Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine von Marchantia polymorpha L. (Brunnenlebermoos):
Identifizierung und Charakterisierung der sie codierenden Genfamilie
Dissertation
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
- Dr. rer. nat. -
dem Fachbereich Biologie/Chemie der
Universität Bremen
vorgelegt von
Dipl.-Biol. Ina Groke
aus Ahlden (Aller)
Bremen
Januar 2002
Die Arbeiten wurden in der Zeit von September 1998 bis Januar 2002 in der Arbeitsgruppe von
Prof. Dr. F. Koe nig an der Universität Bremen und in der Arbeitsgruppe von Dr. S. Jansson an
der Universität Umeå (Schweden) durchgeführt.
Erster Gutachter: Prof. Dr. F. Koenig (Universität Bremen)
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. H. Grimme (Universität Bremen)
Tag des öffentlichen Kolloqiums: 08.02.2002
für Lena
4
INHALT
1 EINLEITUNG ________________________________________________________ 10
1.1 Oxygene Photosynthese________________________________________________ 10
1.2 Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen_________________ 11
1.2.1 Struktur und Funktion__________________________________________________12
1.2.2 Antennensystemtypen und ihre Verbreitung _________________________________15
1.3 Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen_____________ 15
1.3.1 Chlorophyll a/b bindende Proteine ________________________________________17
1.3.1.1 Struktur ___________________________________________________________18
1.3.1.2 Ausgewählte Eigenschaften____________________________________________20
1.3.1.3 Genfamilie der CAB-Proteine __________________________________________23
1.4 Fragestellung und Zielsetzung __________________________________________ 25
2 MATERIAL UND METHODEN _________________________________________ 27
2.1 Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht ___________________________________ 27
2.1.1 Thalluskulturen von M. polymorpha_______________________________________27
2.1.1.1 Kulturbedingungen __________________________________________________27
2.1.1.2 Anlage von Sterilkulturen _____________________________________________28
2.1.1.3 Starklichtexposition__________________________________________________29
2.2 Pigmentanalytik______________________________________________________ 29
2.2.1 Chlorophyllbestimmung ________________________________________________29
2.3 Molekularbiologische Methoden_________________________________________ 30
2.3.1 Bakterienstämme und Vektoren __________________________________________30
2.3.1.1 Anzucht der Bakterien________________________________________________31
2.3.1.2 Dauerkulturen von Bakterien___________________________________________31
2.3.2 Isolierung von Nukleinsäuren ____________________________________________32
2.3.2.1 RNA _____________________________________________________________32
2.3.2.2 Plasmid -DNA ______________________________________________________33
2.3.2.2.1 Präparation von Plasmiden mit geringerem Reinheitsgrad (Boiling-Methode) _____33
2.3.2.2.2 Präparation von Plasmiden mit hohem Reinheitsgrad _______________________33
Inhaltsverzeichnis 5
2.3.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren _______________________________________34
2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen____________________________34
2.3.5 Agarosegelelektrophorese_______________________________________________35
2.3.5.1 Auftrennung von DNA _______________________________________________35
2.3.5.2 Auftrennung von RNA________________________________________________35
2.3.5.2.1 Gelelektrophorese von mit Glyoxal denaturierter RNA ______________________36
2.3.5.2.2 Gelelektrophorese von mit Formaldehyd denaturierter RNA __________________36
2.3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ________________________________________37
2.3.6.1 Oligonukleotidprimer ________________________________________________37
2.3.7 RT-PCR ____________________________________________________________38
2.3.7.1 Reverse Transkription (RT) ____________________________________________38
2.3.7.2 Standardbedingungen für die PCR _______________________________________38
2.3.7.3 PCR für die Amplifikation von DNA-Sonden ______________________________39
2.3.8 Klonierung von DNA-Fragmenten ________________________________________40
2.3.8.1 Isolierung der Insert-DNA _____________________________________________40
2.3.8.2 Vorbereitung des Vektors _____________________________________________40
2.3.8.3 Ligation___________________________________________________________41
2.3.8.4 Herstellung kompetenter Zellen_________________________________________41
2.3.8.5 Transformation von E. coli ____________________________________________41
2.3.8.6 Blau-weiß Selektion _________________________________________________42
2.3.9 DNA-Sequenzierung __________________________________________________42
2.3.10 Northernblot-Analyse _________________________________________________43
2.3.10.1 Transfer von RNA auf Nylonmembranen_________________________________43
2.3.10.2 Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden ___________________________44
2.3.10.3 Hybridisierung_____________________________________________________44
2.3.10.4 Detektion von Hybridisierungen mittels Autoradiographie ____________________45
2.3.10.5 Entfernen radioaktiver Signale vor einer erneuten Hybridisierung ______________45
2.3.11 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels ESTs ________________________45
2.3.11.1 cDNA Bibliotheken _________________________________________________46
2.3.11.1.1 Herstellung ______________________________________________________47
2.3.11.1.2 Titerbestimmung__________________________________________________49
2.3.11.2 In vivo-Excision von pTriplEx2 aus λTriplEx2 ____________________________50
2.3.11.3 Anzucht der EST-Klone______________________________________________51
2.3.11.4 Sequenzierung aus EST-Klonen isolierter Plasmid -DNA _____________________51
2.3.11.5 Verarbeitung von Sequenzdaten: Bioinformatik ____________________________52
Inhaltsverzeichnis 6
ERGEBNISSE ___________________________________________________________ 54
3.1 Strategien zur Identifizierung einzelner Mitglieder der cab-Genfamilie _________ 54
3.1.1 RT-PCR ____________________________________________________________55
3.1.2 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels „expressed sequence tags“_________58
3.1.2.1 Bioinformatische Analyse der EST-Sequenzen _____________________________59
3.1.2.2 ESTs mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen __________________________________60
3.2 Zusammensetzung der cab-Genfamilie von M. polymorpha ___________________ 62
3.2.1 Proteine des LHCI ____________________________________________________65
3.2.2 Proteine des LHCII____________________________________________________67
3.2.2.1 Lhcb1-3___________________________________________________________67
3.2.2.2 Lhcb4-Lhcb6 _______________________________________________________76
3.2.3 Verwandte der cab-Genfamilie ___________________________________________82
3.2.3.1 PsbS _____________________________________________________________82
3.2.3.2 Sep1 ähnliches Protein________________________________________________83
3.2.4 Analyse der Expression einzelner cab-Gene _________________________________84
3.2.4.1 diurnale Expression einzelner cab-Gene __________________________________85
3.2.4.2 Auswirkung von Lichtstress auf die Genexpression des Sep1-ähnlichen Gens ______86
4 DISKUSSION_________________________________________________________ 88
4.1 Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha __________ 88
4.2 Analyse der CAB-Proteinsequenzen______________________________________ 92
4.2.1 Lhca4 ______________________________________________________________93
4.2.2 LHCII1.1-1.4, Lhcb2, Lhcb3 ____________________________________________94
4.2.3 Lhcb4-6 ____________________________________________________________96
4.2.4 Verwandte der cab-Genfamilie ___________________________________________97
4.3 Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha__________________________ 99
4.3.1 Diurnale Expression ___________________________________________________99
4.3.2 Veränderte Expression des Sep1-ähnlichen Gens bei Lichtstress _________________101
4.4 Ausblick ___________________________________________________________ 101
5 ZUSAMMENFASSUNG _______________________________________________ 103
Inhaltsverzeichnis 7
6 LITERATURVERZEICHNIS___________________________________________ 105
7 ANHANG ___________________________________________________________ 119
DANKSAGUNG_________________________________________________________ 127
8
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A. bidest - deionisiertes, dann 2x destilliertes Wasser
Amp, Ampr - Ampicillin, ampicillinresistent
A. thaliana - Arabidopsis thaliana
ATP - Adenosintriphosphat
BNN132 - Bakterienstamm (E. coli)
bp - Basenpaare
CAB - Chlorophyll a/b bindendes Protein
cDNA - complementary DNA - komplementäre DNA
Chl - Chlorophyll
CP - Chlorophyll-bindendes Protein
Cyt b6/f - Cytochrom b6/f-Komplex
DEPC - Diethylpyrocarbonat
DMSO - Dimethylsulfoxid
DMF - N,N’-Dimethylformamid
DNA - Desoxyribonucleicacid – Desoxyribonukleinsäure
E. coli - Escherichia coli
EDTA - Ethylentetraamineessigsäure
ELIP - early light inducible protein - frühes lichtinduziertes Protein
EST - expressed sequence tags – exprimierte Sequenzbereiche
HLIP - high light inducible protein - Starklicht induziertes Protein
IPTG - Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
K - Kelvin
Kan, Kanr - Kanamycin, kanamycinresistent
kDa - Kilodalton
LB - Luria-Bertani (Medium für Bakterien)
Lil - light harvesting like
LHC-Protein - light harvesting complex – Lichtsammelkomplex
M. polymorpha - Marchantia polymorpha
mRNA - messenger RNA - Boten-RNA
MCS - multiple cloning site - Polylinker
MOPS - Morpholinopropansulfonsäure
MSK2 - Nährmedium zur Kultur von Pflanzen
NPQ - nicht photochemisches Quenching
9
OD - optische Dichte
PCR - polymerase chain reaction - Polymerasekettenreaktion
pfu - plaque forming unit - Plaque-bildende Einheit
PSI - Photosystem I
PSII - Photosystem II
RNA - ribonucleiacid - Ribonukleinsäure
rpm - rotations per minute - Umdrehungen pro Minute
RT - Reverse Transkription
SDS - sodium dodecyl sulfate - Natriumdodecylsulfat
SMART - switch mechanism at the 5’ end of RNA transcripts
SSC - standard saline-citrate
TAE - Tris-Acetat-EDTA-Puffer
Tet, Tetr - Tetracyklin, tetracyklinresistent
U - unit - Einheit der Enzymaktivität
UV - Ultraviolett
X-GAL - 5-Bromo-4-chloro-3- indoyl-β-D-galctopyranosid
XL1-Blue - Bakterienstamm (E. coli)
XL1-Blue MRF’ - Bakterienstamm (E. coli)
V - Volt
10
1 Einleitung
1.1 Oxygene Photosynthese
Photoautotrophe Organismen vermögen die Lichtenergie der Sonne in chemisch gebundene
Energie umzuwandeln. Bei diesem als Photosynthese bezeichneten Prozeß werden aus einfachen
anorganischen Substanzen mit Hilfe der Energie absorbierter Strahlung energetisch höherwertige
organische Moleküle synthetisiert. Bei der cyanobakteriellen und pflanzlichen Photosynthese ist
die Reduktion von Kohlendioxid zu Kohlehydraten mit der photoinduzierten Oxidation von
Wasser unter Freisetzung von molekularem Sauerstoff gekoppelt. Für den Gesamtvorgang ergibt
sich die folgende Gleichung (Formel 1):
6 CO2 + 12 H2O � C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2 ÄG° = 2868 kJ Formel 1
Grundvoraussetzung für die Fähigkeit zur photoinduzierten Oxidation von Wasser ist die
Erzeugung eines genügend hohen Redoxpotentials. Dies ist bei Cyanobakterien und Pflanzen
durch das Hintereinanderschalten von zwei in Serie arbeitenden Photosystemen verwirklicht.
Photosysteme sind membrangebundene Multiproteinkomplexe, die sich aus einem Kernkomplex
mit integralem Reaktionszentrum und einem Lichtsammlerkomplex zusammensetzen.
Gemeinsam mit zwei weiteren membrangebundenen Multiproteinkomplexen dem
Cytochrom b6/f-Komplex (Cyt b6/f) und der ATP-Synthase vermitteln die Photosysteme I (PSI)
und II (PSII) unter Einbezug von beweglichen Elektronenüberträgern (Plastochinon,
Plastocyanin, Ferredoxin), die einzelnen Reaktionsschritte des photochemischen Teilprozesses
der oxgenen Photosynthese (Abb. 1).
Pigmente der Lichtsammlersysteme (Antennen) absorbieren Lichtquanten des sichtbaren
Bereichs des Lichtspektrums und leiten deren Energie schnell und effizient in Form von
Excitonen an die photochemischen Reaktionszentren weiter. An speziellen Chlorophyllen in den
Reaktionszentren (special pair) findet die primäre Ladungstrennung statt, und freigesetzte
Elektronen werden über eine Reihe verschie dener Elektronenakzeptoren bzw.
Elektronendonatoren weitergeleitet und schließlich in Form von Reduktionsäquivalenten
festgelegt. Das während des lichtgetriebenen Elektronenflusses durch den Protonentransport und
den sich dadurch aufbauenden Protonengradie nten gebildete elektrochemische Potential über der
Membran wird für die Synthese von Energieäquivalenten in Form von Adenosintriphosphat
(ATP) genutzt.
Einleitung 11
____________________ 1) Für die freien Substanzen wird im folgenden die Bezeichnung Chromophor verwendet, für die Chromophor-Protein-Komplexe der Begriff Pigment.
Bei Pflanzen sind die Multiproteinkomplexe des Photosyntheseapparates in das Thylakoid-
system der Chloroplasten eingebettet und auf unterschiedliche Bereiche dieses Membransystems
verteilt (ANDERSON & ANDERSON, 1988). Während sich das PSII vor allem in den dicht
gestapelten Granathylakoiden befindet, sind das PSI und die ATP-Synthase bevorzugt in den
Stromathylakoiden lokalisiert. Der Cyt b6/f-Komplex ist auf die beiden Membrandomänen
relativ gleich verteilt.
Abb. 1: Vereinfachte Darstellung des photosynthetischen Elektronentransportes bei Pflanzen. Grau: plastidenkodierte Proteine, weiß: kernkodierte Proteine. Die einzelnen Komponenten der Multiprotein-komplexe tragen die Bezeichnung des für sie kodierenden Gens, einige auch die des Proteins (Schema vereinfacht nach HERRMANN 1996).
1.2 Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen
Der überwiegende Teil der an der Photosynthese beteiligten Chromophore ist in den Antennen
organisiert. Dadurch erhöhen Antennen den Absorptionsquerschnitt der Reaktionszentren um ein
Vielfaches. Drei Klassen von Chromophoren sind für die Absorption von Lichtquanten und die
Weiterleitung der Energie in Antennen oxygener photosynthetischer Organismen von
Bedeutung: die Chlorophylle, die Phycobiline und die Carotinoide. Alle diese Chromophore sind
in Form wohl definierter Chromophor -Protein-Komplexe organisiert1.
Durch die Zahl und die spektralen Eigenschaften der enthaltenen Chromophore erlauben
Antennen eine flexible Anpassung des Photosyntheseapparates an unterschiedliche
Einleitung 12
Lichtbedingungen. Somit stellen sie das wesentliche adaptive Element dar, das dem
Photosyntheseapparat ermöglicht, möglichst effizient zu arbeiten.
In Anbetracht der Bedeutung der Photosynthese für die heutige Vielfalt an Lebensformen auf der
Erde ist es wichtig, ein möglichst umfassendes Verständnis zur Funktionsweise
photosynthetischer Antennensysteme zu entwickeln.
1.2.1 Struktur und Funktion
Ein Vergleich der heute bekannten photosynthetischen Systeme zeigt, daß die Evolution mehrere
verschiedene Lichtsammlersysteme hervorgebracht hat. Die funktionellen Anforderungen an die
verschiedenen Antennen sind jedoch gleich. Jede photosynthetische Antenne muß:
(i) Lichtenergie effizient absorbieren,
(ii) die Anregungsenergie schnell und möglichst verlustfrei an die photochemischen
Reaktionszentren weiterleiten bzw. auf diese verteilen,
(iii) überschüssige Lichtenergie zum Schutz vor photooxidativen Schäden ableiten.
Vielfalt herrscht vor allem bei den äußeren Antennensystemen. Neben den mit den
Kernkomplexen der Photosysteme assoziierten lichtsammelnden Komplexen (äußere Antennen),
beteiligen sich auch Pigmente der Kernkomplexe selbst an der Weiterleitung von
Anregungsenergie an die Reaktionszentren. Diese Lichtsammelproteine der Kernkomplexe,
werden als innere Antennen bezeichnet. Bei Pflanzen bilden die eng mit dem Reaktionszentrum
assoziierten Kernkomplexuntereinheiten CP43 und CP47, die innere Antenne des PSII. Sie
binden neben Carotinoiden vorwiegend Chlorophyll a (Chl a). Beim PSI hingegen ist die innere
Antenne integraler Bestandteil der Reaktionszentrumsuntereinheiten PsaA/B.
Die Organisation der Antennenchromophore in wohl definierten Chromophor-Protein-
Komplexen ist von enormer Bedeutung für ihre funktionellen Eigenschaften. Durch die Bindung
an Proteine, nicht kovalent (Chlorophylle und Carotinoide) oder kovalent (Phycobiline), werden
die spektralen Eigenschaften der Chromophore beeinflusst, sowie deren räumliche Anordnung
festgelegt (SIMPSON & KNOETZEL, 1996). Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die wichtigsten
Charakteristika der Gruppen photosynthetischer Chromophore oxygener Phototropher.
Einleitung 13
Tab. 1: Vorkommen und ausgewählte Charakteristika der Chromophore oxygener Phototropher.
Chromophor Organismen Vorkommen (RC, Kernantennen, periphere Antennen)
Funktion Absλmax [nm]1)
Emλmax [nm]1)
Chl a Cyanobakterien, Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen
� RC, Kernantennen � alle Komplexe � alle Komplexe � alle Komplexe � alle Komplexe
Lichtsammlung, Ladungstrennung in den RC
~ 440, ~ 670
680-730
Chl b Prochlorophyten Grünalgen Moose, Farne, Höhere Pflanzen
periphere Antennen
Lichtsammlung
~ 460, ~650
~ 660
Chl c Prochlorophyten Cryptophyten Chromophyten
periphere Antennen
Lichtsammlung
~ 400, (500-600)
~ 620
Chl d Prochlorophyten, Rotalgen
periphere (?) Antennen
Lichtsammlung
~ 440, ~ 690
~ 700
β-Carotin Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen
alle Komplexe
Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie
420-480
~ 700
Xanthophylle Pflanzen
periphere Antenne
Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie
400-500
1 ) in vivo
Die präzise Abstimmung der Abstände und Orientierungen der Antennenchromophore
zueinander ist insbesonders für den strahlungslosen Energietransfer an die Reaktionszentren
entscheidend.
Anregungsenergie muß in den Antennen über Distanzen von mehreren 100 Å transferriert
werden. Grundsätzlich kann die Weiterleitung von Excitonen in photosynthetischen Antennen
über zwei Mechanismen erfolgen, über den Förster- oder den Dexter-Mechanismus. Während
der Förster-Mechanismus einen Energietransfer über Entfernungen von bis zu 100 Å erlaubt, ist
über den Dexter-Mechanismus nur ein Transfer über kürzere Entfernungen von bis zu 20 Å
möglich (SAUER 1986, VAN GRONDELLE et al. 1994).
Dem Förster-Mechanismus liegt eine Resonanzinduktion von Dipolen ohne die wirkliche
Verschiebung von Elektronen zugrunde, der Mechanismus des Dexter-Transfers hingegen ist ein
vollständig anderer (Abb. 2). Hier werden Elektronen zwischen einem Donor-Chromophor und
einem Akzeptor-Chromophor getauscht („Austauschmechanismus“). Aus dem angeregten
Zustand des Donors wechselt ein Elektron zum angeregten Zustand des Akzeptors, während ein
Elektron aus dem Grundzustand des Akzeptors zum Grundzustand des Donors wechselt
(HOLZWARTH 1999). Antennen müssen nicht nur in der Lage sein, Lichtenergie effizient zu
Einleitung 14
absorbieren und weiterzuleiten, sondern sie müssen auch überschüssige Energie wieder abgeben
können. Wird mehr Lichtenergie von den Antennen absorbiert als durch den
Photosyntheseapparat genutzt werden kann, kommt es infolge eines zu hohen Reduktionsgrades
der Elektronentransportkette zur Verminderung der Quantenausbeute. Die relativ lange
Lebensdauer der angeregten Zustände in den Chromophoren, die ja einerseits entscheidend für
die Effizienz der Lichtabsorption ist, birgt zugleich die Gefahr der Bildung von
Triplettzuständen. Chlorophylle im Triplettzustand führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffe wie
Singulett-Sauerstoff, die die oxidative Zerstörung von Pigmenten und Proteinen bedingen
(HOLZWARTH 1999).
Eine große Bedeutung bei der Dissipitation überschüssiger Energie wird den Carotinoiden
zugeschrieben (SIEFERMANN-HARMS 1987, DEMMING-ADAMS 1990, YOUNG 1991, NIYOGI
1999). Carotinoide sind sowohl in photosynthetischen Antennen als auch in den
Reaktionszentren vorhanden. Sie vermögen nic ht nur als Lichtsammlerpigmente zu fungieren,
sondern auch mit Triplett-Chlorophyll oder Singulett-Sauerstoff zu reagieren und die
übernommene Energie als Wärme abzugeben (SIEFERMANN-HARMS 1987, YAMAMOTO & BASSI
1996). Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus, der in den Antennen das Umschalten
zwischen Energietransfer und Energiedissipitaion steuert, ist aber noch nicht verstanden
(HORTON, 1996).
Auch durch die variable Umverteilung von Anregungsenergie zwischen den Photosystemen kann
ein zu hoher Energietransfer zu den Reaktionszentren verhindert werden. Die Phosphorylierung
der Trimere bildenden Lichtsammelproteine Lhcb1 und Lhcb2 im N-terminalen Bereich
(BENNETT 1991, ALLEN 1992, ALLEN & NIELSON 1997) führt bei Pflanzen zur Ablösung dieser
Abb. 2 : Mechanismen des Energie-transfers in photosynthetischen Antennen. a): Förster-Mechanismus. B): Dexter-Mechanismus. Die kurzen, roten Pfeile symbolisieren die Spin-Zustände der beteiligten Elektronen in den ent-sprechenden Molekülorbitalen bzw. Elek-tronenzuständen (horizontale Linien). Die roten gebogenen Pfeile geben den Übergang der entsprechenden Elektronen an, die beim Energietransfer beteiligt sind.
Einleitung 15
_____________________________ 1) der LHCII ist die periphere Antenne des PSII bei Pflanzen (siehe auch 1.3)
Proteine von der peripheren Antenne des PSII (SCHUSTER et al. 1986). Diese Proteine migrieren
dann von den Grana- in die Stromabereiche des Thylakoidsystems und lagern sich dort an das
PSI an (MCCORMAC et al. 1994), wo sie wieder als Antennen fungieren. Die Veränderung der
Verteilung der Trimere des Lichsammelkomplexes II (LHCII)1) zwischen den Photosystemen
wird auch als state transitions bezeichnet (ANDERSON 1986, ANDERSON & ANDERSON 1988,
MELIS 1991, ALLEN 2001).
1.2.2 Antennensystemtypen und ihre Verbreitung
Äußere Antennen lassen sich generell in membranextrinsiche und membranintrinsische
Antennen unterscheiden.
Membranextrinsiche Phycobilinantennen finden sich in Cyanobakterien, Cryptophyceen und
Rotalgen. Nur durch einen kleinen Membrananker sind diese Antennen mit den
photosynthetischen Membranen verbunden. Aufgrund der spektralen Eigenschaften der
gebundenen Phycobiline können membranextrinsische Antennen grünes Licht effizienter nutzen,
als dies membranintrinsischen Antennen vermögen.
Diese hingegen benötigen viel weniger Protein pro Chromophor als membranextrinsiche
Antennen und können aufgrund ihres hohen Chromophor zu Protein-Verhältnisses mit relativ
geringem Aufwand an Proteinsynthese hohe Absorptionskapazitäten erreichen.
Die Chromophoren membranintrinsischer Antennen sind verschiedene Chlorophylle und
Carotinoide. Membranintrinsische Chlorophyll a/b bindende Antennen sind für prokaryotische
Prochlorophyten sowie für eukaryotische Chlorophyten, Moose, Farnpflanzen und Höhere
Pflanzen charakteristisch. Fucoxanthin Chlorophyll a/c bindende Antennensysteme finden sich
in Chromophyten.
1.3 Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen
Lichtsammelproteine mit drei membrandurchspannenden Helices bilden die mit den
Kernkomplexen der Photosysteme der Pflanzen assoziierten Lichtsammelkomplexe, die als
LHCs (light harvesting complexes) bezeichnet werden. Die kerncodierten, verschiedene
Chlorophylle und Carotinoide bindenden Lichtsammelproteine dieser LHC-Komplexe zeichnen
sich durch einen hohen Grad an Sequenzhomologie aus. Deshalb werden sie als eine
Proteinfamilie und die zugehörigen Gene als Genfamilie angesehen (GREEN et al. 1991, GREEN
& DURNFORD 1996). Die Kurzbezeichnung für die Mitglieder der Proteinfamilie lautet Lhc-
Einleitung 16
Proteine, abgeleitet von der englischen Bezeichnung Light harvesting chlorophyll proteins
(PICHERSKY & JANSSON 1996). Zu bedenken ist, daß der Begriff Lhc-Proteine weiter gefaßt ist
und ebenfalls die chloroplastencodierten Chl a bindenden Lichtsammelproteine der
Kernkomplexe (innere Antennen), die einer eigenen Proteinfamilie zugehören, mit einschließt.
Die strukturellen und funktionellen Gemeinsamkeiten der kerncodierten Lhc-Proteine lassen die
Entwicklung aus einem gemeinsamen Vorläufer vermuten (DURNFORD et al. 1999).
MULKIDJANIAN & JUNGE (1997) postulieren die Entwicklung der Reaktionszentren und
membranintrinsicher Lichtsammelproteine aus einem Vorläuferprotein mit zehn
membrandurchspannenden Helices, wie es noch im Reaktionszentrum der Heliobacteriaceae
konserviert ist. Dieses Protein soll ursprünglich als UV-Protektor fungiert haben.
Nach der Endosymbiontentheorie sind Chloroplasten aus von Eukaryoten inkorporierten
Cyanobakterien hervorgegangen. Ob LHCs bzw. ihre Proteine bereits in Cyanobakterien
entwickelt wurden, ist unklar. Die charakteristischen Antennen der Cyanobakterien, die
Phycobilisomen, sind membranextrinsiche Antennen. Zwar wurden in Cyanobakterien erst
kürzlich zusätzliche membranintrinsiche Antennen um das PSI nachgewiesen (BOEKEMA et al.
2001, BIBBY et al. 2001) , bei diesen handelt es sich jedoch nicht um LHCs. Die
Proteinkomponente dieser unter Eisenmangelbedingungen identifizierten intrinsischen Antenne
bindet Chl a und weist starke Sequenzhomologie zur CP43 Untereinheit der Kernantenne um das
PSII auf.
Bei Rotalgen jedoch, die ebenfalls Phycobilisomen als äußere Antennen nutzen, konnten LHCs
nachgewiesen werden (WOLFE et al. 1994, TAN et al. 1997 a, TAN et al. 1997 b). Diese sind
spezifisch mit dem PSI assoziiert (MARQUARDT & RHIEL 1997). Die Proteine dieser LHCs lassen
sich aufgrund der vorhandenen Sequenzhomologie der Proteinfamilie der kerncodierten Lhc-
Proteine zuordnen. Dies läßt vermuten, daß diese Proteine vor der getrennten Entwicklung der
Rot- und Grünalgen entstanden sind. Die Coexistenz von Phycobilisomen und LHCs unterstützt
allerdings nachhaltig den gemeinsamen evolutionären Ursprung aller Chloroplasten (DURNFORD
et al. 1999). Auch die erst vor wenigen Jahren entdeckten, zu den Cyanobakterien zählenden
Prochlorophyten weisen aufgrund ihrer Chromophorzusammensetzung auf eine direkte
Verwandschaft der Cyanobakterien und Chloroplasten hin. Prochlorophyten besitzen anstelle
von Phycobilisomen Chlorophyll a/b bindende Antennen (PALENIK & HASELKORN 1992,
MATTHIJS et al. 1994, POST & BULLERJAHN 1994). Allerdings handelt es sich nicht um LHCs.
Die Chlorophyll a/b bindenden Proteine dieser Antennen weisen starke Sequenzhomologie zu
den Proteinen der IsiA Gene des Cyanobakteriums Synechococcus sp. PCC7942 auf (LA ROCHE
et al. 1996). Diese wiederum sind dem Chl a bindenden CP43 Protein Höherer Pflanzen
verwandt.
Einleitung 17
1.3.1 Chlorophyll a/b bindende Proteine
Seit der ersten Isolierung eines Chlorophyll a/b bindenden (CAB) Proteins durch THORNBER
(1975) sind zahlreiche CAB-Proteine einschließlich der sie codierenden Gene (cab-Gene)
beschrieben und charakterisiert worden.
Zehn verschiedene Typen lassen sich unterscheiden (JANSSON et al. 1992, JANSSON 1994),
wovon vier ausschließlich mit PSI und sechs in der Regel mit PSII assoziiert sind. Sie sind die
Genprodukte der kerncodierten Lhc-Gene und tragen die Bezeichnung Lhca1-Lhca4 für die mit
PSI bzw. Lhcb1-Lhcb6 für die mit PSII assoziierten Proteine. Zwei weitere Gensequenzen,
Lhca5 und Lhca6, wurden für Arabidopsis thaliana beschriebenen und lassen die Existenz
weiterer CAB-Proteine vom Lhca-Typ vermuten (JANSSON 1999).
Abbildung 3 zeigt die derzeitigen Modellvorstellungen zur Organisation der verschiedenen
Antennenpigmente des PSI bzw. des PSII bei Höheren Pflanzen. Zahlreiche verschiedene
Nomenklaturen haben sich im Zuge der Erforschung der CAB-Proteine ergeben, die leider nur
unnötig verwirren. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über die verschiedenen Nomenklaturen. In der
vorliegenden Arbeit wird in der Regel die Nomenklatur von JANSSON (1994) verwendet.
Tab. 2: Nomenklaturen für die zehn verschiedenen Typen von CAB-Proteinen
Gen GREEN et al. 1991 THORNBER et al. 1991 BASSI et al. 1990 JANSSON 1994
Lhca1 Type I LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca1
Lhca2 Type II LHCI ? LHCI-680 Lhca2
Lhca3 Type II LHCI LHC Ia LHCI-680 Lhca3
Lhca4 Type IV LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca4
Lhcb1 Type I LHCII LHC IIb 28 kDa LHCII Lhcb1
Lhcb2 Type II LHCII LHC IIb 27 kDa LHCII Lhcb2
Lhcb3 Type II LHCII LHC IIb 25 kDa LHCIIa Lhcb3
Lhcb4 Type II CP29 LHC IIa CP29 Lhcb4
Lhcb5 Type I CP29 LHC IIc CP26 Lhcb5
Lhcb6 CP24 LHC IId CP24 Lhcb6
Einleitung 18
A B
Abb. 3: Modellvorstellung zur Organisation der Antennenproteine des PSI (A) bzw. PSII (B) am Beispiel Höherer Pflanzen (A: aus SCHELLER et al. 2001; B: aus JANSSON 1994).
1.3.1.1 Struktur
Jedes der zehn verschiedenen CAB-Proteine besitzt vier α-helicale Domänen: drei
membrandurchspannende, von denen die erste und die dritte homolog zueinander sind und eine
vierte, viel kürzere und Lumen exponierte. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der
Struktur des Lhcb1-Proteins der Erbse, dessen atomare Struktur von KÜHLBRANDT und
Mitarbeitern (1994) durch Elektronenbeugung an zweidimensionalen Kristallen bestimmt wurde.
Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung der verschiedenen CAB-Proteine wird diese
Kristallstruktur als Strukturmodell für alle CAB-Proteine herangezogen.
Die erste und die dritte Helix durchspannen die Thylakoidmembran in einem Winkel von
ca. 45 ° zueinander und werden durch Arginin -Glutamin Salzbrücken zusammengehalten. Eine
Folge von 22 Aminosäuren, die auch als „LHC-Motiv“ bezeichnet wird, ist in diesen Helices
hoch konserviert. Die Konsenssussequenz für dieses Sequenzmotiv lautet:
ELINGRLAMLGFGFLVPELIT. Fast sämtliche an der Chlorophyllbindung beteiligten
Aminosäuren sind in dieser hydrophoben Region lokalisiert. Bei der Chlorophyllbindung selbst
spielen neben Koordinationen mit den Aminosäuren Histidin, Glutamin und Asparagin auch
Einleitung 19
______________________________ 1) Die 1.-4. transmembrane Helix der CAB-Proteine werden vom Strukturmodell der Erbse abgeleitet und auch wie folgt bezeichnet: 1. Helix = B, 2. Helix = C, 3. Helix = A, 4. Helix = D.
Pigment/Pigment-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Eine weitere Bindungsstelle für
Chlorophylle, vermutlich für Chl b ist in der vierten, Lumen exponierten Helix lokalisiert
(KÜHLBRANDT et al. 1994).
Zwei eng mit den Helices eins und drei assoziierte Carotinoid-Moleküle stabilisieren die
Gesamtstruktur.1) Bei diesen handelt es sich um zwei Lutein-Moleküle (BASSI et al. 1993,
KÜHLBRAND et al. 1994).
Abb. 4: Schematische Darstellung der Struktur des Lhb1-Moleküls nach KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994). Die schraubenförmigen Bänder stellen die α-helicalen Bereiche des Proteins dar, dünne Fäden die verbindenden Loops. Der N-Terminus ist links oben und dem Stroma zugewandt, der C-Terminus links unten und dem Thylakoidlumen zugewandt. Die Zuordnung der Chlorophylle (Chl a schwarz, Chl b rot) und ihre Orientierungen sind bisher noch nicht gesichert.
CAB-Proteine besitzen außer den beiden Bindungstellen in der ersten und der dritten
transmembranen Helix noch weitere Carotinoid-Bindungsstellen, die zum Teil keine ausgeprägte
Spezifität für ein bestimmtes Carotinoid zeigen. Neben β-Carotin können sie die Xanthophylle
Neoxanthin, Violaxanthin und Lutein binden (SIEFERMANN-HARMS 1985, BASSI et al. 1993,
YAMAMOTO & BASSI 1996, BASSI & CAFFARRI 2000). Unterschiede zwischen verschiedenen
CAB-Proteinen bestehen sowohl was die Anzahl der gebundenen Chlorophylle als auch die Art
der gebundenen Carotinoide betrifft. So enthält ein Lhcb1-Molekül mindestens 12 Chlorophylle:
7 Chl a und 5 Chl b Moleküle (KÜHLBRANDT et al. 1994), während ein Lhcb4 Polypeptid nur
8 Chlorophylle bindet (6 Chl a, 2 Chl b) (SANDONA et al. 1998).
Einleitung 20
1.3.1.2 Ausgewählte Eigenschaften
In Anbetracht der ca. 350 Millionen Jahren konservierten, sehr komplexen Organisation der
Antennensysteme liegt die Vermutung nahe, daß jedem einzelnen CAB-Protein eine besondere
Funktion zukommt (JANSSON 1994). Seitens der differenzierten Funktionen der einzelnen CAB-
Proteine besteht jedoch noch ein enormer Aufklärungsbedarf. Es folgt eine kurze
Zusammenstellung ausgewählter Eigenschaften der verschiedenen Mitglieder der CAB-
Proteinfamilie.
Lhca1-4
Die vier CAB-Proteine Lhca1, Lhca2, Lhca3 und Lhca4 bilden den Lichtsammelkomplex I
(LHCI), die periphere Antenne des PSI von Pflanzen. Aufgrund der jeweils typischen Maxima
im Fluoreszenzemissionsspektrum bei 77 K wird zwischen zwei verschiedenen
Lichtsammelkomplexen unterschieden, dem LHCI-680 und dem LHCI-730. Die mit 22 kDa und
21 kDa zu den kleineren CAB-Proteinen zählenden Lhca1- und Lhca4-Proteine bilden
zusammen den Subkomplex LHCI-730. Die Bestandteile des LHCI-680 sind die
Antennenproteine Lhca2 und Lhca3 (KNOETZEL et al. 1992). Die exakte Position und die Anzahl
der Dimere an Lhca Proteinen, die den LHCI bilden, konnte jedoch bislang noch nicht ermittelt
werden (JANSSON 1999). Nach der derzeitigen Modellvorstellung sind sämtliche Lhca-Proteine
asymmetrisch auf einer Seite des PSI-Kernkomplexes lokalisiert (siehe Abb. 3).
Für die Ausbildung des Heterodimers aus Lhca1 und Lhca4 wird Chlorophyll b benötigt
(SCHMID et al. 1997). BOSSMANN und Mitarbeiter (1997) zeigten, daß Lhca4 als einziges LHCI-
Protein in der Chlorophyll b-freien Gerstenmutante chlorina-f2f2 nicht stabil ist. Das Lhca 4-
Protein gehört damit zusammen mit dem Lhcb1- und dem Lhcb6-Protein des PSII zu den
Antennenproteinen, die Chlorophyll b für die vollständige und stabile Insertion in die
Thylakoidmembran benötigen.
