Aus derStrahlenklinik
derFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Rolf Sauer
Der prognostische Einfluss von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in oropharyngealen Plattenepithelkarzinomen
Inaugural-DissertationZur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultätder
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt vonAlexander Dei Hung
ausErlangen
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Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent: Prof. Dr. G. G. Grabenbauer
Korreferent: Prof. Dr. Rainer Fietkau
Tag der mündlichen Prüfung: 19.3.2010
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Widmung
Ich widme diese Arbeit meinen Eltern ohne deren Unterstützung ich nicht so weit gekommen wäre.
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Inhaltsverzeichnis...........................................................................1 Zusammenfassung 5
....................................................................................1.1 Hintergrund und Ziele 5
.......................................................................................................1.2 Methoden 5
....................................................................1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 5
......................................................................1.4 Praktische Schlussfolgerungen 5
...............................................................................................2 Summary 6
....................................................................................2.1 Background and aims 6
..................................................................................2.2 Materials and Methods 6
..........................................................................................................2.3 Results 6
...................................................................................................2.4 Conclusions 6
..........................................................................................3 Einleitung 7
..............................................................................................4 Methoden 9
..........................................................................................4.1 Patientenauswahl 9
....................................................................................4.2 Behandlungsprotokoll 9
................................................4.3 "Tissue Microarray" und Immunhistochemie 10
...............................................................................................5 Statistik 15
.............................................................................................5.1 Labeling Index 15
............................................................................5.2 Kaplan - Meier - Methode 15
..............................................................................................5.3 Logrank - Test 16
.........................................................................................6 Ergebnisse 17
..........................................................................................7 Diskussion 26
...........................................................................8 Literaturverzeichnis 29
....................................................................9 Abkürzungsverzeichnis 32
.........................................10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 32
.........................................................................11 Tabellenverzeichnis 33
....................................................................12 Abbildungsverzeichnis 33
......................................................................................13 Danksagung 34
.............................................................................................Lebenslauf 35
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1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) gelten in jüngster Zeit als potentielle
Prognosefaktoren bei Tumorpatienten. Ziel dieser Arbeit war es, bei Patienten
mit fortgeschrittenem Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Halsbereichs die
Rolle von CD 8+ und CD 4+ T-Zellen, und speziell die Bedeutung
tumorinfiltrierender Lymphozyten mit regulatorischen Eigenschaften (Treg) zu
untersuchen.
1.2 Methoden
Tissue Microarrays, die Stanzen des Tumorgewebes von 53 nicht operierten
Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Halsbereiches enthielten,
wurden immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen CD 3, CD 8
und foxp3+ gefärbt und semiautomatisch mit dem Bildanalyseprogramm Count
(Biomas, Erlangen, Germany) ausgewertet. Die Zahl der im Tumorgewebe
vorhandenen markierten Lymphozyten wurde ins Verhältnis zu 100 Tumorzellen
gesetzt. Durch Auftrennen dieses Quotienten an der 66% Percentile erhielten
wir zwei Patientengruppen – eine mit hohen und eine mit niedrigen
Lymphozytenzahlen – für die die NED-Überlebensrate und die lokoregionäre
Kontrollrate berechnet und mit Hilfe des Logrank-Tests verglichen wurden.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Eine niedrige Dichte von CD 3+ T-Lymphozyten war mit einer 5-Jahres
Überlebensrate von 72% assoziiert, während Patienten mit mehr CD 3+ T-
Lymphozyten ein 5–Jahres-Überleben von 38% zeigten (p=0.04). Für die foxp3+
Zellen ergab sich kein statistisch signifikanter Einfluss auf klinische
Zielparameter.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
CD3+ TIL können als Prognosefaktoren, ggf. auch als Zielzellen einer
therapeutischen Manipulation bei Kopf-Hals-Patienten dienen.
6
6
2 Summary
2.1 Background and aims
In the past 10 years Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) have been established
as markers for the prognosis of cancer patients, as well as a possible target for
specific tumor therapy. The purpose of this study was to establish the role of
TIL in advanced squamous cell cancers of the head and neck (HNSCC), in
conjunction with their CD 4 and CD 8 positive counterparts, especially with
regard to the prognostic value in advanced squamous cell cancer (SCC) of the
head and neck.
2.2 Materials and Methods
A high-risk group of 53 inoperable patients with advanced disease was treated
by primary radiochemotherapy. Two-hundred-forty biopsies were evaluated by
use of tissue-micro-array technique, using the following markers: CD 3, CD 4,
CD 8, foxp3. The prognostic impact of labeled TILs per 100 tumor cells (labeling
index, LI) was evaluated.
