Zur Rolle der Subtilase 3 aus Tomate (Solanum lycopersicum · Katalase in Tomatenblätter gefolgt...

Universität Hohenheim

Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. A. Schaller

Zur Rolle der Subtilase 3 aus Tomate (Solanum lycopersicum)

in der Pathogenabwehr

Diplomarbeit Monika Neugebauer

Studiengang Biologie, Fakultät Naturwissenschaften

September 2008

betreut von Dr. Anna Cedzich

In Gedenken an Birgit

für Harald und Jana

I

Zusammenfassung

Subtilasen stellen eine der größten Gruppen der in Pflanzen vorrangig

präsenten Familie der Serinproteasen dar. Bisher wurden 15 Subtilasen in

Solanum lycopersicum identifiziert. Für viele wird eine Funktion in der

Pathogenabwehr postuliert. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Expression der

SlSBT3 nach Pathogenbefall mittels SlSBT3-Promotor::GUS-Pflanzen,

semiqRT-PCR, Northern und Western Blot analysiert werden. Darüber hinaus

erfolgte eine vergleichende Untersuchung des Wachstumsverhaltens und der

Krankheitssymptome verschiedener Tomatenpathogene in SlSBT3 RNAi-,

Überexpressions– und Wildtyppflanzen.

Über die exogene Zugabe von Salicylsäure konnte eine Abhängigkeit der

Expression der SlSBT3 von diesem Signalmolekül der biotrophen

Pathogenabwehr festgestellt werden. Eine Induktion der SlSBT3 wurde sowohl

nach Infektion durch avirulente, virulente oder hrp-defiziente Stämme eines

biotrophen Bakteriums, als auch nach Infektion durch einen hemibiotrophen

Oomyceten und nekrotrophen echten Pilz nachgewiesen. Dabei erwies sich die

Expression am stärksten induziert durch Infektion mit dem avirulenten Stamm

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, nach einer langen Besiedlungsphase

von Phytophthora infestans und Sclerotinia sclerotiorum. Die Infiltration von

Katalase in Tomatenblätter gefolgt von einer Inokulation mit S. sclerotiorum

führte zu einer früheren Induktion von SlSBT3 im Vergleich zu Kontrollen die

nur mit S. sclerotiorum infiziert waren. Dies wies daraufhin, dass H2O2 eine

reprimierende Wirkung auf die Expression in diesem Pathogen-Wirtspflanze-

System hat. Als übereinstimmendes Charakteristikum der sonst so

unterschiedlichen Pathogene wurde die Abhängigkeit der SlSBT3-Expression

von der Einleitung des Zelltods genauer untersucht. So konnte auch

unabhängig von Pathogenbefall mit dem Zellgift Cantharidin einer Induktion der

SlSBT3 festgestellt werden.

In der Pflanze der RNAi-Linie war das Wachstum der biotrophen Bakterien

tendenziell am schlechtesten. Zusammen mit dem verstärkten Auftreten von

Krankheitssymptomen in der RNAi-Linie durch den hrp-defizienten

X. campestris und S. sclerotiorum lässt diese Beobachtung eine indirekte

Beteiligung an der Pathogenabwehr auf Ebene der Zelltodregulation vermuten.

II

Inhalt

Zusammenfassung I

Inhalt II

Abkürzungsverzeichnis VII

Abbildungsverzeichnis X

1 Einleitung 1

1.1 Die Besiedlung von Pflanzen durch Pathogene 1

1.2 Die Erkennung von Pathogenen durch pflanzliche Organismen 1

1.3 Abwehrmechanismen und Signalkomponenten in der Pathogenabwehr 3

1.3.1 Hypersensitive Reaktion und systemisch erworbene Resistenz 4

1.3.2 Reaktive Sauerstoffspezies in der Pathogenantwort 5

1.3.3 Abwehrstrategien gegen biotrophe oder nekrotrophe Pathogene 6

1.3.4 Pflanzliche Proteasen 7

1.3.5 Pflanzliche Subtilasen 9

1.3.6 Die Subtilasenfamilie in Tomate (Solanum lycopersicum) 11

1.4 Zielsetzung 12

2 Material und Methoden 15

2.1 Material 15

2.1.1 Pflanzen 15

2.1.2 SlSBT3-Promotor::GUS-Linien 15

2.1.3 SlSBT3-RNAi-Linien 15

2.1.4 SlSBT3-Überexpressions-Linien 16

III

2.1.5 Bakterien 16

2.1.6 Pilze: Sclerotinia sclerotiorum 16

2.1.7 Oomyceten: Phytophthora infestans 17

2.1.8 Plasmide 17

2.1.9 Oligonukleotide 17

2.1.10 Enzyme 18

2.1.11 Antikörper 18

2.1.12 Chemikalien 18

2.1.13 Geräte 19

2.2 Methoden 20

2.2.1 Anzucht von Tomatenpflanzen 20

2.2.1.1 Behandlung der Tomatensamen

zur Dekontamination von Viren 20

2.2.1.2 Anzuchtbedingungen 20

2.2.2 Kultivierung von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 20

2.2.3 Kultivierung von Sclerotinia sclerotiorum 21

2.2.4 Kultivierung von Phytophthora infestans 22

2.2.5 Infiltration von Xcv in Tomatenblätter 22

2.2.6 Reisolierung von Xcv aus Blattgewebe 23

2.2.7 Statistische Auswertung des Wachstumsverhaltens von Xcv 24

2.2.8 Inokulation von Tomatenblättern mit S. sclerotiorum 25

2.2.9 Inokulation von Tomatenblätter mit P. infestans 25

2.2.10 Behandlung von Tomatenpflanzen mit Salicylsäure 26

2.2.11 Infiltration von Katalase 26

2.2.12 Infiltration von H2O2 27

2.2.13 Infiltration von Cantharidin 27

2.2.14 GUS-Färbung 27

2.2.15 DNA-Extraktion 28

IV

2.2.16 Gelektrophorese von DNA 28

2.2.17 RNAse-freies Arbeiten 29

2.2.18 RNA-Extraktion 29

2.2.19 Semiquantitative RT-PCR 31

2.2.19.1 RT-Reaktion 31

2.2.19.2 PCR 32

2.2.20 Northern Blot 34

2.2.20.1 Sondenherstellung für Northern Blot 34

2.2.20.2 Gelelektrophorese von RNA 35

2.2.20.3 RNA-Transfer auf Membranen 36

2.2.20.4 Hybridisierung mit einer radioaktiv-markierten Sonde 37

2.2.20.5 Strippen von Membranen 39

2.2.21 Proteinanalyse 39

2.2.21.1 Herstellung von Gesamtproteinextrakten 39

2.2.21.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford 39

2.2.21.3 SDS-PAGE 40

2.2.21.4 Coomassie-Färbung 41

2.2.21.5 Immunologischer Nachweis von Proteinen

mit Western Blot 41

2.2.21.6 Ponceau-Färbung 43

V

3 Ergebnisse 44

3.1 Überprüfung von SlSBT3-RNAi- und -Überexpressions-Linien in der T3-Generation 44

3.2 Expression von SlSBT3 nach Behandlung mit Salicylsäure 45

3.3 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch Xcv 46

3.4 Wachstumsverhalten von Xcv in SlSBT3 RNAi-,

Überexpressions- und Wildtyppflanzen 54

3.4.1 Wachstum des virulenten Stamms Xcv 85-10 54

3.4.2 Wachstum des avirulenten Stamms Xcv 85-10 pDsK 200 55

3.4.3 Wachstum des hrp-defizienten Stamms Xcv 85-10 hrpA-G 56

3.5 Vergleich der Krankheitssymptome in SlSBT3 RNAi-,

Überexpressions- und Wildtyppflanzen nach Infektion durch Xcv 57

3.6 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch

S. sclerotiorum 59

3.7 Vergleich der Krankheitssymptome in SlSBT3 RNAi-,

Überexpressions- und Wildtyppflanzen nach Infektion durch Xcv 63

3.8 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion

durch P. infestans 64

3.9 Expression von SlSBT3 nach Behandlung mit Katalase und Cantharidin 66

3.9.1 GUS-Repotergenanalyse nach Infiltration von Katalase 67

3.9.2 GUS-Reportergenanalyse nach Infiltration von Cantharidin 68

4 Diskussion 71

4.1 Beeinflussung des Expressionsstatus der SlSBT3 durch Pathogenbefall 71

4.2 Einfluss von Salicylsäure und H2O2 auf die Expression der SlSBT3 77

VI

4.3 Einfluss der SlSBT3 auf das Wachstum von Pathogenen

in Tomatenblättern 79

4.4 Die Rolle der SlSBT3 in der Pathogenabwehr 82

5 Ausblick 87 6 Literatur 89

Erklärung XII

Danksagung XIII

VII

Abkürzungsverzeichnis

Ø Durchmesser

‚ Minute

’’ Sekunde

°C Grad Celsius

Cef Cefotaxim

Ci Curie

Abb. Abbildung

BPB Bromphenolblau

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

ca. circa

cDNA complementary DNA

cfu colony forming units

ddH2O doppelt destilliertes Wasser

dH2O einfach destilliertes Wasser

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

ECL enhanced chemiluminescence

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

Fw forward

g Erdbeschleunigung

g Gramm

GUS β-Glucuronidase

h Stunde

HR hypersensitive Reaktion

hrp hypersensitive Reaktion und Pathogenese

VIII

kb Kilobasenpaare

kDa KiloDalton

Konz. Konzentration

µ mikro (10-6)

m milli (10-3)

M molar (mol/Liter)

mA milliAmpere

max. maximal

min Minute(n)

MOPS 4-Morpholinpropansulfonsäure

mRNA Messenger-RNA

ORF open reading frame

PAMP pathogen-associated patterns

pBS plasmid Blue Script

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PR Pathogenisis related

pv Pathovar

OE Überexpression

Rif Rifampicin

RNA Ribnukleinsäure

RNAi RNA-Interferenz

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptions-PCR

rv Reverse

SA Salicylsäure

SBT Subtilase

sec Sekunden

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Spec Spectinomycin

t Zeit

TAE tris-Essigsäure-EDTA

IX

TNP Trinatriumphosphat

TTSS Typ-III-Sekretionssystem

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Enzymeinheiten

UBQ Ubiquitin

ÜN über Nacht

UV Ultraviolett

V Volt

v/v Volumenprozent

verd. verdünnt

Vol. Volumen

wt Wildtyp

w/v Gewichtsprozent

XC Xylencyanol

Xcv Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-Indolylglucuronid

X

Abbildungsverzeichnis

Abb. 3.1: Überprüfung der SlSBT3-Überexpressions-Linie G2f1D und

SlSBT3-RNAi-Linie 21-7

Abb. 3.2.1: Expressionsanalyse von SlSBT3 von Tomatenblättern nach

Besprühung mit Salicylsäure mit semiqRT-PCR

Abb. 3.2.2: Expressionsanalyse von SlSBT3 in Tomatenblättern nach

Zufuhr von Salicylsäure durch den Transpirationsstrom mit

semiqRT-PCR

Abb. 3.3.1: Expressionsanalyse von SlSBT3 nach Infektion durch Xcv 85-10

mit semiqRT

Abb. 3.4.1: Wachstum virulenter Stamms von Xcv in SlSBT3–RNAi,

Überexpressions- und Wildtyppflanzen.

Abb. 3.4.2: Wachstum avirulenter Stamm Xcv 85-10 pDSk200 in SlSBT3–

RNAi, -Überexpressions- und Wildtyppflanzen.

Abb. 3.4.3: Wachstum hrp-defizienter Stamm Xcv 85-10 A-G in SlSBT3–

RNAi, - Überexpressions- und Wildtyppflanzen

Abb. 3.5.1: Krankheitsymptome durch Xcv 85-10 in SlSBT3–RNAi,

Überexpressions- und Wildtyppflanzen

Abb. 3.5.2: Krankheitsymptome durch Xcv hrp A-G in SlSBT3–RNAi,


Abb. 3.6.1: Expressionsanalyse von SlBT3 nach Inokulation mit

S.sclerotiorum

XI

Abb. 3.6.2: Histochemische Lokalisation der SlSBT3-Promotor::GUS

Aktivität nach Inokulation mit S. sclerotiorum

Abb. 3.7: Krankheitssymptome durch S. sclerotiorum in SlSBT3–RNAi, -


Abb. 3.8.: Expressionsanalyse von SlBT3 nach Inokulation mit P. infestans

Abb. 3.9.1: Histochemische Analyse der SlSBT3-Promotor::GUS Aktivität

nach Infiltration mit Katalase und gleichzeitiger Inokulation mit

S. sclerotiorum

Abb. 3.9.2: Histochemische Analyse der SlSBT3-Promotor::GUS Aktivität

nach Infiltration von Cantharidin

Einleitung

1

Einleitung

1.1 Die Besiedlung von Pflanzen durch Pathogene

Die Besiedlung von Pflanzen durch mikrobielle Krankheitserreger ist in der

Natur ein allgegenwärtiges Ereignis. Für das Wachstum und die Entwicklung

eines Pathogens auf einer Pflanze ist die Überwindung der so genannten

basalen Inkompabilität notwendig. Auf Nichtwirtspflanzen können Pathogene

die vorliegenden Barrieren nicht überwinden. Dazu tragen die bestehenden

strukturellen oder chemischen Eigenschaften der jeweiligen Pflanzen bei, die

bereits ohne Einwirkung von Pathogenen vorhanden sind. Zu strukturellen

Barrieren gehören die pflanzlichen Abschlussgewebe wie z. B. die Kutikula

auf der Epidermis. Zu chemischen Barrieren gehören eine Reihe von

niedermolekularen, antimikrobiell wirkenden Stoffen. Die so genannten

Phytoantizipine werden konstitutiv im Sekundärstoffwechsel gebildet; um

dabei in bestimmte Strukturen oder in bestimmten Kompartimenten gelagert

zu werden und entfalten ihre antimikrobielle Wirkung oft erst nach

Gewebezerstörung (Osbourn, 1996).

Die Überwindung dieser präfomierten Resistenzfaktoren der Pflanze durch

Ausbildung entsprechender Pathogenitätsfaktoren ermöglicht dem Pathogen

die Besiedlung des Pflanzengewebes. Entscheidend dabei sind in jedem Fall

die Genotypen der Interaktionspartner. Damit ist die Ausprägung einer

basalen Kompatibilität spezifisch gegen den jeweiligen Organismus gerichtet.

1.2 Die Erkennung von Pathogenen durch pflanzliche Organismen

Neben den präformierten passiven Resistenzfaktoren werden potentielle

Pathogene durch Signal-Sensor-Reaktionen erkannt.

Die Erkennung typischer Pathogen-assoziierter Strukturen (pathogen-

associated Patterns, PAMPS; microbial-associated Patterns, MAMPS) von

Rezeptoren der Zelloberfläche von Pflanzen wie z. B. die eines 22

Aminosäuren großen Peptids flg22 des hochkonservierten Aminoterminus

Einleitung

2

von Flagellin über die leuzinreiche (LRR)-Rezeptorkinase FLS2 aus

Arabidopsis (Felix et al., 1999; Chinchilla et al., 2006) stellt einen ersten

Schritt der effektiven Pathogen-Abwehr dar. Die daraus resultierende

erfolgreiche Abwehr wird auch PAMP-abhängige Immunität genannt oder

vereinfacht mit dem Begriff der basalen Resistenz umschrieben (Chisholm et

al., 2006; Jones und Dangl, 2006). Durch Pathogene, die diese erste Abwehr

überwinden können, folgt eine Effektoren-gesteuerte Anfälligkeit in der

Pflanze, die in einer weiteren Phase durch die spezifische Erkennung des

Effektors in einer Effektor-vermittelten Immunität enden kann (Jones und

Dangl, 2006).

Das Phänomen der Immunität von Pflanzen wurde schon 1956 in der

Pathogen-Wirtspflanze-System von Flachs (Linum usitatissimum) und

Flachsrost (Melamspora lini) beobachtet (Flor 1956). Genetische

Untersuchungen in diesem Pathosystem führten zu der „Gen für Gen“–

Hypothese, nach der für jedes Resistenz-Gen (R-Gen) in einer Pflanze ein

komplementäres Avirulenz-Gen (Avr-Gen) im Pathogen existiert (Flor, 1971).

Zwei unterschiedliche molekulare Mechanismen werden für die Erkennung

von Avr-Genen durch die R-Gene postuliert.

Bei dem Rezeptor-Liganden Modell wird angenommen, dass das R-

Genprodukt als Rezeptor des Avr-Genprodukts dient und ein Komplex aus

beiden die Resistenz induziert. Viele R- und Avr-Gene wurden identifiziert

(Baker et al., 1997) und eine direkte Interaktion von R- und Avr-Genprodukt

konnte bisher vereinzelt nachgewiesen werden. So für das Avr-Pto aus

Pseudomonas syringae und Pto aus Tomate (Tang et al., 1996) oder PopP2

aus Ralstonia solanacearum und rRRS1-PR aus Arabidopsis (Deslandes et

al., 2003). Die identifizierten R-Gene zeichnen sich oft durch hohe

Strukturähnlichkeit in rezeptor-ähnlichen Leuzin-reichen (LRR)-Domänen und

Nukleotid-bindende-Sequenzen (NBS) aus, was nahe legt, dass die Sensoren

der Pathogenerkennung und die eingeleiteten Abwehrsignalwege konserviert

sind (Hammond-Kosack und Parker, 2003). Typische LRR-NBS-Strukturen

sind bekannt für das RPM1 aus Arabidopsis thaliana, das gegen avrRPm1

aus Pseudomonas syringae gerichtet ist (Grant et al., 1995), oder das RPS2

aus Arabidopsis, welches mit avrRpt2 aus Pseudomonas interagiert (Bent et

al., 1994; Mindrinos et al., 1994).

Einleitung

3

Die Beobachtung, dass das Resistenzgenprodukt Pto aus Tomate, eine

Serin/Threonin-Proteinkinase, mit einem weiteren Protein mit typischer NBS-

LRR-R-Protein-Struktur, dem Prf, interagiert, stützt das Modell eines weiteren

molekularen Mechanismus neben dem postulierten Rezeptor-Liganden-

Modell. Nach dem Guard-Modell kommt es durch Interaktion von

Avirulenzgenprodukt und einem ersten Resistenz- oder Virulenzzielprotein

zur strukturellen Konformationsänderungen, die von einem zweiten

Resistenzprotein, dem Guard oder Wächter, erkannt wird. Erst dadurch wird

letztendlich eine Abwehrreaktion ausgelöst (Dangl und Jones, 2001).

