Chemisch-Analytische Methodenin der Pflanzenphysiologie
• Qualitative Analytik nennt man Nachweis
• Aufgabe der (Bio)Chemischen Analytik ist die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten)
• Spurenanalytik (Kleinstmengenanalyse)
• Test (halbquantitative Analyse)
Verfahren, Methode, Prinzip
Proben-nahme
Vor-bereitung Messung Analytische
Information
Aus-wertung
Unter-suchungs-
Objekt
Analyseverfahren
Analysemethode
Prinzip
G ravim etriez .B . W ä g u n g en
Volum etriez .B . T itra tion en
N a ßchem ischeMethoden
Elek troanalytischeMethoden
O ptischeMethoden
z .B . S p ek troskop ie
Trennm ethodenz .B . C h rom atog rap h ie
Instrum entelleMethoden
Chemische Analytik
Kriterien zur Beurteilung einer Methode
• Spezifität (Selektivität)
• Empfindlichkeit (Nachweisgrenzen)
• Genauigkeit & Reproduzierbarkeit (accuracy & precision)
Selektivität
• Selektivität hängt von möglichen Störungen durch andere Probe-Inhaltsstoffe ab.
Abtrennung von störenden Stoffen spezifischere Methoden
• Begriff: Matrix!
EmpfindlichkeitFähigkeit der Methode zwischen kleinen Differenzenin der Konzentration des Analyten zu unterscheiden
abhängig von der Steigung der Kalibrationsgeraden
Nachweisgrenze:
Konzentration des Analyten (c)
Meß
-Sig
nal (
S)
S = m.c + SL
N = SL + 3.StabL
Genauigkeit & Reproduzierbarkeit
• Genauigkeit (accuracy)sagt aus, wie nahe ein Meßwert dem tatsächlichen Wert kommt
• Reproduzierbarkeit (precision)sagt aus wie übereinstimmend wiederholte Messungen sind
Systematischer & Zufälliger Fehler
Genauigkeit
Reproduzier-barkeit
optimal
optimal
ZufälligerFehler
gut
schlecht
SystematischerFehler
gut
schlecht
Die Kalibration
• Leerwerte (blanks)• Standards (externe, interne)• Kalibrationsbereich• Kontrollen
Prozess, mit welchem man die Gerätewerte mit den absoluten Mengen der zu bestimmenden
Substanz in Übereinstimmung bringt.
Leerwerte
• Leerwert ist Matrix ohne Analyt
• Nullpunktbestimmung für jedes analytische Gerät notwendig
• Man unterscheidet:- Reagenzienleerwerte (z.B. Photometrie)- Blindwerte (Grundwert, z.B. Enzymatik)
StandardsProben bekannter Konzentration, die man zur Kalibrierung einer Methode einsetzt, nennt man Standards!
Standards sollten in Matrix hergestellt sein.
• Externe Standards: die zu bestimmende Substanz wird chemisch rein eingesetzt
• Interne Standards: eine ähnliche Substanz, die man zusetzt und die als Bezugsgröße verwendet wird
Kalibrationskurve
Konzentration des Analyten (c)0 4 8 12 16
Inst
rum
ente
n-A
nzei
ge
0
4
8
12
16
Kalibrations-punkte
Arbeitsbereich
Konzentration des Analyten (c)0 4 8 12 16
Inst
rum
ente
n-A
nzei
ge0
4
8
12
16
Nichtlineare Kalibrationskurve
Kalibration1. LeerwertM + R Messung Instrumenten- Auf Null stellen
Anzeige
2. StandardsS1 + M + R Messung Instrumenten- Kalibrations-S2 + M + R Anzeige kurve
3. ProbenP1 + M + R Messung Instrumenten- Werte-P2 + M + R Anzeige berechnung
M, Matrix; R, Reagentien; S1, Standard 1; P1, Probe 1.
Kontrollen• Um eine Methode zu überprüfen sollte
regelmäßig eine Probe bekannter Konzentration gemessen werden.
• Biologische Referenzmaterialien
• Schwierig bei Methoden die keine pool-Größen messen, sondern Prozesse (etwa Enzymaktivitäten)
Berechnungen 1: Konzentrationen
• Masse (kg)c = m / v (Konzentration = Masse / Volumen)
z.B.: mg L-1, µg cm-3, mg mL-1, etc
• Stoffmenge (Mol)
c = n / v (molare Konzentration = Mol / Volumen)
z.B.: mol L-1 (M), mmol L-1 (mM), µmol mL-1 (mM), µmol L-1 (µM)
Berechnungen 2: Verdünnungen
! das Produkt aus Konzentration mal Volumen vor der Verdünnung entspricht dem Produkt nach der Verdünnung!
