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Einfluss einer mit synthetischem Peptid (P-15)
beschichteten Implantatoberfläche
auf die Osseointegration
in einem diabetischen Tiermodell
Der Medizinischen Fakultät / Dem Fachbereich Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgie
Der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.
vorgelegt von:
Hendrik ter Stal
aus Nordhorn
2
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät/ vom Fachbereich Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2014
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Gutachter: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel
Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich W. Neukam
4
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung …………………………............ 6
1. 1. Hintergrund und Ziele ………………………… 6
1. 2. Material und Methode ………………………… 6
1. 3. Ergebnisse …………………………………………. 6
1. 4. Schlussfolgerung …………………………………. 6
2. Abstract ………………………………………………….. 7
2. 1. Background and aims ………………………… 7
2. 2. Material and methods ………………………… 7
2. 3. Results …………………………………………. 7
2. 4. Conclusion …………………………………………. 7
3. Einleitung …………………………………………. 8
4. Ziel der Arbeit …………………………………………. 11
5. Material und Methode ………………………… 12
5. 1. Das Versuchstier …………………………………. 12
5.1.1. Die Wahl des Versuchstiers ………………… 12
5.1.2. Anzahl der Versuchstiere ………………… 12
5.1.3. Bildung der Versuchsgruppen ……….. 12
5.1.4. Induktion des Diabetes ………………… 12
5.2. Zeitlicher Ablauf mit graphischer Darstellung .. 13
5.3. Implantatsystem …………………………………. 15
5.3.1. Implantateigenschaften ………………… 15
5.3.2. Beschichtung …………………………………. 15
5.4. Art und Durchführung der Eingriffe ………………… 16
5.4.1. Zahnextraktion ………………………… 16
5.4.2. Implantation …………………………………. 16
5.4.3. Sektion …………………………………. 17
5.4.4. Entnahme und Aufbereitung der Prüfkörper .. 17
5.5. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner 18
5.6. Mikroradiographie ………………………………….. 19
5.7. Histomorphometrie ………………………………….. 22
5
5.8. Immunhistochemie ………………………………….. 24
5.8.1. Collagen Typ I ….…………………….. 24
5.8.2. Osteocalcin ………………………………….. 25
5.8.3. Ablauf der Immunhistochemie ………… 26
5.9. Statistik …………………………………………… 30
6. Ergebnisse …………………………………………… 31
6.1. Mikroradiographie ………………………………….. 32
6.1.1. Knochendichte …………………………. 32
6.2. Histomorphometrie ………………………………….. 33
6.2.1. Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) ………… 33
6.3. Immunhistochemie ………………………………….. 34
6.3.1. Collagen I-Expression ...………………. 34
6.3.2. Osteocalcin -Expression ………………… 35
6.4. Zusammenfassung der Ergebnisse ………………… 37
7. Diskussion ………………………………………….. 38
8. Literaturverzeichnis …………………………………. 44
9. Verzeichnis benutzter Abkürzungen ……….. 52
10. Anhang …………………………………………………. .. 53
10.1. Herstellung der Gebrauchslösungen ……….. 53
11. Lebenslauf …………………………………………….. 56
12. Danksagung ……………………………………………. 57
6
1. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziel
In der vorliegenden tierexperimentellen Studie wurden die Auswirkungen
einer mit synthetischem Peptid P-15 beschichteten Oberfläche auf die
Osseoinduktion und Osseointegration von Titanimplantaten in
diabetischen und nicht diabetischen Tieren untersucht. Das Ziel war ein
Vergleich der Ergebnisse mit einer Kontrollgruppe von Implantaten, deren
Oberflächen ausschließlich mit Säure und Korund behandelt wurden.
1.2. Material und Methode
Zur Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen wurde das Minipig
gewählt, da es sich in anderen tierexperimentellen Studien als
Versuchstier bewährt hat. 110 Implantate wurden in 2 Gruppen auf 22
Schweine aufgeteilt. Die Einbringung der Implantate erfolgte im Ober- und
Unterkiefer der Versuchstiere. Postoperativ fanden nach 1 Woche, 2
Wochen, 3 Monaten und 6 Monaten eine mikroradiographische,
histochemische und immunhistochemische Auswertung statt.
1.3. Ergebnisse
Es konnte kein signifikanter Unterschied bei den Parametern
Knochendichte und Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) zwischen den mit
Peptid P-15 beschichteten Implantaten und den unbeschichteten
Implantaten sowohl in der diabetischen als auch in der gesunden Gruppe
festgestellt werden.
1.4. Schlussfolgerung
Die gewonnenen Ergebnisse konnten keine Optimierung und
Verbesserung der Osseointegration bei den mit Peptid P-15 beschichteten
Implantaten gegenüber nicht beschichteten Implantaten aufzeigen.
7
2. Abstract
2.1. Background and aims
In this animal study, the effects were examined with a peptid P-15 coated
on the surface of titanium implants and osseointegration in diabetic and
healthy animals. The aim was to compare the results with a control group
of implants, whose surfaces were treated with acid and corundum.
2.2. Material and method
The transferability of results to humans, the minipig was chosen because it
has proven effective in other animal studies as an experimental animal.
110 implants were divided into 2 groups of 22 pigs. The insertion of the
implants occurred in the maxilla and mandible of test animals. After
surgery took place after 1 week, 2 weeks, 3 months and 6 months a micro-
radiographic, histochemical and immunohistochemical analysis.
2.3. Results
There was no significant difference in the parameters of bone density and
bone-implant contact (KIK) between the observed P-15 with peptid-coated
implants and uncoated implants in both the diabetic and the healthy group.
2.4. Conclusion
The results obtained were able to do not optimize and improve the
osteoinductive properties of peptid P-15 coated implants compared to
uncoated implants.
8
3. Einleitung
Die gegenwärtige Zahnmedizin befindet sich nach wie vor in einem
permanenten Prozess der Veränderung und Weiterentwicklung. In den
vergangenen 20 Jahren hat dabei die implantologische Tätigkeit einen
kontinuierlichen Einzug in die Zahnmedizin gehalten. So ist einem
Patienten die Option eines Zahnimplantats nicht mehr fremd, sondern wird
als Möglichkeit der Behandlung angesehen und ggf. auch eingefordert.
Der Grund hierfür liegt in einem größer werdenden Anspruch der
Patienten an Funktionalität und Ästhetik. Durch die Implantologie haben
sich die Behandlungsoptionen der Art vergrößert, dass einem Patienten im
Rahmen der zahnmedizinischen Behandlung oft unterschiedliche
Lösungsmöglichkeiten für seine persönliche Situation angeboten werden
können. Es ist nun möglich, Zähne einzeln zu ersetzen, ohne die
Nachbarzähne für eine Brückenkonstruktion zu beschleifen. Ferner kann
herausnehmbarer Zahnersatz auf Implantaten befestigt werden und lange
Freiendsituationen können mit festem Zahnersatz versorgt werden. Jedem
Patienten können diese Innovationen jedoch nicht zukommen. Als Grund
sind hier neben finanziellen, zahnmedizinische Gründe und auch
allgemeinmedizinische Faktoren zu nennen, die es verhindern können,
dass ein Patient implantologisch behandelt werden kann. So können
vorangegangene Therapien, ein zu geringes Knochenniveau oder
bestimmte Grunderkrankungen den Erfolg reduzieren oder auch
verhindern [13].
Bei den beeinträchtigenden Grunderkrankungen ist der Diabetes zu
nennen. In der westlichen Welt ist der Diabetes mellitus zahlenmäßig eine
stetig ansteigende endokrine Stoffwechselerkrankung. Studien gehen für
Deutschland von einem Diabetikeranteil von circa 7,5 Millionen Menschen
der Bevölkerung aus [1, 50]. Bei Bundesbürgern im Alter von 45-74
Jahren liegt die Rate bei 8,2%. Gerade diese Personen bilden in der
zahnmedizinischen Behandlung die potentielle Patientengruppe bei einer
zahnimplantologischen Behandlung [53]. Bei Patienten mit einer Diabetes
mellitus Erkrankung sind im Vergleich zu stoffwechselgesunden Patienten
aus der Implantologie geringere Überlebensraten von gesetzten
9
Implantaten dokumentiert [18, 19, 41, 45]. Folglich scheint der Diabetes
den Langzeiterfolg der Osseointegration zu beinträchtigen [12]. Aktuelle
Studien belegen, dass die Erfolgsquote für eine erfolgreiche
Osseointegration bei Diabetikern auf 85%-95% erhöht werden kann. Um
in diesen Prozentbereich zu kommen, ist es jedoch notwendig, dass bei
den diabetischen Patienten entsprechende Störfaktoren reduziert oder
ggf. vollständig beseitigt werden [37, 52]. Als Störfaktoren sind zu
benennen u.a.: Rauchen, schlechte Mundhygiene, schlecht eingestellter
Diabetes, eine Parodontitis und mangelhafte Maßnahmen bei Infektionen
[37, 55, 64].
Der Erfolg eines gesetzten Implantates lässt sich an Parametern wie
Osseointegration, Lokalisation, Funktionalität, Zufriedenheit des
Patienten, Ästhetik, Weichgewebsmanagement, festmachen. Bei der
Vielzahl der Kriterien ist ein Parameter besonders zu gewichten: die
Osseointegration. Diese bildet das Fundament, um andere
Erfolgsfaktoren adäquat beurteilen zu können; denn ohne eine
erfolgreiche Einheilung und ein damit verbundener Implantatverlust sind
andere Bewertungskriterien hinfällig. Eine Definition des Begriffes der
Osseointegration wurde von Branemark et al. vorgenommen. Er
bezeichnet ein Implantat als osseointegriert, wenn ein bewegungsloser
Kontakt zwischen einem gesundem Knochen und einem belastetem
Implantat besteht [8]. Um diesen Idealzustand zu erreichen, findet eine
permanente Implantatoptimierung in Form, Material, Beschichtung und
Verfahren statt.