2.3 Results
In the high-risk-group CD 3+ TIL infiltration below the 66th percentile was
associated with a 5-year-NED survival rate of 72% as compared to 38% for
patients with higher CD 3+ numbers (p=0.04). As far as foxp3+ cells were
concerned a trend towards influence on outcome could be shown for the CD
3+ / foxp3+ ratio, but the significance was low with p at only 0.3.
2.4 Conclusions
A low number of CD 3+ TIL indicated significantly better survival among patients
with advanced disease. Presence or absence of foxp3 and CD 8 did not have
the anticipated influence on NED- survival.
7
7
3 Einleitung
Plattenepithelkarzinome machen ca. 95% der Tumoren des Kopf- und
Halsbereiches aus (Manual of Clinical Oncology5). Die Inzidenz der
Plattenepithelkarzinome des Oropharynx beträgt in den USA zwischen 0,5 und
2 pro 100.000. Männer sind bis zu vier mal häufiger betroffen als Frauen
(Canto and Devesa, 20024). Die Fortschritte der Medizin in den letzten
Jahrzehnten haben jedoch kaum zur Verbesserung der Therapieergebnisse
geführt. Betrachtet man die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten aller TNM-
Stadien zusammengenommen, so liegt sie bei lediglich 66% (Pericot et al.,
200020).
Mitentscheidend für dieses schlechte Ergebnis ist die Entstehung eines
lokoregionären Rezidives. Auf der Suche nach den Ursachen wurden eine
Reihe von unabhängigen Risikofaktoren identifiziert. Zum einen ein
Ungleichgewicht zwischen Apoptose und Proliferation auf Seiten der
Tumorzellen (Grabenbauer, Suckorada, et al. 200314) sowie eine hohe
Proliferationsrate, gemessen als Ki-67 Labeling Index, zum anderen eine
schwache p53-Aktivität (Grabenbauer et al., 200012).
Auf der Suche nach weiteren Einflussgrößen haben sich in letzter Zeit verstärkt
tumorinfiltrierende Lymphozyten als Ziel der Forschung erwiesen,
insbesondere die regulatorischen T-Zellen. Diese Untergruppe der T-Zellen
wurde erstmals 1971 durch Gershon und Kodno9 entdeckt und als
„suppressor“-T-Zellen bezeichnet. Mangels fehlendem spezifischem Antikörper
und widersprüchlichen Aussagen geriet die Forschung jedoch in eine
Sackgasse. Erst 1995 konnten Sakaguchi et al.22 mit Hilfe von CD 25, der
Interleukin-2-Rezeptor-Alpha Kette, eine Subgruppe der CD 4+ Lymphozyten
isolieren, die Autoimmunität verhindern konnten. Die jetzt als regulatorische T-
Zellen bezeichneten Zellen konnten weiter in eine CD25+-high- und CD25+-low -
Gruppe unterteilt werden, wobei die immunmodulierende Wirkung von ersteren
ausging. In diesen wurde dann der Transkriptionsfaktor forkhead box P3 (foxp3)
als unabdingbarer Marker der T-Zell-Subpopulation etabliert.
8
8
Darüber hinaus wurden in zahlreichen früheren Untersuchungen verschiedene
andere Entitäten der TIL untersucht: CD 8+ T-Lymphozyten (Leong et al.,
200616) stellten einen prognostisch günstigen Faktor dar, insbesondere gehen
intratumorale CD 8+-Lymphozyten bei Ösophagus- (Cho et al., 20036);
(Schumacher et al., 200125), Pankreas- (Ryschich, et al. 200522), Endometrium-
(Kondratiev, et al. 200413) und Ovarialkarzinomen (Sato et al., 200524) sowie
bei kolorektalen Tumoren (Menon, et al. 200415) und kleinzelligen
Lungentumoren (Eerola et al., 20009) mit einem längeren Gesamtüberleben
einher. Granzyme B+ und zytotoxische T-Lymphozyten wurden in Studien zu
Hodgkin-Lymphomen (Oudejans, et al. 199719), Nasopharynx- (Oudejans et al.,
200218) und Analkarzinomen (Grabenbauer et al., 200611) mit einer schlechten
Prognose in Verbindung gebracht.