Können die Genprodukte des Avirulenzgens nicht von denen des R-

Genprodukts erkannt werden, folgen Wachstum der Pathogene und die

Ausprägung ihrer Virulenzfaktoren, was zur Bildung von

Krankheitssymptomen führt. Diese kompatible Interaktion resultiert in der

vollständigen Etablierung der Pathogens im Blattgewebe der susceptiblen

Pflanze.

Bei der inkompatiblen Reaktion wird durch Induktion von spezifischen

Abwehrmechanismen eine Besiedlung der Pflanze durch das Pathogen

unterdrückt. Hier wird das Genprodukt des Avr-Gens von R-Genprodukten

erkannt. Bei dieser R-Gen-vermittelten Resistenz oder Wirtsresistenz kommt

es vergleichbar der PAMP-abhängigen Immunität zur Einleitung von

Abwehrmechanismen.

1.3 Abwehrmechanismen und Signalkomponenten in der Pathogenabwehr

Im Gegensatz zu dem Immunsystem der tierischen Organismen verfügen

Pflanzen über keine spezialisierten Zellen, die in einem zirkulatorischen

System einer Abwehr von Pathogenen dienen könnten. Im pflanzlichen

Organismus verfügt jede einzelne Zelle über das Potential

Abwehrmechanismen zu entwickeln und systemische Signale, als Folge

eines Angriffs mikrobieller Krankheitserreger, auszusenden und zu

empfangen (Ausubel et al., 2005; Dangl und Jones, 2001). Hierzu zählt die

Induktion von PR (pathogenesis-related)–Proteinen, die Aktivierung oder de-

novo-Synthese von Resistenzfaktoren. ZU den Resistenzfaktoren gehört die

Einleitung

4

Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Stickoxiden, die Aktivierung der

Synthesewege des Sekundärstoffwechsels resultierend in der zusätzlichen

Bildung von chemischen Barrieren, wie Phytolalexinen, und mechanischen

Barrieren, wie z. B der Verstärkung der Zellwand durch Bildung und

Einlagerung von Kallose, Silikaten und Lignin und der Induktion von

Zellwand-vernetzender Proteine (Glazebrook et al.,2005).

Ungeachtet der Vielfalt der Pathogen-Wirtspflanze-Interaktionen können die

Abwehrmechanismen vereinfacht auf wenige molekulare Mechanismen

zurückgeführt werden: Die Induktion von PR-Genen, die Auslösung von

Zelltod-Mechanismen und die vermehrte Bildung von Signalmolekülen, wie

Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen, die ihre Wirkung nicht nur auf

infizierte Bereiche sondern auch weiter entfernte Bereiche entfalten können.

1.3.1 Hypersensitive Reaktion und systemisch erworbene Resistenz

Eine der ersten Reaktionen der R-Gen-vermittelten Resistenz bei

Pathogenbefall der Pflanze ist häufig eine lokal begrenzte Resistenzreaktion.

Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) im

Apoplasten, der „oxidative burst“, führt zur hypersensitiven Reaktion und zur

Akkumulation von Salicylsäure (Glazebrook et al., 2005; Grant et al., 2000).

Die hypersensitive Reaktion (HR) ist durch schnellen Zelltod der infizierten

Zellen charakterisiert (Hammond-Kosack et al., 1996). Neben den

Abwehrmechanismen, die durch die Erkennung in der betroffenen Zelle

ausgelöst werden, findet auch eine Immunisierung des umliegenden

Gewebes und der gesamten Pflanze statt. So kommt es in den restlichen

Pflanzenorganen nach der Bildung von Nekrosen, die ein Teil der HR oder

auch Krankheitssymptom sein können, zur so genannten systemisch

erworbenen Resistenz (SAR). Die SAR zeichnet sich durch die Induktion von

PR-Proteinen und Akkumulation von Salicylsäure als Regulator der PR-

Protein-Induktion in den nicht befallenen Geweben und Organen aus.

Infolgedessen kann eine lang anhaltende, bisweilen lebenslange Resistenz

gegenüber einem breiten Spektrum von Pathogenen beobachtet werden

(Durrant und Dong, 2004).

Einleitung

5

1.3.2 Reaktive Sauerstoffspezies in der Pathogenantwort

Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies gehört zu den ersten universellen

Reaktionen auf biotischen Stress. Die Bildung von ROS ist auf die Aktivität

von pH-abhängigen Zellwand-Peroxidasen und der NADPH-Oxidase

zurückzuführen (Torres et al., 2006). So zeigten z. B. atrbohD und atrbohF,

Mutanten für Homologe der katalytischen Untereinheit der NADPH-Oxidase in

Arabidopsis, reduzierte HR nach Befall durch einen avirulenten Stamm von

Pseudomonas syringae (Torres et al., 2002).

Durch die Aktivität dieser Enzyme wird im Apoplasten aus Sauerstoff das

Superoxidanionradikal (O2) generiert, das durch die

Superoxiddismutase (SOD) in Wasserstoffperoxid (H2O2) umgesetzt werden

kann. Beide können wiederum in Gegenwart von Metall-Ionen in einer so

genannten Haber-Weiss-Reaktion in hochreaktive Hydroxylradikale

umgesetzt werden (Gechev et al., 2006).

ROS sind sehr instabil. Sie erweisen sich als direkt toxisch gegenüber

Pathogenen und sind in hohen Konzentrationen auch toxisch für die

Pflanzenzelle. Bis auf das Hydroxylradikal ist es der Pflanzenzelle möglich,

die ROS zu detoxifizieren und ein Gleichgewicht aufrechtzuerhalten (Mittler et

al., 2004). Dazu dienen verschiedene reduzierende Moleküle und Enzyme

wie Ascorbat, Gluthathion und Ascorbat-Peroxidasen, Superoxiddismutasen

oder Katalasen.

Durch diese Kontrolle sind vielfältige Funktionen möglich. ROS tragen durch

Vernetzung von Lignin und Verknüpfung von hydroxyprolin-reichen Proteinen

mit Polysacchariden der Zellwand zur Bildung zusätzlicher mechanischer

Barrieren bei. Daneben ist nachgewiesen, dass ROS als Signale in der

Abwehr-abhängigen Genaktivierung wirken und zusammen mit anderen

Signalmolekülen, wie z.B. Salicylsäure (SA) und Stickoxiden (NO),

regulatorische Funktion übernehmen können.

Das stabilste Intermediat, Wasserstoffperoxid (mit einer Halbwertsszeit von

etwa 1 ms), das frei über die Zellmembran diffundieren und in das

umliegende Pflanzengewebe entweichen (Gechev et al., 2006) kann, gilt

dabei als Signalmolekül in der Auslösung des programmierten Zelltods, bei

der Induktion bestimmter Wasserstoffperoxid-abhängiger Gene und von PR-

Genen (Levine et al., 1994, Vandenabeele et al., 2003, Torres et al., 2006).

Einleitung

6

Demzufolge beeinflusst die Aktivität der Katalase das Ausmaß des

programmierten Zelltods. So zeigt z. B. die cat1 Mutante in Tabak unter

abiotschem Stress Induktion von PR-1 und vermindertes Wachstum eines

avirulenten Stamms von Pseudomonas syringae (Chamnongpol et.al., 1996).

1.3.3 Abwehrstrategien gegen biotrophe oder nekrotrophe Pathogene

Die Aktivierung einer Salicylsäure-abhängigen Resistenz ist als eine Folge

des „oxidative burst“ und des R-Gen vermittelten Abwehrmechanismus

gegenüber biotrophen Pathogenen zu betrachten (Glazebrook et al.; 2005).

Modifizierte Pflanzen, die keine oder nur vermindert Salicylsäure in

produzieren, zeigen eine verstärkte Anfälligkeit gegenüber biotrophen

Organismen (Delaney et al.; 1994). Die HR als Ergebnis dieser Aktivierung

erweist sich als erfolgreiche Abwehrstrategie zur Begrenzung des

Pathogenbefalls, da durch das Absterben eines lokalen Bereichs dieser Art

von Pathogenen die Nährstoffquelle entzogen wird.

Die Akkumulation von Salicylsäure führt zur Induktion von PR-Proteinen in

umliegenden Geweben und Organen und kann außerdem in flüchtiger Form

als Methylsalicylat auch zwischen Pflanzen zur SAR führen (Durrant und

Dong, 2004; Shulaev et al., 1997; Park et al., 2007).

Die Auslösung von HR stellt bei Befall durch Nekrotrophe kein effektiver

Abwehrmechanismus dar. Abwehrreaktionen gegen solche Pathogene sind

im Allgemeinen auf Jasmonsäure (JA)- und Ethylen-induzierte Mechanismen

zurückzuführen und überlappen mit den Abwehrmechanismen ausgelöst

durch Verwundung und Insektenbefall (Glazebrook, 2005). In Arabidopsis

konnte nach Inokulation mit dem nekrotrophen Pilz Alternaria brassicicola

gezeigt werden, dass die antimikrobiellen Peptide Thi2.1 und PDF1.2

unabhängig von Salicylsäure durch Jasmonsäure und Ethylen induziert

werden. Außerdem wurde festgestellt, dass die Expression von Thi2.1 und

PDF1 in der Jasmonsäure-insensitiven Mutante coi1 und Ethylen-insensitiven

Mutante ein1 in Arabidopsis ausbleibt (Penninckx et al., 1996). Unabhängig

von Salicylsäure wird in Arabidopsis durch Jasmonsäure (JA) und Ethylen die

PR-Genexpression induziert und die Abwehr von virulenten Stämmen von

Pseudomonas syringae und von Fusarium oxysporum eingeleitet (Dong,

1998). Diese antagonistische Interaktion zwischen SA und JA-abhängigen

Einleitung

7

Signalwegen von Pathogene zur erfolgreichen Infektion genutzt. In

Arabidopsis konnte nach Aktivierung des SA-ahängigen Signalwegs

ausgelöst durch Pseudomonas syringae eine verstärkte Anfälligkeit

gegenüber dem nekrotrophen Pilz Alternaria brassicicola beobachtet werden

(Koorneef und Pieterse, 2008). Synergistische Interaktionen zwischen SA-

und JA eingeleiteten Abwehrwegen sind daneben auch bekannt (Van Wees

et al., 2000). Diese Abhängigkeiten der jeweiligen Signalwege ermöglicht

damit einer Reihe von Pathogenen die Besiedlung der Pflanze (Pieterse und

Dicke, 2007). Insgesamt ist die Abwehr von nekrotrophen und biotrophen

nicht nur auf SA oder JA-abhängige Signalwege beschränkt, sondern kann

auch durch den Einfluss anderer Moleküle mit Signalcharakter, wie

Abscisinsäure und Ethylen, zurückgeführt werden (Koorneef und Pieterse,

2008).

1.3.4 Pflanzliche Proteasen

Über 500 Proteasen sind im Arabidopsis-Genom codiert (Beers et al., 2004).

Die größte Funktion der proteolytisch aktiven Enzyme wurde bisher bei der

Regulierung des Proteinhaushalts vermutet. Mittlerweile wird vielen

Proteasen eine komplexe regulatorische Funktion im pflanzlichen

Organismus aufgrund ihrer hohen Substratspezifität, die durch limitierte

Proteolyse erreicht wird, zugeordnet (van der Hoorn und Jones, 2004; Xia,

2004).

Die Rolle von pflanzlichen Proteasen in der Pathogenabwehr ist in Modellen

in der Abbildung 1 zusammengefasst. Es ist möglich, dass Proteasen

entsprechende Elicitoren erkennen und als Folge dieser Interaktion

Abwehrreaktionen ausgelöst werden. So können Elicitoren durch Proteasen

aktiviert werden, oder aber die Elicitoren beeinflussen die Aktivität der

Proteasen, was in Abwehrreaktionen resultiert (Abb. 1. a-c). Desweiteren gibt

es Hinweise, dass durch die proteolytische Aktivität Regulatoren prozessiert

werden, die daraufhin ihre Wirkung in einem bestimmten Abwehrsignalweg

entfalten können (Abb. 1. d und e). Zuletzt können Effektoren durch

proteolytischen Abbau direkt unschädlich gemacht, peptidbasierende Toxine

freigesetzt oder weitere Abwehrproteine aktiviert werden (Abb. 1. f-h).

Einleitung

8

Abb. 1.1 : Modelle für die Rolle von Proteasen in der Pathogenabwehr. Proteasen

können in der Rezeption von Elicitoren fungieren (a-c); durch Prozessierung von

Effektoren die Abwehr beeinflussen (d, e); Abbau von Effektoren (f)

Prozessierung peptidbasiendender Toxine (g) oder inaktiven Abwehrproteinen

(h) dienen. Grüne Pfeile und rote t-Balken dienen zur Kennzeichnung positiver

oder negativer Signalwege (van der Hoorn und Jones, 2004).

Entsprechend dem Guard-Modell werden pflanzliche Proteasen als

Virulenzzielproteine diskutiert. Mit der T-DNA-Insertionsmutante

cdr1 (constitutive disease resistance) konnte eine Beteiligung einer

apoplastische Aspartat-Protease bei Pathogenbefall gezeigt werden. Die

Expression von CDR1 erweist sich nach Pathogenbefall induziert und die

cdr1-Mutante zeigt neben vermindertem Wachstum auch Resistenz gegen

avirulenten Stamm von P. syringae (Xia et al., 2004). Neueste Beweise für

die Beteiligung von Proteasen bei Abwehrmechanismen gegen Pathogene

lieferte der Nachweis der Interaktion des Avirulenzgenprodukts AVR2 aus

dem Erreger der Blattfleckenkrankheit an Tomate Cladosporium fulvum mit

RCR3, einer apoplastischen Cysteinprotease aus Tomate (Rooney et al.,

2005). 2008 konnte durch heterologe Expression von AVR2 in Arabidopsis

und Tomate eine gestiegene Anfälligkeit nach Befall durch verschiedene

prokaryontische und eukaryontische Phytopathogene demonstriert werden.

Auf diese Interaktion und die Inhibierung des nachgeschalteten Signalwegs

Einleitung

9

über das LRR-NBS-R-Protein Cf2 in planta wird das Abschwächen der

basalen Resistenz zurückgeführt (van Esse et al., 2008).

Weitere Hinweise auf die Beteiligung von Proteasen bei der Pathogenabwehr

ergeben sich aus der Ähnlichkeit pflanzlicher Proteasen zu tierischen

Cysteinproteasen, den so genannten Caspasen. Unter Caspasen versteht

man Cystein-Proteasen, die in tierischen Organismen an der Apoptose

beteiligt sind. Bisher konnte nur die Inhibition von bestimmten pflanzlichen

Cystein- und Serinproteasen durch typische tierische Caspaseinhibitoren

gezeigt werden, die über eine Funktion solcher Proteasen im Prozess des

programmierten Zelltods spekulieren lässt (Bonneau et al., 2008). Die HR der

Pathogenabwehr stellt dabei eine Sonderform des programmierten Zelltods

(PCD) dar (Dangl und Jones, 2001).

Die Entdeckung von Pathogen-sekretierten Protease-Inhibitoren legte

Proteasen abermals als Virulenzziele von Effektoren der Pathogene nahe.

Pathogene erreichen eine Umgehung der Resistenz durch die Unterdrückung

der pflanzlichen Abwehrstrategien. Dazu nutzen sie neben Toxinen und

genregulatorisch wirkenden Molekülen im Wesentlichen Proteine zur

Änderung des pflanzlichen Metabolismus (Abramovitch und Martin, 2004).

So konnten aus dem Erreger der Kraut- und Knollenfäule Phytophtora

infestans gleich mehrere sekretierte Peptide identifiziert werden, die mit

Cystein- oder Serinproteasen interagieren und ihre Funktion inhibieren (Tian

et al., 2007; Tian et al., 2005; Tian et al., 2004).

1.3.5 Pflanzliche Subtilasen

Subtilasen gehören zu der Familie der Serin-Proteasen. In der MEROPS

Datenbank für Proteasen sind sie aufgrund von Sequenzähnlichkeiten in ihrer

Primärstruktur im Clan SB mit der Familie S8 basierend auf Vergleichen der

Tertiärstruktur zu finden. Serinproteasen zeichnen sich durch den

charakteristischen Aufbau des aktiven Zentrums aus Serin (Ser), His (His)

und Asparagin (Asp) in einer katalytischen Triade aus. In dieser räumlichen

Anordnung kommt es zum Ladungsaustausch zwischen den Aminosäuren

und infolgedessen zum nukleophilen Angriff der Serins an die

Carbonylgruppe des Substratpeptids.

Einleitung

10

Namensgebend für die Subtilisin-ähnlichen Proteasen oder Subtilasen war

das Subtilisin Carlsberg aus Bacillus licheniformis. Anhand von Ähnlichkeiten

in ihrer Primärsequenz werden die Subtilasen in weitere sechs Subfamilien

unterteilt: Subtilisin, Thermitase, Proteinase K, lantibiotische Peptidasen,

Kexine und Pyrolysine (Siezen und Leunissen, 1997).

Die Proteasen der Kexin-Subfamilie enthalten eine große Gruppe von

Proproteinkonvertasen (PC). Sie sind die ersten Subtilasen die in

eukaryontischen Organismen in Form der Kex2p-Protease aus

Saccharomyces cerevisiae entdeckt wurden (Julius et al., 1984). Es stellte

sich heraus, dass die PCs in der Aktivierung regulatorischer Proteine bzw.

Peptide eine Rolle spielen wie z. B. bei der Reifung von Peptidhormonen und

Wachstumsfaktoren (Barr 1991, Seidah und Chrétien, 1999). Lediglich zwei

der neun bekannten tierischen Subtilasen mit Eigenschaften der PCs werden

der nicht der Kexin-Familie zugeordnet, die Site-1-Protease/Subtilisin-Kexin-

Isoenzym-1 der Pyrolysin-Familie (Sakai et al. 1998, Seidah et al., 1999) und

die NARC oder PCSK9 Protease K-Familie (Seidah et al., 2003). In der

Pyrolysin-Subfamilie sind alle bekannten pflanzlichen Subtilasen zu finden.

Die Zahl der Subtilasen, die im Genom von Pflanzen codiert sind, übersteigt

die derer in tierischen Organismen. Die erste in Pflanzen identifizierte

Subtilase war Cucumisin aus Cucumis melo (Yamatagata et al., 1989 und

1994).

Von den 56 in Arabidopsis thaliana identifizierten Subtilasen konnten bis jetzt

nur wenigen eine Funktionen zugeordnet werden. Den meisten bisher

entdeckten wird eine Funktion ähnlich der PC nachgesagt.