Bei diesem Optimierungsprozess können einige Schritte besonders
benannt werden: Bei der Wahl des Materials konnte nachgewiesen
werden, dass Materialien mit einer niedrigen Biokompatibilität wie Silber
und Kupfer nach einer Implantation eine geringe oder gar keine
Osseointegration aufwiesen [2]. Somit fielen diese Materialien aus dem
weiteren Entwicklungsprozess heraus. Branemark et al. konnte in seinen
Studien belegen, dass Titan ein besonders gutes Implantatmaterial
darstellt; der Grund hierfür liegt in den spezifischen Eigenschaften von
Titan. In neueren Untersuchungen konnte verifiziert werden, dass Titan im
10
Vergleich mit Kobalt-Chrom und Stahl signifikant bessere Werte bei der
Osseointegration in den Parametern periimplantäre Knochendichte und
Knochen-Implantat-Kontakt aufweist [7, 49]. Zeichneten sich ferner in der
Anfangszeit der Implantologie die benutzten Implantate durch glatte
Oberflächen aus, so wurden in dem weiteren Entwicklungsprozess die
glatten Implantatoberflächen durch Korund gestrahlte und geätzte
Oberflächen abgelöst. Die Implantatoberfläche scheint dabei auf das
Zellwachstum und die Zelldifferenzierung von Osteoblasten Einfluss zu
nehmen und stellt somit einen wesentlichen Faktor für den
Knochenheilungsprozess dar. Es konnte nachgewiesen werden, dass die
Kombination von sandgestrahlten und geätzten Implantatoberflächen sich
im Gegensatz zu glatten Oberflächen positiv auf den
Knocheneinheilungsprozess auswirkt [9, 49]. Neueste Entwicklungen in
Forschung und Industrie zielen auf Implantatoberflächen hin, die
biofunktionalisiert werden, um eine schnellere Osseointegration zu
erreichen und so die Behandlungsdauer für die Patienten zu verkürzen.
11
4. Ziel der Arbeit
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Thema der Osseointegration
bei oberflächenbeschichteten Implantaten in einem Tiermodell. Es wurde
der Einfluss einer mit Peptid P-15 beschichteten ANKYLOS® Bioplus
Oberfläche auf den Einheilungsprozess im Ober- und Unterkiefer bei
diabetischen Tieren und nicht diabetischen Tieren im Vergleich mit einer
nicht beschichteten Implantatoberfläche untersucht.
Folgenden Fragen wurde in dieser experimentellen Tierstudie nach-
gegangen:
1. Ergeben sich signifikante Unterschiede bei der Verwendung von mit
P-15 beschichteten Implantatoberflächen und unbeschichteten
Oberflächen:
in Bezug auf die Knochendichte,
in Bezug auf den Knochen-Implantat-Kontakt (KIK),
in Bezug auf die immunhistochemische Analyse?
2. Wie wirkt sich die Verwendung einer mit P-15 beschichteten
Implantatoberfläche im Gegenüber zu einer unbeschichteten
Implantatoberfläche bei unbehandelten diabetischen Tieren aus?
12
5. Material und Methoden
5.1. Das Versuchstier
5.1.1. Die Wahl des Versuchstiers
Als Versuchstier wurde das Minipig gewählt. Dieses eignet sich
besonders für Studien der Knochenheilung, da die gewonnenen
Ergebnisse aufgrund der anatomischen und pathologischen Eigenschaften
des Schweines gut auf den Menschen übertragen lassen [24, 54, 56].
Physiologische und biochemische Vorgänge beim Schwein sind mit dem
menschlichen Körper vergleichbar [66]. Des Weiteren ist der
Schweineschädel in seiner anatomischen Struktur und Bezahnung dem
Menschen ähnlich [47, 70]. Somit kann man das Schwein als ein sehr
verlässliches Tiermodell in den Punkten Vergleichbarkeit,
Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit auf den Menschen verwenden.
5.1.2. Anzahl der Versuchstiere
Nach Genehmigung der tierexperimentellen Studie 54-2531.31-24/07
durch die zuständige Tierversuchskommission der Regierung
Mittelfrankens in Ansbach wurden 22 Tiere in das Forschungsprojekt
einbezogen.
5.1.3. Bildung der Versuchsgruppen
Die Tiere unterteilten sich in 14 diabetische und 8 gesunde Schweine.
Diese wurden wiederum in 4 Untergruppen eingeteilt, welche sich durch
den Opferungszeitpunkt bestimmten. Die Opferungszeitpunkte waren
nach 1 Woche, nach 2 Wochen, sowie nach 3 Monaten und 6 Monaten.
5.1.4. Induktion des Diabetes
Entsprechend einer Studie von Wilmowski et al. wurde Streptozotocin
(Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI, USA) in physiologischer
Kochsalzlösung auf 1g/10ml verdünnt und 90mg/kg Körpergewicht in die
Ohrvene über eine Zeitspanne von 30 Minuten verabreicht [30, 65]. Nach
Medikation mit Midazolam (1mg/kg/KG) (Dormicum®, Roche Deutschland
Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) und Ketavet®
13
(10mg/kg/KG) (Ketavet®, Pharmacia, Erlangen) fand die Infusionsgabe in
Sedierung statt. Die Durchführung erfolgte 4-5 Stunden nach der
morgendlichen Fütterung.
Die Minipigs erfüllen nach die drei Diabeteskriterien der WHO (World
Health Organisation, 1999) und der ADA (American Diabetes Association,
2006). Diese sind folgende:
1. Blutzuckerwerte von über 200mg/dl in Kombination mit Polyurie,
Polydipsie und einer Polyphagie
2. Nüchternblutzuckerwerte von über 125 mg/ dl
3. Blutzuckerwerte von mehr als 200 mg/dl bei einer genormten
Glucose-Testlösung
Wilmowski et al. konnte nachweisen, dass bereits nach 6 Monaten
histopathologische Veränderungen des Weichgewebes und der Gefäße
eintreten. Ebenfalls vermindert sich die Knochenmineralisationsrate nach
12 Monaten. Diese Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen von
Marshall et al., der in seiner Studie ebenfalls Veränderungen der Gefäße
und des Gewebes nachweisen konnte [38].
5.2. Zeitlicher Ablauf mit graphischer Darstellung
Von der Streptozotocingabe bis zur Implantation verstrich ein Zeitraum
von 180 Tagen, da Wilmowski et al. und Marshall et al. wie oben
beschrieben histologisch nachgeweisen haben, dass bei diabetischen
Schweinen in einem Zeitraum dieser Länge bereits Mikroangiopathien
nach morphologischen Veränderungen entstehen [38, 65].
14
Präoperativ
Implantation:
Abbildung 1: Einteilung der Versuchsgruppen. Angegeben sind die Anzahl der Tiere pro
Versuchsgruppe, gesund (weiß) diabetisch (schwarz) im zeitlichen Verlauf von der Extraktion
über die Implantation bis hin zu den einzelnen Opferungszeitpunkten.
1.Gruppe Opferung: 1. Woche nach Implantation Anzahl: 4 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine
2.Gruppe Opferung: 2. Woche nach Implantation Anzahl: 4 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine
3.Gruppe Opferung: 3. Monat nach Implantation Anzahl: 3 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine
Alle 22 Schweine Implantation der Schweine. Jedes Schwein erhält 12 Implantate.
Alle 22 Schweine Zahnextraktion im Oberkiefer und Unterkiefer. Plastische Deckung der Wunden
1 Woche
2 Wochen
3 Monate
6 Wochen vorher
4.Gruppe Opferung: 6. Monat nach Implantation Anzahl: 3 diabetische Schweine 2 gesunde Schweine
6 Monate
15
5.3. Implantatsystem
5.3.1. Implantateigenschaften
In unserer Studie wurde das Implantatsystem ANKYLOS® der Firma
DENTSPLY Friadent (DENTSPLY Friadent GmbH, Mannheim,
Deutschland) verwendet. Der Implantatkörper ist ein nicht
selbstschneidendes, konusförmiges Schraubenimplantat mit sich nach
apikal vergrößernder Gewindetiefe, welches in vier Durchmessern und
verschiedenen Längen erhältlich ist. In unserem Versuchsaufbau wurden
Implantate mit einer Länge von 11 mm und einem Durchmesser von 3,5
mm verwendet. Das Implantat bestand aus Titan des Grades 2, das nach
Angaben der Firma DENTSPLY Friadent aus mehr als 99% Titan besteht.
Außerdem enthält es geringe Mengen an elementarem Sauerstoff (max.
0,18 %), Kohlenstoff (max. 0,08 %), Stickstoff (max. 0,05 %), Wasserstoff
(max. 0,01 %) und Eisen (max. 0,25 %) [32]. Auch machte der Hersteller
Angaben zu weiteren physikalischen Werten: Das Implantat hat ein
Elastizitätsmodul von 110 GPa, eine Bruchdehnung von 45 % und eine
Zugfestigkeit von 470 N/mm². Ferner erhält die Oberfläche des
Implantates ihre Rauigkeit durch eine gezielte Korund Strahlung, welche
die primäre Mikrostruktur erzeugt. Die gestrahlten Implantate wurden
anschließend durch eine Hochtemperatur-Säureätzung mikrostrukturiert
und somit eine dreidimensionale Struktur geschaffen wird.