Lhcb1-3
Der Lichtsammelkomplex II (LHCII), der mit dem Kernkomplex des PSII assoziiert ist, wird
durch die Antennenproteine Lhcb1-Lhcb6 gebildet. Während Lhcb1 und Lhcb2 bzw. Lhcb1,
Lhcb2 und Lhcb3 gemischte Trimere bilden und an der Peripherie der äußeren PSII-Antenne
lokalisiert sind, gruppieren sich die als Monomere vorliegenden Antennenproteine Lhcb4, Lhcb5
und Lhcb6 eng um den Kernkomplex (PETER & THORNBER 1991a, BASSI et al. 1993). Trimerer
LHCII kann im Rahmen von den sogenannten state transitions, über welche die Verteilung der
Anregungsenergie unter den Photosystemen reguliert wird (WANG & MEYERS 1974) als Antenne
Einleitung 21
für beide Photosysteme fungieren. Alle rdings werden nur Homotrimere aus Lhcb1 sowie
Heterotrimere aus Lhcb1 und Lhcb2 von PSII abgekoppelt. Trimere, die Lhcb3 enthalten,
verbleiben an PSII (THORNBER et al. 1994, JANSSON 1999). Dies mag damit zusammenhängen,
daß Lhcb3 im Gegensatz zu Lhcb1 und Lhcb2 nicht phosphorylierbar ist.
Das Lhcb1-Protein ist das häufigste Protein in Thylakoidmembranen (JANSSON 1994) und bindet
rund die Hälfte aller an der Photosynthese beteiligten Pigmente (KÜHLBRANDT et al. 1994).
Lhcb4-6
Eng um den Kernkomplex des PSII gruppieren sich die Lichtsammelproteine Lhcb4, Lhcb5 und
Lhcb6. Diese CAB-Proteine binden insgesamt weniger Chlorophyll als der trimere LHCII, dafür
aber weitaus größere Mengen an Carotinoiden (Tab. 3). So werden von ihnen zB. 80 % des
gesamten Violaxanthins im PSII gebunden (BASSI et al. 1993). Aufgrund der hohen Anzahl an
gebundenen Carotinoiden kommt diesen CAB-Proteinen wahrscheinlich eine besondere
Funktion bei der Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie zu (BASSI et al. 1993,
GILMORE 1997, NIYOGI 1999).
Carotinoide vermögen sowohl Anregungsenergie auf Chlorophylle zu transferieren als auch
Anregungsenergie von Chlorophyllen im Triplettzustand zu übernehmen. Letzterer Eigenschaft
kommt im Zusammenhang mit dem Xanthophyllzyklus eine besondere Bedeutung zu. Beim
Xanthophyllzyklus wird in einem reversiblen, über den lumenalen pH regulierten Prozess
Violaxanthin über Antheraxanthin zu Zeaxanthin deepoxidiert. Der Triplettzustand des
Zeaxanthins liegt unter dem des Triplett-Chlorophylls und Zeaxanthin kann daher die
Anregungsenergie des Triplett-Chlorophylls übernehmen. Das Zeaxanthin, das durch die
Aktivität der Violaxanthin-Deepoxidase entsteht, wird zum Teil von den CAB-Proteinen Lhcb4
und Lhcb5 gebunden (VERHOEVEN et al. 1999). Ein Großteil verble ibt jedoch frei in der
Lipidphase, wo es Lipide vor der Peroxidation schützt (HAVAUX & NIYOGI 1999). Die Zunahme
des Gesamtgehaltes an Xanthophyllen bei Pflanzen, die sich an Starklichtstandorte anpassen,
legt eine protektive Funktion der Xanthophyllzykluspigmente nahe (THAYER & BJÖRKMANN
1990, SCHÄFER et al. 1994).
BERGANTINO und Mitarbeiter (1995) zeigten an Mais, daß das Lhcb4-Protein bei Licht- und
Kältestreß phosphoryliert. Da Mais-Linien mit einer geringeren Fähigkeit zur Phosphorylierung
des Lhcb4 auch empfindlicher auf Licht und Kältestress reagieren (MAURO et al. 1997) wird dem
Lhcb4 eine besondere Funktion bei der Anpassung an derartige Streßsituationen zu gesprochen.
Über die spezifischen Funktionen des Lhcb6 ist noch wenig bekannt.
Einleitung 22
Tab3: Anzahl der mit verschiedenen CAB-Proteinen des PSII assoziierten Chromophore (nach YAMAMOTO & BASSI 1996). Angegeben wurde die aus experimentellen Werten errechnete Anzahl der Moleküle pro Polypeptid.
Protein Chl a Chl b β-Carotin Lutein Neoxanthin Violaxanthin Referenz
Trimerer LHCII 7 5 - 2 0.4-0.1 0.05-0.02 a,b
Lhcb4 6 2 0.1 1.3 0.5 1.0 a,c
Lhcb5 6 3 0.1 1.3 0.4 0.5 a,d
Lhcb6 3 2 0.2 1.2 - 0.5 a,d
a) BASSI et al. 1993, b) KÜHLBRANDT et al. 1994, c) DE VITRY et al. (1984), d) PETER & THORNBER (1991a)
PsbS
Das ebensfalls Chl a und Chl b bindende PsbS-Protein des PSII weist einige Besonderheiten auf
und wird in der Regel deshalb als Verwandter der 10 CAB-Proteine bezeichnet:
- So zeichnet es sich durch vier transmembrane Helices statt der sonst typischen drei aus.
Drei dieser Helices weisen Homologie zu denen der CAB-Proteinen auf (GRIMM 1989).
- Das PsbS bindet Chl a und b (FUNK et al. 1995 a) in erheblich geringerer Menge
(4-6 Chlorophylle) als andere CAB-Proteine (FUNK et al. 1995 a) und ist aufgrund der geringen
energetischen Kopplung der gebundenen Chlorophylle wahrscheinlich nicht an der
Lichtsammlung selbst beteiligt.
- Im Gegensatz zu anderen CAB-Proteinen kann das PsbS auch bei Abwesenheit von
Chromophoren stabil in die Thylakoidmembran integriert werden (FUNK et al. 1995b).
Dem PsbS-Protein wird eine besondere Funktion beim nicht photochemischen Quenching (NPQ)
zugeschrieben. Hierunter wird weitläufig die Ableitung überschüssiger Anregungsenergie in
Form von Wärme und Fluoreszenz verstanden (OSMOND 1994). LI und Mitarbeiter (2000)
zeigten an einer Mutante von A. thaliana, daß die Deletion des psbS-Gens zu einer deutlichen
Abnahme des NPQ führt. Die Funktionsweise des PsbS-Proteins ist allerdings noch nicht
verstanden. Vorstellbar ist, daß über die Ansäuerung des Thylakoidlumens eine
Konformationsänderung des Proteins induziert wird. Diese Konformationsänderung bedingt, daß
benachbarte PSII-Untereinheiten ebenfalls ihre Konformation ändern. Durch die
Konformationsänderung verändern sic h die funktionellen Eigenschaften dieser Untereinheiten
dahingehend, daß sie dann in der Lage sind, überschüssige Anregungsenergie abzuleiten.
(BASSI & CAFFARI 2000).
Einleitung 23
1.3.1.3 Genfamilie der CAB-Proteine
Je nach Species kann die Zahl der Gene, die für ein CAB-Protein kodieren, stark variieren. Die
höchste Anzahl ist für das Lhcb1-Gen mit 5-18 Genen beschrieben worden (PICHERSKY &
JANSSON 1996), während für die übrigen CAB-Proteine jeweils nur ein oder wenige Gene
bekannt sind.
Neben den genannten 10 Typen an CAB-Proteinen umfaßt die Genfamilie der CAB-Proteine
zahlreiche weitere Mitglieder (Tab. 4). Auch die Gene der sogenannten high light induced
proteins (HLIPs) der prokaryotischen Cyanobakterien (DOLGANOV et al. 1995), der early light
induces proteins, kurz ELIPs (ADAMSKA et al. 1992) genannt und das PsbS-Protein (KIM et al.
1992, WEDEL et al. 1992) gehören dieser Genfamilie an (GREEN & PICHERSKY 1994). Durch eine
Analyse der zahlreichen für A. thaliana existierenden Sequenzen von EST-Klonen (EST =
„expressed sequence tags“) wurden weitere Mitglieder der Genfamilie identifiziert und diese
insgesamt zur „Super“-Genfamilie ausgeweitet (JANSSON 1999). Neben zwei neuen Lhca-Genen,
Lhca5 und Lhca6, wurden weitere Gene für Stress-induzierte Proteins (Seps) entdeckt. Aufgrund
der vorhandenen Sequenzhomologien (LHC-Motiv) in einer von zwei transmembranen Helices
sind die Gene dieser Proteine der Genfamilie der CAB-Proteine zuzuordnen. Auch ein als HLIP
bezeichnetes Protein mit einer transmembranen Helix wurde als neues Mitglied der Lhc-
Genfamilie von A. thaliana identifiziert (JANSSON 1999).
Die Nomenklatur der neuen Mitglieder sorgt für Verwirrung. So existieren synonyme
Bezeichnungen für die Gene der Sep-Proteine, die einerseits als Sep1-3 (ADAMSKA 2001), aber
auch als Lil3-5 (JANSSON 1999) bezeichnet werden. Gleiches gilt für die Gene der ELIPs 1 und
2, die einerseits als Elip1-2 (ADAMSKA 2001) andererseits als Lil 1-2 bezeichnet werden. Es sei
darauf verwiesen, daß in dieser Arbeit im folgenden die Nomenklatur von ADAMSKA (2001)
verwendet wird. ADAMSKA (2001) nimmt eine Gliederung der Familie der Elip-Proteine in drei
Gruppen vor:
(1) Proteine mit drei transmembranen Helices: ELIPs
(2) Proteine mit zwei transmembranen Helices: Seps
(3) Proteine mit einer transmembranen Helix: HLIPs, Scps (small cab like proteins), Ohps (one helix proteins)
Einleitung 24
Tab. 4: Mitglieder der cab-„Super“-Genfamilie von A. thaliana (JANSSON 1999).
Gen Protein Aminosäuren des Proteins
mit Transitpeptid
Aminosäuren des Proteins
ohne Transitpeptid
Lhca1 Lhca1 241 197
Lhca2.1 Lhca2.1 271 213
Lhca3 Lhca3 252 232
Lhca4 Lhca4 255 199
Lhca5 Lhca5 277 211
Lhca6 Lhca6 267 220
Lhcb1.1 Lhcb1.1 267 232
Lhcb1.2 Lhcb1.2 267 232
Lhcb1.3 Lhcb1.3 267 232
Lhcb1.4 Lhcb1.4 266 231
Lhcb1.5 Lhcb1.5 265 232
Lhcb2.1 Lhcb2.1 265 228
Lhcb2.2 Lhcb2.2 265 228
Lhcb2.3 Lhcb2.3 266 228
Lhcb2.4 Lhcb2.4 265 228
Lhcb3 Lhcb3 290 223
Lhcb4.1 Lhcb4.1 288 258
Lhcb4.2 Lhcb4.2 276 256
Lhcb4.3 Lhcb4.3 280 244
Lhcb5 Lhcb5 258 243
Lhcb6 Lhcb6 265 211
PsbS PsbS 195 205
Elip1 ELIP1 193 149
Elip2 ELIP2 110 151
Hlip HLIP 262 69
Sep1 Sep1 146 103
Sep2 Sep2 202 181
Sep3 Sep3 262 223
Evolution der cab-Genfamilie
Die derzeitige Vorstellung zur evolutionären Entwicklung der cab-Genfamilie beruht auf der
Sequenzähnlichkeit in den Helix-Bereichen zwischen den cyanobakteriellen HLIPs einerseits
und den verschiedenen CAB-Proteinen andererseits (DOLGANOV et al. 1995). Ausgehend von
einem HLIP ähnlichen Protein (eine transmembranen Helix) soll durch zwei interne
Genduplikationen ein Protein mit vier Helices entstanden sein. Die Reduktion einer Helix im
Verlauf der Evolution habe dann zu den heutigen Lhc-Proteinen mit drei transmembranen
Einleitung 25
Helices geführt (GREEN & PICHERSKY 1994, MONTANE & KLOPPSTECH 2000). Ein CAB-Protein
mit vier transmembranen Helices ist das PsbS. Drei seiner Helices weisen Homologien zu den
Helices der CAB-Proteinen mit drei transmembranen Helices auf. Durch die Identifizierung der
Seps mit ihren zwei transmebranen Helices konnte inzwischen auch das letzte fehlende Glied, an
dem diese Modell bisher krankte, nachgewiesen werden.
1.4 Fragestellung und Zielsetzung
Untersuchungen zu Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteinen und ihrer Organisation in
den Antennenkomplexen erstreckten sich bisla ng vorwiegend auf Höhere Pflanzen und einige
wenige Algengruppen. Da sich in allen Höheren Pflanzen 10 verschiedene Typen an CAB-
Proteinen und ihre Gene finden, muß jedem Proteintyp wohl seit mehr als 350 Millionen Jahren
eine besondere Funktion innerhalb der Antennenkomplexe zukommen. Ansonsten wären im
Verlauf der Evolution wohl einige der verschiedenen Lhc-Gene verloren gegangen (JANSSON
1994). Welche differenzierten Funktionen ein jedes der CAB-Proteine innerhalb der
Antennenkomplexe erfüllt, ist jedoch erst ansatzweise verstanden. Zu einem besseren
Verständnis kann unter anderem das Wissen von der molekularen Evolution der sie codierenden
Genfamilie beitragen. Landpflanzen und Grünalgen begründen sich auf einen gemeinsamen
Ursprung und bilden eine monophyletische Gruppe (CAVALIER-SMITH 1981). Während eine
Fülle an Sequenzdaten für CAB-Proteine von Samenpflanzen vorliegen und auch für Grünalgen
vermehrt Nukleotidsequenzen gewonnen werden (TERAMOTO et al. 2001), existieren für
Bryophyten nur wenige Sequenzen. Für ein komplettes Bild zur Evolution der cab-Gene bedarf
es aber ebenfalls der Sequenzdaten von Bryophyten, insbesonders da sie erste Landpflanzen
repräsentieren (MISCHLER 1994, KENRICK et al. 1997).
Bryophyten spalteten sich in der phylogenetischen Entwicklung früh von den Farnpflanzen ab,
aus denen sich die Samenpflanzen entwickelten (KRANZ et al 1995, BHATTACHARAYA & MEDLIN
1998). Interessant ist es zwischen den Eigenschaften der CAB-Proteine der Grünalgen,
Bryophyten und der Samenpflanzen zu vergle ichen. Abweichende Eigenschaften könnten helfen
die differenzierten Funktionen der einzelnen Typen an CAB-Proteine besser zu verstehen. Ferner
ist es interessant zu wissen, wann die komplexe Organisation der Antennensysteme und die
Funktionen einzelner CAB-Proteine im Verlauf der Evolution festgelegt wurden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es für das Lebermoos M. polymorpha die Zusammensetzung
der Genfamilie der kerncodierten Lhc-Gene zu ermitteln. Aufbauend auf Vorarbeiten von KILIAN
und Mitarbeitern (1998) die bereits mittels biochemischer Methoden wichtige Informationen zur
Antennenorganisation des PSII dieses Bryophyten sammeln konnten, sollte durch die
Einleitung 26
Klonierung, Sequenzierung und Analyse der Genexpression der einzelnen Mitglieder dieser cab-
Genfamilie zum einen das lückenhafte Wissen zur Evolution dieser Genfamilie komplementiert
werden. Weiterhin sollte auf molekularer Ebene Datenmaterial gewonnen werden, das das bisher
erlangte Verständnis zur Antennenorganisation dieses Bryophyten erweitert und untermauert.
27
2 Material und Methoden
2.1 Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht
2.1.1 Thalluskulturen von M. polymorpha
Alle Experimente wurden mit steril angezogenen in vitro Kulturen von M. polymorpha
durchgeführt. Das Ausgangsmaterial bildeten sterile Thalluskulturen, die Prof. Becker von der
Universität Saarbrücken freundlicherweise zur Verfügung gestellt hatte, bzw. eigens aus Sporen
angelegte Sterilkulturen. Diese Kulturen wurden kontinuierlich in Abständen von 10-14 Wochen
subkultiviert.
2.1.1.1 Kulturbedingungen
Stammkulturen von M. polymorpha wurden mixotroph angezogen, während für die Experimente
ausschließlich autotroph gewachsenes Pflanzenmaterial verwendet wurde. Die Anzucht erfolgte
unter den von ADAM (1992) ermittelten optimalen Wachstumsbedingungen. Als Kulturgefäße
dienten für mixotrophe Kulturen 250 ml Erlenmeyerkolben, die mit Cellulosestopfen und
Kappen aus Aluminiumfolie verschlossen waren. Die Kolben enthielten jeweils 70 ml mit
0.9 % (w/v) Agar Agar verfestigtes und mit 1 % (w/v) Saccharose angereichertes Nährmedium.
Als Nährmedium diente ein leicht modifiziertes GAMBORG-Medium (GAMBORG et al. 1968). Die
Veränderung gegenüber dem Originalmedium bestand im Austausch der
Spurenelementekonzentrationen gegen die des MSK2-Mediums von KATOH und Mitarbeitern
(1980).
Phototrophe Thalli wurden wie bei WÖLFEL (1998) beschrieben in transparenten Plastikgefäßen
(Lifeline, Osmotek, Rehovot, Israel) kultiviert, die mit transparenten Kunststoffdeckeln
verschlossen und mit 400 ml Nährmedium gefüllt waren (Abb. 5). Den Gasaustausch mit der
Umgebung ermöglichte eine in den Deckeln vorhandene, luftdurchlässige Membran. Zur
vegetativen Vermehrung der Kulturen wurden entweder 1-2 cm2 große Thallusstücke von einem
mindestens vier Wochen alten Thallus steril entnommen und in die Erlenmeyerkolben überführt
oder mehrere mit einer Pinzette vorsichtig von der Thallusoberseite entfernte Brutbecher auf das
Kulturmedium übertragen. Für die Anzucht phototrophen Pflanzenmaterials wurden vier ca.
10 mm2 große Thallusstücke randständig auf einer flüssigkeitsdurchlässigen Membran (Liferaft,
Osmotek, Rehovot, Israel) plaziert, die mit Hilfe eines Schwimmkörpers (Osmotek, Rehovot,
Israel) auf der Oberfläche der Nährlösung schwamm. Die Kultur erfolgte in einer Klimakammer
Material und Methoden 28
bei 20 °C unter Langtagbedingungen (16 h Licht, 8 h dunkel) bei einer konstanten
Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s-1. Die Lichteinstrahlung erfolgte durch Leuchtstoffröhren
(L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland) von oben. Die Lichtintensität wurde
mit Hilfe eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland) ermittelt. Dazu
wurde der Quantumsensor in die Kulturbehälter gelegt und diese mit dem entsprechenden
Deckel bzw. Stopfen verschlossen. Die für die Experimente verwendeten phototrophen Thalli
waren zwischen 4 und 6 Wochen alt.
Abb. 5: phototroph kultivierte M. polymorpha-Thalli. Die Thalluslappen sind durch die Rhizoide an einer auf der Nährlösung schwimmenden flüssigkeitsdurchlässigen Membran verankert.
2.1.1.2 Anlage von Sterilkulturen
Sporen im Innern einer Sporenkapsel liegen steril vor. Dies erweist sich als sehr vorteilhaft bei
der Anlage neuer Sterilkulturen aus Sporen. Sporenkapseln von M. polymorpha wurden auf dem
Gelä nde der Universität Bremen gesammelt und zur Oberflächensterilisierung für 10 min in
2 % (w/v) NaOCl-Lösung inkubiert. Nach mehrmaligem Spülen mit sterilem Wasser wurden die
Sporenkapseln unter aseptischen Bedingungen (Heraeus Lamin Air, TL3048, Heraeus
Instruments, Hanau, Deutschland) geöffnet und die Sporen auf sterilem, mit 0.9 % (w/v) Agar
Agar verfestigtem Nährmedium ausgesät. Die sich aus den Sporen entwickelnden Gametophyten
wurden in der zuvor beschriebenen Verfahrenweise (siehe 2.1.1.1) vegetativ vermehrt. Die neu
angelegte Sterilkultur unterschied sich weder im Habitus noch im Chlorophyll a/b Verhältnis von
den schon vorhandenen Sterilkulturen und zeigte ein vergleichbares Wachstumsverhalten.
Material und Methoden 29
2.1.1.3 Starklichtexposition
Bei der Untersuchung von Starklichteffekten an der intakten Pflanze ist zu berücksichtigen, daß
Effekte meist inhomogen auf das Gewebe verteilt sind. Mit zunehmender Tiefe im pflanzlichen
Gewebe nimmt die Lichtintensität exponentiell ab. Des weiteren können sich einzelne Bereiche
der Pflanze bei der Belichtung gegenseitig beschatten. Auch die Gefahr der Austrocknung bei
hohen Lichtintensitäten erschwert die Untersuchung von Starklichteffekten, insbesondere wenn
die zu untersuchenden Pflanzen an feuchte Standorte angewiesen sind, wie M. polymorpha. Die
Wirkungen von Trocken- und Lichtstreß könnten sich überlagern und nicht unterschieden
werden. Der Gefahr der Austrocknung wurde durch das gewählte Kulturverfahren (siehe 2.1.1.1)
begegnet, durch das die ausreichende Versorgung der Thalli mit Nährlösung auch während einer
Starklichtexposition gewährleistet blieb. Des weiteren wurde nur Thallusmaterial, das möglichst
unbeschattet war, für die Experimente verwendet. Zur Untersuchung von Starklichteffekten
wurden vier Wochen alte Thalli in einer auf 20 °C temperierten Klimakammer einer
Quantenflußdichte von 300 µmol m -2 s-1 ausgesetzt. Die Lichtintensität war damit 10 x höher als
bei der Anzucht der Thalli (2.1.1.1). Als Lichtquelle dienten Halogen-Metalldampflampen vom
Typ MT 400 DL IBM (Yor k International, York, USA). Parallel zu den Starklicht exponierten
Thalli wurden Thalli einer Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s-1 in der schattierbaren
Klimakammer ausgesetzt. Effekte nur aufgrund unterschiedlicher Lichtquellen (Anzucht:
Leuchtstoffröhren L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland und
Starklichtexperiment: Halogen-Metalldampflampen vom Typ MT 400 DL IBM, York
International, York, USA) sollten so ausgeschlossen werden. Zur gleichmäßigeren Beleuchtung
wurden die Deckel der Kultur gefäße durch Deckel mit einer klaren und durch ein zentrales
kleines Membranfeld luftdurchlässigen Suncap-Folie (Sigma-Aldrich, Deisenhofen,
Deutschland) ausgetauscht. Lichtintensitäten wurden in den Kulturgefäßen, denen die Deckel
aufgesetzt waren, mittels eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland)
bestimmt. Als Bezugsgröße diente der Chlorophyllgehalt der Thalli, der bei jeder Probennahme
bestimmt wurde (2.2.1).
2.2 Pigmentanalytik
2.2.1 Chlorophyllbestimmung
Chlorophyllgehalte der Thalli wurden photometrisch anhand von Pigmentextrakten mit N,N-
Dimethylformamid (DMF) bestimmt. Die Chlorophyllkonzentration wurde aus den
Material und Methoden 30
Absorptionen bei 646.8, 663.8 und 750 nm anhand der folgenden Gleichungen berechnet (PORRA
et al. 1989):
Chl a = 12.00 (A663.8 – A750) – 3.11 (A646.8 – A750)
Chl b = 20.78 (A646.8 – A750) – 4.88 (A663.8 – A750)
Chl a+b = 17.67 (A646.8 – A750) + 7.12 (A663.8 – A750)
Aus den Thalli wurden Scheibchen mit einem Frischgewicht von 10-20 mg (Ø 5-7 mm)
ausgestanzt und mit 1 ml DMF versetzt. Die Extraktion der Pigmente erfolgte im Dunkeln bei
4 °C über 24 h. Die Thallusstücke entfärbten sich über diesen Zeitraum vollständig.
Anschließend wurden die Extrakte zentrifugiert (14000 x g, 5 min) und die Überstände für die
Absorptionsmessungen verwendet.
2.3 Molekularbiologische Methoden
Wenn nicht anders vermerkt, wurden Chemikalien und Feinchemikalien für die
molekularbiologischen Arbeiten von den Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland),
oder Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alle Arbeiten wurden unter sterilen
Bedingungen durchgeführt.
2.3.1 Bakterienstämme und Vektoren
Für die Klonierung von cDNA wurden die Phagemid-Vektoren pBluescript II SK(+) und
λTriplEx2™ verwendet. Angaben zu den wichtigsten genetischen Eigenschaften der Vektoren
sowie der zur Vermehrung der Vektoren verwendeten Escherichia coli K12 Derivate finden sich
in der Tabelle 5.
Tab. 5: Eigenschaften der verwendeten Vektoren und Bakterienstämme.
Vektor besondere Eigenschaften Referenz
pBluescript II SK (+)a) Amp r, lacZ’ , high copy number Phagemid-Vektor (2.96 kb)
SHORT et al. (1988) Genebank® # X52328[SK(+)]
λTriplEx2™ b) Amp r, lacZ’ , loxP, Phagemid-Vektor (42.3 kb), einfache und effiziente cre-lox Konversion zum Plasmidvektor pTriplEx2 (3.59 kb, high copy number Vektor), regulierte Expression der klonierten Insert-DNA möglich
Clontech (Palo Alto, USA)
Material und Methoden 31
a) Stratagene, Heidelberg, Deutschland b) Komponente des ”SMAR cDNA Library Construction Kit ”, Clontech, Palo Alto, USA c) erhalten von Dr. T. Hiltonen, Universität Umeå, Schweden
2.3.1.1 Anzucht der Bakterien
Die verschiedenen E. coli Stämme wurden in LB-Medium (1 % (w/v) Bacto-Tryptone,
0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, pH 7.0 mit NaOH) angezogen, dem bei Bedarf nach
dem Autoklavieren und Abkühlen auf mindestens 50 °C Antibiotika zugesetzt wurden (Tab. 6).
Für die Herstellung von Platten wurde das LB-Medium mit 0.8 % (w/v) Agar Agar verfestigt.
Zur Anzucht von E.coli XL1-Blue für die Transduktion von λ-Phagen und die Titerbestimmung
der cDNA Banken enthielt das LB-Medium zusätzlich 10 mM MgSO4 und 0.2 % (w/v) Maltose.
Je nach Präparationsart wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA 1.5 ml LB-Medium in 96 well-
Kulturplatten (automatisierte Plasmidisolierung, 2.3.2.2.2) oder 2. 5 – 5 ml LB-Medium in 13 ml
Kunststoffröhrchen mit jeweils einer einzelnen Bakterienkolonie inokuliert. Platten und
Flüssigkulturen mit Bakterien wurden über Nacht (12-16 h) bei 37 °C inkubiert, mit Ausnahme
der Kulturen von E. coli BNN132, die bei 30 °C inkubiert wurden. Flüssigkulturen wurden
zusätzlich bei 220 rpm geschüttelt.
Tab. 6: Konzentrationen der zur Selektion eingesetzten Antibiotika.
Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration
Ampicillin (Amp) 100 mg ml-1 in A. bidest., sterilfiltriert 100 µg ml-1
Tetrazyklin (Tet) 50 mg ml-1 in Ethanol 15 µg ml-1
Kanamycin (Kan) 50 mg ml-1 in A. bidest., sterilfiltriert 50 µg ml-1
2.3.1.2 Dauerkulturen von Bakterien
Zur längerfristigen Lagerung eines Bakterienstammes wurden Stammkulturen in Glycerin
angelegt. Die Zellsuspension einer gut gewachsenen Übernachtkultur wurde dazu mit 15 % (v/v)
Glycerin versetzt, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Derartige
Stammkulturen wurden bei – 80 °C gelagert. Geringe Mengen wurden bei Bedarf entnommen
und auf selektierendem Medium ausgestrichen.
Bakterienstamm Genotyp Referenz E.coli XL1-Blue a) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F’ proAB lacIqZ ∆M15 Tn10 (Tetr)]c BULLOCK et al. (1987)
E.coli XL1-Blue MRF’ a) ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacIqZ ∆M15 Tn10 (Tetr)] c
JERPSETH et al. (1992)
E.coli BNN132 c) endA1 gyr96 hsdR17 relA1 ∆(lac-proAB) (F’ traD36 proA+ proB+ lacIqZ M15) λKC (Kanr-cre)
ELLEDGE et al. (1988)
Material und Methoden 32
2.3.2 Isolierung von Nukleinsäuren
2.3.2.1 RNA
Wäßrige Lösungen zur RNA-Präparation wurden vor dem Autoklavieren mit 0.1 % (v/v)
Diethylpyrocarbonat (DEPC) versetzt und über Nacht gerührt. Dies sollte den Abbau von RNA
durch allgegenwärtige Nukleasen verhindern. Weitere Vorsichtsmaßnahmen umfaßten das
Sterilisieren von Glasgefäßen, Mörsern und Pistillen über Nacht bei 180 °C. Mehrweggefäße wie
Zentrifugenröhrchen wurden vor dem Autoklavieren mit 0.1 M NaOH, 1 mM EDTA und RNase
freiem A. bidest. gespült.
2.3.2.1.1 Präparation von Gesamt-RNA
Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus M. polymorpha wurde nach der von CHANG und
Mitarbeitern 1993 beschriebenen Methode zur Isolierung von RNA aus Kiefern verfahren.
3 g Thallusgewebe wurden in flüssigem Stickstoff mit Hilfe von Mörser und Pistill zerrieben.
Das sehr feine, gefrorene Pulver wurde anschließend zügig in die mit 15 ml Extraktionspuffer
gefüllten, auf 65 °C temperierten Zentrifugenröhrchen überführt. Nach sorgfältigem Mischen
wurde die RNA durch Zugabe von einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) und
anschließender Zentrifugation mit 9500 x g für 20 min bei Raumtemperatur extrahiert. Die
wäßrige Phase wurde abgenommen und die Extraktion noch einmal wiederholt. Durch Zugabe
von einem Viertel des Volumens 10 M Lithiumchlorid zur wäßrigen Phase wurde die RNA über
Nacht bei 4 °C präzipitiert und durch Zentrifugation für 20 min bei 9500 x g und 4°C
sedimentiert. Die sedimentierte RNA wurde in 500 µl 0.5 % (w/v) SDS gelöst und in ein
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Nach erneuter Extraktion der RNA mit einem Volumen
Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) und Zentrifugation bei 4°C mit 9500 x g für 10 min,
erfolgte die Präzipitation der RNA für mindestens 2 h bei – 20 °C nach Zugabe des zweifachen
Volumens an Ethanol zur wässrigen Phase. Die präzipitierte RNA wurde anschließend durch
Zentrifugation für 20 min bei 10.000 x g und 4°C sedimentiert und in einem angemessenen
Volumen an A. bidest. aufgenommen. Die Lagerung von Gesamt-RNA erfolgte nach dem
Schockgefrieren der RNA in flüssigem Stickstoff bei –80°C. Aus 3 g Thallusgewebe wurden
durchschnittlich 70 µg Gesamt-RNA gewonnen.
Material und Methoden 33
2.3.2.1.2 Präparation von mRNA
mRNA wurde aus Gesamt-RNA mit Hilfe des Nucleo Trap Nucleic Acid Purification Kit der
Fa. Clontech (Palo Alto, USA) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Das
Aufreinigungsprinzip basiert auf der spezifischen Bindung von poly A+-RNA an oligo(dT)-Latex
Partikel, von denen die mRNA nach mehreren Waschschritten wieder eluiert wird. Aus 200 µg
Gesamt-RNA wurden pro Isolierungsreaktion durchschnittlich 10 µg mRNA gewonnen. Die
RNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch bestimmt und die RNA, sofern sie nicht sofort
weiterverarbeitet wurde, bei –80 °C gelagert.
2.3.2.2 Plasmid-DNA
Je nach Reinheitsgrad der benötigten DNA wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA
verschiedene Methoden verwendet.
2.3.2.2.1 Präparation von Plasmiden mit geringerem Reinheitsgrad (Boiling-Methode)
Dieses Verfahren wurde meist für das Screening von Bakterienkolonien nach einer
Transformation eingesetzt. Zur Überprüfung des Restriktionsendonukleaseschnittmusters von
DNA werden nur geringe Mengen an DNA benötigt, deren Reinheitsgrad nicht ausgesprochen
hoch sein muß. Die Boiling-Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA lieferte ca. 4 µg DNA
geringerer Reinheit je Milliliter eingesetzter Bakteriensuspension. Die Durchführung erfolgte
wie bei SAMBROOK und Mitarbeitern 1989 beschrieben.
2.3.2.2.2 Präparation von Plasmiden mit hohem Reinheitsgrad
Sehr reine Plasmid-DNA wurde für die Sequenzierung oder Klonierung benötigt. Sie wurde mit
dem Plasmid Mini Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert, wenn Plasmid-DNA aus
einer geringen Anzahl von Bakterienkolonien isoliert werden sollte. Die Plasmidisolierung für
die Sequenzierung der EST-Klone erfolgte hingegen maschinell mittels der Biomek 2000
laboratory automatic workstation (Beckman Instruments, Fullerton, USA), da so sehr viele
Proben parallel bearbeitet werden konnten. Es wurde hierzu der Nucleo Spin Robot 96-B Kit der
Fa. Macherey und Nagel (Düren, Deutschland) verwendet.
Material und Methoden 34
2.3.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren
Für die Quantifizierung von Nukleinsäuren wurde die optische Dichte (OD) der
Nukleinsäurelösungen be i einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm bestimmt (UV/VIS-
Zweistrahl-Spektralphotometer, Hitachi U-3000, Tokyo, Japan). Eine OD bei 260 nm von 1 bei
einer Schichtdicke von 1 cm entspricht ungefähr einer Nukleinsäurekonzentration von 50 µg/ml
bei doppelsträngiger DNA und 40 µg/ml bei einzelsträngiger DNA oder RNA. Das Ergebnis der
photometrischen Quantifizierung von DNA wurde durch eine anschließende
Agarosegelelektrophorese und Vergleich mit einem Standard verifiziert. Aufschluß über die
Reinheit einer Nukleinsäurelösung gibt das Verhältnis der OD bei 260 nm zu der OD bei
280 nm. Für reine, nicht mit Protein verunreinigte Nukleinsäurelösungen sollte das Verhältnis
zwischen 1.7 und 2.0 liegen.
2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Plasmid -DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen entsprechend den Empfehlungen des
Herstellers gespalten. Die Reaktionsansätze wurden mindestens 3 h lang bei der jeweils
optimalen Temperatur inkubiert und die Enzyme stets im Überschuß zugesetzt. Damit sollte die
Spaltung der DNA an sämtlichen für die Enzyme vorhandenen Schnittstellen gewährleistet sein.
In der Regel wurden 200 ng an Plasmid-DNA eingesetzt (Reaktionsvolumen 20 µl). Der Erfolg
der hydrolytischen Spaltung wurde stets mittels Agarosegelelektrophorese überprüft. Die
Tabelle 7 gibt eine Übersicht über die verwendeten Restriktionsendonukleasen. Sämtliche
Enzyme wurden von der Fa. MBI Fermentas (St. Leon-Roth, Deutschland) bezogen.
Tab. 7: Verwendete Restriktionsendonukleasen.
Enzym Reaktionspuffer Erkennungssequenzen BamH I BamH I + 5’-G�GATCC-3’
3’-CCTAG�G-5’ EcoR I EcoR I + 5’-G�AATTC-3’
3’-CTTAA�G-5’ Pst I Puffer 0+ 5’-CTGCA�G-3’
3’-G�AGCGT-5’ Sfi I Sfi I + 5’ GGCCATTA�AGG-3’
3’-CCGGT�AATACC-5’ Xho I Puffer 0+ 5’-C�TCGAG-3’
3’-GAGCT�C-5’
Material und Methoden 35
2.3.5 Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung von Nukleinsäuren erfolgte in horizontalen Agarosegelen. Zwei verschiedene
Gelsysteme (Eigenbau, BRC, Szeged, Ungarn) der Größe 8.0 x 6.0 cm und 20.9 x 16.8 cm
wurden je nach gewünschter Auftrennungsstrecke eingesetzt.
2.3.5.1 Auftrennung von DNA
Je nach Größe der aufzutrennenden DNA-Fragmente wurden 0.8-1.2 % (w/v) Agarose durch
kurzes Erhitzen in 0.5 x TAE-Puffer gelöst. Nachdem sie auf ca. 50 °C abgekühlt war, wurde
Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 µg/ml) zugesetzt. Dies ermöglichte es, auch schon
während der Elektrophorese mittels einer UV-Handlampe die Auftrennung der DNA zu
beobachten. Die Agaroselösung wurde anschließend in den Gelträger, dem ein Kamm
aufgesteckt war, gegossen und der Gelträger nach dem Erstarren der Gelmatrix in die mit
0.5 x TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Zur Erhöhung der Dichte wurden die
DNA-Proben mit 0.1 Volumen Auftragspuffer (20 % (w/v) Ficoll400, 125 mM EDTA (pH 8.0),
0.25 % (w/v) Bromphenolblau, 0.25 % (w/v) Xylencyanol FF) versetzt, nach dem Entfernen des
Kammes in die Geltaschen pipettiert und bei einer Spannung von 70-100 V (1 V/cm)
elektrophoretisch aufgetrennt. Der Grad der Auftrennung wurde anhand der Farbstoffe im
Auftragspuffer verfolgt. Ein DNA-Größenstandard (Smart-Ladder, Eurogentech, Holland) wurde
stets zum Vergleich mit aufgetragen. Zur Visualisierung der DNA-Banden nach Beendigung der
Elektrophorese wurden die Gele auf einem Transluminator (Bachofer, Reutlingen, Deutschland)
mit UV-Licht der Wellenlänge 312 nm durchleuchtet. Zur photographischen Dokumentation
wurde eine Polaroid-Kamera (Polyroid Filme: Typ 667, Polaroid Ltd, Hertfordshire, England)
eingesetzt.