Die Analyse der sdd1 (stomatal density and distribution 1)-Mutante in

Arabidopsis zeigte, dass die SDD1-Subtilase eine wesentliche Funktion in der

Steuerung der Dichte und Verteilung der Stomata erfüllt. Expressionsstudien

ergaben, dass SDD1 stark in den stomatären Vorläuferzellen exprimiert wird

(Berger und Altmann, 2000). Das SDD1 wird vermutlich in den Apoplast der

Zellen sekretiert, wo es an der Prozessierung der für die Kontrolle der

Stomatadichte verantwortlichen Proteine beteiligt sein könnte (von Groll et al.,

2002).

Einleitung

11

Die ALE1 (abnormal leaf shape)-Subtilase wird gewebespezifisch in der

Embryoepidermis exprimiert und zeigt sich notwendig für die Bildung der

Embryoepidermis (Tanaka et al., 2001).

Mit einer T-DNA-Insertions-Mutante für AtS1P konnte deren Beteiligung bei

der Salzstressantwort nachgewiesen werden. In-vitro-Experimente zeigten,

dass AtS1P einen salz-stressabhängigen bZip-Transkriptionsfaktor spaltet

(Liu et al., 2007).

2008 konnte Rautengarten et al. mit einer T-DNA-Insertionslinie für die

Arabidopsis Subtilase atSBT1.7 eine weitere Rolle von Subtilasen während

der Samenentwicklung nachweisen. AtSbt1.7 wird vorwiegend in den sich

entwickelnden Samenschalen exprimiert und die Deletion erweist sich

verantwortlich für eine veränderte Bildung der Schleimschicht der äußeren

Samenhülle.

Eine weitere Funktion von Subtilasen legte die Entdeckung der so genannten

Saspasen nahe. Als Saspasen werden Serin-Proteasen mit caspase-

ähnlichen Eigenschaften bezeichnet (Bonneau et al., 2008). In Avena sativa

werden Saspasen während einer durch Dunkelheit induzierten Seneszenz

exprimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sie in dem Abbau der

Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (RuBisCO) involviert sind,

was eine eventuelle Rolle bei dem darauf folgenden programmierten Zelltod

nicht ausschließt (Coffeen und Wolpert, 2004).

1.3.6 Die Subtilasenfamilie in Tomate (Solanum lycopersicum)

Die Familie der Pyrolysin-Subtilasen in Tomate umfasst 15 identifizierte

Mitglieder. Sie ist aufgrund von Sequenzhomologien in fünf Gruppen

unterteilt: die Einzelgenfamilen tmp, slsbt1 und slsbt2 und die

Multigenfamilien p69 und slsbt3, slsbt4. (Meichtry et al., 1999). Bis auf tmp

enthält keines dieser Subtilasengene Introns. Die Ähnlichkeit der jeweiligen

Aminosäuresequenzen innerhalb einer Unterfamile beläuft sich auf bis zu

98 %, die der Familien untereinander liegt zwischen 34 % und 54 % (Meichtry

et al., 1999).

Einleitung

12

Abb. 1.2: Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie in Tomate (Solanum

lycopersicum). Dargestellt ist ein Evolutinsbaum basierend auf

Aminosäuresequenzen hergeleitet aus cDNA und den Subtilasengenen. Die

Nummern geben die PAM-Distanzen zwischen den Sequenzen an (accepted

point mutations per 100 residues). (Meichtry et al., 1999)

Über die Funktion der Tomatensubtilasen ist bisher wenig bekannt. In ersten

Studien wurde den Tomatensubtilasen aufgrund von Strukturähnlichkeiten

eine Funktion ähnlich der PCs zu geschrieben, wie sie mit Identifikation von

SBP50, einer Subtilase der Kex2p-ähnlichen Familie, nahe gelegt wurde.

SBP50 interagiert mit Systemin, dem Peptidhormon für die wundinduzierte

Abwehrreaktion (Pearce et al., 1991) und konnte mit einem Antiserum gegen

PCs aus Drosophila nachgewiesen werden (Schaller und Ryan, 1994).

Eine Rolle der Tomatensubtilasen in der Pathogenabwehr konnte erstmals

1996 in Viroid-befallenen Tomatenpflanzen entdeckt werden (Tornero et al.,

1996 a). Die Spaltung des Proteins LRP, eines extrazellulären Proteins mit

LRR-Struktur aus Tomate, wird auf die Induktion von P69-Subtilasen

zurückgeführt (Tornero et al., 1996 b). Nachdem weiterer Mitglieder der P69-

Familie identifiziert wurden, ist diese Funktion auf die Familienmitglieder

P69B und P69C eingegrenzt worden. Beide Subtilasen werden nach

Inokulation mit einem avirulenten Stamm von Pseudomonas und nach

Einleitung

13

exogener Zugabe von Salicylsäure zusammen mit PR-Genen exprimiert

(Jordá und Vera, 2000).

Für die weiteren Vertreter der P69 Subtilasen kann eine Rolle in der

Pathogenabwehr aufgrund ihrer gewebe- und entwicklungsabhängigen

Expressionsmuster nicht ausgeschlossen werden. (Jordá und Vera, 2000).

Die meisten charakterisierten Subtilasen werden in Geweben oder

Entwicklungsstadien exprimiert, die in Form von natürlichen Öffnungen

wachstumsfördernde, nährstoffreiche Bereiche für eine erfolgreiche

Besiedlung durch Pathogene bezeichnet werden können und ideale

Eintrittsorte für Pathogene in die Pflanze darstellen. So konnte zum Beispiel

über semiquantitaive RT-PCR und GUS-Reportergenanalysen P69E in allen

Entwicklungsstadien der Wurzel und P69F in Hydathoden nachgewiesen

werden (Jordá et al., 1999).

Expressionsstudien legten für die Vertretrer der SlSBT-Subfamilien ähnliche

Expressionsmuster offen, somit kann für die Vertreter der SlSBT-Subfamilien

eine ähnliche Funktion in der Pathogenabwehr vermutet werden (Ullrich,

Diplomarbeit; Huttenlocher, unveröffentlicht).

GUS-Reportergenanalysen zeigten für SlSBT1 eine Expression in

Abzissionszonen der Blüten, Früchten und Blättern (Cedzich, pers.

Mitteilung). Analysen mit Reportergen, semiquantitativer RT-PCR und

Northern Blot konnten für SlSBT2 eine Expression in allen grünen Organen

und hier interessanterweise ausschließlich in Zellen der Stomata nachweisen.

Zudem konnte das Transkript auch im mikropylaren Endosperm und auf der

Oberfläche der Stigma nachgewiesen werden (Kathrin Ullrich, Diplomarbeit).

SlSBT3 wurde über GUS-Reportergenanalyse, semiquantitativer RT-PCR

und Northern Blot-Analysen in allen Organen und Entwicklungsstadien

nachgewiesen, wobei sich eine besonders starke Expression im

Wurzelgewebe detektieren ließ. Daneben wurde eine abhängige Induktion in

Blättern nach Verwundung und Befall von Fraßschädlingen als auch nach

Inokulation mit Xanthomonas campestris nachgewiesen (Franziska

Huttenlocher, unveröffentlicht).

Einleitung

14

1.4 Zielsetzung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine mögliche Rolle der SlSBT3 in der

Pathogenabwehr detaillierter untersucht werden. Hierzu sollte die Expression

nach Befall durch biotrophe Bakterien, einen hemibiotrophen Oomyceten und

einen nekrotrophen Pilz und nach Behandlung mit ausgewählten

Signalmolekülen untersucht werden. Außerdem sollte eine phänotypische

Charakterisierung in SlSBT3-RNA-Interferenz (RNAi)- und SlSBT3-

überexpremierenden Tomatenpflanzen bezüglich des Wachstumsverhaltens

der Bakterien und der Unterschiede der gebildeten Krankheitssymptome im

Vergleich zum Wildtyp durchgeführt werden.

Material und Methoden

15


2.1 Material

2.1.1 Pflanzen

Die verwendeten Tomatenpflanzen (Solanum lycoperiscum; Sl) waren vom

Kultivar UC82B. Entsprechende Samen des Wildtyps wurden von Royal Sluis

(Enkhuizen, NL) bezogen.

2.1.1.1 SlSBT3-Promotor::GUS-Linien

Für die SlSBT3Promotor::GUS Pflanzen war durchgeführt von E. Sieferer, ein

1,9 kb großes Promoterfragment der SlSBT3-Gens mit dem uidA-Gen aus

E.coli, das für die für die β-Glucuronidase (GUS) kodiert, in den binären

Vektor pBI101 kloniert worden. Durch die Transformation der Tomaten-

Wildtyppflanzen mit Agrobakterien wurde eine kanamycinresistente T0-

Generation generiert, von der drei T2-Linien für die Versuche verwendet

wurden: GUS-12-1, GUS-14-2, GUS-5-3.

2.1.1.2 SlSBT3-RNAi-Linien

In den RNAi-Linien wurde durch RNA-Interferenz-Technik eine Supression

der mRNA der SlSBT3 erzielt. Dazu war von E. Sieferer ein ca. 250 bp

großes Fragment vom 5’-Ende der SlSBT3-cDNA in sense und anitsense

Orientierung in pHannibal kloniert worden und anschließend die gesamte

Expressionskassette in den binären Expressionsvektor pART27 umkloniert

worden. Durch Agrobakterien vermittelte Transformation wurde das konstrukt

in Tomatenpflanzen eingebracht. Von den fünf zur Verfügung stehenden

Linien wurden für die folgenden Versuche die Samen der T2-Generation der

Linie SlSBT3 HP-21-7 verwendet.


16

2.1.1.3 SlSBT3-Überexpressions-LInien

Die SlSBT3 überexprimierenden Pflanzen wurden von Prof. Dr. A. Schaller

zur Verfügung gestellt. Hier war der ORF der SlSBT3-cDNA in den binären

Vektor pRD400 mit dem CaMV-35S-Promotor kloniert worden. Die

Modifizierung der Pflanzen wurde mit Agrobakterien vermittelter

Transformation erreicht. Für die durchgeführten Versuche wurde die

homozygote Linie G2f1D verwendet.

2.1.2 Bakterien

Stamm gentechnisch modifiziert Pathogenität

Xcv 85-10

-

virulent

Xcv 85-10 pDSk200 avirulent

Xcv 85-10 hrpA-G nicht pathogen

Für die vorliegende Arbeit wurden drei isogene Linien vom Stamm

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) 85-10 verwendet. Alle wurden

von dem Institut für Pflanzengenetik der Universität Halle (Prof. Dr. U. Bonas)

für die vorliegende Arbeit zur Verfügung gestellt.

2.1.3 Pilze: Sclerotinia sclerotiorum

Name Sclerotinia sclerotiorum (SSD)

Isolat Dachbrand

Herkunft aus Tabak (Nicotiana benthaminiana)

Das Isolat wurde für die Versuche der vorliegenden Arbeit vom Institut für

Phytomedizin (Dr. A. Walz) der Universität Hohenheim zur Verfügung gestellt.

2.1.4 Oomyceten: Phytophtora infestans

Name Phytophtora infestans

Isolat Freising


17

Herkunft aus Kartoffel (Solanum tuberosum)

Das Isolat wurde für die Versuche der vorliegenden Arbeit vom Institut für

Botanik (AG Prof. Dr. Spring) der Universität Hohenheim zur Verfügung

gestellt.

2.1.5 Plasmide

pBluescript/SlSBT3 enthält die SlSBT3-cDNA

pBluescipt/SlPR1a enthält die SlPR1a-cDNA

pBluescript/SlPR3a enthält die SlPR3a-cDNA

pBluescript/SlUBQ enthält die SlUBQ-cDNA

Die Plasmide wurden von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt.

2.1.6 Oligonukleotide

Primer Sequenz

Solanum lycopersicon

Actinfor-RT TGTGGGAGATGAAGCTCAATCG

Actinrev-RT TCAAACTATCAGTGAGGTCACG

SlSBT3, for ACTCCTCAAGATTACGTAAATCTCC

SlSBT3, rev CAATAATAGGAGATGTTACTATCGG

SlACO, for ACGCAGGAGGCATCATACTTCTGT

SlACO, rev AGGCTAATGACATTCGTGTCCCGT


18

Sclerotinia sclerotiorum

SSgpd* OL742 ATCCCATGGGCTGAGTCTGAG

SSgpd* OL743 ATTGGCGGCCTTCTTGATG

Phytophtora infestans

PiEF2α, for TGACGCTATCGCCAAGGAATC

PiEF2α, rev TAACGCTGAGCCGTAATGGGGG

Oligonukleotide wurden von der Firma Operon (Köln) generiert.

2.1.7 Enzyme

DNAse I DNAse I

MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Reverse Transkriptase RevertAID™ M-MuLV Reverse

Transkriptase

MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Taq-Polymerase thermostabile DNA-Polymerase aus

Thermus aquaticus

PEQlab, Erlangen

2.1.8 Antikörper

Anti-SlSBT3 Polyklonal, (aus Kaninchen),

von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt

Anti-Kaninchen IgG Peroxidase Konjugat, Calbiochem, Darmstadt

2.1.9 Chemikalien

Agarose Life Technologies, Eggenstein

Bacto-Trypton Difco Laboratories, Detroit

Biomalz Difco Laboratories, Detroit

Bradford Reagenz (Protein Assay) BioRad, Hercules CA

Brilliant Blau R Roth, Karlsruhe


19

Cantharidin Sigma-Aldrich, München

dNTP-Mix Bioline, London

EDTA Fluka AG, St. Louis

Fotoentwickler Kodak, Paris

Fotofixierer Kodak, Paris

Gemüsesaft Amecke, Menden

GeneRuler™1kb DNA Ladder MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Katalase Sigma-Aldrich, München

Magnesiumchlorid Fluka AG, St. Louis

Plant Agar Duchefa, Haarlem

Ponceau S Sigma-Aldrich, München

Potato Dextrose Agar (PDA) Roth, Karlsruhe

Protease Inhibitor Mix P Serva, Heidelberg

Salicylsäure Sigma-Aldrich, München

Sarcosin ICN, Aurorar

Weizenstärke Sigma-Aldrich, München

X-Gluc Duchefa, Haarlem

Yeast Extract Difco Laboratories, Detroit

2.1.10 Geräte

Blottingapparatur LKB Bromma/Pharmacia

Elektrophoreseapparatur EasyCast Elektrophoresis

(für Agarosegele) Systems, Owl Scientific Inc.

Elektrophoreseapparatur Bio-Rad

(für Polyacrylamidgele)

Photometer Biophotometer, Eppendorf

Typhoon Trio + Variable Mode Imager, Amersham

Biosciences

UV-Crosslinker UV-Stratalinker 1800, Stratagene


20

2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht von Tomatenpflanzen

2.2.1.1 Behandlung der Tomatensamen zur Dekontamination von Viren

Alle Samen wurden gegen einen möglichen Befall von Viren wie mit z. B. dem

Tomaten Mosaikvirus (ToMV) oder dem Tabak Mosaik Virus (TMV)

behandelt. Dazu wurden die Samen über Nacht bei 70 °C behandelt und

danach 5 min in 70 % Ethanol gewaschen. Anschließend wurde das Ethanol

in zwei kurzen Waschschritten durch ddH2O ersetzt und nach Entfernen des

Wassers die Samen in ausreichend 10% Trinatriumphosphat (TNP)

aufgenommen. Die in der Lösung frei schwimmenden Samen wurden für 3 h

unter ständigem Schütteln so dekontaminiert. Vor der Aussaat wurde das

TNP durch drei- bis fünfmaliges Waschen mit ddH2O entfernt und die Samen

einzeln 5-10 mm tief von Erde bedeckt ausgebracht.

2.2.1.2 Anzuchtbedingungen

Die Tomatenpflanzen wurden im Gewächshaus bei Langtagbedingungen

(16 h Licht) und einer Mindesttemperatur von 26 °C angezogen. Die Aussaat

erfolgte in Töpfen (Ø 4 cm). Nach vollständiger Durchwurzelung, spätestens

nach 4 Wochen, wurden die Pflanzen in größere Töpfe (Ø 14 cm) umgetopft.

Die Bedingungen bei Versuchen im Klimaschrank waren: 22 °C, 16 h Licht

mit einer Lichtintensität von 25 µmol Photonen/m2 s).

2.2.2 Kultivierung von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

Nutritient yeast growth 5 g/l Bactopepton

(NYG) 3 g/l Hefeextrakt

20 % (w/v) Glycerin


21

Selektionsmedien

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) wurde auf NYG-Medium

kultiviert. Bei diesem Medium handelt es sich um ein Minimalmedium, das zur

Induktion der Virulenz der Bakterien verwendet wird. Für die einzelnen

Stämme wurde abhängig von der jeweiligen Resistenz das entsperchende

Antibiotikum in der angegebenen Menge zugegeben. Für Dauerkultur auf

Agarplatten wurden die Bakterien vereinzelt und für 48 h bei 30 °C inkubiert.

Diese Dauerkulturen wurden max. 10 Tage bei 4 °C aufbewahrt. Zum

Animpfen von Über Nachtkulturen wurden davon 3-4 Kolonien entnommen. Aus einer gut bewachsenen Über Nachtkultur angelegt wurde für alle

Stämme Glycerinkulturen angelegt (Endkonzentration Glycerin: 20 %). Die

Lagerung von Glycerinkulturen erfolgte und bei -80 °C.

2.2.3 Kultivierung von Sclerotinia sclerotiorum

Biomalz-Peptonagar 2 % (w/v) Malzin

(BMP) 0,2 % (w/v) Pepton (Fleischextrakt)

1,5 % (w/v) Agar

½ Potato Dextrose Agar 1,95 % (w/v) PDA

(PDA) 0,2 % (w/v) Hefeextrakt

1 % (w/v) Weizenstärke

Zur Erhaltung der Virulenz wurde die Dauerkultur bei 20 °C auf BMP

inkubiert. Zur Inokulation wurde das Isolat von BMP auf ½ PDA überführt und

für 4 Tage im Dunkeln bei 20 °C inkubiert.

Für eine Glycerinkultur wurden von einer 10 Tage bewachsenen Platte

(½ PDA) die Dauerstadien (Sclerotien) in Glycerin aufgenommen und bei

Stamm Antibiotikum

Xcv 85-10

Rifampicin 100 µg/ml

Xcv 85-10 pDSk200 Rifampicin 100 µg/ml

Spectinomycin 50 µg/ml

Xcv 85-10 ∆hrpA-G Rifampicin 100 µg/ml


22

-80 °C eingefroren bzw. abgenommen und in einem Reaktionsgefäß bei

Raumtemperatur trocken gelagert.

