Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorstand: Prof. Dr. F. Paulsen
Die Beteiligung von mTOR an der Regulation des
Haarzyklus und Einfluss von Bimatoprost auf die
mTOR Aktivierung
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Antonia Judit Kellenberger
aus
Sathmar (Satu-Mare)
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Vorsitzender: Prof. Dr. Dr. med. h.c. W. A. Kalender Referent: Prof. Dr. med. E. Lütjen-Drecoll Korreferent: Prof. Dr. med. M. Eichhorn Tag der mündlichen Prüfung: 14. Januar 2011
Meinen Kindern
Patrick und Robert Kellenberger
gewidmet
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Die Beteiligung von m-TOR an der Regulation des Haarzyklus und der
Einfluss von Bimatoprost auf die m-TOR Aktivierung
1. Zusammenfassung und Abstract ............................................................. 1
1.1. Zusammenfassung ........................................................................... 1
1.2. Abstract ............................................................................................. 2
2. Einleitung ................................................................................................. 4
2.1. Haare und Haarwachstum bei der Maus........................................... 4
2.1.1. Morphogenese des Haarfollikels ................................................... 4
2.1.2. Der murine Haarzyklus .................................................................. 6
2.1.2.1. Die Katagenphase………………………………………………...6
2.1.2.2. Die Telogenphase…………………………………………….......7
2.1.2.3. Die Anagenphase………………………………………………....7
2.1.3. Synchronisiertes und nicht synchronisiertes Wachstum ................ 9
2.2. mTOR ............................................................................................. 10
2.2.1. mTOR und Rapamycin– Name und Geschichte .......................... 10
2.2.2. Biochemie und Funktion von mTOR ............................................ 11
2.2.3. Rezeptoren und intrazelluläre Signalwege .................................. 12
2.2.4. Vorkommen von mTOR im Haarfollikel ....................................... 14
2.3. Prostaglandin F2α-Analoga .............................................................. 15
2.3.1. Definition, Struktur und Biosynthese der Prostaglandine ............. 15
2.3.2. Rezeptoren und intrazelluläre Signaltransduktion ....................... 17
2.3.3. Abbau der Prostaglandine ........................................................... 17
2.3.4. Prostamide/Bimatoprost .............................................................. 18
2.3.5. Wirkungen und medizinische Verwendung der Prostaglandine ... 18
2.3.6. Prostaglandine und Haarwachstum ............................................. 20
2.3.7. Aktivierung von mTOR durch Prostaglandine .............................. 20
2.4. Hypothese ....................................................................................... 21
Inhaltsverzeichnis
3. Material und Methoden .......................................................................... 22
3.1. Tiere und Tierhaltung ...................................................................... 22
3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der haarzyklus-abhängigen
mTOR Aktivierung .................................................................................... 22
3.2.1. Probengewinnung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Toluidin-blau-
Färbung zur Haarphasenbestimmung ................................................... 22
3.2.2. Lokalisation von p-mTOR durch immunhistochemische
Markierung. ........................................................................................... 24
3.2.3. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivierung mittels Kinase-
Aktivitätsassay ....................................................................................... 25
3.2.3.1. Probengewinnung mit Abtrennung der Epidermis von der
Dermis und Subkutis……………………………………………………………...25
3.2.3.2. Kinase Aktivitätsassay…………………………………………..27
3.3. Hemmung der haarzyklusabhängigen mTOR Aktivierung durch
Rapamycin ................................................................................................ 28
3.3.1. Rapamycin ................................................................................... 28
3.3.2. Rasur ........................................................................................... 29
3.3.3. Bestimmung der Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus ... 29
3.4. Bestimmung der Wirkung von Bimatoprost auf die mTOR
Aktivierung. ............................................................................................... 31
3.4.1. Bimatoprost ................................................................................. 31
3.4.2. Effekt von Bimatoprostbehandlung auf die mTOR Aktivierung .... 31
3.5. Einfluss von Rapamycin auf die durch Bimatoprost vermittelte
Initiation der Anagenphase.. ..................................................................... 33
3.6. Statistische Analye ......................................................................... 35
4. Ergebnisse ............................................................................................ 36
4.1. Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse .......................................... 36
4.2. Analyse der mTOR Aktivierung im Haarzyklus ............................... 38
4.2.1. Lokalisation von p-mTOR in den Wachstumsphasen .................. 38
4.2.2. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität in verschiedenen
Phasen des Haarzyklus ......................................................................... 45
4.3. Einfluss von Rapamycin auf den Haarzyklus .................................. 46
Inhaltsverzeichnis
4.4. Der Einfluss von Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung ................ 54
4.4.1. Verteilung von p-mTOR in verschiedenen Wachstumsphasen nach
Bimatoprostbehandlung ........................................................................ 54
4.4.2. Einfluss von Rapamycin auf die Initiation des Anagens durch
Bimatoprost ........................................................................................... 58
4.5. Der Einfluss von Rapamycin auf die p-mTOR-Expression .............. 63
5. Diskussion ............................................................................................. 66
6. Literaturverzeichnis ............................................................................... 71
7. Abkürzungsverzeichnis.......................................................................... 79
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen .................................................. 83
9. Danksagung .......................................................................................... 85
10. Lebenslauf ......................................................................................... 87
1
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung und Abstract
1.1. Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: Hypertrichosis wird infolge verschiedener
Krankheiten oder als Nebenwirkung bestimmter Medikamente beobachtet.
Da es überwiegend in der Gesichtsregion auftritt, kann für den Betroffenen
psychisch belastend sein und zum Therapieabbruch führen. Bimatoprost wird
in der Glaukomtherapie zur Senkung des Augeninnendruckes verwendet. Zu
den Nebenwirkungen solch einer Therapie zählt vermehrtes Haar- und
Wimpernwachstum, deren Ursache und Wirkmechanismus weitgehend
unbekannt sind. Die Kinase mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) spielt
eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellproliferation und Wachstum.
Seine aktivierte Form (p-mTOR) wird in der „bulge region“ des Haarfollikels
exprimiert. Es stellt sich die Frage, ob mTOR an dem durch Bimatoprost
induzierten Haarwachstum beteiligt ist. Ziel dieser Studie war zunächst die p-
mTOR Expression im Haarfollikel während des Haarzyklus zu bestimmen
und anschließend zu untersuchen, ob die unter Bimatoprost-behandlung
beobachtete Hypertrichose über eine Aktivierung von mTOR vermittelt wird.
Methoden: Alle Untersuchungen wurden an der Rückenhaut von weiblichen
C57Bl/6 Mäusen durchgeführt. Nach histologischer Bestimmung des
Haarzyklus wurde die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln
immunhistochemisch in jeder Haarphase analysiert. Die Messung der mTOR
Kinaseaktivität in Hautpräparaten erfolgte mit dem Kinase-Aktivitätsassay
über einen kompletten Haarzyklus. Der Einfluss von lokal über die Haut
appliziertes Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung wurde
immunhistochemisch durch Bestimmung der p-mTOR Expression in
Haarfollikeln in verschiedenen Wachstumsphasen analysiert. Zusätzlich
wurde der Einfluss des spezifischen mTOR Inhibitors Rapamycin auf das
spontane Haarwachstum und auf die durch Bimatoprost induzierte Anagen
Initiation makroskopisch und histologisch untersucht.
2
Zusammenfassung
Ergebnisse und Beobachtungen: Aktiviertes mTOR war während des
gesamten Haarzyklus in den Haarfollikeln nachweisbar. Die Verteilung von p-
mTOR war haarphasenspezifisch. Im Telogen war die p-mTOR Expression
auf die „bulge region“ beschränkt und die Kinaseaktivität war niedrig. Im
Anagen exprimierten, zusätzlich zur „bulge region“, zunächst die äußere,
dann die innere epitheliale Wurzelscheide p-mTOR. Gleichzeitig nahm die
Kinaseaktivität zu. Im Katagen wurde p-mTOR zunächst nur in der äußeren
epithelialen Wurzelscheide unterhalb der „bulge region“, in späteren Stadien
zunehmend in der „bulge region“ nachgewiesen. Die Kinaseaktivität sank mit
Fortschreiten des Katagens. Rapamycin führte zur Verzögerung des
Eintrittes der Haarfollikel ins Anagen. Bimatoprost zeigte keine sichtbare
Wirkung auf die mTOR Aktivierung. Dennoch wurde durch Rapamycin
sowohl die spontane, als auch die durch Bimatoprost induzierte Anagen
Initiation gehemmt.
Praktische Schlussfolgerungen: Die vorgelegte Arbeit liefert erste
Erkenntnisse über die Beteiligung von mTOR im Haarzyklus und trägt zu
einem besseren Verständnis der Regulation des Haarwachstums bei.
1.2. Abstract
Background and Goal of the study: Hypertrichosis can be associated with
various diseases or drug treatments. Since in most cases the face region is
affected, psychological strain can occur and cause a termination of the
therapy. Bimatoprost is an antiglaucoma drug that reduces intraocular
pressure. One of its side effects is hypertrichosis of hairs and eyelashes. The
causes and mechanisms of controling growth are largely obscure. The
intracellular kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) is a central
regulator of cell proliferation and growth. Its activated form (p-mTOR) is
expressed in the “bulge region” of the hair follicle. From this background the
question arose, if mTOR is involved in the bimatoprost induced stimulation of
3
Zusammenfassung
hair growth. The intention of this work was to investigate in a first step the p-
mTOR expression in the hair follicle during the hair cycle. In a second step
we addressed the question; if the bimatoprost-induced hypertrichosis is
associated with an activation of mTOR.
Methods: The back skin of female C57BL/6 mice was used in all
experiments. First the time course of the hair cycle was histologically
determined. Subsequently hair follicles in all growth phases were stained
immunhistochemically using an antibody against p-mTOR and the
localization of p-mTOR was investigated. The relative kinase activity of p-
mTOR was measured with a kinase activity assay from protein extracts of
skin samples in each growth phases of the hair follicle. For the study of the
effect of bimatoprost on mTOR activation, bimatoprost was applied on back
skin and p-mTOR expression was determined by immunhistochemical
staining in all growth phases of the hair cycle. Additionally, the effect of
mTOR signaling inhibition on spontaneously hair growth and bimatoprost-
induced anagen initiation was investigated.
Results and observations: Activated mTOR was found in every growth
phase of hair follicles. The expression of p-mTOR was hair phase specific. In
telogen, expression was found in the “bulge region” and the kinase activity
was low. In anagen, in addition to the “bulge region”, p-mTOR was also
expressed first in the outer, later in the inner root sheath. The kinase activity
was significantly higher than that of telogen. At the beginning of catagen, p-
mTOR expression was observed in the outer root sheath proximal to the
“bulge region”, but the “bulge region” was negative. At the end of catagen, p-
mTOR+ cells appeared in the “bulge region” again. The kinase activity was
lower than during anagen. Bimatoprost did not show any effect on mTOR
activation. However, treatment of rapamycin induced delay of both
spontaneous and bimatoprost-induced hair cycle initiation.
Conclusions: This study is the first to show the involvement of mTOR
signaling in normal hair cycle regulation and will contribute to our
understanding in molecular control mechanisms of hair growth.
4
Einleitung
2. Einleitung
2.1. Haare und Haarwachstum bei der Maus
Der Haarfollikel ist ein hochsensitives Organ, dessen zyklische
Veränderungen aus einer Wachstumsphase (Anagen), einer durch Apoptose
herbeigeführten Rückbildungsphase (Katagen) und einer Ruhephase
(Telogen) bestehen(22, 101).
Haaraufbau und –zyklus sind, abgesehen von der Länge der einzelnen
Phasen, bei Mensch(44) und Maus(10, 11, 44, 58, 60, 71, 74, 75, 101, 102) ähnlich. Der
Zyklus des Fellhaares auf dem Rücken von C57BL/6 Mäusen ist mit einer
Dauer von 3-4 Wochen deutlich kürzer als der des menschlichen Kopfhaares
mit einer Dauer von 2-6 Jahren. In tierexperimentellen Studien zur
Untersuchung der Biologie des Haarfollikels werden dorsale Hauthaare von
C57BL/6 Mäusen am häufigsten verwendet. Somit repräsentieren diese das
bisher in der Haarforschung am besten charakterisierte Tiermodell(10, 58, 76, 94).
2.1.1. Morphogenese des Haarfollikels
Bereits in utero, kurz nachdem mesenchymale Zellen die Haut besiedeln, um
die Dermis auszubilden, beginnt die Morphogenese der Haarfollikel(3, 76, 91).
Dabei führt ein Prozess fein aufeinander abgestimmter Zellproliferationen
und Apoptosen zur Ausbildung der typischen Architektur des Haarfollikels(54).
Spezialisierte dermale Fibroblasten – die Zellen der späteren dermalen
Papille - gruppieren sich unter der Epidermis, stimulieren die über ihnen
liegenden epithelialen Zellen in die Tiefe zu wachsen und beginnen einen
Haarfollikel zu bilden(114) (Stadien 0–3)(76). Dieser verlängert sich in der
Dermis und fängt an die ersten charakteristischen Strukturen einer
heranreifendes Haarfollikels auszubilden. Die dermale Papille wird
zunehmend von den Zellen, die die zukünftige äußere epitheliale
Wurzelscheide (ORS) und die Haarmatrix bilden, umgeben und es entsteht
5
Einleitung
die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS). Die „bulge region“ (Wulstregion) -
die Stammzellnische – und die ersten Talgdrüsenzellen differenzieren sich
aus. Bei pigmentierten Stämmen setzt die Melaninbildung über dem distalen
Teil der dermalen Papille ein (Stadien 4-5)(76). Der Haarfollikel wächst weiter
nach unten in die Subkutis. Der Haarschaft (HS) und die Talgdrüse werden
ausgebildet. Der Haarkanal wird lichtmikroskopisch sichtbar (Stadien 6-7)(76).
Ab dem Stadium 5 finden apoptotische Prozesse statt(54), um eine
Überproliferation zu vermeiden und die Feinstruktur des Haarfollikels zu
gewährleisten. Die Morphogenese geschieht asynchron, deswegen zeigen
morphologische Untersuchungen der Haut neonataler Mäuse
unterschiedliche Entwicklungsstadien der Haarfollikel(76). Bis Tag 8 post
partum (d8 p.p.) erreichen alle Haare das Stadium eines reifen Follikels(76),
der durch die maximale Länge charakterisiert ist. Der Haarfollikel reicht bis
zum M. panniculus carnosus und der HS durchbricht die Epidermis (Stadium
8)(76) (Abb. 1). In diesem Stadium wird die Haut dicker und färbt sich bei
pigmentierten Mausstämmen dunkelgrau bis schwarz.
Abb. 1: Schematische Abbildung eines reifen murinen Haarfollikels im
Stadium 8 der Morphogenese.
6
Einleitung
2.1.2. Der murine Haarzyklus
2.1.2.1. Die Katagenphase
Auf die Haarfollikelmorphogenese folgt die Katagenphase (Katagen I –
VIII)(58), womit der reife Haarfollikel in seinen lebenslangen Zyklus eintritt. In
der Literatur ist nicht klar definiert, wann der erste wahre Haarzyklus beginnt.
Einige Wissenschaftler definieren den Anfang ab dem ersten Katagen nach
Stadium 8 der Morphogenese(76), beziehungsweise ab dem ersten Telogen
oder Anagen(10, 100). Auch die Meinung ist vertreten, dass der Zyklus mit der
Morphogenese beginnt, jede Trennung wäre artifiziell(100).
Auch für den Übertritt der Haarfollikel in die Regressionsphase gibt es
mehrere Theorien. Nach Cotsarelis wird sie durch die terminale
Ausdiffenzierung und den daraus resultierenden Proliferationsstopp der
Keratinozyten der Haarmatrix eingeleitet(18). Sobald der Vorrat an
Matrixzellen verbraucht wird, kommt das Haarwachstum zum Stillstand. Nach
Stenn und Paus erfolgt dieser Übertritt durch Ansammlung
wachstumsinhibierender parakriner und proapoptotischer Faktoren oder
durch Änderung in der Aktivität der Mastzellen und Makrophagen(100). Auch
eine Kombination all dieser Ursachen ist möglich(99). Die Melanozyten
beenden die Produktion von Melaningranula(58, 95) und der Haarbulbus
verengt sich durch Apoptosen in der ORS(49). Proximal bildet die ORS eine
Keimkapsel („germ capsule“) um das Haar, die nach außen in Richtung des
Epithels vorgeschoben wird (Kolbenhaar)(58) (Katagen I-VI). Zwischen der
Keimkapsel und der dermalen Papille befindet sich zunächst als Rest vom
unteren Teil des Follikels ein epithelialer Strang, der sich anfangs verlängert,
später aber komplett zurückbildet(58). Innerhalb weniger Tage erfolgt eine
massive Organinvolution, an deren Ende sich der Haarfollikel so weit
verkürzt, bis die dermale Papille die sogenannten „bulge region“ erreicht(58)
(Katagen VII-VIII). An dieser Stelle befinden sich die Stammzellen(18). Bei
pigmentierten Mausstämmen entfärbt sich während der 3-4 Tage
andauernden Regressionsphase die Haut von schwarz (Anagen) bis hellrosa
7
Einleitung
(Telogen) und wird deutlich dünner(58). Der Zeitpunkt, an dem das erste
Katagen anfängt, ist vom Mäusestamm abhängig und variiert signifikant
zwischen verschiedenen Hautregionen(3, 102). Die Entfärbung fängt am Kopf
an und schreitet wellenförmig nach kaudal und lateral voran(3, 58, 102). In der
von der Mittellinie genommenen dorsalen Rückenhaut von C57BL/6 Mäusen
befinden sich die Haarfollikel im Nackenbereich etwa ab d17 p.p.(102), im
Schwanzbereich erst ab d19-20 im Katagen(10, 11, 58, 101).
2.1.2.2. Die Telogenphase
Wenn der epitheliale Strang komplett abgebaut ist und die dermale Papille
das Kolbenhaar erreicht, gelangen die Haarfollikel in die Telogenphase(58). In
dieser Phase ruhen die Follikel, es findet keine Haarproduktion statt und
Größe und Morphologie des Follikels verändern sich nicht(58). Bei Mäusen ist
diese erste Telogenphase kurz(102) und dauert nur 1 oder 2 Tage(3). Die
Angaben in der Literatur zum Auftreten des ersten Telogens sind
uneinheitlich und variieren von d19-21(3) bis d25 p.p.(102). In diesem Stadium
ist die Haut der Mäuse hellrosa(58).