5.3.2. Beschichtung
Bei der Beschichtung der Implantate handelt es sich um das synthetisch
hergestellte Peptid P-15, welches in seiner Struktur durch eine
766GTPGPQGIAGQRGVV780, einer α1-Kette des Collagens Typ I
(Collagen I) entspricht und damit die organische Komponente des
Knochens repräsentiert [34]. Diese zeichnet sich verantwortlich für
Knochenneubildung und der Bindung von Zellen [6, 26]. Das Polypeptid P-
15 wurde an Hydroxylapatit auf der FRIADENT® plus Oberfläche der
Firma DENTSPLY gebunden.
16
5.4. Art und Durchführung der Eingriffe
Alle Eingriffe erfolgten in einer Intubationsnarkose. Den Tieren wurde eine
perioperative Antibiose verabreicht: 1 Stunde präoperativ bis 2 Tage
postoperativ zur Verringerung von Infektionsrisiken (Streptomycin, 0,5g/d,
Grünenthal GmbH, Aachen, Deutschland).
5.4.1. Zahnextraktion
Sechs Wochen vor der Implantation fand bei allen 22 Versuchstieren eine
Zahnextraktion im Ober- und Unterkiefer unter Schonung der umliegenden
Strukturen, vor allem der des Knochens, statt. Dabei wurden die distalen
Wurzeln der dritten und vierten Prämolaren im Ober- und Unterkiefer
entfernt sowie der erste Prämolar im Unterkiefer, an diesen Stellen
erfolgte die spätere Implantation. Die Extraktionsalveolen wurden plastisch
gedeckt, um eine bessere Wundheilung zu erzielen.
5.4.2. Implantation
Bei der Implantation im Ober- und Unterkiefer wurde das ANKYLOS®
System der Firma DENTSPLY Friadent benutzt. Im ersten Schritt wurde
ein Pilotbohrer benutzt, um anschließend die erforderliche Tiefe mit den
entsprechenden Bohrern herzustellen und manuell ein Gewinde zu
schneiden. Nach der Insertion wurde das Innengewinde mit einer
Verschlussschraube versehen.
Oberkiefer Unterkiefer
1x ANKYLOS® A11 plus
Hydroxylapatite surface
2x ANKYLOS® A11 plus
Hydroxylapatite surface
3x ANKYLOS® A11 Bioplus 1x ANKYLOS® A11 Bioplus
2x ANKYLOS® A11 plus 1x ANKYLOS® A11 plus
Tabelle 1: Darstellung der gesetzten ANKYLOS® Implantate im Ober- und
Unterkiefer je Tier. Informationen über die Art der Beschichtungen, die pro Kiefer
gesetzt wurden.
17
Abbildung 2: Darstellung der Anzahl und Implantatverteilung im Ober- und
Unterkiefer und ihre Positionierung auf dem Kieferbogen. Die Positionen 3,6,8,10
stellen den Bereich der distalen Wurzel des vierten Prämolaren da, die
Positionen 2,5,9,7 den Bereich der distalen Wurzel des dritten Prämolaren und
die Positionen 1,4 den Bereich des ersten Prämolaren.
5.4.3. Sektion
Nachdem die geplante Einheilzeit erreicht worden war, wurden die Tiere
geopfert. Die Minipigs erhielten zur Sedation eine i.m. – Injektion in die
Nackenregion mit Azaperone (1mg/kg KG) und Midazolam (1mg/ kg KG).
Anschließend erfolgte die Tötung durch eine intravasale Injektion 20%iger
Pentobarbitallösung in die Ohrvene bis zum Herzstillstand. Die Anzahl der
Tiere hat bei den ersten beiden Opferungszeitpunkten jeweils 6 Tiere
betragen. Bei den zwei folgenden waren es jeweils 5 Tiere. Nach der
Opferung wurden die Proben entnommen und bei -80°C eingefroren.
5.4.4. Entnahme und Aufarbeitung der Prüfkörper
Um sich einen Gesamtüberblick über die Lage der einzelnen Implantate
zu machen, wurden von jedem Schädel ein CT Bild angefertigt (Somaton
Sensation Open™, Siemens AG, Erlangen, Deutschland). Anschließend
wurden die Kiefer abgesetzt und es folgte das Separieren der einzelnen
Zahnimplantate mit einer speziellen Bandsäge (EXAKT Apparatebau,
Advanced Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland). Um die
biologische Aktivität der Proteine in den Proben zu erhalten und die
organische Matrix zu insolubilisieren, wurden die Gewebeblöcke für drei
bis vier Tage bei 4°C in eine Immersionsfixierung 1,4 % Paraformaldehyd
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gelegt. Für eine bessere Wirkung
wurde diese Lösung täglich erneuert. Danach erfolgte bei
18
Raumtemperatur die Dehydration der Proben in einer aufsteigenden
Alkoholreihe.
Fixierung/ Dehydrierung Tage
1,4% Paraformaldehyd 4
70% Alkohol 5
80% Alkohol 5
90% Alkohol 5
96% Alkohol 5
100% Alkohol 5
100% Alkohol 5
Tabelle 2: Darstellung der durchgeführten Dehydrierung mittels einer
Alkoholreihe und ihr zeitlicher Verlauf in Tagen.
Als Intermedium kam Xylol (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland)
zum Einsatz. Die Immersion erfolgte in drei Stufen, wobei die Infiltration im
Kühlschrank bei 4°C unter kontinuierlichem Rühren stattfand. Eine
zeitliche Dauer von einer Woche pro Medium bei einer Probengröße von
1–2 cm hat sich dabei bewährt. Zur Einbettung wurde ein spezieller
Kunststoff verwendet. Es handelte sich um Technovit® 9100 NEU
(Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland). Dieser ermöglicht einen
quantitativen Nachweis von Knochenmatrixproteinen und ist zugleich
geeignet für die Durchführung des Trenn-Dünnschliffverfahren nach
Donath und Breuner [10]. Bei dem Kunststoff Technovit® 9100 NEU
handelt es sich um ein Kaltpolymerisat auf Methylmethacrylatbasis. Dieser
härtet unter Ausschluss von Sauerstoff bei -6°C innerhalb von 4 Tagen
aus.
5.5. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner
Bei der weiteren Verarbeitung der Kunststoffblöcke wurde nach dem
Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner verfahren [15].
Zunächst wurden die Kunststoffüberstände mit einer Säge (EXAKT
19
Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland)
auf einen Probenüberstand von 1-2 cm reduziert. Danach wurden die
Proben mit einem Längsschnitt in zwei Teile geteilt. Dabei wurde darauf
geachtet, dass auf beiden Längsschnitten eine Hälfte des Implantates
sowie randständigem Knochen vorhanden blieb. Der erste Schnitt diente
zur Anfertigung der Mikroradiographie mit anschließender Histologie. Der
zweite Schnitt wurde zum Anfertigen der Immunhistologie verwendet.
Danach wurden die Außenflächen der Knochenproben mit Technovit®
4000 (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) und einer Präzisions-
Klebepresse (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH,
Norderstedt, Deutschland) auf angeraute Plexiglasobjektträger (Carl Roth
GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) aufgeklebt. Dann erfolgte eine
Bearbeitung der Proben auf den Objektträgern mit einer
Präzisionsschleifmaschine. Hierzu wurden die Proben eingespannt und
unter Wasserkühlung mit einer rotierenden, oszillierenden Bewegung plan
geschliffen. Dazu bediente man sich einer aufsteigenden Körnung des
Schleifpapieres (Hermes Schleifmittel GmbH & Co. KG, Hamburg,
Deutschland): beginnend mit 320, danach 800 und 1200. Abschließend
wurde die Oberfläche mit einem 4000 Schleifpapier hochglanzpoliert. Auf
die jetzt plane und hochglanzpolierte Probe wurde mit der Präzisions-
Klebepresse ein Plexiglasobjektträger planparallel mit Zyanoarclat
Technovit® 7210 VI-C (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland)
aufgeklebt. Der neu aufgeklebte Objektträger wurde dann mit einem rund
300 μm dicken Anteil der Probe von dem EXAKT-Trennsystem abgesägt.
Anschließend wurde die Schichtdicke der Proben auf ca. 200 μm mit dem
EXAKT-Schleifsystem (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies,
GmbH, Norderstedt, Deutschland) reduziert.
5.6. Mikroradiographie
Zur mikroradiographischen Untersuchung der Proben wurde das
Verfahren nach Freitag gewählt (1980). Dazu wurden die Proben zunächst
mit dem Schleifsystem EXAKT 400CS (EXAKT Apparatebau, Advanced
Technologies, GmbH, Norderstedt, Deutschland) auf eine Schichtdicke
von 90 μm reduziert. Der Röntgenvorgang erfolgte in einem Faxitron®-
20
Tischröntgengerät (Faxitron® R, Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA)
über 2 min 30 sec bei 15kV und 2,5 mA. Um eine hohe und gute
Auflösung zu erreichen, lag der Objekt-Film Abstand bei fast null, da die
Proben auf den Röntgenfilm gelegt wurden.
Abbildung 3: Die Präparate wurden mit dem Tischröntgengerät Faxitron®
geröntgt, um sie anschließend zu digitalisieren und mit einem
Bildbearbeitungsprogramm zuzuschneiden und zu kontrastieren.