2.2.4 Kultivierung von Phytophtora infestans

Gemüseagar 2 g/l CaCO3

25 % (v/v) Gemüsesaft

12 g/l Agar

Rye B Agar (zur Sporulation) 15 g/l Bacto-Agar

20 g/l Saccharose

in Roggenextrakt

Zur Erhaltung der Virulenz wurde das Isolat zur Inokulation max. acht

Generationen auf Gemüseagar bei 16 °C inkubiert und danach eine

Generation auf Rye Agar B zur Sporulation oder auf Gemüseagar zusammen

mit einer oberflächensterilisierten Kartoffelscheibe im Dunkeln bei 16 °C

inkubiert.

Für Rye Agar B wurde 60 g Roggen über Nacht mit Wasser überschichtet

und bei Raumtemperatur gequollen. Der Überstand wurde entnommen und

aufbewahrt. Der Roggen wurde ohne zu mischen in 2 l ddH2O 1 h aufgekocht

und dabei nach Bedarf auf 2 l aufgefüllt. Der noch warme Roggen wurde über

ein Tuch abfiltriert und die aufgenommene Flüssigkeit aus dem Sud gepresst.

Beide Extrakte wurden vereinigt, mit Agar und Saccharose versetzt und

autoklaviert.

2.2.5 Infiltration von Xcv in Tomatenblätter

Zur Inokulation wurden aus einer Über Nachtkultur 100 µl ausplattiert und für

48 h bei 30 °C inkubiert. Die Bakterien wurden steril von Agarplatten

entnommen und in 25 ml 1 mM Mg2Cl aufgenommen. Die optische Dichte der

Suspension wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt. Ausgehend von

diesem Wert wurde dann die Bakeriendichte auf 108 cfu/ml (OD600: 0,4)

eingestellt; für die Erstellung der Wachstumskurven wurden die Bakterien auf

eine cfu/ml von 104 verdünnt.


23

Zum Nachweis der Induktion der SlSBT3 wurden pro Probenzeitpunkt das

vordere Fiederblatt des drittältesten Blattstadiums von drei fünf Wochen alten

Pflanzen abgeschnitten und infiltriert. Hierfür wurden die Blätter eines

Probenzeitpunkts in 200 ml der Bakteriensuspension mit 0,04 % Silwet L77

im Exikator infiltriert (3 x 10 min; 100 mbar). So war eine Inokulation der

gesamten Blattoberfläche sichergestellt. Alternativ wurde die Lösung mit einer

2 ml Spritze mit bis zu 4 Infiltrationspunkten an der Blattunterseite infiltriert

ohne die Blätter davor abzuschneiden.

Zur Untersuchung der Symptome und des Bakterienwachstums im

Blattgewebe wurde die Suspension an der Blattunterseite mit der Spritze

injiziert. Die Suspension wurde in den vorderen Teil der zwei vorderen

benachbarten Fiederblätter des drittältesten Blattstadiums an der

Blattunterseite mit der Spritze bis in die Blattspitze infiltriert. Dabei wurden

möglichst wenige Infiltrationspunkte gesetzt, d.h. maximal drei, damit eine

homogene Verteilung der Bakterien im Blattgewebe gewährleistet war.

2.2.6 Reisolierung von Xcv aus Blattgewebe

Pro Probenzeitpunkt wurden mit einem Korkbohrer (Durchmesser: 1 cm) aus

den zwei infiltrierten vorderen Fiederblättern des drittältesten Blattstadiums

von je drei fünf Wochen alten Pflanzen eine Blattscheibe aus der Blattspitze

ausgestanzt. Nach kurzer Oberflächensterilisation der 6 Blattscheiben in

25 ml 70 % Ethanol und anschließendem kurzen Waschen in 1 mM MgCl2

wurden die Blattscheiben auf Zellstoff getrocknet und jeweils in 100 µl 1 mM

MgCl2 in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit einem sterilen Plastikpistill

mazeriert. Der Pistill wurde mit 900 µl 1 mM MgCl2 abgespült. Ausgehend von

dieser ersten Verdünnung (1:10) wurden die folgenden Verdünnungen

abhängig vom Bakterienstamm bis zu einer Verdünnung von 1:108

hergestellt. Nach Erstellung der Verdünnungstufen wurden 10 µl auf eine

Agarplatte getropft, die Agarplatte um 90° gedreht, damit die Suspension bis

ca. 1 cm vor dem unteren Rand sich verteilt, und vollkommen trocknen

gelassen. Um eine Kontamination mit Pilzen zu vermeiden wurden dem

verwendeten Selektionsmedium (s. 2.2.2 zusätzlich Cefotaxim (50 µg/ml) als

Antimykotikum zugesetzt. Die so beimpften Platten wurden anschließend mit


24

Parafilm verschlossen und drei Tage bei 30 °C inkubiert. Anschließend

wurden die Kolonien pro Verdünnung ausgezählt.

2.2.7 Statistische Auswertung des Wachstumsverhaltens von Xcv

im Blattgewebe

Für die statistische Auswertung wurde nur die cfu/ml einer Verdünnungsstufe

berücksichtigt und hierbei die niedrigste Verdünnungsstufe gewählt, bei der

eine Dokumentation der Kolonienzahl möglich war. Von den sechs ermittelten

Werten wurde als Lagemaß der arithmetische Mittelwert mit

Stichprobenvolumen (n=4) berechnet, dazu wurden der jeweils höchste und

der niedrigste ermittelte Wert gestrichen. Die Standardabweichung wurde

ausgehend von einem Stichprobenvolumen n-1 ermittelt.

a) Berechnung der cfu/cm2:

cfu/Blattscheibe=cfu*Verdünnung

cfu/cm2=cfu*Verdünnung/(0,52ת)

b) Berechnung des Mittelwerts:

c) Berechnung der Standardabweichung einer Stichprobe:

Dabei entspricht n dem Stichprobenumfang und x dem Stichprobenmittelwert.


25

2.2.8 Inokulation von Tomatenblättern mit S. sclerotiorum

Zur Inokulation wurden aus vier Tage inkubierten Agarplatten Blöcke von

einem Durchmesser von 0,5 cm mit einem Korkbohrer ausgestanzt. Dabei

wurden ausschließlich Bereiche des jüngsten Myzels verwendet. Die Blöcke

wurden mit der Seite des Myzels auf die Oberseite eines vorderen

Fiederblatts des drittältesten Blattstadiums von fünf Wochen alten Pflanzen

inokuliert. Die Blätter wurden hierfür abgeschnitten und drei Blätter pro

Probenzeitpunkt in durchsichtige Plastikboxen gelegt. Für die Erhaltung

dieser Blätter über den Versuchszeitraum wurden die Boxen mit feuchtem

Zellstoff (20 ml ddH2O auf zwei Lagen Zellstoff) bis zum Rand ausgelegt, mit

Frischhaltefolie am Boden bedeckt und bis zu vier Tagen im Klimaschrank

belassen.

2.2.9 Inokulation von Tomatenblätter mit P. infestans

Die Inokulation mit Phytophtora infestans erfolgte über das Stadium der

Sporangien. Dafür wurde das Myzel von zehn Tage alten Gemüseagarplatten

mit ca. 10 ml 4 °C kalten dH2O überflutet, mit Hilfe eines Glasspatels eine

Suspension hergestellt und über eine einfache Lage Miracloth (Calbiochem,

Porengröße: 22-25 µm) abfiltriert, um die Sporangien von den Myzelresten zu

trennen. Die Sporendichte wurde mit Hilfe der Neubauer-Kammer am

Mikroskop bestimmt und durch Zentrifugieren bei 100 x g und

Resuspendieren der Sporen in einem geringeren Volumen dH2O auf 1000

Sporen pro ml eingestellt.

Die Suspension wurde in 10 µl Tropfen an vier Stellen auf die Blattunterseite

getropft. Die Blätter wurden hierfür abgeschnitten und pro Probenzeitpunkt

wurde ein vorderes Fiederblatt des drittältesten Blattstadiums fünf Wochen

alter Pflanzen in durchsichtige Plastikboxen gelegt. Für die Erhaltung dieser

Blätter über den Versuchszeitraum wurden die Boxen mit feuchtem Zellstoff

(20 ml ddH2O auf zwei Lagen Zellstoff) bis zum Rand ausgelegt, mit

Frischhaltefolie am Boden bedeckt und bis zu vier Tagen mit der

Blattunterseite nach oben im Klimaschrank belassen.


26

2.2.10 Behandlung von Tomatenpflanzen mit Salicylsäure

Lösung 1,5 mM Salicylsäure

10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6.8

Zur Behandlung von Tomatenpflanzen mit Salicylsäure wurde eine

entsprechende Menge in 10mM Kaliumphosphat lichtgeschützt über Nacht

gelöst. Für eine exogene Zugabe der Salicylsäure wurden zwei

unterschiedliche Methoden verwandt. Zur Applikation wurde eine

Salicylsäurelösung mit 0,1 % Tween 20 verwendet. Diese wurde mit Hilfe

einer Sprühflasche auf die Blattoberfläche 2 Wochen alter Tomatenpflanzen

gegeben. Entsprechende Kontrollpflanzen wurden mit 10 mM

Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 % Tween 20 behandelt. Alternativ wurden

Pflanzen gleichen Alters an der Bodengrenze abgeschnitten und in

Reaktionsgefäße mit 100 µl Salicylsäurelösung überführt. Die Pflanzen

konnten so über das Leitgewebe die Salicylsäurelösung aufnehmen. Erst

wenn das gesamte Volumen aufgenommen war (nach max. 2 h), wurden die

Pflanzen in Glaskolben mit H2O überführt. Die Kontrollpflanzen wurden

jeweils in 100 µl Kaliumphosphatpuffer gestellt und genauso behandelt.

Die Probenentnahme erfolgte 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h und 48 h nach

Behandlung statt. Für jede Probe wurden jeweils die zei entwickelten

Fiederblätter von drei Pflanzen vereinigt und in flüssigem Stickstoff

eingefroren.

2.2.11 Infiltration von Katalase

Lösung 2000 U/ml Katalase

10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.0

Für die Infiltration mit Katalase wurden die Blätter wie für die Inokulation mit

pathogenen Pilzen abgeschnitten. Die Katalase wurde unmittelbar vor der

Infiltration in Puffer gelöst und mit Hilfe einer Spritze an der Blattunterseite

infiltriert. Der infiltrierte Bereich umfasste dabei einen Durchmesser von etwa

2 cm.


27

2.2.12 Infiltration von H2O2

Lösung 10 mM H2O2

in ddH2O

Für die Infiltration mit Wasserstoffperoxid wurden die Blätter abgeschnitten

und mit einer 2 ml Spritze an der Blattunterseite infiltriert. Die Blätter wurden

wie für die Inokulationen mit pathogenen Pilzen in Plastikboxen im

Klimaschrank belassen. Die Probenentnahme erfolgte 48 h nach Infiltration.

2.2.13 Infiltration von Cantharidin

Lösung 5 µM Cantharidin

Für die Infiltration wurde zunächst eine 50 mM Stammlösung angesetzt. Dazu

wurde die die entsprechende Menge Cantharidin in 1 ml 70 % Ethanol gelöst

wurde und dann auf das entsprechende Volumen mit ddH2O eingestellt. Die

Blätter wurden abgeschnitten und mit einer 2 ml Spritze an der Blattunterseite

infiltriert. Anschließend wurden sie wie für die Inokulationen mit pathogenen

Pilzen in Plastikboxen im Klimaschrank belassen. Die Probenentnahme

erfolgte bei Bildung von Läsionen nach 72 h.

2.2.14 GUS-Färbung

GUS-Puffer 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.0

10 mM EDTA pH 8.0

3 mM K4[Fe(CN6)]

0,5 M K3[Fe(CN6)]

0,1 % Triton X-100

1 mg/ml X-Gluc

Die komplette Blattfläche wurde in bis zu 10 ml GUS-Färbelösung 3x 1 min

bei 100 mbar vakuuminfiltriert und im Dunkeln über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Anschließende Entfärbung zur besseren Sichtbarkeit des gebildeten

Präzipitats erfolgte mit 70 % bzw. 100 % Ethanol bis zur völligen Entfernung

des Chlorophylls aus dem Blattgewebe.


28

2.2.15 DNA-Extraktion

DEX-Puffer 0,14 M Sorbitol

0,22 M Tris-HCl pH 8.0

0,22 M EDTA pH 8.0

0,8 M NaCl

0,8 % CTAB

1 % Sarcosin

2 % β-Mercaptoethanol

TE-Puffer 10 mM Tris-HCl pH 8.0

1 mM EDTA

Für die Extraktion genomischer DNA wurden ca. 10 mg Blattmaterial mit

flüssigem Stickstoff und mit der Hilfe eines gekühlten Pistills zu einem feinen

Pulver zermörsert. Anschließend wurden 100 µl DEX-Puffer zugesetzt und

kurz resuspendiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde die Probe

30 min lang bei 65 °C inkubiert und anschließend zentrifugiert (10000 x g,

5 min, RT). Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Die

in dem Überstand befindliche DNA wurde mit 100 µl Isopropanol für 15 min

bei RT gefällt und danach abzentrifugiert (15 min, 4 °C, 13000 x g). Das

Präzipität wurde dann mit 70 % Ethanol gewaschen und nach einem weiteren

Zentrifugationsschritt (10 min, 4 °C, 13000 x g) in 30 µl TE gelöst. Für die

PCR wurde 1 µl DNA als Matrize verwendet. Der Rest wurde bei -20 °C

eingefroren.

2.2.16 Gelektrophorese von DNA

50х TAE (1l) 242 g Tris-HCl

57,1 ml Essigsäure

100 ml 0,5 M EDTA

Ladepuffer (10x) 50 % Glycerin

1 mM EDTA

0,03 % Bromphenolblau oder Xylencyanol


29

Die Auftrennung von Nukleinsäuren erfolgte auf TAE-Agarosegelen (1,5 %

Agarose, 1 % Ethidiumbromid) in 1x TAE-Puffer bei 80 V bis 120 V. Die

aufgetragenen Proben wurden mit 10x Ladepuffer versetzt (Endkonzentration

Ladepuffer: 1x). Als Größenstandard wurden 5 µl GeneRuler™ 1 kb DNA

ladder aufgetragen. Nach der Auftrennung wurde die DNA unter UV-Licht im

Gel sichtbar gemacht und durch Fotos dokumentiert.

2.2.17 RNAse-freies Arbeiten

Um ein RNAse-freies Arbeiten zu ermöglichen wurden alle angesetzten

Lösungen mit 0,01 % DEPC-behandelt und zweimal 45 min autoklaviert.

Glaswaren wurden über Nacht bei 250 °C sterilisiert, Reaktionsgefäße,

Spitzen und weiteres Verbauchsmaterial aus Plastik wurden 45 min

autoklaviert. Apparaturen, Schlitten und Kämme der

Gelektrophoreseapparatur wurden mit herkömmlichen Spülmittel gewaschen,

über Nacht in einer Spülmittellösung eingeweicht und danach mit dH2O

ausgespült.

2.2.18 RNA-Extraktion

Extraktionspuffer 75 mM NaCl

25 mM Tris/HCl pH 8.0

25 mM EDTA pH 8.0

1 % SDS

1 M β-Mercaptoethanol

PClphenol 50:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol

PCl 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol

5x Ladepuffer 2 µl 0,5 M EDTA

25 µl 1 % BPB

50 µl Glycerol

1 µl 10 mg/ml EtBr

22 µl ddH2O


30

Für die RNA-Isolation wurden 300 mg Blattmaterial in flüssigem Stickstoff zu

einem feinen Pulver zerrieben. Anschließend wurde das Pulver in ein

Reaktionsgefäß überführt, mit 800 µl Extraktionspuffer versetzt und gemischt.

Dann wurden 750 µl PClphenol zugegeben und der Ansatz gut resuspendiert.

Für die Aufbereitung mehrerer Proben wurden die so präparierten Proben für

max. 2 h auf Eis mit zwischenzeitlichem Resuspendieren gelagert. Das

Gemisch wurde 10 min abzentrifugiert (4° C, 13000 x g). Die obere Phase

wurde abgenommen, zweimal mit einem Volumen PCl extrahiert und

zentrifugiert (4° C, 13000 x g). Anschließend erfolgte ein zusätzlicher

Extraktionsschritt mit einfachem Volumen Chloroform. Das

Extraktionsgemisch wurde erneut abzentrifugiert (4 °C, 13000 x g) und die

wässrige Phase zur Fällung der RNA mit dem 0,25 - fachem Volumen 10 M

LiCl versetzt und ÜN bei auf Eis inkubiert. Am nächsten Tag wurde das

Präzipitat abzentrifugiert (4 °C, 13000 x g). Das RNA-Sediment wurde mit

70 % Ethanol gewaschen und in 400 µl ddH2O gelöst. Es folgte eine weitere

Fällung mit 0,1 - fachem Volumen 3 M NaAc pH 4.8 und dem 2,5 - fachem

Volumen an 99 % Ethanol. Danach wurde das Präzipität mit 70 % Ethanol

gewaschen, für 5 min bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend in

30 µl ddH2O gelöst. Die Konzentration und Reinheit der isolierten RNA

wurden photometrisch durch Messung der Extinktion bei 260 nm und 280 nm

bestimmt. Die RNA wurde bei -80 °C bzw. -20 °C aufbewahrt.


31

2.2.19 Semiquantitative RT-PCR

2.2.19.1 RT-Reaktion

Ansatz für DNAse-Verdau 8 µg RNA

(40µl) 4 µl 10x DNAse I-Puffer

8 U DNAse I

2 µl 25 mM EDTA

Ansatz für RT-Reaktion 10 µl RNA (DNAse I verdaut)

(20 µl) 1 µl 100 µM Oligo (dT)

4 µl 5x RT-Reaktionspuffer

2 µl 10 mM dNTP

1 µl ddH2O (DEPC)

1 µl(=200 U) Reverse Transkriptase

Die isolierte RNA wurde für die Synthese von komplementärer DNA (cDNA)

mit DNAse I im Thermocycler für 30 min bei 37 °C verdaut. Durch Zugabe

von 2 µl 25 mM EDTA und Erhitzen des Ansatzes auf 70 °C wurde die

Reaktion abgestoppt und die DNAse I denaturiert. Zur Überprüfung der

Integrität wurden 8 µl der DNAse I verdauten RNA auf ein TAE-Agarosegel

aufgetragen.

Die RNA wurde anschließend mit der Reversen Transkriptase (RT) in einer

Reaktion im Thermocycler in cDNA umgeschrieben. Hierfür wurden in einem

ersten Schritt die Oligo(dT)-Nukleotide 5 min bei 70 °C an den poly(A)-Kette

der mRNA angelagert dann in einem zweiten Schritt nach Zugabe von 7 µl

von einem Mastermix bestehend aus Wasser, Nukleotiden und 5x RT-

Reaktionspuffer 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl Reverser

Transkriptase wurde für 1 h bei 42 °C die cDNA-Synthese eingeleitet. Die

Lagerung der cDNA erfolgte bei -20 °C.