2.1.2.3. Die Anagenphase
Derzeit sind die genauen Mechanismen, die zur Induktion des Anagens
führen, noch nicht vollständig bekannt. Eine Hypothese nimmt die Aktivierung
von ruhenden Stammzellen in der „bulge region“ des Telogenfollikels an(18).
Aber auch die dermale Papille hat eine wichtige Rolle in der Regulation des
Haarzyklus(123) und könnte am Übergang von der Telogen- in die
Anagenphase beteiligt sein. Schließlich wurde in der murinen Epidermis ein
Inhibitor des Haarwachstums identifiziert, der nur in der Telogen-, nicht aber
in der Anagenphase nachweisbar ist(77).
8
Einleitung
Im Gegensatz zur spontanen Katagenentwicklung, fängt die spontane
Anagenphase kaudal im Beckenbereich an und schreitet wellenförmig nach
kranial voran(58). Durch massive Proliferation der Keratinozyten, erlangt der
Haarfollikel erneut seine maximale Größe (Anagen I-VI)(58). Die Länge der
Haare wird von der Dauer der Anagenphase bestimmt, während die
Haardicke von der Dicke des Haarbulbus in der Wachstumsphase
derterminiert wird(99). Durch fortschreitende Proliferation und Differenzierung
des Epithels erreicht der Haarfollikel zunächst die Dermis-Subkutis-Grenze
(Anagen I-II). Der Bereich der ORS, der an die dermale Papille angrenzt, ist
der „secondary germ“(73). Hier befinden sich ebenfalls Stammzellen, die eine
wichtige Rolle in der Ausbildung des proximalen, cyclischen Teiles der
Haarfollikel spielen(73). Im weiteren Verlauf wird der Anagenbulbus mit der
Haarmatrix gebildet, die die induktive mesenchymale Zellgruppe, die dermale
Papille (DP), umwächst(58). Dadurch wird sie permanenter Teil der
Follikelbasis. In Anagen III-IV bildet die Haarmatrix, die aus sogenannten
„transit-amplifying“ Zellen besteht, die sechs Schichten des Haarschaftes
(HS) und der umliegenden inneren epithelialen Wurzelscheide (IRS), die von
der äußeren epithelialen Wurzelscheide (ORS) umgeben wird(58). IRS und
HS gliedern sich von außen nach innen in folgende Schichten: Henley
Schicht, Huxley Schicht, Scheidenkutikula, Haarkutikula, Haarrinde und
Haarmark (Abb. 2). Die IRS und der HS wachsen nach distal, bis im Anagen
IV die Spitze des HS den Haarkanal erreicht. In späten Anagenstadien
wächst die IRS bis zur Einmündung der Talgdrüse in das Infundibulum und
der HS verlängert sich bis er schließlich durch die Epidermis tritt (Anagen V-
VI).
9
Einleitung
Abb. 2: Schematische Zeichnung einer Haarfollikel im Bereich des Bulbus
(modifiziert nach Rohen)(83).
2.1.3. Synchronisiertes und nicht synchronisiertes Wachstum
Nach der Anagenphase schließt sich etwa ab d42 p.p. die zweite
Katagenphase an. Nach wenigen Tagen, etwa ab d49 p.p., gelangen die
Haarfollikel wieder ins Telogenstadium, welches ca. 3-4 Wochen anhält(58)
(Abb. 3). Bis zu diesem Zeitpunkt verläuft das Haarwachstum völlig
synchron, d.h. alle Haarfollikel eines Tieres durchlaufen die einzelnen
Stadien gleichzeitig(99). In den danach folgenden Haarzyklen geht die
synchrone Kopplung der Haarzyklen für das gesamte Tier verloren und bleibt
nur für einzelne zusammenhängende Hautareale erhalten. Mit
zunehmendem Alter der Tiere nimmt die Frequenz des wellenförmig
fortschreitenden Follikelwachstums ab und führt dazu, dass die Hautflächen,
auf denen der Haarzyklus synchronisiert verläuft mit dem Alter der Tiere
kleiner werden(99).
10
Einleitung
Abb. 3: Zeitskala für den Haarzyklus weiblicher C57BL/6 Mäusen während
der ersten 14 Wochen nach Geburt (modifiziert nach Müller-Röver)(58).
2.2. mTOR
2.2.1. mTOR und Rapamycin – Name und Geschichte
TOR (Target Of Rapamycin) wurde erstmals in Hefen 1991 identifiziert(35).
Seitdem wurden aber die Orthologe in vielen Pflanzen- und Tierspezies, wie
z.B. bei Arabidopsis thaliana(56), C. elegans(50), Drosophila melanogaster(69,
124) und auch bei Säuger(6, 16, 84, 85) nachgewiesen. mTOR(85) (mammalian
TOR) ist auch unter dem Namen FRAP (=FKBP12 rapamycin associated
protein)(6), RAFT (rapamycin and FKBP12 target)(84), SEP (Sirolimus effector
protein)(15) und RAPT (rapamycin target)(16) bekannt.
Rapamycin (=Sirolimus) ist eine Substanz mit Makrolidstruktur, welches aus
dem Bakterienstamm Streptomyces hygroscopicus isoliert wird(7). Es hat
immunsuppressive, antimikrobielle, das Tumorwachstum hemmende und
fungizide Eigenschaften(7). Da diese Bakterien auf den Osterinseln
einheimisch sind, die in der Sprache der Landesbewohner „Rapa Nui“
heißen, wurde der aus ihnen gewonnene Stoff Rapamycin genannt(80).
Rapamycin ist ein hochspezifischer Inhibitor der mTOR-Funktion(28, 32, 80, 90).
11
Einleitung
2.2.2. Biochemie und Funktion von mTOR
Eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellproliferation und Wachstum
spielt das intrazelluläre Signalmolekül mTOR (mammalian Target Of
Rapamycin), das als ein Sensor für ATP und Aminosäuren wirkt(28, 108). In
frühen Mäuseembryonen und embryonalen Stammzellen wurde
nachgewiesen, dass mTOR sowohl die Zellgröße als auch die
Zellproliferation kontrolliert(59). Abhängig von der Qualität und Quantität der
Nährstoffe koordiniert diese Proteinkinase das Gleichgewicht zwischen
Proteinsynthese und –degradierung durch Integration unterschiedlicher
Signalwege(80).
mTOR ist Bestandteil von zwei Proteinkomplexen. Der eine Komplex ist
mTORC1 (mTOR complex 1), der neben mTOR und einem weiteren Protein
aus Raptor (regulatory associated protein of mTOR) besteht und durch
Rapamycin gehemmt wird(121). In diesem Komplex regulieren TOR-Proteine
(i) die Initiation- und Elongationphasen der Translation, (ii) die Ribosomen-
Biosynthese, (iii) den Import von Aminosäuren, (iv) die Transkription
zahlreicher Enzyme und (v) die Autophagie(80, 121). Der zweite Komplex ist
mTORC2 (mTOR complex 2), der von mTOR, Rictor (rapamycin-insensitive
companion of mTOR) und weiteren Proteinen gebildet wird und nicht durch
Rapamycin gehemmt werden kann(39). Über diesem Komplex kann mTOR
die Aktinorganisation regulieren(39, 121). Während mTORC1 in den zeitlichen
Ablauf der Proliferation eingreift, spielt mTORC2 eine Rolle in der räumlichen
Organisation der Proliferation(121).
mTOR ist eine Serin/Threonin-Kinase mit einem Molekulargewicht von 289
kDa(90, 121) und gehört zu der Familie der, in der Evolution hochkonservierten
Phosphatidylinositol-Kinase-verwandten Kinasen (PIKK)(80, 121). Mensch,
Maus und Ratte zeigen eine >95% Übereinstimmung der mTOR-Proteine auf
Aminosäureebene(80). (Abb. 4).
12
Einleitung
Abb. 4: Schematische Darstellung des mTOR Moleküls (modifiziert nach
Schmelzle)(90). Die Inaktivierung von mTOR erfolgt durch die Bindung des
FKBP12-Rapamycin-Komplexes an die FRB-Domäne. Die HEAT-Gruppen(78,
90, 121) und die FAT-Domäne(5), benannt nach Vertreter der Hauptgruppen, die
diese Domänen enthalten, vermitteln wahrscheinlich Protein-Protein-
Interaktionen. Zusätzlich soll die FAT-Domäne auch als Gerüst dienen(90).
Die FATC-Domäne spielt wahrscheinlich eine Rolle für die katalytische
Aktivität von mTOR(5, 43).
Der intrazelluläre Rapamycinrezeptor ist in allen eukaryotischen Zellen das
kleine ubiquitär vorkommende Protein FKBP12 (FK506-binding protein 12
kDa). Durch Bindung des Rapamycin-FKBP12-Komplexes an mTOR, wird
dieser inaktiviert(80, 90). Die FRB-Domäne (FKBP12-Rapamycin-Bindungs-
Domäne) des Moleküls interagiert mit dem FKBP12-Rapamycin-Komplex,
dessen Bindung zur Hemmung der Funktion von mTOR führt.
2.2.3. Rezeptoren und intrazelluläre Signalwege
Einer der Hauptsignalwege, der durch Wachstumsfaktoren aktiviert wird,
involviert den Insulinrezeptor, Insulinrezeptor Substrate und PI3K
(Phosphoinositid 3-Kinase)(28, 121) (Abb. 5).
13
Einleitung
Abb. 5: Model des mTOR Signalweges in Säugerzellen (modifiziert nach
Wullschleger)(121).
PI3K aktiviert Proteinkinase B (PKB oder Akt), die mTOR phosphorylieren
kann. Die Aktivierung von mTOR wird durch TSC1 (tuberous sclerosis
complex 1, bekannt auch als Hamartin) und TSC2 (tuberous sclerosis
complex 2 oder Tuberin) inhibiert(45, 55, 106, 121). Der inhibierende Effekt von
TSC2 kann entweder Akt-abhängig oder durch die Aktivierung von
Proteinkinase C (PKC) und des Raf-MEK-Erk-Signalweges aufgehoben
werden(104).
Energie- und Nährstoffmangel führt zum Abfall der Konzentrationen von ATP
und Aminosäuren in der Zelle und über verschiedene Signalmoleküle zur
Hemmung von mTOR(28, 64, 121). Stress führt ebenfalls zur Hemmung von
mTOR(121).
14
Einleitung
Die Regulation der Translation erfolgt über die Phosphorylierung des
eukaryotischen Initiationsfaktor 4E (eIF4E)-Bindungsproteins (4EBP1) und
der 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1 (S6K1)(p70S6K)(28, 30, 90,
113, 121). 4EBP1 ist ein Repressor der Translation, der durch mTOR gehemmt
wird. Aktiviert durch mTOR, erhöht S6K1 die Effizienz funktionsfähiger
Ribosomen(80). Sie ermöglicht die Translation von mRNAs, die hauptsächlich
für ribosomale Proteine und andere Komponenten des Translationsapparates
kodieren(90).
mTOR Aktivierung erhöht die Aktivität der RNA-Polymerase I (Transkription
der 40S rRNAs) und der RNA-Polymerase III (Transkription der 5S rRNAs
und tRNAs)(90, 121). In Säugerzellen aktiviert mTOR auch die RNA-
Polymerase II(90, 121).
Die Inaktivierung von mTOR führt zur Verminderung des Aminosäure-Imports
in Hefezellen und zur Induktion von Autophagie, sogar im nährstoffreichen
Medium, sowohl in Hefe- als auch in Säugerzellen(90).
2.2.4. Vorkommen von mTOR im Haarfollikel
Die Verteilung von mTOR wurde bisher nur in einer Studie
immunhistochemisch an Mäusehaaren und ausschließlich im
Telogenstadium des Haarzyklus untersucht(2). Die Autoren fanden mTOR+
Zellen in der „bulge region“ der Haarfollikel, im Infundibulum und in den
Basalzellen der Epidermis. Ihre Ergebnisse im Bereich des murinen Epithels
weisen daraufhin, dass mTOR hier eventuell für die Proliferation der Zellen
eine Rolle spielt.
15
Einleitung
2.3. Prostaglandin F2α-Analoga
2.3.1. Definition, Struktur und Biosynthese der Prostaglandine
Prostaglandine (PG) gehören einer der wichtigsten Klasse der
Lipidmediatoren, bekannt als Eicosanoide an(24). Diese sind endogene
Derivate essentieller Fettsäuren mit 20 Kohlenstoffatomen, die im
Säugerorganismus ubiquitär vorkommen. Sie sind durch einen
Cyclopentanring, sowie eine Carboxyl- und einer Alkylseitenkette
charakterisiert.
Abhängig von der Ausgangssubstanz werden drei Hauptgruppen der
Prostaglandine gebildet: die Serie-1 Prostaglandine entstehen aus
Dihomogammalinolensäure (8,11,14-Eicosatriensäure), die Serie-2
Prostaglandine aus Arachidonsäure (5,8,11,14-Eicosatetraensäure) und die
Serie-3 Prostaglandine aus Timnodonsäure (5,8,11,14,17-
Eicosapentaensäure). Die Zahlen 1 – 3 weisen auf die Anzahl der
Doppelbindungen in den Seitenketten der PG hin. Am wichtigsten sind die
Serie-2 Prostaglandine, die unter anderem für die Entstehung oder
Verstärkung von Entzündungen verantwortlich sind, sowie auch für die
Intensivierung der Schmerzwahrnehmung. Sie lösen im Körper die
notwendigen Reaktionen aus, um auf Wunden oder andere Verletzungen zu
reagieren.
Wenn aus den Phospholipiden der Zellmembran durch Phospholipase A2
oder durch Phospholipase C und Diacylglyceridlipase Arachidonsäure
freigesetzt wird, erfolgt sofort nach der Synthese ihre Umwandlung in eine
Reihe unterschiedlicher Stoffgruppen durch Einwirkung verschiedener
Enzyme(98) (Abb. 6).
16
Einleitung
Abb. 6: Schematische Darstellung der Prostaglandinsynthese (modifiziert
nach Smith et al.)(98).
So entsteht aus freier Arachidonsäure durch Prostaglandin H-Synthasen
(PGHS-1, und PGSH-2), bekannt auch als Cyclooxigenasen (COX-1 und
COX-2)(97), die intermediären PG-Endoperoxide Prostaglandin G2 (PGG2)
und Prostaglandin H2 (PGH2)(27), durch die Einwirkung von Lipoxygenasen
die Gruppe der Leukotrienen und durch Epoxygenase
Epoxyeicosatriensäure(24, 98). Aus PGH2 werden durch zelltypspezifische
Synthasen oder durch nichtenzymatische Transformation die biologisch
aktiven Prostanoide synthetisiert(27, 98). Zu diesen zählen sowohl die stabilen
Prostanoide, die Prostaglandine PGD2, PGE2, PGF2, PGJ2, als auch die
labilen Prostanoide, neben den schon erwähnten PG-Endoperoxiden auch
Prostazyklin (PGI2) und Thromboxan A2 (TxA2)(27). Die
Buchstabenbezeichnungen charakterisieren die Substitutionen an dem
Cyclopentanring des Moleküls. Die sterische Position der OH-Gruppe an C9
wird bei den Prostaglandinen F durch die Bezeichnung α oder β angegeben.
17
Einleitung
2.3.2. Rezeptoren und intrazelluläre Signaltransduktion
Die Prostaglandine, bis auf PGD2, vermitteln ihre Wirkung über die Bindung
an G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren (GPCR). Der Prostaglandin-D-
Rezeptor DP2 ist ein Chemokinrezeptor. Zusätzlich zu
Zelloberflächenrezeptoren binden PGI2 und ein Abbauprodukt von PGD2
auch an intrazelluläre Rezeptoren. Die Rezeptoren, entsprechend der
höchsten Affinität für die unterschiedlichen PG, werden in die fünf Hauptypen
DP, FP, IP, EP und TP unterteilt.
Die Bindung der PG an ihren Rezeptor kann entweder zu einem Anstieg oder
Abfall der zellulären cAMP-Konzentration führen oder zu einem Anstieg der
Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol-Konzentration und letztlich zum
Anstieg der zellulären Ca2+-Konzentration. Ein bekannter Signalweg für die
Wirkung von PGF2α erfolgt über die Bindung an seinem GPCR, was die
Aktivierung von Phospholipase C-β (PLCβ) und die Bildung von
Diacylglycerol und Inositoltriphosphat bewirkt(20). Es erfolgt die Proteinkinase
C (PKC)-abhängige Aktivierung von Raf(14, 29). Über andere Signalwege ist
wenig bekannt.
2.3.3. Abbau der Prostaglandine
Prostaglandine wirken vorwiegend autokrin oder parakrin. Ihre Halbwertszeit
ist kurz. Prostaglandin E und F werden rasch durch 15-Hydroxy-
Prostaglandin-Dehydrogenase zu den entsprechenden 15-Keto-
Verbindungen und in einem zweiten Schritt durch Prostaglandin-Δ13-
Reduktase zu 15-Keto-13,14-Dihydro-Derivaten überwiegend in der Lunge,
aber auch in der Niere, Milz, im Gastrointestinaltrakt und in der Placenta
metabolisiert und inaktiviert. Von einer injizierten Dosis werden bei einer
einzigen Lungenpassage ca. 95% metabolisiert. Der weitere Abbau der 15-
Keto-13,14-Dihydro-Derivaten erfolgt langsamer vorwiegend in der Leber. Es
18
Einleitung
dauert ca. 4 Minuten bei 37°C für den Abbau von PGI2 zum biologisch
inaktiven 6-Keto-PGF1α und ca. 30 Sekunden bei 37°C für die
nichtenzymatische Inaktivierung von TxA2(27).
2.3.4. Prostamide/Bimatoprost
Parallel zur Synthese von Prostaglandin H2 durch Oxidation der
Arachidonsäure wird aus dem Endokannabinoid Anandamid
(=Arachidonylethanolamid) durch Oxidation, katalysiert ausschließlich von
dem Enzym COX-2, über das Zwischenprodukt Prostamid G2, Prostamid H2
hergestellt(119). Dieses wird durch die unterschiedlichen Prostaglandin-
Synthasen zu einer Vielzahl von Prostamiden umgewandelt, unter anderem
zu Prostamid F2α(119). Prostamide sind Prostaglandin-Ethanolamide, die sich
von den Prostaglandinen durch Substitution einer Hydroxyl-Gruppe durch
eine Ethanolamid-Gruppe unterscheiden(119).
Ein synthetisches Prostamid F2α-Analogon ist Bimatoprost, (Lumigan™), das
sich als ein sehr effektives augeninnendrucksenkendes Therapeutikum
heraus gestellt hat(118, 119).
