Konfigurierbare Software– Userspezifische Software
Validierung von computerisierten Produktionsanlagen
Validation Master Plan (Vergabe von Verantwortlichkeiten)
• Installation qualification:– establishing confidence, that process equipment and ancillary
systems are capable of consistency operating within establishedlimits and tolerances
• Operation qualification– establishing confidence, that the process is effective and reproducible
• Product qualification:– establishing confidence, through appropriate testing, that the finished
product produced by a specified process meets all releaserequirements for functionality and safety
Systempflege (maintenance) und Vorgangsweise bei Änderungen,Identifizierung von Ereignissen, die validierten Status verändern könnten,Maßnahmen zu deren Verhinderung
Ablauf eines Validierungsprojektes:
• Angaben über:– Systemverantwortlichkeit– Gebäude, Raum– Computersystem: z.B. PLS Einsatz in folg. Produktionsbereichen– Systembeschreibung: Software/Hardware Gesamtsystem,
Funktionen, Umfang, Abgrenzung zu anderen Bereichen undSchnittstellen
– Prozeß (MSR), analoge/digitale Aus- und Eingänge– Energieversorgung, Stromlaufpläne
• Beschreibung der Hardware– Beschreibung HW Ebenen, ev. vorhandene Hierarchien (Leitebene,
Feldebene),– Hardware Dokumentation (IQ, OQ, PQ, SOPs)– Leitebene: z.B. Leitrechner, Prozeßrechner, Bedienterminal,
Alarmdrucker, Protokolldrucker,Modemalarm, Scanner, Barcodereader etc.
Ablauf eines Validierungsprojektes (Fortsetzung)
• Feldebene: angesteuerte Aktoren, Schnittstellen– Datenübertragung: Physik. Einheit (z.B. Bussegment, Ethernet)– Ausführung: z.B. Kabelart, Länge, Übertragungsgeschwindigkeit,
Anzahl der Module– Übertragungsprotokoll (z.B. TCP/IP), Zugriffsverfahren,
Übertragungssicherheit
• Software– Betriebssystem: SW Leitrechner, Prozeßrechner, LAN, etc.– Konfigurierte SW, Kundenspezifische SW– Anforderungen an die Dokumentation der SW (SOP)
• Betreibermanuals, Struktogramme,• Programme (IQ, OQ, PQ, SOPs)
– SW muß auditierbar sein– Funktionen des Computersystems (verwendete SW an einzelnen
Einheiten)– Archivierung der Daten, z.B. Chargenprotokolle, Alarmprotokolle– Bilanzierungen, Statistikfunktionen, Meßdaten, Protokolleingänge,
Re-Evaluierung der Anlage
• Logistik:– Ablaufüberwachung, Freigabe, Quarantäne, Kontrollfunktion über
Abläufe, Steuerungs- und Regelfunktionen, Beschreibung desSignalflusses, Regelalgorithmen
• Beschreibung Rezepturbetrieb– Rezept = verfahrenstechnische Operation, alle Schritte zur
Produktion einer Charge, sequentiell abgearbeitet
• Prozeßbedienung– Prozeßbeobachtung, Visualisierung, Auflistung der Darstellungs-
möglichkeiten, z.B. Anlagenübersicht, Trends, Meß- undRegelkreise, Rezepturen, Alarmierung, Dokumentation
• Mengengerüst des Computersystems• Anzahl der Signale an einzelnen Prozeßeinheiten
Ablauf eines Validierungsprojektes (Fortsetzung)