HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 1
Universität RegensburgLS für Organische ChemieProf. B. König
AbteilungInstrumentelle Analytik
Einführendes Praktikum in die HPLC
WS 2018/19
Dr. R. Vasold
CH 32.1.04
Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1
Inhalt
I Theoretischer Teil
I.1 Einleitung ............................................................. 4
I.2 Zielsetzung .......................................................... 4
I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase) .......................... 5
I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen ................................ 7
I.4 Die mobile Phase (Eluent) .................................. 7
I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen ........ 7
I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen .................................... 9
I.4.2.1 Die Isokratische-Elution ........................................... 10 I.4.2.2 Die Gradienten-Elution ............................................ 10
I.5 Die Pumpen ....................................................... 11
I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem ........................... 11
I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme ........................................ 11
I.6 Die Injektionseinheit ......................................... 12
I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) .............. 12
I.6.2 Die manuelle Injektion ..................................................... 12
I.7 Der Detektor ....................................................... 13
I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 16
I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 17
I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers ...................................... 17
I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil................... 19
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II Experimenteller Teil
II.1 Einleitung ........................................................... 20
II.2 Durchführung ..................................................... 21
II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ......................... 21
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen ......................... 21 II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung ................ 21 II.2.1.2 Vorbereitung der Probenlösungen ......................... 22 II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen ................................. 23
II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung ................................. 23 II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens ........ 24 II.2.2.3 Die Detektor-Programmierung................................. 24 II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten ....... 25 II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter .............. 25 II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers .................. 26 II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ......................... 26 II.2.3 Die quantitative Auswertung ........................................... 27
II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data-Analysis ................................ 27 II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ............................ 27 II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes ............... 28
I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................ 29
III Auswertung Theoretischer Teil ........ 30
IV Auswertung Experimenteller Teil ..... 31
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Einführendes Praktikum in die HPLC
I Theoretischer Teil
I.1 Einleitung
Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine leis-
tungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatographi-
schen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anorgani-
schen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbindungen, die man in
Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein chromatographisches
Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen trennen und anschließend
qualitativ oder quantitativ bestimmen kann.
Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwen-
dung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems,
sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die Ei-
genschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsystem
abschätzen können, man muss Misserfolge bei der Trennung erklären können
und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz erwerben.
I.2 Zielsetzung
Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung
in die HPLC zu geben.
In diesem Praktikum sollen u.a.
die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems
kennen gelernt werden, wie
- die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h. re-
versed phase-Phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule.
- die mobile Phase mit Eluentenversorgung,
- Pumpen und Einspritzventil (Autosampler),
- der Detektor,
- die Steuerungs- und Auswertesoftware;
die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt wer-
den;
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 5
wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durch-
bruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsge-
schwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.
die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen
Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.
Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems
näher beschrieben.
I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase)
RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von
denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP-
Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselgelo-
berfläche (normal-Phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Reste (z.B.
C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) unpolar ge-
macht worden (sog. „endcapping“). Über die chemischen Einzelheiten der Her-
stellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über die Ei-
genschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakterisie-
rung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Herstel-
ler informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine Reihe
von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller Trennun-
gen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wiederverwend-
barkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen Einstel-
lung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöhten Re-
produzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor allem beim
Gradientenbetrieb sehr wichtig.
Durch fast vollständiges „endcapping“ sind weniger Wechselwirkungen mit noch freien Silanolgruppen (SiOH) möglich. Folge: „scharfe Peakform“
Abb. 1.3.a Schematische Darstellung eines relativ gut “endgecappten“ C18-Materials.
Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Si
NCH
3
CH3
N
Cl
C18-Ketten
Si H O
Si H O
Si
H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si H O
Si
Probensubstanz Beispiel einer Probensubstanz
Silicagel
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Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma Pheno-
menex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend „hydrophobem
Schild“ auf der Kieselgelbasis).
Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen Sila-
nolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Hersteller
unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. Wegen der
schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser Restanteil
den diesen nicht vollständig „endgecappten" RP-Phasen gewisse „Ionenaus-
tauscheigenschaften“.
Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Geladene
Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert ihren La-
dungszustand ändern, z.B. saure Substanzen (z.B. Phenole) und besonders
basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen "nicht
vollständig endgecappten“ RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum Tai-
ling. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein, dass
man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es heute
viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen speziellen
RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit kürzeren
organischen Resten (z.B. C12) möglichst vollständig modifiziert.
Verbindung interagiert mit noch „freien Silanolgruppen“ Folge: „Bandenverbreiterung“ und „Peaktailing“
Abb. 1.3.b Schematische Darstellung eines relativ schlecht „endgecappten“
C18-Materials.
Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden
wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end-
gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig frei
ist von Schwermetallverunreinigungen (z.B. Merck: Purospher).
Si Si Si Si Si Si Si Si Si
Si
N C H 3 C H 3
N
Cl
C18-Ketten
Si H
O
Si H
O
Si
H
O
Si H
O
Si HO
Si
H
O
Si H
O
Si H
O
Si H
O
Si H
O
Si
H O
Si
H O
Si H
O
Si H
O
Si H
O
Si
H
O
H
OH
O
H
OH
O
Silicagel
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 7
I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen
Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen
sind:
1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irre-
versibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub,
Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent.
Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des
Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns
(=Vorsäulen); Säulenspülung mit geeignetem Eluenten.
2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer pH-Werte.
Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten"
3. Falsche Säulenaufbewahrung.
Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen !) und der Gefahr des Auskristallisie-
rens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in
Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung
von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril
gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich
eine Mischung aus 20% H2O und 80% Acetonitril.
I.4 Die mobile Phase (Eluent)
I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen
In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem
unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fäl-
len (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen Men-
gen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder „Stärke“ der verschiedenen Eluenten
wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert festgehal-
ten. Als Symbol dafür verwendet man E0 oder ε0. Die so gefundene Reihenfolge
von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man die Eluo-
trope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität geord-
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net sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) stärkerer Eluent ist immer
polarer, ein schwächerer unpolar:
Eluent Polarität [E0] UV-Grenze
[nm]
NP
-Chr
omat
ogra
phie
* n-Hexan 0,00 190
Toluol 0,29 285
Chloroform 0,40 245
Dichlormethan 0,42 230
Aceton 0,56 330
Essigsäureethylester 0,58 260
RP
-Chr
omat
ogra
phie
* Dimethylsulfoxid 0,62 270
Diethylamin 0,63 275
Acetonitril 0,65 190
Ethanol 0,88 210
Methanol 0,95 205
Wasser >1,11 <190 * im angegebenen Chromatographiemodus (RP/NP) häufig, aber nicht aus-
schließlich verwendet. Wichtige Voraussetzung ist die Mischbarkeit der Eluenten
Tab. 1.4.1 Eluotrope Reihe (Auszug) (Lit.: Meyer V.R. „Praxis der
Hochleistungsflüssigchromatographie“ Salle+Sauerländer
7, S. 110ff). Die angegebenen E0-Werte gelten streng ge-
nommen für Aluminiumoxid als Adsorbens, doch sind sie
für Silicagel nur um einen konstanten Faktor verschieden:
E0 (SiO2) = 0,77 E0 (Al2O3). Die Lösungsmittelreihenfolge
ändert sich also nicht, wenn man von Aluminiumoxid auf
Silicagel übergeht. In der linken Spalte ist angegeben, bei
welcher Chromatographieart die Eluenten häufiger Ver-
wendung finden.
In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase
in der Mehrzahl der Fälle aus einem überwiegend polaren Eluenten.
Stark polare Eluenten, (z.B. Wasser) verzögern die Elution. Beimengungen von
dazu schwächer polaren Eluenten (z.B. MeOH, Acetonitril) beschleunigen sie.