Die entstandenen Röntgenbilder (Kodak GmbH, Stuttgart) wurden
entwickelt und mit einem Epson Scanner (Epson Perfection 4900 Photo)
mit 2400dpi und 8-bit-Grauskala gescannt und im Tiff-Format gespeichert.
Anschließend fand eine Auswertung der Bilder mittels BIOQUANT®
(BIOQUANT Image Analysis Corporation, Nashville, TN, USA) statt.
Dieses Programm kann den Anteil einer einzelnen Graustufe in dem Bild
bestimmen, so dass der prozentuale Anteil an Hartgewebe und die damit
verbundene Knochendichte ermittelt werden kann. Es wurden an 4
Stellen, den sogenannten Regions of Interest (ROI), eine jede Probe
vermessen, der Screenshot gespeichert und die Werte tabellarisch
erfasst.
21
Abbildung 4: Darstellung der Regions of Interest (ROI) zur Auswertung der
Mikroradiographien. Auf einer Implantatseite finden sich 2 Auswertungsbereiche
gleicher Größe.
Abbildung 5: Auswertung einer ROI mit Bioquant Osteo®. Nach der Markierung
der ROI (grünes Rechteck) werden der Knochen (rotgefärbter Bereich) und die
Implantatfläche innerhalb der ROI (weißgefärbter Bereich) markiert. Bioquant
Osteo errechnet daraus den prozentualen Anteil des markierten Knochens an der
Gesamtfläche in der ROI abzüglich der Implantatfläche.
1
2 3
4
22
5.7. Histomorphometrie
Die Toluidinblauschliffe wurden zur Ermittlung des Knochen-Implantat-
Kontaktes (KIK) verwendet. Um eine optimale Auswertung vornehmen zu
können, war es zunächst wichtig, die Proben auf eine Dicke von 30 μm zu
reduzieren, dadurch wurde eine Zellüberlagerung auf den Objektträgern
vermieden. Nach der letzten Politur wurden die Proben für 5 Minuten in
einem 10%igem H202 Bad behandelt. Anschließend wurden unter
laufendem Wasser die Proben gespült und danach getrocknet. Danach
erfolgte die Färbung in Toluidinblau-O-Lösung für 12 Minuten. Um die
überschüssige Farbe zu entfernen, wurden die Proben erneut unter
fließendem Wasser gespült. Die Auswertung des Knochen-Implantat-
Kontaktes fand mit einem Zeiss Lichtmikroskop - ausgestattet mit einer
Digitalkamera - (Axioskop, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland)
statt, welches ermöglichte, die Schliffe mittels des Programmes
BIOQUANT® Osteo Software V7.10.10 (BIOQUANT Image Analysis
Corporation, Nashville, TN, USA) einzulesen und auszuwerten. Das
Programm ermöglicht es, in einem Bildausschnitt die Implantatoberfläche
zu kennzeichnen und manuell zuzuweisen, an welcher Stelle ein KIK
besteht; der KIK ist dann prozentual errechenbar. Für die Auswertung der
Proben wurden 6 Regions of Interest (ROI) festgelegt.
23
Abbildung 6: Darstellung der ROI zur Auswertung der Toluidinblauschliffe. Auf
einer Implantatseite finden sich 4 Auswertungsbereiche gleicher Größe zur
Bestimmung des Knochen-Implantat-Kontaktes (KIK).
Abbildung 7: Exemplarische Darstellung des Auswertverfahrens der
Dünnschliffpräparate in Toluidinblau O Färbung mit dem Computerprogramm
BIOQUANT®. Hierdurch wird der prozentuale Anteil des Knochens mit der rot
dargestellten Implantatfläche berechnet.
2 3
1 4
5 6
7 8
24
5.8. Immunhistochemie
Bei der Immunhistochemie wurde mittels einer Komplexbildung durch
Antikörperzugabe die Gewebsantigene für das menschliche Auge sichtbar
gemacht. Da Knochenmatrixproteine beim Knochenumbau und der
Knochenregeneration eine entscheidende Rolle spielen, ist deren
Nachweis ein Kriterium zur Beurteilung des zeitlichen Prozesses der
Knochenregeneration. Deshalb wurden in dieser Studie folgende
Färbungen durchgeführt.
5.8.1. Collagen Typ I
Collagen ist ein Strukturprotein, das im menschlichen Organismus in der
extrazellulären Matrix vorkommt. Der prozentuale Anteil der Collagene am
Gesamtgewicht aller Proteine im Organismus beträgt 30%. Collagen ist
somit das am häufigsten vorkommende Protein im menschlichen Körper:
Es findet sich in Sehnen, Haut, Knorpel, Gefäßen und hat einen Anteil von
95 Prozent im Knochen [17]. Die extrazelluläre Matrix und damit auch das
Collagen sind für die biochemischen und mechanischen Eigenschaften
von Geweben verantwortlich und zeichnen diese aus. Collagen steht in
seiner Bedeutung nicht für ein einzelnes Protein, sondern ist der
Oberbegriff für eine ganze Gruppe von über 20 verschiedenen
Collagenen.
Allen Vertretern der Collagenfamilie ist ein Strukturmerkmal gemeinsam:
Sie besitzen eine charakteristische Tripelhelix, die aus drei
Polypeptidketten besteht [20]. Beim Collagen vom Typ I (Collagen I),
welches das häufigste Collagen darstellt, besteht die Tripelhelix aus zwei
identischen α1 (I)-Ketten und einer α2 (I)-Kette. Die Peptidketten teilen die
Eigenschaft, dass sie eine regelmäßig wiederholende Abfolge von Gly-X-Y
besitzen, dabei steht das X oft für Prolin und Y häufig für Hydroxyprolin
[68].
Die Biosynthese von Collagen I wird von bestimmten Zellen
übernommen: den Osteoblasten und Fibroblasten. Sie beginnt am rauen
endoplasmatischen Retikulum. Diese Vorläufermoleküle, die sogenannten
Pro-α-Ketten, die dort produziert werden, besitzen am N- und C-terminus
25
ein Propeptid. Anschließend werden am Golgi-Apparat die Prolin und
Lysin Reste hydroxyliert und glycolysiert. Mit der beginnenden Ausbildung
von Disulfidbrücken zwischen den C-terminalen Propetiden beginnt die
Tripelhelixbildung, diese wird fortgesetzt durch die Vernetzung mit
Wasserstoffbrücken der drei Pro-α-Ketten. Diese Vorläuferstufen werden
dann durch Exocytose in den extrazellulären Raum abgegeben. Dort
findet eine Abspaltung der Propeptide durch sogenannte Procollagen-
Peptidasen statt; es entstehen Tropocollagene, die sich zu Fibrillen
zusammenlagern. Mehrere Collagenfasern lagern sich zu
Collagenbündeln zusammen, womit die Synthese endet.
Bei der Osteoneogenese wirkt das Collagen wie folgt: Zunächst ist die
Bildung der extrazellulären Collagen I Matrix zu nennen; dieser Schritt
nimmt ungefähr 10 Tage in Anspruch [17]. Danach folgt die Mineralisation
dieser Matrix, wo sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der
Collagenfasern anlagern und die Fasern als Kristallisationskeime wirken.
Dieser Vorgang erstreckt sich über eine Dauer von 2-3 Monaten [17] [67].
Mittlerweile konnte nachgewiesen werden, dass Collagen nicht nur eine
Leitstruktur ist, sondern auch andere aktivere Funktionen wahrnimmt. Es
konnte in Studien belegt werden, dass Collagen I einen Speicher für
Wachstumsfaktoren wie IGF-I und IGF–II und Cytokinen bildet. Diese
werden in der Struktur des Collagen gespeichert [4]. Dadurch ist das
Collagen an der Osteoblasten-Differenzierung beteiligt und induziert
dieselbe [39]. Auch wirkt das Collagen an der Apotose und Proliferation
der Osteoblasten mit [23, 69]. Daher kann man resümierend sagen, dass
Collagen I und seine Vorstufen bei der Knochenbildung und den
Umbauprozessen des Knochens eine wichtige Rolle spielen und sich
somit gut als Marker der frühen Knochenentwicklung eignet [58].
5.8.2. Osteocalcin
Osteocalcin, auch "bone γ-carboxylglutamic acid-containing protein"
(BGP) genannt, gehört zu den nicht collagenen Bestandteilen der
Knochenmatrix. Die Grundstruktur besteht aus 49 Aminosäuren und ist
mengenmäßig mit 1-2% in der nicht collagenen Matrix vorhanden. Der
26
Syntheseort ist im Knochen der Osteoblast und im Zahn der Odontoblast
und sie läuft während der Mineralisation ab. Es konnte nachgewiesen
werden, dass das Vorhandensein von Vitamin K die γ-Carboxylierung von
Osteocalcin fördert und sich somit positiv auf die Anheftung von
Hydroxyapatit an das Osteocalcin auswirkt. Durch diese Reaktion
verändert sich auch die Qualität der Knochenmatrix. Die nun veränderte
Knochenmatrix scheint einen Einfluss auf die Reifung der Knochendichte
zu haben [3]. Eine endgültige Funktionsbeschreibung von Osteocalcin im
Knochen und im Glucosestoffwechsel kann bis zum gegenwärtigen
Zeitpunkt nicht gemacht werden [25]. Nachgewiesen wurde bisher unter
anderem, dass bei ansteigenden Serumspiegeln von Calcium und
Phosphat und einer erhöhten Mineralisation des Knochens die Expression
von Osteocalcin ebenfalls linear ansteigt [27]. Durch diese erhöhte
Expression und der oben erwähnten Synthese im Osteoblasten kann
Osteocalcin als wichtiger Marker der Osteoblastenaktivität und der späten
Knochenreifung dienen [10].
