KIT – Universität des Landes Baden-Württemberg undnationales Forschungszentrum in der Helmholtz-Gemeinschaft
KIT Sicherheitsmanagement, Abt. Zentrale Beauftragte und Technische Beratung, Genehmigungen
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Euthanasie, Anästhesie und Analgesie
Literaturübersicht für Laborfische
Almut Köhler, Ph.D.
SUM1 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Gründe für das Töten von Fischen
Vermeidung von Schmerzen, Leiden, Schäden
Nahrungsgewinnung
Artenschutz/Ökologie
Gewinnung von Blut, Gewebe für Versuche
Ausmerzung aus Zuchtgründen
Versuchsende
SUM2 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Tod ohne Anzeichen von Panik, Schmerz, Leid
minimale Zeit bis zum Eintritt der Bewusstlosigkeit
verlässlich, reproduzierbar
einfache, wartungsfreie Apparatur
sicher für Durchführenden
keine Kontamination der Umwelt
geringe emotionale Effekte auf Durchführenden
Kriterien für das humane Töten von Fischen
SUM3 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Methoden der Euthanasie
Physikalisch Pistolenschuss Bolzenschuss zervikale Dislokation Dekapitation Mikrowelle Elektroschlag Betäubungsschlag mit Ausbluten
Chemisch Injektion
Barbiturate, (Cloralhydrat, Ethanol, Ketamin, MgSO4, KCl, neuromuskuläre Blocker)
Inhalation/ImmersionMS-222, Eugenol, Benzocain, (Halothan, Isofluran, Enfluran, Chloroform, NO, CO2, CO, Argon, HCN, Methoxyfluran)
SUM4 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Euthanasie/Anästhesie bei Fischen
sehr große Tiergruppe (> 30000 Arten; Säuger 5500 Arten) sehr heterogene Tiergruppe (ca. 500 Familien; Säuger: ca. 130 Familien) andere Physiologie andere Sinnesorgane keine Mimik keine Laute
SUM5 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Anzeichen für Bewusstlosigkeit / Tod bei Fischen
Bewusstlosigkeit:
Verlust des Stellreflexes Verlust des VOR
Tod:
Stillstand Operkulum Verlust des Herzschlages EEG (Kestin et al., 1991; Lambooij et al., 2002 ; Robb et al.; 2000b Van de Vis et al., 2003)
Rigor mortis Livor mortis
SUM6 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Rechtliche Grundlagen
TierSchVersV 2013 (identisch mit Annex 4 der Direktive EU 2010/63)
Zugelassene Tötungsmethoden im Rahmen von Tierversuchen:
Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den Kopf
Elektrische Betäubung (Zusatz: geeignete Anlagen / Geräte erforderlich)
Überdosis eines Betäubungsmittels (unter vorheriger Sedierung, wenn nicht unangemessen)
Andere Methoden, wenn das Tier zuvor wahrnehmungs- und empfindungslos ist und auch bleibt bis zum Eintritt des Todes
Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn wissenschaftlich nachgewiesen werden, kann, dass die Methode nicht zu mehr Schmerzen, Leiden oder Schäden führt.
Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn es experimentelle Gründe gibt und die Methode ethisch vertretbar und unerlässlich ist.
SUM7 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den Kopf
Training nötig ästhetisch schwierig Kombination mit anderen Methoden
European Food Safety Authority- AHAW/04-027
SUM8 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den Kopf
SUM9 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
AVMA-Guide 2013; Lines et al., 2003, 2004, 2005
Elektro-Euthanasie
Tod durch Kammerflimmern, Herzstillstand zerebrale Hypoxie epileptische Anfälle mit tonisch-klonischen Krämpfen gefährlich für Anwender unästhetisch
SUM10 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Immersionsbäder
direkter Übergang von Sedation und Narkose in den Tod
Substanz wird meist vornehmlich über die Kiemen aufgenommen, zirkuliert im Blut und wird unverändert oder nach Abbau über Kiemen, Niere, Haut wieder ausgeschieden
einfach anzuwenden, schnell, relativ billig
Probleme:
Metaboliten können sich im Wasser anreichern.
Notatmung einiger Fischarten kann den Effekt reduzieren.
Chemikalien können für Umwelt oder Anwender giftig sein.
Stress vs. Exzitationsphase
SUM11 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Anästhesie und Stress
Das gilt für jede Form der Anästhesie!
Anästhesie bedeutet Stress für den Fisch: Atemdepression reduzierter Gasaustausch Hypoxie respiratorische Azidose (CO2 Akkumulation) Anstieg von Adrenalin und Cortisol
SUM12 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Auswahlkriterien für eine gute Narkose
Anästhesie in weniger als 3 min, Wiedererwachen in weniger als 5 min!