Bei Standardtrennungen ist meist Acetonitril im Vergleich zu Methanol die bes-
sere Wahl (warum ?). Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein (Milli-
pore-Qualität) und darf insbesondere keine organischen Verunreinigungen ent-
halten (deshalb niemals Wasser verwenden, das lediglich mit Ionenaustau-
schern entionisiert wurde).
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Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase
enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig ent-
gast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch: Va-
kuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in
Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium
mischbar sind, ab).
Ganz wichtig ist auch, dass die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei
von Partikeln (z.B. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr
feinen Einlassfritten (2 m) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die
Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder
der Gebrauch von Einlassfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist
bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es
muss sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wäs-
serige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Nie-
mals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach
Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pum-
pen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im
Laufe der Zeit auskristallisieren!
I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen
Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem
Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < < 0,95). Dies ent-
spricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen
H2O im Verlauf der Trennung.
Anmerkung:
Man muss sich leider damit abfinden, dass in fast allen HPLC-Büchern und Ar-
beitsanweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben
unter Verwendung der definierten Gehaltsgröße σ "Volumenanteil", sondern oft
nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.B. oft: "Methanol/Wasser
50:50" oder "50% Wasser in Methanol" etc. Man kann dann aber davon ausge-
hen, dass damit der Volumenanteil gemeint ist, weil dies der gängigen Arbeits-
weise entspricht.
Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwischen zwei
Arbeitsweisen: Der isokratischen Elution und der sog. Gradientenelution.
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I.4.2.1 Die Isokratische-Elution
D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-
nung nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis vorgemischt und ent-
gast und können dann von z.B. nur einer Pumpe gefördert werden.
- Vorteil: es wird nur eine Pumpe benötigt;
- Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennprob-
lemen oder in der Erprobungsphase eines neuen Eluenten-
systems muss der Vorratsbehälter der mobilen Pase häufig
gewechselt werden. Erfahrung oder langwierige Erprobun-
gen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches Eluenten-
gemisch zu optimieren (Zeitaufwendig !!).
I.4.2.2 Die Gradienten-Elution
D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-
nung! Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus
zwei, von ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw.
vier Bestandteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zu-
sammensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden.
Auf diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, kon-
kav, stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausrei-
chend.
- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennprob-
lemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von
Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen;
- Nachteil: es werden oft mehrere Pumpen (Hochdruckgradient) bzw.
komplexere Pumpensysteme benötigt. Erfahrungen im
Gradientendesign sind nötig. So muss man z.B. wissen,
dass Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung von Gradien-
ten nicht optimal sind, weil die Mischungsreaktion stark
exotherm ist, sowie eine Volumenverminderung und eine
Viskositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt. Gemische
aus Acetonitril und Wasser sind in dieser Hinsicht viel un-
problematischer.
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 11
Einlaßventil
Auslaßventil
Kolben
Hydraulik-Flüssigkeit
Membran
Kolben
I.5 Die Pumpen
I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem
Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der
Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wich-
tigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien ge-
nannt:
Es muss eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit ge-
währleistet werden.
Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und
damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig.
Es muss ein möglichst pulsationsfreier Fluss gewährleistet werden, weil
sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die
stationäre Phase schädigen können.
Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt,
dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung
durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmten Wert
hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon, würde der
Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen
der stationären Phase (< 3 m) auch viel zu hoch werden.
I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme
Abb. 1.5.2.a Kolbenpumpe Abb. 1.5.2.b Diaphragmapumpe
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I.6 Die Injektionseinheit
I.6.1 Der automatische Probengeber (Auto-sampler)
Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Pro-
bengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen
Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der
außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges.
I.6.2 Die manuelle Injektion
Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, emp-
findliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Ver-
bindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten
Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die
technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise muss man sich in
geeigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines Au-
tosamplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen
sein, seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beach-
tung genannt:
Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen.
Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden.
Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe
dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet
werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt wer-
den.
Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-Stellung,
der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es
sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpackung
schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des gesamten
Systems auslöst.
Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen wer-
den, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 13
I.7 Der Detektor
Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Es gibt eine Vielzahl
von Detektionsverfahren. Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder
sichtbarer Strahlung beruhen, haben einen großen Einsatzbereich. Viele orga-
nische und anorganische Moleküle (Aromaten, Carbonylverbindungen, etc.)
absorbieren im mittleren UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen
Absorptionskoeffizienten (Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht aus-
reicht, kann man auch in das kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann
allerdings ist eine etwaige Eigenabsorption der Eluenten zu berücksichtigen.
Abb. 1.7.a: Schematische Darstellung eines einfachen UV/VIS-Detektors (z.B.
sog. VWD- oder MWD-Detektor) mit einstellbaren Einzel-
Wellenlängen (nicht kontinuierlich).
Anstelle eines einfachen UV/VIS-Detektors (Abb. 1.7.a), bei dem man meist nur
eine bestimmte Wellenlänge auswählen kann, ist es besser, ein spezielles,
computerunterstütztes Spektrophotometer, den Photodioden-Array-Detektor
(DAD) mit sog. „inverser Optik“ zu verwenden (siehe Abb. 1.7.b). Die Be-
zeichnung „inverse Optik“ bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, son-
dern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch
die Flusszelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale
Lichtfächer fällt dann auf ein Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen
(100 - 1000) lichtempfindlichen Photodioden. Diese Dioden werden kontinuier-
lich in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) elektronisch ausgelesen und daraus eine
Vielzahl von UV-Spektrum generiert. Der DAD-Detektor ist somit in der Lage,
während einer chromatographischen Trennung die kompletten UV-Spektren
aller Peaks zu registrieren und abzuspeichern. Dies ist besonders wichtig zur
Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-Purity-Check) und zur Ermitt-
lung optimaler Detektionswellenlängen bei der Untersuchung unbekannter Pro-
ben.
Spalt
Deuteriumlampe
Gitter
Flußzelle
PhotozelleLampe (UV/VIS)
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Deuteriumlampe
Gitter
Spalt Photodioden
Flußzelle
Abb. 1.7.b: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors
(DAD-Detektor)
Weitere häufig eingesetzte HPLC Detektoren sind: HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität
UV/VIS bzw. DAD (Dioden-Array-Det.)
selektiv für UV/VIS-aktive Analyte (ca. 190-950 nm)
ca. 0,3 ng/mL ca. 1 x 104
RI (Refractive-Index-Det.) Analyte mit unterschiedlichem Brechungsindex zum Eluenten (temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, wenig empfindlich)
ca. 0,7 g/mL ca. 3 x 103
FLD (Fluorescence-Det.)
selektiv nur für fluoreszierende Analyte
ca. 0,2 pg/mL (!) ca. 103 -
104 ECD (Electro-Chemical-Det.)
selektiv nur für oxidierbare bzw. reduzierbare Analyte
ca. 1,0 pg/mL (!) -
CD (Conductivity-Det.)
Ionen a) ca. 105
ELSD (Evaporative-Light Scattering-Det.)
speziell geignet für Substanzen, die im UV/VIS nicht absorbieren z.B. Zucker, Salze (Gradientenelution möglich)
- -
MSD (Mass-Selective-Det.) für alle im MS ionisierbaren Analyte
- -
a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen.
Tab. 1.7 Übersicht über häufig eingesetzte HPLC-Detektoren:
Lampe (UV/VIS)
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I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software
Bei modernen HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Pro-
benaufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem
Rechner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Dar-
stellung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach
Aufnahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Be-
arbeitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen
passenden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei
denen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt,
übernimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der
Chromatogramme (heute nicht mehr gebräuchlich).
Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration)
wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Vorausset-
zung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen
Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie
konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlap-
pende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der
Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die
Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um
Störpeaks zu beseitigen.
Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog. Peak-
verarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus den
Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wich-
tigsten Peakverarbeitungsparameter sind:
- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der
ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten
interessierenden Peaks.
- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest (Peakerken-
nungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn) bzw. ne-
gative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwankungen
der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur Peakerkennung
durch die Software.
Seite 16 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1
I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD)
In der HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen
Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Be-
dingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten erlau-
ben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei exakt
symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herangezogen
werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge der zu
analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der Kon-
zentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten abhän-
gig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Konzent-
ration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder
Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-
zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-
barer Korrekturfaktor verwendet werden.
I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers
Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchen-
den Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den
sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard
eingesetzt werden soll, muss aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfül-
len:
sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-
kommen.
sie muss chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kom-
ponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der
Säule und der verwendeten mobilen Phase.
sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.
sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften
(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestim-
mende Substanz verfügen.
sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den
chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in ver-
gleichbarer Konzentration zugesetzt werden.
Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den
genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine
Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in ähn-
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lichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, lässt sich für
jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr und
fi nach folgenden Zusammenhängen ermitteln:
fi = i
i
m
a
fi = Response-Faktor der
Komponente i
ai = Fläche der Substanz i
mi = Masse der Komponente i
KFi = i
Tr
f
f = K
iKTr
KTr
Ki
am
am
KFi = Kalibrierfaktor der
Komponente i
fTr = Response-Faktor
desTracers
miK = Masse der Komponente i in
der Kalibrierlösung (K)
mTrK = Masse des Tracers in der
Kalibrierlösung (K)
aTrK = Fläche des Tracers in der
Kalibrierlösung (K)
aiK = Fläche der Komponente i in
der Kalibrierlösung (K)
m xi = KFi
xTr
xi
a
amTr
m xi = Masse der Komponente i in
der Probenlösung (X)
m xTr = Masse des Tracers in der
Probenlösung (X)
a xi = Fläche der Komponente i
a xTr = Fläche des Tracers
Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und glei-
cher Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus der
Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach
Formel (3) ermitteln.
(1)
(2)
(3)
Seite 18 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1
I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil
1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Ad-
sorptionschromatographie unterschieden werden?
2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.
3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B.
stark basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten
RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele aufzeichnen )?
4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu
NP-Phasen aufweisen.
5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt,
und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?
6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?
7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Ein-
satz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung
unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?
8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“
und „quaternärer“ Gradient.
9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.
10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung.
11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?
12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer
aufweisen muss.
13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip
eines herkömmlichen UV/VIS-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläu-
tern sie in diesem Zusammenhang den Ausdruck: „Inverse Optik“.
14.) Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 19
II Experimenteller Teil
HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken (Kaffee und Energy-Drinks) mit der Methode des Internen Standards
II.1 Einleitung
Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psycho-
pharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Sub-
stanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen Krämpfe
auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen, die vor-
wiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.B. bei Coffein diureti-
sche, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Regel kei-
ne bleibenden organische Schädigungen.
Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7-
Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und Theo-
bromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle drei
genannten Xanthinderivate kommen in Teeblättern
vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und in der
Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in Teeblät-
tern ist Coffein gegenüber den beiden anderen Xan-
thinderivaten der Hauptbestandteil.
N
NN
N
O
O
CH3
CH3
CH3
Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentrati-
onen von 85 - 250 mg/L enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach speziel-
len Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentrati-
on (ca. 350 mg/L) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2-
Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthal-
ten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" ver-
helfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksam-
keit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 mL Energy Drink
hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der
übrigen Bestandteile eher spekulativ.
Coffein
Seite 20 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1
II.2 Durchführung
II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen
Coffein-Stammlösung (Lösung A):
10 mg Coffein (27600 Fluka ≥ 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen
(Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysen-
systeme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend
wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben
überführt und mit H2O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der
Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird
beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml] ! ).