5.8.3. Ablauf der Immunhistochemie
Zunächst wurde die zweite Hälfte des Probenblocks genommen und das
halbierte Implantat herausgelöst. Anschließend wurde diese Probenhälfte
erneut mit Technovit® 9100 NEU eingebettet und bei -6 °C 4 Tage
ausgehärtet. Nach dieser Zeit wurden zu große Probenüberstände mit
einer Säge (EXAKT Apparatebau, Advanced Technologies, GmbH,
Norderstedt, Deutschland) reduziert und die Ecken der Proben
abgerundet, um das spätere Schneiden zu erleichtern. Im Anschluss
wurden die Proben mit dem Kaltpolymerisat (Technovit® 3040; Heraeus
Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) auf spezielle Formen (Simport
Plastics Ltd., Beloein, QC, Kanada) geklebt. Es wurden Schnitte mit einer
Dicke von 5 μm angefertigt und auf einen Superfrost Ultra Plus
Objektträger (Menzel GmbH & Co. KG, Braunschweig, Deutschland)
mittels Ethanols gezogen. Nach dem Abdrücken des restlichen Ethanols
und dem Abdecken der Probe mit einer Polyethylenfolie (Heraeus Kulzer
GmbH, Hanau, Deutschland) wurden die Schnitte bei 58°C unter Druck in
einer Spindelpresse für eine Nacht im Wärmeschrank (Memmert GmbH &
27
Co. KG, Schwabach, Deutschland) aufbewahrt. Am nächsten Tag erfolgte
die Entfernung der Polyetylenfolie von den Proben.
Die Färbung
Zum Starten des Färbeverfahrens mit einem Antigen-Antikörpernachweis
mussten die Probenschnitte vorbehandelt werden. Diese Vorbehandlung
wurde bei allen zu färbenden Proben durchgeführt und bestand aus zwei
Abschnitten: Der Entacrylierung und einer anschließenden Rehydrierung.
Zur Entacrylierung wurden die Proben 60 Minuten unter Bewegung in 2
Methoxyethylacetat (MEA, Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn,
Deutschland) gegeben. Nach der Entacrylierung startete die Rehydrierung
in einer absteigenden Alkoholreihe. Danach wurden die Proben in 10%iger
Ethylendiamintetraessisäure-Lösung (DakoTM, Glostrup, Dänemark)
entkalkt. Zum Schluss fand ein Spülen der Proben unter fließendem
Leitungswasser statt. Die Proben kamen zuerst in ein aqua destillata (aq.
dest.) Bad und anschließend in einen Waschpuffer (Dako Wash Buffer
х10, Code S3006, DakoTM, Glostrup, Dänemark). Danach wurden die
Proben 22 Minuten in einem 95°C Citrat Bad (DakoCytomation Target
Retrieval Solution Citrate pH 6, х10, Code S2369) gestellt, um die
Zielantigene bei einem pH-Wert von 6,0 zu demaskieren. Ebenfalls
wurden noch bestehende Proteinvernetzungen, die durch die
Formalinfixierung entstanden waren, gelöst. Nach dem Abkühlen im
Waschpuffer konnte der eigentliche Färbevorgang gestartet werden.
Dieser fand in einem Dako Cytomation Autostainer Plus (DakoTM,
Glostrup, Dänemark) vollautomatisch statt. Bei jeder Färbung wurden zwei
Negativkontrollen angefertigt, die mit denselben Flüssigkeiten behandelt
wurden wie die zu färbenden Proben (ausgenommen dem
Primärantikörper). Als nächstes wurden die zu färbenden Proben mit einer
3%igen Wasserstoffperoxid/TBS-Pufferlösung behandelt, um die
Peroxidase zu blockieren. Um unerwünschte Reaktionen zu verhindern,
wurde der Proteinblock (Dako Protein Block Serum-Free, Code X0909,
DakoTM, Glostrup, Dänemark) aufgebracht. Zur Lokalisation der
spezifischen Gewebsantigene wurde die Labelled (Strept-)Avidin-Biotin-
Methode (LSAB) benutzt.
28
Zur Durchführung der LSAB-Methode ist das System der Firma Dako
(Dako REALTM Detection System, Alkaline Phosphatase RED, Rabbit
Mouse, DakoTM, Glostrup, Dänemark) benutzt worden. Dieses hatte sich in
vorherigen Studien als sehr zuverlässig erwiesen. Die LSAB-Methode
zeichnet sich durch folgende charakteristische Schritte aus (Abbildung 8):
1.Schritt:
Als erstes werden die zu färbenden Proben mit einem unkonjugiertem
Antikörper behandelt. Dieser bindet an das spezifische Antigen und lässt
ein Antigen-Antikörperkomplex entstehen.
2.Schritt:
Die Antikörper aus dem zweiten Schritt werden mit Antibodydiluent (Dako
REALTM Antibody Diluent, Code S2022, DakoTM, Glostrup, Dänemark) auf
die benötigte Konzentration verdünnt (Tabelle 3). Der nun biotinilierter
Antikörper bindet an den Primärantikörper.
3.Schritt:
Im dritten Schritt wird die Dako Streptavidin-Peroxidase (HRP) (DakoTM,
Glostrup, Dänemark) aufgetragen; sie bindet an den biotinilierten
Sekundärantikörper.
4.Schritt:
Im letzten Schritt wird das Substrat hinzugefügt. Bei diesem handelt es
sich um eine wasserstoffperoxidhaltige Substratlösung mit 3-Amino-9-
Ethylcarbazol (AEC). Das Substrat reagiert am Enzym und es entsteht ein
rotbraunes Produkt am Ort des nachzuweisenden Antigens.
29
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Labelled-(Strept)-Avidin-Biotin-
Methode (LSAB-Methode).
Nachdem die Arbeitsschritte im Dako Cytomation Autostainer Plus
abgeschlossen worden waren, wurden die Proben entnommen und in
einem destillierten Wasserbad gespült. Der letzte Arbeitsschritt bestand in
einer Hämalaun-Färbung (Microscopy Mayers Hämalaunlösung, Merck
1.) Primärantikörper bindet an das Antigen
2.) Biotiylierter Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper
3.)Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (HRP) bindet an Biotin
4.) AEC und Wasserstoff werden unter der katalytischen Wirkung der Peroxidase zu einem rotbraunem Farbstoff umgesetzt
30
KGaA, Darmstadt, Deutschland). Um überschüssige Farbe zu entfernen,
fand eine erneute Spülung unter fließendem Wasser statt und ein
abschließendes Bad in destilliertem Wasser. Zum Schluss wurden die
Proben mit einem Deckglas und einem Einschlussmedium (Microscopy
Aquatex®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) versiegelt.
Antikörper Hersteller Typ Gewonnen
aus
Konzentration
Collagen I
(Col-I)
Abcam,
Monoklonal Maus 1:10000
Osteocalcin
(OC 4-30)
Takara Monoklona Maus 1:10000
Tabelle 3: Darstellung verwendeter Antikörper und deren Konzentration zur
Herstellung der immunhistochemischen Färbungen.
5.9. Statistik
Die Proben wurden von zwei Untersuchern ausgewertet und die
gewonnen Ergebnisse in das Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2007®
(Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) übertragen. Zur graphischen
Darstellung wurden die arithmetischen Mittelwerte ermittelt und die
Standardabweichung errechnet. Zur Darstellung wurde die
Standardabweichung den Graphen der Mittelwerte additiv aufgesetzt. Zur
Bestimmung etwaiger Signifikanzen wurde der Wilcoxon-Vorzeichen-
Rank-Test mit dem Programm AXUM® (Math Software, Cambridge, USA)
benutzt, dabei wurde ein Signifikanzniveau (p-value) von p≤0,05 zu
Grunde gelegt.
31
6. Ergebnisse
Grundlage dieser Tierstudie sind die bei diabetischen und
stoffwechselgesunden Tieren (Minipigs) im Ober- und Unterkiefer
eingebrachten Implantate (mit Peptid P-15 beschichtete Implantate
ANKYLOS® A11 Bioplus und unbeschichtete Implantate ANKYLOS® A11
plus).
Ausgangspunkt der Ergebnisdarstellung sind die mikroradiographischen,
histochemischen und immunhistochemischen Resulate der postoperativen
Auswertung nach 1 und 2 Wochen. Bei der postoperativen Untersuchung
nach 3 bzw. 6 Monaten konnte kein belastbares und aussagekräftiges
Datenmaterial ermittelt werden, da die in die Auswertung einbezogenen
Tiere keinen komplikationslosen postoperativen Heilungsverlauf
aufzeigten. Es stellte sich zu diesen Zeitpunkten ein fast vollständiger
Verlust der zur Verfügung stehenden Implantate bei den Tieren ein, so
dass keine hinreichenden Prüfkörper für eine Analyse, eine Darstellung
von Resultaten und der daraus resultierenden Folgerungen vorhanden
waren.