Hieraus ergab sich als logischer Schritt die Untersuchung der prognostischen
Rolle der foxp3+ TIL. Diese waren teils mit einer schlechten Prognose assoziiert
( (Curiel et al., 20047); (Kono et al., 200614); (Wolf et al., 200527), da sie sowohl
über Zell-Zell-Kontakt als auch über die Sekretion der antiinflammatorischen
Zytokine IL-10 und TGF-β, CD8+ T-Lymphozyten sowie CD4+ T-Helferzellen in
ihrer Wirkung hemmen können (Yu et al., 200528).
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9
4 Methoden
4.1 Patientenauswahl
Mit Hilfe des Tumorzentrums Erlangen-Nürnberg wurden insgesamt 110
Patienten der Jahre 1995 bis 2005 mit der histopathologischen Diagnose
P l a t t e n e p i t h e l k a r z i n o m d e s O r o p h a r y n x m i t p r i m ä r e r
radiochemotherapeutischen Behandlung identifiziert. Es wurde ein Kollektiv von
53 Patienten ausgewählt. Voraussetzungen für die Aufnahme in die Studie
waren ein oropharyngeal lokalisierter Primärtumor (unabhängig vom
Lymphknotenstatus) und der Verzicht auf eine Operation mit primär kurativer
Intention. Ein solches Vorgehen ist nur bei Patienten mit grossem Tumorbefund
angezeigt, so dass sich aus dieser Gruppe die Hochrisikogruppe der
gemeinsamen Publikation aus unserem Institut8 ergab. Ausschlusskriterien
waren eine unzureichende Dokumentation, sowie, bei einem Großteil der
Ausgeschlossenen, die mangelnde Qualität der Paraffinblöcke, die aufgrund
eines Wasserschadens im Pathologischen Institut Erlangen teilweise
unbrauchbar wurden. Von den nicht in unserer Universität vorgehaltenen
Probeblöcken wurden 2 eingesandt, bei insgesamt 6 angeschriebenen
Institutionen.
4.2 Behandlungsprotokoll
Im Rahmen der Staging-Untersuchung wurden eine Tracheoskopie und
Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts durchgeführt. Beide Halsseiten
und die Supraclavicularregion wurden klinisch und sonographisch untersucht.
Alle Patienten mussten initial normale Leberwerte aufweisen, die
Lungenfunktion musste sich nahe den Normwerten befinden, hämatologisch
durften sich keine Auffälligkeiten zeigen, um aggressiv radiochemotherapeutisch
behandelt werden zu können. Ein CT von Kopf und Hals mit Kontrastmittel in
Maske wurde angefer t ig t , um die Behandlung zu p lanen. Die
Bestrahlungsplanung wurde 3d-konformal mit dem Planungssystem Pinnacle
10
10
(Philips, Eindhoven, Netherlands) durchgeführt. Die Bestrahlungsdosis für den
Primärtumor betrug 72 Gy, bereits befallene Lymphknoten wurden mit 60 Gy
und nicht befallene nodale Regionen mit 50 Gy bestrahlt. Die simultan
verabreichte Chemotherapie bestand aus Fluorouracil als Infusion
(kontinuierlich verteilt über 5 Tage während der ersten Woche, Dosis: 600 mg /
m2) und 10 mg /m2 Mitomycin C als iv. Bolus am 1. und 29. Tag. Die
Erfolgskontrolle wurde klinisch sowie über HNO- Endoskopie, Ultraschall und
CT des Halses 6 Wochen nach Abschluss der Behandlung und im Folgenden
dann alle 3 Monate durchgeführt.
4.3 "Tissue Microarray" und Immunhistochemie
Um eine rasche Verarbeitung mit einer einheitlichen Färbung der Proben zu
ermöglichen, wurden Tissue Microarrays erstellt. Lichtmikroskopisch wurden
Tumorlokalisationen im Paraffinschnitt identifiziert und auf dem dazugehörigen
Paraffinblock markiert. Anhand der Markierungen hat die Firma BioCat,
(Heidelberg, Deutschland) Zylinder mit einem Durchmesser von 2 mm
ausgestanzt und in einen Sekundärparaffinblock (Rezipientenblock) dem Tissue
Microarray (TMA, vgl. Bild 5), eingesetzt und miteinander verschmolzen.
Insgesamt wurden drei TMAs mit je durchschnittlich 60 Stanzen generiert. Die
Anzahl der individuell generierten Stanzen variierte, wegen der Qualität der
Paraffinblöcke, zwischen 2 und 5, und lag bei durchschnittlich 3,1. Die TMAs
wurden mit dem Mikrotom geschnitten und auf Objektträger aufgezogen. Die
TMAs wurden entwachst und die Proteine im Dampftopf für die Antikörper
zugänglich gemacht. Anschließend wurden die TMAs mit folgenden
monoklonalen Antikörpern gefärbt:
CD 4 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK), CD 3, CD 8, (DakoCytomation,
Hamburg, Germany), foxp3 (abcam, Cambridge, UK).