2.3.5.2 Auftrennung von RNA
Intramolekulare Sekundärstrukturen beeinträchtigen das Laufverhalten von RNA bei der
Gelelektrophorese. Entweder durch die Denaturierung der RNA mittels Glyoxal (Universität
Umeå, Schweden) oder mittels Formaldehyd (Universität Bremen, Deutschland) wurde die
Ausbildung solcher Sekundärstrukturen verhindert. Die Elektrophorese erfolgte in
Flachbettgelkammern, die ausschließlich nur für die elektophoretische Auftrennung von RNA
benutzt wurden. Die Laufpuffer wurden vor dem Gebrauch mit 0.1 % (v/v) DEPC versetzt, über
Nacht gerührt und autoklaviert.
Material und Methoden 36
2.3.5.2.1 Gelelektrophorese von mit Glyoxal denaturierter RNA
Zur Herstellung der Gelmatrix wurden 1.2-1.5 % (w/v) Agarose in 0.01 M Natriumphosphat-
puffer (pH 6.0) durch kurzzeitiges Erhitzen gelöst, nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C mit
Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 µg/ml) versetzt und zum Erstarren in den Gelträger
gegossen. Der Gelträger wurde anschließend in die mit 0.01 M Natriumphosphatpuffer gefüllte
Gelkammer gelegt.
Die RNA-Proben wurden in der Zwischenzeit in Gegenwart von Glyoxal und DMSO
denaturiert. 5 µg RNA (1 µg/µl) wurden im Verhältnis 1:3 mit dem Denaturierungsreagenz
(65 % (v/v) DMSO, 30 % (w/v) Glyoxal, 0.01 M Natriumphosphatpuffer pH 6.0) versetzt und
für 1 h bei 50 °C inkubiert. Glyoxal vermag leicht an der Luft zu Glyoxalsäure oxidieren. Diese
vermag RNA zu hydrolysieren. Zur Entfernung von Glyoxalsäure wurden Lösungen von
Glyoxal deshalb vor dem Gebrauch durch ein Mischbett-Harz gemäß den Angaben des
Herstellers laufengelassen (Bio-Rad-AG 501 x 1, Biorad, München, Deutschland). Das
deionisierte Glyoxal wurde in kleinen Portionen in gut verschlossenen Reaktionsgefäßen bei
-20 °C bis zum Gebrauch gelagert.
Vor dem Beladen des Gels wurde für 5 min eine Spannung von 100 V angelegt. Dann wurden
die denaturierten RNA-Proben mit 0.05 Volumen Auftragspuffer (0.25 % (w/v) Xylencyanol FF,
0.25 % (w/v) Bromphenolblau, 0.01 M Natriumphosphatpuffer pH 6.0) versetzt und auf das Gel
aufgetragen. So konnte der Verlauf der Elektrophorese anhand der Farbstoffe verfolgt werden
und die Dichte der Proben wurde erhöht. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V für ca. 4-5 h. Da
Glyoxal bei einem pH über 8.0 von der RNA dissoziiert, wurde der Laufpuffer während der
Elektrophorese mittels einer Pumpe umgewälzt. Das Umwälzen des Puffers diente dazu den pH-
Wert aufrechtzuerhalten. Die Gele wurden im Anschluß an die Elektrophorese mit UV-Licht
(312 nm) durchleuchtet und photographiert.
2.3.5.2.2 Gelelektrophorese von mit Formaldehyd denaturierter RNA
Für ein 7.5 cm x 5 cm großes Gel wurden 1.2 % (w/v) Agarose in mit 0.1 % (v/v) DEPC
behandeltem A. bidest. durch kurzes Erhitzen gelöst und die Lösung nach Abkühlen auf
ca. 50 °C mit 10 x MOPS-Puffer (0.02 M MOPS, 0.05 M Na-Acetat pH 7.0, 0.01 M EDTA,
Endkonzentration 1 x), Formaldehyd (Endkonzentration 6% (v/v)) und Ethidiumbromid
(Endkonzentration 1µg/ml) versetzt.
Durch vorsichtiges Schwenken wurde der Ansatz gut gemischt und in den vorbereiteten
Gelträger, dem ein Kamm aufgesteckt war, gegossen. Die Arbeiten wurden aufgrund der
Flüchtigkeit und gesundheitsgefährdenden Wirkung des Formaldehyds unter einem Abzug
ausgeführt. Nach dem Erstarren der Gelmatrix wurde der Gelträger in die mit 1x MOPS-Puffer
Material und Methoden 37
gefüllte Flachbettkammer gelegt und vor der Beladung des Geles für 5 min eine Spannung von
40 V (5 V/cm) angelegt. Zur Denaturierung der RNA und um die Dichte der RNA-Proben zu
erhöhen, wurden sie vor dem Auftrag auf das Gel im Verhältnis 1:1 mit Denaturierungspuffer
(50 % (w/v) Formamid (deionisiert), 10 x MOPS-Puffer, 2 % (w/v) Formaldehyd, 7 % (w/v)
Glycerin, 0.01 % (w/v) Bromphenolblau) versetzt. Anschließend wurden die Proben für 5 min
bei 65 °C inkubiert und dann für 5 min auf Eis gestellt.
Die Elektrophorese erfolgte für ca. 2 h bei einer konstanten Spannung von 40 V (5 V/cm). Der
Verlauf der Elektrophorese ließ sich anhand der blauen Lauffront, verursacht durch den
Farbstoff Bromphenolblau im Denaturierungspuffer beobachten.
Zur Dokumentation wurden die Formaldehydgele nach der Elektrophorese auf einem
Transilluminator mit UV-Licht durchleuchtet und photographiert.
2.3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.3.6.1 Oligonukleotidprimer
In Tabelle 8 sind alle Oligonukleotidprimer aufgeführt, die für die Amplifikation von DNA
eingesetzt wurden. Alle Primer mit Ausnahme von CDSIII/3’ und SMARTIII, die Bestandteil
des Kits zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken waren, wurden von der Fa. Life Technologies
(Karlsruhe, Deutschland) synthetisiert.
Tab. 8:Für PCR-Reaktionen verwendete Oligonukleotidprimer.
Primerbezeichnung bp Oligonukleotidsequenz
oligo(dT)17 31 5’-CTGCATGCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT
Lhcb4-I 24 5’-CAGAACYTSGCTAAGAAGGAGTTC-3’
Lhcb4-II 21 5’-AACGAGTTCGGWGAYGTSATC-3’
Lhcb6-I 29 5’-TTGAATTCACCAAGAAGGTBGCYGCY-3’
T31) 20 5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’
T71) 21 5’-GTAATACGACTCACTATAGGG-3’
M13 reverse1) 18 5’-GGAAACAGCTATGACCAT -3’
M13 universe1) 14 5’-GTAAAACGACCAGT-3’
CDS III/3’ 57 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30N-1N-3’
SMARTIII 39 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’
1) auch in CY5-Fluorensz gelabelter Form verwendet
Material und Methoden 38
2.3.7 RT-PCR
2.3.7.1 Reverse Transkription (RT)
Die Reverse Transkription von RNA zu cDNA erfolgte mit M-MuLV-Reverser Transkriptase
(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) und wurde gemäß der Anleitung des Herstellers
durchgeführt. In A. bidest. gelöste Gesamt-RNA in wurde mit oligo(dT)17-Primer versetzt
(Reaktionsvolumen 11 µl), für 5 min bei 70 °C denaturiert und anschließend kurz auf Eis
gekühlt. Nach Zugabe der weiteren Reaktionskomponenten (Tab. 8) bis auf das Enzym wurde
der Reaktionsansatz für 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zusatz der Reversen Transkriptase
(20 U) erfolgte eine einstündige Inkubation bei 37 °C, gefolgt vom Erhitzen für 10 min auf
70 °C zum Abstoppen der Reaktion. Jeweils 10 % des Ansatzes wurden direkt für die
anschließende Amplifikation der gewünschten cDNA mittels PCR eingesetzt.
Tab. 9 Reaktionsansatz für die Reverse Transkription.
Reaktionskomponente Menge / Konzentration
Gesamt -RNA 1-1.5 µg
oligo(dT)17-Primer 200 pmol
5 x Reaktionspuffer 1 x
10 mM dNTP-Mix 200 µM
RNAsin (40 U/µl) 1 U
A. bidest. (steril) ad 20 µl
2.3.7.2 Standardbedingungen für die PCR
Für die präparative Amplifikation der gewünschten cDNA nach vorangegangener Reverser
Transkription von RNA in cDNA wurde Pwo-Polymerase eingesetzt. Pwo-Polymerase zeichnet
sich wegen ihrer 3’-5’-Exonuklease-Funktion gegenüber herkömmlicher Taq-Polymerase durch
eine gesteigerte Ablesegenauigkeit aus und besitzt eine erheblich bessere Temperaturstabilität.
Die PCR-Ansätze wurden in den auf 95 °C vorgeheizten Thermoblock des Thermocyclers
(Personal Cycler, Biometra, Göttingen, Deutschland) gestellt und das folgende
Temperaturprogramm durchlaufen:
Schritt 1 95 °C 5 min Schritt 2 94 °C 30 s Schritt 3 optimale Hybridisierungstemperatur 60 s 29 x Schritt 4 72 °C 90 s Schritt 5 72 °C 10 min Schritt 6 4 °C bis zur Weiterverarbeitung
Material und Methoden 39
Die PCR erfolgte mit einem sogenannten hot start: in der ersten fünfminütigen
Denaturierungsphase wurde das Thermoprogramm kurz unterbrochen und erst dann die
entsprechende Menge an Pwo-Polymerase hinzupipettiert. Dieser Schritt soll unspezifische
Paarungen der Primer vor Beginn der Synthese-Reaktion minimieren. Die Zusammensetzung der
Reaktionsansätze für die PCR ist Tabelle 10 zu entnehmen. Ein Überschichten der PCR-Proben,
z.B. mit Mineralöl entfiel, da der eingesetzte Thermocycler über einen temperierbaren Deckel
verfügte, dessen Temperatur während eines Thermoprogrammes auf 105 °C eingestellt wurde.
Tab. 10: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für die PCR mit Pwo-Polymerase.
Reaktionskomponente Zusammensetzung Menge
Reaktionsansatz der Erststrangsynthese siehe 2.3.7.1.1 2 µl
10 x PCR-Puffer 100 mM Tris -HCl (pH 8.85), 250 mM KCl, 50 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4
10 µl
DMSO 10 µl
dNTP-Mix 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP in A. bidest.
2 µl
Primer1: oligo(dT)17 20 pmol / ul in A bidest. 1 µl Primer 2: sequenzspezifischer Primer 20 pmol/ ul in A bidest. 1 µl A. bidest. (steril) 28 µl Pwo-Polymerase Konzentration: 5U/µl
in 20 mM Tris -HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5 % (v/v) TWEEN 20, 50 % (w/v) Glycerin
1 µl
Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte durch die gelelektrophoretische Auftrennung von einem
Fünftel der PCR-Ansätze in 0.8-1.2 % (w/v) Agarosegelen (2.3.5). Einzelne DNA-Banden
wurden aus den Gelen mittels des Qiaquick Gel Extraktion Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland)
eluiert und entweder in einen Vektor kloniert (2.3.8) oder einer Reamplifikation durch erneute
PCR unterzogen.
2.3.7.3 PCR für die Amplifikation von DNA-Sonden
In den Vektor pTriplEx2 klonierte Lhc-Gene aus M. polmyorpha wurden für den Einsatz als
Sonden bei der Northernblot-Analyse mittels PCR amplifiziert. Die Zusammensetzung der PCR-
Ansätze ist Tabelle 11 zu entnehmen. Folgendes Thermoprogramm wurde durchlaufen:
Schritt 1 94 °C 5 min Schritt 2 94 °C 30 s Schritt 3 55 °C 1 min 25 x Schritt 4 72 °C 1 min Schritt 5 72 °C 7 min Schritt 6 4 °C bis zur Weiterverarbeitung
Material und Methoden 40
Im Anschluß an die PCR wurden die Amplifizierungsprodukte direkt aus den PCR-Ansätzen
mittels des PCR Product Purification Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) präpariert.
Tab. 11: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für die Amplifikation von DNA-Sonden.
Reaktionskomponente Zusammensetzung / Konzentration Menge DNA in A. bidest. 250 ng – 1 µg 10 x PCR-Puffer 100 mM Tris -HCl (pH 8.85), 250 mM KCl,
50 mM (NH4)2SO4 5 µl
MgCl2 25 mM 10 µl dNTP-Mix 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP,
10 mM dTTP in A. bidest. 2 µl
Primer1 10 pmol/µl in A bidest. 1 µl Primer 2 10 pmol/µl in A bidest. 1 µl Taq-Polymerase Konzentration: 5U/µl 0.4 µl A. bidest. (steril) ad 50µl
2.3.8 Klonierung von DNA-Fragmenten
PCR-Produkte wurden in den Vektor pBluescript II SK(+) kloniert und anschließend
sequenziert.
2.3.8.1 Isolierung der Insert-DNA
Die zu klonierenden DNA-Fragmente wurden mit Restriktionsendonukleasen hydrolysiert
(2.3.4) und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines Skalpells wurden die mittels UV-
Licht (312 nm) sichtbar gemachten DNA-Banden aus dem mit Ethidiumbromid versetzten
Agarosegel ausgeschnitten und extrahiert. Zur Extraktion der DNA aus dem Gel wurde das
QiaEx II Gel Extraktions Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) gemäß den Angaben des
Herstellers verwendet.
2.3.8.2 Vorbereitung des Vektors
Der Vektor pBluescript II SK(+) wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten, wie
das zu klonierende DNA-Fragment. Zusätzlich wurde der Vektor dephosphoryliert um die
intramolekulare Ligation der Vektor-DNA zu vermeiden, wenn nur mit einem
Restriktionsenzym geschnitten wurde. Endständige 5’-Phosphatgruppen wurden mit alkalischer
Phosphatase aus Kalbsthymus (CIAP, EF0341, MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland)
entfernt. Anschließend wurde der Ansatz einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen und
die Vektor-DNA mit Ethanol präzipitiert.
Material und Methoden 41
2.3.8.3 Ligation
Die Ligation von Insert-DNA und Vektor-DNA wurde mit Hilfe einer T4-DNA-Ligase (MBI
Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Zur
Erhöhung der Ausbeute an rekombinanter DNA erwies sich ein DNA-Massenverhältnis Insert-
DNA zu Vektor-DNA von 3:1 als sehr geeignet. Dieses wurde mittels folgender Formel
ermittelt:
ng Plasmid x kb Insertgröße x Mol Insert = ng Insert kb Plasmidgröße Mol Plasmid
Ligationsansätze wurden über Nacht bei 14 °C inkubiert und anschließend entweder sofort in
den E. coli Stamm XL1-Blue MRF’ transformiert (2.3.8.5) oder bei –20 °C eingefroren.
2.3.8.4 Herstellung kompetenter Zellen
Für die effiziente Transformation von E .coli ist es nötig, die Bakterienzellen vorzubehandeln, so
daß sie leichter in Lösung befindliche DNA aufzunehmen vermögen. Die Herstellung
kompetenter E. coli XL-1 Blue MRF’-Zellen erfolgte nach der Mehr -Ionen Technik von
HANAHAN (1995) nach einem von der Fa. Promega (1996) veränderten Protokoll. 250 ml mit
20 mM MgSO4 supplementiertes LB-Medium wurde mit 1 % (v/v) einer über Nacht
gewachsenen Bakterienkultur inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. War
eine OD600 von 0.4-0.6 erreicht, wurden die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4500 x g
bei 4 °C sedimentiert und in 100 ml TFB1 (30 mM Kaliumacetat, 10 mM CaCl2, 50 mM MnCl2,
100 mM RbCl, 15 % (w/v) Glycerin) resuspendiert. Nach einer Inkubation der resuspendierten
Zellen von 5 min auf Eis wurden sie wie zuvor sedimentiert und vorsichtig in 10 ml TFB2
(10 mM MOPS pH 8,5, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl, 15 % (w/v) Glycerin) aufgenommen. Nach
45 min Inkubation auf Eis wurden Aliquots von 200 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und anschließend bei – 80 °C gelagert. Derart behandelte E. coli Zellen waren für ca. 6 Monate
kompetent.
2.3.8.5 Transformation von E. coli
Für die Transformation von E. coli XL1-Blue-MRF’ wurden 200 µl kompetente Bakterienzellen
auf Eis aufgetaut und 10-50 ng der Vektor-DNA in einem kleinen Volumen (<10 µl) zugesetzt.
Es folgte nach kurzem Mischen durch vorsichtiges Schwenken eine Inkubation für 30 min auf
Eis und eine 45 s lange Wärmebehandlung bei 42 °C im Wasserbad. Nach kurzem Abkühlen auf
Material und Methoden 42
Eis für 2 min wurden die Zellen mit 3 ml LB-Medium verdünnt und zur Entwicklung der auf
dem Vektor codierten Antibiotika-Resistenz 1 h bei 37 °C mit 150 rpm geschüttelt. Als
Negativkontrolle für die Transformation dienten 200 µl kompetente Bakterienzellen, die in der
zuvor beschriebenen Weise behandelt worden waren, jedoch ohne Zusatz von Vektor-DNA.
2.3.8.6 Blau-weiß Selektion
Die Selektion der Transformanten erfolgte auf Ampicillin und Tetrazyklin haltigen LB-Platten,
auf denen zuvor je 40 µl Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG, 2 % (w/v) in A. bidest.,
strerilfiltriert) und 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal, 2 % (w/v) in
DMF) verteilt worden waren. 100-200 µl der Transformationsansätze wurden auf derartige LB-
Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Integration von
Insert-DNA in den Vektor entwickelten sich weiße Kolonien, da das lacZ-Gen des Vektors
inaktiviert wurde. Blaue Kolonien hingegen waren ein Anzeichen für Klone ohne Insert-DNA,
da das Enzym ß-Galactosidase, das das Substrat X-Gal zu einem Indigofarbstoff umsetzt,
gebildet worden war.
2.3.9 DNA-Sequenzierung
Sequenzierungen von cDNA-Inserts einzelner Plasmide wurden entweder selbst mit dem
Automated Laser Fluorescent DNA Sequencer (ALF) der Fa. Amersham Pharmacia (Freiburg,
Deutschland) in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. B. Reinhold-Hurek (Universität Bremen,
Deutschland)) durchgeführt oder bei der Fa. GAG BIOSCIENCE (Bremen, Deutschland) in
Auftrag gegeben. Für die Sequenzierungen am AFL express DNA Sequencer wurde das Thermo
Sequenase Fluorescent Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gemäß den Angaben
des Herstellers verwendet. Die Sequenzierreaktion beruhte auf dem Reapeated Primer
Extension-Verfahren, einer Weiterentwicklung der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode
(SANGER et al. 1977). CY5-fluoreszenzmarkierte Primer (3 pmol/Sequenzierreaktion) wurden
verwendet. Pro Sequenzierreaktion wurden 0.7-1.0 µg Plasmid-DNA in 21 µl A. bidest
eingesetzt.
Material und Methoden 43
2.3.10 Northernblot-Analyse
Zur Analyse der Expression verschiedener Lhc-Gene aus M. polymorpha in Abhängigkeit von
den herrschenden physiologischen Bedingungen (Dauer der Lichtphase, Intensität des Lichts),
wurde Gesamt-RNA isoliert, mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und
auf eine Nylonmembran transferiert. Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit radioaktiv
markierten cDNA-Sonden (Nukleinsäurefragmente codierend für Lhc-Gene aus M. polymorpha).
2.3.10.1 Transfer von RNA auf Nylonmembranen
In denaturierenden Agarosegelen aufgetrennte Gesamt-RNA (2.3.5.2.2) wurde im Kapillarblot-
Verfahren auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland)
übertragen. Der Transfer erfolgt hierbei mit Hilfe der Kapillarwirkung eines Flüssigkeitsstroms,
der durch das Gel führt. Abbildung 6 zeigt den zuletzt angewandten Aufbau für den
Kapillartransfer. Auf einer Glasplatte der Größe 15 x 30 cm wurden mittig 2 Lagen, auf
Gelgröße zurechtgeschnittene Whatmann 3 MM Filterpapiere (Biometra, Göttingen,
Deutschland) plaziert. Die Filterpapiere waren zuvor kurz (2-3 min) mit 6 x SSC-Puffer getränkt
worden, ebenso wie das Agarosegel, das auf die 2 Lagen Filterpapier mit der Unterseite nach
oben gelegt wurde. Dabei wurde darauf geachtet, daß sich keinerlei Lufblasen zwischen dem
Filterpapier und der Glasplatte bzw. zwischen Filterpapier und Gel befanden. An die Kanten um
das Gel herum gelegte entsprechend große Stücke von Röntgenfilm oder Parafilm sollten einen
seitlichen Puffertransfer am Gel vorbei, verhindern. Anschließend wurde die mit 0.1 % (v/v)
DEPC behandeltem A. bidest. benetzte und dann in 6 x SSC getränkte Nylonmembran
luftblasenfrei auf das Gel gelegt, gefolgt von 10 Lagen trockenem Whatmann 3 MM-Papier. Ein
ca. 10 cm hoher Stapel Zellstofftücher wurde auf den Aufbau gelegt, das Ganze mit einer
Glasplatte abgedeckt und einem Gewicht von 1-2 kg beschwert. Der Transfer erfolgte für
mindestens 16 h über Nacht. Die Immobilisierung der auf die Membranen transferierten RNA
erfolgte durch anschließendes Backen der Nylonmembranen bei 80 °C für 2 h oder 120 °C für
30 min. Der anfänglich benutzte Aufbau für den Transfer von RNA auf Nylonmembranen
unterschied sich von dem zuvor beschriebenen daduch, daß die untere Glasplatte über die
Längskanten einer mit 20 x SSC gefüllten Glasschale gelegt wurde und die unteren 2 Lagen
Whatmann 3 MM-Filterpapiere in dieses Pufferreservoir hineinragten. Des weiteren erfolgte der
Transfer nicht mit 6 x SSC-Puffer, sondern mit 20 x SSC-Puffer.
Material und Methoden 44
Abb. 6: Aufbau für den Kapillartransfer, wie er zuletzt angewandt wurde.
2.3.10.2 Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden
DNA-Sonden wurden mit [α32P]-dCTP (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) nach der
random priming-Markierungsmethode (FEINBERG & VOGELSTEIN, 1983) mit Hilfe des
Oligolabelling Kits der Fa. Amersham Pharmacia (Freiburg, Deutschland) markiert (gemäß den
Angaben des Herstellers). In der Regel wurden 25–50 ng an DNA pro Markierungsreaktion
eingesetzt. Die Entfernung nicht inkorporierter Nukleotide erfolgte mit Hilfe des Nucleotide
Removal Kits der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland).
2.3.10.3 Hybridisierung
Vor der eigentlichen Hybridisierung erfolgte eine Vorbehandlung der Nylonmembranen.
Unspezifische Bindungsstellen für die DNA-Sonden sollten so möglichst weitreichend zu
blockiert werden. Die Nylonmembranen wurden in Hybridisierungsflaschen überführt und für
eine Stunde mit 10 ml PWB-Puffer (0.1 x SSC, 1% (w/v) SDS) bei 65 °C im
Hybridisierungsofen inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Prähybidisierungspuffer (6 x SSC,
0.5 % (w/v) SDS, 5 x Denhardts Reagenz) mit 100 µl Heringssperma-DNA (100µg/µl) versetzt
und nach dem Abgießen des PWB-Puffers auf die Nylonmembranen gegeben. Vor Zugabe zum
Prähybridisierungspuffer war die Heringssperma-DNA für 5 min bei 95 °C denaturiert und
anschließend für 5 min auf Eis gestellt worden. Nach mindestens zweistündiger Inkubation bei
65 °C im Hybridisierungsofen (Prähybridisierung) wurde die für 5 min bei 95 °C
hitzedenaturierte 32P-markierte DNA-Sonde zugesetzt (25-50 ng). Die Hybridisierung erfolgte
Glasplatte
Zellstoff
3MM Filterpapier (trocken)
Röntgenfilm Gel
Glasplatte
3 MM Filterpapier (feucht)
Nylonmembran
3 MM Filterpapier (feucht)
Material und Methoden 45
über Nacht für mindestens 16 h bei 65 °C im Hybridisierungsofen. Nicht hybridisierte DNA-
Sonde wurde durch die anschließenden Waschschritte entfernt. Nach Abgießen der
Hybridisierungslösung wurden die Nylonmembranen je für 15 min bei 65 °C mit 10 ml
Waschpuffer 1 (2 x SSC, 0.1% (w/v) SDS) gefolgt von 10 ml Waschpuffer 2 (1 x SSC,
0.1 % (w/v) SDS) gewaschen.
2.3.10.4 Detektion von Hybridisierungen mittels Autoradiographie
Der Nachweis von Hybridisierungen erfolgte mittels Autoradiographie, über die Schwärzung
hochempfindlicher Röntgenfilme (Kodak X-Omar R). Die in Frischhaltefolie eingeschlagenen
Membranfilter wurden nach einer Hybridisierung mit der RNA-Seite nach oben in
Autoradiograhie-Kassetten mit Verstärkerfolien gelegt. Nach dem Auflegen von Röntenfilm
erfolgte eine unterschiedlich lange Exposition bei – 80 °C, die von 3 h bis zu 7 d dauern konnte.
Die Entwicklung der Röntgenfilme erfolgte manuell, indem die Filme zunächst für 6-8 min unter
Rotlicht in Entwicklerlösung gelegt wurden, dann kurz mit Leitungswasser gewaschen, und
anschließend für 10 min in Fixierlösung gelegt und dann gut gewässert.
2.3.10.5 Entfernen radioaktiver Signale vor einer erneuten Hybridisierung
Auf Nylonmembranen fixierte Nukleinsäuren können mehrfach Hybridisierungsreaktionen
unterzogen werden. Vor einer erneuten Hybridisierung müssen die zuvor an die Nukleinsäuren
gebundenen radioaktiv markierte Sonden jedoch entfernt werden. Die Nylonmembranen wurden
zu diesem Zweck mit 100-200 ml kochender 0.1 % (w/v) SDS-Lösung übergossen und in der
Lösung geschwenkt, bis sie Raumtemperatur erreicht hatte. Anschließend wurden die
Membranen zweimal kurz mit 2 x SSC gespült, mit Prähybridisierungspuffer benetzt und in
Frischhaltefolie eingeschlagen. Bis zur erneuten Hybridisierung erfolgte die Lagerung der
Membranen bei – 20°C.
2.3.11 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels ESTs
Über die Erzeugung und computergestützte Analyse einer Vielzahl ansequenzierter cDNA-
Klone (expressed sequence tags, ESTs) lassen sich relativ schnell Informationen über die
codierenden Sequenzabschnitte von uncharakterisierten Genomen erhalten.
Zur partiellen Analyse des nahezu uncharakterisierten nukleären Genoms und speziell zur
Identifizierung und Klonierung des möglichst kompletten Satzes an cab-Genen wurden ESTs
von M. polymorpha generiert, sequenziert und einer Datenbankanalyse unterzogen. Die
Material und Methoden 46
Abbildung 7 gibt eine Übersicht über die einzelnen bei der Erzeugung der EST-Klone erfolgten
Arbeitsschritte.
1. Phase:
Isolierung von mRNA Herstellung einer cDNA Bibliothek
Thalli
2. Phase:
Parallele Anzucht einer hohen maschinelle Präparation Ansequenzierung der cDNAs Anzahl von cDNA-Klonen von Plasmiden der Plasmide
3. Phase:
Verarbeitung der Sequenzdaten: Bestimmung der Basenabfolge Bioinformatik Editierung und Assemblierung Annotierung
Abb. 7: Arbeitsschritte bei der partiellen Analyse des nukleären Genoms von M. polymorpha durch Herstellung und Sequenzierung von EST-Klonen.
2.3.11.1 cDNA Bibliotheken
Zwei cDNA-Bibliotheken von M. polymorpha wurden hergestellt. Die hierfür benötigete
mRNA wurde aus vier Wochen alten Thalli gewonnen. Die Thalli waren bei einer
Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s -1 angezogen worden (Ausgangsmaterial für die erste
cDNA-Bibliothek) bzw. zusätzlich für drei Tage einer um das 10 fache erhöhten
Quantenflußdichte ausgesetzt worden (Ausgangsmaterial für die 2. cDNA-Bibliothek). mRNA
wurde aus den Thalli 1 h vor dem Beginn der Lichtphase bzw. 2 h und 4 h nach dem Beginn der
Lichtphase isoliert und anschließend gepoolt.
Material und Methoden 47
2.3.11.1.1 Herstellung
Die cDNA Bibliotheken von M. polymorpha wurden mit dem SMART cDNA Library
Construction Kit der Fa. Clontech (Palo Alto, USA) hergestellt. Ausgehend von sehr geringen
Mengen an RNA (50 ng Gesamt-RNA bzw. 25 ng polyA+ RNA) lassen sich mit der SMART
(Switch Mechanism At the 5’ end of RNA Transcripts) Methode schnell und effizient große
Mengen an „full-length“ cDNA anreichern. Die Synthese des ersten cDNA Stranges erfolgt mit
Hilfe eines modifizierten oligo(dT) Primers (CDS III Primers) und einer MMLV RNase H-
Reversen Transkriptase, die aufgrund ihrer Terminalen Transferase Aktivität noch einige wenige
Desoxycytidin Reste an das 3’ Ende des synthetisierten cDNA Stranges anfügt. Das SMARTIII
Oligonukleotid bildet im folgenden über die oligo(dG) Sequenz an seinem 3’ Ende mit den an
den cDNA Strang angehängten Desoxycytidin Resten Basenpaarbindungen aus und dient der
Reversen Transkriptase als erweiterte Matrize. Die auf diese Weise erzeugten einzelsträngigen
cDNA Stränge sollten über das komplette komplementäre 5’ Ende der jeweiligen mRNA
verfügen, sowie über die komplementäre Sequenz zum eingesetzten SMARTIII Oligonukleotid.
Bei der sich anschließenden Amplifizierung der synthetisierten cDNA dient die zum SMARTIII
Oligonukleotid komplementäre Sequenz als Primerbindungsstelle. Über den bei der
Erststrangsynthese verwendeten Primer CDSIII und das SMARTIII Oligonukleotid werden
außerdem asymmetrische Sfi I Restriktions-schnittstellen an das 5’ (Sfi IA) und 3’ Ende (Sfi IB)
der synthetisierten cDNA Stränge eingeführt. Nach dem Schneiden der cDNA mit dem
Restriktionsenzym Sfi I und einer Größenfraktionierung mittels CHROMA SPIN–400 Säulen
erfolgt die Ligation in den ebenfalls mit Sfi I geschnittenen Phagemid-Vektor λTriplEx2. Nähere
Angaben zu genetischen Eigenschaften des Phagemid-Vektor λTriplEx2 finden sich unter 2.3.1.
Wenn nicht anders vermerkt, wurde nach dem Protokoll des Herstellers verfahren.
Erststrangsynthese
Die Reverse Transkription der poly A+-RNA in cDNA erfolgte mit Hilfe der MMLV RNase H-
Reversen Tanskriptase Superscript II der Fa. Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland). Pro
Reaktionsansatz wurden 200 Units der Reversen Transkriptase und 1 µg polyA+-RNA
eingesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 100µl.
Synthese doppelsträngiger cDNA
Für die Synthese dopelsträngiger cDNA mittels primer extension wurde die Zykluszahl des im
Protokoll angegebenen Thermoprogramms von drei um weitere zwei Zyklen erhöht. Grund
hierfür war die geringe Anzahl an sichtbaren Nukleinsäurebanden im Agarosegel nach
gelelektrophretischer Auftrennung eines 10-tels des Ansatzes. Es ergab sich somit folgendes
Material und Methoden 48
Thermoprogramm, das in einem GeneAmp2400-Thermocykler der Fa. Perkin Elmer
(Überlingen, Deutschland) durchlaufen wurde:
1. Schritt: 72 °C für 10 min 2. Schritt: 95 °C für 20 s 3. Schritt: 3 Zyklen 95°C für 5 s und 68 °C für 8 min
Spaltung der cDNA mit SfiI
Nach der Inaktivierung der DNA-Polymerase durch eine Proteinase K Behandlung der Ansätze
gemäß den Angaben des Herstellers, erfolgte die gezielte Spaltung der cDNA mit dem
Restriktionsenzym Sfi I. Die Spaltung der cDNA mit dem Restriktionsenzym Sfi I diente der
Vorbereitung für die direktionale Ligation der cDNA in die asymmetrischen SfiI (A&B)
Schnittstellen des Phagemidvektors λTriplEx2.
Größenfraktionierung
cDNA, die kleiner als 100 bp war, wurde aus den Ansätzen entfernt. Dies geschah mittels einer
Fraktionierung der cDNAs nach ihrer Größe durch CHROMA-SPIN-400-Säulen. Das Profil der
einzelnen Fraktionen wurde elektrophoretisch in einem 1.1 % (w/v) Agarosegel überprüft. Die
ersten drei Fraktionen, die cDNA enthielten, wurden gepoolt und in den Vektor λTriplEx2
ligiert.
Ligation
Zur Ligation der cDNA in den Vektor xTriplEx2 wurden pro cDNA-Bibliothek drei
Ligationsansätze vorbereitet. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze ist in Tabelle 12
wiedergegeben.
Tab. 12: Zusammensetzung der Ligationsansätze.
Komponente 1. Ligationsansatz (µl) 2. Ligationsansatz (µl) 3. Ligationsansatz (µl)
cDNA (50 ng/µl) 0.5 1.0 1.5
Vektor DNA (500 ng/µl) 1.0 1.0 1.0
10 x Ligationspuffer 0.5 0.5 0.5
10 mM ATP 0.5 0.5 0.5
T4 DNA Ligase 0.5 0.5 0.5
A. bidest. (steril) 2.0 1.5 1.0
Gesamtvolumen (µl) 5.0 5.0 5.0
Die Ligation selbst erfolgte über Nacht bei 16 °C.
Material und Methoden 49
In vitro-Verpackung in λ-Phagen
Die in vitro-Verpackung der rekombinierten DNA in λ-Phagenköpfe erfolgte mittels des
Gigapack III Gold Packaging Extracts der Fa. Stratagene (Heidelberg, Deutschland) gemäß den
Angaben des Herstellers.
2.3.11.1.2 Titerbestimmung
Das wichtigste Charakteristikum einer cDNA-Bibliothek ist die sogenannte Representativität, die
Angabe darüber, ob alle mRNA-Moleküle in Form ihrer cDNAs in der Bibliothek vertreten sind.
Eine mittels des SMART cDNA Library Construction Kit der Fa. Clontech (Palo Alto, USA)
erzeugte, unamplifizierte cDNA-Bibliothek sollte mehr als 1 x 106 unabhängige Klone enthalten,
um representativ zu sein (Handbuch, SMART cDNA Library Construction Kit der Fa. Clontech,
Palo Alto, USA). Der Titer der unamplifizierten cDNA-Bibliotheken wurde bestimmt, inde m die
Zahl der plaque forming units (pfu) pro ml Phagensuspension ermittelt wurde (SAMBROOK et al.,
1989). Hierzu wurden die Phagensuspensionen 1:10 und 1:15 mit SM-Puffer (1 M NaCl,
0.1 M MgSO4, 0.35 M Tris-HCl, pH7,5) verdünnt und jeweils 1 µl zu 200 µl einer
Übernachtkultur von E.coli XL1-Blue-Zellen gegeben. Nach Inkubation für 15 min bei 37 °C
wurden die Suspensionen mit je 2 ml geschmolzenem Top-Agar (48 °C) versetzt und
luftblasenfrei auf 37 °C vorgewärmte LB-Agarplatten gegossen. Auf die Agarplatten waren
zuvor je 50 µl 100 mM IPTG und 100 mM X-Gal verteilt worden. In dem Vektor λTriplEx2
liegt die Multiple cloning site (MCS) in dem für das α-Polypeptid der β-Galactosidase (lacZ’)
codierenden Sequenzbereich. Dies ermöglicht es, die Insert-tragenden Phagen mittels lacZ α-
Komplemetation zu identifizieren (siehe Blau-Weiß-Selektion, 2.3.8.6). Nach Erstarren des Top-
Agars, wurden die Platten für 7-8 h zur Ausbildung der Plaques bei 37 °C inkubiert. Die
Ermittlung der pfu/ml erfolgte durch Auszählen der Plaques pro Agarplatte und wurde unter
Berücksichtigung der entsprechenden Verdünnungsfaktoren mit ca. 1.1 x 107 (1. cDNA
Bibliothek) bzw. 1 x 107 (2. cDNA Bibliothek) bestimmt. 85 % der erhaltenen Plaques waren
rekombinante Klone.
Nach Amplifikation der cDNA-Bibliotheken erfolgte erneut eine Titerbestimmung, wobei nach
der zuvor beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen wurde. Unterschiede bestanden in den
angesetzten Verdünnungen der Phagensuspensionen. Verdünnungen von 1:100, 1:1000, 1:10000
und 1:100000 wurden angesetzt und die pfu/ml für die 1. cDNA-Bibliothek mit 3.5 x 109 bzw.
für die 2. cDNA Bibliothek mit 2.6 x 109 bestimmt.