Die vergleichende Darstellung der beiden Implantatsysteme (mit Peptid P-
15 beschichtete Implantate ANKYLOS® Bioplus und unbeschichtete
Implantate ANKYLOS® plus) erfolgte zum einen unter dem Aspekt der
stoffwechselgesunden Tiere im Gegenüber zu (unbehandelten)
diabetischen Tieren. Zum anderen wurde in die Beschreibung die Dauer
der Implantateinheilung mit einbezogen. Die unterschiedlichen Regions of
Interest (ROI) der Minipigs wurden schließlich in der Darstellung zu einer
Datenbasis summiert, da signifikate Differenzen bei der Analyse der zur
Verfügung stehenden Daten einen Vergleich der einzelnen ROI´s nicht
möglich machten.
32
6.1. Mikroradiographie
6.1.1. Knochendichte
Abbildung 9: Periimplantäre Knochendichte [%], nach der 1.Woche und
2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos Bioplus entspricht
den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den geätzten und
Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die
Standardabweichung dar.
Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche ließ sich bei den Proben mit
P-15 beschichteten Implantaten eine Knochenmineralisationsrate von
50,2% ± 21,0% und in der unbeschichteten Implantatgruppe von 41,7% ±
16,1% nachweisen. Nach 2 Wochen zeigte die P-15-Gruppe eine
periimplantäre Knochendichte von 50,4% ± 22,4% und die Kontrollgruppe
71,9% ± 25,4%.
Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre
Knochendichte der P-15-Gruppe 61,9% ± 22,8% und die der
Kontrollproben 55,6% ± 25,2%. Nach 2 Wochen fiel die Knochenmine-
ralisationsrate in der P-15-Gruppe auf 57,6% ± 23,8% und stieg in der
Kontrollgruppe auf 69,3% ± 20,3% an.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus
Kn
och
en
dic
hte
(BV
/TV
) [%
]
1.Woche
Gesund
Diabetisch
2.Woche
1
2 3
4
33
6.2. Histomorphometrie
6.2.1. Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)
Abbildung 10: Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) in [%], nach der 1.Woche und
2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos Bioplus entspricht
den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den nur geätzten und
Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die Standardab-
weichung dar.
Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus
beschichteten Implantaten eine KIK-Rate von 41,3% ± 25,7% und die mit
Plus beschichtete Implantatgruppe von 39,7% ± 22,7%. Nach 2 Wochen
ließ sich in der Bioplus-Gruppe eine KIK-Rate von 27,4% ± 25,7% und in
der Plus-Gruppe von 40,7% ± 13,2% nachweisen.
Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die KIK-Rate der
Bioplus-Gruppe 30,3% ± 24,0% und die der Plus-Proben 26,0% ± 19,9%.
Nach 2 Wochen betrug die KIK-Rate bei der Bioplus-Gruppe 29,4% ±
24,1% und in der Plus-Gruppe 30,6% ± 25,2%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus
Kn
och
en
-Im
pla
nta
t-K
on
takt in
%
1.Woche
Gesund
Diabetisch
2.Woche
34
6.3. Immunhistologie
6.3.1. Collagen I-Expression
Abbildung 11: Periimplantäre Collagen-Typ I- Expression/Fläche [%], nach der
1. Woche und 2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos
Bioplus entspricht den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den
nur geätzten und Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die
Standardabweichung dar.
Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus
beschichteten Implantaten eine periimplantäre Collagen I-Expression von
48,0% ± 24,8%. In der Plus beschichteten Gruppe belief sich der Wert für
die Collagen I-Expression auf 51,3% ± 14,7%. Nach 2 Wochen lag die
periimplantäre Collagen I-Expression bei den Bioplus beschichteten
Implantaten bei 31,3% ± 19,8%. Bei den Plus beschichteten Implantaten
lagen folgende Werte vor 35,3% ± 24,7%.
Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre
Collagen I-Expression der Bioplus-Gruppe 35,9% ± 22,6% und die der
Plus-Proben 29,0% ± 22,8%. Nach 2 Wochen betrug periimplantäre
Collagen I-Expression bei der Bioplus-Gruppe 38,6% ± 24,9% und in der
Plus-Gruppe 34,3% ± 25,7%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus
Co
llag
en I-E
xp
ressio
n/F
läche
(B
V/T
V)[
%]
1.Woche
Gesund
Diabetisch
2.Woche
35
6.3.2. Osteocalcin-Expression
Abbildung 12: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] nach der 1.
Woche und 2.Woche im diabetischen und gesunden Stoffwechsel. Ankylos
Bioplus entspricht den Implantaten mit der P-15 Beschichtung, Ankylos Plus den
nur geätzten und Korund gestrahlten Implantaten. Fehlerindikatoren stellen die
Standardabweichung dar.
Gesunde Stoffwechsellage: Nach 1 Woche zeigten die Proben mit Bioplus
beschichteten Implantaten eine periimplantäre Osteocalcin-Expression
von 29,1% ± 22,9% und die mit Plus beschichtete Implantatgruppe von
35,2% ± 25,5%. Nach 2 Wochen ließ sich in der Bioplus-Gruppe eine
periimplantäre Osteocalcin-Expression von 29,7% ± 23,2% und in der
Plus-Gruppe von 31,7% ± 21,7% nachweisen.
Diabetische Stoffwechsellage: Nach 1 Woche betrug die periimplantäre
Osteocalcin-Expression der Bioplus-Gruppe 34,4% ± 20,1% und die der
Plus-Proben 27,8% ± 18,7%. Nach 2 Wochen betrug die periimplantäre
Osteocalcin-Expression bei der Bioplus-Gruppe 35,5% ± 25,7% und in der
Plus-Gruppe 33,0% ± 23,5%.
0
10
20
30
40
50
60
70
Ankylos Bioplus Ankylos Plus Ankylos Bioplus Ankylos Plus
Oste
oca
lcin
-Exp
r./F
läch
e(B
V/T
V) [%
}
1.Woche
Gesund
Diabetisch
2.Woche
36
Abbildung 13: Darstellung eines Toluidinblauschliffes zur Ermittlung des
Knochen-Implantat-Kontaktes von einem ANKYLOS ® Bioplus Implantat mit der
P-15 Beschichtung zum Auswertungszeitpunkt nach 1 Woche.
Abbildung 14: Darstellung eines Toluidinblauschliffes zur Ermittlung des
Knochen-Implantat-Kontaktes von einem ANKYLOS ® Bioplus Implantat mit der
P-15 Beschichtung zum Auswertungszeitpunkt nach 2 Wochen.
37
6.4. Zusammenfassung der Ergebnisse Wertetabelle 1: Chronologische Gliederung
Knochendichte%
Knochen-Impl.-Kontakt(KIK)%
Osteocalcin– Expression%
Collagen I– Expression%
1.Woche Gesund
Bioplus Plus
Diabetisch Bioplus Plus
50,2±21,0 41,7±16,1 61,9±22,8 55,6±25,2
41,3±25,7 39,7±22,7 30,3±24,0 26,0±19,9
29,1±22,9 35,2±25,5 34,4±20,1 27,8±18,7
48,0±24,8 51,3±14,7 35,9±22,6 29,0±22,8
2.Woche Gesund
Bioplus Plus
Diabetisch Bioplus Plus
50,4±22,4 71,9±25,4 57,6±23,8 69,3±20,3
27,4±25,7 40,7±13,2 29,4±24,1 30,6±25,2
29,7±23,2 31,7±21,7 35,5±25,7 33,0±23,5
31,3±19,8 35,3±24,7 38,6±24,9 34,3±25,7
Wertetabelle 2: Gliederung nach Stoffwechsellage
Knochendichte%
Knochen-Impl.-Kontakt(KIK)%
Osteocalcin– Expression%
Collagen I– Expression%
Gesund Bioplus
1.Woche 2.Woche
Plus 1.Woche 2.Woche
50,2±21,0 50,4±22,4 41,7±16,1 71,9±25,4
41,3±25,7 27,4±25,7 39,7±22,7 40,7±13,2
29,1±22,9 29,7±23,2 35,2±25,5 31,7±21,7
48,0±24,8 31,3±19,8 51,3±14,7 35,3±24,7
Diabetisch Bioplus
1.Woche 2.Woche
Plus 1.Woche 2.Woche
61,9±22,8 57,6±23,8 55,6±25,2 69,3±20,3
30,3±24,0 29,4±24,1 26,0±19,9 30,6±25,2
34,6±20,1 35,5±25,7 27,8±18,7 33,0±23,5
35,9±22,6 38,6±24,9 29,0±22,8 34,3±25,7
38
7. Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss einer mit synthetischem
Peptid (P-15) beschichteten Implantatoberfläche auf die frühe
Osseointegration in einem diabetischen Tier untersucht (FRIADENT®
bioplus Oberfläche). Dazu wurden die Ergebnisse in Korrelation zu einer
Tiergruppe mit unbeschichteten Implantaten gestellt, deren Oberflächen
nur mit Säure und Korund behandelt wurden (FRIADENT® plus
Oberfläche). In wissenschaftlichen Studien konnte bereits die positive
Wirkung dieser FRIADENT® plus Oberfläche bei der Osseointegration
nachgewiesen werden [14, 16, 43, 44, 51]. Zur Gewinnung von
Vergleichsdaten erfolgte in dieser Studie die Implantation der
beschichteten und unbeschichteten Implantate sowohl beim diabetischen
als auch beim stoffwechselgesunden Schwein (Minipig). Als Implantatort
wurde der Ober- und Unterkiefer der Schweine gewählt. Die Analyse der
gewonnenen Daten erbrachte keinen signifikanten Unterschied zwischen
beschichteten und unbeschichteten Implantaten sowohl bei der
stoffwechselgesunden als auch bei der diabetischen Tiergruppe. Eine
Optimierung der Osseointegration durch mit P-15 beschichteten
Implantaten gegenüber unbeschichteten Implantaten konnte nicht belegt
werden. Dieses Ergebnis ist in einen kritischen Diskurs mit anderen
Studien zu stellen, die bei der Verwendung von P-15 beschichteten
Implantatoberflächen im Tiermodell eine Optimierung der
Osseointegration im stoffwechselgesunden Tiermodell nachweisen
konnten [36].