Es wurde die Standardmethode streptavidin biotinylated alkaline phosphatase
(ABC-AP, DakoCytomation, Hamburg, Germany) verwendet, lediglich für foxp3
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wurde zusätzlich eine Tyramide Signalamplifikation verwendet. Anschließend
wurden die gefärbten TMAs mit Hilfe einer CCD Kamera, die an ein
Lichtmikroskop angeschlossen wurde, in relevanten Abschnitten abfotografiert.
Die Bilder wurden dann mit Hilfe des Computerprogramms COUNT (Biomas,
Er langen, Deutschland) semiautomat isch ausgewertet . Posi t ive
tumorinfiltrierende Zellen wurden in Beziehung zu 100 Tumorzellen gesetzt.
Hieraus ergab sich der Labeling – Index (LI).
Abb. 1: CD8 positive Lymphozyten im Tumor
12
12
Abb. 2: CD3 positive Lymphozyten im Tumor
Abb. 3: CD4 positive Lymphozyten im Tumor
13
13
Abb. 4: foxp3 positive Lymphozyten im Tumor
14
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Abb. 5: Tissue Micro Array in der Übersicht
15
15
5 Statistik
5.1 Labeling Index
Grundlage aller Berechnungen ist der Labeling - Index. Mathematisch ist dieser über die Formel:
definiert, wobei LI der Labeling - Index ist, L die intratumoralen Lymphozyten
und T die Tumorzellen, sodass ein prozentähnliches Verhältnis (keine
Auszählung der Gesamttumorzellen) resultiert.
5.2 Kaplan - Meier - Methode
Um den „Erfolg“ von hoher oder niedriger Treg - Infiltration zu vergleichen,
haben wir die Kaplan - Meier - Methode herangezogen. Um vergleichen zu
können, muss die Population geteilt werden. Wir haben uns für die Trennung an
der 66% Percentile des LI entschieden.
Mit Hilfe der Formel:
können wir nun das Überleben der Gruppen vergleichen, wobei Ŝ(t) die
Wahrscheinlichkeit ist, dass zu einem Zeitpunkt t einem Patienten aus der
Gruppe der noch vorhandenen Patienten ni das Ereignis di widerfährt. Hierbei
gilt zum Zeitpunkt Ŝ(0)= 1. Die Patienten ni sind solche, die zum Zeitpunkt ti
( i := 0,1,2...,) unter Risiko sind. Ausscheiden aus der Gruppe kann man
entweder dadurch, dass man das Ereignis erlebt, oder keine weiteren Daten
mehr vorhanden sind. Das Ereignis di ist für unsere Arbeit als das
posttherapeutische Auftreten eines Lokal-, Lymphknotens oder eines
Fernrezidives definiert, oder aber als durch eine senkrechte Linie markiertes
Fehlen von weiteren Daten. Ein Ausscheiden aus n ergibt graphisch eine Stufe.
16
16
Der Beobachtungszeitraum wurde auf 6 Jahre festgelegt, beginnend mit dem
ersten Tag der Therapie und endend nach Auftreten von di oder nach 6 Jahren.
Tod mit NED wurde aus der Berechnung genommen, es sei denn die Autopsie
ergab doch ein Rezidiv.
5.3 Logrank - Test
Um zu überprüfen, ob sich aus der unterschiedlichen Entwicklung der
Überlebenskurven eine statistische Signifikanz ergab, bedienten wir uns des
Logrank - Testes, da er nicht auf eine Standardverteilung oder besondere
Vollständigkeit der Daten angewiesen ist.
Es sei Erwartungswert für die Gruppe 1: E1j = O1j x (N1j/Nj) und
Varianz Vj = {E1j x( 1- N1j/Nj)x(Nj-Oj)} / (Nj-1) wobei Oj die Ereignisse in beiden
Gruppen zum Zeitpunkt tj sind. Nj ergibt sich aus N1j + N2j.
Mit der Formel:
ist es nun möglich, die beobachteten (O, observed) mit den nach der
Nullhypothese erwarteten (E, expected) Ereignissen zum Zeitpunkt tj zu
vergleichen. Die Summe der Differenzen geteilt durch die Wurzel der Summe
der Varianz V zum Zeitpunkt j ergibt den p - Wert ( = Z in der Formel).