2.3.5. Wirkungen und medizinische Verwendung der Prostaglandine
Die Wirkung dieser Gewebshormone ist überaus vielfältig, da es einerseits
eine Vielzahl von verschiedenen Prostaglandinen gibt und andererseits für
ein Prostaglandin unterschiedliche Rezeptoren mit unterschiedlicher Wirkung
existieren. So bindet zum Beispiel PGE2 an vier verschiedene Rezeptoren,
EP1-EP4, die je nach Subtyp die Adenylatcyclase aktivieren, inhibieren oder
die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration erhöhen können. So werden durch
den gleichen Stimulus unterschiedliche, zum Teil sogar antagonistische
Reaktionen hervorgerufen. Im Kreislaufsystem erweitern PGE1 und PGE2 die
19
Einleitung
Gefäße und senken dadurch den peripheren Widerstand und den arteriellen
Blutdruck, während PGF2α den Blutdruck für mäßig steigern kann(61). Vor der
Geburt induzieren PGF2α und PGE2 beim Menschen die Uteruskontraktion
und die Zervixdilatation. Der Grund dieser Erweiterung ist ein Anstieg der
kollagenolytischen Aktivität durch Induktion von Metalloproteinasen in der
Cervix(111). Im Myokard und im Skelettmuskel werden Prostaglandine durch
Dehnung induziert(12, 112). PGF2α-Behandlung führt am Herzen zu einer
Hypertrophie der Herzmuskelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen in
vitro und in vivo bei Ratten(1, 46). Dementsprechend vielfältig sind auch die
Anwendungen von PGs in der Medizin.
Ihre natürlichen oder synthetischen Vertreter werden in der Geburtshilfe (zur
Einleitung von Wehen)(63, 72), der Augenheilkunde (Behandlung von
Glaukomen)(37, 42, 96), der Angiologie (bei arteriellen Gefäßverschlüssen oder
Gefäßverengungen)(34, 57, 70, 109) und Gastroenterologie (zur Ulkusprophylaxe
bei Gabe von nicht-steroidalen Antiphlogistika)(21, 33, 92) eingesetzt.
Bimatoprost wird in der Glaukomtherapie(65, 66, 118) und neuerdings zur
Anregung des Wimpernwachstums(17, 47, 120, 122) verwendet. Das primäre
Offenwinkelglaukom gehört weltweit zu einer der häufigsten Ursachen von
Erblindung(25). Mit der Einführung von Bimatoprost zur Senkung des erhöhten
intraokulären Augeninnendrucks wurden die medikamentösen
Behandlungsoptionen beim Glaukom wesentlich erweitert. Auf Grund seiner
potenten Augendruck senkenden Wirkung und der Tatsache, dass es nur
einmal am Tag als Augentropfen appliziert werden muss, zählt Bimatoprost
zu den am häufigsten verordneten Medikamenten beim Glaukom. Nach
Aufnahme zum größten Teil über die Sklera(118), erfolgt die
augeninnendrucksenkende Wirkung der Prostaglandine durch eine Erhöhung
des uveoskleralen(37, 51-53, 103) und des trabekulären(37) Kammerwasser-
abflusses. Bimatoprost entfaltet seine therapeutische Wirkung durch die
Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen(67, 68, 115, 116), die kollagene Fibrillen
abbauen, dadurch die intermuskulären Spalten im M. ciliares erweitern und
somit den Abflusswiderstand für das Kammerwasser erniedrigen(51-53, 103).
20
Einleitung
2.3.6. Prostaglandine und Haarwachstum
Hypertrichosis oder Trichomegalie ist durch ein erhöhtes Längen- und
Dickenwachstum der Haare, sowie durch Zunahme der Steifigkeit und der
Pigmentierung definiert. Eine Verdickung und Verlängerung der
Augenwimpern, sowie das Auftreten zusätzlicher Wimpernreihen, was früher
nur eine unerwünschte Nebenwirkung der Prostaglandin-Behandlung war(8,
26, 36, 89, 93, 110), kann heute medizinisch und kosmetisch zur Förderung des
Wimpernwachstums eingesetzt werden(17, 47, 120, 122).
Bei Glaukompatienten kann die Prostaglandinbehandlung zum verstärkten
Wachstum der Vellushaare in der Jochbein-Region führen(8), was für den
Betroffenen sehr störend sein kann. Auch ein verstärktes Wimpernwachstum
ist eher unerwünscht, weil dadurch das Aussehen des Patienten verändert
wird und zu psychischen Belastungen führen kann. Die Ursache und der
Wirkmechanismus des vermehrten Wimpern- und Haarwachstums sind noch
weitgehend unbekannt. Es wurde aber gezeigt, dass auch bei Mäusen
Prostaglandin F2α das Haar-(86) und Wimpernwachstum(105), infolge der
Induktion der Wachstumsphase in telogenen Follikeln und der Prolongation
der Anagenphase(41, 105), fördert. Aus diesem Grund eignet sich das
Mausmodell für Untersuchungen zur Erforschung der Wirkmechanismen
einer Prostaglandinbehandlung.
2.3.7. Aktivierung von mTOR durch Prostaglandine
Aus Untersuchungen am Rind ist bekannt, dass Prostaglandin F2α die Akt-
unabhängige Phosphorylierung von TSC2 und die Aktivierung von mTOR in
Corpus luteum-Zellen induzieren kann(4). Ebenso ist bekannt, dass die
21
Einleitung
PGF2α-induzierte Hypertrophie glatter Muskelzellen in Blutgefäßen mit der
Phosphorylierung von mTOR einhergeht(81).
2.4. Hypothese
Aus den vorliegenden Daten wurde die Arbeitshypothese formuliert, dass die
unter Bimatoprostbehandlung beobachtete Zunahme des Haarwachstums
über eine Aktivierung von mTOR in den Stammzellen der Haarfollikel
vermittelt wird.
Aus der Kenntnis des Wirkungsmechanismus von Bimatoprost auf das
Haarwachstum könnten neue Strategien entwickelt werden, um sowohl
unerwünschte Trichomegalie als Nebenwirkung einer Glaukombehandlung
zu vermeiden, als auch Haarwachstum zu stimulieren, um, z.B. die Folgen
von Haarausfall besser als bisher behandeln zu können.
22
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1. Tiere und Tierhaltung
Weibliche C57BL/6J Mäuse unterschiedlichen Alters wurden von der Société
Janvier (Le Genest-St-Isle, Frankreich) bezogen. Die Mäuse wurden in
Gruppen von vier bis acht Tieren in Gemeinschaftskäfigen bei
automatisiertem zwölfstunden Hell/Dunkel Rhythmus gehalten. Der Raum
wurde kontinuierlich auf Temperatur und Luftfeuchtigkeit kontrolliert.
Trockennahrung und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.
3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der haarzyklus-
abhängigen mTOR Aktivierung
3.2.1. Probengewinnung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Toluidin-
blau-Färbung zur Haarphasenbestimmung
Die Charakterisierung des Haarzyklus der in der vorgelegten Arbeit
verwendeten Kontrollmäuse erfolgte mit Hilfe Toluidinblau gefärbter
Semidünnschnitten. Es wurden 66 unbehandelte Mäuse in 11
unterschiedliche Altersgruppen unterteilt: d14, d17, d20, d23, d26, d30, d34,
d38, d41, d44 und d47 p.p. Dadurch wurde sichergestellt, dass ein
kompletter Haarzyklus untersucht werden konnte(58). Die Tiere wurden durch
zervikale Dislokation getötet. Jeweils ein 1 cm2 großes Stück dorsale
Rückenhaut wurde kaudal des Halses, über dem linken Schulterblatt,
chirurgisch abgetrennt (Region 1) (Abb. 7). Davon wurde je ein 2-4 mm
breiter Streifen parallel zur Ausrichtung der Haarreihen ausgeschnitten, in
ITO-Lösung (2,5% Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd, 0,01% Pikrinsäure
in 0,1 mM Cacodylat-Puffer) über Nacht fixiert und in Epon eingebettet. Die
restlichen Hautstückchen wurden für immunhistochemische Untersuchungen,
wie weiter unten beschrieben, aufgehoben. Von den Eponblöcken wurden
1µm dicke sagittale Schnitte hergestellt und mit Toluidinblau (Sigma,
23
Material und Methoden
Hannover, Deutschland) angefärbt. Die Bestimmung der Wachstumsphase
der Haarfollikel erfolgte durch die lichtmikroskopische Analyse der
Hautpräparate nach den Kriterien von Müller-Röver(58). Repräsentative
Schnitte wurden fotografiert (Mikroskop: Carl Zeiss, Software: AxioVision 4.0,
Göttingen, Deutschland).
Abb. 7: Schemazeichnung der Probengewinnung. Die Hautfläche von Region
1 wurde für alle Versuche dorsal, kaudal des Halses über dem linken
Schulterblatt entnommen (kleines weißes Rechteck). Diese wurde für
histologische/immunhistochemische Untersuchungen verwendet. Die
Hautfläche von Region 2 ist 2 cm2 groß und wurde weiter kaudal, unterhalb
des Ersten entnommen (großes weißes Rechteck) und für die quantitative
Bestimmung der p-mTOR Kinaseaktivität verwendet.
Alle histologischen Haarphasenbestimmungen für die folgenden Versuche
erfolgten mit Hilfe Hämatoxylin-Eosin gefärbter Paraffinschnitte. Dafür wurde
jeweils ein Stück Rückenhaut (Region 1) abgetrennt und in 4%iger
Paraformaldehyd-TBS-Lösung (TBS: Tris buffered saline, 0,05 M, pH 7,4;
6,61 g Salzsäure, 0,97 g Tris-Base, 8 – 10 g Natriumchlorid pro Liter Lösung)
über Nacht bei 4°C immersionsfixiert. Davon wurden, wie für die Herstellung
von Semidünnschnitten, Streifen ausgeschnitten und in Paraffin eingebettet.
Mit Hilfe eines Schlittenbahnmikrotoms (Leica, Nussloch, Deutschland)
24
Material und Methoden
wurden 5 μm dicke Sagittalschnitte hergestellt und im Anschluss daran
Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt. Unter dem Lichtmikroskop erfolgten die
Bestimmung der Wachstumsphase der Haarfollikel und das Fotografieren
repräsentativer Schnitte.
Alle Chemikalien wurden von der Firma Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)
erworben, sofern nicht anders vermerkt.
3.2.2. Immunhistochemische Lokalisation von p-mTOR positiven Zellen
Um die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln in verschiedenen
Wachstumsphasen zu bestimmen, wurden Paraffinschnitte von der Haut
(Region 1, Abb. 7) von je drei Mäusen im Alter von 3, 4, 5, 6 und 7 Wochen
untersucht. Der Alter der Tiere wurde so ausgewählt, dass ein kompletter
Haarzyklus untersucht werden konnte(58). Zur Demaskierung vernetzter
Antikörperbindungsstellen wurden die Schnitte für 10 min in 10mM
Zitratpuffer, pH 6,0 (9 ml 0,1 M Zitronensäurelösung, 41 ml 0,1 M
Natriumcitrat in 450 ml gereinigtem Wasser) gekocht. Die Aktivität der
endogenen Peroxidase wurde durch Inkubation mit 3%iger
Wasserstoffperoxidlösung inhibiert. Um unspezifische Hintergrungfärbung zu
verhindern, wurden die Schnitte für 30 min mit Blockierungslösung [5%
Ziegenserum in TBST-Puffer (TBS mit 0,1% Tween 20)] inkubiert. Der
monoklonale Hase-α-Maus αPhospho-mTOR (Ser2448) Primärantikörper
(Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt am Main,
Deutschland) wurde in einer Verdünnung von 1:200 in Blockierungslösung
über Nacht bei 4°C zugegeben. Nach dreimal 5 min Waschen mit TBST-
Puffer wurde der biotinilierte Ziege-α-Hase Sekundärantikörper in der
Verdünnung von 1:200 (Vector Laboratories, Linaris, Wertheim-Bettingen,
Deutschland) in Blockierungslösung für 30 min zugegeben. Ungebundene
Antikörper wurden durch dreimaliges Spülen für je 5 min mit TBST-Puffer
entfernt. Um das Signal zu verstärken, erfolgte die Inkubation mit ABC-
25
Material und Methoden
Reagenzlösung (Vector Laboratories, Linaris, Wertheim-Bettingen,
Deutschland) nach Anweisung des Herstellers. Nach dreimaligem Spülen mit
TBST-Puffer erfolgte die Entwicklung durch Zugabe des chromogenen
Substrats 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) (SERVA, Heidelberg, Deutschland) für
3 min. Die Farbreaktion wurde in destilliertem Wasser gestoppt. Nach
Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (Ethanol 70%-100%) und
Entfernung des Alkohols durch Xylol, wurden die Schnitte in Entellan (Merck,
Darmstadt, Deutschland) eingedeckt.
Die Verteilung von p-mTOR in den Haarfollikeln in jeder Wachstumsphase
wurde lichtmikroskopisch analysiert. Repräsentative Schnitte wurden
fotografiert.
3.2.3. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivierung mittels Kinase-
Aktivitätsassay
3.2.3.1. Probengewinnung mit Abtrennung der Epidermis von der
Dermis und Subkutis
Zur Erstellung eines quantitativen mTOR Aktivierungsprofils wurden je 6
unbehandelte Mäuse unterschiedlichen Alters (d14, d17, d20, d23, d26, d30,
d34, d38, d41, d44 und d47 p.p.) untersucht. Das Altersintervall wurde so
gewählt, dass ein kompletter Haarzyklus untersucht werden konnte(58).
Es wurden jeweils zwei Hautstückchen pro Maus entnommen (Abb. 7). Das
Erste (Region 1) diente der histologischen Haarphasenbestimmung und
wurde wie oben beschrieben verarbeitet. Das zweite Hautstückchen wurde
weiter kaudal, mittig, in einer Größe von 2 cm2 entnommen (Region 2) und
auf einer Silikonplatte mit der Epithelseite nach unten befestigt. Von diesem
Gewebestück wurde unter einem Stereomikroskop (Carl Zeiss, Göttingen,
Deutschland) nach grober Entfernung des unter der Subkutis liegenden
Bindegewebes, beginnend mit dem M. panniculus carnosus die Subkutis und
26
Material und Methoden
der größte Teil der Dermis, bis einschließlich der Talgdrüsen, abpräpariert
und zur Herstellung eines Proteinextrakts in flüssigem Stickstoff tiefgefroren
(Abb. 8). Um die Qualität der Präparation zu beurteilen, wurde das restliche
Epithelgewebe in 4%iger Paraformaldehyd-TBS-Lösung über Nacht fixiert,
mehrfach in TBS-Puffer ausgewaschen und die Hälfte zur Herstellung von 20
μm dicken Serienschnitten mit Hilfe eines Gefriermikrotoms (Leica, Nussloch,
Deutschland) verwendet. Nach H.E.-Färbung wurde eine mikroskopische
Kontrolle durchgeführt.
Abb. 8: Hämatoxylin-Eosin gefärbte histologische Schnitte (a) vor
Präparation (Paraffinschnitt, 5 µm), (b) nach Präparation (Gefrierschnitt, 20
µm) zur Darstellung des Gewebes, das zur Gewinnung des Proteinextraktes
für die quantitative Bestimmung der p-mTOR Kinase Aktivität verwendet
wurde. Das Gewebe besteht aus der Dermis, einschließlich der Talgdrüsen,
der angrenzenden Subkutis und dem Musculus panniculus carnosus.
[Balken: 50 µm]
Es wurden nur Proben für die Proteinisolierung verwendet, die in dem
Kontrollschnitt nach Präparation (Abb. 8 b) weniger als 10% Talgdrüsen, in
27
Material und Methoden
Relation zur Zahl der Haarfollikel, enthielten. Durch die Präparation wurde
sichergestellt, dass 1) durch die im Epithel befindlichen Stammzellen, die
selbst eine hohe mTOR-Aktivität aufwiesen, eine Aktivitätsänderung von
mTOR, abhängig von der Haarzyklus, nicht übersehen werden konnte und 2)
der Bulbus und die „bulge region“ der Haarfollikel hinsichtlich der mTOR
Aktivierung untersucht werden konnten.
Das in flüssigem Stickstoff tiefgefrorene Gewebe wurde in gefrorenem
Zustand gemörsert und in TBST-Puffer aufgenommen. Zur Vermeidung der
Proteindegradation wurden dem TBST-Puffer 4 μl pro ml eines Protease-
Inhibitor Cocktails (20 µl Aprotinin 10 mg/ml, 100 µl Leupeptin 5 mg/ml, 100
µl 10 mg/ml Pepstatin A, 200 µl Glycerin pro ml Lösung) und 20 μl pro ml
PMSF zugefügt (alle Protease-Inhibitoren: Sigma, Hannover, Deutschland).
Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben bei 11.000
rpm/min in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 4°C
abzentrifugiert. Im Überstand wurde die Proteinkonzentration mit der
Methode nach Bradford (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) nach
Anweisung des Herstellers bestimmt. Der Proteinextrakt diente der
quantitativen Bestimmung der mTOR Aktivierung.
3.2.3.2. Kinase-Aktivitätsassay
Um die Aktivierung von mTOR quantitativ zu bestimmen und ein mTOR
Aktivierungsprofil zu erstellen, wurde ein Kinase-Aktivitätsassay (K-LISA
mTOR™ Activity Kit, Calbiochem, Merck, Darmstadt, Deutschland) nach
Anweisung des Herstellers angewandt.
Der Test funktioniert nach dem Prinzip eines Enzyme-linked immuno sorbent
Assay´s (ELISA), der als spezifisches Substrat für mTOR ein p70S6K-GST
Fusionsprotein verwendet. Das mTOR Substrat wurde in den Wells einer mit
Glutathion beschichteten 96 Well-Platte gebunden. Für jeden Assay zur
quantitativen mTOR Aktivitätsbestimmung wurde von jeder Probe die gleiche
28
Material und Methoden
Proteinmenge eingesetzt, wobei man sich an der Probe mit der niedrigsten
Proteinkonzentration orientierte. Das eingesetzte Maximalvolumen betrug 50
μl, die eingesetzte Proteinmenge 80-130 µg. Damit die Ergebnisse des
Kinaseassays untereinander vergleichen werden können, wurde eine
Verdünnungsreihe der mitgelieferten Standardlösung als Doppelbestimmung
mitgeführt. Die mTOR-haltige Probe wurde zusammen mit ATP in den Wells
der Platte bei 30°C für 30 min inkubiert. Während dieser Zeit erfolgt die
Phosphorylierung von p70S6K an Thr389. Anschließend wurde die
Phosphorylierung mit einem Anti-p70S6K-T389 Antikörper (Verdünnung
1:1000) nachgewiesen. Nach Entfernung ungebundenen Antikörpers,
erfolgte die Detektion von gebundenen Anti-p70S6K-T389 Antikörpern durch
ein HRP-Antikörper-Konjugat und TMB Substrat. Die Farbreaktion wurde
nach ca. 10-20 min durch Zugabe von Elisa Stopplösung, die einen
Farbumschlag von blau nach gelb bewirkt und dadurch die Sensitivität des
Assay erhöht, beendet. Die relative mTOR Aktivität wird durch Messung der
Absorption bei den Wellenlängen 450 nm und 590 nm mit Hilfe eines ELISA-
Gerätes (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Deutschland) bestimmt.