Material und Methoden 50
2.3.11.1.3 Amplifizierung
Die Amplifikation der primären cDNA-Bibliotheken erfolgte durch die Vermehrung der Phagen
in dem Wirtsstamm E. coli XL-1 Blue. Hierzu wurden die Phagen auf den Wirtsstamm plattiert
und nach Inkubation der Platten für 6-7 h bei 37 °C die Phagenplaques resuspendiert, indem die
Platten vorsichtig mit SM-Puffer gespült wurden. Die Vervielfältigung der primären cDNA-
Bibliotheken war einerseits notwendig, um die Stabilität der Bibliotheken zu erhöhen,
andererseits, um nicht durch die Menge des Materials limittiert zu sein. Während unamplifizierte
cDNA-Bibliotheken nur für kurze Zeit einen stabilen Titer und da mit ihre Repräsentativität
behalten, können amplifizierte Bibliotheken bis zu 7 Monate bei 4°C ober mindestens ein Jahr in
DMSO (Endkonzentration 7 % (v/v)) bei –80 °C aufbewahrt werden, ohne ihre Repäsentativität
zu verlieren (SAMBROOK et al. 1989).
Die Anzahl der zum Ausplattieren des Wirtsstammes benötigen LB-Agarplatten wurde in
Abhängigkeit von der zu amplifizierenden Anzahl an unabhängigen Klonen pro cDNA-
Bibliothek kalkuliert. Die Verdünnung der Phagensuspensionen erfolgte so, daß pro LB-
Agarplatte (Durchmesser150 mm) ca 1 x 105 Plaques zu erwarten waren. Jeweils 100 µl der
verdünnten Phagensuspensionen wurden mit 500 µl E. coli-XL-1-Blue Zellen für 15 min bei
37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Suspensionen mit 4.5 ml geschmolzenem Top-Agar
(48 °C) versetzt und luftblasenfrei auf die vorgewärmten LB-Agarplatten gegossen. Nach dem
Erkalten der Top-Agarschicht erfolgte die Inkubation der Platten für 6-7 h bei 37°C zur
Ausbildung der Phagenplaques. Nach Zugabe von 12 ml SM-Puffer und durch vorsichtiges
Schütteln der Platten bei 4 °C für 18 h und 1 h bei RT wurden die lysierten Phagen gewonnen.
Die anschließende Extraktion der vereinigten Lysate mit 0.25 Volumen an Chloroform diente
der Lyse noch vorhandener E. coli-Zellen bzw. der Entfernung vorhandener Zellrückstände. Die
amplifizierten cDNA-Bibliotheken wurden mit DMSO bis zu einer Endkonzentration von
7 % (v/v) versetzt und bei –80°C gelagert.
2.3.11.2 In vivo-Excision von pTriplEx2 aus λTriplEx2
Der Phagemidvektor λTriplEx2 ist derart konstruiert, daß durch eine Cre-Rekombinase
vermittelte Rekombination an den loxP Stellen des Phagemidvektors die effiziente in vivo-
Excision des Plasmides pTriplEx2 möglich ist. Die in vivo-Excision der Plasmide geschieht
automatisch bei der Transduktion der Phagen in einem E. coli Wirtsstamm, in dem die Cre-
Rekombinase exprimiert wird.
Material und Methoden 51
20 ml einer bei 30 °C über Nacht angezogenen Kultur von von E. coli BNN132 mit einer OD600
von 0.5 wurden durch Zentrifugation (4000 x g, 4 °C) sedimentiert und in 12 ml 10 mM MgCl2
resuspendiert. Anschließend wurden je 108 Phagen mit 1ml dieser Bakteriensuspension für
30 min bei 30°C inkubiert, mit 2 ml LB-Medium versetzt und für eine weitere Stunde einer
Inkubation bei 30°C, jedoch unter Schütteln (230 rpm), unterzogen. Das Ausplattieren der
Bakterien erfolgte auf Carbenicillin, IPTG-und X-Gal-haltigen LB-Platten, die für 16-18 h über
Nacht bei 37 °C inkubiert wurden.
2.3.11.3 Anzucht der EST-Klone
Nach erfolgter in vivo-Excision der rekombinanten Plasmide pTriplEx2 in dem E. coli Stamm
BNN132 wurden für jede cDNA-Bibliothek 960 einzelne, rekombinante Plasmide tragende
Bakterienkolonien mittels steriler Zahnstocher gepickt. Mit jeder einzelnen Kolonie wurden je
1.5 ml Carbenicillin haltiges LB-Medium inokuliert, und die Bakterien in 96-well Kulturplatten
bei 37 °C unter Schütteln angezogen. Die Kulturplatten waren zuvor mit einer den Gasaustausch
ermöglichenden Membran verschlossen worden, um die sterilen Bedingungen zu wahren. Die
Kulturdauer betrug zwischen 30 und 48 h, je nachdem wie gut die einzelnen Kulturen wuchsen.
Von jeder der 1920 angezogenen Bakterienkulturen wurden 200 µl abgenommen und
Glycerinstammkulturen in 96 well Mikrotiterplatten durch Versetzen der Suspensionen mit
Glycerin (Endkonzentration 15 % (w/v)) angelegt. Die Zellen der je verbleibenden 1.48 ml
Bakteriensuspension wurden durch Zentrifugation der Kulturplatten für 10 min mit 1000 x g
sedimentiert, das überständige Medium abgegossen und die Platten bis zur maschinellen
Plasmidpräparation bei –20°C eingefroren.
2.3.11.4 Sequenzierung aus EST-Klonen isolierter Plasmid-DNA
Die Sequenzierung der aus 1920 EST-Klonen isolierten Plasmide erfolgte an der Universität
Umeå (Schweden) in der Abteilung für Pflanzenphysiologie mit dem CEQ 2000 XL DNA
Analysis System (Beckman Coulter, Fullerton, USA). Dieses System vermag parallel 96 in einer
Mikrotiterplatte vorgelegte Sequenzierreaktionen durchzuführen, wobei pro Reaktion für die vier
Basen je ein unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt wird. Die Auftrennung mittels
Kapillar-Elektrophorese und die zeitaufgelöste Messung der Intensitäten der vier
basenspezifischen Fluoreszenzsignale verlaufen voll automatisiert. Die Sequenzdaten können als
verschiedene Formate ausgegeben werden (*.abd,*.scf,*.fas,*.txt) und mittels anderer
Programme als Chromatogramme dargestellt werden.
Material und Methoden 52
Pro Sequenzierreaktion wurden 0.5-1.5 µg Plasmid-DNA eingesetzt. Die Qualität und Quantität
der maschinell präparierten Plasmide wurde aufgrund der großen Anzahl der Proben nur
stichprobenartig mitte ls Agarosegelelektrophorese analysiert. Für die zyklische Sequenzierung
(cycle sequencing) beruhend auf der Kettenabbruch-Methode nach SANGER (1977) wurde das
CEQ 2000 Dye terminator Cycle Sequencing Kit der Fa. Beckman Coulter (Fullerton, USA)
verwendet.
2.3.11.5 Verarbeitung von Sequenzdaten: Bioinformatik
Die bioinformatische Analyse der mittels des CEQ 2000 XL DNA Analysis Systems (Beckman
Coulter, Fullerton, USA) generierten Sequenzrohdaten umfaßte die halbautomatisierte
Bestimmung der Basenabfolge (basecalling), die Editierung und die Assemblierung der
Sequenzen sowie die Annotierung und die Homologiesuche in Datenbanken.
Bestimmung der Basenabfolge (basecalling)
Sequenzrohdaten wurden im „*.scf“ Format ausgegeben und die Basenabfolge mit Hilfe des
base caller Programms Phred bestimmt. Hierbei wird über Algorithmen die Wahrscheinlichkeit
berechnet, wann die Base A,T,C oder G an Position XYZ im DNA-Sequenzchromatogramm
vorhanden ist. Die Intensitäten der Fluoreszenzsignale sind entschiedend für die Auswertung der
Chromatogramme. Ab einem bestimmten Signal/Rausch-Verhältnis läßt sich die Sequenz nicht
mehr eindeutig ermitteln. Daher können Fehlinterpretationen, fälschliche Insertionen und
Deletionen einzelner Basen vorkommen. Das Programm Phred wurde für die Bestimmung der
Basenabfolge gewählt, da es sich im Vergleich zu anderen base caller Programmen (z.B. ABI
Software) durch eine sehr hohe Bestimmungsgenauigkeit auszeichnet. Das Programm bewertet
zur Fehlerabschätzung die Qualität einzelner Teilsequenzen, indem es durch Auswertung der
Fluoreszenspeaks eine lokale Fehlerwahrscheinlichkeit p bestimmt. Diese dient dazu einen
Qualitätsfaktor q zu definieren, für den gilt:
q = - 10 log (p)
Der Qualitätsfaktor kann Werte von 4 bis 60 annehmen, wobei höhere Werte mit einer höheren
Bestimmungsgenauigkeit einhergehen. Ein Wert von 40 bedeutet z.B., daß unter jeweils 10.000
Basen im Mittel mit einem Fehler zu rechnen ist.
Material und Methoden 53
Editierung und Assemblierung von Sequenzen
Im Anschluß an die Bestimmung der Basenabfolge wurden die Sequenzen sowohl um die
Sequenzen des Klonierungsvektors pTriplEx2 korrigiert (GCCATTATGGCCGGG) als auch um
die PolyA-Sequenzen. Dies erfolgte automatisch mit Hilfe des Programmes „vectorstrip“ von
EMBOSS (Version 2.3.45). Bei der darauffolgenden Assemblierung von Contigs wurden
Sequenzen, die aufgrund von überlappenden Sequenzbereichen zusammengehören, zu Klustern
(Contigs) zusammengefaßt. Von allen Teilsequenzen in einem Contig wurde zudem eine
Consensus-Sequenz generiert. Die Vorgehensweise entspricht der Bildung eines Multiplen
Sequenz Aligments. Der Assemblierungsprozeß selbst gliedert sich somit in drei Schritte: der
Bestimmung überlappender Regionen, der Bildung von Contigs und der Generierung der
Consensus-Sequenz. Das Assembly erfolge vollautomatisch mit Hilfe des „phragment assembly
program“, kurz Phrap genannt (Version 0.990319).
Annotierung und Homologiesuche in Datenbaken
Bei der Annotierung einer Sequenz wird versucht, die DNA-Sequenz zu identifizieren. Dies
geschah durch Homologiesuche mittels der Vergleichsalgorithmen der Programmgruppe Basic
Local Aligment Search Tool (BLAST, ALTSCHUL et al. 1997). Als Vergleichsdatenbank wurde
die Protein -Sequenzdatenbank Swiss-Prot gwählt (Stand Juni 2001). Die Homologiesuche
erfolgte auf Proteinebene, nachdem eine DNA-Sequenz je nach reading frame in die möglichen
Proteinsequenzen translatiert worden war (Programm: blastx). Dies ermöglicht es, wesentlich
weiter entfernte Homologien zu detektieren als auf DNA-Ebene.
Ergebnisse 54
Ergebnisse
12 Mitglieder der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha konnten über zwei
verschiedene methodische Ansätze identifiziert werden (3.1.1). Neun der ermittelten cDNA-
Sequenzen lassen sich Proteinen des Antennensystems des PSII zuordnen, eine Sequenz dem des
PSI. Weiterhin konnte für das ebenfalls zur cab-Genfamilie Höherer Pflanzen zählende PsbS-
Protein eine Teilsequenz ermittelt werden, sowie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana
ähnliche Sequenz.
Die von den ermittelten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit den
Sequenzen der homologen Proteine eines Vertreters der Samenpflanzen (A. thaliana) und der
Grünalgen (C. reinhardtii) verglichen. Da für Bryophyten bislang kaum Informationen über
CAB-Proteine vorliegen, sollten so charakteristische Unterschiede bzw. Gemeinsamkeiten
herausgearbeitet werden (3.1.2).
Weitere Untersuchungen bezogen sich auf die Analyse der Expression einzelner cab-Gene von
M. polymorpha (3.1.3). Zum einen wurden Veränderungen in der Expression des Sep1-ähnlichen
Gens als Folge von Lichtstreß aufgezeigt. Zum anderen konnte gezeigt werden, daß die
Expression verschiedener cab-Gene von M. polymorpha einer diurnalen Rhythmik unterliegt. Im
Vergleich zu dem für viele Pflanzenspecies beschriebenen Expressionsmuster bestehen je doch
charakteristischen Unterschiede.
3.1 Strategien zur Identifizierung einzelner Mitglieder der cab-Genfamilie
Zahlreiche molekularbiologische Methoden stehen für die gezielte Klonierung von Genen zur
Verfügung. Bei der Wahl einer geeigneten Methode zur Klonierung der kerncodierten Lhc-Gene
von M. polymorpha war folgendes zu berücksichtigen:
- es sollte ein möglichst vollständiges Bild von der Zusammensetzung der cab-Genfamilie
gewonnen werden.
- das nukleäre Genom von M. polymorpha war nahezu uncharakterisie rt. So lag auch keine
Nukleotidsequenz für ein cab-Gen vor. Zudem mangelte es an einer Codon usage für die
Aminosäuren kerncodierter Proteine.
- Die verschiedenen CAB-Proteine sind sehr homolog zueinander. Die N-Termini sind
noch die am wenigsten konservierten Bereiche (PICHERSKY & JANSSON 1996).
Ergebnisse 55
- KILIAN und Mitarbeiter (1998) konnten vier Aminosäureteilsequenzen für CAB-Proteine
ermitteln. Allerdings ließen sich nur zwei dieser Sequenzen eindeutig als Lhcb4- bzw. Lhcb6-
Teilsequenz identifizieren und den N-Termini der jeweiligen Proteine zuordnen.
Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen wurden zwei verschiedene Strategien zur
Identifizierung der einzelnen Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha verfolgt.
Zunächst wurde versucht, über RT-PCR die cDNAs der Lhc-Gene Lhcb4 und Lhcb6 zu
amplifizieren. Hierfür wurden die von KILIAN und Mitarbeitern (1998) ermittelten
Aminosäureteilsequenzen für Lhcb4 und Lhcb6 für die Ableitung von Primern herangezogen.
Aufgrund der großen Sequenzähnlichkeit der CAB-Proteine in den Helixbereichen hätten die
mittels RT-PCR amplifizierten Lhc-cDNAs dann als Sonden beim Screenen einer cDNA-Bank
von M. polymorpha eingesetzt werden können, um weitere Mitglieder der Genfamilie zu
identifizieren.
Da sich im Verlauf der Arbeit jedoc h die Möglichkeit der Herstellung und Sequenzierung von
expressed sequence tags (ESTs) von M. polymorpha bot, wurde die zunächst eingeschlagene
Strategie durch die oben umrissene Methodik nur bis zum Schritt der RT-PCR verfolgt.
Die Herangehensweise über die Sequenzierung von 1920 EST-Klonen versprach in der für die
Arbeit zur Verfügung stehenden Zeit weitaus mehr Mitglieder der cab-Genfamilie identifizieren
zu können. Auch die Chance Gene für bisher nicht bekannte CAB-Proteine zu finden, erhöhte
sich durch diesen methodischen Ansatz.
Obwohl sowohl das plastidäre und auch das mitochondriale Genom von M. polymorpha schon
komplett durchsequenziert waren (OHYAMA et al. 1986, ODA et al. 1992), lagen wenig
Sequenzen kerncodierter Gene vor. Durch die partielle Ana lyse des nukleären Genoms von
M. polymorpha mittels der Analyse von ESTs konnte eine Vielzahl an Sequenzinformation
gewonnen werden, die die Grundlage für weiterführende Forschungsvorhaben bildet.
3.1.1 RT-PCR
Da zu Beginn der Arbeiten noch keinerlei Infor mation über die bevorzugte Nutzung von Codons
für die Aminosäuren kerncodierter Proteine von M. polymorpha vorlag, wurde bei der
Konstruktion der Primer auf die von M. paleacea bekannte Codon Usage zurückgegriffen.
Ausgehend von Gesamt-RNA erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in die
entsprechende cDNA mit Hilfe eines sich an den 3’-Poly(A)-Enden der mRNAs anlagernden
oligo(dT)17-Primers. Für die sich anschließende PCR wurde ein Primersystem aus dem
„genspezifischem“ Primer (Lhcb4 bzw. Lhcb6) und dem oligo(dT)17-Primer eingesetzt.
Ergebnisse 56
Gesamt-RNA von M. polymorpha wurde 4 h nach dem Beginn der Lichtphase isoliert.
Ausschlaggebend für den raschen Erfolg einer RT-PCR ist auch immer der Gesamtanteil der
mRNA des gewünschten Produktes an eingesetzter Gesamt-RNA. Über die Expression der
verschiedenen Lhc-Gene von M. polymorpha war zu Beginn der Arbeiten nichts bekannt. Wenn
ihre Expression ebenfalls der für viele pflanzliche Species beschriebenen typischen diurnalen
Rhythmik (PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT et al. 1996) unterliegt, sollte 4 h nach dem
Beginn der Lichtphase ein hoher Spiegel an mRNAs für Lhc-Proteine vorliegen. Der mRNA-
Gehalt für Lhc-Proteine steigt bei Angiospermen z.B. gerade mit Beginn der Lichtphase an und
erreicht um die Mittagszeit ein Ma ximum (PIECHULLA et al. 1993). Bleibt die Expression der
Lhc-Gene von M. polymorpha wie für das Lebermoos Conocephalum conicum beschrieben
(OBERSCHMIDT et al. 1996) dagegen konstant, ist der Zeitpunkt der Probennahme für die
Isolierung von Gesamt-RNA nicht bedeutsam.
Der methodische Ansatz, mittels RT-PCR die cDNAs der Lhc-Gene Lhcb4 und Lhcb6 von
M. polymorpha zu amplifizieren war nur für das Lhcb6-Gen erfolgreich.
Bei der RT-PCR zur Amplifizierung der Lhcb4 cDNA wurden mehrere im gleichen
Größenbereich liegende PCR-Produkte amplifiziert. Die Bedingungen für die RT-PCR konnten
nicht dahingehend optimiert werden, daß ein einzelnes PCR-Produkt amplifizierbar war. Da sich
die Möglichkeit der Erzeugung und Sequenzierung von ESTs von M. polymorpha bot, wurde der
methodische Ansatz ein Lhcb4-Gen mittels RT-PCR zu amplifizieren nicht weiter verfolgt.
Amplifikation der cDNA eines Lhcb6-Gens
Unter Verwendung des für die Amplifikation der Lhcb6 cDNA konstruierten Primersystems
konnte mittels RT-PCR ein einzelnes PCR-Produkt stark angereichert werden. Da die Größe des
PCR-Produktes mit ca. 820 bp der zu erwartenden Größe entsprach, wurde das PCR-Produkt
aufgereinigt, in den Vektor pBluescript SK(+) kloniert und sequenziert.
Der Homologievergleich mittels des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al. 1997) ergab,
daß die erhaltene Nukleotidsequenz für ein Protein codiert, das 76% Übereinstimmung zu dem
reifen Lhcb6-Protein von Spinacia oleracea aufweist. Sequenzierungsfehler wurden durch
vierfaches Sequenzieren der DNA-Stränge ausgeschlossen.
Die vollständige Nukleotidsequenz und die von der Nukleotidsequenz abgeleitete
Aminosäuresequenz sind in Abbildung 8 dargestellt.
Das als Lhcb6 identifizierte 819 bp lange cDNA-Fragment von M. polymorpha codiert für ein
Protein von 221 Aminosäuren. Somit ist es um sieben Aminosäuren länger als die von
PICHERSKY & JANSSON (1996) ermittelte Konsensussequenz für Lhcb6.
Ergebnisse 57
Da der N-terminale Primer zur Amplifizierung von der von KILIAN und Mitarbeitern (1998)
ermittelten Aminosäureteilsequenz abgeleitet worden war, ist unklar, ob der N-terminale Bereich
möglicherweise noch länger ist.
Interessanterweise unterscheidet sich der N-terminale Bereich der in dieser Arbeit für
M. polymorpha identifizierten Lhcb6-Sequenz von dem von KILIAN und Mitarbeitern (1998)
bestimmten N-Terminus des Lhcb6-Proteins von M. polymorpha. Abbildung 9 zeigt ein
Alignment der beiden N-Termini.
1 accaagaaggtggccgctaagcccgccttcaagggaggaaagggaggaaagctttcgtgggtcccc T K K V A A K P A F K G G K G G K L S W V P 22
67 gccatcaagagcggaggtagcttcgtcgaccccgagtggctcgatggctcgctcccaggagactac
A I K S G G S F V D P E W L D G S L P G D Y 44
133 ggcttcgaccccttgggactcggaagggaccctgctgctctgaagtggtacagggaagccgagatc G F D P L G L G R D P A A L K W Y R E A E I 66
199 atccacggccgatgggcgatggcagctgttcttggaatcttcgtcggtcaggcctggagcggtatc I H G R W A M A A V L G I F V G Q A W S G I 88
265 ccctggttcgaggccggtgccgatccctcggccgtggcaccattctccttcggaaccctgttggga P W F E A G A D P S A V A P F S F G T L L G 110
331 acccagctgttgttgatgggatgggtcgagggcaagagatgggcagactacgtgaaccccaactct T Q L L L M G W V E G K R W A D Y V N P N S 132
397 cagttggtcgactgggccactccatggtcgaggaccgcagagaacttcggtaactccaccggtctc Q L V D W A T P W S R T A E N F G N S T G L 154
463 cagggataccccggaggcaagttcttcgaccctctgagccttgctggagatgtgaagaacggaaag Q G Y P G G K F F D P L S L A G D V K N G K 176
529 tacaccaccgactacgacaagctcagcaggttgcagctcgccgagatcaagcactccagactcgcg Y T T D Y D K L S R L Q L A E I K H S R L A 198
595 atgttggccatgcttatcttctacttcgaggctggacagggactgacccccctcggtgccctcgga M L A M L I F Y F E A G Q G L T P L G A L G 220
661 ctgtaaatgtaatttagctgaccctgtgtatgatgtgtagtaattagccgaaatccaggactcgac L 231
727 cccactgagaatcttccgacagtcaaatcgactctgttttttgtaccgaacttgtgattatattct
793 tgcccttcacgaaaaaaaaaaaaaaaa Abb. 8: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb6 aus M. polymorpha. Besonders gekennzeichnet (grau unterlegt) sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D (KÜHLBRANDT et al. 1994). Die linke Nummerierung bezieht sich auf die Anzahl der Basen, die rechte auf die der Aminosäuren.
Ergebnisse 58
Unterschiede bestehen in einer Insertion von drei Aminosäuren, die die von KILIAN und
Mitarbeiten (1998) ermittelte Sequenz nicht aufweist, sowie in fünf weiteren Aminosäuren. Es
scheint sich somit um zwei verschiedene Lhcb6-Proteine von M. polymorpha zu handeln. Sie
werden im folgenden als Lhcb6.1 (KILIAN et al. 1998) und Lhcb6.2 (hier ermittelte Sequenz)
bezeichnet.
Lhcb6.1 TKKVAAKPS---GKGGKLSWIPAVKGGGSLVD Lhcb6.2 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVD
Abb. 9: Alignment der von KILIAN und Mitarbeitern (1998) ermittelten Aminosäureteilsequenz für den N-Terminus des Lhcb6-Proteins von M. polymorpha (Lhcb6.1) mit dem N-terminalen Bereich, des in dieser Arbeit identifizierten Lhcb6-Proteines von M. polymorpha (Lhcb6.2). Unterschiede zwischen den Sequenzen sind orange unterlegt.
3.1.2 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels „expressed sequence tags“
Über die Erzeugung und computergetützte Analyse einer Vielzahl ansequenzierter cDNA-Klone
(expressed sequence tags, ESTs) lassen sich relativ schnell Informationen über die codierenden
Sequenzabschnitte von uncharakterisierten Genomen erhalten (BOUCHEZ & HÖFTE 1998).
Sequenzdatenbanken mit ihrem enormen Informationsgehalt dienen dabei als wertvolle Quelle
zur Identifizierung homologer Nukleotidsequenzen.
Zwei verschiedene cDNA-Banken von M. polymorpha wurden hergestellt und 1920 cDNA-
Klone ansequenziert und analysiert. Die Anzahl der zu sequenzierenden EST-Klone von
M. polymorpha war auf 1920 begrenzt worden, da unter einer vergleichbaren Anzahl von EST-
Sequenzen der Pappel nahezu alle Nukleotidsequenzen für die verschiedenen Mitglieder der cab-
Genfamilie zu finden waren (JANSSON, persönliche Mitteilung).
Beeinflußt von Umweltfaktoren wird gewebespezifisch jeweils nur ein bestimmter Teil des
gesamten Genoms eines Organismus exprimiert. Für die Gene der ELIPs und Seps konnte
gezeigt werden, daß ihr mRNA-Gehalt unter Lichtstress stark ansteigt (JANSON 1999, HEDDAD &
ADAMSKA 2000). Die Chance auch Homologe zu diesen Genen zu identifizieren, wurde dadurch
erhöht, daß die mRNA für eine der cDNA-Bibliotheken aus Thalli isoliert wurde, die drei Tage
vor der Isolierung der mRNA einer 10fach erhöhten Quantenflußdichte (300 µmol m-2 s-1)
ausgesetzt worden waren. Von jeder der beiden cDNA-Bibliotheken wurden 960 zufällig
ausgewählte cDNA-Klone vom 5’-Ende her ansequenziert.
Ergebnisse 59
3.1.2.1 Bioinformatische Analyse der EST-Sequenzen
Von den insgesamt 1920 ansequenzierten EST-Klonen konnten nach Analyse der erhaltenen
Sequenzrohdaten 1838 Nukleotidsequenzen einer weiteren bioinformatischen Auswertung
unterzogen werden. Die durchschnittliche Länge der EST-Sequenzen betrug 550 bp.
1399 EST-Sequenzen von M. polymorpha ließen sich zu 202 unabhängigen Clustern
zusammenfassen. Die verbleibenden 439 Sequenzen repräsentieren sogenannte Singlet-
Sequenzen (Sequenzen, die nur einmal innerhalb des ausgewerteten Datensatzes an Sequenzen
auftreten). Die Anzahl an unabhängigen EST-Sequenzen betrug somit 641. Diese 641 Sequenzen
wurden mit Hilfe des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al.1997) einem Vergleich mit
den in der Swiss-Prot.-Datenbank registrierten Sequenzen unterzogen.
176 der 641 unabhängigen EST-Klonen wiesen eine signifikante Ähnlichkeit zu einem in der
Datenbank registrierten Protein auf. Jedoch mehr als die Hälfte (72%) der Sequenzen ließen sich
nicht identifizieren (Abb. 10). In Anlehnung an die Arbeiten von NISHIYMA und Mitarbeitern
(2000) war ein Ähnlichkeitswert (score bits) von mindestens 100 als Grenzwert gesetzt worden,
um einen Treffer als signifikant zu definieren. Allerdings wurde kein weiterer Vergleich nur auf
Nukleotidebene durchgeführt. Somit läßt sich nicht mit Sicherheit sagen, ob die 465 ESTs ohne
Ähnlichkeit zu einem in der Swiss-Prot.-Datenbank registrierten Protein wirklich neue
Transkripte darstellen.
72%
23%
5%
nicht identifiziert
Ähnlichkeit zu einer Proteinsequenzeiner pflanzlichen Species
Ähnlichkeit zu einer Proteinsequenzeiner nicht pflanzlichen Species
Abb. 10: Anteil an EST-Klonen mit oder ohne signifikanter Ähnlichkeit zu einem bekannten Protein. Die Datenbankenrecherche erfolgte mittels des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al. 1997). Vergleichsdatendank war die Swiss-Prot.-Datenbank. Als signifikante Treffer wurden jene angesehen, die einen Ähnlichkeitswert (score bits) von mindestens 100 aufwiesen.
Ergebnisse 60
Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf die weitere bioinformatische Auswertung wie die
Klassifizierung der ESTs nach Funktionen der von ihnen codierten Proteine oder ein Vergleich
zwischen den von den verschiedenen cDNA-Banken generierten ESTs verzichtet. Ein derartiger
Vergleich könnte z.B. Aufschluß darüber geben, welche Proteine insbesonders unter Lichtstress
exprimiert werden. Mit dem in dieser Arbeit erarbeiteten Datenmaterial wurde jedoch die solide
Grundlage für derart weiterführende Analysen gelegt. Die Ergebnisse des Vergleiches mit der
Swiss-Prot.-Datenbank für sämtliche in dieser Arbeit sequenzierte ESTs sind dem Anhang zu
entnehmen.
3.1.2.2 ESTs mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen
Insgesamt 41 der 1838 auswertbaren EST-Sequenzen zeigen Ähnlichkeit mit einer in der Swiss-
Prot.-Datenbank registrierten Sequenz für ein Chlorophyll a/b-bindendes Protein. Diese 41
Sequenzen schließen auch jene mit ein, deren Ähnlichkeitswert zu einem CAB-Protein unter 100
lag (Tab. 13). Als wesentliches Kriterium für die Identifizierung als Mitglied der Lhc-Genfamilie
wurde das Vorhandensein des hoch konservierten LHC-Motivs (1.3.1.1) herangezogen.
Tab. 13 : ESTs von M. polymorpha mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen. Bezüglich der mutmaßlichen Identifizierung wurde jeweils das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, angegeben. Es sei hier auf die verschiedenen für CAB-Proteine verwendeten Nomenklaturen verwiesen (1.3.1). Einträge von ESTs mit einem Ähnlichkeitswert unter 100 wurden grau unterlegt.
EST a) L b) Ä c) mutmaßliche Identifizierung Organismus d) Datenbanknr. C07P.E02 520 164 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4
(LHCI Type III CAB-4) Arabidopsis thaliana sp|P27521|
C02P.D04 484 57 Chlorophyll a/b bindendes Protein 1 (LHCII Type I)
Chlamydomonas moewusii sp|P22686|
35 (2 Klone)
601 162 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4 (LHCII Type I CAB-4)
Lycopersicon esculentum sp|P14278|
72 (2 Klone)
498 232 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB-4)
Lycopersicon esculentum sp|P14278|
88 (2 Klone)
609 261 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4 (LHCII Type I CAB-4)
Lycopersicon esculentum sp|P14278|
178 (8 Klone)
628 310 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB-4)
Lycopersicon esculentum sp|P14278|
185 (9 Klone)
686 64 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB)
Petunia x hybrida sp|P13869|
188 (12 Klone)
661 294 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB)
Silene pratensis sp|P12332|
127 (3 Klone)
572 244 Chlorophyll a/b bindendes Protein 13 (LHCII Type III)
Lycopersicon esculentum sp|P27489|
C05P.A12 437 41 Photosystem II 22 kD Protein (PsbS)
Spinacia oleracea sp|Q02060|
D10P.G07 541 85 Photosystem II 22 kD Protein (PsbS)
Lycopersicon esculentum sp|P54773|
a) Contigs werden nur mit einer Nummer bezeichnet, während Singlets mit einer Kombination von Zahlen und Buchstaben bezeichnet werden.
b) sequenzierte Länge der ESTs (bp). c) Ähnlichkeitswert (score bits). d) Organismus, aus dem das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, isoliert wurde
Ergebnisse 61
Wie Tabelle 13 zu entnehmen ist, lassen sich 38 der Sequenzen zu 7 unabhängigen Contigs
gruppieren. Die von den Konsensussequenzen der Contigs 35, 72 , 88 und 178 abgeleiteten
Aminosäureteilsequenzen sind jeweils dem Lhcb1-Protein der Erbse mit der Datenbanknummer
P14278 am ähnlichsten. Das Alignment der Aminosäuresequenzen zeigt, daß die cDNA Klone
eines jeden Contigs aber für unterschiedliche Proteine kodieren (Abb. 11). Die genannten
Contigs repräsentieren somit nicht nur sich überlappende Teilsequenzen ein und desselben
Genes. Auf Nukleotidebene sind die Unterschiede zwischen den genannten Contigs noch
ausgeprägter als auf Aminosäureebene (Tab. 14 und 15).
Tab. 14: Unterschiede zwischen den Contigs 35, 72, 88 und 178 auf Nukleotidebene. Es wurden nur die die ersten 435 bp des translatierten Bereiches verglichen (kürzeste Sequenz: Contig 72, 435 bp). Angegeben wurde die Anzahl unterschiedlicher Basen, sowie der Prozentsatz an Identität zwischen den Sequenzen (ID).
Contig 35 72 88 72 41 von 435
(90.6 % ID)
88 67 von 435 (84.6 % ID)
67 von 435 (84.6 % ID)
178 71 von 435 (83.7 % ID)
69 von 435 (84.1 % ID)
81 von 435 (81.4 % ID)
Tab. 15 Unterschiede zwischen den Contigs 35, 72, 88 und 178 auf Aminosäureebene. Es wurden die ersten 145 Aminosäuren ausgehend vom Transitpeptid verglichen (kürzeste Sequenz: Contig 72, 145 AS). Angegeben wurde die Anzahl unterschiedlicherAS, sowie der Prozentsatz an Identität zwischen den Sequenzen (ID).
Contig 35 72 88 72 8 von 145
(94.5 % ID)
88 16 von 145 (89 % (ID)
16 von 145 (89 % ID)
178 24 von 145 (84 % ID)
21 von 145 (85.5 % ID)
23 von 145 84.1 % (ID)
Die vollständige cDNA-Sequenz der in Tabelle 13 aufgeführten EST-Klone wurde schließlich
durch mehrfaches Sequenzieren ermittelt. Von den Contigs war dafür jeweils der EST-Klon mit
dem längsten 5’-Ende ausgewählt worden. Die ermittelten Sequenzen wurden zur eindeutigen
Identifizierung einem erneuten Vergleich mit der Swiss-Prot.-Datenbank unterzogen.
Ergebnisse 62
Contig 35 MAAVTACASTSLAGQALGASSNALAAKVNVGEARVVMRKT-VKSTPTSIWYGEDRPKYLG Contig 72 ...A.....STF............................-................... Contig 88 ..TAT.....F...........E..K..............---GSAP............. Contig 178 -M.A..VSASTFV.....L.G...TQ...............SKAAAPA............ Transitpeptide Contig 35 PFSGATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAKNRELEVIHSRWAMLGALGCVFPELLS Contig 72 .....................................S....A................. Contig 88 ..........................................A................A Contig 178 ..........................................A................A Helix B
Contig 35 KNGVTFGEAVWFKAGSQIFAEGGLDYLGNSSLIHAQSILAIWGCQVVLMGAIEGYRVGGG Contig 72 ....S......S..............---------------------------------- Contig 88 ....K......S..................G.V.........AV.......V....QN.L Contig 178 ....K...........................V.........A..............A.. Helix C
Contig 35 PLGEGLVKIYPGGAFDPL Contig 72 ------------------ Contig 88 .G---------------- Contig 178 ...DVVDP....------
Abb. 11: Alignment der von den Nukleotidsequenzen (Konsensussequenzen) abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Contigs 35, 72, 88 und 178. Grau unterlegt sind die Bereiche der transmembranen Helices (KÜHLBRANDT et al., 1994). Bezogen auf die Sequenz des Contig 35 sind identische Aminosäuren durch Punkte dargestellt (...), die Bereiche der Transitpeptide sind unterstrichen.
3.2 Zusammensetzung der cab-Genfamilie von M. polymorpha
Insgesamt 12 Mitglieder der Lhc-Genfamilie von M. polymorpha konnten in der vorliegenden
Arbeit über die zwei beschriebenen methodischen Ansätze kloniert und identifiziert werden. Wie
der Tabelle 12 zu entnehmen ist, ließen sich 9 zu Lhcb-Genen homologe Sequenzen ermitteln.
Sechs dieser Sequenzen codieren für Proteine, die in Höheren Pflanzen den trimeren LHCII
bilden, drei für die in Höheren Pflanzen als Monomere vorliegenden CAB-Proteine Lhcb4,
Lhcb5 und Lhcb6. Eine für ein Lhca-Protein codierende Sequenz, eine Lhca4-Sequenz, war die
einzige Sequenz, die für ein Protein der peripheren Antenne des PSI ermittelt werden konnte.
Weiterhin wurden zwei Teilsequenzen für ein psbS-Gen und ein dem Sep1 ähnliches Gen
kloniert.
Die Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha scheint somit
generell der für Höhere Pflanzen bekannten vergleichbar. Die Übereinstimmung der reifen
Proteine für die die vollständige Sequenz ermittelt werden konnte mit den homologen Proteinen
Höherer Pflanzen beläuft sich zwischen 76 und 85 % (Tab. 16).
Ergebnisse 63
Tab. 16: Über EST-Sequenzierung und RT-PCR identifizierte Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha.
a) identische Aminosäuren bezogen auf das reife Protein b) Organismus, aus dem das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, isoliert wurde.
Für sechs Lhc-Proteine von M. polymorpha wurden die Sequenzen für die reifen Proteine
vollständig bestimmt (Tab. 16). Abbildung 12 zeigt ein Alignment dieser Sequenzen. Besonders
gekennzeichnet sind in Analogie zu den homologen Proteinen Höherer Pflanzen die Bereiche der
mutmaßlichen transmembranen Helices und der Chlorophylliganden (abgeleitet vom Lhcb1 der
Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994)) sowie mögliche Bindungsstellen für Xanthophylle. Alle
Sequenzen enthalten die für die CAB-Genfamilie hoch konservierten Aminosäuren (GREEN &
KÜHLBRANDT 1995).
Die Ähnlichkeit der einzelnen Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha zueinander
gibt Abbildung 13 wieder. So sind sich die Lhcb2-, Lhcb3- und die verschiedenen als LHCII-
1.1-1.4 bezeichneten nicht eindeutig zuordbaren LHCII-Proteine untereinander ähnlicher als die
anderen CAB-Proteine.