32

2.2.19.2 PCR

5x PCR-Puffer 15 mM MgCl2

100 mM (NH4)2SO4

0,08 % Triton X-100

20 % DMSO

250 mM KCl

50 mM Tris-HCl pH 8.3

PCR-Programm

Funktion Primer

SSgpd PiEF2α EPI1 EPI10

95°C 10’ 95°C 5’ 95°C 5’ 95°C 5’

Denaturierung 95°C 30’’ 95°C 30’’ 95°C 30’’ 95°C 30’’

Annealing 56°C 30’’ 66°C 45’’ 60°C 30’’ 68°C 45’’

Elongation 72°C 1’ 72°C 45’’ 72°C 45’’ 72°C 45’’

72°C 10’ 72°C 10’ 72°C 10’ 72°C 10’

PCR-Programm

Funktion Primer

Actin, PR1a ACO1 LeSBT3

95°C 5’ 95°C 5’ 95°C 5’

Denaturierung 95°C 30’’ 95°C 30’’ 95°C 30’’

Annealing 58°C 30'' 60°C 30’’ 58°C 30''

Elongation 72°C 45’’ 72°C 45’’ 72°C 45’’

72°C 10’ 72°C 10’ 72°C 7’

Die RT-PCR wurde in einem Volumen von 50 µl mit 5 µl 5x PCR-Puffer, 1 µl

dNTPs (10 mM), 10 U Taq-DNA-Polymerase und je 1 µl von 10 µM „Forward“

und „Reverse“ Primer durchgeführt. Das Endvolumen wurde duch Zugabe

von entsprechenden Mengen ddH20 erreicht. Das Volumen der cDNA als


33

Matrize im jeweiligen PCR-Ansatz variierte abhängig von der jeweiligen

Konzentration der cDNA im Ausgangsmaterial. Ein Angleichen der cDNA-

Konzentration der einzelnen Proben eines Versuchsansatzes erfolgte über

Angleichen des PCR-Produkts eines konstitutiv exprimierten Gens.

2.2.20 Northern Blot

2.2.20.1 Sondenherstellung für Northern Blot

Mix 1 (25µl) 5 µl 5×PCR-PuffeR

4 µl (5U) Taq Polymerase

16µl ddH20

Mix 2 (75µl) 15 µl 5x PCR-Puffer

2 µl 10 mM dNTPs

2 µl 10 µM Primer forward

2 µl 10 µM Primer reverse

2 µl Plasmid-DNA

52 µl ddH20

PCR-Programm

Funktion

SBT3-Sonde PR3a-Sonde UBQ-Sonde

95°C 2’ 95°C 2’ 95°C 2’

Denaturierung 95°C 20’’ 95°C 20’’ 95°C 20’’

Annealing 55 40’’ 54°C 40’’ 55 40’’

Elongation 72°C 30’’ 72°C 30’’ 72°C 30’’

Für diese PCR wurden zwei Mastermixe angesetzt. Der erste Mastermix (Mix

1) enthielt die Matrize-DNA und Oligonukleotide und der zweite (Mix 2)

enthielt die Nukleotide und die Taq-Polymerase. Um eine optimale Zyklenzahl

zu bestimmen, wurde zuerst ein Reaktionsansatz aus 75 µl Mix 1 und 25 µl

Mix 2 angesetzt und die PCR gestartet. Nach 20, 25, 30 und 35 Zyklen


34

wurden 10 µl Reaktionsansätze entnommen, auf Eis abgekühlt, mit 1 µl

Ladepuffer versetzt und gelelektrophoretisch analysiert.

Nachdem die optimale Zyklenzahl bestimmt war, wurden Mix 1 und Mix 2

vereinigt und in 100 µl Reaktionsansätze die Sonde über PCR amplifiziert.

Zur Kontrolle wurde 1 µl eines Reaktionsansatzes über Gelelektrophorese

analysiert.

Die Reinigung der Sonde erfolgte dann durch Phenol/Chloroform-Extraktion

mit anschließender Ethanol-Fällung. Hierfür wurde der Ansatz mit 600 µl

Phenol/Chloroform (1:1) ausgeschüttelt, 2 min bei 4 °C und 10000 x g

abzentrifugiert und der Überstand in 0,1- fachem Volumen Natriumacetat 3 M

pH 5.2 und 2,5 - fachem Volumen 99 % EtOH versetzt. Danach erfolgte die

Fällung der DNA für 20 min auf Eis. Nach 20 min Zentrifugieren bei 4 °C und

10000 ×g wurde das Sediment mit 70 % EtOH gewaschen, 10 min bei 4 °C

und 10000 ×g abzentrifugiert. Abschließend wurde das Sediment getrocknet

und in 30 µl ddH2O aufgenommen. Die Konzentration der Sonde wurde

anhand eines standartisierten Markers bestimmt. Hierfür wurden 1 µl und 2 µl

der Sonden–DNA auf ein Gel aufgetragen und mit der definierten Menge des

Markers verglichen.


35

2.2.20.2 Gelelektrophorese von RNA

Ladepuffer 50 % Glycerol

1 mM EDTA pH 8.0

0,03 % Bromphenolblau

2 % Ethidiumbromid

10x Gelpuffer 0,4 M MOPS

100 mM Na-Acetat

10 mM EDTA

pH 7.0 (eingestellt mit NaOH)

Agarose-Gel (1,2%) 1,5 g Agarose

90 ml ddH2O

12,5 ml 10x Gelpuffer

22,5 ml Formaldehyd

Für die RNA-Analyse mittels Northern Blot wurde ein denaturierendes Gel

gegossen. Hierfür wurden 1,5 g Agarose in 90 ml Wasser geschmolzen,

12,5 ml 10x Gelpuffer, 22,5 ml Formaldehyd unter Schwenken zugefügt,

zügig gegossen und für mindestens 0,5 Stunden erhärten gelassen. 5,5 µg

der zu analysierenden RNA-Proben wurden mit 1 µl 10x Gelpuffer, 3,5 µl

Formaldehyd, 10 µl Formamid versetzt und 15 min bei 65 °C denaturiert.

Danach wurden die Proben kurz auf Eis abgekühlt und in der Tischzentrifuge

(13000 ×g, 10 sec) abzentrifugiert. Die denaturierte RNA wurde bei 60 V etwa

5 h elektrophoretisch in 1x Gelpuffer aufgetrennt. Zur Dokumentation wurde

das Gel unter UV-Beleuchtung fotografiert.


36

2.2.20.3 RNA-Transfer auf Membranen

20×SSC 3 M NaCl

0,3 M Na-Citrat

50x Denhardts (500ml) 5 g Ficoll 400

5 g Polyvinylpyrrolidon

5 g BSA Fraktion V

Transferpuffer 10x SSC

Hybridisierungslösung 50 % Formamid

5x SSC

50 mM KPP pH 7,0

2x Denhardts

100 µg/ml sssDNA

0,5 % SDS

Waschlösung 1 1x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung 2 0,2x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung 3 0,04x SSC

0,04% SDS

Für den Blot wurde das denaturiende Gel 2x 15 min in ausreichend ddH2O

und anschließend 15 min in 10x SSC-Puffer geschwenkt. Anschließend

erfolgte der Aufbau des Blots:


37

Abb. 2.1: Aufbau Northern Blot

Das Gel wurde auf 2 Lagen entsprechend großen 3MM Whatman Filterpapier

sgelegt, die auf einer Glasplatte liegend Kontakt mit dem 10x SSC-Puffer

hatten. Dann erfolgte die Abdeckung der Ränder mit Parafilm.

Die Nitrocellulosemembran wurde kurz in ddH2O, anschließend in 10x SSC

angefeuchtet und luftblasenfrei auf das Gel positioniert. Auf die Membran

wurden drei Lagen 3MM Whatman Filterpapier in Größe des Gels gelegt. Von

einem Stapel Zellstoff und einer Glasplatte bedeckt, die mit ca. 200 g

beschwert wurde, fand der Transfer über Nacht statt.

Nach dem Transfer der RNA von dem Agarose-Gel auf die Nitrocellulose-

Membran wurde der Zellstoff entfernt, die Membran zur Orientierung markiert

und kurz in 10x SSC geschwenkt. Anschließend wurde die Membran auf

3MM Whatman Filterpapier mit der geblotteten bzw. RNA-Seite nach oben

soweit getrocknet, dass kein überschüssiges SSC als Flüssigkeitsfilm auf der

Membran lag. Die transferierte RNA wurde dann durch UV-Crosslink auf der

Membran fixiert (1200 µJx100). Die Membran wurde vollständig bei

Raumtemperatur getrocknet und aufbewahrt.

2.2.20.4 Hybridisierug mit einer radioaktiv-markierten Sonde

Für die Hybridisierung wurde die Membran zuerst in ddH2O angefeuchtet und

dann in eine Schale mit 5x SSC überführt, wo sie mit Hilfe zweier steriler

Pipetten aufgerollt und in eine Hybridisierungsröhre überführt wurde. Die


38

Röhre wurde dann mit ca. 10 ml Hybridisierungslösung gefüllt. Anschließend

wurde die Membran für mindestens 2 h bei 42°C prähybridisiert.

Die radioaktive Markierung der Sonde wurde unter Verwendung des

„RadPrime DNA Labeling System“-Kit der Firma Invitrogen durchgeführt. 30 g

DNA wurden in 21 µl H2O denaturiert, anschließend auf Eis abgekühlt und

kurz anzentrifugiert. Es wurden zugefügt:

- 1 µl 500 µM dATP

- 1 µl 500 µM dTTP

- 1 µl 500 µM dGTP

- 20 µl 2,5x Random Primer Lösung

- 5 µl (50 µCi) [α-32P]-dCTP

- 1 µl Klenow-Fragment

Der Ansatz wurde gut gemischt, kurz anzentrifugiert und 10 min bei 37°C

inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl Stop-Puffer beendet.

Danach folgte die Reinigung der Sonde über eine Bio-Spin-Column, um nicht

eingebaute Nukleotide zu entfernen. Hierfür wurde die Säule unten geöffnet,

in ein 2 ml Eppendorfgefäß gesetzt und der Deckel abgenommen, um die

Säulenflüssigkeit auslaufen zu lassen. Zur vollständigen Entfernung der

Flüssigkeit wurde das Säulchen 2 min bei ca. 4000 x g zentrifugiert. Die

radioaktive Probe wurde in die Mitte der Säule pipettiert und 4 min bei ca.

4000 x g zentrifugiert. Zur Überprüfung der Einbaurate wurde dann die

Aktivität der Sonde im Durchlauf bestimmt. Die Probe wurde dann durch

Erhitzen auf 100°C für 5 min denaturiert, auf Eis abgeschreckt und kurz

anzentrifugiert. Aus der Hybridisierungsröhre wurde die

Prähybridisierungslösung entfernt, durch 10 ml frische Hybridisierungslösung

ersetzt und die denaturierte Sonde dazupipettiert.

Die Hybridisierung erfolgte ÜN bei 42°C. Am nächsten Tag wurde die

Membran in mehreren Schritten gewaschen, um unspezifisch gebundene

Sonden zu entfernen. Zunächst wurde sie kurz mit Waschlösung 1 gespült

und dann 5 min in dieser Lösung gewaschen, während die Temperatur im

Hybridisierungsofen auf 60°C erhöht wurde. Es folgten ein 30-minütiger

Waschschritt bei 60°C in Waschlösung 1 und danach ein ebenfalls 30-


39

minütiger Waschschritt bei 60°C in Waschlösung 2. Die Exposition erfolgte

gegen eine Storage Phosphor Screen Platte (Amersham Biosciences) und

wurde über Typhoon Trio+ Imaging System (GE Healthcare) radiographisch

dokumentiert.

2.2.20.5 Strippen von Membranen

Für die Hybridiserung mit weiteren Sonden wurde die Membran gestrippt.

Dazu wurden die Blots mit ca. 400 ml kochender Waschlösung 3 übergossen,

1 min in der Mikrowelle erhitzt und unter leichtem Schwenken abgekühlt.

Dieser Vorgang wurde bis zu zwei Mal wiederholt. Anschließend wurden die

Membranen bei RT getrocknet.

2.2.21 Proteinanalyse

2.2.21.1 Herstellung von Gesamtproteinextrakten

5xExtraktionspuffer 500 mM NaCl

250 mM Tris/HCl pH 7.5

2,5 % Triton-X 100

50 mM β-Mercaptoethanol

0,1 % Protease Inhibitor Mix P

Das in flüssigem Stickstoff zerriebene Blattmaterial wurde in 200 µl

Extraktionspuffer resuspendiert und so aufgetaut. Zelltrümmer wurden durch

eine Zentrifugation für 2 min bei 4 °C und 13000 x g entfernt. Die

Aufbewahrung der Proben erfolgte bei -20 °C.

2.2.21.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Hierfür wurde ein 1 ml Ansatz bestehend aus 2 µl Proteinextrakt bzw. Wasser

als Leerwert, 200 µl Bradford-Reagenz und 798 µl ddH2O vorbereitet.

Anschließend wurde die Absorption im UV/Vis Spektrophotometer bei 595 nm

gemessen und die Proteinkonzentration anhand einer BSA-Eichgerade

errechnet.


40

2.2.21.3 SDS-PAGE

Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl pH 8.8

0,4 % SDS

Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl pH 6.8

0,4 % SDS

4×Ladepuffer 200 mM Tris/HCl pH 6.8

400 mM Dithiothreitol (DTT)

8 % SDS

0,4 % Bromphenolblau

40 % Glycerin

Gelrezeptur (für 2 Gele, 1,5 mm Dicke):

9 %(w/v) Trenngel 4,2 ml 40 % (w/v) Acrylamidstammlösung

9,6 ml ddH2O

4,6 ml 4x Trenngelpuffer

200 µl 10 % (w/v) APS

20 µl TEMED

4,5 %(w/v)Sammelgel 1,1 ml 40% (w/v) Acrylamidstammlösung

6,3 ml ddH2O

2,5 ml 4x Sammelgelpuffer

100 µl 10 % (w/v) APS

10 µl TEMED

Die Gesamtproteinextrakte wurden über ein 9 % Polyacrylamidgel

aufgetrennt. Hierzu wurden die Proteinproben in 1x SDS-Ladepuffer auf eine

bestimmte Konzentration verdünnt, bei 100 °C 5 min denaturiert und kurz auf

Eis abgekühlt. Als Größenstandard diente ein vorgefärbter Proteinmarker. Die

Elektrophorese wurde bei 100 V für 1,5 h in 1x SDS-Laufpuffer durchgeführt.


41

2.2.21.4 Coomassie-Färbung

Färbelösung 2,5 g Coomassie Brilliant Blue R250

450 ml ddH2O

450 ml Methanol

100 ml Essigsäure

Entfärbelösung 600 ml ddH2O

300 ml Methanol

100 ml Essigsäure

Nach der Elektrophorese wurde dafür ein SDS-Gel über Nacht in etwa 20 ml

in Färbelösung bei Raumtemperatur und ständigem Schütteln inkubiert.

Danach erfolgte mit jeweils ca. 20 ml Entfärbelösung unter Schütteln bei

Raumtemperatur die Entfärbung des Gels. Das Gel wurde in ddH2O bei 4 °C

aufbewahrt. Die Dokumentation erfolgte durch einscannen.

2.2.21.5 Immunologischer Nachweis von Proteinen mit Western Blot

Kathodenlösung 40 mM 6-Aminohexanlösung

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 1 0,3 M Tris/ HCl pH 10.4

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 2 0,25 M Tris/HCl pH 10.4

20 % (v/v) Methanol

2×TBS-Puffer 40 mM Tris/HCl pH 7.5

270 mM NaCl

Blockierungslösung 0,1 % Tween20

6 % (w/v) Magermilchpulver

1× TBS

Waschlösung 0,1% Tween20


42

1x TBS

ECL-A 5 ml 1 M Tris/HCl pH 8.5

45 ml ddH2O

110 µl 90 mM ρ-Cumarsäure

250 µl 250 mM Luminol

ECL-B 100 µl 30 % H2O2

900 µl ddH2O

ECL-Lösung 10 ml ECL-A

30 µl ECL-B

Das Polyacrylamid-Gel wurde nach dem Semi-Dry-Verfahren geblottet. Pro

Gel wurden 15 Blatt Blotting-Papier als auch die Nitrocellulose-Membran auf

Gelgröße zugeschnitten und vor dem Blotten ca. 10 min in der jeweiligen

Lösung inkubiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde vor dem Equilibrieren in

Anodenpuffer einmal kurz in autoklaviertem ddH2O geschwenkt. Der Aufbau

erfolgte nach Abtropfen der jeweiligen Lösung vom Papier sukzessiv.

Abb. 2.2: Aufbau Western Blot.

Nach dem Auflegen der letzten Lage von Papier wurden eventuelle

Luftblasen durch vorsichtiges Ausstreichen entfernt. Der Transfer fand für 1

Polyacrylamidgel bei 100 mA bei 2 Gelen bei 150 mA für 1 h bis 1,5 h statt.

Die Nitrocellulose-Membran wurde unmittelbar nach dem Elektrotransfer in

ca. 20 ml Blockierungs-Lösung überführt und über Nacht bei Raumtemperatur


43

oder 4 °C unter Schütteln inkubiert. Danach wurde die Blockierungslösung,

durch den primären anti-SBT3-Antikörper (polyklonales Serum1:2000 in

Blockierungslösung) ersetzt und unter Schütteln 2 h oder über Nacht

inkubiert. Vor Zugabe des sekundären Antikörpers erfolgten 2-3

Waschschritte mit 50-100 ml Waschlösung a` 10 min bei Raumtemperatur.

Als sekundärer Antikörper wurde die anti-Kanninchen IgG-Peroxidase

Konjugat in einer Verdünnung von 1:10000 in Blockierungslösung verwendet

und abgedunkelt bei Raumtemperatur 1 h unter Schütteln inkubiert. Der nicht

gebundene Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen in jeweils ca. 50-

100 ml Waschlösung entfernt und der Blot 2 min in 1x TBS inkubiert. Die

Membran wurde ca. 2 min in 10 ml ECL-Lösung inkubiert, anschließend

luftblasenfrei in eine durchsichtige Folie gepackt und gegen einen

Röntgenfilm exponiert.