3.3. Hemmung der haarzyklusabhängigen mTOR Aktivierung durch
Rapamycin
Um zu bestimmen, wie die Aktivierung von mTOR den Wachstumszyklus der
Haarfollikel beeinflusst, wurde Mäusen mit telogenen Haarfollikeln der
spezifische mTOR Inhibitor Rapamycin verabreicht, und seine Wirkung auf
den Haarzyklus analysiert.
3.3.1. Rapamycin
Rapamycin (LC Laboratories, Woburn, MA) wurde in einer Stammlösung von
10 mg/ml in absolutem Ethanol angesetzt(13). Die Gebrauchslösung von 0,05
μg/µl wurde durch Verdünnen der Stammlösung in 5% Tween 80/PEG-400 in
29
Material und Methoden
gereinigtem Wasser erhalten(13). Diese wurde den Mäusen in einer Dosis von
0,5 μg Rapamycin pro Gramm Körpergewicht pro Tag verabreicht(79). Die
Vehikellösung hatte dieselbe Zusammensetzung, enthielt aber kein
Rapamycin.
3.3.2. Rasur
Die Rückenhaut aller behandelten Mäuse wurde mit einem handelsüblichen
elektrischen Rasierapparat am Anfang jedes Versuches unter Anästhesie
rasiert. Die Anästhesie erfolgte durch eine intraperitoneale Injektion eines
Cocktails von Ketamin/Xylazin (90 µg Ketamin und 10 µg Xylazin pro Gramm
Körpergewicht). Da das Ziehen an den Haaren zur Induktion der
Anagenphase und somit zu verfälschten Ergebnissen führen kann, wurde die
Rasur besonders vorsichtig durchgeführt, die Haut sofort auf eventuelle
Verletzungen untersucht und auf Farbunterschiede der Rückenhaut nach
einem Tag geachtet. Tiere mit Hautverletzungen wurden von weiteren
Versuchen ausgeschlossen. Zeigte sich bei der Rasur eine punkt- oder
fleckförmige Dunkelfärbung bzw. eine Veränderung der Rückenhautfarbe, die
auf Probleme in der Tierhaltung hindeutete(107), wurde es dokumentiert und
die entsprechenden Hautstellen weder makroskopisch noch mikroskopisch
weiter untersucht.
3.3.3. Bestimmung der Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus
Die Wirkung von Rapamycin auf den Haarzyklus wurde an insgesamt 32 drei
Wochen alten Mäusen mit Haare im Telogen, untersucht. Die Mäuse wurden
in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 wurde zwei Wochen lang, Gruppe 2 vier
Wochen lang behandelt. Beide Gruppen wurden weiterhin in je eine Vehikel-
und Rapamycingruppe unterteilt. Vierundzwanzig Stunden nach Rasur und
30
Material und Methoden
fotografischer Dokumentation der Rückenhaut wurde die Behandlung
begonnen. Nach täglichem Wiegen der Mäuse wurde die Vehikel- bzw.
Rapamycinlösung [Konzentration: 0,5 µg/g Körpergewicht(79)] einmal am Tag
intraperitoneal injiziert. Um festzustellen, ob die Inhibierung von mTOR den
Eintritt telogener Haarfollikel in den Haarzyklus verhindern kann, wurden die
Tiere der Gruppe 1 (Vehikelkontrollen n=6, Rapamycin-Behandlungsgruppe
n=6) für zwei Wochen behandelt und anschließend die Rückenhaut
fotografiert. Die Tiere der Gruppe 2 (Vehikelkontrollen n=10, Rapamycin-
Behandlungsgruppe n=10) wurden vier Wochen lang behandelt und der
Rücken der Mäuse, während der gesamten Dauer der Behandlung, zweimal
pro Woche fotografiert (Abb. 9).
Abb. 9: Schema für die Rapamycinbehandlung. Schematische Darstellung
der zwei- und vierwöchigen Behandlung von Vehikel- bzw.
Rapamycingruppen. Dicke horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmal
täglich Injektion von Vehikel- bzw. Rapamycinlösung), X: Tötung der Tiere.
Der erste Behandlungstag ist mit dem vertikalen Pfeil markiert.
Nach der Behandlung wurden die Tiere getötet. Es wurde jeweils ein
Hautstückchen aus Region 1 (Abb. 7) entnommen und in Paraffin
31
Material und Methoden
eingebettet. Für jede Maus wurden an drei bis acht H.E. gefärbten
Sagittalschnitten je 60 (Gruppe 1 - zweiwöchige Behandlung) bzw. 28
(Gruppe 2 - vierwöchige Behandlung) Haarfollikel mit sichtbarer dermaler
Papille den unterschiedlichen Zyklusphasen zugeordnet, die Anzahl der
Follikel pro Phase bestimmt und damit der prozentuale Anteil jeder
Wachstumsphase errechnet.
3.4. Bestimmung der Wirkung von Bimatoprost auf die mTOR
Aktivierung
3.4.1. Bimatoprost
Bimatoprost ist ein synthetisches Prostamidanalogon, welches in einer
0,03%igen ophthalmologischen Lösung unter dem Namen Lumigan®
(Allergen, Irvine, CA) erhältlich ist. Sowohl Bimatoprost, als auch sein Vehikel
(NaCl, Na2HPO4, Zitronensäure, Benzalkoniumchlorid als
Konservierungsmittel in gereinigtem Wasser) wurden von der Firma Allergan
für die Experimente bereitgestellt.
Auf die rasierte Rückenhaut der Mäuse wurden einmal täglich je 2 Tropfen
Bimatoprost (40-50 μl)(23) aufgebracht und gründlich eingerieben.
3.4.2. Effekt von Bimatoprostbehandlung auf die mTOR Aktivierung
Da Bimatoprost einen induktiven Effekt auf den Eintritt ruhender Haarfollikel
(Telogen) in die Wachstumsphase (Anagen) hat(105), wurde untersucht, ob
diese durch Aktivierung von mTOR in Haarfollikeln im Telogen vermittelt
wird. Die Behandlung mit Bimatoprost führt auch zur Verdickung und
Verlängerung der Vellushaare beim Menschen(8). Da diese Vorgänge im
Anagen stattfinden(99), wurde die Aktivierung von mTOR in Haarfollikeln auch
im Anagen untersucht. Es wurden zwei Altersgruppen untersucht: d26
(Anagen) bzw. d56 p.p. (Telogen). Nach Rasur wurde in jeder Altersgruppe
je vier Mäusen Vehikellösung auf den Rücken aufgebracht, je sechs erfuhren
eine einmalige Bimatoprost Behandlung und je vier blieben unbehandelt
32
Material und Methoden
(Abb. 10). Da die Aktivierung von mTOR über eine posttranslationale
Modifikation (Phosphorylierung)(62) rasch erfolgt, wurden die Tiere nach 2h
getötet und von jeder Maus je ein Hautstückchen der Region 1 (Abb. 7) in
Paraffin eingebettet und phosphoryliertes mTOR immunhistochemisch
dargestellt.
Abb. 10: Schema für die einmalige Bimatoprostbehandlung. Schematische
Darstellung der Behandlung von Tieren im Alter von d26 und d56. In beiden
Altersgruppen gab es je drei Untergruppen: Unbehandelt, Vehikel und
Bimatoprost. Horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmalige
Verabreichung von Vehikel- bzw. Bimatoprostlösung), X: Tötung der Tiere.
Der Zeitpunkt der Verabreichung der Bimatoprost bzw. Vehikellösung ist mit
dem vertikalen Pfeil markiert.
In einem weiteren Versuch wurde der Einfluss von Bimatoprost auf die
mTOR Aktivierung nach zweitägiger Behandlung in allen Wachstumsphasen
untersucht. Dafür wurden je vier Mäuse an d28 (Anagen), d40 (Katagen) und
d54 (Telogen) behandelt. Die entsprechenden Kontrollgruppen blieben
unbehandelt (Abb. 11). Nach Tötung der Mäuse wurde je ein Stück von der
dorsalen Haut analog zu der vorher beschriebenen Prozedur präpariert,
eingebettet und immunhistochemisch markiert.
33
Material und Methoden
Abb. 11: Schema für die zweitägige Bimatoprostbehandlung. Schematische
Darstellung der Behandlung von Tieren im Alter von d28, d40 und d54 (zu
Anfang der Behandlung). In jede Altersgruppe wurden unbehandelte
Kontrollen mitgeführt. Dicke horizontale Pfeile: Behandlungsdauer (einmal
täglich Injektion von Vehikel- bzw. Rapamycinlösung), X: Tötung der Tiere.
Der erste Behandlungstag ist mit dem vertikalen Pfeil markiert.
3.5. Einfluss von Rapamycin auf die durch Bimatoprost vermittelte
Initiation der Anagenphase
Wenn Bimatoprost die Initiation von Anagen in Telogenfollikeln durch eine
Aktivierung von mTOR bewirkt, dann sollte dieser Effekt durch die
zusätzliche Gabe von Rapamycin inhibiert werden können. Diese Hypothese
wurde durch Doppelbehandlung mit Bimatoprost (2 Tropfen pro Tag pro Tier)
und Rapamycin [Injektionslösung (Gebrauchslösung 0,1 µg/µl), Dosis 0,5 µg
pro Gramm Körpergewicht] überprüft. Dafür wurden 29 acht Wochen alte
Mäuse in vier Gruppen mit je 7 bis 8 Tieren eingeteilt und für 3 Wochen
behandelt. Gruppe 1 erhielt gleichzeitig Bimatoprostvehikel und
Rapamycinvehikel [Ve(B)+Ve(R)] (n=7), Gruppe 2 Bimatoprostvehikel und
34
Material und Methoden
Rapamycin [Ve(B)+Rap] (n=7), Gruppe 3 wurde mit Bimatoprost behandelt
bei gleichzeitiger Gabe von Rapamycinvehikel [Bi+Ve(R)] (n=7) und bei den
Tieren der Gruppe 4 erfolgte die Doppelbehandlung mit Bimatoprost und
Rapamycin (Bi+Rap) (n=8) (Abb. 12). Während der gesamten Dauer der
Behandlung wurde der Rücken der Tiere zweimal pro Woche fotografiert.
Nach der Behandlung wurden die Tiere getötet, je ein Hautstückchen aus der
Region 1 entnommen und in Paraffin eingebettet. Für jede Maus wurden an
drei bis acht H.E. gefärbten Sagittalschnitten je 24 Haarfollikel mit sichtbarer
dermaler Papille den unterschiedlichen Zyklusphasen zugeordnet, die Anzahl
der Follikel pro Phase bestimmt und damit der prozentuale Anteil jeder
Wachstumsphase errechnet. Um eine eventuelle Änderung der p-mTOR
Expression zu untersuchen, wurden zusätzlich Paraffinschnitte
immunhistochemisch untersucht.
Abb. 12: Schema für die Doppelbehandlung mit Bimatoprost und Rapamycin.
Schematische Darstellung der dreiwöchigen Behandlung (einmal täglich) mit
Bimatoprost (Bi), Rapamycin (Rap) bzw. den wirkstofffreien Vehikellösungen:
Bimatoprostvehikel [Ve(B)] und Rapamycinvehikel [Ve(R)]. Dicke horizontale
Pfeile: Behandlungsdauer (einmal tägliche Behandlung), X: Tötung der Tiere.
Der erste Behandlungstag ist mit dem vertikalen Pfeil markiert.
35
Material und Methoden
3.6. Statistische Analyse
Für den Vergleich der p-mTOR Aktivität in den verschiedenen Haarphasen
mit derjenigen im Telogen wurde die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA),
und der anschließende Dunnett´s Test verwendet. p-Werte kleiner als 0,05
sind statistisch signifikant.
36
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse
Bei den 14 Tage alten Tieren befanden sich alle Haare synchron im
Endstadium der Morphogenese (Abb. 13 a). Der erste Haarzyklus begann an
d17 bei Mäusen, bei denen die Haare morphologisch eine synchronisierte
Katagenphase (Katagen I-VI) aufwiesen (Abb. 13 b). Makroskopisch war für
das Katagen die schwarze Hautfarbe der Tiere charakteristisch. An d20
waren die Haarfollikel noch im Katagen (Katagen VII-VIII) (Abb. 13 c). In
dieser Studie wurde das Katagen in frühes Katagen (Katagen I-VI) und in
spätes Katagen (Katagen VII-VIII) unterteilt. An d23 befanden sich die Haare
im Telogen (Abb. 13 d), makroskopisch sichtbar an der rosa Hautfarbe. An
d26 war der Übergang in die frühe Anagenphase (Anagen I) zu beobachten
(Abb. 13 e). Das Anagen verlief bei den einzelnen Tieren unterschiedlich. An
d30–38 hatten die Haarfollikel bei einigen Mäusen gerade die Dermis-
Subkutis-Grenze erreicht (Anagen II) (Abb. 13 f), bei anderen waren die
Follikel in dieser Zeit bis zum Musculus panniculus carnosus vorgewachsen,
wobei die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS) im Bulbusbereich voll
ausgebildet war und der Bulbus seine maximale Größe erreicht hatte
(Anagen IIIc-IV) (Abb. 13 g). Das makroskopische Kennzeichen des Eintrittes
in die Wachstumsphase war die Graufärbung der Haut ab dem Anagen III-IV.
An d41 war bei allen Tieren das Stadium der mittleren bis späten
Anagenphase (Anagen IV-VI) erreicht, das sich durch das weitere
Vorwachsen der IRS und des Haarschaftes nach distal auszeichnet (Abb. 13
h). Die Anagenphase war zwischen d41 und 44 abgeschlossen. In der
vorgelegten Arbeit wurde die Anagenphase in frühes Anagen (Anagen I-II),
mittleres Anagen (Anagen III-IV) und spätes Anagen (Anagen V-VI) unterteilt.
An d44 waren die Haare bei den meisten Tieren im Katagenstadium
(Katagen III-VI), am Beginn des neuen Zyklus (Abb. 13 i). An d47 waren die
Haarfollikeln im späten Katagen (Katagen VII-VIII) oder bereits im Telogen.
37
Ergebnisse
Abb. 13: Zeitskala für den Haarzyklus der C57Bl/6 Kontrollmäuse.
(Semidünnschnitte, 1 µm, Toluidinblau-Färbung). (a) Morphogenese, (b)
Katagen I-IV, (c) Katagen VI-VIII, (d) Telogen, (e) Anagen I, (f) Anagen II, (g)
Anagen IIIc-IV, (h) Anagen IV-VI, (i) Katagen III-IV, (j) Telogen. [Balken = 100
µm]
38
Ergebnisse
4.2. Analyse der mTOR Aktivierung im Haarzyklus
4.2.1. Lokalisation von p-mTOR in den Wachstumsphasen
p-mTOR war immunhistochemisch während des gesamten Haarzyklus in den
Haarfollikeln nachweisbar. Auch das Stratum germinativum der Epidermis
wies immer zahlreiche markierte Zellen auf.
Telogen
Im Telogen waren vereinzelt p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“ der
Haarfollikel detektierbar (Abb. 14).
Abb. 14: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
mit Haarfollikel im Telogen (Paraffinschnitt, 5 µm). In der „bulge region“
(Pfeilspitze) erkennt man eine p-mTOR exprimierende Zelle (Pfeil). [Balken =
20 µm]
39
Ergebnisse
Anagen
Die Anzahl der p-mTOR+ Zellen stieg in der frühen Anagenphase (Anagen I-
II) deutlich an (Abb. 15).
Fig. 15: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
mit Haarfollikeln im frühen Anagen (Anagen I-II) (Paraffinschnitte, 5 µm).
Nahezu alle Zellen der „bulge region“ (a, b, Pfeilspitzen) und der „secondary
germ“ in der äußeren epithelialen Wurzelscheide (outer root sheath, ORS)
(a-c, Pfeile) exprimieren p-mTOR. [Balken = 50 µm]
40
Ergebnisse
In der „bulge region“ waren nahezu alle Zellen des äußeren Bereichs
markiert und auch die angrenzenden Zellen der äußeren epithelialen
Wurzelscheide (ORS) (vor allem im Bereich der „secondary germ“) waren
nahezu alle p-mTOR+. Die dermale Papille blieb vollständig unmarkiert.
Im Übergang zum Anagen III und der Ausbildung der IRS änderte sich das
Verteilungsmuster. Zwar war auch in diesem Stadium der Großteil der Zellen
der „bulge region“ p-mTOR+, zusätzlich waren aber alle Zellen der IRS
markiert (Abb. 16). Die dermale Papille blieb auch in dieser
Wachstumsphase ungefärbt. Die ORS (mit Ausnahme der „bulge region“)
war ebenfalls vollständig unmarkiert.
Fig. 16: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
mit Haarfollikel im Anagen III (Paraffinschnitt, 5 µm). Neben Zellen der „bulge
region“ (Pfeilspitze) sind auch Zellen der inneren epithelialen Wurzelscheide
(inner root sheath, IRS) (Pfeile) p-mTOR+, während die Zellen der ORS in
diesem Stadium ungefärbt bleiben. [Balken = 50 µm]
41
Ergebnisse
Die Verteilung von p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“, in der dermalen
Papille und in der ORS änderte sich während späteren Anagenphasen kaum
(Abb. 17).
Abb. 17: (a)-(c) Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der
Rückenhaut mit Haarfollikeln im mittleren und späten Anagen (Anagen IV-VI)
42
Ergebnisse
(Paraffinschnitte, 5 µm). Nahezu alle Zellen der „bulge region“ (a, Pfeilspitze)
und der IRS (b, c, schwarze Pfeile) exprimieren von der Höhe der Bulbus bis
zu einer deutlich markierten Grenze (c, weiße Pfeile), die etwa auf der Hälfte
zwischen Bulbus und „bulge region“ liegt, p-mTOR. Die ORS ist ungefärbt.