Gen Protein Transitpeptid (AS)
reifes Protein (AS)
EST-Klon % IDa)
Organismusb)
Lhca4 Lhca4 31 (Teilsequenz)
200 C07/P.E02 80 Pinus sylvestris (S31863)
LHCII-1.1 Lhcb1 /2 ? 37 160 (Teilsequenz)
C01P.F03 Contig 35
90 Lycopersicon esculentum (S10857)
LHCII-1.2 Lhcb1 /2 ? 37 108 (Teilsequenz)
C06P.H11 Contig 72
88 Lycopersicon esculentum (P14278)
LHCII-1.3 Lhcb1 /2 ? 37 142 (Teilsequenz)
C09P.E07 Contig 88
88 Lycopersicon esculentum (P14278)
LHCII-1.4 Lhcb1 /2 ? 37 155 (Teilsequenz)
C04P.G06 Contig 178
86 Nicotiana sylvestris (ABO12638)
Lhcb2 Lhcb2
39 226 C.o4P.B09 Contig 188
83 Pinus palustris (U51632)
Lhcb3 Lhcb3 40 223 C06P.H08 Contig 127
85 Lycopersicon esculentum (P27489)
Lhcb4 Lhcb4 45 262 C.06P.F02 83 Vigna radiata (AF139466)
Lhcb5 Lhcb5 39 248 C.02P.D04 77 Zea mays (T02251)
Lhcb6 Lhcb6 nicht ermittelt 221 RT-PCR (3.1.1.1.1)
76 Spinacia oleracea (P36494)
PsbS PsbS nicht ermittelt 79 Teilsequenz
D10P.G07 92 Spinacia oleracea (P36491)
Sep 1? Sep1 ? nicht ermittelt 150 Teilsequenz
C05P.A12 33 Arabidopsis thaliana (AF134139)
Ergebnisse 64
Abb. 12: Alignment der für M. polymorpha bestimmten Aminosäuresequenzen für Lhca4, Lhcb2, Lhcb3,
Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 (jeweils vollständige Sequenz für das reife Protein). Im oberen Bereich sind für
CAB-Proteine konservierte Sequenzmotive dargestellt, die sich über die verschiedenen Farben den
Sequenzen zuordnen lassen. Grün hervorgehoben sind die mutmaßlichen Chlorophylliganden
(dunkelgrün: Chl a, hellgrün: Chl b).
consensus 2
1 3
Helix B Helix C Helix A Helix D
consensus 4 5
konservierte Sequenzmotive:
1: WYGPDRVL oder WFPG 3: VWFKAG 5: FDPLGL
2: GWDTA 4: YPGG 6: FVQA
Helix A consensus: ELWNGRFAMLGLVALAFTE
Helix B consensus: ELIHGRWAMLGALGXIXPE
Lhca4 KKGEWLPGL------PSPAYLNGSLAGDNGFDPLGLAED-------------------------------------------- Lhcb2 ITMRRTKTSTPESIWYGPDRPKFLGPF----SEATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSAD-------------------------------------------- Lhcb3 CRAKVSMDADYWYGPDRPKYLGPF----SAQTPSYLKGEFPGDYGWDTAGLSAD-------------------------------------------- Lhcb4 SAIKKAASAAKGAVKKAAPRPGSADRPLWFP-GAQAPAWLDGTLVGDYGFDPLGLDKPAEYLQYELDSLNQNLAKNEFGDVIGVRVDKKADLNPTPFQPYSE Lhcb5 KAAGKVAKTAPPSNAELAKWYGPDRRIYLPEGLLDKSDIPAYLTGEVPGDYGFDPFGLSKK-------------------------------------------- Lhcb6 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVDPEWLDGSLPGDYGFDPLGLGRD-------------------------------------------- a4 a5 a1 b6 b5 b5 Lhca4 PAALNWYVQAELQNGRWAMLGVAGMLVPEVLTKIGLI---NAPLWYDTGK---------------VEYFAPASTLFVIEFILFHYVEIRRWQDIKYPGSVSQD Lhcb2 PETFSKNRELEVIHSRWAMLGTLGMIFPELLAKNG --ITFGEPIWFKAGSQIFADGGLNYLGNENLIHAQSILAILGCQVVLMGLIEGYRVGGGPLGA----- Lhcb3 PESFAKNRALELIHGRWAMLGALGCILPEALVKYS-RVTLKEAVWFKAGSQIFTDGGLDYLGNPNLVHAQSILAIWAVQVVLMGAVEGYRQNGLPGIG----- Lhcb4 VFGLQRFRECELIHGRWCMLATLGALSVEAFTGVT ---------WQDAGKVELVEGSS-YLGQPLPF---SITTLIWIEVLVIGYIEFQRNAELD-------- Lhcb5 PADFDKYQAYELIHARWAMLGAAGFVLPEAFNKYG -ARCGPEAVWFKTGALLLEGNTLNYFGA--SIPVNLSLAAVIAEVILVGGAEYYRLSPLG-------- Lhcb6 PAALKWYREAEIIHGRWAMAAVLGIFVGQAWSGIP ---------WFEAGA------------DPSAVAPFSFGTLLGTQLLLMGWVEGKRWADYVNPNSQLVD Helix B Helix C a1 a2 a4 a3 b3 Lhca4 PF------FKSYKLPPGDVGYPGGI-FNPL -------------KFPANQEYKEKEIANGRLAMLAFLGMLVQSK-LTGAGPFENLLTHLADPWHTTIIQTLAN Lhcb2 ---------------DLDPIYPGGA-FDPLGLA---------NDPDTFAELKVKEIKNARLAMFSMFGFFVQAI-VTGKGPLDNLLSHIADPATNNAWAYATASPPGQ Lhcb3 ---------------EGGELYPGGKYFDPLGLA---------EDPETFAELKVKEIKNGRFAMFSMFGFFVQAI-VTGKGPLENLLDHLDNPVANNAWVYATNFRPGA Lhcb4 ---------------PEKRLYPGGKYFDPLGLA---------SDPEKKATLQLAEIKHARLAMVAFLGFAVQAAA-TGKGPLDNWATHLSDPLHTTIIDTFSK Lhcb5 --------------SGLDRLHPGGA-FDPLGLA---------KDPDQFALLKVKEIKNGRLAMVSMLGFFIQAY-VTGEGPVENLAAHLSDPFGNNLLTVIGGASERVPT Lhcb6 WATPWSRTAENFGNSTGLQGYPGGKFFDPL SLAGDVKNGKYTTDYDKLSRLQLAEIKHSRLAMLAMLIFYFEAG--QGLTPLGALGL Helix A Helix D
Ergebnisse 65
Abb. 13:Vergleichende Darstellung der relativen Übereinstimmung der für M. polymorpha ermittelten CAB-Proteine (erstellt mittels CLUSTALW).
3.2.1 Proteine des LHCI
Lhca4
Für das Antennensystem des PSI konnte lediglich ein EST-Klon mit einer für ein Lhca4-Protein
codierenden cDNA-Sequenz von 878 bp isoliert werden. Die von der Nukleotidsequenz
abgeleitete Aminosäuresequenz (Abb. 14) weist 80 % Übereinstimmung mit der Lhca4-Sequenz
des reifen Proteines von Pinus sylvestris auf.
Das als Lhca4 identifizierte cDNA-Fragment codiert für 200 Aminosäuren des reifen Proteins
sowie für 31 Aminosäuren des Transitpeptids, das nur unvollständig vorliegt.
0.1
Lhcb3
Lhcb5
Lhca4
Lhcb4
Lhcb6
Lhcb2 LHCII-1.4
LHCII-1.1
LHCII-1.2
LHCII-1.3
Ergebnisse 66
1 gtctcctctccgggaactagcagcactcgcttctccaggaatgtgcaggtcgctgccgctcccatc
A S S P G T S S T R F S R N V Q V A A A P I 22
67 tcttcccaatctttgaaggtcgagggcaagaagggagaatggctgcccggtctcccctcccccgct
S S Q S L K V E G K K G E W L P G L P S P A 44
133 taccttaacggaagcttggccggagacaacggattcgaccccctcggtcttgctgaggaccctgct
Y L N G S L A G D N G F D P L G L A E D P A 66
199 gccttgaactggtacgtccaggccgagctccagaacggacgatgggctatgctcggagttgcaggt
A L N W Y V Q A E L Q N G R W A M L G V A G 88
265 atgttggtgcccgaggttctgaccaagatcggtctgatcaacgcgcccctgtggtacgacaccggt
M L V P E V L T K I G L I N A P L W Y D T G 110
331 aaggtcgagtacttcgctcccgcctcgactcttttcgtgatcgagttcatcctcttccactacgtc
K V E Y F A P A S T L F V I E F I L F H Y V 132
397 gagatcagaaggtggcaagacatcaagtaccctggtagcgtgagccaggaccccttcttcaagagc
E I R R W Q D I K Y P G S V S Q D P F F K S 154
463 tacaagcttccccctggtgatgtcggttaccccggaggtatcttcaaccctctaaagttccccgcc
Y K L P P G D V G Y P G G I F N P L K F P A 176
529 aaccaggagtacaaggagaaggaaatcgccaacggacgattggccatgctcgctttcttgggtatg
N Q E Y K E K E I A N G R L A M L A F L G M 198
595 cttgtgcaatcgaaattgaccggagctggaccttttgagaatttgttgacccaccttgccgacccg
L V Q S K L T G A G P F E N L L T H L A D P 220
661 tggcacacaaccattatccagacactcgcgaactagattatctgcgtcttgtaaagatgggacctg
W H T T I I Q T L A N * 231
727 tccttgatgcggatttatgctagaatttgtcgacgcatccttggagcgttttgatgtattgtacca
793 tgtaactactttctcagaccaccgtgtatttcagcaaaacgacataatttttcttgggccgctgca
859 aaatctctaaaaaaaaaaaa
Abb. 14: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhca4 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen. Die Numerierung links bezieht sich auf die Basen, die rechts auf die Aminosäuren.
Abbildung 15 zeigt ein Alignment der Lhca4 Aminosäuresequenz des reifen Proteins von
M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Die bestehenden
Unterschiede liegen im wesentlichen in Bereichen, die nach der Konsensussequenz von
PICHERSKY & JANSSON (1996) zwischen Lhca4-Sequenzen verschiedener Species wenig
konserviert sind.
Ergebnisse 67
a4 a5 a1 M. polymorpha Lhca4 kKGeWLPGLpSPaYLdGSLpGDNGFDPLGLaEDPAaLNWyvQAELQNGRWAMLGVAGMLv A.. thaliana Lhca4 .........A..D..T..................EN.K.F.....V.............L Helix B b6 b5 b5 M. polymorpha Lhca4 PEVlTkIGliNAPlWYDTGKveYFAPASTLFVIEFILFHYVEiRRWQDIKyPGSVSQDPf A. thaliana Lhca4 -..F.......V.E...A..EQ...SS.......................N....N...I Helix C a1 a2 a4 a3 M. polymorpha Lhca4 FKsYKLPpgdvgYPGGIFNPLKFpAnqEYKEKEIANGRLAMLAFLGMlVQSKLTGAGPFe A. thaliana Lhca4 ..Q.S....E...........N.APT..A.................FV..HNV..K.... Helix A b3 M. polymorpha Lhca4 NLLTHLADPWHTTIiQTlan A. thaliana Lhca4 ...Q..S....N..V..FN- Helix D
Abb. 15: Alignment der Lhca4 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha und A. thaliana (reife Proteine). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D, grün die als mutmaßliche Chlorophylliganden identifizierten Aminosäuren des Lhcb1 der Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994) (hellgrün:Chl b , dunkelgrün: Chl a).Kleine Buchstaben in der Sequenz von M. polymorpha kennzeichnen Aminosäuren, die laut der Konsensussequenz für Lhca4 von PICHERSKY & JANSSON (1996) weniger hoch konserviert sind.
3.2.2 Proteine des LHCII
3.2.2.1 Lhcb1-3
In Höheren Pflanzen setzt sich der trimere Hauptlichtsammelkomplex LHCII aus den Proteinen
Lhcb1-Lhcb3 zusammen. Vier der für M. polymorpha ermittelten Lhc-Sequenzen (Abb. 16/17)
lassen sich weder dem Lhcb1 noch dem Lhcb2 eindeutig zuordnen, obwohl sie diesen Proteinen
am ähnlichsten sind. Die Unterschiede zwischen den vier genannten LHCII-Sequenzen von
M. polymorpha belaufen sich auf Aminosäureebene zwischen 6% und 16%. Im folgenden
werden diese Proteine als LHCII-1.1.-1.4 bezeichnet. Zwei weitere Lhc-Sequenzen von
M. polymorpha konnten hingegen eindeutig als Lhcb2- (EST-Klon C04P.B09 aus Contig 188)
bzw. Lhcb3-Gensequenz (EST-Klon C06P.H08 aus Contig 127) identifiziert werden.
Damit verfügt der Bryophyt M. polymorpha über zwei LHCII-Proteine, die bei Grünalgen noch
nicht zu finden sind, aber in Höheren Pflanzen.
Ergebnisse 68
LHCII-1.1 (Contig 35)
1 aacagtggtatcaacgcagagtgccattttggcgggaactgaatca 47 tttgttcagcatttctcttccatttcccagagcttcgcattcgaccccctgtgcaagtcggaagcc 113 atggccgccgtcaccgcttgcgcttccacctccctcgctggacaggccctcggagcctccagcaat
M A A V T A C A S T S L A G Q A L G A S S N 22
179 gccctcgccgccaaggtgaacgtcggcgaagcccgcgtcgtcatgcgtaagaccgtgaagagcacc A L A A K V N V G E A R V V M R K T V K S T 44
245 cccaccagcatctggtacggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggcGccacccca P T S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66
311 agctacttgaccggtgagttccccggggactacggttgggacactgctggactcTctgctgaccca S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88
377 gagaccttcgctaagaaccgtgaattggaggtgatccactcccgatgggctAtgttgggagctttg E T F A K N R E L E V I H S R W A M L G A L 110
443 ggatgcgtcttccccgagcttttgagcaagaacggagttaccttcggaGaggctgtgtggttcaag G C V F P E L L S K N G V T F G E A V W F K 132
509 gctggctcccagatcttcgctgagggaggtttggactacctcggcaactcgagcctcatccacgct A G S Q I F A E G G L D Y L G N S S L I H A 154
575 cagagcattctggccatctggggctgccaggtcgtcctcatgggggccatcgagggatacagagtg Q S I L A I W G C Q V V L M G A I E G Y R V 176
641 ggcggaggacctttgggtgagggacttgtcaacatctacCccggaggtgcattcgaccccctg G G G P L G E G L V K I Y P G G A F D P L 197
LHCII-1.2 (Contig 72)
1 gagaagctctcactaaaccctcagttcaccgagaaagcttctctcccacctcaccaggacacg
65 atggccgccgctaccgcctgtgcctcctccaccttcgctggtcaggctctcggagcctccagcaat M A A A T A C A S S T F A G Q A L G A S S N 22
131 gccctcgctgccaaggtcaacgttggtgaggctcgcgtggtgatgcgcaagaccgtgaagagcact A L A A K V N V G E A R V V M R K T V K S T 44
197 cccaccagcatctggtacggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggcgccacccca P T S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66
263 agctacttgaccggtgaattccccggtgactacggctgggacaccgctggactctctgctgatcca S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88
329 gagaccttcgccaagaaccgtgaatcggaggtgatccacgcccgatgggccatgttgggagctttg E T F A K N R E S E V I H A R W A M L G A L 110
395 ggatgcgtcttccccgagcttttgagcaagaacggtgtctccttcggagaggcagtgtggtccaag G C V F P E L L S K N G V S F G E A V W S K 132
461 gccggatctcaaatcttcgctgagggagggttggactac A G S Q I F A E G G L D Y 145
Abb. 16 : Nukleotidsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für LHCII-1.1 und -1.2 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.
Ergebnisse 69
LHCII-1.3 (Contig 88)
1 ga
3 acactacatcgttccaactgttgctgcacagaagtcagtttgcgaagtgttcttacgactatcagg
69 atggccacagcaacagcttgcgcatctaccttcttggctggacaggctctcggagcctccagcaat
M A T A T A C A S T F L A G Q A L G A S S N 22
135 gagctcgccaagaaagtcaacgtcggtgaagcccgcgttgttatgcgcaaaggatctgccccatcc E L A K K V N V G E A R V V M R K G S A P S 44
201 agcatctggtatggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggtgccaccccaagctac S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P S Y 66
267 ttgaccggtgaattccccggtgactacggttgggacaccgccggactctctgccgatcccgagacc L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P E T 88
333 ttcgccaagaaccgtgaattggaggtgatccacgctcgatgggccatgttgggagctttgggatgt F A K N R E L E V I H A R W A M L G A L G C 110
399 gtgacccccgagctgctggccaagaacggcgtcaagttcggcgaggcggtgtggttcaaggccgga V T P E L L A K N G V K F G E A V W F K A G 132
465 tcgcagatcttctccgagggaggcctggactacctcggcaattctggccttgtccacgcccagagc S Q I F S E G G L D Y L G N S G L V H A Q S 154
531 atcctggccatctgggcctgccaggtcgtgctcatgggagccgttgagggataccgccagaacggt I L A I W A V Q V V L M G A V E G Y R Q N G 176
597 ctccccgga
L P G
LHCII-1.4 (Contig 178)
1 gaaccattcctctcatactcgaacacttcacctcctctcaccgccttctagtcagc
57 atggccgccaccgccgtctccgcatccaccttcgttggacaggctttgggcctgtccggcaatgcc M A A T A V S A S T F V G Q A L G L S G N A 22
123 ctcacccagaaggtgAatgttggtgaggctcgcgttgtcatgcgcaagacctcgaaggccgccgcc L T Q K V N V G E A R V V M R K T S K A A A 44
189 cccgcctccatctggtacggtgagGaccgacccaagtacttgggcccattctccggagctaccccc P A S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66
255 tcgtacctgactggtgagttccccggtgactacGgatgggacactgcaggactctctgctgacccc S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88
321 gagaccttcgccaagaaccgtgaattggaggtgatccacgctcgatgggccatgttgggagctctg E T F A K N R E L E V I H A R W A M L G A L 110
387 ggatgcgtcttccccgagttgttggccaagaacggtgtgaagttcggagaggcagtgtggttcaag G C V F P E L L A K N G V K F G E A V W F K 132
453 gctggatcacagatcttcgctgagggaggtttggactacctcggtaactcgagcctcgtccacgcc A G S Q I F A E G G L D Y L G N S S L V H A 154
519 cagagcattctggccatctgggcttgtcaggttgtgctcatgggagccatcgagggatacagagta Q S I L A I W A C Q V V L M G A I E G Y R V 176
585 gcaggaggtcctttgggtgatgtcgtcgaccccatctaccccgga A G G P L G D V V D P I Y P G 191
Abb. 17 : Nukleotidsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für LHCII-1.3 und -1.4 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.
Ergebnisse 70
Lhcb2 (Contig 188)
1 gacacatctctcagcttgcgaagttctcagactctgagatttgtcatccacgaagaccgtcacc
65 atggcagcagccaccgcgtccgccatcagcagcaccaccttcgccggccagagcgtgctcaaggga M A A A T A S A I S S T T F A G Q S V L K G 22
130 cagagcgagctctccaagaaggtcggcaatgtcgacgccaggatcaccatgaggaggaccaagacc Q S E L S K K V G N V D A R I T M R R T K T 44
196 agcaccccagagagcatctggtacggtcccgacagacccaagttcttgggcccgttctctgaggcg S T P E S I W Y G P D R P K F L G P F S E A 66
262 accccatcgtacctgaccggagagttcccgggagactacgggtgggacaccgcggggctctcggct T P S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A 88
328 gaccccgagaccttctccaagaaccgggagctcgaggtgatccactcgcgctgggcaatgctcgga D P E T F S K N R E L E V I H S R W A M L G 110
394 acattgggaatgatcttccccgagcttctggccaagaacggcatcaccttcggcgagcccatctgg T L G M I F P E L L A K N G I T F G E P I W 132
460 ttcaaggccgggtcgcagatcttcgccgatggcggtctgaactacctcggcaacgagaacctgatc F K A G S Q I F A D G G L N Y L G N E N L I 154
526 cacgcgcagagcattctggccatcctcggatgccaggttgttctcatgggcctgatcgagggttac H A Q S I L A I L G C Q V V L M G L I E G Y 176
592 cgagtgggaggcggccctctgggcgctgacctcgacccgatctaccccggaggcgctttcgacccc R V G G G P L G A D L D P I Y P G G A F D P 198
658 ttgggtcttgccaacgaccccgacaccttcgccgagctcaaggtgaaggagatcaagaacgcccgt L G L A N D P D T F A E L K V K E I K N A R 220
724 ctggccatgtttccxtccggattcttcgtccaggccatcgtcaccggcaagggacctctggacaac L A M F S F G F F V Q A I V T G K G P L D N 231
790 ttgctgagccacatcgccgaccccgccaccaacaatgcctgggcctacgccaccgcctcacccccc L L S H I A D P A T N N A W A Y A T A S P P 253
856 ggccagtaagcgctggacgctctgagggatttcgttcagtggatggatatgccgccggagtctcga G Q * 255
922 tctatcgatcgctggcgaggcaatggaacggaattggagcgagcgcggtcgtgtactatgcgaacc
988 ttgattgtacagttgcaattttgcctcccacttgatctcgtttagaatgtaattgtagagcacgat
1054 cactgggatttactgatggactcgtcgatgtatacccatatataaacgaaccatttccaaaaaaaa
1120 aaaaaaa
Abb. 18: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb2 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.
Ergebnisse 71
Lhcb3
1 tagagatttccattgctgtcagtcgagtgttgtgcagtcggtcttccatcagcagcc
58 atggccgccacagcactcaccaagcaggtcgtgagccgatccacattcttgggtgctaccgctgca
124 cccaaggatgctctcagggagcaattgccagtatgcagggccaaggtctcaatggacgccgactac P K D A L R E Q L P V C R A K V S M D A D Y 44
190 tggtatggcccggacagacccaagtacttgggcccgttctcagctcagaccccctcttacctgaag W Y G P D R P K Y L G P F S A Q T P S Y L K 66
256 ggagagttccccggtgactacggatgggataccgctgggttgtctgccgaccccgaatcgttcgcc G E F P G D Y G W D T A G L S A D P E S F A 88
322 aagaaccgcgctttggagctgatccacggaaggtgggcaatgctcggagctttgggatgcatcttg K N R A L E L I H G R W A M L G A L G C I L 110
388 cccgaggctttggtgaagtacagccgagtgacgctgaaggaggcagtgtggttcaaggccgggtcc P E A L V K Y S R V T L K E A V W F K A G S 132
454 cagatcttcaccgacggtggtctcgactacctcggcaaccccaaccttgtgcacgcgcagagcatt Q I F T D G G L D Y L G N P N L V H A Q S I 154
520 ttggccatctgggccgtgcaggtcgtgctcatgggagccgttgagggataccgccagaacggtctc L A I W A V Q V V L M G A V E G Y R Q N G L 176
586 cccggaatcggagagggaggcgagctttaccccggaggcaagtacttcgacccactgggtcttgct P G I G E G G E L Y P G G K Y F D P L G L A 198
652 gaggaccccgagaccttcgccgagctgaaggtgaaggagatcaagaacggccggtttgccatgttt E D P E T F A E L K V K E I K N G R F A M F 220
718 tccatgttcggattctttgtccaggccatcgtcaccggcaagggcccccttgagaaccttttggac S M F G F F V Q A I V T G K G P L E N L L D 231
784 caccttgacaacccggttgccaacaacgcctgggcttaacgcaaccaactttcgtcccggagctta H L D N P V A N N A W V Y A T N F R P G A 252
850 aattgtgaaggaaaagaataat
Abb. 19 : Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb3 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.
Für Lhcb2 und Lhcb3 konnte der vollständig codierende cDNA-Bereich ermittelt werden
(Abb. 18/19). Die 1127 bp lange cDNA-Sequenz des EST-Klones C04P.B09 codiert für 226
Aminosäuren eines reifen Lhcb2-Proteins sowie für 39 Aminosäuren des Transitpeptids, das als
Lhcb3 identifizierte 871bp lange cDNA-Fragment für 223 Aminosäuren des reifen Proteins und
40 Aminosäuren des Transitpeptids. Damit sind die reifen Proteine von M. polymorpha etwa so
lang wie bekannte Lhcb2- bzw. Lhcb3-Proteine Höherer Pflanzen (vergleiche Tab. 4, 1.3.1.3).
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von Lhcb2 und Lhcb3 aus M. polymorpha mit den
entsprechenden Proteinsequenzen aus A. thaliana zeigt den hohen Grad an Homologie zwischen
den Sequenzen. Die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen beläuzft sich auf 83 % (Lhcb2)
bzw. 86 % (Lhcb3). Alle Pigmentbindungsstellen sind in den Sequenzen von M. polymorpha
konserviert. Auch das für die Trimerisierung als essentiell betrachtete Sequenzmotif WYGPDR
(HOBE et al. 1995) ist vorhanden (Abb.20).
Ergebnisse 72
Abb. 20: : Alignment der Lhcb2 und Lhcb3 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha und A. thaliana (reife Proteine). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D, grün die als mutmaßliche Chlorophylliganden identifizierten Aminosäuren des Lhcb1 der Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994) (hellgrün: Chl b , dunkelgrün: Chl a). Im oberen Bereich der Abbildung sind für diese CAB-Proteine konservierte Sequenzmotive (die Nummerierung der farblichen Bereiche ergibt die Zuordnung zu einem konservierten Motiv).
1
2 3 5 4
Helix B Helix C Helix A Helix D
Helix B consensus Lhcb2: PETFArNRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNG Helix B consensus Lhcb3: PEAFAkNRALEVIHGRWAMLGALGCifPEVLqKWV Helix C consensus Lhcb2: SILAIWAcQVVLMGfvEGYRV Helix C consensus Lhcb3: SILAVLGFQvvLMGLVEGFRI Helix A consensus Lhcb2: PeafAELKVKEiKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix A consensus Lhcb3: PvTFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix D consensus Lhcb2: PIENLsDhia Helix D consensus Lhcb3: PLENLlDHLD 1: Trimerisierungsmotiv: WYGPDR 2: Luteinbindungsstelle (L2): GDYGWD 3: Luteinbindungsstelle (L2): WFKAG 4: Luteinbindungsstelle (L1): FDPLGL 5: Trimerisierung: W
M. polymorpha Lhcb2 RRTKTSTPESIWYGPDRPKFLGPFSEATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFSKNREL A. thaliana Lhcb2.1 ...VK...Q..........Y......N........Y..................A..... M. polymorpha Lhcb3 -------DADYWYGPDRPKYLGPFSAQTPSYLKGEFPGDYGWDTAGLSADPESFAKNRAL A. thaliana Lhcb3 -------GN.L......V.......V......T...................A....... Helix B a4 a5 a1 M. polymorpha Lhcb2 EVIHSRWAMLGTLGMIFPELLAKNG-ITFGEPIWFKAGSQIFADGGLNYLGNENLIHAQS A. thaliana Lhcb2.1 ...........A..CT...I.S...-VK...AV.........SE...D....P....... M. polymorpha Lhcb3 ELIHGRWAMLGALGCILPEALVKYSRVTLKEAVWFKAGSQIFTDGGLDYLGNPNLVHAQS A. thaliana Lhcb3 .V..........F...T..V.Q.WV..DF..P..........SE................ b6 b5 b5 a1 M. polymorpha Lhcb2 ILAILGCQVVLMGLIEGYRVGGGP-LGADLDPIYPGG-AFDPLGLANDPDTFAELKVKEI A. thaliana Lhcb2.1 ....WAV......F..........-.-EG...L....-.....N..E..EA.S......L M. polymorpha Lhcb3 ILAIWAVQVVLMGAVEGYRQNGLPGIGEGGE-LYPGGKYFDPLGLAEDPETFAELKVKEI A. thaliana Lhcb3 ...VLGF..I...L...F.I...D.V...ND-.....Q........D..V.......... Helix C Helix A a2 a4 a3 b3 M. polymorpha Lhcb2 KNARLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLDNLLSHIADPATNNAWAYATASPPGQ A. thaliana Lhcb2.1 ..G.....................IE..FD.L...VA....S...NFV..K M. polymorpha Lhcb3 KNGRFAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLENLLDHLDNPVANNAWVYATNFRPGA A. thaliana Lhcb3 ....L.....................................F..K.A... Helix D
Ergebnisse 73
Lhcb1 und Lhcb2 unterscheiden sich bei Höheren Pflanzen in weniger als 15% der Aminosäuren
der reifen Proteine, wobei maximal 14 Aminosäurepositionen zwischen den beiden Proteintypen
unterschiedlich sein können (PICHERSKY & JANSSON 1996). Abbildung 21 zeigt ein Alignment
der als LHCII-1.1-1.4 bezeichneten Proteine von M. polymorpha mit den von PICHERSKY &
JANSSON (1996) ermittelten Konsensussequenzen für Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau). Sowohl
zu Lhcb1 als Lhcb2 identische Aminosäuren sind durch Punkte wiedergegeben (...). Es wird
deutlich, daß ein sehr hoher Grad an Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Sequenzen
besteht. Für Lhcb1 charakteristische Aminosäuren in den Sequenzen von M. polymorpha sind
orange hervorgehoben, für Lhcb2 charakteristische Aminosäuren blau.
Die vier LHCII-Sequenzen LHCII-1.1-1.4 von M. polymorpha weisen sowohl für Lhcb1 als
auch Lhcb2 charakteristische Aminosäuren auf (Abb.21), was sie weder als das eine noch das
andere Protein identifizieren läßt. Sie scheinen vielmehr eine „Mischung“ zwischen diesen
Proteinen darzustellen. Dieser Befund ist aus Sicht der phylogenetischen Entwicklung der
verschiedenen cab-Gene von besonderem Interesse.
TERAMOTO und Mitarbeiter (2001) identifizierten für die Grünalge C. reinhardtii vier
verschiedene LHCII-Proteine, die sie als LhcII-1.1-LhcII-1.6 bezeichnen.
Obwohl diese Proteine ebenfalls den Proteinen des trimeren LHCIIs Höherer Pflanzen (Lhcb1-
Lhcb3) am ähnlichsten sind, lassen sie sich nicht eindeutig als Lhcb1, Lhcb2 oder Lhcb3
identifizieren. Die LHCII-Sequenzen LHCII-1.1-1.4 von M. polymorpha wurden mit den
genannten LHCII-Sequenzen von C. reinhardtii verglichen. Die Sequenzen von C. reinhardtii
unterscheiden sich zu den LHCII-1.1-1.4 Sequenzen von M. polymorpha in dem gleichen
Ausmaß, wie zu den Lhcb1 bzw Lhcb2 Sequenzen von A. thaliana. Dies zeigt die vergleichende
Darstellung der relativen Übereinstimmung der für M. polymorpha ermittelten LHCII-Sequenzen
mit den LHCII-Sequenzen von A. thaliana bzw. C. reinhardtii (Abb. 22). Zum anderen wird die
deutliche Ähnlichkeit der als Lhcb3 bzw Lhcb2 identifizierten Sequenzen von M. polymorpha
mit den Sequenzen der Lhcb2- bzw. Lhcb3-Proteine aus A. thaliana ersichtlich.
KILIAN und Mitarbeiter (1998) unterschieden mehrere Proteine des trimeren LHCIIs von
M. polymorpha durch Isoelektrische Fokussierung (IEF), wobei das Protein mit dem niedrigsten
Molekulargewicht (22 kDa) im Unterschied zu den Proteinen des trimeren LHCIIs bei
Samenpflanzen den basischeren pI aufweist. Der Anteil der sauren und basischen Aminosäuren
wurde aus den hier ermittelten Sequenzen bestimmt (Tab. 17).
Ergebnisse 74
Tab. 17: Anteil der basischen (K, N, Q, R) und sauren ( E, D) Aminosäuren in den ermittelten Sequenzen LHCII-1.1-1.4, Lhcb2 und Lhcb3 von M. polymorpha sowie der entsprechenden Sequenzabschnitte der Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996).
Protein saure Aminosäuren basische Aminosäuren
Lhcb2 23 30
Lhcb3 24 31
Lhcb2 (Konsensussequenz) 26 32
Lhcb3 (Konsensussequenz) 24 32
Das Verhältnis basischer zu sauren Aminosäuren ist für das Lhcb3 dem der Konsensussequenz
vergleichbar., das des Lhcb2 ist hingegen höher als das der Konsensussequenz. Dies läßt auf
einen basischeren pI des Lhcb2 Proteines aus M. polymorpha schließen. Aus Abbildung 21 wird
für die LHCII-1.1-1.4 Sequenzen von M. polymorpha ersichtlich, daß die Unterschiede zu den
Konsensussequenzen von Lhcb1 und Lhcb2 sich nic ht in einem veränderten Anteil an basischen
zu sauren Aminosäuren widerspiegelt.
LHCII-1.1 RKT-V.STP---T.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.2 RKT-V.STP---T.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.3 ---RKGSAP---S.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.4 RKTSKAAAP---A.I...E..P.......GAT...........................K Lhcb1 RKtatkakpvssgSPWyGpDRVkYLGPFSGEsPSYLTGEFpgDYGWDTAgLSADPETFAk Lhcb2 -RRTvk---SaPqSIWYGeDRPKyLGPFSEqTPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAr LHCII-1.1 ....... S..............L.SK...T..............A.........SS.I. LHCII-1.2 ...S....A..............L.SK...S......S.......A......-------- LHCII-1.3 ........A...........T..L.AK........................... SG... LHCII-1.4 ........A..............L.AK................. A.........SS... Lhcb1 NReLEVIHcRWaMLGALGCVFPELLaRNGvKFGEAvWfKaGsQIFseGGLdYLGnPslvH Lhcb2 NRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNGVkFGEAVWFKAGsQIFseGGLDYLGNPNLvH Helix B LHCII-1.1 ....... G...V...AI....VG......GLVKI....A....---------------- LHCII-1.2 ------------------------------------------------------------ LHCII-1.3 ........ VQ.V...A.....QN.L.G-------------------------------- LHCII-1.4 ............V...AI....VA.....DVVDPIYPG---------------------- Lhcb1 AQSiLAIWAcQViLMGAvEGYRiAGgPLGevtDPlYPGGsFDPLgLAddpeafaELkVKE Lhcb2 AQSILAIWAcQVVLMGFvEGYRVGGGPLGEGLDkiYPGGAFDPLGLAdDPeafAELKVKE Helix C Helix A LHCII-1.1 ---------------------------------------------------- LHCII-1.2 ---------------------------------------------------- LHCII-1.3 ---------------------------------------------------- LHCII-1.4 ---------------------------------------------------- Lhcb1 iKnGRLAMfSMFGFFvQAiVTGKGPlenLADHlaDPVNNNAwAfATNFVPgK Lhcb2 iKNGRLAMFSMFGFFVQAIVtGKGPIENLsDhiaDPVANNAWAyATNFVPGK Helix D
Abb. 21: Alignment der LHCII-1.1-1.4 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha mit den Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau) Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D. Zu beiden Konsensussequenzen identische Aminosäuren sind durch Punkte (...) gekennzeichnet, für Lhcb1 bzw. Lhcb2 typische Aminosäuren mit der entsprechenden Farbe der Konsensussequenz.
Ergebnisse 75
Abb. 22: Vergleichende Darstellung der relativen Übereinstimmung verschiedener LHCII-Sequenzen von M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii aufgrund der Sequenzähnlihckeiten (Alignment und Gruppierung mittels CLUSTALW (EMBL, European Bioinformatic Institue).
0.1
C. reinhardtii LHCII-4
C. reinhardtii LHCII-3
C. reinhardtii LHCII-2
C. reinhardtii LHCII1.3
C. reinhardtii LHCII1.1
C.reinhardtii LHCII 1.2
A. thaliana Lhcb3
M. polymorpha Lhcb3
M. polymorpha LHCII-1.3
M. polymorpha LHCII-1.2
M. polymorpha LHCII-1.1
M. polymorpha LHCII-1.4
M. polymorpha Lhcb2
A. thaliana Lhcb2.1
A. thaliana Lhcb2.4
A. thaliana Lhcb1.4
A. thaliana Lhcb1.1
A. thaliana Lhcb1.5
Ergebnisse 76
3.2.2.2 Lhcb4-Lhcb6
Von 1838 analysierten EST-Sequenzen von M. polymorpha wiesen zwei jeweils eine besonders
hohe Homologie zu den CAB-Proteinen Lhcb4 bzw. Lhcb5 auf. Eine für ein Lhcb6-Protein
codierende Sequenz fand sich nicht unter den EST-Sequenzen. Eine solche konnte jedoch mittels
RT-PCR amplifiziert werden (3.1.1.1.1).