2.2.21.6 Ponceau-Färbung

Ponceau-Lösung 2 g Ponceau S

(10x) 30 g Trichloressigsäure

30 g Sulfosalicylsäure

mit ddH2O auf 100 ml aufgefüllt

Die zu färbende Membran wurde 5 min in Ponceau-Lösung geschwenkt.

Danach wurde die Membran mit H2O entfärbt. Abschließend wurde die

Membran eingescannt und getrocknet.

Ergebnisse

44

Ergebnisse

3.1 Überprüfung von SlSBT3-RNAi- und -Überexpressions-Linien in der T2-Generation

Zu Beginn der vorliegenden Diplomarbeit standen homozygote Samen der

T2- und T3-Generation von drei Kanamycin-resistenten RNAi-Linien zur

Verfügung. Für die Durchführung der Versuche wurde die Linie SlSBT3 HP-

21-7 ausgewählt, da diese nur eine Kopie des Transgens enthält und eine

vollständige Unterdrückung der Expression von SlSBT3 in der T2-Generation

aufwies. Als Überexpressionslinie wurde die Linie G2f1D ausgewählt, da

diese die stärkste Überexpression von SlSBT3 in der T2-Generation zeigte

(Franziska Huttenlocher, unveröffentlicht). Vor der Untersuchung der

Krankheitssymptome und des Wachstumsverhaltens von X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 bzw. S. sclerotiorum wurden die verwendeten Linien mittels

Western Blot analysiert, um die Expression von SlSBT3 zu überprüfen.

Das Ergebnis der Western Blot-Analyse ist in der Abbildung 3.1 gezeigt. Das

SlSBT3-Protein konnte in keiner Pflanze der RNAi-Linie SlSBT3 HP-21-7-5

detektiert werden. Somit ist auf Proteinebene die Expression von SlSBT3

vollständig unterdrückt. Die Nachkommen der Überexpressions-Linie (OE)

zeigten kein einheitliches Muster. Dennoch ist eine deutlich stärkere

Expression der SlSBT3-Subtilase im Vergleich zum Wildtyp (Wt) zu sehen.

Damit liegen mit der Linie 21-7 eine erfolgreich unterdrückte SlSBT3-RNAi-

Linie und mit G2f1D eine echte SlSBT3-Überexpressionslinie vor.

Ergebnisse

45

Abb. 3.1: Überprüfung der SlSBT3-Überexpressions-Linie G2f1D (A) und SlSBT3-RNAi-Linie 21-7 (B). Um

SlSBT3 (79 kDa) nachzuweisen wurden 20 µg Gesamtproteinextrakt wurde von 11 Pflanzen der

Übereexpressions-Linie über SDS-Page aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit polyklonalem

anti-SlSBT3-Antiserum nachgewiesen. Als Vergleich dienten Proteinextrakte aus Wildtyppflanzen.

3.2 Expression von SlSBT3 nach Behandlung mit Salicylsäure

Da in ersten Versuchen eine Induktion von SlSBT3 nach Pathogenbefall

beobachtet werden konnte (Huttenlocher, unveröffentlicht) sollte der Einfluss

von Salicylsäure (SA), als endogenes Signal einer Pathogenabwehr,

detaillierter untersucht werden (Durrant und Dong, 2004).

Hierzu wurden wie unter Kapitel 2.2.8 beschrieben drei Wochen alte

Tomatenpflanzen mit einer 1,5 mM Salicylsäure-Lösung behandelt. Die

Kontrollpflanzen wurden mit der entsprechenden Pufferlösung behandelt.

Nach bestimmten Zeitpunkten wurden die Blätter geerntet und die

Expressionsanalyse von SlSBT3 mit semiqRT-PCR durchgeführt.

Ergebnisse

46

Abb. 3.2.1: Expressionsanalyse von SlSBT3 von Tomatenblättern nach Besprühung mit Salicylsäure mit

semiqRT-PCR. Blätter von 3 Wochen alte Tomatenpflanzen wurden mit 1,5 mM Salicylsäure in 10 mM

Kaliumphosphatpuffer und 0,1 %Tween (A) oder mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer und 0,1 %Tween (B)

besprüht.

Wie in Abbildung 3.2.1 zu sehen, kann das Besprühen von Tomatenpflanzen

mit Salicylsäure zu einer Induktion des SlSBT3-Transkripts mit einem

Maximum nach acht und zwölf Stunden führen. Als Positivkontrolle für die

Versuchsdurchführung wurde die Expression des PR3a-Gens, der sauren

Chitinase mitverfolgt. In den entsprechenden Kontrollpflanzen war auch eine

Induktion der SlSBT3 nachzuweisen. Allerdings war in diesem Fall die Stärke

der Induktion bei acht und zwölf Stunden im Vergleich zu denen der SA-

behandelten Pflanzen deutlich schwächer. Auch die Expression des PR3a-

Gens erwies sich in den Kontrollpflanzen ab vier Stunden als induziert. Die

Induktion beider Gene könnte auf das Vorhandensein von Detergenz Tween

20 in der Sprühlösung oder auf die angewandte Applikationstechnik

zurückzuführen sein.

Ergebnisse

47

Abb. 3.2.2: Expressiosanalyse von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Zufuhr von Salicylsäure durch den

Transpirationsstrom mit semiqRT-PCR. Blätter von 3 Wochen alten Tomatenpflanzen wurden

abgeschnitten und über den Transpirationsstrom mit 1,5 mM Salicylsäure in 10 mM

Kaliumphosphatpuffer (A) oder 100 µl Kaliumphosphatpuffer (B) zugeführt.

Um den Einfluss von Tween 20 oder der Applikationstechnik auszuschließen,

wurde in einem zweiten Versuch die Salicylsäure über den

Transpirationsstrom zugeführt. Aus dem geernteten Blattmaterial wurde RNA

isoliert und die Expression über semiqRT-PCR analysiert. Die Abbildung

3.2.2 sind zeigt, dass die Expression von SlSBT3 nach acht und zwölf

Stunden erhöht war. Die Expression des PR3a-Gens zeigte sich bereits nach

zwei Stunden induziert. Die Kontrollpflanzen zeigten wie im vorhergehenden

Versuch eine schwache Induktion von SlSBT3 mit einem Maximum nach

zwölf Stunden. Eine gesteigerte Induktion des PR3a-Gens war auch mit

dieser Methode in den Kontrollpflanzen zu beobachten. Die schwache

Induktion des PR3a-Gens in den Kontrollen könnte durch Stress induziert

werden, der bei dem Abschneiden der Pflanzen oder bei der Applikation von

Ergebnisse

48

Salicylsäure ausgelöst wird. Mit diesem Versuch konnte das vorherige

Ergebnis bestätigt werden. SlSBT3 ist durch Behandlung mit Salicylsäure

induzierbar.

3.3 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch Xcv

Nachdem die Induzierbarkeit von SlSBT3 durch Applikation von Salicylsäure

nachgewiesen worden war, sollte die Abhängigkeit der SlSBT3-Expression

nach Infektion durch biotrophe, prokaryontische Pathogene untersucht

werden. Die eingesetzten Stämme von Xcv waren mit Ausnahem der Gene,

die für die Resistenzreaktion in Wirtspflanzen verantwortlich sinfd, isogen. Es

wurden ein virulenter, ein avirulenter (AvrBs3) und ein hrp-defizienter Stamm

eingesetzt, der durch Mutation der hrp-Gene A bis G des Typ-III-

Sekretionsapparats nicht pathogen ist (Schornack, Inst. Pflanzengenetik

Universität Halle, pers. Mitteilung)

Für den Versuch wurden fünf Wochen alte Pflanzen eingesetzt. Pro

Probenzeitpunkt wurden drei Blätter von drei Pflanzen in einem definierten

Volumen Bakteriensuspension vakuuminfiltriert (s. Kap. 2.2.5). Für den

virulenten Stamm und den hrp-defizienten Stamm wurde eine Bakteriendichte

von 108 cfu/ml gewählt. Für den avirulenten Stamm wurde aufgrund der zu

erwartenden starken Symptome und dem damit einhergehenden frühen

Absterben der Gewebe eine geringere Dichte von 104 cfu/ml gewählt. Die

Infiltration der Kontrollpflanzen erfolgte mit 1mM MgCl2. Die Probenentnahme

fand in einem Rhythmus von 24 Stunden bis fünf Tage nach Inokulation statt.

Aufgrund zu starker Symptombildung und beginnender Nekrotiersierung des

Gewebes war eine RNA-Isolierung danach nicht mehr durchführbar.

Alle Stämme von X. campestris pv. vesicatoria 85-10 induzieren die

Expression von SlSBT3. Nach Infiltration mit dem virulenten Stamm

(Abb.3.3.1 A) und dem hrp-defizienten (Stamm Abb. 3.3.1 C) war ein

Induktionsmaximum nach dem ersten und zweiten Tag, während durch

Infektion mit dem avirulenten Stamm (Abb. 3.3.1 B) eine über den gesamten

beobachteten Zeitraum gleichmäßig starke Induktion zu beobachten. Wie

unter 3.2.1 konnte auch hier eine relativ starke Induktion von SlSBT3 in den

Ergebnisse

49

Kontrollpflanzen beobachtet werden, die durch die mechanische

Beanspruchung oder Behandlung der Blätter mit Detergenz erklärt werden

könnte. Dadurch kann an dieser Stelle keine eindeutige Aussage über die

spezifische Induktion von SlSBT3 nach Infektion durch Xcv getroffen werden.

Ergebnisse

50

Abb. 3.3.1: Expressionsanalyse von SlSBT3 nach Infektion durch Xcv 85-10 mit semiqRT. Blätter von 5

Wochen alten Pflanzen wurden jeweils in 200 ml Bakteriensuspension von virulentem X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 mit 108 cfu/ml(A), avirulentem X. campestris pv. vesicatoria 85-10 pDSk 200 mit 104

cfu/ml (B), X. campestris pv. vesicatoria ∆hrpA-G (C) mit 108 cfu/ml und 1 mM MgCl2 (D)

vakuuminfiltriert.

Um eine Beeinflussung durch mechanische Belastung und unspezifische

chemische Induktoren wie Detergenzien auszuschließen wurde eine

Infiltration der Bakteriensuspension in Blätter direkt an der Pflanze

durchgeführt. Hierfür wurden für alle Stämme mit Bakteriensuspensionen

gleicher Dichte (108 cfu/ml) gewählt. Eine vollständige Inokulation der

gesamten Blattfläche gelang aufgrund der unterschiedlichen Turgeszenz

nicht. So konnte eine Infektion des Blatts auch nur partial stattfinden (siehe

Kap. 2.2.5).

Ergebnisse

51

Die Probenentnahme erfolgte in einem Rhythmus von 24 Stunden über eine

Dauer von zehn Tagen. Dafür wurden drei Blätter gleichen Alters von drei

unterschiedlichen Pflanzen in einer Probe vereinigt. Aus den geernteten

Blättern wurde RNA isoliert und einer Northern Blot-Analyse mit einer

SlSBT3-spezifischen Sonde unterzogen. Danach wurde mit der PR3a-Sonde

und mit der Ubiquitin-Sonde hybridisiert. Zuletzt wurde nochmals zu

Bestätigung der erfolgreichen Infektion mit der PR1a-Sonde hybridisiert. Die

Hybridisierung mit der PR1a Sonde führte aber nur zu undeutlichen Signalen,

die wahrscheinlich auf die Beeinträchtigung der Membranen durch das

mehrmalige Strippen zurückzuführen sind. Aus diesem Grund sind die

Ergebnisse dieser Hybridiesierung in der folgenden Abbildung 3.3.2 nicht

gezeigt.

Die untersuchten Pflanzen zeigten 48 Stunden nach Inokulation mit dem

avirulenten Stamm erste Anzeichen einer hypersensitiven Reaktion. In

Pflanzen, die mit dem virulenten Stamm inokuliert waren, konnten am fünften

Tag nach Inokulation nekrotische Bereiche an den Infiltrationsstellen

beobachtet werden. Pflanzen, die mit dem hrp-defizienten und die mit

Kontrolllösung behandelt wurden, zeigten keine auffälligen Veränderungen

der Blattfläche über den gesamten Versuchzeitraum.

In den Kontrollpflanzen konnte keine erhöhte Expression von SlSBT3 und des

PR-Proteins PR3a beobachtet werden (Abb. 3.3.2 D). Damit erwies sich die

Durchführung des Versuchs erfolgreich. Die mit Xcv infizierten Blätter zeigten

ein mit denen aus der semiqRT-Analyse vergleichbares Expressionsmuster.

Die Induktion des PR3a-Gens in allen infizierten Proben wies auf eine

erfolgreiche Infektion durch die Bakterien hin. Dabei lässt sich in den

Blattproben, die mit dem virulenten Stamm infiziert waren ein späteres

Induktionsmaximum nach fünf Tagen als durch den avirulenten Stamm nach

bereits einem Tag beobachten. Die Signale des „housekeeping“-Genes

Ubiquitin waren nach Infiltration des avirulenten und hrp-defizienten Stämmen

gleichmäßig stark, was zeigt, dass vergleichbare Menge der pflanzlichen

RNA aufgetragen wurden. Die geringe Abnahme der Signale des

„housekeeping“-Genes bei den mit dem virulenten Stamm infizierten

Blattproben ist am steigenden Anteil bakterieller RNA zu erklären, was im

starken das Wachstum des virulenten Stamms liegt.

Ergebnisse

52

Die Expression von SlSBT3 zeigte sich nach Infektion durch alle Stämme

induziert. Sie war im Falle der Infektion durch den avirulenten Stamm (B) am

stärksten, mit einem Maximum am dritten Tag nach Inokulation (Abb. 3.3.2

B). In Pflanzen, die mit dem virulenten Stamm (Abb.3.3.2 A) infiziert wurden,

war eine starke Induktion von SlSBT3 fünf Tage nach Inokulation zu

beobachten. Durch Infektion mit dem hrp-defizienten Stamm (Abb. 3.3.2 C)

konnte eine Induktion der SlSBT3 acht Stunden nach Inokulation beobachtet

werden. Die SlSBT3-Signale nach 24 Stunden bis zum fünften Tag nahmen

rapide ab.

Ergebnisse

53

Abb. 3.3.2: Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch X. campestris pv. vesicatoria 85-

10 mit Northern Blot. Blätter von 5 Wochen alten Pflanzen wurden an der Blattunterseite mit 108 cfu/ml

Bakterien infiltriert. Virulenter X. campestris pv. vesicatoria 85-10 (A), avirulenter X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 pDSk 200 (B), X. campestris pv. vesicatoria ∆hrpA-G (C) und 1 mM MgCl2 (D). Je 5 µg

RNA wurden elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferriert und mit entsprechenen

radioaktiv-markierten Sonden hybridisiert.

Ergebnisse

54

3.4 Wachstumsverhalten von Xcv in SlSBT3 RNAi-, Überexpressions- und Wildtyppflanzen

Über das Wachstumsverhalten der Bakterien sollte der Einfluss von SlSBT3

auf die Etablierung der Population der verschiedenen Stämme von X.

campestris pv. vesicatoria spezifiziert werden. Hierzu wurden fünf Wochen

alte SlSBT3-RNAi, SlSBT3-überexpermierende und Wildtyp-Tomatenpflanzen

mit jeweils einer geringen Bakteriendichte (104 cfu/ml) infiltriert. Damit

konnten die lokale Symptombildungen unterdrückt und die exponentielle

Phase des Bakterienwachstums im Blattgewebe nachvollzogen werden. Die

Größe der Bakterienpopulation wurde als Zahl der koloniebildenden Einheit

proBlattfläche berechnet (vgl. Kap. 2.2.5).

Die abgebildeten Wachstumskurven zeigen das Wachstum der drei isogenen

Stämme von X. campestris pv. vesicatoria 85-10 über eine Zeitraum von acht

Tagen nach Infiltration. Danach konnten aufgrund von beginnenden

Symptombildungen in Pflanzen, die mit dem virulenten und avirulenten

Stamm inokuliert wurden, keine aussagekräftigen Ergebnisse erzielt werden.

Vereinzelt beginnende Nekrotisierung des Gewebes acht Tage nach

Infiltration durch den avirulenten Stamm wurde in der Auswertung

vernachlässigt.

Insgesamt wurde ein tendenziell besseres Wachstum in der

Überexpressionslinie und ein tendenziell schlechteres Wachstum in der

RNAi-Linie von SlSBT3 beobachtet unabhängig von dem verwendeten

Stamm von X. campestris pv. vesicatoria 85-10.

3.4.1 Wachstum des virulenten Stamms Xcv 85-10

Der vorliegende Wildtyp X. campestris pv. vesicatoria 85-10 ist auf

Wirtspflanzen virulent (Thieme et al., 2005). Dieser Stamm führt zur

Ausbildung von Krankheitssymptomen und löst somit eine kompatible

Resistenzreaktion aus. Nach Infiltration des virulenten Stamms von Xcv kam

es tendenziell zum gleichmäßigen Wachstum in allen drei Genotypen. Damit

kann durch Überexpression der SlSBT3 keine erfolgreiche Abwehr

gegenüber dem virulenten Stamm von Xcv erreicht werden.

Ergebnisse

55

Die Tendenz des reduzierten Wachstums in der RNAi-Linie entspricht dem

allgemeinen Trend der Wachstumskurven mit den anderen Stämmen.

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

0 2 4 6 8

dpi

rela

tive

log

cfu/

cm^2 OE

WtRNAi

Abb. 3.4.1: Wachstum virulenter Stamm von X. campestris pv. vesicatoria in SlSBT3–RNAi, -

Überexpressions- und Wildtyppflanzen. Blätter von 5 Wochen alten Pflanzen wurden mit 104 cfu/ml

inokuliert. Die Reisolierung erfolgte aus ausgestanzten Blattscheiben der infiltrierten Bereiche. Die

danach bestimmte cfu/cm2 wurde in der Darstellung am Tag 0 auf 1 normiert.

3.4.2 Wachstum des avirulenten Stamms Xcv 85-10 pDsK 200

Bei X. campestris pv. vesicatoria 85-10 pDsK 200 handelt es sich um den

avirulenten Stamm. Durch Transformation eines AvrBs3 tragenden Plasmids,

früher AvrBs4 (Schornack, Inst. für Pflanzengenetik, Universität Halle, pers.

Mitteilung), löst dieser Stamm in Wirtspflanzen eine inkompatible

Resistenzreaktion hervor (Ballvora et al., 2001).