(d) Darstellung der Trichohyalingranulae (d, schwarze Pfeile) durch
Nachfärbung des Paraffinschnittes von (c) mit Eosin. Der Vergleich von (c)
mit (d) zeigt die Kolokalisation von p-mTOR mit den eosinophilen
Trichohyalingranulae in der IRS. [Balken = 50 µm]
Mit Fortschreiten der IRS-Entwicklung während der anschließenden
Anagenstadien (Anagen IV-VI) wurde die p-mTOR Expression in einem
Bereich detektiert, der sich vom Bulbus bis etwa zur Hälfte zwischen Bulbus
und „bulge region“ erstreckte. In diesem Bereich der IRS wurden eosinophile
Trichohyalingranulae nachgewiesen. Weiter distal war die IRS unmarkiert.
Katagen
In der frühen Katagenphase (Katagen I-VI) drehte sich diese Verteilung um
(Abb. 18).
43
Ergebnisse
Abb. 18: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
in Haarfollikeln im frühen Katagen (Katagen I-VI) (Paraffinschnitt, 5 µm). In
diesen Stadien sind noch p-mTOR+ Zellen der IRS, vor allem in der Nähe der
Bulbus (weiße Pfeile) erkennbar. Mit Fortschreiten des Katagens werden
immer weniger IRS-Zellen markiert und auch die Intensität der Markierung
nimmt ab. Die Zellen der ORS, die an die „bulge region“ angrenzen
(zwischen den schwarzen Pfeilen) sind p-mTOR+. Die „bulge region“ ist nicht
gefärbt. [Balken = 20 µm]
44
Ergebnisse
Die Zellen der „bulge region“ waren unmarkiert, wohingegen die distalen
Zellen der ORS, ab etwa der Mitte zwischen Bulbus und „bulge region“, p-
mTOR exprimierten. Die Zellen der IRS blieben im frühen Katagen in der
Nähe der Bulbus markiert. Im Gegensatz zum Anagen waren nun vereinzelte
Zellen der dermalen Papille markiert. Im weiteren Verlauf, einhergehend mit
einer Distalbewegung des Follikels, blieb die „bulge region“ zunächst
unmarkiert und nur Zellen der ORS, die proximal der „bulge region“ lagen,
zeigten eine intensive p-mTOR Markierung. Mit Fortschreiten der
Regressionsphase (Katagen VII) näherte sich diese intensiv markierte
Region kontinuierlich der „bulge region“ (Abb. 19).
Abb. 19: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
mit Haarfollikeln im späten Katagen (Katagen VII-VIII) (Paraffinschnitte, 5
µm). Die Zellen der ORS, die an der „bulge region“ angrenzen sind sehr
intensiv gefärbt (schwarze Pfeile in a, b). Am Ende der Katagenphase sind
die Zellen der „bulge region“ nahezu alle p-mTOR+ (weißer Pfeil in b) und es
treten auch einzelne intensiv markierte Zellen im Bereich der dermalen
Papille auf (Pfeilspitze in b). [Balken = 50 µm]
Die ORS-Zellen der gegenüber liegenden Seite waren deutlich weniger
intensiv markiert. Am Ende des Katagens (Katagen VIII) waren nahezu alle
45
Ergebnisse
Zellen der „bulge region“ p-mTOR+ und in der dermalen Papille einzelne
intensiv markierte Zellen detektierbar (Abb. 19 b).
4.2.2. Quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität in verschiedenen
Phasen des Haarzyklus
Die Quantifizierung der mTOR Aktivität, durch eine modifizierte ELISA-
Methode, zeigte deutliche phasenkorrelierte Aktivitätsänderungen. Die
höchste Aktivität wurde im Anagen bestimmt, zum Katagen hin nahmen die
Werte ab, und reduzierten sich im Telogen bis an die Nachweisgrenze (Abb.
20).
Abb. 20: Veränderungen der mTOR Aktivität in den verschiedenen
Wachstumsphasen des Haarzyklus, dargestellt als Vielfaches der Aktivität
der Telogenphase (Statistik: einfaktorieller ANOVA, anschließend Dunnett´s
Test, signifikanter Unterschied zum Telogen: * p≤0,01, ** p≤0,005, ***
p≤0,0001).
46
Ergebnisse
Die relative mTOR Aktivität wurde als Vielfaches des Mittelwertes der im
Telogen gemessenen Aktivität (n=6) angegeben.
Im Endstadium der Morphogenese war der Mittelwert der mTOR Aktivität mit
15,31±1,26 (m.a.±SEM) gegenüber dem Telogen signifikant erhöht (n=6;
p≤0,0001). Zu Beginn des ersten Haarzyklus, im frühen Katagenstadium
(Katagen I-II), nahm dieser Wert auf 10,98±1,46 (n=6; p≤0,005) ab, war aber
noch signifikant gegenüber der Telogenphase erhöht. In der späten
Katagenphase (Katagen VII-VIII) wurde ein Wert von 4,64±1,18 (n=6)
ermittelt, der Unterschied zum Telogen war jedoch nicht signifikant. Gleiches
galt für das Anagen I (2,36±1,12; n=5). An d30, als sich die Haarfollikel in
den Anagenstadien II-III befanden, steigerte sich die Aktivität auf 9,45±3,38
(n=6; p≤0,005). Als die meisten Tiere das Anagenstadium III-IV erreicht
hatten, lag die mTOR Aktivität bei 14,21±1,65 (n=5, p≤0,0001) an d34, bzw.
bei 11,45±0,82; (n=4; p≤0,005) an d38. Sowohl an d30, als auch an d34 und
d38, war der Unterschied zum Telogen signifikant. In den Anagenstadien IV-
VI lag der Mittelwert bei 10,0±0,44 (n=4; p≤0,01). Auch im frühen Katagen
(Katagen I-VI) wurde ein Wert von 9,46±2,99 (n=6; p≤0,005) ermittelt. Im
Anagen IV-VI, sowie in den frühen Katagenstadien war die mTOR Aktivität
gegenüber dem Telogen signifikant erhöht. Im späten Katagen- (Katagen VII-
VIII) bis zum Telogen sank die Aktivität auf einem Mittelwert von 3,81±1,11
(n=6), der Unterschied zum Telogen war nicht signifikant.
4.3. Einfluss von Rapamycin auf den Haarzyklus
Der Vergleich Rapamycin behandelter Mäusen mit Vehikelkontrollen zeigte in
beiden Gruppen (drei Wochen alte Tiere, Behandlung der Tiere der Gruppe
1: zwei Wochen, Gruppe 2: vier Wochen), dass der spezifische mTOR
Inhibitor Rapamycin einen Einfluss auf den Haarzyklus ausübt. Bei
unbehandelten Kontrollmäusen, das heißt ohne Verabreichung von
Rapamycin- oder Vehikellösung, verlief der Haarzyklus im Alter von drei bis
47
Ergebnisse
sieben Wochen synchron, wie vorher beschrieben. Nach einem kurzen, ca.
drei Tage andauernden Telogen um d23, traten die Haarfollikel spontan in
das Anagen ein, makroskopisch durch eine Graufärbung der Haut nach ca.
eine Woche sichtbar.
In der Gruppe 1 Vehikelkontrollen (das heißt Injektion von Vehikellösung
einmal täglich für zwei Wochen) zeigten am Ende des Versuches acht von
neun Tiere Haarwachstum (Abb. 21).
Abb. 21: Änderung der Hautfarbe nach zweiwöchiger Vehikel/Rapamycin -
Behandlung. Es wurde repräsentativ aus der Vehikelkontroll- bzw.
Rapamycin-Behandlungsgruppe je ein Tier ausgewählt und die Rückenhaut
am Anfang (d0 = 20 Tage alt) und am Ende des Versuches (d15 = 36 Tage
alt) gegenübergestellt. Die mit Rapamycin behandelten Mäuse hatten am
Ende des Experimentes keine Haare am Rücken, im Gegensatz zu denen,
die mit Vehikellösung behandelt wurden.
48
Ergebnisse
Bei einer Maus war die Haut dunkelgrau gefärbt, was auch als Zeichen für
den Eintritt der Haarfollikel ins Anagen gewertet wurde. Im Gegensatz dazu
war bei Rapamycin behandelten Mäusen kein Haarwachstum sichtbar. Bei
einem von zehn Tieren wurde keine Änderung der Hautfarbe beobachtet
(rosa), fünf zeigten eine Verfärbung nach Hellgrau und bei vier Mäusen
wurde die Haut dunkelgrau. Die histologische Analyse ergab, dass die
Haarfollikel der Vehikelkontrollen alle das späte Anagen (Anagen V-VI)
erreicht hatten, wohingegen sich die Follikel der behandelten Mäuse im
frühen und mittleren Anagen (Anagen I-IV) oder späten Anagen (Anagen V-
VI) befanden (Abb. 22).
Abb. 22: Histologische Kontrolle der Haut (H.E.-Färbung, Paraffinschnitt, 5
µm) nach zwei wöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Es wurde jeweils
49
Ergebnisse
eine repräsentative Maus aus der Vehikelkontroll- bzw. Rapamycin-
Behandlungsgruppe ausgewählt. (a) Die Haarfollikel des Tieres aus der
Vehikelgruppe sind in Anagen V-VI. Die Follikel sind bis zum M. panniculus
carnosus vorgewachsen, die innere epitheliale Wurzelscheide (IRS) ist
ausgebildet. (b) Die Haarfollikel der Maus aus der Rapamycingruppe
befinden sich in Anagen IIIa. Die Follikel sind erst gerade über die Grenze
Dermis-Subkutis getreten, die ersten Anzeichen der IRS-Bildung sind zu
beobachten. [Balken = 100 µm]
In Übereinstimmung zur optischen Beurteilung der Hautfarbe als Hinweis auf
die Haarphasen, ergab die histologische Bestimmung der prozentualen
Anteile der einzelnen Haarphasen bei den behandelten Mäusen folgende
Ergebnisse: 9,7%±9,7 für Anagen I-II, 50,3%±16,6 für Anagen III-IV und
40,0%±16,3 für Anagen V-VI (Abb. 23).
Abb. 23: Prozentuale Verteilung der Haarphasen nach zweiwöchiger
Vehikel/Rapamycin Behandlung. Bei den Tieren der Vehikelkontrollgruppe
waren alle Haarfollikel im späten Anagen (Anagen V-VI), während bei den
mit Rapamycin behandelten Tieren ein Großteil der Haarfollikel sich noch im
frühen und mittleren Anagen (Anagen I-IV) befanden.
50
Ergebnisse
In Gruppe 2 (Behandlung der Tiere für vier Wochen) kam es in der
Rapamycin-Behandlungsgruppe (n=5) zu einer verzögerten Änderung der
Hautfarbe der Tiere von rosa nach grau und dementsprechend zum
verspäteten Haarwachstum im Vergleich zu den Kontrollen (n=4) (Abb. 24).
Abb. 24: Änderung der Hautfarbe während der vierwöchigen
Vehikel/Rapamycin - Behandlung. Es wurde repräsentativ aus beiden
Gruppen je ein Tier ausgewählt und die Rückenhaut an verschiedenen
Behandlungstagen gegenübergestellt. Bei der Maus aus der
Rapamycingruppe, erfolgte das Haarwachstum etwa 7 Tage später, als bei
der Vehikelkontrolle.
Die Analyse der Hautfarbe (Tab. 1.) zeigte bei den Vehikelkontrollen eine
Änderung der Hautfarbe nach hellgrau frühestens an d11 des Versuches und
spätestens an d18. Bei den Rapamycin behandelten Tieren trat diese
Farbänderung zwischen d18 und d24 auf. Eine dunkelgraue bis schwarze
Färbung der Haut war bei den Vehikelkontrollen frühestens an d14 zu sehen,
51
Ergebnisse
bei den mit Rapamycin behandelten Mäusen deutlich später an d21. Haare
waren bei den Vehikelkontrollen erstmals an d18 sichtbar, ab d24 hatten alle
Kontrolltiere ein komplettes Fell. Bei der Rapamycingruppe war
Haarwachstum erst an d24 der Behandlung sichtbar. Am Ende des
Versuches, nach 28d Behandlung, hatten nur drei behandelte Tiere ein
komplettes Fell, zwei wiesen noch kahle Stellen auf.
Tab. 1.: Semiquantitative Auswertung der Änderung der Hautfarbe während
der vierwöchigen Vehikel/Rapamycin Behandlung. Für jede Maus aus beiden
Gruppen wurde für jeden Behandlungstag der Farbe der Rückenhaut nach
folgenden Kriterien eine Zahl zwischen 1 und 4 zugeordnet: 1 – rosa Haut, 2
– hellgraue Haut, 3 – dunkelgraue/schwarze Haut, 4 – Haut, aufgrund des
kompletten Fellwachstums nicht mehr sichtbar. Jeder Zahl wurde in der
Tabelle ein bestimmter Grauton zugeordnet.
Der Vergleich der Hautfarbe der Vehikelkontrollen der Gruppe 1 und 2
untereinander (Vehikelinjektion einmal täglich für zwei Wochen vs. vier
Wochen) zeigte an d14 deutliche Unterschiede im Haarwachstum. Während
fast alle Vehikelkontrollen der Gruppe 1 an d14 ein komplettes Fell hatten,
zeigten die Tiere der Gruppe 2 zum selben Zeitpunkt höchstens eine
Graufärbung der Rückenhaut. Diese Verzögerung im Haarwachstum konnte
52
Ergebnisse
stressbedingt entstanden sein, verursacht durch das Absetzen der Tiere des
zweiten Versuches im jüngeren Alter.
Die histologische Analyse zeigte bei den Vehikelkontrollen Haarfollikel im
Anagen, Katagen und Telogen, während bei der Behandlungsgruppe nur
Anagenfollikel (Anagen III-VI) nachweisbar waren (Abb. 25).
Abb. 25: Histologische Kontrolle der Haut (H.E. Färbung, Paraffinschnitt, 5
µm) nach vierwöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Es wurde jeweils
eine repräsentative Maus aus der Vehikelkontroll- bzw. Rapamycin-
Behandlungsgruppe ausgewählt. (a) Die Haarfollikel des Tieres aus der
53
Ergebnisse
Vehikelgruppe befinden sich in den Katagenstadien I-VI. Die Bulbi sind
schmal und es sind keine Melaningranula in der präkortikalen Region des
Haarschaftes. (b) Die Haarfollikel der Maus aus der Rapamycingruppe
befinden sich in den Anagenstadien V-VI. Die Bulbi sind sehr breit und in der
präkortikalen Region des Haarschaftes ist starke Melaninproduktion zu
beobachten. [Balken = 100 µm]
Die prozentualen Anteile der einzelnen Haarphasen bei den Kontrollen lagen
bei 50,0% für Anagen III-VI, 25,0% für Katagen I-VI, 1,8% für Katagen VII-
VIII und 23,2% für Telogen. In der Behandlungsgruppe waren alle Follikel im
mittleren bis späten Anagen (Stadien III-VI) (Abb. 26).
Abb. 26: Prozentualer Anteil der unterschiedlichen Wachstumsphasen der
Haarfollikel nach vierwöchiger Vehikel/Rapamycin Behandlung. Während alle
Haarfollikel der Mäuse der Rapamycin-Behandlungsgruppe sich noch im
mittleren bis späten Anagen (Anagen III-VI) befanden, war bei den Tieren der
Vehikelkontrollgruppe schon die Hälfte der Follikel im Katagen (Katagen I-
VIII) bis Telogen.
54
Ergebnisse
Die makroskopischen und mikroskopischen Ergebnisse deuten darauf hin,
dass die Hemmung der mTOR Aktivierung zu einer verzögerten Initiation der
Anagenphase führt. Auf den weiteren Verlauf des Haarzyklus ist kein Einfluss
erkennbar.
4.4. Der Einfluss von Bimatoprost auf die mTOR Aktivierung
4.4.1. Verteilung von p-mTOR in verschiedenen Wachstumsphasen
nach Bimatoprostbehandlung
Sowohl nach einmaliger Behandlung und nachfolgender Tötung der Tiere
nach zwei Stunden, als auch nach zweitägiger Behandlung mit Bimatoprost
waren in telogenen Follikeln nur einzelne Zellen in der „bulge region“ p-
mTOR+ (Abb. 27). Im frühen Anagen (Anagen I-II) nahm bei beiden
Behandlungsgruppen die Anzahl der p-mTOR+ Zellen in der ORS – „bulge
region“ und „secondary germ“ – zu, wohingegen in der dermalen Papille
keine p-mTOR+ Zellen nachgewiesen wurden (Abb. 27).
Im weiteren Verlauf des Anagens (Anagen III-VI) war zwei Stunden nach
einmaliger und nach zweitägiger Behandlung der überwiegende Anteil der
Zellen in der „bulge region“ p-mTOR+; die proximalen IRS-Zellen waren bis
etwa zur Hälfte zwischen Bulbus und „bulge region“ markiert. Distal von
dieser Region wurden in der IRS keine p-mTOR+ Zellen nachgewiesen. Auch
die dermale Papille sowie die übrige ORS (mit Ausnahme der „bulge region“)
zeigten keinerlei Markierung (Abb. 28).
55
Ergebnisse
Abb. 27: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
(Paraffinschnitt, 5 µm) nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung bei 30 Tage
altem Tier. Der rechte Haarfollikel ist im Telogen mit p-mTOR+ Zellen in der
„bulge region“ (schwarze Pfeile), links daneben der Follikel im frühen Anagen
(Anagen I-II) mit p-mTOR+ Zellen im ORS (schwarze Pfeilspitze). Die
dermale Papille des Anagenfollikels ist, wie bei den Kontrollen, unmarkiert
(weißer Pfeil). [Balken = 20 µm]
56
Ergebnisse
Abb. 28: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung (Paraffinschnitt, 5 µm). Alle
Haarfollikel sind im mittleren bis späten Anagen (Anagen IV-VI). Wie bei
unbehandelten Kontrollen befinden sich p-mTOR+ Zellen in der „bulge
region“ (a, weißer Pfeil) und IRS (b, Pfeilspitze). Die Markierung endet abrupt
in derselben Höhe, wie bei den Kontrollmäusen (a, b, schwarze Pfeile).
[Balken = 100 µm]
57
Ergebnisse
Im späten Katagen waren nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung die
Zellen der „bulge region“ und der ORS unterhalb der „bulge region“ p-
mTOR+, darüber hinaus traten einzelne intensiv markierte Zellen im Bereich
der dermalen Papille auf (Abb. 29).