1 gtc 4 atttcatcgggttgaaatcggggcgtttcttcgtggagctgcagtagtgcggtagacagtaagtgg
70 tcgaacattcagtccgcagcctctcaaacacagaccgcagcagtgcagccatcagcagcaggagca
136 atggcgaccgccatcgcagcgacgtcgttggccgcatcttccttctgtggatcatgccgcgaggtt
M A T A I A A T S L A A S S F C G S C R E V 22
202 gggtccgtcgagagcgtcgcgtatagcagggtattcggagcacccagcaatgccgccaggattgtt G S V E S V A Y S R V F G A P S N A A R I V 44
268 tgccgatcggccataaagaaggccgcatctgctgccaagggagctgtgaagaaggccgcacccaga C R S A I K K A A S A A K G A V K K A A P R 66
334 cccggaagtgcggaccgcccattgtggtttcccggtgcacaggctcccgcgtggttggacggtacg P G S A D R P L W F P G A Q A P A W L D G T 88
400 cttgttggagattacggatttgatcctcttggtttggacaagcccgcagagtacttgcaatatgaa L V G D Y G F D P L G L D K P A E Y L Q Y E 110
466 ttggactcacttaaccagaacttggccaagaatgagtttggtgatgttattggagtccgcgtggac L D S L N Q N L A K N E F G D V I G V R V D 132
532 aagaaggcagacttgaaccccacaccattccagccgtacagtgaggtatttgggcttcaaaggttc K K A D L N P T P F Q P Y S E V F G L Q R F 154
598 agagaatgtgagctcatccacggaagatggtgtatgctcgccactcttggtgcgctctcagtcgaa R E C E L I H G R W C M L A T L G A L S V E 176
664 gcattcactggcgttacctggcaagatgccggaaaggttgagctcgtcgaagggtcatcttacctg A F T G V T W Q D A G K V E L V E G S S Y L 198
730 ggacntccactgccnttctcaattaccaccctgatctggatcgaggtcctggtcattggatacatc G Q P L P F S I T T L I W I E V L V I G Y I 220
796 gagttccagcgtaacgctgagctggaccctgagaagcgtctgtacccaggagggaagtacttcgac E F Q R N A E L D P E K R L Y P G G K Y F D 231
862 ccgttgggactcgcctcagaccccgagaagaaggctaccctgcagctggctctggctgaaatcaag P L G L A S D P E K K A T L Q L A L A E I K 253
928 cacgcccgtcttgctatggttgcgttcttgggattcgctgttcaagccgctgctactggaaagggc H A R L A M V A F L G F A V Q A A A T G K G 275
994 cccctcgacaactgggcgactcacttgagcgaccctctccacacgaccatcatcgacaccttctct P L D N W A T H L S D P L H T T I I D T F S 297
1060 aagtgatgtgacata gatgaagctgcgatatgtaatttctagttggtttccccgagagctgtaac K 298
1126 aaatgtaacatgttggatcgttatttcaagtcaatgtagatattcaacattttatccgcgcactgg
1192 aatggtagctcttgctatcatttctagctttgtggcttggccttgacttgtatcccgccttagcac
1258 gtattattcaacctcgttgcagtccttcgtgtgcagtgtgtcgcaccctggaaataatttgtcgat
1324 ttctccagttaatgataaatctatcttccttttcgtgagggtattttccaaaaaaaaaaaaaaaaa 1390 aaaaaaaaaa
Abb. 23: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb4 aus M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices A-D sind grau unterlegt, das Transitpeptid ist unterstrichen. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.
Ergebnisse 77
Die 1398 bp lange Lhcb4 cDNA-Sequenz (EST-Klon C06P.F02) besitzt ein offenes Leseraster
von 927 bp und codiert für 226 Aminosäuren des reifen Proteins sowie für 39 Aminosäuren des
Transitpeptids (Abb. 23). Damit konnte die Sequenz des reifen Proteines vollständig bestimmt
werden.
Auch das als Lhcb5 identifizierte 926 bp lange cDNA-Insert des EST-Klones C02P.D04 codiert
für die vollständige Sequenz des reifen Proteins (Abb. 24). Die Länge der reifen Proteine von
M. polynmorpha entspricht somit der für diese Proteine aus Höheren Pflanzen bekannten
(vergleiche Tabelle 4, 1.3.1.3). Die Aminosäuresequenzen der Lhcb6-Proteine von
M. polymorpha sind jedoch am N-Terminus um mindestens sieben Aminosäuren länger (siehe
3.1.1.1.1).
1 aggtcgagggcgagagcttcgcgaagctttctgtagagtgaggagaa
48 atggcggcaatggctggaaccgcagccgtgctcggaaggtccgagatcctgggacagggcctcgtc M A A M A G T A A V L G R S E I L G Q G L V 22
114 gcctcgtcctccacctccgtcaggacctcgtccccgttccaggtcgtggccctcttcaacaagaag A S S S T S V R T S S P F Q V V A L F N K K 44
180 ggtgctgctcccaagaaggccgctggcaaggtcgccaagaccgcaccaccctccaacgccgagttg G A A P K K A A G K V A K T A P P S N A E L 66
246 gccaagtggtatggccctgacaggagaatctacttgcccgagggtcttttggacaagtctgatatc A K W Y G P D R R I Y L P E G L L D K S D I 88
312 cccgcgtacttgacgggtgaggttcccggagattacggattcgaccccttcggtctctccaagaag P A Y L T G E V P G D Y G F D P F G L S K K 110
378 cccgccgacttcgacaagtaccaggcctacgagctcatccacgcccgttgggccatgctcggagca P A D F D K Y Q A Y E L I H A R W A M L G A 132
444 gctggattcgtcctccccgaggccttcaacaagtacggtgcccgttgcgggcccgaggctgtgtgg A G F V L P E A F N K Y G A R C G P N L E A 154
510 ttcaagaccggagctcttctgctcgaaggaaacaccctcaattacttcggtgccagcattccagtg V W F K T G A L L L E G N T L N Y F G A S I 176
576 aaccttaacagcctggccgctgtcatcgccgaaggtatcctcgtcggaggtgccgagtactaccgg P V N S L A A V I A E V I L V G G A E Y Y R 198
642 cttagccccctgggatctggacttgaccgtctgcaccccgggggagctttcgaccccctgggactt L S P L G S G L D R L H P G G A F D P L G L 220
708 gctaaggaccctgatcagttcgctctgctgaaggtcaaggagatcaagaacggaaggctggctatg A K D P D Q F A L L K V K E I K N G R L A M 242
774 gtctctatgctgggattcttcatccaggcttacgtcaccggagagggacccgtcgagaacctggct V S M L G F F I Q A Y V T G E G P V E N L A 264
840 gctcaccttagcgaccctttcggaaacaacttgctgactgtcatcggaggcgcttctgagcgtgtc A H L S D P F G N N L L T V I G G A S E R V 286
906 cccacctaagctagtctggta P T 288
Abb. 24: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb5 von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices (A-D) sind grau unterlegt. Der Bereich des Transitpeptids wurde unterstrichen. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.
Ergebnisse 78
Lhcb4
Die größten Unterschiede zwischen den Primärsequenzen der Lhcb4-Proteine von
M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii bestehen in den N-terminalen Bereichen
(Abb. 25). Wie das Lhcb4 Höherer Pflanzen besitzt auch das für M. polymorpha ermittelte
Lhcb4-Protein im Vergleich zu anderen Lhc-Proteinen ein 40 Aminosäure langes Insert vor der
ersten transmembranen Helix.
Zwei der von KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994) als Chlorophylliganden für das Lhcb1 der
Erbse identifizierten Aminosäuren sind in Lhcb4-Proteinen Höherer Pflanzen nicht konserviert
(SANDONA et al. 1998). So ist der Ligand für das Chl b6, das Glutamin in Helix C, durch
Glutamat ersetzt und der Ligand für das Chl a2, ein Asparagin in Helix A durch, Histidin. Wie
aus Abbildung. 25 zu ersehen ist, findet sich auch bei dem Lhcb4 von M. polymorpha in Helix C
anstelle des Glutamin ein Glutamat und in Helix A anstelle des Asparagin ein Histidin.
Weiterhin sind die für Lhcb4-Proteine Höherer Pflanzen charakteristischen sauren Aminosäuren
im Loop zwischen der Helix B und C auch bei M. polymorpha hoch konserviert.
Abgesehen von seiner Funktion bei der Absorption und Weiterleitung von Anregungsenergie
wird dem Lhcb4 insbesonders eine Rolle beim nicht photochemischen Quenching (NPQ)
zugeschrieben (CROFTS & YERKES 1994, PERSARESI et al. 1997, BASSI et al. 1999, NIYOGI 1999).
Das Glutamat in Helix C sowie drei für Lhcb4-Proteine charakteristische saure Aminosäuren im
Loop zwischen der Helix B und C sollen hierfür von funktioneller Bedeutung sein
(JEGERSCHÖLD et al. 2000). Diese Aminosäuren sollen die Bindung von Ca2+-Ionen coordinieren.
Bei niedrigem pH soll das NPQ dadurch getriggert werden, daß sich die Coordination der Ca2+-
Ionen verändert (4.1.3).
Da die drei sauren Aminosäuren im Loop zwischen Helix B und C (Abb. 23) ebenfalls bei
M. polymorpha hoch konserviert sind, läßt sich vermuten, daß auch das Lhcb4 von
M. polymorpha eine Funktion beim NPQ übernehmen kann.
Bei Mais kommt es in vivo unter Licht- und Kältestress zu einer reversiblen Phosphorylierung
des Lhcb4 (BERGANTINO et al. 1995). Phosphoryliert wird hierbei das Threonin-83 (TESTI et al.
1996), das in einer für Lhcb4 charakteristischen Stroma-exponierten Schleife vor der ersten
transmembranen Helix liegt (PICHERSKY & JANSSON 1996). Die von der Nukleotidsequenz
abgeleitete Aminosäuresequenz des Lhcb4 von M. polymorpha weist anstelle des Threonin-83
ein Valin auf (Abb 25). Der Befund von KILIAN und Mitarbeitern (1998), die dies anhand der
von ihnen ermittelten Aminosäureteilsequenz für Lhcb4 zeigen konnten, wurde somit bestätigt.
Ergebnisse 79
Abb. 25: Alignment der Aminosäuresequenzen für die Lhcb4-Proteine aus M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii. Grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices, grün: Chlorophyllliganden des Lhcb1 der Erbse (hellgrün: Chl b, dunkelgrün Chl a), orange: konservierte saure Aminosäuren im Loop zwischen den Helices C und A, ?: Phosphorylierungsstelle in Mais.
1 2 3
Helix B Helix C Helix A Helix D
Helix B consensus Lhcb4: PETFArNRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNG Helix C consensus Lhcb4: SILAIWAcQVVLMGfvEGYRV Helix A consensus Lhcb4: PeafAELKVKEiKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix D consensus Lhcb4: PIENLsDhia 1: Luteinbindungsstelle (L2): GDYGWD 2: Luteinbindungsstelle (L2): WQDAG 3: Luteinbindungsstelle (L1): FDPLGL
M. polymorpha Lhcb4 -RSAIKKAASAAKGAVKKAAPRPGSADRPLWFPGAQAPAWLDGTLVGDYGFDPLGLDKPA A. thaliana Lhcb4.1 --VFGFGKKK..P---..S.KKTVTT.........IS.D....S.........F..G... A. thaliana Lhcb4.3 RFGFSFGKKKP.PPP-..SRQVQDDG.........NP.E....SMI..R....F..G... C. reinhardtii Lhcb4 --------------TRSGGVGYRKYQGDA..LPNTTR.E....S.P..R.......S..S * a4 a5 a1 M. polymorpha Lhcb4 EYLQYELDSLNQNLAKNEFGDVIGVRVDKKADLNP-TPFQPYSEVFGLQRFRECELIHGR A. thaliana Lhcb4.1 ....FDI...D......LA.....TRT-EA..AKS-...........I............ A. thaliana Lhcb4.3 .....DF.G.D......VA..I..IIQ-ESSEIKP-......T....I............ C. reinhardtii Lhcb4 .FVVIGV.END..A...NK.S.EAIVQATPDEVSSENRLA........A........... ? Helix B Ca2+ b6 b5 M. polymorpha Lhcb4 WCMLATLGALSVEAFTGVTWQDAGKVELVEGSSYLGQPLPFSITTLIWIEVLVIGYIEFQ A. thaliana Lhcb4.1 .A............L..............D.............S................ A. thaliana Lhcb4.3 .A..G....IA...L..IA.......................L..........V...... C. reinhardtii Lhcb4 .A...C....VA..T...S.VE......-D.A..A.LS......Q......I.V.GA..Y Helix C b5 a1 a2 a4 a3 M. polymorpha Lhcb4 RNAELDPEKRLYPGGKYFDPLGLAS-DPEKKATLQLAEIKHARLAMVAFLGFAVQAAATG A. thaliana Lhcb4.1 ................F.......A-......Q........................... A. thaliana Lhcb4.3 ..S.......I....-....... A-....LD..K......S........I..L...F.. C. reinhardtii Lhcb4 ..S.TN....C....-V....K...E.E.RAFR.KT...........S.F.YG...LS.. Helix A b3 M. polymorpha Lhcb4 KGPLDNWATHLSDPLHTTIIDTFSK A. thaliana Lhcb4.1 ....N...................SS A. thaliana Lhcb4.3 ...VSFL..FNN C. reinhardtii Lhcb4 E.A.GSL.KFADGLNNGKGL Helix D
Ergebnisse 80
Lhcb5
Ein Vergleich der Primärsequenzen der Lhcb5-Proteine von M. polymorpha, A. thaliana und
C. reinhardtii (Abb. 26) zeigt, daß das Lhcb5 von M. polymorpha wesentlich mehr identische
Aminosäuren zur Lhcb5-Sequenz von A. thaliana aufweist als zu C. reinhardtii. So zeigen die
interhelikalen Bereiche zwischen den Helices B und C bzw. C und A nicht die für C. reinhardtii
beschriebene hohe Variabilität (KÜHLBRANDT et al. 1994, TERAMOTO et al. 2001). Zudem läßt
sich auch keine Insertion zusätzlicher Aminosäuren im Anschluß an die Helic C wie bei
C. reinhardtii ausmachen.
Hochkonserviert sind die für das Lhcb1 der Erbse von KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994)
bestimmten Chlorophylliganden, ebenso wie die für die Trimerisierung des LHCII wichtige
Sequenzabfolge WYGPDR (Abb. 26). Wie von HOBE und Mitarbeitern (1995) gezeigt, soll das
Vorhandensein dieses Motivs ja essentiell für die Bildung von trimerem LHCII in vitro sein.
Allerdings ist immer noch unklar, warum gerade in Lhc b5-Proteinen diese Sequenzabfolge hoch
konserviert ist. Es ist nicht bekannt, daß sie Trimere zu bilden vermögen.
In Höheren Pflanzen wird dem Lhcb5 ebenso wie dem Lhcb4 eine besondere Bedeutung bei der
Dissipitation überschüssiger Energie beigemessen. Die Protonierungstellen, die hierbei eine
wichtige Rolle spielen, können durch DCCD blockiert werden (4.1.3). Die für Höhere Pflanzen
bekannten DCCD-Bindungsstellen sind auch in dem Lhcb5-Protein von M. polymorpha
konserviert (Abb.26).
M. polymorpha Lhcb5 LFNKKGAAPKKAAGKVAKTAPPSNAELAKWYGPDRRIYLPEGLLDKSDIPAYLTGEVPGD A. thaliana Lhcb5 ---..KP..A.S-----.AVSETSD............F..D....R.E..E..N...A.. C. reinhardtii Lhcb5 ---.A.GK.TRG----WLGGQGGA.D.D.......KLF..S..YDR.E..E..N..LA.. M. polymorpha Lhcb5 YGFDPFGLSKKPADFDKYQAYELIHARWAMLGAAGFVLPEAFNKYGARCGPEAVWFKTGA A. thaliana Lhcb5 ............EN.A....F...............II...L.....N............ C. reinhardtii Lhcb5 .....L..G.D.ETVA..REN..........A...IL...GLQAN..NIK-GGT..E... Helix B � M. polymorpha Lhcb5 LLLEGNTLNYFGA--SIPVN--LSLAAVIAEVILVGGAEYYRLS---------------- A. thaliana Lhcb5 ...D........K--N..I.--.V....V...V.L.......IT---------------- C. reinhardtii Lhcb5 EM.N.G.....AVPWGIVS.PLPLF.VIAV..G.MGAV.F..RNGTGPAGYSPGIGKFDS � Helix C M. polymorpha Lhcb5 PLGSGLDRLHPGGAFDPLGLAKDPDQFALLKVKEIKNGRLAMVSMLGFFIQAYVTGEGPV A. thaliana Lhcb5 NGLDFE.K.....P..........E.G...............FA................ C. reinhardtii Lhcb5 SVFD...PLY...P.......D..EVLQE...............V...AV.S...... Y Helix A � M. polymorpha Lhcb5 ENLAAHLSDPFGNNLLTVIGGASERVPT- A. thaliana Lhcb5 ....K..............A.TA..A..L C. reinhardtii Lhcb5 A.WTK.VA....Y.....LG-.E..T..L Helix D
Abb. 26: Alignment der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz für Lhcb5 aus M. polymorpha mit den Sequenzen der homologen Proteine aus A. thaliana und C. reinhardtii. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: Chlorophylliganden (hellgrün: Chl b, dunkelgrün: Chl a) (nach KÜHLBRANDT et al. 1994), türkis: Trimerisierungsmotif, � bzw. orange: DCCD Bindungsstellen.
Ergebnisse 81
Lhcb6
Während in Grünalgen bisher keine Lhcb6-Sequenz kloniert werden konnte, konnte für
M. polymorpha eine für ein Lhcb6-Protein codierende cDNA-Sequenz mittels RT-PCR
amplifiziert werden (3.1.1.1.1).
Der Sequenzvergleich zu Lhcb6 von A. thaliana zeigt, daß alle für die Pigmentbindung
wichtigen Aminosäuren in der Lhcb6-Sequenz von M. polymorpha hoch konserviert sind und
auch sonst die Übereinstimmungen sehr hoch sind.
M. polymorpha Lhcb6 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVDPEWLDGSLPGDYGFDPLGLGRDPAALKW A. thaliana Lhcb6 ----------AAAAQP-K..I..V.G..N.L............F............F... M. polymorpha Lhcb6 YREAEIIHGRWAMAAVLGIFVGQAWSGIPWFEAGADPSAVAPFSFGTLLGTQLLLMGWVE A. thaliana Lhcb6 .....L.....................VA......Q.D.I......S............. Helix B Helix C M. polymorpha Lhcb6 GKRWADYVNPNSQLVDWATPWSRTAENFGNSTGLQGYPGGKFFDPLSLAGDVKNGKYTTD A. thaliana Lhcb6 S...V.FF..D..S.E......K.....A.Y..D......R.....G...KNRD.V.EP. M. polymorpha Lhcb6 YDKLSRLQLAEIKHSRLAMLAMLIFYFEAGQGLTPLGALGL A. thaliana Lhcb6 FE..E..K...........V............K........ Helix A Helix D
Abb. 27: Alignment der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz für Lhcb6.2 aus M. polymorpha mit den Sequenzen dem homologen Protein aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: Chlorophylliganden (hellgrün: Chl b, dunkelgrün: Chl a) (nach KÜHLBRANDT et al. 1994).
Da KILIAN und Mitarbeiter (1998) auch für die CAB-Proteine Lhcb4-Lchb6 ungewöhnlich
basische pI -Werte ermittelten, wurde der Anteil der sauren und basischen Aminosäuren aus den
Lhcb4-Lhcb6-Aminosäuresequenzen bestimmt (Tab. 18) und mit denen der Konsensus-
sequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996) verglichen:
Tab. 18: Anteil der basischen (K, N, Q, R) und sauren (E, D) Aminosäuren in den ermittelten Sequenzen für Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 von M. polymorpha sowie der der Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996).
Protein Anteil saurer Aminosäuren Anteil basischer Aminosäuren Lhcb4 31 43 Lhcb5 24 36 Lhcb6 18 32 Lhcb4 (Konsensussequenz) 30 39 Lhcb5 (Konsensussequenz) 30 36 Lhcb6 (Konsensussequenz) 23 28
Das Verhältnis basischer zu sauren Aminosäuren ist in der Tat für die Proteine von
M. polymorpha höher als für die entsprechenden Konsensussequenzen.
Ergebnisse 82
3.2.3 Verwandte der cab-Genfamilie
3.2.3.1 PsbS
Das 22 kDa große membranintrinsische PsbS-Protein des PSII Höherer Pflanzen ist ein
Chlorophyll bindendes Protein mit Besonderheiten (1.3.1.2).
Ein dem PsbS Höherer Pflanzen homologer EST-Klon konnte von M. polymorpha isoliert
werden (Abb. 27). Allerdings codiert das 237 bp lange cDNA-Insert nur für eine Teilsequenz des
vollständigen Proteins. Die von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz von
79 Aminosäuren zeigt 92 % Übereinstimmung zum entsprechenden Bereich des PsbS-Proteins
von A. thaliana (Abb. 28).
NISHIYAMA und Mitarbeiter (2000) generierten aus Sporophyten von M. polymorpha 960 EST-
Klone. Unter den analysierten Sequenzen fand sich ebenfalls ein EST-Klon mit Homologie zum
PsbS.
Die vollständige cDNA-Sequenz dieses freundlicherweise von Dr. K. Yamato (Universität
Kyoto, Japan) zur Verfügung gestellten EST-Klones wurde in der vorliegenden Arbeit ermittelt.
Leider codiert das cDNA-Insert ebenfalls nur für eine Teilsequenz des PsbS-Proteins. Allerdings
für den C-terminalen Bereich, während die in dieser Arbeit isolierte EST-Sequenz für den N-
terminalen Bereich eines PsbS-Proteins codiert (Abb. 29). Auch der C-terminale Bereich zeigt
mit 73% Sequenzidentität eine hohe Ähnlichkeit zu dem PsbS-Protein von A. thaliana.
PsbS (D10P.G07)
1 gaggatggtatcttcggaacctcaggaggaatcggtttcaccaaggctaacgagcttttcgttgga E D G I F G T S G G I G F T K A N E L F V G 22
67 cgtgtagctatgcttggtttctctgcctccatccttggagaggctcttaccggaaagggtaccctt R V A M L G F S A S I L G E A L T G K G T L 44
133 gcccagttcgacgttgagaccggtattcccttgaacgagaccgagccactgttgctgtccttcatt A Q F D V E T G I P L N E T E P L L L S F I 66
199 ctgttcactttgttgggagcaattggagctctcagcgac L F T L L G A I G A L S D 79
PsbS (zur Verfügung gestellter Klon)
1 caattgaacatcgagactggtctgccgatcactgagctcgagcccctgatcctgttcaacgttatc Q L N I E T G L P I T E L E P L I L F N V I 22
67 ttctttttccttgctgctatcaaccctggtaccgggaagttcatcaacgacgatgacatcgaagag F F F L A A I N P G T G K F I N D D D I E E 44
133 taaagtggaaatggattttgcgtaacctcactttttccctctaggacttgacttggttttagaaat
199 ttgttgataatttcattgcggagctgcaaatacgaattattt
Abb. 28: Nukleotidteilsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für das PsbS von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices (A-D) sind grau unterlegt. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.
Ergebnisse 83
A. thaliana PsbS APKKVEKPKSKVEDGIFGTSGGIGFTKANELFVGRVAMIGFAASLLGEALTGKGILAQLN M. polymorpha PsbS ------------EDGIFGTSGGIGFTKANELFVGRVAMLGFSASILGEALTGKGTLAQFD
A. thaliana PsbS LETGIPIYEAEPLLLFFILFTLLGAIGALGDRGKFVDDPPTGLEKAVIPPGKNVRSALGL M. polymorpha PsbS VE**********************************************************
A. thaliana PsbS KEQGPLFGFTKANELFVGRLAQLGIAFSLIGEIITGKGALAQLNIETGIPIQDIEPLVLL M. polymorpha PsbS *****************************************QLNIETGLPITELEPLILF A. thaliana PsbS NVAFFFFAAINPGNGKFITDDGEES M. polymorpha PsbS NVIFFFLAAINPGTGKFINDDDIEE
Abb. 29: Alignment der von den Nukleotidteilsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen für ein PsbS aus M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: zwischen den Sequenzen unterschiedliche Aminosäuren, *****: Bereiche, von denen keine Sequenzdaten für M. polymorpha vorliegen.
3.2.3.2 Sep1 ähnliches Protein
Für die molekularbiologisch wohl am besten untersuchteste Pflanze A. thaliana konnten unter
über 30.000 EST-Sequenzen in den Datenbanken zahlreiche neue Mitglieder der Lhc-Genfamilie
identifiziert werden (JANSSON 1999). Aus Sicht der molekularen Entwicklung der Genfamilie
könnten insbesonders Sep-Proteine das fehlende Glied zwischen den ein und drei Helix
Antennenproteinen in Pro- und Eukaryoten repräsentieren (JANSSON 1999, HEDDAD & ADAMSKA
2000).
Die vollständige Sequenzierung der cDNA des EST-Klones C05P.A12 von M. polymorpha ergab
ein 598 langes bp Fragment, welches für 150 Aminosäuren eines Proteinfragmentes codiert mit
Ähnlichkeit zu dem von HEDDAD & ADAMSKA (2000) näher charakterisierten Sep1-Protein von
A. thaliana (Abb. 28) Der Prozenzsatz identischer Aminosäuren beträgt nur zwar nur 33 %, aber wie
das Alignment der Sequenzen von M. polymorpha und A. thaliana zeigt (Abb. 29), sind 18 von 22
Aminosäuren der ersten transmembranen Helix zwischen den beiden Proteinsequenzen identisch. Die
Übereinstimmung zwischen den zweiten transmembranen Helices beträgt 57 %. Die mutmaßlichen
transmembranen Regionen der Proteinteilsequenz aus M. polymorpha wurden mittels des TMHMM-
Programmes (Version 2.0) ermittelt.
Ergebnisse 84
1 gcgtgcgagaaggaaagcatcgaccatggcaactctttgtgtctcgtcgattgtgcacggtgccat A C E K E S I D H G N S L C L V D C A R C H 22
67 gccagctgggcatgtatgctcagcagtttcttctggacaacaaaagctccatgcctagagcgagac A S W A C M L S S F F W T T K A P C L E R D 44
133 tgtcctccacatcgtcattttggtagctccaacttggtagcattgaggtccgaatcgaaaggagtc C P P H R H F G S S N L V A L R S E S K G V 66
199 aaacgagttgccaccgtagaaacaaggtgtgagagcaagacagaggagaccagaggacccagcgcc K R V A T V E T R C E S K T E E T R G P S A 88
265 gatatttggatcggatgattagcgatggtcgggtttgccgctgccatcacatcggagattgtcacc D I W I G S L A M V G F A A A I T S E I V T 110
331 gggaaaggagtactagcgaccgcaggtttgagcactccccaacccactctggctctggcgttagca G K G V L A T A G L S T P Q P T L A L A L A 132
397 gcactggtaggaggattgacagcgtttggagtgttccgatctgctggaagtgattaattggacttg A L V G G L T A F G V F R S A G S D 150
463 atgttccagaaacaacacattgatgtagaaagctgttcaatacttgccactagtgtagccttttgt
529 agagactgttgcctctttgagtctcttgtctaggaattgatgcgggtaaattagatgacaacaaga
595 agttttagaacgggcaactagaccaacgcgccgttctctgcaagtactactgcacatcctcacgag
661 tccgtgactgtcatttgaattataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Abb. 30: Nukleotidteilsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für das Sep1-ähnliche Protein von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices sind grau unterlegt. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.
M. polymorpha Sep1? ACEKESIDHGNSLCLVDCARCHASWACMLSSFFWTTKAPCLERDCPPHRHFGSSNLVALR A.thaliana Sep1 -MALSQVSASLAFSLPNSGALKLATITNPTSTCR-VHVPQLAGIRSTFASGSPLLPLKLS M. polymorpha Sep1? SESKGVKRVATVETRCESKTEETRGPSADIWIGSLAMVGFAAAITSEIVTGKGVLATAGL A.thaliana Sep1 MTRRGGNRAASVSIRSEQSTEGSSG--LDIWLGRGAMVGFAVAITVEISTGKGLLENFGV M. polymorpha Sep1? STPQPTLALALAALVGGLTAFGVFRSAGSD A.thaliana Sep1 ASPLPTVALAVTALVGVLAAVFIFQSSSKN
Abb. 31: Alignment der von der Nukleotidteilsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen für ein Sep1-ähnliches Protein aus M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices.
3.2.4 Analyse der Expression einzelner cab-Gene
Die Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha wurde unter zwei Gesichtspunkten
näher untersucht. Zum einen sollte die Frage geklärt werden, ob die Expression verschiedener
Lhc-Gene von M. polymorpha ebenfalls wie für viele Pflanzenspecies gezeigt, einer diurnalen
Rhythmik unterliegt. Zum anderen sollte die Auswirkung von Lichtstress auf die Expression des
Ergebnisse 85
Sep1-ähnlichen Gens untersucht werden. In A. thaliana sind Sep-Proteine Stress-induzierte
Proteine.
3.2.4.1 diurnale Expression einzelner cab-Gene
Viele Untersuchungen haben gezeigt, daß pflanzliche Gene oft circadian bzw. diurnal exprimiert
werden, so auch die Lhc-Gene in vielen Pflanzenspecies (PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT
et al. 1996). Das typische Akkumulationsmuster für mRNAs der Lhc-Gene beginnt mit einem
langsamen Anstieg der mRNA-Gehalte vor und nach Sonnenaufgang. Diese erreichen dann ihre
höchste Konzentration um die Mittagszeit und erfahren eine stetige Abnahme im Laufe des
Nachmittages und der Nacht (PIECHULLA et al.1993). Während viele angiosperme Pflanzen eine
derartiges Lhc-Genexpressionsmuster zeigen, läßt sich bei den gymnospermen Conipherophytina
keine solche diurnale Oscillation der mRNA von Lhc-Proteinen finden.
OBERSCHMIDT und Mitarbeiter (1996) ermittelten für zwei Vertreter der Bryophyten,
Conocephalum conicum und Physcomitrella patens, das Expressionsmuster des Gens im
Tagesgang. Interessanterweise unterliegt die Expression des Hauptlichsammelproteins des
LHCIIs von Physcomitrella patens (LHCP), einem Laubmoos, der oben beschriebenen diurnalen
Rhythmik, während für das Lebermoos C. conicum die Expression dieses Genes im Tagesverlauf
nahezu konstant bleibt.
Die Expression von fünf in dieser Arbeit identifizierten Lhc-Genen (Lhca4, Lhcb2, Lhcb4. PsbS,
Sep1-ähnlich) von M. polymorpha wurde auf das Auftreten einer diurnalen Rhythmik hin
untersucht. Abbildung 30 zeigt die Ergebnisse der entsprechenden Northern Blot-Analysen.
Photoautotroph gewachsene Thalli von M. polymorpha wurden für die Isolierung von Gesamt-
RNA aus 6 Kulturbehältern entnommen und das Material gepoolt. Die Probennahme begann im
Dunkeln, 1 h vor dem Beginn der Lichtphase und erfolgte dann alle 3 h. Die letzte Entnahme
erfolgte 1 h nach der Lichtphase. Die Dauer der Lichtphase betrug 16 h, die der Dunkelphase
8 h. Die Quantenflußdichte entsprach den Anzuchtsbedingungen.
Mit Ausnahme des Sep1 ähnlichen Gens, kommt es zu einem stetigen Anstieg der mRNA
Gehalte nach Beginn der Lichtphase. Die maximale Konzentration wird jedoch nicht um die
Mittagszeit erreicht, sondern durchweg erst nach elfstündiger Lichtphase. Zur Dunkelphase hin
erfolgt dann eine stetige Abnahme der mRNA-Gehalte.
Das Sep1-ähnliche Gen von M. polymorpha wird insgesamt nur sehr schwach exprimiert
(Abb. 30). Es kommt zu einem langsamen aber stetigen Anstieg des mRNA-Gehalts in
Abhängigkeit von Dauer der Lichtphase.
Ergebnisse 86
Abb. 32: Northernblotanalyse: Ergebnisse der Expressionsanalyse zur diurnalen Expression einzelner Lhc-Gene (Lhca4, Lhcb2, Lhcb4, PsbS, Sep1?) von M. polymorpha. Die Lichtphase betrug 16 h, die Dunkelphase 8 h. 1 h vor Beginn der Lichtphase (6.00 Uhr), wurde die erste Probe genommen, dann alle 3 h, bis 1h nach Ende der Lichtphase. Der untere Balken gibt die Dauer Dunkel und Lichtzeiten wieder, oberer Auftrag: Uhrzeit der Probennahme.
3.2.4.2 Auswirkung von Lichtstress auf die Genexpression des Sep1-ähnlichen Gens
Für Sep-Proteine von A. thaliana ist beschrieben, daß ihr mRNA-Gehalt in Folge von Lichtstress
drastisch ansteigt. Bisher liegen nur Sequenzen für Sep-Proteine aus A. thaliana vor. Die
Expression des Sep1-ähnlichen Gens von M. polymorpha, wurde auf Veränderungen in Folge
von Lichtstress untersucht. Damit sollte geklärt werden, ob sich die Expression des für
M. polymorpha nachgewiesenen Gens ähnlich der für die Sep-Gene aus A. thaliana
beschriebenen Expression verhält, oder ob gravierende Unterschiede bestehen.
Thalli von M. polymorpha wurden zur Lichtstress-Behandlung einer Quantenflußdichte von
300 µmol m-2 s-1 ausgesetzt. Diese war damit 10 fach erhöht gegenüber der Quantenflußdichte
bei der die Thalli angezogen wurden. WÖLFEL (1998) hatte gezeigt, daß es unter diesen
Lichtbedingungen zu einer Abnahme der Effizienz des photosynthetischen Elektronentransportes
kommt, die bei einer anschließenden Erhohlungsphase im Schwachlicht nur langsam und nur
teilweise reversibel war.
Gesamt-RNA wurde aus den Thalli nach 0, 2, 4, 8, 24 und 48 h Lichtstress isoliert. Dazu wurden
Thalli aus sechs Kulturgefäßen, die sich möglichst wenig beschatteten, vorsichtig entnommen
ohne sie zu verwunden und das Material gepoolt.
Lhca4
Lhcb2
Lhcb4
Psb S
Sep1?
6.00 9.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00
Ergebnisse 87
Abbildung 31 zeigt das Ergebnisse der Northernblot-Analyse. Während das Sep1-ähnliche Gen
vor Gabe des Lichtstresses schwach exprimiert wird, kommt es schon nach 2 h erhöhter
Quantenflußdichte zu einem drastischen Zunahme an mRNA. Der Gehalt an mRNA bleibt dann
für die weitere Dauer nahezu konstant. Das Ergebnis wurde durch drei unabhängige Experimente
reproduziert.
Lichtstress: 0 h 2 h 4h 8 h 16 h 24 h 48 h
Abb. 33: Northernblotanalyse: Spiegel des Transkriptes des Sep1-ähnlichen Gens von M. polymorpha in Abhängigkeit zur Dauer des Lichtstresses (0 , 2, 4, 6, 8, 16, 24, 48 h, 300 µmol m-2 s-1). Der gleichmäßige Auftrag der Gesamt-RNA wurde durch EtBr -Färbung überprüft.
Sep1?
88
4 Diskussion
Das Ziel der vorliegenden Arbeit, für den Bryopyten M. polymorpha ein umfassendes Bild von
der Zusamensetzung der cab-Genfamilie zu erlangen, konnte durch die Klonierung und
Sequenzierung der cDNAs von 12 verschiedenen Mitgliedern erreicht werden. Die
Zusammensetzung der Genfamilie und der Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine mit
denen der homologen Proteine der Samenpflanzen und Grünalgen werden in bezug auf die
molekulare Evolution dieser Genfamilie diskutiert (4.1, 4.2). Die Primärsequenzen geben einen
Hinweis darauf, daß die differenzierten Funktionen der meisten CAB-Proteine wohl schon vor
der Trennung der Bryophyten von den Farnpflanzen, aus denen sich die Samenpflanzen
entwickelten, festgelegt waren (4.2).
Wie Expressionsanalysen zeigen, läßt sich die für viele pflanzliche Species beschriebene
diurnale Expression der cab-Gene auch an M. polymorpha beobachten. Es bestehen jedoch
charakteristische Unterschiede zum sonst typischen Expressionsmuster. Über mögliche Gründe
hierfür, läßt sich nur spekulieren (4.3.1). Die festgestellten Veränderungen in der Expression des
Sep1-ähnlichen Gens als Folge von Lichtstress zeigt, daß der mRNA-Gehalt in Folge von
Lichtstress ebenfalls wie für die Sep-Proteine aus A. thaliana beschrieben drastisch ansteigt.
Dies legt eine mögliche Funktion des Proteins bei Lichtstress nahe (4.3.2).
4.1 Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Zusammensetzung der cab-Genfamilie eines Bryophyten
erstmalig detailliert untersucht. Sequenzdaten für cab-Gene, die für Samenpflanzen ja keine
Seltenheit mehr darstellen, lagen für Bryophyten bisher nur sehr begrenzt vor. Bis weit in die
neunziger Jahre waren zwei von LONG und Mitarbeitern (1989) sequenzierte Gene für zwei
LHCII-Proteine des Laubmooses Physcomitrella patens, die einzig sequenzierten Gene von
CAB-Proteinen eines Bryophyten, deren Sequenzen zur Verfügung standen. Mit dem Beginn
mehrerer Genomprojekte, finden sich seit neuestem auch vermehrt Sequenzen für verschiedene
CAB-Proteine von Bryophyten in den Datenbanken, insbesonders für das Laubmoos
Physcomitrella patens. Allerding handelt es sich hierbei um unausgewertete und nicht
abgesicherte Nukleotidteilsequenzen von EST-Klonen. Eine umfassende Analyse der cab-
Genfamilie eines Bryophyten stand somit immer noch aus.