Bei dem avirulenten Stamm von X. campestris pv. vesicatoria ist ein

gleichmäßiges Wachstum in allen drei Genotypen nachweisbar. Damit kann

durch Überexpression von SlSBT3 keine erfolgreiche Abwehr gegenüber dem

avirulenten Stamm von X. campestris pv. vesicatoria erreicht werden. Die

Tendenz des reduzierten Wachstums in der RNAi-Linie entspricht dem

allgemeinen Trend der Wachstumskurven mit den anderen Stämmen. Die

Populationsgröße entspricht der des virulenten Stamms. Bei einer

inkompatiblen Reaktion sollte der avirulente Stamm eine geringere

Populationsgröße als der virulente Stamm erreichen, was mit einer

Ergebnisse

56

fehlerhaften Expression oder Erkennung des Avirulenzgens in diesem

Pathosytem erklärt werden kann.

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

0 2 4 6 8

dpi

rela

tive

log

cfu/

ml^

2 OEWtRNAi

Abb. 3.4.2: Wachstum avirulenter Stamm X. campestris pv. vesicatoria 85-10 pDSk200 in SlSBT3–RNAi, -




3.4.3 Wachstum des hrp-defizienten Stamms Xcv 85-10 hrpA-G

Der hrp (hypersensitive Reaktion und Pathogenität)-defizienten Stamm

X. campestris pv. vesicatoria 85-10 hrpA-G ist im Genom in den Genen hrp A,

B, C, D, E, F und G deletiert und daher nicht in der Lage einen

funktionsfähigen Typ-III-Sekretionsapparat auszubilden, der die Effektor-

Proteine über die pflanzliche Zellmembran in das Cytoplasma der

Pflanzenzelle sekretiert und dessen Proteine selbst als Effektoren wirken

können (Rossier et al., 1999, Büttner und Bonas, 2002). Dieser hrp-defiziente

Stamm ist in Wirtspflanzen nicht pathogen und kann keine Modifizierung des

pflanzlichen Zellstoffwechsels zur Steigerung seines Wachstums durch Typ-

III sekretierte Effektoren vollziehen.

Ergebnisse

57

Im Wachstum des hrp-defizienten Stamms von Xcv waren die größten

Unterschiede der Populationsgrößen in den drei SlSBT3-Genotypen zu

beobachten. Das Wachstum ist in der SlSBT3-RNAi-Linie gegenüber dem

Wildtyp vermindert und in der Überexpressions-Linie erhöht.

1,E-01

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

0 2 4 6 8

dpi

rela

tive

log

cfu/

cm^2

OEWtRNAi

Abb. 3.4.3: Wachstum hrp-defizienter Stamm X. campestris pv. vesicatoria 85-10 hrpA-G in SlSBT3–RNAi, -




Ergebnisse

58

3.5 Vergleich der Krankheitssymptome in SlSBT3 RNAi-, Überexpressions- und Wildtyppflanzen nach Infektion durch Xcv

Nachdem eine Induktion von SlSBT3 durch Infektion mit Xcv festgestellt

wurde, sollte der Einfluss der SlSBT3-Protease auf die Entwicklung der

Krankheitssymptome untersucht werden. Die geänderte Expression von

SlSBT3 in den RNAi- und Überexpressionspflanzen sollte bei einer tragenden

Rolle von SlSBT3 in der Pathogenabwehr einen qualitativen Unterschied in

der Bildung der Krankheitssymptome im Vergleich zum Wildtyp deutlich

machen. Um dies zu untersuchen, wurden fünf Wochen alte Pflanzen mit

Bakteriensuspensionen von 108 cfu/ml des jeweiligen Stamms von

X. campestris pv. vesicatoria infiltriert, um die lokale Symptombildung zu

forcieren. Die Kontrolle wurde mit 1 mM MgCl2 behandelt. Die hier

dokumentierten Symptome wurden in mindestens zwei unabhängigen

Versuchen über einen Zeitraum von 14 Tagen nach Inokulation beobachtet

und stellen eine Dokumentation der zeitlichen bzw. qualitativen Änderungen

zum Wildtyp dar.

Abb. 3.5.1: Krankheitsymptome durch X. campestris pv. vesicatoria 85-10 in SlSBT3–RNAi, Überexpressions-

und Wildtyppflanzen. Blätter 5 Wochen alter Wildtyp (WT)-, RNAi- und Überexpressionspflanzen (OE).

Dargestellt ist die Blattoberseite 10 Tage nach Inokulation mit 108 cfu/ml.

Ergebnisse

59

Bis zum zehnten Tag nach Inokulation mit dem avirulenten und virulenten

Stamm von Xcv waren keine Unterschiede in den Krankheitssymptome in der

RNAi- und der Überexpressions-Linie im Vergleich zum Wildtyp zu

beobachten (Abb. 3.5.1). In den Kontrollpflanzen waren keine Symptome zu

erkennen. In allen drei Genotypen ist die Infiltrationsstelle anhand der

Kontaktfläche mit der Spritze zu erkennen. Am 10.Tag konnte in den Blättern

die dem hrp-defizienten Stamm ausgesetzt waren bei zwölf von 15 Pflanzen

der RNAi-Linien Nekrosen beobachtet werden, die dem des virulenten

Wildtyps in Konsistenz und Farbe ähnlich waren. In einem zweiten Versuch

konnte diese Beobachtung wiederholt werden. Hier wurde der

Versuchszeitraum auf 14 Tagen ausgeweitet. Danach zeigten alle 15

SlSBT3-RNAi-Pflanzen die erwähnten Nekrosen. Daneben konnte die

Beobachtung der Nekrotisierung auch in 6 von 15 Pflanzen des Wildtyps

beobachtet werden, während keine Pflanze der überexprimierenden Linie

Symptome aufwies (Abb. 3.5.2). Die Symptome ausgelöst durch die anderen

pathogenen Stämme änderten sich nicht.

Abb. 3.5.2: Krankheitsymptome hervorgerufen durch den hrp-defizienenten Stamm X. campestris pv.

vesicatoria hrp A-G in SlSBT3–RNAi, Überexpressions- und Wildtyppflanzen. Blätter 5 Wochen

alter Wildtyp (WT)-, RNAi- und Überexpressionspflanzen (OE). Dargestellt ist die Blattoberseite (links)

und die Blattunterseite (rechts) 14 Tage nach Inokulation mit 108 cfu/ml.

Ergebnisse

60

3.6 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch S. sclerotiorum

In Kapitel 3.2 konnte eine gestiegene Expression von SlSBT3 nach Befall

durch biotrophe Bakterien gezeigt werden. Um das Spektrum der

phytopathogen Organismen zu erweitern, wurden weitere Organismen mit

einem anderen Infektionsmechanismus und Lebensweise gewählt. Hierfür

wurde S. sclerotiorum, ein Ascomycet mit breitem Wirtspflanzenkreis, mit der

besonderen Eigenschaft unter Kulturbedingungen im Labor nicht zu

sporulieren, als eukaryontisches Phytopathogen mit nekrotropher

Lebensweise gewählt (Bolton et al., 2006, Walz, Inst. für Phytomedizin, pers.

Mitteilung). Die Inokulation der Blattoberfläche erfolgte wie unter 2.2.8

beschrieben mit Myzel bewachsenen Agarstücken auf die Blattoberfläche.

Die Probenentnahme erfolgte nach einer ersten erfolgreichen Besiedlung des

Blattgewebes durch den Pilz nach 17 Stunden und darauf folgend nach 24,

48 und 72 Stunden nach Inokulation. Eine weitere Probenentnahme wurde

nicht durchgeführt, da 72 h nach Inokulation ca. 2/3 der Blattflächen

nekrotisch waren und daher für die RNA-Analyse ungeeigenet waren.

Pro Zeitpunkt wurden drei gleich alte Blätter vereinigt und für die

Expressionsanalyse auf RNA-Ebene mit semiquantitativer RT-PCR und auf

Proteinebene mit Western Blot verwendet.

Die Expression von SlSBT3 zeigte sich mit zunehmendem Wachstum S.

sclerotiorum erhöht. Das Wachstum des Pilzes wurde mit pilzspezifischen

Primern für die Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (GPD bzw. GAP-

DH) als „house-keeping“-Gene von S. sclerotiorum in der semiqRT-PCR

quantifiziert (Abb. 3.6.1 A). Im Western Blot konnte eine Zunahme der

Signale für SlSBT3 ebenfalls beobachtet werden (Abb. 3.6.1 B). Die Signale

oberhalb des Signals für SlSBT3 sind in der Positivkontrolle, dem gereinigten

SlSBT3-Protein, nicht nachweisbar. Hierbei könnte es sich um unspezifische

Signale handeln, die durch Kreuzreaktion des SlSBT3-Antiserums mit

pilzlichen Proteinen entstehen. Die Zunahme der Signalstärke wäre also

durch das Wachstum des Pilzes zu erklären. Auf Proteinebene ist auch in den

Kontrollen eine schwache Zunahme der Signale von SlSBT3 nachweisen, die

in der semiqRT-PCR-Analyse nicht nachweisbar war. Dies könnte durch

einen posttranslationellen Mechanismus, etwa eine erhöhte Stabilität des

Ergebnisse

61

Proteins zu erklären sein, oder durch die Akkumulation von anderen

Subtilasen, die mit dem polyklonalen SlSBT3-Antikörper nachgewiesen

werden können.

Abb. 3.6.1: Expressionsanalyse von SlBT3 nach Inokulation mit S. sclerotiorum. Blätter von 5 Wochen alten

Tomatenpflanzen wurden abgeschnitten und mit S. Sclerotiorum inokuliert. Als Kontrolle dienten Blätter,

die abgeschnitten wurden und nicht inokuliert waren. A) SemiqRT-PCR. Das Wachstum von S.

sclerotiorum wurde über Primer für die Glyceraldehyd Phosphat Dehydrogenase (GPD) nachvollzogen.

B) Western Blot (oben) und Coomassie gefärbtes SDS-Gel (unten). 25 µg Gesamtproteinextrakt wurden

über SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit gereinigtem anti-SlSBT3-Antikörper

nachgewiesen. Als Positivkontrolle dienten 10 ng gereinigte SlSBT3.

Zudem wurde die Induktion des SlSBT3-Promotors mit Hilfe des GUS-

Reportergens analysiert. Um die Lokalisation der SlSBT3-Expression in dem

befallenen Blatt in SlSBT3-Promotor::GUS-Pflanzen zu bestimmen, wurden

drei Wochen alte Pflanzen mit einem myzelbewachsenen Agarblock inokuliert

und in Plastikboxen im Klimaschrank inkubiert. Die Probenentnahme zur

Infiltration der GUS-Lösung erfolgte nach 24, 48 und 72 Stunden nach

Inokulation. Die Versuche wurden mit den Linien 5-3, 12-1 und 14-2

Ergebnisse

62

durchgeführt. Alle Linien zeigten qualitativ ähnliche Ergebnisse. Die Linie 14-

2 erwies sich für diese Untersuchungen am besten, da sie die geringste

Färbung im nicht-induzierten Blatt zeigte.

Nur diese Linie wurde für die vorliegenden Abbildungen v (Abb. 3.6.2). 24

Stunden nach Inokulation war der Pilz im Gewebe voll etabliert und es waren

wässrige Läsionen mit einem Durchmesser von ca. 0,5 cm bis 0,8 cm zu

erkennen (s. Abb. 3.6.2 A und B). Durch anschließende Färbung dieser

Blätter mit X-Gluc-Lösung wurde eine Blaufärbung und damit die Aktivität der

SlSBT3-Promotors 24 Stunden nach Inokulation vor allem in den

Grenzbereichen der Nekrose gezeigt. Vereinzelt waren auch Färbungen an

den Blatträndern zu beobachten. Nach etwa 40 Stunden hatte die Nekrose

das gesamte inokulierte terminale Fiederblatt erfasst und breitete sich über

die Radis in die distalen und proximalen Fiederblättchen aus (Abb.3.6.2 C).

Ergebnisse

63

Abb. 3.6.2: Histochemische Lokalisation derSlSBT3-Promotor::GUS Aktivität nach Inokulation mit S.

sclerotiorum. (GUS-SlSBT3 14-2). Ein terminales Fiederblatt von 3 Wochen alten Tomatenpflanzen

wurde mit einem mycelbewachsenen Agarblock inokuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die

Blätter mit X-Gluc gefärbt. A) Totalaufnahme von Blättern vor der GUS-Färbung. B) Totalaufnahme der X-

Gluc gefärbten und mit 70 % Ethanol entfärbten Blätter. C) Ausschnitte mit einer 6x Vergrößerung der

gleichen Blätter Der Pilz wächst vom inokulierten terminalen Fiederblatt (24 hpi) über die Radis zu den

benachbarten distalen (48 hpi) und proximalen (72 hpi) Fiederblättern.

Ergebnisse

64

3.7 Vergleich der Krankheitssymptome in SlSBT3 RNAi-, Überexpressions- und Wildtyppflanzen nach Infektion durch S. sclerotiorum

Abb. 3.7: Krankheitssymptome durch S. sclerotiorum in SlSBT3–RNAi, -Überexpressions- und

Wildtyppflanzen. Blätter von 5 Wochen alten Tomatenpflanzen 36 h nach Inokulation.

Wie unter 3.4 sollte die Bildung von Nekrosen in Tomatenpflanzen des

Wildtyps, in entsprechenden SlSBT3 unterdrückten- und überexpremierenden

Tomatenpflanzen auf zeitliche oder qualitative Änderungen untersucht

werden. Hierzu wurden, wie unter 2.2.8 beschrieben, die Blätter mit einem

von S. sclerotiorum myzelbewachsenen Agarblock inokuliert. 17 Stunden

nach Inokulation konnte ein gleichmäßiges Anwachsen von S. sclerotiorum

an der Blattunterseite beobachtet werden. Danach breitete sich die Nekrose

in acht von zehn untersuchten Blättern der gesilenceten Linie schneller aus

als im Wildtyp und der überexpremierenden Linie. Die Unterschiede in der

Ausbreitung der gebildeten Nekrose wurden nach 36 Stunden nach

Inokulation am besten deutlich (Abb. 3.6).

Ergebnisse

65

3.8 Expression von SlSBT3 in Tomatenblättern nach Infektion durch P. infestans

Unter 3.1 und 3.4 konnte gezeigt werden, dass nach Infektion durch biotrophe

prokaryontische und nekrotrophe eukaryontische Pathogen eine Induktion

von SlSBT3 stattfindet. Um die Abhängigkeit dieser Induktion von den

jeweiligen Pathogenen und deren Eigenheiten bei dem

Infektionsmechanismus auszuschließen, wurde ein weiteres Pathogen

gewählt. Bei dem Oomyceten Phytophtora infestans handelt es sich um einen

hemibiotrophen, eukaryontischen Organismus, der nach einer ersten

biotrophen Besiedlungsphase nach etwa 5-6 Tagen seine Lebensweise

ändert und fortan nekrotroph leben kann. Daneben ist bekannt, dass die von

P. infestans gebildeten Kazal-Inhibitoren die gereinigte SlSBT3 in-vitro

inhibieren können, was eine nähere Untersuchung die Pathogen-

Wirtspflanze-Beziehung anhand eines veränderten Expressionsstatus von

SlSBT3 rechtfertigt (Tian et al., 2005, Knappenberger, unveröffentlicht)

Die Inokulation der Tomatenblätter erfolgte wie in Kapitel 2.2.9 beschrieben

über das Stadium der Sporangien. Bedingt durch die Tatsache, dass das

verwendete Isolat in der Erkennung durch Tomaten als Wirtspflanzen nicht

genauer charakterisiert ist, kann hier keine eindeutige Aussage getroffen

werden, ob es sich um ein avirulentes oder virulentes Kultivar handelt. Unter

Berücksichtigung der beobachteten großflächigen Nekrosen um die

Inokulationsstellen, die nach fünf Tagen sichtbar wurden und bis zum Ende

des Versuchszeitraums zunahmen, wurde davon ausgegangen, dass es sich

um ein virulentes Kultivar von P. infestans handelt. Für die Probenentnahme

wurden drei Blätter von drei Pflanzen vereinigt. Die Entnahme erfolgte in

einem Rhythmus von 24 Stunden bis zum vierten Tag und nochmals acht

Tage nach Inokulation. Somit konnte sichergestellt werden, dass die

Entnahme während einer biotrophen Phase und einer nekrotrophen Phase

erfolgte, was auch in einer Nekrose am achten Tag zu äußerte (nicht

abgebildet).

Die anschließende Analyse der Expression von SlSBT3 erfolgte mit semiqRT-

PCR und mit Western Blot. Das Wachstum von P. infestans im Blattgewebe

wurde mit spezifischen Primern für das Gen des Elongationsfaktors von P.

infestans nachvollzogen. Neben der Expression vonSlSBT3 wurde auch die

Ergebnisse

66

der ACC-Oxidase, eines Enzyms der Ethylensynthese, untersucht. Sowohl

mittels RT-PCR als auch mit Western Blot konnte eine gestiegene SlSBT3-

Expression nach Inokulation mit P. infestans festgestellt werden. Auf der

Transkript-Ebene wurde eine erster Anstieg der SlSBT3 Expression ein Tag

nach Inokulation beobachtet werden. Die maximale Induktion konnte vier

Tage nach Inokulation nachgewiesen werden (Abb. 3.8.1 A). Das Wachstum

von P. infestans konnte nicht über eine Zunahme der Expression des

Elongationsfaktors nachgewiesen werden. So muss davon ausgegangen

werden, dass die Infektion mit P. infestans ungleichmäßig erfolgt war. Zur

Kontrolle der Infektion wurde der Anstieg der Aminocyclopropancarboxylat-

Oxidase (ACO)-Expression überprüft (Smart et al., 2003). Hier zeigte sich,

dass eine erfolgreiche Infektion stattgefunden hatte.

Mit der Western Blot-Analyse konnte eine Induktion nach drei Tagen und eine

starke Expression acht Tage nach Inokulation gezeigt werden. Wie unter

Kapitel 3.6 wurde eine Zunahme der SlSBT3-Expression auch in den

Kontrollen auf Proteinebene detektiert, obgleich sie mit der semiqRT-PCR

nicht nachweisbar war (Abb. 3.8.1 B). Wahrscheinlich erkennt der polyklonale

Antiköper andere Subtilasen, die durch die Behandlung der Blätter induziert

werden. Zusammenfassend konnte mit diesem Versuch eine erhöhte

Expression von SlSBT3, insbesondere in einer späten Phase der Besiedlung

der Pflanzengewebes durch P. infestans gezeigt werden.