17
17
6 ErgebnisseFür unsere Patienten ergaben sich die in den folgenden Tabellen und
Abbildungen zu sehenden Charakteristika:
N (%)GesamtGesamt 53 100Tumor LokalisationTumor Lokalisation
Hypopharynx 16 30Zungengrund 13 25Tonsille 5 9Oropharynx 19 36
T KategorieT Kategorie
T1 0 0T2 4 8T3 26 49T4 23 43
N KategorieN Kategorie
N0 5 9N1, NX 4 7N2a 0 0N2b 13 25N2c 29 55N3 2 4
Grading (WHO)Grading (WHO)
G1/2 38 72G3/4 15 28
UICC StadiumUICC Stadium
1 0 02 0 03 7 134A 43 814B/C 3 6
Tabelle 1: Statistische Verteilung der Patienten nach klinischen Gesichtspunkten.
18
18
Die Geschlechterverteilung spiegelt das Raucherverhalten von vor ca. 50
Jahren wieder (vgl. Altersverteilung, Abb 6.). 90% der Erkrankten sind Raucher.
Abb. 6: Patientenverteilung nach dem Geschlecht
Es steht zu erwarten (Beelte, Pritzkuleit und Katalinic 20083), dass sich die
Geschlechterverteilung zu Gunsten des Frauenanteils verändert.
Ein bekannter Amplifikator für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms ist
der Konsum von hochprozentigem Alkohol, sowie aller Wahrscheinlichkeit nach
eine schlechte Mundhygiene. Bei 10% der Patienten lässt sich eine erbliche
Dispos i t ion eru ieren (Rasse 200825) . Aufgrund der feh lenden
Screeningverfahren werden die meisten Karzinome erst ab einem Stadium ab
T2 diagnostiziert, was bei positivem Lymphknotenstatus schon einem
Hochrisikotumor gleichkommt.
10,0
43,0
Geschlecht Männer Frauen
19
19
Abb. 7: Altersstruktur der Patienten
Wie bei einem durch chemische Induktion ausgelösten Tumor zu
erwarten ,befinden sich die meisten Patienten schon in einem fortgeschrittenen
Lebensalter (siehe. Abb 7.). In Anbetracht der notwendigen radikalen Therapie
kommt es zwangsweise nicht immer zur Operation.
Für das Färbeverhalten der Antikörper der untersuchten TIL ergab sich folgende
Verteilung:
TIL-LI Median LI (Range) Mittelwert (LI ± SE)CD 3+ 10.9 (0-53.7) 15.5±13.7
CD 8+ 2.2 (0-9.5) 2.6±1.9
foxp3+ 10.0 (0-64.6) 11.8±8.1
Tabelle 2: Median und Mittelwert der tumorinfiltrierendenen Lymphozyten (TIL), bezogen auf den Labelling-Index(LI) für CD3+, CD8+ und foxp3+ TIL.
Die univariante Analyse mit einem „cut-off“ bei 66% bzw. am Median zeigte den
Einfluss der TIL auf das NED-Überleben: Tabelle 3 und 4 gibt hierzu die
Resultate.
20
20
Faktor NED-Überleben p-Wert
CD 3+ 72% vs. 38% 0,045
CD 8+ 56% vs. 71% 0,4
foxp3+ 62% vs. 59% 0,5
CD 3/foxp3+ 71% vs. 44% 0,3
CD 8/foxp3+ 66% vs. 50% 0,6
Tabelle 3: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ bei 66.6%.
Faktor NED-Überleben (6a) p-Wert
CD 3+ 77% vs. 44% 0,09
CD 8+ 60% vs. 62% 0,8
foxp3+ 57% vs. 67% 0,7
CD 3/foxp3+ 74% vs. 49% 0,1
CD 8/foxp3+ 64% vs. 57% 0,7
Tabelle 4: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ am Median.
Es wird deutlich, dass sich nur für CD3+ TIL ein signifikanter Einfluss postulieren
lässt. Natürlich gab es auch andere Einflussgrößen, wie bekannte klinische
Parameter.
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Berücksichtigt man klinische Einflussgrößen, ergeben sich folgende Werte:
Klinische Faktoren NED-Überleben p
T Kategorie T1-2: 56% T3-4: 59% 0,7N Kategorie 69% vs. 51% 0,3
Alter 40% vs. 76% 0,01Geschlecht 60% vs. 52% 0,6
Tumor Lokalisation 66% vs. 60% vs. 47% 0,5
Tabelle 5: NED Überleben nach klinischen Kriterien
Die Ergebnisse aus Tabelle 5 lassen darauf schließen, dass eine
Haupteinflussgrösse auf das NED-Überleben das Alter der Patienten darstellt.