Besonders interessant macht eine derartige Untersuchung, daß signifikante Unterschiede in den
Sequenzen der CAB-Proteine auf wichtige funktionelle Unterschiede hinweisen könnten. Somit
böte sich ein weiterer Ansatz die spezifischen Funktionen eines jeden CAB-Proteines besser
Diskussion 89
verstehen zu lernen. Des weiteren bedarf es der Sequenzdaten für CAB-Proteine von
Bryophyten, um das Bild von der Evolution der Lhc-Genfamilie zu komplementieren,
insbesonders da Bryophyten erste Landpflanzen repräsentieren (MISHLER et al. 1994, KENRICK et
al. 1997).
Das thallö se Lebermoos M. polymorpha, ist unter letzterem Gesichtspunkt ein besonders
interessantes Untersuchungsobjekt, denn aus morphologischen Untersuchungen resultiert die
Annahme, daß Lebermoose die primitivsten Landpflanzen seien (GRAHAM 1993, EDWARDS et al.
1995, KENRICK et al. 1997). Diese Annahme wird inzwischen durch Untersuchungen von QIU
und Mitarbeitern (1998) über die Verteilung dreier mitochondrialer Introns unterstützt. Sie
untersuchten 352 verschiedene Landpflanzen auf das Vorkommen der mitochondrialen Introns
cox2.i3 , cox2.i4 und nad1.i4 . Diese finden sich bei allen Hauptlinien der Gefäßpflanzen, den
Moosen (mit einigen wenigen Ausnahmen) und den Hornmoosen, aber nicht in Lebermoosen,
Grünalgen und allen anderen Eukaryoten.
Die grobe Architektur der Antennenkomplexe scheint seit mehr als 350 Millionen Jahren zu
existieren, da die zehn verschiedenen CAB-Proteine in allen Höheren Pflanzen präsent sind
(JANSSON 1994). Dies legt gleichzeitig nahe, daß den verschiedenen Proteinen jeweils eine
differenzierte Funktion zukommen muß, ansonsten wären einige der sie codierenden Gene wohl
im Verlauf der Evolution verloren gegangen.
Die Zusammensetzung der in dieser Arbeit ermittelten cab-Genfamilie des Bryophyten
M. polymorpha (Tab. 16, 3.1.2) ist der Höherer Pfla nzen in weiten Teilen sehr ähnlich. Dies und
die Tatsache, daß die Sequenzen der verschiedenen cab-Gene von M. polymorpha sehr hoch
konserviert sind, spricht dafür, daß sich die CAB-Proteine der PSII-Antenne und ihre
Eigenschaften seit ca. 480 Millionen Jahren nicht gravierend verändert haben. Da nur eine
cDNA-Sequenz für ein Antennenprotein des PSI ermittelt werden konnte (3.1.2.1.1), eine Lhca4-
Sequenz, läßt sich bezüglich der PSI-Antenne auf Basis der in dieser Arbeit ermittelten Daten
wenig aussagen. Bereits die biochemische Charakterisierung einzelner CAB-Proteine des PSII
von HARRER und Mitarbeitern (1998) sowie die von ihnen durchgeführten cross-link-Studien zur
Organisation der einzelnen Lhc-Proteine innerhalb der PSII-Antenne zeigen, daß die
Organisation des Antennensystems des PSII bei M. polymorpha grundsätzlich mit der bei
Samenpflanzen übereinstimmt. Somit scheinen Aufbau und Organisation der PSII-Antenne
schon seit den ersten Landpflanzen, seit ca. 480 Millionen Jahren, konserviert zu sein.
Wie am Beispiel von C. reinhardtii gezeigt werden konnte, findet sich die komplexe
Organisation der PSII-Antenne mit monomeren und trimeren CAB-Proteinen bereits bei den
Grünalgen (TREMOLIERES et al. 1994). Es stellt sich somit die Frage, wie ähnlich sind sic h die
Diskussion 90
Antennen der Lebermoose und der Grünalgen. Sind Aufbau und Oganisation schon seit den
Grünalgen so stark konserviert, wie zwischen Lebermoosen und Höheren Pflanzen?
Durch die Analyse von 15.000 EST Sequenzen wurde erst kürzlich ein umfassendes Bild von der
Zusammensetzung der Lhcb-Genfamilie der Grünalge C. reinhardtii gewonnen (TEARAMOTO et
al. 2001). Charakteristische Unterschiede zu Höheren Pflanzen bestehen darin, daß die als
LhcII-1.1-1.4 bezeichneten Proteine von C. reinhardtii zwar den Trimere bildenden
LHCII-Proteinen (Lhcb1-Lhcb3) Höherer Pflanzen homolog sind, sich jedoch nicht eindeutig
einem dieser Proteine zuordnen lassen. Ferner konnte keine homolge Lhcb6-Gensequenz und
ebenso keine homolge psbS-Sequenz ermittelt werden, obwohl die Anzahl der ausgewerteten
EST-Sequenzen mit 15.000 doch recht hoch ist. Dies führte zu dem vorsichtigen Schluß, daß
Grünalgen diese Proteine möglicherweise nicht besitzen (TERAMOTO et al. 2001).
Für M. polymorpha hingegen konnte in der vorliegenden Arbeit sowohl eine Lhcb6-Sequenz
(Abb. 8, 3.1.1.1.1) als auch eine psbS Sequenz (Abb. 28, 3.1.2.3) ermittelt werden. Aufgrund der
Unterschiede in den N-terminalen Bereichen der in dieser Arbeit ermittelten Lhcb6-Sequenz
(Lhcb6.2) und der Aminosäureteilssequenz von KILIAN und Mitarbeitern (1998) (Lhcb6.1) ist
sogar davon auszugehen, daß M. polymorpha über zwei verschiedene Lhcb6-Proteine verfügt
(Abb.9).
Ferner ließen sich die Sequenzen für ein Lhcb2 bzw. Lhcb3 Protein identifizieren (3.1.2.2.1).
Die Zusamensetzung der Lhcb-Familie von M. polymorpha entspricht somit doch schon
wesentlich mehr der Höherer Pflanzen als die der Grünalge C. reinhardtii.
Jedoch wurden ebenso wie bei der Grünalge C. reinhardtii LHCII-Sequenzen für M. polymorpha
ermittelt, die hohe Homolgie zu den Trimere bildenden LHCII-Proteinen Lhcb1 und Lhcb2
Höherer Pflanzen aufweisen und sich nicht eindeutig einem dieser beiden Proteine zuordnen
lassen (3.1.2.2.1). Zwar konnten von diesen als LHCII-1.1-1.4 bezeichneten Proteinen von
M. polymorpha nur Teilsequenzen ermittelt werden, die fehlenden C-terminalen Sequenz-
bereiche sind aber nicht die Ursache, daß nicht unterschieden werden kann, ob sie Lhcb1 oder
Lhcb2 ähnlicher sind (Abb. 21). Aber genauso wenig lassen sich die genannten Sequenzen von
M. polymorpha den LhcII-1.1-1.4 Proteinen von C. reinhardtii zuordnen (Abb. 22).
TERAMOTO und Mitarbeiter (2001) zogen aufgrund der von ihnen für C. reinhardtii ermittelten
Daten den Schluß, daß sich erst nach der phylogenetischen Trennung der Grünalgen und der
Höheren Pflanzen die Proteine Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 entwickelten.
Ferner soll dieser Prozess in jeder Algenspecies unabhängig voneinander erfolgt sein, als
Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen, da sich die LHCII-1.1-1.4-Proteine von
C. reinhardtii auch nicht denen anderer Grünalgen wie zB von Dunalielle salina (LONG et al.
1989, Dunaliella tertiolecta (LAROUCHE et al. 1990) oder C. moewusii (LAROUCHE et al. 1991)
Diskussion 91
zuordnen lassen. Die inneren PSII-Antennenproteine aber müssen sich aufgrund der bestehenden
Sequenzähnlichkeiten der CAB-Proteine Lhcb4 und Lhcb5 zu den Lhca-Proteinen früher d.h.
vor der phylogenetischen Trennung der Höheren Pflanzen und Grünalgen entwickelt haben
(DURNFORD et al. 1999, TERAMOTO et al. 2001)
Die in dieser Arbeit gewonnenen Sequenzdaten für die CAB-Proteine von M. polymoprha fügen
sich in diese Vorstellungen zur phylogenetischen Entwicklung der einzelnen CAB-Proteine ein.
Allerdings konnten für M. polymorpha schon eindeutig Sequenzen für ein Lhcb2 und Lhcb3-
Protein ermittelt werden, was dafür spricht, daß bereits ab den Bryophyten vor 480 Millionen
Jahren diese Proteine entwickelt waren und in den Höheren Pflanzen erhalten blieben. Eine
Frage, die sich nun aufdrängt ist, wie sieht es bei anderen Bryophyten aus? Sequenzen liegen
bisher nur noch für P. patens vor: zwei vollständig sequenzierte Gensequenzen für zwei LHCP-
Proteine (LHCP(1), LHCP (2) (LONG et al. 1989)). Aber handelt es sich um Lhcb2-, Lhcb3- oder
gar um Lhcb1-Proteine? Die Frage läßt sich durch ein Alignment der entsprechenden Sequenzen
klären (Abb. 34).
Lhcb1 ---------------------------------------RKTATKAKPVS-SGSP--WYG Lhcb2 -------------------------------------------RRTVK---SAPQSIWYG LHCP(2) ----------------------------------------KKGAKAVSK.-SSSANQF.. LHCP(1) ---------------------------------------------------AGSDTI... Lhcb1 PDRVKYLGPFSGESPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAKNRELEVIHCRWAMLGALG Lhcb2 EDRPKYLGPFSEQTPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFARNRELEVIHCRWAMLGALG LHCP(2) P.ATSGWD-LQHQH.RLP... P.................KRY....L..A.CGL..... LHCP(1) A..PKFL....GET....N...A...........S......R........A......... Lhcb1 CVFPELLA-RNGVKFG-EAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPSLVHAQSILAIWACQVILMG Lhcb2 CVFPEILS-KNGVKFG-EAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPNLVHAQSILAIWACQVVLMG LHCP(2) M.T..L.ADEDGI...DA.I.....AA..QD...N.....S.I...N.V.TL.V..V... LHCP(1) .LT..L.A-KS.....-........A..............S...............V... Lhcb1 AVEGYRIAGGPLGEVTDPLYPGGSFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFV Lhcb2 FVEGYRVGGGPLGEGLDKIYPGGAFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFV LHCP(2) L.....VN...A..GL.PL...EA..........DTF................ACL.... LHCP(1) A......A......VT.P.....S..........DT........................ Lhcb1 QAIVTGKGPLENLADHLADPVNNNAWAFATNFVPGK- Lhcb2 QAIVTGKGPIENLSDHIADPVANNAWAYATNFVPGK- LHCP(2) .........I...T..L.N.AE...F.Y..K.T.Q-- LHCP(1) .........L...N..L....A.....Y.PTSP.. TR
Abb. 34: Alignment der LHCP-Sequenzen von P. patens mit den Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau) Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON. (1996). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices. Zu beiden Konsensussequenzen identische Aminosäuren sind durch Punkte (...) gekennzeichnet, für Lhcb1 bzw. Lhcb2 typische Aminosäuren mit der entsprechenden Farbe der Konsensussequenz.
Diskussion 92
Die LHCP (1) Sequenz läßt sich eindeutig als ein Lhcb2-Protein identifizieren, die andere
hingegen weder als Lhcb1 noch als Lhcb2. Auch P. patens verfügt somit eindeutig über ein
Lhcb2-Protein. Weitere Untersuchungen an anderen Organismen müssen klären, ab wann sich
im Verlauf der Evolution der Lhcb1 der Höheren Pflanzen herausgebildet hat.
Auch was das Vorhandensein der Verwandten der CAB-Proteine betrifft, scheint M. polymorpha
Höheren Pflanzen vergleichbar. So konnte eine dem PsbS-Protein homolge Sequenz ermittelt
werden, ebenso wie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana ähnliche Sequenz. Immunnachweise
lassen auch das Vorhandensein anderer zur ELIP-Familie gehörenden Proteine in dem
Lebermoos M. polymorpha vermuten (KILIAN 1998).
Bezüglich der am Aufbau des LHCI beteiligten Proteine von M. polymorpha kann aufgrund nur
einer ermittelten Lhca-Sequenz nur gesagt werden: M. polymorpha besitzt ein Lhca4-Protein,
das dem Höherer Pflanzen sehr ähnlich ist.
Jedoch zeigen frühere biochemische Untersuchungen, daß sich die periphere Antenne des PSI
von M. polymorpha ebenfalls wie bei Höheren Pflanzen aus vier verschiedenen Lhca-Proteinen
zusammensetzt. HERRMANN und Mitarbeiter (1997) isolierten aus phototrophen Zellkulturen von
M. polymorpha PSI-Komplexe. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung unter
volldenaturierenden Bedingungen im Polyacrylamidgel ordneten sie vier Proteine mit apparenten
Molekulargewichten von 20-24 kDa aufgrund ihres Molekulargewichtes den LHCI-
Untereinheiten Lhca1-Lhca4 zu.
Warum sich unter den 1920 analysiertern EST-Sequenzen nur eine Lhca-Sequenz fand, ist
schwer zu sagen. Die Häufigkeit mit der eine bestimmte cDNA in einer cDNA-Bibliothek
vertreten ist, gibt zwar auch einen Hinweis auf die Expression des entsprechenden Genes. Doch
darf dies nicht überbewertet werden. Vermutlich würden sich bei Untesuchung einer höheren
Anzahl an EST-Sequenzen von M. polymorpha auch weitere Lhca-Sequenzen finden.
4.2 Analyse der CAB-Proteinsequenzen
Lassen die in dieser Arbeit ermittelten Sequenzdaten für die CAB-Proteine von M. polymorpha
Rückschlüsse auf von den Proteinen aus Samenpflanzen abweichende Eigenschaften zu?
Im folgenden werden die Ergebnisse der Sequenzvergleiche zwischen den CAB-Proteinen von
M. polymorpha und den homologen Proteinen der Höheren Pflanzen diskutiert.
Die Übereinstimmungen der für M. polymorpha identifizierten CAB-Proteine mit denen Höherer
Pflanzen belaufen sich für die reifen Proteine auf Aminosäureebene zwischen 76 und 85 %
Diskussion 93
(Tab 16, 3.1.2). Damit liegen die Sequenzabweichungen in der für verschiedene
Pflanzengruppen bisher bekannten Größenordnung. In der Regel sind die Übereinstimmungen
zwischen den Primärsequenzen homologer CAB-Proteine verschiedener pflanzlicher Species
sehr hoch: innerhalb der Angiospermen beläuft sich die Übereinstimmung auf mehr als 90%.
Werden Sequenzen Angiospermer mit denen Gymnospermer verglichen, liegt der Prozentsatz
identischer Aminosäuren bei 80 bis 90 % (JANSSON & GUSTAFSSON 1991, PICHERSKY &
JANSSON 1996). Angemerkt sei, daß sich diese Zahlenwerte auf die reifen Proteine beziehen.
Bezüglich der Transitpeptide bestehen wesentlich größere Unterschiede (ROBINSON & KNOTT
1996).
4.2.1 Lhca4
Zwei Subkomplexe des LHCI werden aufgrund ihrer Fluoreszensemissionsmaxima bei 77K
unterschieden, der LHCI-630 und der LHCI-730. Sind beide Subkomplexe mit dem PSI-
Reaktionszentrum assoziiert, liegt das 77K-Fluoreszensmaximum des Gesamtkomplexes
zwischen 738-742 nm (KNOETZEL et al. 1992). Das Flureszenzmaximum der PSI-Komplexe von
M. polymorpha bei 77K liegt, wie von HERRMANN und Mitarbeitern (1997) gezeigt, hingegen bei
720 nm. Dieses Maximum entspricht damit eher dem einer PSI-Reaktionszentrumseinheit ohne
Lhca-Proteine (KNOETZEL et al. 1992, TJUS et al. 1995), scheint aber, wie von ARO und
Mitarbeitern (1981) gezeigt, typisch für Moose und einige Algen zu sein. Eine mögliche Ursache
für dieses blauverschobene Fluoreszenzmaximum bei 77K läßt sich von der in dieser Arbeit
ermittelte Lhca4-Sequenz von M. polymorpha nicht ableiten. Mit 80 % identischen Aminosäuren
zur Lhca4-Sequenz des reifen Proteins von A. thaliana (Abb. 15) ist das Lhca4 von
M. polymorpha dem Höherer Pflanzen doch sehr ähnlich. Die Sequenzunterschiede liegen
zudem in Bereichen, die im Vergleich zur Lhca4-Konsensussequenz von PICHERSKY & JANSSON
(1996) zwischen den Sequenzen verschie dener Species eher nicht so hoch konserviert sind.
Alle mutmaßlichen der aus der Kristallstruktur für das Lhcb1 der Erbse bestimmten
Chlorophylliganden (KÜHLBRANDT et al. 1994) sind in der Lhca4-Proteinsequenz von
M. polmorpha hoch konserviert. Allerdings liegen bisher keine quantitativen Daten zur
Pigmentbindung vor. Für LHCI ermittelte Pigmentverhältnisse (CROCE & BASSI 1998) sprechen
dafür, daß jedes der Lhca-Proteine ca. 10.4 Chl a, 2.6 Chl b, 1.3 Lutein, 1.3 β-Carotein und
0.8 Violaxanthin bindet (SCHELLER et al. 2001). Abgesehen davon, daß weitere Lhca-Sequenzen
für M. polymorpha weiteren Aufschluß für das blauverschobene Fluoreszenzmaximum bei 77K
geben könnten, könnten aber auch Rekonstitutionsexperimente mit Lhca1-Proteinen aus anderen
Organismen z.B. ein Ansatz sein, diese Frage zu klären.
Diskussion 94
4.2.2 LHCII1.1-1.4, Lhcb2, Lhcb3
Bereits ARO (1982) konnte die Existenz eines LHCIIs für M. polymorpha nachweisen. KILIAN
und Mitarbeitern (1998) gelang es dann zu zeigen, daß ebenso wie bei Samenpflanzen zwischen
Trimere bildenden LHCII-Proteinen und monomeren minoren CAB-Proteinen unterschieden
werden kann.
Jedes der LHCII-1.1-1.4-Proteine von M. polymorpha stellt für sich eine Mischung aus Lhcb1-
und Lhcb2- Protein Höherer Pflanzen dar, was sie als Vorläufer dieser Proteine erscheinen läßt.
Vermutlich sind sie somit auch Bestandteil der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha,
zusammen mit dem Lhcb2 und Lhcb3. Zeichnen sich die trimeren LHCII-Komplexe von
M. polymorpha nun durch andere Eigenschaften aus?
Da charakteristische Sequenzbereiche, deren Vorhandensein bisher mit spezifischen
Eigenschaften der Proteine in Verbindung gebracht werden, hoch konserviert sind, eher nicht.
Das für die Trimerisierung als essentiell betrachtete Aminosäuresequenzmotiv WYGPDR (HOBE
et al. 1995) ist in allen diesen Sequenzen vorhanden. Zudem ist die 11. Aminosäure an den C-
Terminini des Lhcb2 und des Lhcb3 von M. polymorpha ein Tryptophan (Abb. 20). Dieses soll,
wie von KUTTKAT und Mitarbeitern (1996) gezeigt, ebenfalls essentiell für die Trimerisierung
des LHCII sein. Somit ist davon auszugehen, daß die LHCII-1.1-1.4-Proteine zusammen mit
dem Lhcb2 und dem Lhcb3 die trimeren LHCII-Kompexe von M. polymorpha bilden. In SDS-
Harnstoffgelen trennen sich trimere LHCII-Komplexe von M. polymorpha in Apoproteine von
25-29 kDa und einem Protein von 22 kDa auf (KILIAN 1998). Da nur Teilsequenzen von den
LHCII-1.1-1.4-Proteinen ermittelt werden konnten, läßt sich leider nicht ihr Molekulargewicht
ableiten.
Die spektralen Eigenschaften der LHCII-Trimere von M. polymorpha entsprechen denen von
isolierten LHCII-Komplexen aus Samenpflanzen (KILIAN 1998). Die Sequenzvergleiche zeigen,
daß alle mutmaßlichen Chlorophylliganden und Xanthophyllbindungsstellen hoch konserviert
sind (3.1.2.2.1), dies läßt auf eine vergleichbare Chromophorbindung schließen und steht in
Einklang mit den spektralen Eigenschaften der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha.
Im Unterschied zu Samenpflanzen weist das kleinste von KILIAN (1998) nach Elektrophorese in
SDS-Harnstoffgelen detektierte Protein der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha einen
basischeren pI auf als die entsprechenden Proteine Höherer Pflanzen. Da es das kleinste Protein
von 22 kDa betrifft, wurde vermutet, daß es sich um das Lhcb3-Genprodukt handelt.
Basische pI-Werte deuten auf einen höheren Gehalt an basischen Aminosäuren in der
Primärsequenz hin. Das in dieser Arbeit bestimmte Verhältnis an basischen zu sauren
Diskussion 95
Aminosäuren für das Lhcb3-Protein von M. polymorpha (Tab 17, 3.1.2.2.1), weicht jedoch nur
geringfügig von dem der Konsensussequenz des Lhcb3-Proteines ab. Das Lhcb3 von
M. polymorpha sollte somit einen dem Lhcb3 Höherer Pflanzen vergleichbaren pI-Wert
aufweisen. Für das Lhcb2 Protein von M. polymorpha hingegen ist das Verhältnis basischer zu
sauren Aminosäuren jedoch höher gegenüber der Konsensussequenz (PICHERSKY & JANSSON
1996) und läßt auf basischeren pI-Wert des Proteines schließen.
Die Phosphorylierung von Lhcb-Proteinen und ihre Bedeutung für die Verteilung von
Anregungsenergie zwischen den Photosystemen (state transistions) ist ein inzwischen
weitreichend bekanntes Phänomen (WANG & MEYERS 1974). Die N-terminale Phosphorylierung
der Untereinheiten Lhcb1 und Lhcb2 und die damit möglicherweise einhergehende
Konformationsänderung (ALLEN et al. 1997) bewirkt die Dissoziation der LHCII-Trimere vom
PSII. Für die Assoziation dieser Trimere mit PSI scheint dann, wie von LUNDE und Mitarbeitern
(2000) gezeigt der PSI-H Untereinheit der PSI eine besondere Funktion zuzukommen. Die
Phosphorylierungsstelle in Lhcb1-Proteinen liegt in unmittelbarer Nähe des N-Terminus
(MULLET , 1985). Jedoch läßt sich der genaue Aminosäurerest, der phosphoryliert wird, nicht so
eindeutig definieren, wie dies für andere PSII-Phosphoproteine möglich ist (RINTAMÄKI & ARO
2001). So ist das Thr-5 (Nummerierung beginnend mit dem Arginin des processierten Proteines)
in synthetischen Peptiden, die zum N-Terminus des Lhcb1-Proteines der Erbse analog sind, die
am meisten phosphorylierte Aminosäure (MICHEL & BENNETT, 1989). Ist dieser Threoninrest in
den synthetischen Peptiden nicht vorhanden, werden andere Threoninreste oder Serinreste in
unmittelbarer Nähe phosphoryliert (MICHEL & BENNETT 1989). Das Thr-5 ist nicht in allen
Aminosäuresequenzen von Lhcb1 oder Lhcb2-Proteinen konserviert (JANSSON 1999), was darauf
schließen läßt, daß andere Threonin- oder Serinreste dieser Proteine phosphoryliert werden
(DILLY-HARTWIG et al. 1998).
Die molekulare Grundlage für die LHCII-Phosphorylierung ist auch in den LHCII-Sequenzen
von M. polymorpha vorhanden. Die N-terminalen Regionen der LHCII-Proteine LHCII-1.1,
LHCII-1.2, LHCII-1.4 und Lhcb2 weisen jeweils einen Threoninrest auf. Frühere
Untersuchungen lassen vermuten, daß bei M. polymorpha grundsätzlich auch state transitions
stattfinden. SCHMID und Mitarbeiter (1995) konnten bei photoautotrophen
Suspensionskulturzellen von M. polymorpha eine Verlagerung des LHCII in die
Stromamembranen als Folge von Lichtstress feststellen. HERRMANN und Mitarbeiter (1997)
wiesen zudem LHCII als Bestandteil einer PSI-Bande im Saccharosedichtegradienten nach.
Diskussion 96
4.2.3 Lhcb4-6
Insbesondere aufgrund der hohen Gehalte an Xanthophyllzykluspigmenten (BASSI et al. 1993)
wird den CAB-Proteinen Lhcb4-6 von Samenpflanzen eine wichtige Funktion bei der
Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie zugesprochen (BASSI et al. 1993, HORTON et al.
1996, NIYOGI 1999) (siehe Tab 3, 1.3.1.2). Ausgelöst durch einen niedrigen pH-Wert im Lumen
der Thylakoide, der sich infolge überschüssiger Anregungsenergie bildet, werden die Minoren
CAB-Proteine Lhcb4 und Lhcb5 protoniert (CROFTS & YERKES 1994, HORTON & RUBAN 1994,
WALTERS et al 1994, RUBAN & HORTON 1996, NIYOGI 1999). Gleichzeitig bedingt der niedrige
pH-Wert die Deepoxidation von Violaxanthin zu Zeaxanthin durch die Violaxanthin-
Deepoxidase. Die Bindung von Zeaxanthin und Protonen durch die Minoren CAB-Proteine mag
dann die für die Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie in Wärme nötigen
Konformationsänderungen auslösen (BILGER & BJÖRKMANN 1989, NIYOGI 1999).
JEGERSCHÖLD und Mitarbeiter (2000) propagieren, daß das Glutamat in Helix C sowie die drei
für Lhcb4 charakteristischen sauren Aminosäuren im Loop zwischen den Helices B und C die
Bindung von Ca2+-Ionen coordinieren. Bei niedrigem pH soll das NPQ dadurch getriggert
werden, daß sich die Koordination der Ca2+-Ionen verändert.
Auch für die CAB-Proteine Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 von M. polymorpha wurde gezeigt, daß sie
einen hohen Anteil des Xanthophylls Violoxanthin binden und daß die spektralen Eigenschaften
der Proteine denen der Samenpflanzen vergleichbar sind (KILIAN 1998). Die in dieser Arbeit
ermittelten Sequenzdaten für die Minoren CAB-Proteine von M. polymorpha zeigen, daß die
molekularen Grundlagen für vergleichbare Funktionen der Proteine beim NPQ vorliegen.
So sind zum einen die für Lhcb4-Proteine Höherer Pflanzen charakteristischen sauren
Aminosäuren im Loop zwischen den Helices B und C auch bei M. polymorpha hoch konserviert
(Abb. 25), ebenso wie die für Lhcb4 und Lhcb5 Proteine bekannten DCCD-Bindungsstellen.
DCCD bindet bevorzugt an saure Aminosäuren in hydrophoben Umgebungen, die an
Protonentranslokationen beteiligt sind und fungiert somit als ein Inhibitor des NPQ. Zwei
DCCD-Bindungdstellen wurden für Lhcb5-Proteine identifiziert (WALTERS & HORTON 1995).
Zum einen ist dies ein Glutaminsäurerest im Lumen-exponierten Loop zwischen Helix B und C,
zum anderen ein Glutaminsäurerest am C-Terminus des Proteines (Abb. 25). Lhcb5 weist andere
DCCD-Bindungsstellen auf als Lhcb4. PESARESI und Mitarbeiter identifizierten den Glutamat-
liganden für das Chl b6 als DCCD-Bindingsstelle in Lhcb4.
KILIAN (1998) ermittelte für die CAB-Proteine Lhcb4-6 von M. polymorpha um zwei bis drei
Einheiten basischere pI-Werte als für die homologen Proteine der Samenpflanzen beschrieben.
Die Ermittlung des Verhältnisses basischer zu sauren Aminosäuren aus den in dieser Arbeit
Diskussion 97
ermittelten Primärsequenzen ergab, daß die Verhältnisse in der Tat für alle drei Minoren CAB-
Proteine höher sind (Tab. 18, 3.1.2.2.2) und sich so die basischeren pI-Werte der Proteine im
Vergleich zu den homologen Proteinen der Samenpflanzen erklären lassen. Ob und welche
Auswirkungen dies jedoch auf die Funktion der Proteine hat, bleibt weiterhin in den Raum
gestellt. Auch für den Farn Ceratopteris richardii berichteten OBERSCHMIDT und Mitarbeiter
(1995) basischere pI-Werte der Lhcb4- und Lhcb5-Proteine.
Neben den Lhcb1 und Lhcb2-Proteinen ist das Lhcb4-Protein ein weiteres Lhcb-Protein für das
eine reversible Phosphorylierung beschrieben wurde. BERGANTINO und Mitarbeiter (1995)
berichteten von einer reversiblen Phosphorylierung des Lhcb4 bei Mais unter Licht- und
Kältestress in vivo. Phosphoryliert wird hierbei das Threonin-83 (TESTI et al. 1996), das in einer
für das Lhcb4 charakteristischen Stroma-exponierten Schleife vor der ersten transmembranen
Helix liegt. Über die Bedeutung dieser Phosphorylierung unter Licht- und Kältestress wird
jedoch immer noch spekuliert. CROCE und Mitarbeiter (1996) vermuten, daß die
Phosphorylierung eine Konformationsänderung des Proteines induziert, die sich wiederum auf
die Chlorophyll-Chlorophyll-Wechselwirkungen auswirkt. Dadurch soll ein dissipativer Zustand
erreicht werden, der das PSII-Reaktionszentrum bei Lichtstress entlasten kann (CROCE et al.
1996). Gestützt wird diese Annahme dadurch, daß Mais-Linien mit einer geringeren Fähigkeit
zur Phosphorylierung des Lhcb4 auch empfindlicher auf Licht und Kältestress reagieren
(MAURO et al. 1997). Wie schon von KILIAN und Mitarbeiter (1998) ermittelt und nun durch die
von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Lhcb4-Proteines von
M. polymorpha bestätigt, sitzt anstelle des Threonin-83 ein strukturell ähnliches aber nicht
phosphorylierbares Valin. Auch in unmittelbarer Nähe finden sich keine phosphorylierbaren
Aminosäurereste (Abb. 25). Phosphoryliertes Lhcb4 weist in SDS-Harnstoffgelen gegenüber der
Normalform ein verändertes Migrationsverhalten auf. Eine solche Form des Lhcb4 trat auch bei
Lichtstressbehandlung von phototrophen Suspensionskulturzellen von M. polymorpha nicht auf.
Ein Vergleich mit weiteren Sequenzdaten von Lhcb4-Proteinen von Bryophyten könnte klären,
ob die Phosphorylierungsstelle in Lhcb4 der Bryophyten generell nicht vorhanden ist und sich
erst im Verlauf der Evolution ein neuer protektiver Mechanismus entwickelt hat.
4.2.4 Verwandte der cab-Genfamilie
Als erstmals die Sequenz eines psbS-Gens ermittelt wurde (KIM et al. 1992, WEDEL et al. 1992),
herrschte großes Erstaunen über den hohen Grad an struktureller Ähnlichkeit des Proteines zu
den CAB-Proteinen. Die Sequenzähnlichkeit des PsbS-Proteins der Tomate zu dem Lhcb3-
Genprodukt beläuft sich zum Beispiel auf 44.4 % (FUNK 2001). Erst später wurde gezeigt, daß
Diskussion 98
das PsbS auch Chlorophyll a und b zu binden vermag, wenn auch in weitaus geringerem Maße
als andere CAB-Proteine (FUNK et al. 1995 a,b).
PsbS-Gensequenzen liegen inzwischen für verschiedene C3 und C4-Pflanzen vor (KIM et al.
1992, WEDEL et al. 1992, WALLBRAUN et al. 1994, IWASAKI et al. 1997, WYRICH et al. 1998,
JANSSON et al. 1999). Mittels polyklonaler Antikörper konnte das Protein auch in dem Farn
Nephrolepsis exaltata und in der Grünalge C. reinhardtii identifiziert werden. Die psbS-Gene
verschiedener Organismen sind sehr hoch konserviert. So beläuft sich die Übereinstimmung der
Sequenzen des psbS-Genes der Tomate und des Spinates auf 86% (WALLBRAUN et al. 1994). Die
Ähnlichkeit des psbS aus Reis zu dem aus Tomate liegt bei 84.4 %, zu dem des Spinates bei
80.6 % (IWASAKI et al. 1997).
Zwei der in dieser Arbeit analysierten EST-Klone von M. polymorpha codieren für jeweils einen
anderen Teilbereich eines PsbS-Proteines (3.1.2.3). Der Anteil identischer Aminosäuren der
beiden Teilsequenzen zu der entsprechenden Sequenz von A. thaliana liegt mit 92% für den N-
terminalen und mit 73 % für den C-terminalen Bereich ebenfalls sehr hoch.
Aufgrund der hohen Übereinstimmungen zwischen den PsbS-Proteinen verschiedener
Organismen, wird vermutet, daß dem PsbS eine essentielle Funktion zukommen muß. Mehrere
mögliche Funktionen werden diskutiert. Diese können dann auch für das PsbS aus
M. polymorpha in Frage kommen. Die relativ schwache Bindung der Pigmente und die geringe
Anzahl an Chlorophyllen sowie deren geringe excitonische Kopplung ließ vermuten, daß es als
„Liganden Chaperone“ fungiert und kurzfristig Sammelstelle für neu synthestisierte
Chlorophylle ist (FUNK 2001).
LI und Mitarbeiter (2000) konnten zeigen, daß eine an dem psbS-Gen defiziente Mutante von
A. thaliana kein NPQ ausführen konnte. Somit scheint eine wichtige Funktion des PsbS-
Proteines bei der Dissipitation überschüssiger Lichtenergie zu liegen. Da M. polymorpha
ebenfalls über ein PsbS-Protein verfügt und dieses, wie die ermittelten Teilsequenzen, vermuten
lassen, dem Höherer Pflanzen sehr ähnlich ist, liegt es nahe, daß dem Protein in M. polymorpha
eine ähnliche Funktion zukommt. Der vermutete protektive Mechanismus muß also schon sehr
alt und essentiell sein.
Nach derzeitiger Vorstellung gehen die Lichtsammelproteine aller photosynthetischen
Eukaryoten auf einen gemeinsamen Ursprung zurück. Aufgrund des hohen Grades an
Sequenzhomologie zwischen dem cyanobaktriellen HLIP, der ersten transmembranen Helix der
Sep-Proteine und der Helices I und III der CAB-Proteine von A. thaliana postulierten HEDDAD &
ADAMSKA (2000), daß die Sep-Proteine das fehlende Bindeglied in der derzeit favorisierten
Vorstellung zur Evolution der Antennenproteine von Pro-und Eukaryoten repräsentieren (siehe
1.1.3.3). Veröffentlichte Sequenzen liegen bisher nur für Sep-Proteine aus A. thaliana vor. Es
Diskussion 99
konnte jedoch auch ein dem Sep1 homologer cDNA-Klon von der Pappel sequenziert werden
(JANSSON 1999). Der in dieser Arbeit isolierte cDNA-Klon mit Ähnlichkeit zum Sep1-Protein
aus A. thaliana besitzt im Bereich der ersten transmembranen Helix 82 % Übereinstimmung zu
diesem. Die Übereinstimmung für die zweite transmembrane Helix beläuft sich nur noch auf
57% (Abb. 29). Alle weiteren Bereiche zwischen den Proteine unterscheiden sich sehr stark
voneinander. Dies läßt vermuten, daß es sich möglicherweise um einen anderen Typ eines Sep-
Proteines in M. polymorpha handelt. Auch der Vergleich der für A. thaliana ermittelten
Sequenzen der drei Sep-Proteintypen zeigt, daß die Sequenzähnlichkeit zwischen den drei Sep-
Proteinen weniger als 25 % beträgt. Höchste Ähnlichkeit besteht auch dort zwischen der ersten
transmembranen Helix, während die Helix II und der N-Terminus sehr polymorph sind und
zwischen den verschiedenen Sep-Proteinen stark variierten (ADAMSKA 2001).
Durch die für M. polymorpha ermittelte Sequenz konnte eindeutig gezeigt werden, daß die zur
ELIP-Familie gehörenden zwei Helix-Proteine nicht nur auf Höhere Pflanzen beschränkt sind.
Dies unterstützt nachhaltig die derzeitigen Vorstellungen zur Evolution der Lhc-Proteine.
4.3 Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha
Lhc-Gene waren unter den ersten pflanzlichen Genen, die isoliert und sequenziert wurden. Somit
ist es auch nicht verwunderlich, daß zahlreiche Untersuchungen bezüglich ihrer Expression
erfolgten. Allerdings beschränkten sich diese meist auf das Lhcb1-Gen. Expressionsmuster
wurden für verschiedenste physiologische Bedingungen, während verschiedener
Entwicklungsstadien und in den unterschiedlichsten pflanzlichen Organen ermittelt (PICHERSKY
& JANSSON 1996).