Abb. 29: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
(Paraffinschnitt, 5 µm) nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung. Alle
Haarfollikel sind im späten Katagen (Katagen VI-VIII). Wie bei unbehandelten
Kontrollen befinden sich p-mTOR+ Zellen in der „bulge region“ (Pfeilspitze)
und der ORS unterhalb dieser Region (Pfeil). [Balken = 50 µm]
58
Ergebnisse
Die imunhistochemische Färbungen für p-mTOR zeigten sowohl nach
zweistündiger, als auch nach zweitägiger Bimatoprostbehandlung keine
Unterschiede zu den unbehandelten Kontrollen.
4.4.2. Einfluss von Rapamycin auf die Initiation des Anagens durch
Bimatoprost
Die Haarfollikel der Kontrollmäuse befanden sich ab der 8. Woche p.p. im
Telogen, makroskopisch durch rosa Haut gekennzeichnet. Nach
dreiwöchiger gleichzeitiger Gabe von Bimatoprostvehikel und
Rapamycinvehikel blieb die dorsale Haut aller elf Wochen alten Mäusen der
Vehikelkontrollgruppe (n=7) rosa. Dasselbe Ergebnis zeigte die Rapamycin
behandelte Gruppe bei zusätzlicher Gabe von Bimatoprostvehikel (n=7)
(Abb. 30).
Behandlung mit Bimatoprost bei zusätzlicher Gabe von Rapamycinvehikel
führte zur Initiation der Anagenphase. Die makroskopische Beurteilung der
Rückenhaut am Ende des Versuches zeigte ein Haarwachstum bei drei von
sieben Tieren und eine Graufärbung der Haut bei zwei Tieren; bei zwei
Mäusen wurde weder Hautverfärbung noch Haarwachstum beobachtet. Die
gleichzeitige Behandlung mit Bimatoprost und Rapamycin führte dagegen zu
einer Hemmung des Bimatoprost vermittelten Anagen induzierenden Effekts.
Bei keinem der Tiere zeigte sich Fellwachstum oder Hautfärbung (n=8).
59
Ergebnisse
Abb. 30: Fotografische Darstellung der Rückenhautfarbe von C57Bl/6
Mäusen nach 11, 14, 18, 21 Tagen Behandlung (Bilder in einer Reihe von
links nach rechts) am Beispiel eines repräsentativen Tiers aus jeder der
Gruppen. (a) – Bei den Vehikelkontrollen (Bimatoprostvehikel +
Rapamycinvehikel) blieb die Haut bis ans Ende der dreiwöchigen
Behandlung rosa. (b) - Dies war auch der Fall, wenn Tiere mit
Bimatoprostvehikel und mit Rapamycin behandelt wurden. (c) Behandlung
der Mäuse mit Bimatoprost und mit Rapamycinvehikel führte zur Induktion
der Anagenphase bei telogenen Haaren und am Ende der dreiwöchigen
Behandlung zum Haarwachstum, erkennbar an der Graufärbung der Haut.
(d) Bei der gleichzeitigen Behandlung der Tiere mit Bimatoprost und
Rapamycin trat kein sichtbarer Effekt auf. Die Haut bleibt rosa,
Haarwachstum ist nicht nachweisbar.
Die histologische Bestimmung der Haarzyklusphasen bestätigte die
makroskopischen Beobachtungen (Abb. 31).
60
Ergebnisse
Abb. 31: Histologische Schnitte, H.E.-Färbung (Paraffinschnitt, 5 µm) zur
Bestimmung der Haarphasen am Ende der dreiwöchigen Behandlung. Für
jede Gruppe wurde je ein repräsentatives Tier ausgewählt. (a) Bei den
Vehikelkontrollen ist der überwiegende Anteil der Haarfollikel im Telogen
oder frühem Anagen (Anagen I-II). (b) Dies ist auch der Fall, wenn Mäuse bei
gleichzeitiger Verabreichung von Bimatoprostvehikel mit Rapamycin
behandelt werden. (c) Die Behandlung mit Bimatoprost bei gleichzeitiger
Gabe von Rapamycinvehikel führt zur Induktion der Anagenhase. Der
61
Ergebnisse
überwiegende Anteil der Haarfollikel ist im mittleren Anagen (III-IV). Die
Haarfollikel sind bis in die Subkutis vorgewachsen, die IRS ist ausgebildet.
(d) Doppelbehandlung mit Bimatoprost und Rapamycin führte zur Hemmung
dieses Effektes. Der überwiegende Anteil der Haarfollikel ist im Telogen-
oder frühem Anagen (Anagen I-II). [Balken = 100 µm]
In der Tabelle 2. sind die Ergebnisse der histologischen Auswertung
zusammengefasst. Die Mittelwerte (±SEM) der prozentualen Anteile der
einzelnen Wachstumsphasen in den vier Gruppen sind tabellarisch und als
Grafik zusammengefasst (Abb. 32).
Tab. 2.: Zusammenfassung der histologischen Ergebnissen nach der
gleichzeitigen Behandlung acht Wochen alter Tieren mit Bimatoprostvehikel
und Rapamycinvehikel, Bimatoprostvehikel und Rapamycin, Bimatoprost und
Rapamycinvehikel, bzw. Bimatoprost und Rapamycin. Zwar sind bei allen
Tieren Haarfollikel im frühen Anagen zu sehen, aber nur nach Behandlung
mit Bimatoprost und Rapamycinvehikel treten bei allen Tieren der Gruppe
Haarfollikel im mittleren Anagen auf; telogene Follikel kommen in dieser
Gruppe nur selten vor. Bei der Doppelbehandlung mit Bimatoprost und
Rapamycin ist die Anzahl der Tiere mit Haarfollikel im mittleren Anagen
62
Ergebnisse
deutlich niedriger; bei der überwiegender Anteil der Mäuse treten telogene
Follikel auf. In den Kontrollgruppen besitzen alle Tiere Haarfollikel im
Telogen, aber kaum welche Follikel im mittleren Anagen.
Abb. 32: Grafik: Prozentuale Anteile der Wachstumsphasen der Haarfollikel
nach vier wöchiger Behandlung mit Bimatoprostvehikel und
Rapamycinvehikel [Ve(B)+Ve(R)], Bimatoprostvehikel und Rapamycin
[Ve(B)+Rap], Bimatoprost und Rapamycinvehikel [Bi+Ve(R)], bzw.
Bimatoprost und Rapamycin [Bi+Rap]. Tabelle: Prozentuale Anteile der
Haarfollikeln in verschiedenen Wachstumsphasen als Mittelwert in % ±SEM.
63
Ergebnisse
4.5. Der Einfluss von Rapamycin auf die p-mTOR-Expression
Die Verteilung von p-mTOR war im Telogen (Abb. 33) in den Nullkontrollen,
den Vehikelkontrollen, den Bimatoprost-, den Rapamycin-, und den
Bimatoprost/Rapamycin doppelbehandelten Tieren identisch.
Abb. 21.: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
(Paraffinschnitt, 5 µm) mit Haarfollikel im Telogen nach dreiwöchiger
gleichzeitiger Behandlung mit Bimatoprost und Rapamycin. p-mTOR+ Zellen
befinden sich, wie bei den unbehandelten Kontrollen, in der „bulge region“
(Pfeile). Die dermale Papille weist keine p-mTOR exprimierende Zellen auf.
[Balken = 20 µm]
Im frühen (Anagen I-II) und mittleren Anagen (Anagen III-IV) (Abb. 34 und
35) war die Verteilung von p-mTOR in allen vier Gruppen identisch, aber es
gab Unterschiede in der Intensität der Färbung. Die Zellen der „bulge region“
waren in jeder untersuchten Haarphase in allen Gruppen gleich stark
markiert. Außerhalb der „bulge region“ waren nur in den Follikeln Rapamycin
64
Ergebnisse
behandelter Tiere Unterschiede erkennbar. Zum einen war die p-mTOR
Markierung in jeder Haarphase deutlich weniger intensiv, zum anderen
waren deutlich weniger Zellen markiert. Ein ähnliches Bild ergab sich für die
Zellen des Stratum germinativum des Epithels. Im frühen Anagen waren im
Vergleich zu den übrigen Gruppen in der „secondary germ“ und der
restlichen ORS nur vereinzelte p-mTOR+ Zellen nachweisbar, die ebenso,
wie die Zellen der IRS im mittleren Anagen eine schwache Markierung
zeigten.
Abb. 34: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
(Paraffinschnitt, 5 µm) eines Tieres aus der Gruppe, die mit Bimatoprost und
Rapamycin behandelt wurde. In die frühen Anagenfollikel färben sich die
Zellen der „bulge region“ (Pfeilspitze), wie die der unbehandelten Kontrollen,
an. In der ORS sind aber, im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollen, nur
wenige Zellen sehr schwach angefärbt (Pfeile). [Balken = 50 µm]
65
Ergebnisse
Abb. 35: Immunhistochemische Darstellung von p-mTOR in der Rückenhaut
(Paraffinschnitt, 5 µm) mit Haarfollikel im mittleren Anagen nach Behandlung
mit (a) Bimatoprost und Rapamycin, bzw. (b) Bimatoprost und
Rapamycinvehikel behandelt wurde. Bei beiden sind die Zellen der „bulge
region“ (Pfeilspitzen) und der IRS (Pfeile) gefärbt. Die Intensität der Färbung
ist in der IRS bei dem mit Bimatoprost und Rapamycin behandelten Tier
deutlich geringer, als bei dem mit Bimatoprost und Rapamycinvehikel
behandelten Tier. [Balken = 50 µm]
66
Diskussion
5. Diskussion
Unsere Ergebnisse bestätigen die Befunde von Affara et al.(2), dass p-mTOR
in der „bulge region“ von telogenen Haarfollikeln vorkommt. In der
vorgelegten Arbeit wurde das erste Mal gezeigt, dass mTOR zyklusabhängig
aktiviert wird. Die Änderung des Expressionsmusters in den verschiedenen
Haarphasen weist auf eine phasenspezifische Funktion von mTOR hin.
Im Telogen war p-mTOR auf die „bulge region“ beschränkt und die
immunhistochemische Markierung blieb durch Rapamycinbehandlung
unverändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass mTOR in den Stammzellen des
Haares in einem Rapamycin-insensitiven Komplex, mTOR Complex 1
(mTORC1), vorliegt(121). Dies änderte sich bei Haaren in Anagen. In der
frühen Wachstumsphase war mTOR zusätzlich zur „bulge region“ auch in
ORS-Zellen, vor allem im Bereich des „secondary germ“´s nachzuweisen.
Diese Region zeichnet sich durch hohe Mitoseraten aus(105). Dabei handelt
es sich um proliferierende Zellen, die in der Wachstumsphase den zyklischen
Teil des Haarfollikels bilden. Dies spricht dafür, dass mTOR eine Rolle bei
der Zellproliferation hat. Eine entsprechende Funktion wird mTOR auch in
anderen Geweben zugesprochen(121). In der mittleren bis späten
Anagenphase wurde p-mTOR in der IRS nachgewiesen. Die Nachfärbung
der Paraffinschnitte mit Eosin zeigte, dass in den IRS-Zellen proximal einer
Stelle, die etwa auf der Mitte zwischen dem Bulbus und „bulge region“ liegt,
p-mTOR mit den eosinophilen Trichohyalingranula kolokalisiert war(31).
Mitosen sind in diesen Zellen eher selten zu finden, das heißt, hier spielt
mTOR für proliferative Prozesse kaum eine Rolle. Zusätzlich enthalten diese
Zellen viele Mitochondrien(82). In Zellkultur und in-vivo konnte gezeigt
werden, dass mTOR die oxidative Funktion der Mitochondrien reguliert(19, 88).
Ob mTOR für die Bildung der Trichohyalingranula eine Rolle spielt oder im
funktionellen Zusammenhang mit den Mitochondrien steht, muss weiteren
Untersuchungen vorbehalten bleiben.
67
Diskussion
Interessanterweise zeigte mTOR auch im Katagen eine hohe Aktivität. Im
Vergleich zum Anagen war das Verteilungsmuster ein völlig anderes.
Abhängig vom Katagenstadium, war p-mTOR in unterschiedlichen Regionen
der ORS nachweisbar: in frühen Stadien in Zellen der distalen ORS, im
späten Katagen in den ORS-Zellen direkt unter der „bulge region“ und am
Ende der Katagenphase in den Zellen der „bulge region“. In Katagen erfolgt
die Regression der Haarfollikel durch massive Apoptose der proximalen
epithelialen Haarfollikelzellen(49). Nach der „Prädeterminationshypothese“
von Panteleyev(73), wird der „secondary germ“ von den Zellen des unteren,
proximalen Teils der Anagenfollikel gebildet, die das Katagen überleben(11, 38,
73), und nicht von den Zellen der „bulge region“. Die ORS-Zellen, die nicht
durch Apoptose zugrunde gehen(38, 73), wandern nach distal, in Richtung zum
Epithel. Diese Zellen müssen überleben um im nächsten Haarzyklus aktiviert
werden zu können. Das hier beschriebene Expressionsmuster von p-mTOR
im Katagen könnte den Migrationsweg dieser Zellen repräsentieren. Die
Expressionsverteilung von mTOR in Haarfollikeln in den verschiedenen
Haarphasen ist nahezu identisch mit der des intestinalen Stammzellmarkers
Lgr5(40). Lgr5+ Zellen repräsentieren eine Population von Stammzellen, die im
Verlauf des Haarzyklus zyklisch von der „secondary germ“ nach unten in den
Bulbus und wieder zurück migrieren(40). Diese Zellen stellen eine andere
Population von Stammzellen dar, als die sogenannten LRC´s („label retaining
cells“)(18), die nur in der „bulge region“ vorkommen und durch niedrige
Proliferationsraten gekennzeichnet sind. Es ist bekannt, dass mTOR, als Teil
des Akt-Signalweges auch antiapoptotische Wirkung hat(9, 117). Wenn das
auch für den Haarzyklus zutrifft, könnten die Ergebnisse dieser Arbeit auf
eine mögliche protektive Funktion von p-mTOR für die Zellen, die den
späteren „secondary germ“ bilden, hindeuten, indem p-mTOR diese Zellen
während der Regressionsphase vor apoptotischen Prozessen schützt. Die
fehlende p-mTOR Expression in der „bulge region“ während des frühen und
mittleren Katagens könnte die Apoptosen erklären, die in dieser Region
vorkommen(38).
68
Diskussion
Die quantitative Bestimmung der mTOR Aktivität durch den modifizierten
ELISA-Assay bestätigte die Ergebnisse der immunhistochemischen
Untersuchungen. Die höchsten Aktivitätswerte wurden im Anagen gemessen,
die niedrigsten im Telogen.
Die Behandlung der Mäuse mit dem spezifischen mTOR Inhibitor Rapamycin
für 14 bzw. 28 Tage führte zur Hemmung des Eintrittes in den Haarzyklus.
Die regelmäßigen makroskopischen und mikroskopischen Kontrollen der
Haare am Ende der jeweiligen Versuche deuteten darauf hin, dass diese
Hemmung auf einen verzögerten Eintritt telogener Haarfollikel in die
Anagenphase zurückzuführen ist und dass damit mTOR an der zeitlichen
Determinierung der Anagen-Initiation beteiligt ist. Nach Eintritt in die
Anagenphase verlief der weitere Haarzyklus normal. Es konnten keine
morphologischen Unterschiede zu den Vehikelkontrollen beobachtet werden.
Die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen zeigten,
dass sowohl die Intensität der Immunreaktivität als auch die Anzahl der p-
mTOR+ Zellen in Anagenfollikeln bei Rapamycin behandelten Tieren deutlich
geringer war als bei den Vehikelkontrollen. Dies traf sowohl für die Zellen der
ORS, als auch die des IRS zu. Im Gegensatz hierzu war die Markierung in
der „bulge region“ durch Rapamycin unbeeinflusst. Diese Ergebnisse
unterstützen die „Prädeterminationshypothese“ von Panteleyev(73),
derzufolge der „secondary germ“ für das Follikelwachstum im Anagen eine
entscheidende Rolle spielt. Die Ursache für das unterschiedliche Verhalten
der Zellen in der „bulge region“ bzw. in der „secondary germ“ könnte darin
begründet sein, dass mTOR in den verschiedenen Regionen in
unterschiedliche Komplexe eingebunden ist. So könnte die mTOR-Wirkung in
der „secondary germ“ über den Rapamycin-sensitiven mTOR Complex 1
(mTORC1) vermittelt werden, von dem bekannt ist, dass er den zeitlichen
Ablauf des Zellwachstum beeinflusst(121). Dadurch kann mTOR den Zeitpunkt
des Eintrittes in das Anagen regulieren. In der „bulge region“ dagegen kann
mTOR an mTOR Complex 2 (mTORC2) gebunden sein, der den räumlichen
Aspekt des Zellwachstums reguliert(121).
69
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin untersucht, ob die Beeinflussung
des Haarwachstums durch Bimatoprost durch eine mTOR Aktivierung
vermittelt werden könnte.
Es wurde gezeigt, dass Bimatoprost die Initiation der Anagenphase bei
telogenen Haaren und Wimpern bei der Maus(86, 105) bewirkt. Bimatoprost
führt auch zur Verdickung und Verlängerung sowohl der Haare und Wimpern
bei der Maus(86, 105), als auch der Vellushaare der Jochbein-Region beim
Menschen(8). Die Versuche mit dem spezifischen mTOR Antagonisten
Rapamycin zeigten eine mögliche Beteiligung der mTOR Aktivierung an der
Anagen-Induktion durch Bimatoprost. Rapamycin führte zur Hemmung der
Bimatoprost-induzierten Anagen Initiation. Allerdings konnte das durch
Bimatoprost verursachte Haarwachstum durch die gleichzeitige
Verabreichung von Rapamycin nicht komplett gestoppt werden.
Die immunhistochemische Untersuchung von Haarfollikeln im Telogen und
im Anagen zeigte zwei Stunden nach einmaliger und nach zweitägiger
Bimatoprostbehandlung weder in der Intensität noch in der Verteilung der p-
mTOR Markierung einen Unterschied zu unbehandelten Kontrolltieren.
Wenn die Wirkung von Bimatoprost über eine Aktivierung von mTOR
vermittelt wird, ist es wahrscheinlich, dass diese erst zu einem späteren
Zeitpunkt erfolgt. Auch dieser Teil der Befunde lässt die Möglichkeit offen,
dass die das Haarwachstum fördernde Wirkung von Bimatoprost mTOR
unabhängig erfolgt.
Zum Wirkmechanismus von Bimatoprost wird angenommen, dass es an
Bimatoprost Rezeptor bindet(48). Die weiteren Signalwege sollen ähnlich, wie
bei dem FP Rezeptor sein, da Bimatoprost denselben Effekt hat wie PGF2α.