Betrachten wir zunächst die Ergebnisse der stoffwechselgesunden
Tiergruppe und setzen dann die Daten der diabetischen Tiergruppe dazu
in Korrelation. Zur Beurteilung der Implantatoberfläche wurden der
Knochen-Implantat-Kontakt (KIK), die Knochendichte, als auch die
Expression des Knochenmatrixmoleküls Collagen I und Osteocalcin
untersucht.
In der stoffwechselgesunden Tiergruppe konnten im untersuchten
Zeitraum beim Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)-Wert keine signifikanten
Differenzen zwischen den Werten bei den unbeschichteten und
39
beschichteten Implantaten festgestellt werden. Die Werte lagen fast auf
gleicher Höhe. Bei den unbeschichteten Implantaten betrugen sie (39,7%
und 40,7%) und bei den beschichteten Implantaten (41,3% und 27,4%). In
anderen Tierstudien, die sich mit oberflächenmodifizierten Implantaten
beschäftigten, konnte dagegen eine signifikante Optimierung der initialen
Osseointegration durch die Verwendung von biochemisch behandelten
Implantatoberflächen nachgewiesen werden. [59] Es muss auch
berücksichtigt werden, dass die Versuchsparameter der einzelnen
Studien nicht genormt waren und so ein direkter Vergleich
Differenzierungen nötig macht und Interpretationsspielräume bietet. So
gibt es Unterschiede im Studiendesign, in der Lokalisation der Implantate
bei der Wahl der Versuchstiere, der Auswertungsmethoden und der
Untersuchungszeitpunkte. Bezieht man diese Fakten in unsere
Betrachtung mit ein, so wird verständlich, dass sich in vergleichbaren
Studien bei den Ergebnissen gegenüber dieser Studie Differenzen und
Unterschiede einstellen. Schliephake et al. verglichen biofunktionalisiert
Oberflächen mit glatten Titanoberfächen. Als Versuchstier wurde der Hund
gewählt. Sie konnten in ihrer Studie einen Vorteil der modifizierten
Oberflächen gegenüber glatten Oberflächen nachweisen. Der KIK-Wert
erhöhte sich im ausgewerteten Untersuchungszeitraum. Ein Vorteil der
biofunktionalisierten Implantate zeigte sich dabei im Vergleich zu glatten
Oberflächen. Ein signifikanter Vorteil im Vergleich mit geätzten
Oberflächen konnte dagegen von ihnen nicht ermittelt werden [57]. Lutz
et al. und Tima untersuchten in ihren jeweiligen Studien am Minipig mit P-
15 behandelte Implantatoberflächen und verglichen diese mit
unbeschichteten Oberflächen, als Implantatort wurde die Schädelkalotte
des Schweines gewählt [62] . Das Ergebnis ihrer Untersuchungen bestand
im Aufweis eines erhöhten KIK-Wertes und eines damit verbundenen
signifikanten Vorteils der mit P-15 beschichteten Implantate [36] . Die
Knochen-Implantat-Kontakt (KIK)-Werte dieser Studie belegen dagegen in
der stoffwechselgesunden Tiergruppe keinen signifikanten Vorteil der
beschichteten Implantate gegenüber den unbeschichteten Implantaten.
Dieses Ergebnis bestätigt sich auch in der Darstellung der
mikroradiographischen Messdaten.
40
Zur Beurteilung des Osseointegration bei Implantaten diente in dieser
Studie neben der Ermittlung des KIK-Wertes die mikroradiographische
Bestimmung der periimplantären Knochendichte. Lutz et al. hatten in
ihrer Studie am Schwein bei den mit P-15 beschichteten Implantaten eine
Optimierung der Knochen-mineralisationsrate nachweisen können [36]. In
dieser Studie konnte im untersuchten Zeitraum bei den
stoffwechselgesunden Tieren ein differenzierter Verlauf ermittelt werden.
Die Werte stiegen unwesentlich bei den beschichteten Implantaten (50,2%
auf 50,4%) und erzielten damit keine signifikant höheren Werte gegenüber
den unbeschichteten Implantaten (41,7% auf 71,9%).
Zur weiteren Beurteilung der Osseointegration der unbeschichteten und
beschichteten Implantate wurden immunhistologischen Untersuchungen
vorgenommen. Als Parameter dienten die Collagen I -Expression und die
Osteocalcin-Expression. Beide Parameter stehen für einen anderen
Zeitpunkt in der Knochenbildungsphase.
Collagen I ist ein Indikator in der frühen Phase der Knochenentwicklung
und kann als Frühindikator bei der Knochensynthese angesehen werden.
Die Bildung eines Knochens beginnt mit der Genese eines
Collagengerüstes, das primär aus Collagen I-Fasern besteht. Diese
Phase dauert ca. 10 Tage [17]. Daran schließt sich ein ca. 3-4 Monate
dauernder Mineralisationsvorgang an [17, 61]. Thorwarth et al. konnten in
ihrer Studien nachweisen, das Collagen I ein Frühindikator der
Knochenbildung ist. Nach zwei Wochen wird das Maximum in der
Collagen I-Expression erreicht. Nach 1 Monat fallen diese Werte im
gesunden Organismus ab [61]. In dieser Studie konnten in der gesunden
Tiergruppe sowohl bei den unbeschichteten als auch bei den
beschichteten Implantaten nach einer Woche ein erhöhter Wert bei der
ersten Messung festgestellt werden, der dann bei der zweiten Messung
absank (unbeschichtete Implantate 51,3% auf 35,3%, beschichtete
Implantate 48,0% auf 31,3%). Diese Daten werden durch Erkenntnisse
der Studie von Thorwarth et al. unterlegt und deuten auf eine früh
einsetzende Knochenbildung hin. Zum anderen zeigt der Vergleich der
Werte, dass auch bei diesem Parameter, der Collagen I-Expression, kein
41
Vorteil der beschichteten Implantate gegenüber den unbeschichteten
Implantaten festgestellt werden kann.
Daneben wurde in der immunhistologischen Untersuchung die
Osteocalcin-Expression als zweiter Parameter zur Bestimmung der
Osseointegration von Implantaten verwendet. Osteocalcin ist ein Marker
der späten Osteoblastenentwicklung, das in der späteren Phase der
Osteointegration gebildet wird [5]. Untersuchungen haben ergeben, dass
Osteocalcin am Anfang der Mineralisationsphase induziert wird und somit
deutlich nach der Expression zeitlich vorhergehender Marker wie Collagen
I [46]. Thorwarth et al. hat in seiner Studie beschrieben, dass das die
Mineralisation steuernde Protein Osteocalcin nach 3 Monaten sein
Expressionsmaximum erreicht und in den ersten Wochen nur in geringen
Mengen synthetisiert [61]. Die Analyse der Osteocalcin-Expression in
dieser Studie konnte in den stoffwechselgesunden Tieren weder bei den
unbeschichteten Implantaten (35,2% und 31,7%) noch bei den
beschichteten Implantaten (29,1% und 29,7%) entscheidende
Veränderung konstatieren. Dieses durfte auch auf Grund der zur
Verfügung stehenden Datenbasis der ersten 2 Wochen nicht erwartet
werden, da Osteocalcin ein später Marker der Osseointegration ist. Auch
im direkten Vergleich zwischen unbeschichteten und beschichteten
Implantaten kann kein signifikanter Vorteil aus Seiten der chemisch
modifizierten Implantate ermittelt werden.
Die immunhistologische Untersuchung dieser Studie unterlegen somit
beim Marker Collagen I-Expression die Resultate der Knochen-Implantat-
Kontakt-Wertebestimmung und der Knochendichtemessung. In
vergleichbaren wissenschaftlichen Studien bietet sich ein differenziertes
Bild. In den Studien von Lutz et al. [36, 62] konnten diese Parametern
ebenfalls keine eindeutig signifikanten Ergebnisse erbringen. Dagegen
untermauerten die beiden Marker in anderen Studien den Vorteil chemisch
modifizierter Implantatoberflächen bei der Osseointegration [40, 48]. Die
Zusammenschau der Untersuchungsparameter dieser Studie kann
dagegen mit den ermittelten Vergleichsdaten nicht belegen, dass bei der
Osseointegration ein Vorteil beschichteter gegenüber unbeschichteter
Implantate besteht.
42
Primäres Ziel dieser Studie war die Beschreibung des Einflusses einer mit
P-15 beschichteten Implantatoberfläche auf die Osseointegration im
diabetischen Tiermodell. Die Resultate der stoffwechselgesunden
Tiergruppe gilt es nun mit der Datenbasis der diabetischen Tiergruppe in
Korrelation zu stellen.
Bei der Bewertung der verschiedenen Parameter der diabetischen
Tiergruppe ist von der Beobachtung auszugehen, dass ein unbehandelter
Diabetes die Osseointegration von Implantaten negativ beeinflusst [29].