Keine toxischen Nebenwirkungen für Fisch bzw. Anwender Keine langanhaltenden Auswirkungen auf Physiologie,
Immunsystem oder Verhalten Effizienz abhängig von Spezies, Größe, Dichte im Tank,
Wasserqualität Vortests mit kleiner Fischzahl! (Dosis, Wirkzeit) Anästhesie-Überwachung
Es gibt keinen Standard für alle Spezies und alle Zwecke!
SUM13 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Narkose bei Fischen - Hinweise
Schleimschicht nicht verletzen, Fisch feucht halten Fütterung aussetzen (spezies-abhängig!) immer Fischwasser verwenden (inkl. Temperatur) Sauerstoffzufuhr sicherstellen
SUM14 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Narkose-StadienStadium Beschreibung Symptome0 normal Aktives Schwimmen, Reaktion auf externe Reize, normales Gleichgewicht,
normaler Muskeltonus
I.1 Leichte Sedation Leichter Reaktionsverlust auf Reize (visuell, Berührung); normale Atemfrequenz, normales Gleichgewicht; normaler Muskeltonus; freiwilliges Schwimmen
I.2 Tiefe Sedation Verlangsamung; Einstellung freiwilliges Schwimmen; unkontrollierte Bewegungen, Verlust Reaktionsfähigkeit (visuell, Berührung) ; leichte Abnahme der Atemfreq.; Gleichgewicht normal, Muskeltonus leicht reduziert; Reaktion auf Positionsreize
II.1 Leichte Narkose Exitationsphase ggf. vor Anstieg der Atemfrequenz, Verlust der Körperspannung; Reaktion auf Positionsreize
II.2 Tiefe Narkose (Toleranzstadium)
Ausfall der Positionsantwort; Abnahme der Atemfrequenz wieder auf Normalmaß, Verlust des Gleichgewichts; Muskeltonus vermindert; leichte Reaktion auf starke Reize (Berührung, Vibration); äußere Probennahme; Flossenbiopsien; Kiemenbiopsien
III.1 Leichte Anästhesie völliger Verlust des Muskeltonus; Reaktion auf starken Druck; weiterer Abfall der Atemfrequenz; kleinere chirurgische Manipulationen
III.2 ChirurgischesStadium
Völliger Verlust von Reaktivität und Nozizeption; komplette Muskelrelaxation; langsame Atmung und Herzfrequenz; völliger Verlust der Reizantwort; (→ Druck auf Schwanzansatz); Chirurgische Eingriffe
IV MedullärerKollaps
Totaler Verlust des Muskeltonus, Reaktion auf starken Druck, weiterer Abfall der Atemfrequenz; irreversibel
SUM15 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
(AVMA-Guide 2013 ; Matthews und Varga, 2012, Rombough, 2007)
MS-222 (Tricain)
am weitesten verbreitet
Pulver, in gelöster Form sauer, daher puffern
Wirkungsweise:
blockiert die Na+- (und K+)-Kanäle in NervenzellmembranenAusbleiben von Aktionspotentialen; Muskelrelaxation, Lokalanästhesie, Signalunterbrechung Peripherie – Gehirn
Blockade der Kiemenventilation Hypoxie
Blockade der Herz-Kontraktion Herzstillstand
wirkt besser in warmem Wasser mit geringerer Härte
SUM16 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
MS-222
Probleme mit MS-222:
sehr unterschiedliche Konzentrationsangaben, was effektiv ist, Speziesunterschiede (Carter et al., 2011; Neiffer und Stamper 2009)
Indizien für Stress obwohl deutliche Anzeichen für Anästhesie (Carter et al., 2011; Matthews
und Varga, 2012)
aversiv (Readman et al., 2013; Wong et al., 2014)
dauert teilweise bis 3 h, dass Herzschlag aufhört (Veterinary Office, University of California,
Riverside)
werden teilweise wieder wach (4/23 Fischen) (Wilson et al., 2009)
retinotoxisch (Carter et al., 2011, Neiffer und Stamper 2009)
Steigerung von Hämatopoese-Faktoren mRNA (stärker als bei Benzocain, CO2, ZD) (Bowen et al., 2011)
SUM17 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
MS-222
Dosierung von MS-222 im Zebrabärbling:
Sedierung: 0.01 mg/ml (Trevarrow, 2007, 2011)
Anästhesie: 0.168 mg/ml (Westerfield, 2007)
Euthanasie: 0.2 - 0.3 mg/ml (Wilson et al., 2009)
SUM18 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Benzocain
sehr ähnlich zu MS-222
schlecht löslich, daher letale Dosis schwer zu erreichen (AFMA, 2013)
nicht sauer, weniger empfindlich gegenüber Wasserhärte (Neiffer und Stamper, 2009)
schlechtere Sicherheitsspanne bei höheren Temperaturen (Gilderhus, 1989)