In der vorgelegten Arbeit wurde gezeigt, dass mTOR die Anagen Initiation
beeinflusst. Für die Initiation des Anagens und die Aufrechterhaltung der
Wachstumsphase sind auch andere Signalwege, wie zum Beispiel NF-κB,
von Bedeutung. So wurde zum Beispiel vor kurzem gezeigt, dass bei TAK1
(transforming growth factor beta activated kinase 1) defizienten Mäusen die
Haarfollikeln später aus dem Telogen in das Anagen übertreten und auch die
70
Diskussion
Anagen – Katagen - Transition früher erfolgt(87). Zum jetzigen Zeitpunkt ist
die Frage, ob diese Signalwege sich gegenseitig beeinflussen, und wenn ja,
wie das exakte Verhältnis zwischen der einzelnen Signalmolekülen ist, nicht
eindeutig zu beantworten. Ob mTOR, TAK1 oder andere derzeit nicht
bekannte Mechanismen bei der Vermittlung des Bimatoprosteffektes auf das
Haarwachstum eine Rolle spielen, muss in weiteren Studien untersucht
werden.
Zusammenfassend wurde in der vorgelegten Arbeit das erste Mal gezeigt,
dass aktiviertes mTOR in die Regulation des Haarzyklus involviert ist, und
dass die mTOR Aktivierung und infolgedessen das Follikelwachstum durch
Rapamycin gehemmt wird. Die Funktion von p-mTOR in den verschiedenen
Haarphasen umfassen 1. Initiation des Haarzyklus im Telogen, 2.
Zellproliferation im ORS und eventuell Beeinflussung der
Trichohyalinsynthese oder Mitochondrienfunktion der IRS im Anagen, sowie
3. antiapoptotische Wirkung während der Katagenphase. Darüber hinaus
konnte gezeigt werden, dass der Anagen initiierende Effekt von Bimatoprost
durch den spezifischen mTOR Inhibitor Rapamycin gehemmt wird, was
bedeutet, dass eine Beteiligung von mTOR an der Haarwachstum
induzierenden Wirkung von Bimatoprost möglich ist.
71
Literaturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
1. Adams JW, Migita DS, Yu MK, Young R, Hellickson MS, Castro-Vargas FE, Domingo JD, Lee PH, Bui JS, and Henderson SA. Prostaglandin F2 alpha stimulates hypertrophic growth of cultured neonatal rat ventricular myocytes. J Biol Chem 271: 1179-1186, 1996. 2. Affara NI, Trempus CS, Schanbacher BL, Pei P, Mallery SR, Bauer JA, and Robertson FM. Activation of Akt and mTOR in CD34+/K15+ keratinocyte stem cells and skin tumors during multi-stage mouse skin carcinogenesis. Anticancer Res 26: 2805-2820, 2006. 3. Alonso L, and Fuchs E. The hair cycle. J Cell Sci 119: 391-393, 2006. 4. Arvisais EW, Romanelli A, Hou X, and Davis JS. AKT-independent phosphorylation of TSC2 and activation of mTOR and ribosomal protein S6 kinase signaling by prostaglandin F2alpha. J Biol Chem 281: 26904-26913, 2006. 5. Bosotti R, Isacchi A, and Sonnhammer EL. FAT: a novel domain in PIK-related kinases. Trends Biochem Sci 25: 225-227, 2000. 6. Brown EJ, Albers MW, Shin TB, Ichikawa K, Keith CT, Lane WS, and Schreiber SL. A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex. Nature 369: 756-758, 1994. 7. Carraway H, and Hidalgo M. New targets for therapy in breast cancer: mammalian target of rapamycin (mTOR) antagonists. Breast Cancer Res 6: 219-224, 2004. 8. Centofanti M, Oddone F, Chimenti S, Tanga L, Citarella L, and Manni G. Prevention of dermatologic side effects of bimatoprost 0.03% topical therapy. Am J Ophthalmol 142: 1059-1060, 2006. 9. Chan TO, Rittenhouse SE, and Tsichlis PN. AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annu Rev Biochem 68: 965-1014, 1999. 10. Chase HB. Growth of the hair. Physiol Rev 34: 113-126, 1954. 11. Chase HB, Rauch R, and Smith VW. Critical stages of hair development and pigmentation in the mouse. Physiol Zool 24: 1-8, 1951. 12. Chazov EI, Pomoinetsky VD, Geling NG, Orlova TR, Nekrasova AA, and Smirnov VN. Heart adaptation to acute pressure overload: an involvement of endogenous prostaglandins. Circ Res 45: 205-211, 1979. 13. Chen C, Liu Y, Liu R, Ikenoue T, Guan KL, and Zheng P. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. J Exp Med 205: 2397-2408, 2008. 14. Chen DB, Westfall SD, Fong HW, Roberson MS, and Davis JS. Prostaglandin F2alpha stimulates the Raf/MEK1/mitogen-activated protein kinase signaling cascade in bovine luteal cells. Endocrinology 139: 3876-3885, 1998. 15. Chen Y, Chen H, Rhoad AE, Warner L, Caggiano TJ, Failli A, Zhang H, Hsiao CL, Nakanishi K, and Molnar-Kimber KL. A putative sirolimus (rapamycin) effector protein. Biochem Biophys Res Commun 203: 1-7, 1994.
72
Literaturverzeichnis
16. Chiu MI, Katz H, and Berlin V. RAPT1, a mammalian homolog of yeast Tor, interacts with the FKBP12/rapamycin complex. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 12574-12578, 1994. 17. Cohen JL. From Serendipity to Pilot Study and Then Pivotal Trial: Bimatoprost Topical for Eyelash Growth. Dermatol Surg 2010. 18. Cotsarelis G, Sun TT, and Lavker RM. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell 61: 1329-1337, 1990. 19. Cunningham JT, Rodgers JT, Arlow DH, Vazquez F, Mootha VK, and Puigserver P. mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha transcriptional complex. Nature 450: 736-740, 2007. 20. Davis JS, Weakland LL, Weiland DA, Farese RV, and West LA. Prostaglandin F2 alpha stimulates phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate hydrolysis and mobilizes intracellular Ca2+ in bovine luteal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 3728-3732, 1987. 21. Donnelly MT, Goddard AF, Filipowicz B, Morant SV, Shield MJ, and Hawkey CJ. Low-dose misoprostol for the prevention of low-dose aspirin-induced gastroduodenal injury. Aliment Pharmacol Ther 14: 529-534, 2000. 22. Dry FW. The coat of the mouse (Mus Musculus). Journal of Genetics 16: 287-340, 1926. 23. Frenkel RE, Frenkel M, and Toler A. Pharmacoeconomic analysis of prostaglandin and prostamide therapy for patients with glaucoma or ocular hypertension. BMC Ophthalmol 7: 16, 2007. 24. Funk CD. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science 294: 1871-1875, 2001. 25. Fuse N. Genetic bases for glaucoma. Tohoku J Exp Med 221: 1-10, 2010. 26. Gandolfi S, Simmons ST, Sturm R, Chen K, and VanDenburgh AM. Three-month comparison of bimatoprost and latanoprost in patients with glaucoma and ocular hypertension. Adv Ther 18: 110-121, 2001. 27. Gryglewski RJ. Prostacyclin among prostanoids. Pharmacol Rep 60: 3-11, 2008. 28. Gulati P, and Thomas G. Nutrient sensing in the mTOR/S6K1 signalling pathway. Biochem Soc Trans 35: 236-238, 2007. 29. Hakeda Y, Shiokawa M, Mano H, Kameda T, Raisz LG, and Kumegawa M. Prostaglandin F2alpha stimulates tyrosine phosphorylation and mitogen-activated protein kinase in osteoblastic MC3T3-E1 cells via protein kinase C activation. Endocrinology 138: 1821-1828, 1997. 30. Hara K, Yonezawa K, Weng QP, Kozlowski MT, Belham C, and Avruch J. Amino acid sufficiency and mTOR regulate p70 S6 kinase and eIF-4E BP1 through a common effector mechanism. J Biol Chem 273: 14484-14494, 1998. 31. Hardy MH. The histochemistry of hair follicles in the mouse. Am J Anat 90: 285-337, 1952. 32. Hasty P. Rapamycin: the cure for all that ails. J Mol Cell Biol 2: 17-19, 2010. 33. Hawkey CJ, Karrasch JA, Szczepanski L, Walker DG, Barkun A, Swannell AJ, and Yeomans ND. Omeprazole compared with misoprostol for
73
Literaturverzeichnis
ulcers associated with nonsteroidal antiinflammatory drugs. Omeprazole versus Misoprostol for NSAID-induced Ulcer Management (OMNIUM) Study Group. N Engl J Med 338: 727-734, 1998. 34. Heidrich H. [Vasoactive agents and prostanoids in the therapy of PAD: facts, questions, disproven assumptions]. Hamostaseologie 26: 220-223, 2006. 35. Heitman J, Movva NR, and Hall MN. Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast. Science 253: 905-909, 1991. 36. Higginbotham EJ, Schuman JS, Goldberg I, Gross RL, VanDenburgh AM, Chen K, and Whitcup SM. One-year, randomized study comparing bimatoprost and timolol in glaucoma and ocular hypertension. Arch Ophthalmol 120: 1286-1293, 2002. 37. Ishida N, Odani-Kawabata N, Shimazaki A, and Hara H. Prostanoids in the therapy of glaucoma. Cardiovasc Drug Rev 24: 1-10, 2006. 38. Ito M, Kizawa K, Hamada K, and Cotsarelis G. Hair follicle stem cells in the lower bulge form the secondary germ, a biochemically distinct but functionally equivalent progenitor cell population, at the termination of catagen. Differentiation 72: 548-557, 2004. 39. Jacinto E, Loewith R, Schmidt A, Lin S, Ruegg MA, Hall A, and Hall MN. Mammalian TOR complex 2 controls the actin cytoskeleton and is rapamycin insensitive. Nat Cell Biol 6: 1122-1128, 2004. 40. Jaks V, Barker N, Kasper M, van Es JH, Snippert HJ, Clevers H, and Toftgard R. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet 40: 1291-1299, 2008. 41. Johnstone MA, and Albert DM. Prostaglandin-induced hair growth. Surv Ophthalmol 47 Suppl 1: S185-202, 2002. 42. Katz LJ, Cohen JS, Batoosingh AL, Felix C, Shu V, and Schiffman RM. Twelve-month, randomized, controlled trial of bimatoprost 0.01%, 0.0125%, and 0.03% in patients with glaucoma or ocular hypertension. Am J Ophthalmol 149: 661-671 e661, 2010. 43. Keith CT, and Schreiber SL. PIK-related kinases: DNA repair, recombination, and cell cycle checkpoints. Science 270: 50-51, 1995. 44. Kligman AM. The human hair cycle. J Invest Dermatol 33: 307-316, 1959. 45. Kwiatkowski DJ, and Manning BD. Tuberous sclerosis: a GAP at the crossroads of multiple signaling pathways. Hum Mol Genet 14 Spec No. 2: R251-258, 2005. 46. Lai J, Jin H, Yang R, Winer J, Li W, Yen R, King KL, Zeigler F, Ko A, Cheng J, Bunting S, and Paoni NF. Prostaglandin F2 alpha induces cardiac myocyte hypertrophy in vitro and cardiac growth in vivo. Am J Physiol 271: H2197-2208, 1996. 47. Law SK. Bimatoprost in the treatment of eyelash hypotrichosis. Clin Ophthalmol 4: 349-358, 2010. 48. Liang Y, Woodward DF, Guzman VM, Li C, Scott DF, Wang JW, Wheeler LA, Garst ME, Landsverk K, Sachs G, Krauss AH, Cornell C, Martos J, Pettit S, and Fliri H. Identification and pharmacological characterization of the prostaglandin FP receptor and FP receptor variant complexes. Br J Pharmacol 154: 1079-1093, 2008.
74
Literaturverzeichnis
49. Lindner G, Botchkarev VA, Botchkareva NV, Ling G, van der Veen C, and Paus R. Analysis of apoptosis during hair follicle regression (catagen). Am J Pathol 151: 1601-1617, 1997. 50. Long X, Muller F, and Avruch J. TOR action in mammalian cells and in Caenorhabditis elegans (Abstract). Curr Top Microbiol Immunol 279: 115-138, 2004. 51. Lutjen-Drecoll E, and Kaufman PL. Morphological changes in primate aqueous humor formation and drainage tissues after long-term treatment with antiglaucomatous drugs. J Glaucoma 2: 316-328, 1993. 52. Lutjen-Drecoll E, and Tamm E. The effects of ocular hypotensive doses of PGF2 alpha-isopropylester on anterior segment morphology. Prog Clin Biol Res 312: 437-446, 1989. 53. Lutjen-Drecoll E, and Tamm E. Morphological study of the anterior segment of cynomolgus monkey eyes following treatment with prostaglandin F2 alpha. Exp Eye Res 47: 761-769, 1988. 54. Magerl M, Tobin DJ, Muller-Rover S, Hagen E, Lindner G, McKay IA, and Paus R. Patterns of proliferation and apoptosis during murine hair follicle morphogenesis. J Invest Dermatol 116: 947-955, 2001. 55. Martin DE, and Hall MN. The expanding TOR signaling network. Curr Opin Cell Biol 17: 158-166, 2005. 56. Menand B, Desnos T, Nussaume L, Berger F, Bouchez D, Meyer C, and Robaglia C. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 6422-6427, 2002. 57. Miwa K, Matsubara T, Uno Y, Yasuda T, Sakata K, Tsuda T, and Kanaya H. Combination therapy with oral sildenafil and beraprost for pulmonary arterial hypertension associated with CREST syndrome. Int Heart J 48: 417-422, 2007. 58. Muller-Rover S, Handjiski B, van der Veen C, Eichmuller S, Foitzik K, McKay IA, Stenn KS, and Paus R. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol 117: 3-15, 2001. 59. Murakami M, Ichisaka T, Maeda M, Oshiro N, Hara K, Edenhofer F, Kiyama H, Yonezawa K, and Yamanaka S. mTOR is essential for growth and proliferation in early mouse embryos and embryonic stem cells. Mol Cell Biol 24: 6710-6718, 2004. 60. Nakamura M, Sundberg JP, and Paus R. Mutant laboratory mice with abnormalities in hair follicle morphogenesis, cycling, and/or structure: annotated tables. Exp Dermatol 10: 369-390, 2001. 61. Nakano J. Relationship between the chemical structure of prostaglandins and their vasoactivities in dogs. Br J Pharmac 44: 63-70, 1972. 62. Nave BT, Ouwens M, Withers DJ, Alessi DR, and Shepherd PR. Mammalian target of rapamycin is a direct target for protein kinase B: identification of a convergence point for opposing effects of insulin and amino-acid deficiency on protein translation. Biochem J 344 Pt 2: 427-431, 1999. 63. Nicholson JM, Yeager DL, and Macones G. A preventive approach to obstetric care in a rural hospital: association between higher rates of
75
Literaturverzeichnis
preventive labor induction and lower rates of cesarean delivery. Ann Fam Med 5: 310-319, 2007. 64. Nobukuni T, Joaquin M, Roccio M, Dann SG, Kim SY, Gulati P, Byfield MP, Backer JM, Natt F, Bos JL, Zwartkruis FJ, and Thomas G. Amino acids mediate mTOR/raptor signaling through activation of class 3 phosphatidylinositol 3OH-kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14238-14243, 2005. 65. Noecker RJ, Earl ML, Mundorf T, Peace J, and Williams RD. Bimatoprost 0.03% versus travoprost 0.004% in black Americans with glaucoma or ocular hypertension. Adv Ther 20: 121-128, 2003. 66. Noecker RS, Dirks MS, Choplin NT, Bernstein P, Batoosingh AL, and Whitcup SM. A six-month randomized clinical trial comparing the intraocular pressure-lowering efficacy of bimatoprost and latanoprost in patients with ocular hypertension or glaucoma. Am J Ophthalmol 135: 55-63, 2003. 67. Oh DJ, Martin JL, Williams AJ, Peck RE, Pokorny C, Russell P, Birk DE, and Rhee DJ. Analysis of expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human ciliary body after latanoprost. Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 953-963, 2006. 68. Oh DJ, Martin JL, Williams AJ, Russell P, Birk DE, and Rhee DJ. Effect of latanoprost on the expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 3887-3895, 2006. 69. Oldham S, Montagne J, Radimerski T, Thomas G, and Hafen E. Genetic and biochemical characterization of dTOR, the Drosophila homolog of the target of rapamycin. Genes Dev 14: 2689-2694, 2000. 70. Olschewski H, Walmrath D, Schermuly R, Ghofrani A, Grimminger F, and Seeger W. Aerosolized prostacyclin and iloprost in severe pulmonary hypertension. Ann Intern Med 124: 820-824, 1996. 71. Orwin DF, Chase HB, and Silver AF. Catagen in the hairless house mouse. Am J Anat 121: 489-507, 1967. 72. Pandis GK, Papageorghiou AT, Otigbah CM, Howard RJ, and Nicolaides KH. Randomized study of vaginal misoprostol (PGE(1)) and dinoprostone gel (PGE(2)) for induction of labor at term. Ultrasound Obstet Gynecol 18: 629-635, 2001. 73. Panteleyev AA, Jahoda CA, and Christiano AM. Hair follicle predetermination. J Cell Sci 114: 3419-3431, 2001. 74. Panteleyev AA, van der Veen C, Rosenbach T, Muller-Rover S, Sokolov VE, and Paus R. Towards defining the pathogenesis of the hairless phenotype. J Invest Dermatol 110: 902-907, 1998. 75. Paus R, and Cotsarelis G. The biology of hair follicles. N Engl J Med 341: 491-497, 1999. 76. Paus R, Muller-Rover S, Van Der Veen C, Maurer M, Eichmuller S, Ling G, Hofmann U, Foitzik K, Mecklenburg L, and Handjiski B. A comprehensive guide for the recognition and classification of distinct stages of hair follicle morphogenesis. J Invest Dermatol 113: 523-532, 1999. 77. Paus R, Stenn KS, and Link RE. Telogen skin contains an inhibitor of hair growth. Br J Dermatol 122: 777-784, 1990.