Wissenschaftliche Studien belegen, dass Diabetes den
Knochenheilungsprozess später eintreten lässt [22, 28]. Dieses zeigt sich
auch bei den mikroradiographischen Werten der Knochendichte [21]. Die
verschlechterte Osseointegration von Implantaten zeigt sich ebenso in
niedrigeren Werten der Knochen-Implantat-Kontakt-Bestimmung (KIK-
Wert) [40]. Ferner haben Studien aufgezeigt, dass eine eingeschränkte
Expression von Osteocalcin bei Diabetserkrankung eintritt [33, 35, 42, 60].
Studien von Colombo et al. haben aufgezeigt, dass im diabetischen
Organismus eine verspätete Knochenformation aufgewiesen werden kann
[11]. Zwar verzögert sich der Einheilungsprozess eines Implantates bei
einem diabetischen Tiermodell, aber am Ende des Prozesses können
keine Differenzen zwischen gesunden und diabetischen Tiermodellen im
Knochen-Implantat-Resultat ausgemacht werden [31]. Der Einfluss des
Implantatortes wird in verschiedenen Studien hervorgehoben. Neben der
Schädelkalotte wurde auch der Ober- und/oder Unterkiefer des Schweines
gewählt, was sich auf die Parameterwerte bei Bestimmung der
Osseointegration auswirkte. Es zeigte sich, dass in diabetischen
Tiermodellen die Kalotte eine Osseointegration gegenüber dem Ober- und
Unterkiefer befördert [40]. Eine Erklärung findet dieser Sachverhalt in der
sich differierenden Knochenbeschaffenheit von Schädelkalotte und Ober-
und Unterkiefer [63]. Stellen wir die ermittelten Werte dieser Studien in
diesen wissenschaftlichen Kontext, so unterlegen und verdeutlichen die
anderen Studien die hier ermittelten Resultate. In der
mikroradiographischen Analyse zur Bestimmung des Knochen-Implantat-
Kontaktes liegt die diabetische Tiergruppe sowohl bei den beschichteten
Implantaten als auch bei den unbeschichteten Implantaten hinter den
43
Werten der stoffwechselgesunden Tiergruppe (Bioplus: 30,3% und 29,4%
gegenüber 41,3% und 27,4%; Plus: 26,0% und 30,6% gegenüber 39,7%
und 40,7%). Ebenso können bei der Betrachtung der immunhistologischen
Werte, insbesondere der Bestimmung der Collagen I-Expression,
niedrigere Werte bei allen Implantatoberflächen der diabetischen
Tiergruppe beschrieben werden (Bioplus: 35,9% und 38,6% gegenüber
48,0% und 31,3%; Plus: 29,0% und 34,3% gegenüber 51,3% und 35,3%)
Bei der Osteocalcin-Expression, einem späten Parameter in der
Osseointegration, und der Knochendichtebestimmung bieten die
ermittelten Daten keine interpretierbare Wertegrundlage. In der
Zusammenschau der verschiedenen Parameter spiegelt diese Studie die
Ergebnisse anderer Studien wieder, dass Diabetes die Osseointegration
negativ beeinflusst. Der direkte Vergleich der einzelnen Werte im
Gegenüber von unbeschichteten und beschichteten Implantaten belegt
auch bei der diabetischen Tiergruppe keinen ausweisbaren Vorteil der
beschichteten Implantate. Sowohl in der gesunden als auch in der
diabetischen Tiergruppe konnten in dieser Untersuchung die beschichten
Implantate keinen signifikanten Vorteil erzielen.
Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass die Analyse und der
Vergleich von wesentlichen Parametern der Osseointegration die
wissenschaftlichen Ergebnisse einer negativen Beeinflussung von
unbehandelter Diabetes auf die Einheilung von Implantaten bestätigen.
Daneben konnte in dieser Studie auf der vorhandenen Datenbasis im
Vergleich von unbeschichteten und mit synthetischem Peptid (P-15)
beschichteten Implantatoberflächen, sowohl in der stoffwechselgesunden
als auch in der diabetischen Tiergruppe, kein signifikanter Unterschied bei
der Osseointegration ermittelt werden. Unter Berücksichtigung der
Übertragbarkeit der in dieser Tierstudie gewonnenen Erkenntnisse auf den
Menschen lässt sich konstatieren: Die mit P-15 beschichteten Implantate
bieten gegenüber den unbeschichteten Implantaten in der Verwendung
bei Diabetikern keinen Vorteil.
44
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52
9. Verzeichnis benutzter Abkürzungen
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
aq. dest. aqua destillata
BGP bone γ-carboxylglutamic acid-containing protein
Bit binary digit
BV/TV bone volume / tissue volume ratio
dpi dots per inch
i.m. intramuskulär
KIK Knochen-Implantat-Kontakt
LSAB-Methode Labelled-(Strept-)Avidin-Biotin-Methode
OC Osteocalcin
ROI Region of Interest
Tiff Tagged Image File Format
53
10. Anhang
10.1. Herstellung der Gebrauchslösungen
Färbeprotokoll Toluidinblau-O: Zeitdauer Arbeitsschritte
Objektträger in Glasküvetten einlegen
15 min Präparate in 30%iger H202 Lösung
5 min Unter fließendem Leitungswasser
Trocknen der Präparate mit Papiertüchern
12 min Färbung in Toluidinblau-O
5 min Unter fließendem Leitungswasser
Lichtgeschützte Lagerung der Proben
Rezept Toluidinblau-O
Ansatz A
800 ml aq. dest.
8 g Di-Natrium-Tetraborat Borax (Merck 106306)
8 g Toluidinblau-O (Chroma 1B481)
15 min rührend mischen
Ansatz B
200ml aq. dest.
2 g Pyronin G (Merck 107518)
Ansatz A + B
15 min rührend mischen
15 min Ansatz A und B vermischen und 2-mal filtrieren
14 Tage Lichtgeschützt reifen lassen
54
Färbeprotokoll für Osteocalcin
Osteocalcin (Takara M041, OC4-30)
Zeit Temperatur Arbeitsschritt
3x20 min RT MEA Entacrylierung
RT Alkoholreihe und aq. dest. Bad
20 min RT EDTA 10%
10 min RT Fließendes Wasser
3x2 min RT aq. dest.
3x2 min RT Dako Waschpuffer pH7,4 (Dako S3006)
25 min 100°C Citratpuffer pH 6,0 (Dako S2369)
25 min RT auskühlen
3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)
15 min RT Avidin (Dako X0590)
15 min RT Biotin (Dako X0909)
1 h RT Osteocalcin, 1:10.000 Primärer Antikörper
15 min RT Sekundärer Antikörper
15 min RT Streptavidin-AP-Komplex
8 min RT Chromogen Red K5005
6 min RT Chromogen Red 2 K5005
10 min RT aq. dest.
5 min RT Hämalaun (Dako S3301)
5 min RT Fließendes Wasser
5 min RT aq. dest.
55
Färbeprotokoll für Collagen
Collagen I (Abcam ab6308)
Zeit Temperatur Arbeitsschritt
3x20 min RT MEA Entacrylierung
RT Alkoholreihe und aq. dest. Bad
20 min RT EDTA 10%
10 min RT Fließendes Wasser
3x2 min RT aq. dest.
3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)
25 min 100°C Citratpuffer pH 6,0 (Dako S2369)
25 min RT auskühlen
3x2 min RT Dako Waschpuffer pH 7,4 (Dako S3006)
15 min RT Avidin (Dako X0590)
15 min RT Biotin (Dako X0909)
1 h RT Collagen 1, 1:10.000 Primärer Antikörper
15 min RT Sekundärer Antikörper
15 min RT Streptavidin-AP-Komplex
8 min RT Chromogen Red K5005
6 min RT Chromogen Red 2 K5005
10 min RT aq. dest.
5 min RT Hämalaun (Dako S3301)
5 min RT Fließendes Wasser
5 min RT aq. dest.
56
11. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Hendrik ter Stal
Wohnort: Frohsinnstraße 9, 63739, Aschaffenburg
Geburtsdatum: 09.02.1986
Eltern: Günther ter Stal und Fenna ter Stal
Familienstand: ledig
Staatsangehörigkeit: deutsch
Konfession: evangelisch-reformiert
Schulbildung:
1992 - 1996 Besuch der Primarstufe in Hoogstede
1996 - 1998 Besuch der Orientierungsstufe in Emlichheim
1998 - 2002 Besuch der Sekundarstufe 1 in Emlichheim
2002 - 2005 Besuch der Sekundarstufe 2 in Neuenhaus
07.05.2005 Abitur am Lise-Meitner-Gymnasium in Neuenhaus
Wehrdienst:
07 - 10.2005 Grundausbildung im 2./VAZ 163 in Lingen (Ems).
10 - 03.2006 Dienstzeit in der Stab & Stabskompanie Log Brig 1 EK in
Delmenhorst
Hochschulstudium:
04.2006 Beginn des Studiums der Zahnmedizin an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
2007 Naturwissenschaftliche Vorprüfung
2009 Zahnärztliche Vorprüfung
2012 Zahnärztliche Prüfung
Beruf:
09.2012 Beginn der zahnärztlichen Tätigkeit in Aschaffenburg
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12. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl
Andreas Schlegel für die freundliche Überlassung des Themas und Herrn
Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam für die
Möglichkeit danken, die Dissertation in der Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
durchführen zu können.
Ferner gilt ein besonderer Dank meinem Betreuer, Herrn Dr.med. dent. Dr.
med. Rainer Lutz, für die engagierte Betreuung und fachliche
Unterstützung.
Abschließend danke ich meinen Eltern, meiner Freundin und meinen
studentischen Freunden für ihre motivierende Anteilnahme.