nach 15 min letal (Gilderhus, 1989)
Bewusstlosigkeit setzt teilweise erst sehr spät ein (Zahl et al, 2009)
aktiviert Hämatopoese-Faktoren nicht so sehr wie MS-222 (Bowen et al., 2011)
unterdrückt signifikant zelluläre und humorale Immunantwort (Bressler und Ron 2004)
SUM19 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Eugenol / Nelkenöl
bekannt aus der Zahnmedizin als Lokalanästhetikum, riecht gut
blockiert wahrscheinlich auch Na+-Kanäle (AFMA, 2013)
in USA nicht zur Euthanasie zugelassen (AFMA, 2013)
schnellere Bewusstlosigkeit als mit MS-222, als Narkose aber längere Erholung (AFMA, 2013)
vermutlich karzinogen (AFMA 2013), beeinflusst Hormonsynthese (Cytochrom P450) (Jayashree und Subramanyam, 1999); lebertoxisch?(Matthews und Varga, 2012)
Stressantwort weniger gesenkt (Goldelritze) (Palić et al., 2006)
löst sich schlecht in kaltem Wasser (Neiffer und Stamper, 2009)
kein analgetischer Effekt nachgewiesen (Sladky et al., 2001)
Dosierung von Eugenol im Zebrabärbling: Sedierung: 2 - 5 mg/l (Grush & Noakes, 2004)
Anästhesie: 60 - 100 mg/ml (Grush & Noakes, 2004)
SUM20 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Benzocain, Eugenol / Nelkenöl
MS-222 Benzocaine Nelkenöl / EugenolLöslichkeit gut schlecht schlecht in kaltem
WasserAzidität, Pufferung nötig + (+) -
Wasserhärte sensitiv nicht sensitiv ?
Wirkung bei höherenTemperaturen
gut reduziert ?
Bewusstseinsverlust (verglichen mit MS-222)
sehr spät schneller
Nachteile aversivTod nicht zuverlässigretinotoxischverändert TranskriptionZeichen von Stress
während der Anästhesie
letal nach 15 minstarker Einfluss auf die
zelluläre und humorale Immunantwort
kein Nachweis für einen analgetischen Effekt
kaum Verminderung der Stressantwort
karzinogenlebertoxischhemmt
Hormonsynthese (Cytochrome P450)
AVMA –Guide 2013; EMEA;2001; Matthews und Varga; Meinertz et al., 1999; Neiffer und Stamper, 2009; Sladky et al., 2001
SUM21 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Probleme mit Embryonen / Larven
1-2 dpf (Embryo): keine Kiemen-Atmung reagieren nur schlecht auf MS-222 o.ä.
5-6 dpf (Larven): nicht empfindlich Larven werden dann zunehmend empfindlich gegenüber MS-222
reagieren auch auf letale Dosen nicht gut, bes. < 1 h brauchen teilw. 10-20fach höhere Dosen (RBF) für LD50
kein Herzschlag ≠ tot 14 dpf: Herz schlug auf auch nach > 30 min (teilweise -75 min) noch wenn 20 min nach Ende des Herzschlags zurückgesetzt: 100% wieder erholt!
(Matthews und Varga, 2012; Rombough, 2007; Strykowski und Schech, 2015)
SUM22 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung:
- zu langsam
- verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)
- stressig
- Eiskristallbildung ist schmerzhaft
- vielleicht nur immobilisiert
- keine anästhetische Wirkung
Quelle: American Veterinary Medical Association (2001) und Zitate davon
aber: in Ausgabe von 2013 ist es zugelassen
SUM23 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung: - zu langsam, verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)
Todeseintritt meist nach 10-20 s (oft schneller)
AVMA-Guide 2013; Wilson et al., 2009; Shine et al., 2015
SUM24 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung:
- zu langsam
- stressig
Shine et al., 2015
Literatur: Plasma-Cortisol steigt; gestörte Plasma-Osmolarität, pH-Wert im Muskel gesenkt
Lachse, hohe Dichte, 1°C, 1 h
Vergleich mit Benzocain (Süßwasser-Hering): weniger Muskelreaktionen, schnellerer Gleichgewichtsverlust; Operkulum-Bewegung endet schneller, keine Anzeichen von Stress, abhängig von Körpergröße (linear) [Blessing et al., 2010)
(Donaldson, 1981; Rorvik et al., 2001; Skjervold et al., 2001)
SUM25 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung:
- zu langsam
- stressig
- Eiskristallbildung ist schmerzhaft
MS-222 Eisbad
Gefrierschrank
Wilson et al., 2009
Fische haben keine Kälte-sensitiven Nozizeptoren (RBF, Ashley et al. 2006, 2007).