76
Literaturverzeichnis
78. Perry J, and Kleckner N. The ATRs, ATMs, and TORs are giant HEAT repeat proteins. Cell 112: 151-155, 2003. 79. Phung TL, Eyiah-Mensah G, O'Donnell RK, Bieniek R, Shechter S, Walsh K, Kuperwasser C, and Benjamin LE. Endothelial Akt signaling is rate-limiting for rapamycin inhibition of mouse mammary tumor progression. Cancer Res 67: 5070-5075, 2007. 80. Raught B, Gingras AC, and Sonenberg N. The target of rapamycin (TOR) proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 7037-7044, 2001. 81. Rice KM, Uddemarri S, Desai DH, Morrison RG, Harris R, Wright GL, and Blough ER. PGF2alpha-associated vascular smooth muscle hypertrophy is ROS dependent and involves the activation of mTOR, p70S6k, and PTEN. Prostaglandins Other Lipid Mediat 85: 49-57, 2008. 82. Rogers GE. Some aspects of the structure of the inner root sheath of hair follicles revealed by light and electron microscopy. Exp Cell Res 14: 378-387, 1958. 83. Rohen JW, Lütjen-Drecoll, E. Funktionelle Histologie. Stuttgart: F. K. Schattauer Verlagsgesellschaft mbH, 2000, p. 1-500. 84. Sabatini DM, Erdjument-Bromage H, Lui M, Tempst P, and Snyder SH. RAFT1: a mammalian protein that binds to FKBP12 in a rapamycin-dependent fashion and is homologous to yeast TORs. Cell 78: 35-43, 1994. 85. Sabers CJ, Martin MM, Brunn GJ, Williams JM, Dumont FJ, Wiederrecht G, and Abraham RT. Isolation of a protein target of the FKBP12-rapamycin complex in mammalian cells. J Biol Chem 270: 815-822, 1995. 86. Sasaki S, Hozumi Y, and Kondo S. Influence of prostaglandin F2alpha and its analogues on hair regrowth and follicular melanogenesis in a murine model. Exp Dermatol 14: 323-328, 2005. 87. Sayama K, Kajiya K, Sugawara K, Sato S, Hirakawa S, Shirakata Y, Hanakawa Y, Dai X, Ishimatsu-Tsuji Y, Metzger D, Chambon P, Akira S, Paus R, Kishimoto J, and Hashimoto K. Inflammatory mediator TAK1 regulates hair follicle morphogenesis and anagen induction shown by using keratinocyte-specific TAK1-deficient mice. PLoS One 5: e11275, 2010. 88. Schieke SM, Phillips D, McCoy JP, Jr., Aponte AM, Shen RF, Balaban RS, and Finkel T. The mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway regulates mitochondrial oxygen consumption and oxidative capacity. J Biol Chem 281: 27643-27652, 2006. 89. Schlote T. [Side-effects and risk profile of latanoprost 0.005% (Xalatan)]. Ophthalmologe 99: 724-729, 2002. 90. Schmelzle T, and Hall MN. TOR, a central controller of cell growth. Cell 103: 253-262, 2000. 91. Schmidt-Ullrich R, and Paus R. Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis. Bioessays 27: 247-261, 2005. 92. Schoenfeld P, Kimmey MB, Scheiman J, Bjorkman D, and Laine L. Review article: nonsteroidal anti-inflammatory drug-associated gastrointestinal complications--guidelines for prevention and treatment. Aliment Pharmacol Ther 13: 1273-1285, 1999. 93. Shaikh MY, and Bodla AA. Hypertrichosis of the eyelashes from prostaglandin analog use: a blessing or a bother to the patient? J Ocul Pharmacol Ther 22: 76-77, 2006.
77
Literaturverzeichnis
94. Slominski A, Paus R, and Costantino R. Differential expression and activity of melanogenesis-related proteins during induced hair growth in mice. J Invest Dermatol 96: 172-179, 1991. 95. Slominski A, Paus R, Plonka P, Chakraborty A, Maurer M, Pruski D, and Lukiewicz S. Melanogenesis during the anagen-catagen-telogen transformation of the murine hair cycle. J Invest Dermatol 102: 862-869, 1994. 96. Smid SD. Role of prostaglandins and specific place in therapy of bimatoprost in the treatment of elevated intraocular pressure and ocular hypertension: A closer look at the agonist properties of bimatoprost and the prostamides. Clin Ophthalmol 3: 663-670, 2009. 97. Smith WL, DeWitt DL, and Garavito RM. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology. Annu Rev Biochem 69: 145-182, 2000. 98. Smith WL, Marnett LJ, and DeWitt DL. Prostaglandin and thromboxane biosynthesis. Pharmacol Ther 49: 153-179, 1991. 99. Stenn KS, and Paus R. Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev 81: 449-494, 2001. 100. Stenn KS, and Paus R. What controls hair follicle cycling? Exp Dermatol 8: 229-233; discussion 233-226, 1999. 101. Straile WE, Chase HB, and Arsenault C. Growth and differentiation of hair follicles between periods of activity and quiescence. J Exp Zool 148: 205-221, 1961. 102. Sundberg JP, Peters EM, and Paus R. Analysis of hair follicles in mutant laboratory mice. J Investig Dermatol Symp Proc 10: 264-270, 2005. 103. Tamm E, Rittig M, and Lutjen-Drecoll E. [Electron microscopy and immunohistochemical studies of the intraocular pressure lowering effect of prostaglandin F2 alpha]. Fortschr Ophthalmol 87: 623-629, 1990. 104. Tang X, Wang L, Proud CG, and Downes CP. Muscarinic receptor-mediated activation of p70 S6 kinase 1 (S6K1) in 1321N1 astrocytoma cells: permissive role of phosphoinositide 3-kinase. Biochem J 374: 137-143, 2003. 105. Tauchi M, Fuchs TA, Kellenberger AJ, Woodward DF, Paus R, and Lutjen-Drecoll E. Characterization of an in vivo model for the study of eyelash biology and trichomegaly: mouse eyelash morphology, development, growth cycle, and anagen prolongation by bimatoprost. Br J Dermatol 2010. 106. Tee AR, Manning BD, Roux PP, Cantley LC, and Blenis J. Tuberous sclerosis complex gene products, Tuberin and Hamartin, control mTOR signaling by acting as a GTPase-activating protein complex toward Rheb. Curr Biol 13: 1259-1268, 2003. 107. The_Jackson_Laboratory. Alopecia (loss of hair) in C57BL/6J and Related Strains. Jax Notes 1-2, 1987. 108. Tokunaga C, Yoshino K, and Yonezawa K. mTOR integrates amino acid- and energy-sensing pathways. Biochem Biophys Res Commun 313: 443-446, 2004. 109. Torley HI, Madhok R, Capell HA, Brouwer RM, Maddison PJ, Black CM, Englert H, Dormandy JA, and Watson HR. A double blind, randomised, multicentre comparison of two doses of intravenous iloprost in the treatment of Raynaud's phenomenon secondary to connective tissue diseases. Ann Rheum Dis 50: 800-804, 1991.
78
Literaturverzeichnis
110. Tosti A, Pazzaglia M, Voudouris S, and Tosti G. Hypertrichosis of the eyelashes caused by bimatoprost. J Am Acad Dermatol 51: S149-150, 2004. 111. Uldbjerg N, Ekman G, Malmstrom A, Sporrong B, Ulmsten U, and Wingerup L. Biochemical and morphological changes of human cervix after local application of prostaglandin E2 in pregnancy. Lancet 1: 267-268, 1981. 112. Vandenburgh HH, Hatfaludy S, Sohar I, and Shansky J. Stretch-induced prostaglandins and protein turnover in cultured skeletal muscle. Am J Physiol 259: C232-240, 1990. 113. Wang X, Campbell LE, Miller CM, and Proud CG. Amino acid availability regulates p70 S6 kinase and multiple translation factors. Biochem J 334 ( Pt 1): 261-267, 1998. 114. Weinberg WC, Goodman LV, George C, Morgan DL, Ledbetter S, Yuspa SH, and Lichti U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J Invest Dermatol 100: 229-236, 1993. 115. Weinreb RN, Lindsey JD, Marchenko G, Marchenko N, Angert M, and Strongin A. Prostaglandin FP agonists alter metalloproteinase gene expression in sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 4368-4377, 2004. 116. Weinreb RN, Toris CB, Gabelt BT, Lindsey JD, and Kaufman PL. Effects of prostaglandins on the aqueous humor outflow pathways. Surv Ophthalmol 47 Suppl 1: S53-64, 2002. 117. Wendel HG, De Stanchina E, Fridman JS, Malina A, Ray S, Kogan S, Cordon-Cardo C, Pelletier J, and Lowe SW. Survival signalling by Akt and eIF4E in oncogenesis and cancer therapy. Nature 428: 332-337, 2004. 118. Woodward DF, Krauss AH, Chen J, Lai RK, Spada CS, Burk RM, Andrews SW, Shi L, Liang Y, Kedzie KM, Chen R, Gil DW, Kharlamb A, Archeampong A, Ling J, Madhu C, Ni J, Rix P, Usansky J, Usansky H, Weber A, Welty D, Yang W, Tang-Liu DD, Garst ME, Brar B, Wheeler LA, and Kaplan LJ. The pharmacology of bimatoprost (Lumigan). Surv Ophthalmol 45 Suppl 4: S337-345, 2001. 119. Woodward DF, Liang Y, and Krauss AH. Prostamides (prostaglandin-ethanolamides) and their pharmacology. Br J Pharmacol 153: 410-419, 2008. 120. Woodward JA, Haggerty CJ, Stinnett SS, and Williams ZY. Bimatoprost 0.03% gel for cosmetic eyelash growth and enhancement. J Cosmet Dermatol 9: 96-102, 2010. 121. Wullschleger S, Loewith R, and Hall MN. TOR signaling in growth and metabolism. Cell 124: 471-484, 2006. 122. Yoelin S, Walt JG, and Earl M. Safety, Effectiveness, and Subjective Experience with Topical Bimatoprost 0.03% for Eyelash Growth. Dermatol Surg 2010. 123. Young RD. Morphological and ultrastructural aspects of the dermal papilla during the growth cycle of the vibrissal follicle in the rat. J Anat 131: 355-365, 1980. 124. Zhang H, Stallock JP, Ng JC, Reinhard C, and Neufeld TP. Regulation of cellular growth by the Drosophila target of rapamycin dTOR. Genes Dev 14: 2712-2724, 2000.
79
Abkürzungsverzeichnis
7. Abkürzungsverzeichnis
4EBP1 eIF4E-Bindungsprotein
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Komplex
AS Aminosäure
ATP Adenosin-5´-triphosphat
α Anti-
Bi Bimatoprost
bzw. Beziehungsweise
C Kohlenstoff
°C Grad Celsius
ca. Circa
Ca2+ Kalcium Ion
cAMP cyclisches Adenosin-5´-monophosphat
cm Zentimeter
COX Cyclooxygenase
d Tag
d.h. das heißt
DP dermale Papille
eIF4E eukaryotischer Initiationsfaktor 4E
ELISA Enzyme-linked immuno sorbent Assay
EP Prostaglandin E Rezeptor
FKBP12 FK506-binding protein 12 kDa
FP Prostaglandin F-Rezeptor
FRB FKBP12 rapamycin binding
80
Abkürzungsverzeichnis
g Gramm
GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor
GST Glutathion-S-Transferase
h Stunde
H.E. Hämatoxylin-Eosin
HRP Merrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase)
HS Haarschaft
IRS innere epitheliale Wurzelscheide (inner root sheath)
kDa Kilodalton
M Molar
m.a. Mittelwert (mean average)
mM Millimolar
M. Musculus
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
mRNA messenger RNA
mTOR mammalian Target of Rapamycin
mTOR+ mTOR positiv
mTORC mTOR complex
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
81
Abkürzungsverzeichnis
nm Nanometer
OH- Hydroxyl-
ORS äußere epitheliale Wurzelscheide (outer root sheath)
p70S6K 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1
PDK1 3´-Phosphoinisitid abhängige Proteinkinase
PEG-400 Polyethylenglykol 400
PFA Paraformaldehyd
PG Prostaglandine
PGE Prostaglandin E
PGF Prostaglandin F
PGHS Prostaglandin H-Synthase
PI3K Phosphoinositid 3-Kinase
PI4K Phosphoinositid 4-Kinase
PMSF Phenylmethansulfonylfluorid
Pol. Polymerase
p.p. post partum
Rap Rapamycin
RNA Ribonukleinsäure
rpm Umdrehungen (rotation per minute)
rRNA ribosomale RNA
S Svedberg
S6K1 70 kDa ribosomalen Protein S6-Proteinkinase 1
SEM Standard error of the mean
Ser Serin
Tab. Tabelle
TBS tris buffered saline
82
Abkürzungsverzeichnis
TBST TBS mit 0,1% Tween 20
Thr Threonin
TM trade mark
TMB Tetramethylbenzidin
TOR Target of Rapamycin
tRNA transfer RNA
TSC2 Tuberous sclerosis complex 2
Tx Thromboxan
usw. und so weiter
Ve Vehikel
Ve(B) Vehikel für Bimatoprost
Ve(R) Vehikel für Rapamycin
vs. versus
83
Vorveröffentlichungen
8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
E.R. Tamm, A. Kellenberger (2008). Aqueous Humor Dynamics and
Trabecular Meshwork. In: Eye, Retina, and Visual System of the Mouse. III
Organization of the Adult Mouse Eye and Central Visual System (Eds.
Chalupa L.M., Williams R.W.). MIT Press, p. 129-33.
M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll
(2009). “Murine eyelashes as a study model for hypertrichosis or alopecia of
eyelashes”. The 14th Annual Meeting of European Hair Research Society,
Graz, Austria.
M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll
(2009). “Murine eyelashes as a study model for hypertrichosis or alopecia of
eyelashes”. The Society of Investigational Dermatology, annual meeting,
Montreal, Canada.
M.Tauchi, T.A. Fuchs, A. J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E.
Lütjen-Drecoll (2010). “Caracterisation of an in vivo model for the study of
eyelash biology and trichomegaly: mouse eyelash morphology, development,
growth cycle and anagen prolongation by bimatoprost.” British Journal of
Dermatology
M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E.
Lütjen-Drecoll (2010). “Characterization of an in vivo-model for the study of
eyelash biology.” The 6th World Congress for Hair Research, Cairns,
Australia
84
Vorveröffentlichungen
M. Tauchi, A.J. Kellenberger. „The involvement of mTOR signaling
activation in the murine hair cycle.“ (in Vorbereitung).
85
Danksagung
9. Danksagung
Mein größter Dank gilt Frau Prof. Dr. E. Lütjen-Drecoll für die Vergabe des
Themas, die Betreuung und außerordentliche Unterstützung bei der Arbeit.
Ich danke ihr für die jederzeit gewährte Hilfe und ihr Engagement, die diese
Arbeit ermöglicht haben, sowie für die Übernahme des Erstgutachtens.
Meinen besonderen Dank möchte ich Frau Dr. med. vet. Dr. rer. nat. M.
Tauchi widmen für die intensive und freundschaftliche Betreuung während
der gesamten Zeit, ihre Hilfe und die kritischen und konstruktiven
Diskussionen bezüglich meiner Arbeit.
Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. M. Eichhorn für die Bereitschaft diese
Arbeit zu korrigieren und für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Herrn Dr. M.T. Birke gebührt mein großer Dank für das Korrekturlesen der
Arbeit und seine vielfältige Hilfe sowohl bei wissenschaftlichen wie auch
technischen Fragen.
Ich danke den früheren und jetzigen Mitarbeiter des histologischen und
elektronenmikroskopischen Labors für ihre freundliche und kompetente
technische Unterstützung, wobei ich mich an dieser Stelle besonders bei
Frau H. Nguyen und G. Link bedanke.
Außerdem danke ich Herrn J. Pekarsky für die Hilfe bei Erstellung der
Zeichnungen.
Ich danke Herrn Prof. Dr. F. Paulsen, dass er mich nach Übernahme des
Lehrstuhls großzügig und hilfsbereit bei der Fertigstellung dieser Arbeit
unterstützte.
Ich danke Herrn Prof. Dr. E.R. Tamm für das mir entgegengebrachten
Vertrauen und dafür, dass er mir den Anstoß für meine wissenschaftliche
Laufbahn gegeben hat.
Allen Mitgliedern des Lehrstuhles Anatomie 2 möchte ich für die
Freundlichkeit, Hilfsbereitschaft und nicht zuletzt für die gute
Arbeitsatmosphäre danken.
Zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie, insbesondere bei meinen
Kindern bedanken, die immer für mich da waren. Ihre Liebe und ihre
86
Danksagung
Unterstützung haben mich durch jede Lebenslage sicher geführt und mir den
nötigen Rückhalt gegeben.
87
Lebenslauf
10. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Antonia Judit Kellenberger, Dipl.-Ing. univ.
Geburtsdatum 22. Januar 1968
Geburtsort Sathmar (Satu-Mare), Rumänien
Staatsangehörigkeit deutsch
Familienstand verheiratet, seit 12.08.1989
Ehemann Atila Alfred Kellenberger, Dipl.-Ing. Maschinenbau
Kinder Patrick Kellenberger, 22.02.1992
Robert Kellenberger, 20.03.2003
Eltern Balogh Carol, Lebensmittelchemiker
Balogh Judit Julianna, medizinisch-technische
Assistentin
Schulbildung und Studium
1974 – 1978 Grundschule Sathmar, Rumänien
1978 – 1986 „Kölcsey Ferenc“-Gymnasium Sathmar,
Rumänien, Abitur
1986 – 1991 Universität „Traian Vuia“, Temeschburg
(Timisoara), Rumänien, Studium: Technologie der
anorganischen Chemie
Juni 1991 Staatsexamen, Note 9,0
Juni 2009 Vorprüfung für die Promotion als Dr.rer.biol.hum.,
Bestanden
88
Lebenslauf
Sonstige Ausbildungen
1995 – 1998 Staatliche Berufsfachschule für Technische
Assistenten in der Medizin, Erlangen, Deutschland
Abschluss: MTLA – Medizinisch Technische
Laborassistentin
Anstellungen
Juni – Dez. 1991 Umweltschutz, Sathmar, Rumänien, Chemiker
1998 – 2004 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg, Deutschland, MTA
2004 –2005 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg, Deutschland,
Doktorand
2005 - 2008 Anatomisches Institut LS II, Universität
Regensburg, Deutschland, Doktorand
2008-28.02.2010 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg, Doktorand
Sprachenkenntnisse Deutsch
English
Rumänisch
Ungarisch (Muttersprache)
Erfahrung im Unterricht
2004 – 2010 Anatomisches Institut LS II, Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,
Deutschland, „Funktionelle Histologie“ - Kurs für
Studenten der Human- Zahn- und Molekular-
Medizin, Unterrichtsassistent