Tracer-Stammlösung (Lösung B):
25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z
276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysensysteme
GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das
Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben über-
führt und mit Acetonitril (HPLC –Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt Ba-
ker, D-64347 Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Messkol-
ben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird beschriftet
(Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml] ! ).
II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung
Herstellung der Eichlösung C:
Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany) wer-
den je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen zu-
sammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze
vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel verschlos-
sen und 10 s geschüttelt und beschriftet.
Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze
(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels
einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x
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11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die
Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach
oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil
Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Mache-
rey-Nagel, D-52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig !
durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst.
Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet
(Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentratio-
nen angeben !
II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen
Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1):
Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung wer-
den mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen
überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es
wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration
analog Lösung C.
Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2):
700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden mit
700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein
Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen
und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung C.
Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3):
700µl (Transferpette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden
mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein
Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen
und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung (C).
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II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen
Säule:
Phenomenex Luna© C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm
Vorbereitung:
Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H2O
[Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC –Ultra-Gradient-Grade
9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D-64347 Griesheim, Germany] bestückt wurde,
wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditio-
niert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingun-
gen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence
mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) ver-
messen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenom-
men, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard über-
haupt verwendet werden kann.
II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung
A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein.
B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen).
C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte Gra-
dientenprogramm angeben 10% B → 95% B in 20 min.
B
C
A
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II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens
D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein.
II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung
E : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein.
F : Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.
D
E
F
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II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten
G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0°C ein.
II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter
H : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein.
I : Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.
G
H
I
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II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers
J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die
Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abge-
arbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ).
Unter „Inj/Location“ ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeu-
tet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll.
Tragen sie unter der Rubrik „Sample Info“ die jeweiligen Vialkon-
zentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein.
II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence
K : Starten sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die Analysense-
quence, nachdem sie die Proben in den Probenteller des Auto-
samplers gestellt haben.
J
K
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II.2.3 Die quantitative Auswertung
II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis
L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter
dem Menüpunkt „Data Analysis“. Hier können u.a. die Integrations-
parameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als
auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot
etc.) durchgeführt werden.
II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle
M : Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie
die „Calibration Table“. Geben sie unter der Rubrik „Compound“
für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein.
N : Geben sie in der der Spalte „Amt (=Amount !)“ die Vialkonzentrati-
on der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in der Spalte
ISTD mit „YES“. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode drucken
sie mit „Print“ die Tabelle aus und schließen mit „OK“ ab.
L
N M
HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 27
II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes (ISTD-Report)
O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben
(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme
der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes Chromato-
gramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen sie
den Menüpunkt „Specify Report“ aus. Im Fenster „Destination“
wählen sie „Printer“, im Fenster „Style“ wählen sie „Short“ aus.
Unter der Rubrik „Quantitative Results“ muss „ISTD“ aktiviert sein.
Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit dem
Kommando „Print Report“ kann danach jeweils der spezifische
quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie diesen
Report für jedes Chromatogramm aus.
O
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II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil
1.) Was versteht man unter der chromatographischen Durchbruchszeit tm.
2.) Welche apparativen Einflüsse (zusätzlich zur Säule) können in der HPLC zu
einer deutlichen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2
Beispiele)?
3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)
von Benzophenon
4.) Berechnen sie die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase um in
[cm/min] bei einer gegebenen Durchbruchszeit von tm = 1.33 min (Länge
der Säule = 150 mm).
5) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie
das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.
6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.
7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Er-
gebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.
8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an
Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originalgetränken (Kaffee-
Lösung / Red Bull / Coca-Cola).
9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz
Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-
sulfonsäure. Geben Sie die entsprechende chemische Formel an.
10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum
Coffein-Peak in etwa erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit).
Begründen sie ihre Aussage.
11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV/VIS-Detektor
einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsme-
thode für Taurin.
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III Auswertung Theoretischer Teil
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IV Auswertung Experimenteller Teil