4.3.1 Diurnale Expression
Ein Charakteristikum der Lhc-Genexpression, das immer noch unbeantwortete Fragen aufwirft,
ist die diurnale Expression der Lhc-Gene in vielen pflanzlichen Species (MEYER et al. 1989,
NEVO et al. 1993, PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT et al. 1995). Lhc-Gene der Vertreter der
verschiedensten Abteilungen des pflanzlichen Reiches werden diurnal exprimiert, was zu der
Vermutung führte, daß der Kontrollmechanismus, eine „circadiane Uhr“, ein sehr alter Prozess
ist (OBERSCHMIDT et al. 1995). Species der gymnospermen Coniferophytina bilden jedoch eine
Ausnahme, ebenso wie das Lebermoos C. conicum. Sie zeigen keine diurnale Akkumulation der
Lhc-mRNA. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsanalysen sprechen dafür, daß dies
kein generelles Merkmal für Lebermoose ist, denn wie gezeigt werden konnte, werden
verschiedene Lhc-Gene von M. polymorpha diurnal exprimiert (Abb. 32). Allerdings bestehen
Diskussion 100
charakteristische Unterschiede im Akkumulationsmuster, das im Vergleich zu dem bisher
bekannten zeitverschoben ist. Über die Gründe warum der regulatorische Mechanismus zur
Kontrolle der täglichen Expression der Lhc-Gene fehlt (Coniferophytina) oder wie im Fall von
M. polymorpha die diurnale Expression im Vergleich zu Angiospermen zeitverschobenen ist,
läßt sich, bislang leider nur spekulieren. Da Kinetiken zum CAB-Protein turnover bisher so gut
wie gar nicht vorliegen, läßt sich nicht mit Bestimmtheit sagen, ob das mittägliche bzw. spät
nachmittägliche Maximum (M. polymorpha) der Akkumulation von Lhc-mRNA sich auch auf
Proteinebene widerspiegelt und einem erhöhten Bedarf an Lhc-Protein entspricht. Diesbezüglich
sind weitere Untersuchungen unabdingbar, um so auch das Phänomen der diurnalen Lhc-
Genexpression besser zu verstehen.
OBERSCHMIDT und Mitarbeiter (1995) spekulierten, daß die diurnale Expression der Lhc-Gene in
einem direkten Zusammenhang damit steht, ob eine Pflanze nur auf einen lichtabhängigen
Chlorophyllbiosyntheseweg angewiesen ist, oder ob sie auch im Dunkeln Chlorophyll
synthetisierern kann. Coniferophytina können ebenso wie einige Species der Bryophyten
Chlorophyll unabhängig vom Licht synthetisieren (STAHL 1909, KOJIMA et al. 1992, CANOVAS et
al. 1993, YAMAMOTO et al. 1991). Die Synthese von Chl a und Chl b ist bei vielen Species eine
determinierende Voraussetzung für die Expression der CAB-Proteine (ALOSI & NEALE 1991)
und da viele CAB-Proteine ohne Pigmente nicht stabil sind (PAULSEN 2001) und das
Gefährdungspotential des Photosyntheseapparates durch freie Pigmente im Licht erhöht ist,
macht die unter der Kontrolle einer circadianen Uhr stehendende Lhc-Genexpression hochgradig
Sinn. So setzt mit Sonnenaufgang, wenn die Chlorophyllsynthese wieder einsetzt, auch vermehrt
die Expression der Lhc-Gene ein. In Pflanzen mit lichtunabhängigem Chlorophyllbio-
syntheseweg liegt der Chlorophyllgehalt im Dunkeln bei etwa 20-50 % von im Licht
gewachsenen Pflanzen (OBERSCHMIDT et al. 1995).
Die für M. polymorpha festgestellte zeitverschobene diurnale Expression der Lhc-Gene im
Vergleich zu Angiospermen, paßt sich insofern in diese Vorstellungen ein, daß M. polymorpha
ebenso wie C. conicum auch im Dunkeln Chlorophyll zu synthetisieren vermag (STAHL 1909).
Somit liegt bei Sonnenaufgang schon ein gewisser Gehalt an Chlorophyll in der Pflanze vor und
es Bedarf nicht einer solch erhöhten Lhc-Genexpression in den Vormittagsstunden. Warum
allerdings gerade in den späten Nachmittagsstunden nach 11h Lichtphase die Genexpression
erhöht ist, bleibt offen. Hier ist es unabdingbar zu untersuchen, in wieweit der erhöhte Lhc-
mRNA-Gehalt auch zu einem erhöhten Lhc-Proteingehalt führt.
Diskussion 101
4.3.2 Veränderte Expression des Sep1-ähnlichen Gens bei Lichtstress
Frühere Arbeiten vor allem an phototrophen Suspensionskulturzellen von M. polymorpha zeigen,
daß das Lebermoos M. polymorpha zu einer Starklichtanpassung in Folge von Lichtstress fähig
ist (PETER 1994, ROOS 1994, HERRMANN 1995, WÖLFEL 1998). Da Sep-Proteine Lichtstress-
induzierte Proteine sind (HEDDAL & ADAMSKA 2000), wird viel über eine mögliche Funktion
spekuliert, insbesondere aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Lhc-Genfamilie. Bislang liegen
Sequenzen für Sep-Proteine nur für A. thaliana vor. Hier konnte erstmalig gezeigt werden, auch
Bryophyten haben Sep-ähnliche Proteine. Da Sep-Proteine das bislang fehlende „missing link“
bei der derzeit gängigen Vorstellung zur Evolution der Lhc-Genfamilie darstellen, ist es umso
bedeutender zu zeigen, daß sich diese Proteine auch bei Bryophyten finden.
Für die Sep-Proteine von A. thaliana ist beschrieben, daß ihr mRNA-Gehalt in Folge von
Lichtstress drastisch ansteigt. Dies konnte auch für den mRNA-Gehalt des Sep1-ähnlichen
Proteins von M. polymorpha gezeigt werden. Die Reaktion erfolgt sogar sehr zügig, schon nach
2 h. Ist dies ein Hinweis auf eine ganz besondere Funktion dieses Proteines bei Lichtstress?
Zunächst müßte die Frage geklärt werden, ob sich der erhöhte mRNA-Gehalt auch wirklich auf
Proteinebene widerspiegelt.
4.4 Ausblick
Durch das hier erarbeitete und vorgestellte Datenmaterial ergeben sich eine Reihe weiterer
Fragestellungen und Forschungsansätze. Insbesondere die Fülle der hier gewonnenen Sequenzen
für das nukleäre Genom von M. polymorpha wartet auf eine weitere Auswertung. Zum einen
würde die Klassifizierung der EST-Sequenzen nach Funktionen der von ihnen codierten Proteine
wichtige Informationen über diesen Organismus liefern. Ganz besonders mit dem Augenmerk
auf seine phylogenetische Stellung. Zum anderen steht der Vergleich zwischen den EST-
Sequenzen, der zwei verschiedenen cDNA-Bibliotheken von M. polymorpha aus. Darüber
könnten wichtige Informationen gewonnen werden, welchen Proteinen und Stoffwechselwegen
bei Lichtstress eine besondere Funktion zukommt.
Aufgrund der hier ermittelten CAB-Proteinsequenzen lassen sich Antikörper generieren, die
eingesetzt werden sollen, um in der Einzelpartikelanalyse mittels Elektronenmikroskopie eine
Lokalisierung der einzelen CAB-Proteine innerhalb der Antenne des PSII vorzunehmen. Ein
schwieriges Unterfangen, das aber, wenn es gelingen würde, wesentlich zum Verständnis der
pflanzlichen PSII-Antenne und ihrer einzelnen Pigmente beitragen könnte.
Diskussion 102
Die weitere Sequenzierung von EST-Klonen von M. polymorpha wäre sinnvoll, um mehr Lhca-
Sequenzen zu gewinnen. Denn über den LHCI von M. polymorpha ist weit weniger bekannt als
über den LHCII.
Ganz besonders interessant wäre es, das Sep1-ähnliche Protein von M. polymorpha näher zu
charakterisieren. Bisher ist es das einzige für eine Niedere Pflanze ermittelte. Zudem scheint es
möglicherweise ein eigener Typ eines Sep-Proteins zu sein. Über die Funktion dieser Proteine ist
bislang sehr wenig bekannt, auch ob sie überhaupt Chlorophylle zu binden vermögen, bedarf
noch erst einer eingehenden Untersuchung.
103
5 Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die cab-Genfamilie eines Bryophyten detailiert
untersucht. Untersuchungen der Chlorophyll a/b bindenden (CAB) Lichtsammelproteinen
erstreckten sich bislang vorwiegend auf Samenpflanzen und einige wenige Algengruppen.
Aufgrund der taxonomischen Zwischenstellung des hier untersuchten Lebermooses
M. polymorpha, komplementieren die gewonnenen Daten das bisherige Bild von der
molekularen Entwicklung dieser Genfamilie.
12 Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha wurden über zwei verschiedene
methodische Ansätze identifiziert. Neun der ermittelten cDNA-Sequenzen lassen sich Proteinen
des Antennens ystems des PSII zuordnen, eine Sequenz dem des PSI. Weiterhin konnte für das
ebenfalls zur cab-Genfamilie Höherer Pflanzen zählende PsbS-Protein eine Teilsequenz ermittelt
werden, sowie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana ähnliche Sequenz.
Anhand der gewonnenen Daten kann zwar wenig bezüglich der Antenne des PSI von
M. polymorpha ausgesagt werden, doch bezüglich des PSII weist die Zusammensetzung der cab-
Genfamilie darauf hin, daß sich der Aufbau des LHCII aus den verschiedenen Lhcb-Proteinen
seit mehr als 480 Millionen Jahren, seit den primitivsten Landpflanzen, nicht mehr gravierend
verändert hat. Dafür spricht abgesehen von der Zusammensetzung der Genfamilie auch der hohe
Grad an Sequenzhomologie zwischen den CAB-Proteinen von M. polymorpha und denen der
Samenpflanzen. Im Vergleich zur Grünalge C. reinhardtii sind bei M. polymorpha zwei Lhcb-
Proteine, das Lhcb2 und das Lhcb3 schon entwickelt. Ein eindeutig dem Lhcb1 Protein Höherer
Pflanzen zuzuordnendes Protein konnte hingegen nicht gefunden werden. Da stattdessen LHCII-
Proteine gefunden wurden (LHCII1.1-1.4), die eine Mischform aus Lhcb1- und Lhcb2-Protein
Höherer Pflanzen darzustellen scheinen, liegt die Vermutung nahe, daß sich das Lhcb1 erst
später aus einem solchen entwickelte. Die Primärsequenzen der für M. polymorpha ermittelten
CAB-Proteine geben ferner einen Hinweis darauf, daß die differenzierten Funktionen der
meisten CAB-Proteine wohl schon vor der Trennung der Bryophyten von den Farnpflanzen, aus
denen sich die Samenpflanzen entwickelten, festgelegt waren.
Sep-Proteine sind erst kürzlich entdeckt und der Proteinfamilie der Elips zugeordnet worden.
Sequenzen lagen bisher nur für drei Proteine aus A. thaliana vor. Erstmalig konnte hier eine für
ein Sep1-ähnliches Protein codierende cDNA Sequenz auch in einer Niederen Pflanze
nachgewiesen werden. Wie der Anstieg des mRNA-Gehaltes in Folge von Lichtstress zeigt,
scheint es sich bei dem Sep1-ähnlichen Protein von M. polymorpha ebenfalls um ein Lichtstress-
induziertes Protein zu handeln. Seine funktionelle Bedeutung ist allerdings noch völlig unklar.
Zusammenfassung 104
Anhand von Expressionsanalysen konnte geteigt werden, daß einzelne cab-Gene von
M polymorpha ebenfalls wie die der Angiospremen diurnal exprimiert werden. Gründe für das
zeitverschobene Akkumulationsmuster sind allerding sehr schwer auszumachen. Die Frage,ob
sich ein erhöhter mRNA-Spiegel auch auf Proteinebene widerspiegelt, muß erst noch durch
entsprechendeUntersuchungen ermittelt werden.
105
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119
7 Anhang
Im folgenden werden die Ergebnisse der Annotierung der in dieser Arbeit ermittelten EST-
Sequenzen für M. polymorpha aufgelistet.
Anhang 120
Contig /Klone
Länge
(Basen)
Score
(bits) Identifizierung Organismus
5 712 137
HYPOTHETICAL OXIDOREDUCTASE IN ADD-NTH
INTERGENIC REGION Escherichia coli
9 549 117
PERIOD CIRCADIAN PROTEIN 1 (CIRCADIAN
PACEMAKER PROTEIN RIGUI) (HPER) Homo sapiens (Human)
44 619 147
HYPOTHETICAL 9.8 KD PROTEIN ZK652.3 IN
CHROMOSOME III Caenorhabditis elegans
114 1080 124
PROBABLE PHOSPHATIDYLINOSITOL-4-PHOSPHATE 5-
KINASE MSS4
Saccharomyces cerevisiae
(Baker's yeast)
137 753 178
SUCCINATE DEHYDROGENASE [UBIQUINONE] IRON-
SULFUR PROTEIN
Drosophila melanogaster
(Fruit fly)
167 700 215 SERINE--GLYOXYLATE AMINOTRANSFERASE (SGAT)
Hyphomicrobium
methylovorum
193 637 129 40S RIBOSOMAL PROTEIN S27
Xenopus laevis (African
clawed frog)
UC04P.D04 390 170
2-OXOGLUTARATE DEHYDROGENASE E1
COMPONENT, MITOCHONDRIAL PRECURSOR Saccharomyces cerevisiae
UC02P.H08 330 119 40S RIBOSOMAL PROTEIN S3
Ambystoma mexicanum
(Axolotl)
UC04P.G01 423 140 40S RIBOSOMAL PROTEIN S9 Podospora anserina
UC06P.C01 541 126 50S RIBOSOMAL PROTEIN L18 Bacillus stearothermophilus
UC10P.H05 611 116
ADENYLATE KINASE (ATP-AMP
TRANSPHOSPHORYLASE) (SUPEROXIDE-INDUCIBLE
PROTEIN 16) (SOI16) Bacillus subtilis
UC09P.H04 583 168 NIFS PROTEIN HOMOLOG Haemophilus influenzae
UC01P.D11 508 217 PUTATIVE ATP-DEPENDENT RNA HELICASE STE13
Schizosaccharomyces
pombe (Fission yeast)
UC05P.H01 377 120
SERINE/THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE 5 (PP5)
(PROTEIN PHOSPHATASE T) Rattus norvegicus (Rat)
UC03P.G11 415 129 SEVERIN
Dictyostelium discoideum
(Slime mold)
UC01P.B11 402 116
VACUOLAR ATP SYNTHASE SUBUNIT C (V-ATPASE C
SUBUNIT) (VACUOLAR PROTON PUMP C SUBUNIT)
Dictyostelium discoideum
(Slime mold)
UD08P.E10 667 194
3-HYDROXYISOBUTYRATE DEHYDROGENASE
PRECURSOR (HIBADH) Rattus norvegicus (Rat)
UD09P.B12 688 120
ATP-DEPENDENT CLP PROTEASE PROTEOLYTIC
SUBUNIT (ENDOPEPTIDASE CLP) Bacillus halodurans
UD06P.B05 579 101
BIFUNCTIONAL PURINE BIOSYNTHESIS PROTEIN
PURH Aquifex aeolicus
UD02P.G11 520 132
COATOMER BETA' SUBUNIT (BETA'-COAT PROTEIN)
(BETA'-COP) (P102) Homo sapiens (Human)
UD07P.F02 663 113
GLUTATHIONE S-TRANSFERASE THETA 1 (GST CLASS-
THETA) Mus musculus (Mouse)
UD09P.G04 580 100
GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE
(GAPDH) Candida albicans (Yeast)
UD04P.G08 687 215 HYPOTHETICAL 31.8 KD PROTEIN IN CHROMOSOME II Caenorhabditis elegans
UD01P.E07 495 110 NIFU-LIKE PROTEIN Rickettsia prowazekii
UD08P.H09 590 123
NUCLEAR TRANSPORT FACTOR 2 (NTF-2) (NUCLEAR
TRANSPORT FACTOR P10) Candida albicans (Yeast)
Anhang 121
UD09P.H10 541 137
PROBABLE LEUCYL-TRNA SYNTHETASE (LEUCINE--
TRNA LIGASE) (LEURS) Caenorhabditis elegans
UD10P.G06 610 161
PROTEASOME BETA CHAIN PRECURSOR (MACROPAIN
BETA CHAIN)
Xenopus laevis (African
clawed frog)
UD10P.C01 582 150
PROTEASOME SUBUNIT BETA TYPE 2 (PROTEASOME
COMPONENT C7-I) Mus musculus (Mouse)
UD06P.B08 622 125
SPLICEOSOME ASSOCIATED PROTEIN 62 (SAP 62)
(SPLICING FACTOR 3A Mus musculus (Mouse)
UD08P.B03 578 190 WD40-REPEAT CONTAINING PROTEIN CIAO 1 Homo sapiens (Human)
Contig / Klone
Länge
(Basen))
Score
(bits) Identifizierung Organismus
53 538 181
(S)-2-HYDROXY-ACID OXIDASE, PEROXISOMAL
(GLYCOLATE OXIDASE) (GOX)
Spinacia ol eracea
(Spinach)
60 571 172
2-CYS PEROXIREDOXIN BAS1 PRECURSOR (THIOL-
SPECIFIC ANTIOXIDANT)
Spinacia oleracea
(Spinach)
UD02P.C04 447 130
3-ISOPROPYLMALATE DEHYDROGENASE
PRECURSOR (BETA-IPM DEHYDROGENASE) Brassica napus (Rape)
UC09P.G08 585 267 40S RIBOSOMAL PROTEIN S11 Glycine max (Soybean)
UC02P.D02 417 200 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15A (PPCB8) Brassica napus (Rape)
130 810 263 40S RIBOSOMAL PROTEIN S16
Gossypium hirsutum
(Upland cotton)
122 637 275 40S RIBOSOMAL PROTEIN S18
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
29 415 166 40S RIBOSOMAL PROTEIN S19 Oryza sativa (Rice)
94 616 160 40S RIBOSOMAL PROTEIN S23 (S12)
Fragaria ananassa
(Strawberry)
152 654 118 40S RIBOSOMAL PROTEIN S26
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
116 575 258 40S RIBOSOMAL PROTEIN S3A (CYC07 PROTEIN)
Catharanthus roseus (Rosy
periwinkle)
UD07P.A05 457 201 40S RIBOSOMAL PROTEIN S5
Cicer arietinum (Chickpea)
(Garbanzo)
UD07P.D01 605 233 40S RIBOSOMAL PROTEIN S8 Oryza sativa (Rice)
UD04P.G11 658 188
50S RIBOSOMAL PROTEIN L15, CHLOROPLAST
PRECUR
Pisum sativum (Garden
pea)
UD09P.B10 575 213
50S RIBOSOMAL PROTEIN L24, CHLOROPLAST
PRECURSOR (CL24)
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
UD05P.B06 585 116
50S RIBOSOMAL PROTEIN L28, CHLOROPLAST
PRECURSOR (CL28)
Nicotiana tabacum
(Common tob acco)
62 938 381 60S ACIDIC RIBOSOMAL PROTEIN P0 Glycine max (Soybean)
183 676 326 60S RIBOSOMAL PROTEIN L10 (EQM)
Solanum melongena
(Eggplant) (Aubergine)
UC01P.H06 450 252 60S RIBOSOMAL PROTEIN L11 (L5) Medicago sativa (Alfalfa)
123 548 141 60S RIBOSOMAL PROTEIN L12 Prunus armeniaca (Apricot)
UC10P.B05 557 263 60S RIBOSOMAL PROTEIN L15-1
Picea mariana (Black
spruce)
UD09P.G06 597 320
60S RIBOSOMAL PROTEIN L2 (L8) (RIBOSOMAL
PROTEIN TL2)
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
Anhang 122
UD10P.E12 472 198
60S RIBOSOMAL PROTEIN L2 (L8) (RIBOSOMAL
PROTEIN TL2)
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
159 560 180 60S RIBOSOMAL PROTEIN L23A Fritillaria agrestis
UC09P.A03 632 148 60S RIBOSOMAL PROTEIN L26 Brassica rapa (Turnip)
11 587 141 60S RIBOSOMAL PROTEIN L27
Pisum sativum (Garden
pea)
110 493 205 60S RIBOSOMAL PROTEIN L27
Pisum sativum (Garden
pea)
14 584 294 60S RIBOSOMAL PROTEIN L3
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
186 643 192 60S RIBOSOMAL PROTEIN L34
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
77 600 155 60S RIBOSOMAL PROTEIN L37
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
160 646 183 60S RIBOSOMAL PROTEIN L37A
Pseudotsuga menziesii
(Douglas-fir)
162 638 117 60S RIBOSOMAL PROTEIN L38
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
17 325 173 60S RIBOSOMAL PROTEIN L44
Gossypium hirsutum
(Upland cotton)
107 553 253 60S RIBOSOMAL PROTEIN L5 Oryza sativa (Rice)
UD04P.F02 613 236 60S RIBOSOMAL PROTEIN L6 (YL16-LIKE)
Mesembryanthemum
crystallinum (Common ice
plant)
174 570 286 ACTIN 2/7
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
76 719 316
ALCOHOL DEHYDROGENASE CLASS III
(GLUTATHIONE-DEPENDENT FORMALDEHYDE
DEHYDROGENASE) Oryza sativa (Rice)
UD06P.B10 560 190 ARGININE DECARBOXYLASE (ARGDC) (ADC)
Brassica juncea (Leaf
mustard)
UC02P.E02 441 180
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE, CHLOROPLAST
PRECURSOR
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UC02P.E01 377 178 ATP SYNTHASE A CHAIN (PROTEIN 6) Marchantia polymorpha
UD06P.G02 542 156
ATP SYNTHASE GAMMA CHAIN 1, CHLOROPLAST
PRECURSOR
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
177 608 215 CALMODULIN
Helianthus annuus
(Common sunflower)
184 638 134
CARBONIC ANHYDRASE 2 (CARBONATE
DEHYDRATASE 2)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
119 669 327 CATALASE
Phaseolus aureus (Mung
bean)
UD10P.F12 607 133 CATIONIC PEROXIDASE 2 PRECURSOR Arachis hypogaea (Peanut)
UD09P.F01 599 257 CELL DIVISION CYCLE PROTEIN 48 HOMOLOG
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
15 443 123
CHALCONE SYNTHASE (NARINGENIN-CHALCONE
SYNTHASE) Hydrangea macrophylla
111 612 178
CHALCONE SYNTHASE (NARINGENIN-CHALCONE
SYNTHASE) Hydrangea macrophylla
70 715 129 CHAPERONIN 20 KD, CHLOROPLAST PRECURSOR
(PROTEIN CPN10)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
Anhang 123
(PROTEIN CPN10) (Mouse-ear cress)
UC06P.F02 510 122
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1 PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB-1)
Sinapis alba (White
mustard)
127 572 244
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 13 PRECURSOR
(LHCII TYPE III
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
UC05P.E02 520 164
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 4 PRECURSOR
(LHCI TYPE III CAB-4)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
88 609 261
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 4 PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB-4
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
35 601 162
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 4 PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB-4)
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
72 498 232
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 4 PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB-4)
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
178 628 310
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 4 PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB-4)
Lycopersicon esculentum
(Tomato)
188 661 294
CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN PRECURSOR
(LHCII TYPE I CAB)
Silene pratensis (White
campion)
UD06P.E05 612 320 CHLOROPLAST 30S RIBOSOMAL PROTEIN S4 Marchantia polymorpha
UC10P.G08 594 197 CHLOROPLAST 50S RIBOSOMAL PROTEIN L16 Marchantia polymorpha
UC10P.H11 543 249 CHLOROPLAST 50S RIBOSOMAL PROTEIN L2 Marchantia polymorpha
97 620 174 CINNAMYL-ALCOHOL DEHYDROGENASE 2 (CAD 2)
Picea abies (Norway
spruce)
57 485 206 CLATHRIN HEAVY CHAIN
Spinacia oleracea
(Spinach)
108 503 238 COP1 REGULATORY PROTEIN (FUSCA PROTEIN FUS1)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
173 1064 355 CYTOCHROME B6
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UC08P.F02 610 212
CYTOCHROME B6-F COMPLEX IRON-SULFUR SUBUNIT
2 PRECURSOR (RIESKE IRON-SULFUR PROTEIN)
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
UD03P.B08 474 124
DIHYDROFLAVONOL-4-REDUCTASE (DFR)
(DIHYDROKAEMPFEROL 4-REDUCTASE)
Antirrhinum majus (Garden
snapdragon)
93 584 168 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA CHAIN
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UC01P.E05 410 148 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA CHAIN Marchantia polymorpha
UD09P.H11 450 205 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA" CHAIN Marchantia polymorpha
196 1801 858 ELONGATION FACTOR 1-ALPHA (EF-1-ALPHA) Vicia faba (Broad bean)
UD07P.E10 259 118 ELONGATION FACTOR TU (EF-TU)
Cyanophora paradoxa
[Cyanelle]
74 611 129
ELONGATION FACTOR TU, CHLOROPLAST
PRECURSOR (EF-TU) Glycine max (Soybean)
UC09P.A08 576 170 ENDOCHITINASE CH25 PRECURSOR Brassica napus (Rape)
UC06P.D07 554 103 ETHYLENE- INDUCIBLE PROTEIN HEVER
Hevea brasiliensis (Para
rubber tree)
81 857 349
EUKARYOTIC INITIATION FACTOR 4A-11 (EIF-4A-11)
(EIF4A-11)
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
169 721 150 FERREDOXIN
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
175 574 180
FRUCTOSE-BISPHOSPHATE ALDOLASE,
CHLOROPLAST PRECURSOR (ALDP) Oryza sativa (Rice)
Anhang 124
UD06P.A02 583 114
GLUCAN ENDO-1,3-BETA-GLUCOSIDASE GIV ((1->3)-
BETA-GLUCAN Hordeum vulgare (Barley)
40 644 296 GLUTAMATE DEHYDROGENASE 2 (GDH 2)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
19 429 128
GLUTAMINE SYNTHETASE NODULE ISOZYME
(GLUTAMATE--AMMONIA LIGASE)
Vigna aconitifolia
(Mothbean)
UD09P.G01 616 110
GLUTATHIONE S-TRANSFERASE (GST CLASS-PHI) (25
KD AUXIN-BINDING
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
144 638 222
GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE
A, CHLOROPLAST PRECURSOR
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
129 627 121
GLYCINE CLEAVAGE SYSTEM H PROTEIN,
MITOCHONDRIAL PRECURSOR
Mesembryanthemum
crystallinum (Common ice
plant)
28 618 136 GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN Daucus carota (Carrot)
UD03P.B09 438 105 HEAT SHOCK PROTEIN (HSP 18.1) 18.1 KD CLASS I
Pisum sativum (Garden
pea)
UC10P.B10 486 302 HEAT SHOCK PROTEIN 83
Pharbitis nil (Viol et)
(Japanese morning glory)
98 621 148 HEVEIN-LIKE PROTEIN PRECURSOR
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD05P.A08 353 133
HYDROXYACYLGLUTATHIONE HYDROLASE,
MITOCHONDRIAL PRECURSOR
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD08P.H02 564 140
HYPOTHETICA L 11.1 KD PROTEIN IN NAD3-NAD7
INTERGENIC REGION Marchantia polymorpha
145 834 213
HYPOTHETICAL 19.6 KD PROTEIN IN RPS1-NAD4L
INTERGENIC REGION (ORF172)
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UD07P.F07 487 208 HYPOTHETICAL 259 KDA PROTEIN (ORF 2136) Marchantia polymorpha
37 820 296 INITIATION FACTOR 5A-2 (EIF-5A) (EIF-4D)
Nicotiana plumbaginifolia
(Leadwort-leaved tobacco)
146 587 229 L-ASCORBATE PEROXIDASE, CYTOSOLIC (AP)
Pisum sativum (Garden
pea)
132 667 226
MALATE DEHYDROGENASE, GLYOXYSOMAL
PRECURSOR
Citrullus lanatus
(Watermelon)
140 608 225
MALATE DEHYDROGENASE, MITOCHONDRIAL
PRECURSOR
Citrullus lanatus
(Watermelon)
69 716 106 MANNOSE-SPECIFIC LECTIN (AGGLUTININ)
Aloe arborescens (Kidachi
aloe)
UD04P.F07 527 169 MARPO MITOCHONDRIAL RIBOSOMAL PROTEIN S7 Marchantia polymorpha
79 908 153 MITOCHONDRIAL RIBOSOMAL PROTEIN S3
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UC07P.D10 176 120
NADH-PLASTOQUINONE OXIDOREDUCTASE CHAIN 1,
CHLOROPLAST Marchantia polymorpha
52 477 275
NADH-PLASTOQUINONE OXIDOREDUCTASE SUBUNIT
K
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
143 725 253
NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE 20 KDA
SUBUNIT PRECURSOR (COMPLEXI-20KD)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD01P.H10 429 115
NADP-DEPENDENT MALIC ENZYME, CHLOROPLAST
PRECURSOR (NADP-ME) Oryza sativa (Rice)
UC02P.D03 431 107
OUTER MITOCHONDRIAL MEMBRANE PROTEIN PORIN
36 KDA
Solanum tuberosum
(Potato)
Anhang 125
UD10P.H04 656 293 PHENYLALANINE AMMONIA -LYASE Pinus taeda (Loblolly pine)
136 1030 700
PHOTOSYSTEM I P700 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN
A2
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UD09P.B06 495 243
PHOTOSYSTEM I P700 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN
A2 Marchantia polymorpha
166 1299 250
PHOTOSYSTEM I REACTION CENTRE SUBUNIT III
PRECURSOR (PSI-F)
Spinacia oleracea
(Spinach)
36 595 119
PHOTOSYSTEM I REACTION CENTRE SUBUNIT N
PRECURSOR (PSI-N) Hordeum vulgare (Barley)
18 445 206
PHOTOSYSTEM II P680 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN
(CP-47 PROTEIN)
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
UC10P.C07 455 221
PHOTOSYSTEM II P680 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN
(CP-47 PROTEIN) Marchantia polymorpha
147 1177 470
PHOTOSYSTEM Q(B) PROTEIN (32 KD THYLAKOID
MEMBRANE PROTEIN)(PHOTOSYSTEM II PROTEIN D1)
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
22 400 114
PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN 1B
(TRANSMEMBRANE PROTEIN A)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UC07P.E03 600 191
PROBABLE 60 RIBOSOMAL PROTEIN L14
(HYDROXYPROLINE RICH GLYCOPROTEIN
Pisum sativum (Garden
pea)
170 635 385
PROBABLE CLPP-LIKE PROTEASE (ENDOPEPTIDASE
CLP) (ORF 203)
Marchantia polymorpha
(Liverwort)
67 702 153
PROBABLE COATOMER EPSILON SUBUNIT (EPSILON-
COAT PROTEIN)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UC09P.D03 631 257 PROBABLE CYTOCHROME C BIOSYNTHESIS PROTEIN Marchantia polymorpha
UD08P.A11 548 128
PROBABLE METHIONINE AMINOPEPTIDASE 1 (METAP
1) (PEPTIDASE M 1)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD02P.B02 455 205
PROTEASOME SUBUNIT ALPHA TYPE 2 (20S
PROTEASOME ALPHA SUBUNIT B) Oryza sativa (Rice)
126 634 207
PROTEIN TRANSLATION FACTOR SUI1 HOMOLOG
(GOS2 PROTEIN) Oryza sativa (Rice)
UD08P.F05 548 215
PROTOCHLOROPHYLLIDE REDUCTASE,
CHLOROPLAST PRECURSOR (PCR) Marchantia paleacea
133 623 152
PUTATIVE LACTOYLGLUTATHIONE LYASE
(METHYLGLYOXALASE)
Brassica oleracea
(Cauliflower)
UC07P.B05 556 134
PUTATIVE RECEPTOR PROTEIN KINASE ZMPK1
PRECURSOR Zea mays (Maize)
UD04P.D04 620 258 RAS-RELATED PROTEIN RAB11B
Nicotiana tabacum
(Common tobacco)
151 597 198
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
168 943 305
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
171 698 202
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
172 664 194
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
181 660 306
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
190 676 299
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
Anhang 126
197 698 173
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
198 697 178
RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL
CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea
87 564 145
RIBULOSE BISPHOSPHATE
CARBOXYLASE/OXYGENASE ACTIVASE,
CHLOROPLAST Malus domestica (Apple)
113 1343 326
S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE
PROENZYME (ADOMETDC) (SAMDC)
Pharbitis nil (Violet)
(Japanese morning glory)
135 930 488
SERINE HYDROXYMETHYLTRANSFERASE,
MITOCHONDRIAL PRECURSOR (SERINE
Solanum tuberosum
(Potato)
UC09P.B09 633 234
SERINE HYDROXYMETHYLTRANSFERASE,
MITOCHONDRIAL PRECURSOR (SERINE METHYLASE)
Solanum tuberosum
(Potato)
UC07P.A08 634 138 SUCCINYL-COA LIGASE [GDP-FORMING] ALPHA -CHAIN
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD06P.B03 650 229
THIAZOLE BIOSYNTHETIC ENZYME, CHLOROPLAST
PRECURSOR
Citrus sinensis (Sweet
orange)
103 626 142 THIOREDOXIN H-TYPE (TRX-H)
Picea mariana (Black
spruce)
47 550 133
TONOPLAST INTRINSIC PROTEIN, GAMMA (GAMMA
TIP) (AQUAPORIN-TIP)
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
55 821 195
TRANS-CINNAMATE 4-MONOOXYGENASE (CINNAMIC
ACID 4-HYDROXYLASE) Zinnia elegans
75 554 197
TRANSLATIONALLY CONTROLLED TUMOR PROTEIN
HOMOLOG (TCTP)
Hevea brasiliensis (Para
rubber tree)
UC04P.C02 462 192 TUBULIN ALPHA -2/ALPHA-4 CHAIN
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
UD03P.E05 484 113
UBIQUINOL-CYTOCHROME C REDUCTASE COMPLEX
7.8 KDA PROTEIN
Solanum tuberosum
(Potato)
131 777 150 UBIQUITIN Glycine max (Soybean)
UC04P.E03 481 174
VACUOLAR ATP SYNTHASE 16 KD PROTEOLIPID
SUBUNIT Oryza sativa (Rice)
Contig / clone
length
(bases)
Score
(bits) putative identification organsim
53 538 181
(S)-2-HYDROXY-ACID OXIDASE, PEROXISOMAL
(GLYCOLATE OXIDASE) (GOX)
Spinacia oleracea
(Spinach)
60 571 172
2-CYS PEROXIREDOXIN BAS1 PRECURSOR (THIOL-
SPECIFIC ANTIOXIDANT)
Spinacia oleracea
(Spinach)
UD02P.C04 447 130
3-ISOPROPYLMALATE DEHYDROGENASE
PRECURSOR (BETA-IPM DEHYDROGENASE) Brassica napus (Rape)
UC09P.G08 585 267 40S RIBOSOMAL PROTEIN S11 Glycine max (Soybean)
UC02P.D02 417 200 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15A (PPCB8) Brassica napus (Rape)
130 810 263 40S RIBOSOMAL PROTEIN S16
Gossypium hirsutum
(Upland cotton)
122 637 275 40S RIBOSOMAL PROTEIN S18
Arabidopsis thaliana
(Mouse-ear cress)
29 415 166 40S RIBOSOMAL PROTEIN S19 Oryza sativa (Rice)
94 616 160 40S RIBOSOMAL PROTEIN S23 (S12)
Fragaria ananassa
(Strawberry)
127
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, mich in den letzten drei Jahren unterstützt und damit wesentlich zu dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein ganz großer Dank gilt Frau Prof. Dr. F. Koenig: ohne unsere Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe wäre das Projekt zu dieser Arbeit niemals zustande gekommen und ich hätte mich für ein anderes Thema entscheiden müssen. Als sich dann die „Elternlosigkeit“ anbahnte, hat sie sofort und ohne großes Zögern die „Patenschaft“ übernommen. Dafür, für die stetige Unterstützung und die anregenden Diskussionen möchte ich mich bedanken.
Großer Dank gilt auch Dr. Stefan Jansson und seiner Arbeitsgruppe. Die insgesamt vier Monate, die ich am Institut für Pflanzenphysiologie der Universität Ume å (Schweden) verbringen durfte, haben wissenschaftlich wesentlich zu dem beigetragen, was aus dieser Arbeit geworden ist. Es war eine sehr schöne Zeit, die ich niemals vergessen werde. Kirsten, Jenny, Ulrika, Johanna und Karsten sei in diesem Zuge für die herzliche Aufnahme im Labor gedankt.
PD Dr. Christian Schäfer danke ich für die Vergabe des Themas zu dieser Arbeit und die anfängliche Hilfsbereitschaft.
Dr. Thomas Hiltonen (Universität Ume å, Schweden) danke ich für die Einweisung in die EST-Sequenzierung und die Bioinfomatik sowie für die Durchführung eines Teils davon.
Dr. Thomas Hurek (Arbeitsgruppe Fr. Prof. Dr. B. Reinhold-Hurek,Universität Bremen) danke ich für die Einweisung in die Sequenzierung am ALF.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) danke ich für die Finanzierung der Arbeit. Der FNK (Universität Bremen) sei für das dreimonatige Abschlußstipendium gedankt. Ganz herzlichen Dank an Annette Hintelmann, Guido Lützenkirchen, Dorothea Mangels, Petra Jöstingmeyer, Tall Pressler und unserem „Ehrenmitglied“ Frank Klimmek: ohne Euch wären mir die „Cyanos“ immer noch suspekt. Danke für die Zusammenarbeit und die uneigennützige Unterstützung, nicht nur in wissenschaftlichen Dingen.
Annette Hintelmann und Dorothea Mangels danke ich für das Korrekturlesen der Arbeit und für die seelische Unterstützung gerade in der letzten Phase.
Meinem Mann Horst Heitmann danke ich für Liebe und Unterstützung während der letzten drei Jahre.