Cvor x Vvor = Cnach x Vnach
z.B.: Aus einer 1M KCl-Lösung soll 250 mL einer 20mM Lösung hergestellt werden.
1M x X = 0.02M x 250 mLX = (0.02 x 250) / 1 = 5 mL
Lösung: 5 mL einer 1M KCl sind notwendig um 250 mL einer 20 mM Lösung herzustellen
Berechnungen 3: Verdünnungsfaktor
• Z.B.: 10-fache Verdünnung (1 zu 10, 1:10)
1 mL auf 10 mL bedeutet 1 mL + 9 mL oder 1 mL in einem Gesamtvolumen von 10 mL
• Mischt man also gleiche Volumina miteinander hat man eine Verdünnung von 1:2 (nicht 1:1!).
Werteangaben (signifikante Stellen)
Resultat Grenzwert Differenz Max. Fehler*(R) min max (in %)
4 3,5 4,4 0,9 11,254,4 4,35 4,44 0,09 1,02
4,44 4,435 4,444 0,009 0,1014,444 4,4435 4,4444 0,0009 0,010
*) F=0.5(/R)*100
Beispiel:Waage zeigt 0.0256 g an. Die letzte Stelle ist unsicher! Der wahre Wert kann also zwischen 25.55 und 25.64 mg liegen.
Werteangaben 2Beispiel:Meßwerte — 11.44 mg Calcium, 2.11 g Pflanzenmaterial
11.44 2.1111.435 - 11.444 2.105 - 2.114
5.4092
Jeder Wert zwischen 5.409 und 5.437 ist möglich. Der Wert kann also nicht als 5.42 angegeben werden(Grenzwerte 5.415-5.424), sondern nur als 5.4 mg g-1
(Grenzwert 5.35 und 5.44).
5.4366
Praktische Hinweise
• Chemikalien
• Wasserqualitäten
• Wägen
• Zentrifugation
• Volumsmessungen
• Gefahrensymbole
• Qualitätenp.a. (pro analysis), zur Synthese, ACS, OEAB, chemisch rein, Suprapur, Biochimica select
• Beschriftungen von abgefüllten ChemikalienInhalt, Konzentration, Datum, Benutzer
Chemikalien
Giftig Mindergiftig Ätzend Explosions- Brand- Hoch/Leicht Reizend gefährlich fördernd Entzündlich
Chemikalien
Wasserqualitäten• Demineralisiertes Wasser Geschirrspüler
(Reversosmose, Hausleitung)
• Deionisiertes Wasser Abwaschen,(Ionentaustauscherpatrone, allg. Labor) anorg. Analytik
• Destilliertes Wasser Enzymaktivitäten(Quarzdestillationsanlage)
• Milli Q-Wasser Reinstwasser, (Reinstwasser >18.2 MOhm cm-1)Chromatographie
WÄGEN• Wägebereich der Waage beachten!• Störungen: Offene Türen, Heizung, Erschütterungen• Nivellieren (Libelle) und Kalibrieren (Auto)
• Wägegefäß sollte möglich klein sein• Statische Aufladungen vermeiden (kein Kunststoff)• Mitte der Waagschale (Ecklasteffekt) • Waage vorbelasten (Erstwägeeffekt) • Indirekte Handhabung (Zange; T- und RH-Effekte) • Wägegut sollte Umgebungstemperatur haben
Einflüsse beim Wägen
Wägeguterscheint leichter
T+ T-
Wägeguterscheint schwerer
Temperatur Luftfeuchte
Verdunstungerscheint leichter
Wasseraufnahmeerscheint schwerer
Zentrifugation
• Relative Beschleunigung(x g) statt Drehzahl (rpm)
• Max. Drehzahl beachten• Bremsen (je nach An-
wendung) • Austarieren der Gefäße• Beladung:
- 2 x gegenüber (180°)- 3 x im Winkel 120°
Volumsmessung(auf Wägungen zurückführbar)
• Glaspipetten (Ex, 20°, ± 1%)Voll-, Meß-, Präszisionspipetten
• Luftpolsterpipetten• Meßzylinder• Büretten• Dispensoren• Meßkolben (In!)
Enghals, Weithals