Faktor Lokoregionäre TumorkontrolleLokoregionäre TumorkontrolleTIL pCD 3+ 81% vs. 79% 0,7CD 8+ 79% vs. 82% 0,8foxp3+ 83% vs. 76% 0,2
CD 3+/foxp3+ 89% vs. 68% 0,4CD 8+/foxp3+ 88% vs. 64% 0,3
Tabelle 6: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off value von 66%.
22
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Faktor Lokoregionäre TumorkontrolleLokoregionäre Tumorkontrollep
CD 3+ 84% vs. 75% 0,9
CD 8+ 87% vs. 74% 0,4
foxp3+ 79% vs. 83% 0,7
CD 3/foxp3+ 89% vs. 71% 0,5
CD 8/foxp3+ 88% vs. 72% 0,5
Tabelle 7: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off am Median.
Es zeigte sich, dass die lokoregionäre Tumorkontrolle als ein entscheidender
Faktor für das Überleben der Patienten in unserer Gruppe statistisch nicht
signifikant mit einem bestimmten TIL assoziiert ist (siehe Tabelle 6 und 7).
23
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Abb. 8: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD3+ TIL.
Abbildung 8 zeigt die Überlebensraten für Patienten mit hoher und niedriger
Infiltrationsdichte des Tumors mit CD3+ TIL. Getrennt wurden die Gruppen ab
einem Labeling-Index von 0.15. Deutlich zeigt sich der statistisch signifikante
Unterschied (p=0,045) im Überleben. Patienten mit wenigen CD3 +
Lymphozyten im Tumorbett überlebten länger als solche mit vielen CD3 +
Lymphozyten. Von letzteren lebte nach zwei Jahren nur noch ca. ein Drittel.
24
24
Abb. 9: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD8+ TIL.
Für die Infiltration des Tumors mit CD8+ Zellen ließ sich kein statistisch
signifikanter Einfluss (p=0,4) feststellen.
25
25
Abb. 10: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit foxp3+ TIL.
Entgegen der initialen Annahme hat sich gezeigt, dass foxp3 positive T-
Lymphozyten keinen Einfluss auf das NED Überleben oder die lokoregionäre
Tumorkontrolle (vgl. oben sowie Tabellen 3,4,6 und 7) innerhalb unserer
Gruppe ausübten. Lediglich für CD3 positive Zellen zeigte sich eine Signifikanz
(Tabellen 3 und 4).
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7 Diskussion
In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass über die Knutssonsche „2 hit“ -
Hypothese hinaus noch weitere Faktoren zur Tumorentstehung beitragen
können. Hierzu gehört auch eine Einflussnahme auf das Immunsystem durch
den Tumor selbst. Die in der Arbeit von Baecher-Allan und Anderson 20063
zusammengefasste Vermutung, dass ein hoher Anteil an foxp3+-Zellen das
Überleben der Erkrankten verkürzt, indem es Toleranz gegenüber der sonst als
fremd erkannten, entarteten Zelle herstellt, bestätigte sich in unserer Arbeit
nicht.
Die Arbeit von Badoual et al., (20062) , die einen ähnlichen Ansatz verfolgte wie
die hier vorgelegte, kommt zu dem Ergebnis, dass eine hohe foxp3+ TIL
Infiltration im Tumor mit einer besseren lokoregionären Kontrolle des
Tumorgeschehens assoziiert sei.
Diese Ergebnisse stehen den Resultaten, die bei anderen Tumorentitäten
gesehen wurden, diametral gegenüber, insbesondere auch der wegweisenden
Arbeit von Curiel et al., (20047), welche sich allerdings mit der foxp3+-TIL-
Konzentration im Aszites von an Ovarialkarzinom erkrankten Frauen befasste.
Curiel und Mitarbeiter konnten zeigen, dass offenbar diejenigen Patienten mit
hoher Treg-Konzentration im Aszites eine signifikant schlechtere Überlebenszeit
hatten. Die Autoren folgern, dass der Tumor infolge eines Immunprivilegs durch
regulatorische Zellen, die zytotoxische T-Zellen antagonisieren, unbeeinträchtigt
proliferieren kann.