SUM26 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung:
- zu langsam
- stressig
- Eiskristallbildung ist schmerzhaft
- vielleicht nur immobilisiert
Keine Erholung nach Todeszeichen + 10 min (MS-222 4/23)(Wilson et al., 2009)
SUM27 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
oft nicht akzeptiert als Methode
Ablehnung:
- zu langsam
- stressig
- Eiskristallbildung ist schmerzhaft
- vielleicht nur immobilisiert
- keine anästhetische Wirkung
Nervenleitfähigkeit nimmt bei Kälte ab (Analgesie, Anästhesie?)(Wilson et al., 2009)
SUM28 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Hypothermie / „rapid chilling“
mit physikalischer Methode kombinieren (Mazeration o.ä.)
entscheidend: Körpergröße, Leitfähigkeit des Gewebes, große Körperoberfläche im Verhältnis zur Größe
Temperatur: 2-4° C; letale Temperatur des Fisches muss > 4°C sein
anwendbar bei kleinen tropischen-subtropischen Fischen
Adulte + 10 min nach scheinbarem Tod, 4-7 Tage: + 20 min
Nicht anwenden < 3 dpf: keine Effekt; teilw. > 14 h behandelt und trotzdem überlebt, sehr Hypoxie-resistent Bleichlösung o.ä.
nicht Einfrieren bei Bewusstsein, nicht langsam abkühlen
nicht gut: moderate Kühlung zusammen mit Anästhetikum, weil das Anästhetikum dann langsamer wirkt und die Tiere weniger O2 benötigen
Euthanasie dauert oft länger (Matthews und Varga, 2012)
SUM29 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Zusammenfassung Euthanasie / Anästhesie
chemisch physikalisch
MS-222 Benzocain Eugenol Bleich-Lösung Eisbadadult
++ / +++ + / ++ - / + - / - +++ / -Larve
+ / ++ + / ++ ? / ? - / - ++ / -Embryo
- / - - / - - / - +++ / - - / -
SUM30 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Anästhesie und Analgesie beim Fisch im Labor
Anästhesie Analgesie
Empfindungslosigkeit
(ggf. zusammen mit Narkose = reversibler Zustand der Bewusstlosigkeit)
Schmerzausschaltung
Unterdrückung des Schmerzempfindens ohne Auswirkung auf Bewusstsein,
Sinneswahrnehmung oder andere primäre ZNS-Funktionen
≠
SUM31 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Analgesie bei Fischen
Rezeptorenproteine der Nozizeptoren sind nachgewiesen; Funktionsweise unklar
Schmerz wird auf absteigenden Bahnen moduliert, Efferenzen bisher nicht beschrieben; viele Analgetika (u.a. Opioide) setzen an diesen Synapsen an
keine Opioidrezeptoren im RM nachgewiesen, an diesen bindet Morphin beim Säuger als Analgetikum
Modulatoren-Funktion (s. Aspirin auf Prostglandine): nichts bekannt
Opioide bisher nur als Hungerregulatoren oder Funktion bei Entzündung, Hormonsynthese, Verhalten etc. untersucht, nicht wirklich als Analgetika
Pharmakodynamik Morphin: -, keine dosisabhängigen Informationen vorhanden
Ehernsink (1982) hat Morphin am optischen Tektum appliziert: Reaktion auf Elektroschock beim Goldfisch vermindert; Naloxon als Antagonist wirksam
SUM32 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Analgesie bei Fischen
Morphin: Dosisangaben schwanken zwischen 10 und 3000 mg/kg (Säuger: 2-5 mg/kg)
Studie von Sneddon: 0,3 g / 1 ml i.m. (0,1 ml/ 10 g) = 3000 mg/kg; angeblich Rechenfehler (nie offiziell): 300 mg/kg (LD50 Maus: 200 mg/kg)
keinerlei Nebenwirkungen (?) andere Wirkung oder Pathways?
5
5
5
2
0,2
0,06
300
0 50 100 150 200 250 300 350
Maus
Ratte
Kaninchen
Hund
Pferd
Elephant
Regenbogenforelle (Sneddon)
Morphin mg/kg i.m.
SUM33 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
Analgesie bei Fischen
Gabe ins Wasser: sehr langsame Wirkung, große Mengen nötig; andere Applikationen: zusätzlicher Stress
Eliminations-Halbwertszeit sehr spezies-abhängig
Verteilung im Fisch: 10x langsamer als bei Säugern (Temperatur) SneddonsDosis noch höher (32 Tage statt 4-6 h)
Morphin wirkt anziehend (Sucht?)
manche Analgetika sind tödlich im Fisch (Sidnophen, Analgin)
Einsatz und Nutzen von Analgetika bei Laborfischen sehr unklar; analgetisches Potential von MS-222, Benzocain
SUM34 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM35 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
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SUM36 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
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