Die tatsächliche Funktionalität der Treg ist ein entscheidender, allerdings selten
überprüfter Punkt, der von Strauss et al., (200725) an 10 Kopf-Hals-
Tumorpatienten und 5 Gesunden untersucht wurde. Auch hier zeigten die
Tumorpatienten eine deutlich höhere Rate an foxp3+ Zellen im peripheren Blut
im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die funktionelle Differenzierung erfolgte hier
27
27
nur anhand von CD4 und CD25, was die Aussagekraft relativieren könnte. Es
ergaben sich jedoch Hinweise, dass nur ein geringer Anteil der CD4+, CD25+
Zellen regulatorische Funktionen übernahm. In einer zweiten Arbeit mit größerer
Fallzahl konnte gezeigt werden, dass chemotherapeutisch vorbehandelte Kopf-
Hals-Tumorpatienten im NED – Status mehr Treg im Blutkreislauf beherbergten
als Patienten mit aktivem Tumor.
Aufgrund dieser Arbeiten könnte man annehmen, es ließe sich schlüssig
behaupten, dass hohe Konzentrationen an Treg in Kopf-Hals-Tumorpatienten
einen signifikanten negativen Prädikator für das Überleben darstellen. Alle
Arbeiten leiden an der problematischen Situation in Bezug auf die genaue
Differenzierung der Treg. Inzwischen kann man mehrere Arten von Treg
unterscheiden. Sogenannte natürliche Treg (nTreg) entstehen im Thymus, sind
von Anfang an stark CD4+-, CD25+-positiv und sofort funktionsfähig, Tr1
wiederum zählt man zu den generierten Treg, die in der Peripherie entstehen
(adaptive Treg, aTreg). Darüber hinaus gehören zu dieser Gruppe noch Th3
und Th2 ( Bacchetta et al., 20071, Baecher-Allan et al., 20063). Die drei
letztgenannten Typen können ohne direkten Zell – Zell - Kontakt Einfluss auf die
Immunantwort des Körpers nehmen (IL 10, IFN gamma, TNFß), so dass eine
Infiltration des Tumors für diese Treg nicht zwingend notwendig ist.
Diese Unklarheit ist insofern von Bedeutung, als man in foxp3+ Zellen nicht nur
einen unter Umständen prognostisch bedeutsamen Faktor sieht, sondern auch
ein therapeutisches Ziel. Auf der Suche nach einer Immuninduktion zur
Therapie von Kopf-Hals-Tumoren stellten Nitcheu-Tefit et al. (200716) fest, dass
sie die besten Erfolge unter anderem mit der Depletion von CD4+ - Zellen
erreichten. Daraufhin identifizierten sie CD4+-, foxp3+ - Zellen als entscheidend.
Im Mausmodell also konnte schon gezeigt werden, dass eine spezifische
immunologische Therapie möglich ist.
Auch beim Menschen gibt es erste klinische Therapieversuche, so zum Beispiel
durch eine Gruppe in Ulm (Riechelmann et al., 2007 21), die mit Catumaxomab,
einem bispezifischen Antikörper, der einerseits an CD3+ Zellen, andererseits an
28
28
EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) bindet, 4 Patienten, die einen nicht
mehr therapierbaren Kopf-Hals-Tumor hatten, therapierte.
Um eine in vivo Ausschüttung von IFN gamma und TNF alpha zu umgehen,
gewannen die Autoren zunächst PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)
und kultivierten diese zusammen mit dem Antikörper und Tumor unter
Auswaschung der Cytokine. Im Anschluss erfolgte dann die Replantation durch
i.v. Gabe an die Patienten. Immerhin einer der 4 Patienten erreichte eine
komplette Remission, was angesichts der sonst bei Hochrisikopatienten zu
erwartenden Resultate ein beachtlicher Erfolg ist. Natürlich musste zunächst
die positive Expression von EpCAM sichergestellt werden, jedoch ist zu
erwarten, dass in Zukunft noch zahlreiche spezifische Antikörper entdeckt
werden und eine spezifische Tumortherapie möglich werden wird.
Insgesamt lässt sich festhalten, dass die Ergebnisse dafür sprechen, dass bei
Tumorpatienten die Treg – Zahl erhöht ist und eine positive Korrelation
zwischen der Höhe der Treg und einer Verschlechterung der Prognose besteht.
Wahrscheinlich ist nicht die Infiltrationsdichte der Treg im Tumor entscheidend,
sondern es ist eher die Konzentration im peripheren Blut oder der umgebenden
Flüssigkeit ( z.B. Aszites ) prognostisch relevant. Eine Kombination aus der
Depletion von Treg und einer spezifischen Tumortherapie könnte der nächste
Durchbruch bei der Krebsbehandlung sein.
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9 Abkürzungsverzeichnis
Ak: Antikörper
CD: cluster of differentiation
CT: Computer Tomographie
EpCAM: epithelial cell adhesion molecule
Foxp3+: forkhead box P3
Gy: Gray
HNSCC: head and neck squamous cell carcinoma
IFN gamma: Interferon Gamma
IL: Interleukin
iv. : intravenös
NED: no evidence of disease
PBMNC: peripheral blood mononuclear cells
SCC: squamous cell carcinoma
TMA: tissue micro array
TGF-β: Tumor growth factor ß
TIL: Tumorinfiltrierende Lymphozyten
Treg: Tumorinfiltrierende Lymphozyten mit regulatorischen Eigenschaften
UK: United Kingdom
USA : United States of America
10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
Distel et al. Tumour infiltrating lymphocytes in squamous cell carcinoma of the
oro- and hypopharynx: prognostic impact may depend on type of treatment and
stage of disease. Oral Oncol (2009) vol. 45 (10) pp. 167-74
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11 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Statistische Verteilung der Patienten nach klinischen Gesichtspunkten. S 17
Tabelle 2: Median und Mittelwert der tumorinfiltrierendenen Lymphozyten (TIL), bezogen auf den Labelling-Index(LI) für CD3+, CD8+ und foxp3+ TIL. S 19
Tabelle 3: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem„cut-off“ bei 66.6%. S 20
Tabelle 4: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ am Median. S 20
Tabelle 5: NED Überleben nach klinischen Kriterien S 21
Tabelle 6: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off value von 66%. S 21
Tabelle 7: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off am Median. S 22
12 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: CD8 positive Lymphozyten im Tumor S 11
Abb. 2: CD3 positive Lymphozyten im Tumor S 12
Abb. 3: CD4 positive Lymphozyten im Tumor S 12
Abb. 4: foxp3 positive Lymphozyten im Tumor S 13
Abb. 5: Tissue Micro Array in der Übersicht S 14
Abb. 6: Patientenverteilung nach dem Geschlecht S 18
Abb. 7: Altersstruktur der Patienten S 19
Abb. 8: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD3+ TIL. S 22
Abb. 9: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD8+ TIL. S 23
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Abb. 10: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit foxp3+ TIL. S 24
13 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner
Arbeit beigetragen haben.
Hierbei ist an erster Stelle mein Betreuer Prof. Dr. G. G. Grabenbauer zu
nennen, der mir die Gelegenheit gegeben hat diese Arbeit aufzunehmen und
dessen beständiges Engagement entscheidenden Anteil am erfolgreichen
Abschluss dieser Arbeit hat.
Herrn Dr. L. Distel danke ich sowohl für die Hilfestellung bei der Planung dieser
Arbeit als auch für die fachkundige Unterstützung sowie die wertvollen
Ratschläge während ihrer Durchführung.
Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. R. Sauer, Direktor der Strahlenklinik der
Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, diese Arbeit an der
Strahlenklinik abzuschliessen.
Ein besonderer Dank gilt Prof. Dr. G. Niedobitek sowie dessen Mitarbeiterinnen,
insbesondere Frau Christa Winkelmann und Dr. med. Maike Büttner, die mir mit
ihrer praktischen Erfahrung stets zur Seite gestanden haben.
Den größten Dank möchte ich meinen Eltern aussprechen, die mich stets
unterstützt haben und ohne die mein Studium in dieser Form nicht möglich
gewesen wäre.
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Lebenslauf
Name: Hung, Alexander DeiGeburtsdatum: 26-09-1979Geburtsort: ErlangenStaatsangehörigkeit: DeutschFamilienstand: LedigEltern: Herr Chau Chun Hung (Dipl. Mathematiker)
Frau Dr. phil. Ute Rupprecht-Hung
Ausbildung:
September 1986 bis Juli 1990 Adalbert – Stifter Grundschule Erlangen
September 1990 bis Juni 1999 Emil-von-Behring Gymnasium Spardorf
Oktober 2000 bis Dezember 2007 Oktober 2000 bis Dezember 2007 Studium der Medizin an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Beschäftigung
● August 1999 bis Juni 2000: Zivildienst am Institut für Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
● 2002 – 2004: Videobearbeitung für die Gastroenterologie der Universitätsklinik der FAU
● Oktober 2005- 2007: Studentische Hilfskraft bei orthopädischen-Operationen in den Kliniken Dr. Erler GmbH und Unfallchirurgie des Klinikum Fürth
● seit Februar 2008: Weiterbildungsassistent Orthopädie / Unfallchirurgie BG- Kliniken Bergmannstrost Halle / Saale