Ergebnisse

67

Abb. 3.8.: Expressionsanalyse von SlBT3 nach Inokulation mit P. infestans. Blätter von 5 Wochen alten

Tomatenpflanzen wurden abgeschnitten und mit 10 µl einer Sporensuspension von P.infestans (1000

Sporen/ml) inokuliert. Als Kontrolle wurden uninokulierte Blätter mitgeführt. A) SemiqRT-PCR. Das

Wachstum von P.infestans wurde über Primer für den Elongationsfaktor (PiEF) nachgewiesen. Der

Nachweis der Infektion des Blattgwebes erfolgte über mit Primern der ACC-Oxidase (ACO). B) Western

Blot (oben) und Coomassie gefärbtes SDS-Gel (unten). 25 µg Gesamtproteinextrakt wurden über SDS-

PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit anti-SlSBT3-Antikörper detektiert. Als Positivkontrolle

dienten 10 ng gereinigte SlSBT3.

3.9 Expression von SlSBT3 nach Behandlung mit Katalase und Cantharidin

Aufgrund der Beobachtung, dass sich eine starke Expression von SlSBT3 bei

Befall durch den avirulenten Stamm von X. campestris, den nekrotrophen Pilz

S. sclerotiorum und in der nekrotrophen Phase der P. infestans-Infektion

Ergebnisse

68

nachwiesen ließ, wurde die Abhängigkeit der Expression von SlSBT3 von der

Einleitung des programmierten Zelltods vermutet, die im folgenden genauer

untersucht werden sollte. Hierzu wurde der Einfluss von Wasserstoffperoxid

nach Infektion durch S. sclerotiorum und einer exogenen Zugabe des Zellgifts

Cantharidin mit GUS-Reportergenpflanzen untersucht.

3.9.1 GUS-Repotergenanalyse nach Infiltration von Katalase

Bei Pathogenbefall kommt es zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS).

In diesem Versuch sollte eine eventuelle Beeinflussung der Expression durch

das relative stabile ROS H2O2 untersucht werden.

Dazu wurden wie unter 3.5 beschrieben drei Wochen alte Pflanzen der GUS-

Linie 12-1 verwendet. In beide Blatthälften wurde zunächst großflächig

Katalase infiltriert. Katalase ist ein pflanzliches Enzym, das die Umwandlung

von H2O2 in Sauerstoff und Wasser katalysiert. Durch Infiltration wird dadurch

gesamte H2O2 entfernt, das während der Interaktion mit S. sclerotiorum

entsteht. Danach wurde eine Blatthälfte S. sclerotiorum inokuliert.

Kontrollpflanzen wurden nur mit Pufferlösung infiltriert und anschließende mit

S. sclerotiorum inokuliert bzw. nur mit S. sclerotiorum inokuliert.

Nach 17 Stunden war ein weitgehend gleichmäßiges Anwachsen des Mycels

zu beobachten. Nur in einem von drei Blättern war in dem Katalase-

infiltrierten Bereich war zu diesem Zeitpunkt eine minimal verstärkte

Ausbreitung der Nekrose auszumachen (nicht abgebildet). Die Nekrosen vor

der X-Gluc Färbung 24 Stunden nach Inokulation waren in ihrer Größe nicht

unterschiedlich. Die Reportergen-Analyse in den Abbildungen 3.9.1 zeigte,

dass die Aktivität des SlSBT3-Promotors in den mit S. sclerotiorum

inokulierten und Katalase-infiltrierten Blättern Blättern stark erhöht wurde. In

Gegenwart von Katalase erreichte die Blaufärbung schon nach 24 Stunden

eine Intensität, die durch die Pilzinfektion alleine erst nach 48 Stunden zu

beobachten war. Wie unter 3.6 war hier eine starke Induktion des SlSBT3-

Promotors im Grenzbereich der Nekrose und im Gewebe des

Infiltrationsbereichs zu sehen. Die Kontrollinfiltration mit Katalase auf der

anderen Blattseite zeigte keine großflächige Blaufärbung. Die drei

Kontrollblätter die mit S. sclerotiorum, aber nicht mit Katalase infiltriert waren,

zeigten im Gewebe um die Nekrose wie unter 3.6 eine vergleichbar

Ergebnisse

69

schwächere Blaufärbung. 48 Stunden nach Inokulation war in diesen Blättern

eine vergleichbar starke Färbung zu erkennen (nicht abgebildet).

Kontrollpflanzen die mit Pufferlösung infiltriert waren zeigten eine

vergleichbare Blaufärbung zu der Kontrolle, die nur mit S. sclerotiorum

inokuliert waren (nicht abgebildet). Eine Untersuchung in den Katalase-

infiltrierten Blättern nach 48 Stunden erschien als nicht sinnvoll, da nach

diesem Zeitraum das Wachstum des Pilzes den Infiltrationsbereich

überschritten hatte. Blätter, die nicht infiltriert und nicht inokuliert waren,

zeigten keine ausgeprägte Färbung des Blattgewebes. Damit kann

angenommen werden, dass es durch H2O2 zu Reprimierung der Expression

von SlSBT3 kommt.

Abb. 3.9.1: Histochemische Analyse der SlSBT3-Promotor::GUS Aktivität nach Infiltration mit Katalase und

gleichzeitiger Inokulation mit S. sclerotiorum. Dargestellt ist die Färbung von Tomatenblätter (GUS-

Linie 12-1) mit X-Gluc zum Zeitpunkt 0, Infiltration von 2000 U Katalase und gleichzeitiger Infektion mit

S. sclerotiorum nach 24 h, Infektion durch S. sclerotiorum nach 24 h. Die Pfeile deuten die infiltrierten

Bereiche an.

3.9.2 GUS-Reportergenanalyse nach Infiltration von Cantharidin

Der Einfluss des Zellgifts Cantharidin wurde ebenfalls mit GUS-Reportergen

analysiert. Die Blätter wurden hierfür an der Blattunterseite mit Cantharidin

infiltriert und nach 72 Stunden mit X-Gluc Lösung gefärbt. Die

Kontrollpflanzen wurden nicht infiltriert. Nach 72 Stunden war in dem

infiltrierten Bereich eine großflächige Nekrose sichtbar (Abb. 3.9.2). Um diese

Ergebnisse

70

Nekrose konnte ein Bereich chlorotischen Gewebes anhand der Gelbfärbung

beobachte werden. Nach Färbung der Pflanzen zeigte sich in den

Cantharidin-behandelten Blättern eine starke unregelmäßige Blaufärbung im

gesamten Blattgewebe. Die Kontrollpflanzen zeigten nur eine erhöhte

Induktion in den Blattadern, aber keine Färbung im Gewebe zwischen den

Blattadern. Somit ist mit diesem Versuch eine Aktivität des SlSBT3-Promotors

unabhängig von Pathogenen nach einem lokal begrenzten Zelltod

nachgewiesen worden.

Abb. 3.9.2: Histochemische Analyse der SlSBT3-Promotor::GUS Aktivität nach Infiltration von Cantharidin.

(GUS-SlSBT3 12-1, rechts oben). Infiltration von 5 µg Cantharidin führt nach 72 h zu lokal begrenzten

Nekrosen (links oben). Färbung mit X-Gluc und Entfärbung mit 70 %Ethanol (links unten). Kontrollen

waren unbehandelt (rechts unten).

Diskussion

71

Diskussion

Über ein Drittel der pflanzlichen Proteasen sind Serinproteasen. Mit mehr als

50 codierten Genen in Arabidopsis stellt die S8-Familie der Subtilisin-

ähnlichen Proteasen die größte Familie der Proteasen in Pflanzen dar (Van

der Loon und Jones, 2004).

In Tomate sind bisher 15 Mitglieder identifiziert worden. Sie werden in fünf

Subfamilien: tmp, P69, SlSBT1, SlSBT2 und SlSBT3/4 unterteilt (Meichtry et

al., 1999). Mit der Charakterisierung von Vertretern der P69-Subfamilie ist

einmalig die Induktion pflanzlicher Subtilasen nach Pathogenbefall gelungen

(Tornero et al., 2000; van der Hoorn und Jones, 2004).

Um die Funktion der Subtilasen in planta genauer zu bestimmen, sollten in

der vorliegenden Arbeit die Beziehungen der SlSBT3 zu

Abwehrmechanismen und anderen durch Phytopathogene hervorgerufene

Reaktionen beschrieben werden. So wurde die Expression der SlSBT3

untersucht, nachdem die Pflanze mit virulenten, avirulenten oder hrp-

defizienten biotrophen Bakterien der Gattung Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria sowie mit einem hemibiotrophen Oomyceten, Phytophthora

infestans, und einem nekrotrophen echten Pilz, Sclerotinia sclerotiorum,

infiziert wurden. Daneben wurden der Einfluss bekannter Signalmoleküle der

Pathogenabwehr und am Zelltod beteiligter Substanzen auf die Expression

der SlSBT3 untersucht. Außerdem wurden unter Verwendung von transgenen

Pflanzen, die sich in der Expressionsstärke der SlSBT3 unterschieden, das

Bakterienwachstum und die auftretenden Krankheitssymptome untersucht.

4.1 Beeinflussung des Expressionsstatus der SlSBT3 durch Pathogenbefall

Da bereits in Vorversuchen (Huttenlocher, unveröffentlicht) eine Änderung

der Expression der SlSBT3 nach Befall durch Xanthomonas campestris

beobachtet werden konnte, wurde m Rahmn dieser Arbeit eine genauere

Analyse der Expressionnach Pathogenbefall durchgeführt.

Diskussion

72

Die Untersuchungen wurden auf mehrere repräsentative Vertreter von

Phytopathogenen ausgeweitet. So wurde die Wirtspflanze Tomate mit

virulenten, avirulenten oder hrp-defizienten Bakterien, mit einem Oomyceten

bzw. mit einem echten Pilz infiziert. Damit waren aus drei phylogenetisch

verschiedenen Klassen repräsentative Vertreter von mikrobiellen

Schaderregern ausgewählt, die gleichzeitig verschiedene pathogenetische

Strategien, von biotroph über hemibiotroph bis hin zu nekrotroph, verfolgen.

Die Ergebnisse der Expressionsanalyse mittels semiqRT (Abb. 3.2.1) nach

Infektion durch X. campestris pv. vesicatoria sind nicht aussagekräftig. Durch

die Induktion der SlSBT3 in der Kontrollbehandlung müssen in diesem

Versuch Störfaktoren, wie eine zu große mechanische Beanspruchung der

Blätter durch die Vakuuminfiltration oder ein Einfluss des Detergenz Silwet

L77 berücksichtigt werden. Dies wurde durch die in den Kontrollen

auftretende Induktion des PR3a-Gens in Folge in diesem Experiment

ebenfalls deutlich.

Durch Inokulation mit der Spritze und Analyse des Expressionsspiegels mit

Northern Blot (Abb. 3.2.2) konnten trotz der geringeren Sensitivität der

Nachweismethode aussagekräftigere Ergebnisse erzielt werden. Damit ist

dieses Vorgehen besser geeignet, um einen eindeutigen Beweis der

Expression der SlSBT3 nach bakterieller Infektion zu erbringen.

Durch den avirulenten Stamm von X. campestris pv. vesicatoria wurden über

den gesamten beobachteten Zeitraum die stärksten Signale detektiert. Die

Induktion des PR-3a Gens zeigte sich in diesem Experiment einen ähnlichen

zeitlichen Verlauf. Die unerwartet schwachen Signale des PR-3a Gens nach

erfolgter Infektion könnten durch eine schwache Hybridisierung zu erklären

sein oder auf eine unvollständige Erkennung des AvrBs3-Genprodukts im

Pathosystem mit dem Tomatenkultivar UC82B zurückzuführen sein. Die

Einleitung einer für die inkompatible Interaktion typischen hypersensitiven

Reaktion (HR) spricht aber aufgrund der frühzeitig beobachteten Symptome

und deren Unterschiede zu denen des virulenten Stamms von Xcv (vgl. Kap.

3.5 für eine partielle Erkennung von Xcv pDsK 200 als avirulentes Pathogen.

Das Pr-3a Signal 24 Stunden nach Inokulation weicht in der Intensität von

Diskussion

73

den anderen beobachteten stark ab. Damit muss angenommen werden, dass

die untersuchen Proben zu diesem Zeitpunkt nicht ausreichend infiziert

waren, was das Ausbleiben eines Signals nach der Hybridisierung mit der

SlSBT3-Sonde zu diesem Zeitpunkt erklären könnte. Die unregelmäßige

Verteilung des Signals nach 48 Stunden muss als ein Artefakt des RNA-

Transfers auf die Membran gedeutet werden, da sich nur zu diesem Zeitpunkt

ein undeutliches Signal zeigt. Die Induktion der SlSBT3 durch den avirulenten

Stamm deutet auf ein R-Gen-vermitteltes Induktionssignal hin. Mit der R-Gen-

Erkennung kommt es zur Einleitung einer effektiven Pathogenabwehr

verbunden mit der Induktion von PR-Proteinen und der Einleitung der HR.

Nach Inokulation mit dem virulenten Stamm von Xcv lässt sich eine Induktion

der SlSBT3 erst nach fünf Tagen, vergleichbar mit einer Infektion mit dem

avirulenten Stamm gleichzeitig mit den ersten sichtbaren

Krankheitssymptomen beobachten, wobei das Expressionssignal nur

geringfügig stärker ist als das Signal der konstitutiv exprimierten SlSBT3 zum

Zeitpunkt Null. Zum gleichen Zeitpunkt ist auch die stärkste Induktion des

PR3a-Gens zu beobachten. Mit dieser Beobachtung könnte die Induktion der

SlSBT3 auf eine Effektor-vermittelte Erhöhung der Genexpression oder auf

das lokale Absterben des Gewebes infolge der Infektion zurückzuführen sein.

Mit dem Nachweis der Induktion der SlSBT3 ausgelöst durch den nicht

pathogenen hrp-defizienten Stamm von Xcv kann grundsätzlich eine

spezifische TTS-vermittelte Induktion der SlSBT3 in diesem Pathogen-

Wirtspflanze-System ausgeschlossen werden.

Mit dem hrp-defizienten Stamm ist eine Induktion der SlSBT3 acht Stunden

nach Inokulation festzustellen. Die Expression von PR-3a war nach acht

Stunden im Vergleich zum Zeitpunkt Null nicht erhöht. Die Abnahme des

Signals der PR3a-Hybridisierung scheint im weiteren Verlauf schwächer zu

sein als das Signal vor der Inokulation. Somit kann eine geringe Induktion der

PR-Gene der Versuchspflanzen vor der Inokulation nicht ausgeschlossen

werden. Das untersuchte RNA-Isolat zum Zeitpunkt Null war für alle

durchgeführten Northern Blot-Analysen identisch. Daher kann die geringere

Expression des PR-3a-Gens der hrp-Stamm infizierten Proben im Vergleich

zum Zeitpunkt Null nicht als spezifisches Merkmal dieser Infektion gedeutet

Diskussion

74

werden. Vielmehr muss von einer minimalen Beeinträchtigung der

Versuchspflanzen ausgegangen werden, die allerdings aufgrund der geingen

Unterschiede für die Aussage des gesamten Versuchs vernachlässigt werden

kann, da die entsprechenden Kontrollpflanzen keine Abweichungen in der

Pr-3a Genexpression zeigen. Demnach besteht in diesem Fall keine

Abhängigkeit der SlSBT3-Expression von der Induktion des PR-3a-Gens.

Schlussfolgernd kann eine Induktion der SlSBT3 mit einer starken Induktion

von PR-Genen, dem Eintreten von sichtbaren Blattveränderungen, wie HR

oder Krankheitssymptomen, und der Erkennung von Bakterien im Apoplasten

in Verbindung gebracht werden.

Die Induktion der SlSBT3 nach acht Stunden und die schnelle Abnahme

dieses Signals im weiteren Verlauf der Analyse, würden hierbei für eine

Funktion in der frühen basalen Resistenz sprechen. Untersuchungen zur

differentiellen Genexpression nach Inokulation mit einem hrp-defizienten

Stamm von P. syringae ergaben eine induzierte Expression von etwa 800

regulierten Genen in Arabidopsis nach zwei bis zwölf Stunden (Truman et al.,

2005). Im Zusammenhang mit der frühen basalen Resistenz konnte

festgestellt werden, dass es sich dabei insbesondere um Gene handelt, die

für extrazelluläre Proteine codieren. So wurde für eine in der frühen basalen

Resistenz nachgewiesene extrazelluläre Chitinase ein vergleichbarer

Zeitverlauf der Expression mit einem Maximum nach acht Stunden gezeigt

(Szatmari et al., 2006).

In der Literatur ist bereits ein ähnliches Expressionsmuster mit einem

Induktionsmaximum acht Stunden nach Inokulation für die apoplastische

Pepsin-ähnliche Aspartatprotease CDR1, eine extrazelluläre Protease mit

Funktion in der effektiven Abwehr von P. syringae, beschrieben (Xia et al.,

2004). Außerdem wurde für die Subtilasen-Gene bereits früher eine schnelle

stressinduzierte Expression postuliert, da sie keine Introns beinhalten

(Meichtry et al., 1999).

Im weiteren Verlauf der Untersuchungen wurde die Expressionsanalyse der

SlSBT3 nach erfolgter Infektion durch Eukaryonten ausgeweitet. Die

Translokation von Effektoren durch eukaryontische Pathogene ist nicht

Diskussion

75

beschrieben (Ellis et al., 2006). Daher finden die Erkennung und die erste

Abwehr von Oomyceten und echten Pilzen im extrazellulären Bereich statt,

wo die Aktivität der SlSBT3-Protease vermutet wird.

Kompatible hemibiotrophe Organismen, wie das hier verwendete Kultivar von

P. infestans, durchlaufen eine Phase biotrophen Wachstums, in der sich die

Population etabliert, gefolgt von einer Phase des nekrotrophen Wachstums.

Pflanzliche extrazelluläre Proteine stellen bei der Etalierung der Population

ein bekanntes Ziel von Effektoren der Oomyceten und echten Pilzen dar. Für

einen Vertreter der oben genannten P69-Subtilasen aus Tomate, P69B,

konnte bereits eine funktionelle Interaktion mit solchen Effektoren

nachgewiesen werden (Tian et al., 2004; Tian et al., 2005). Auch für SlSBT3

wurde eine Hemmung der proteolytischen Aktivität durch Virulenzfaktoren von

P. infestans gezeigt (Knappenberger, unveröffentlicht). Für weitere

extrazelluläre Proteasen konnte eine vergleichbare inhibierende Funktion

durch P. infestans sekretierte Peptide gezeigt werden. Darunter die Cystein-

Protease PIP1 deren Expression bereits zwei Tage nach Infektion bzw. nach

Behandlung mit einem SA-Analogon induziert wird (Tian et al., 2007).

Unter Vorraussetzung, dass der polyklonale Antikorper eine ausreichend

spezifische Identifizierung der SlSBT3 erlaubt, wurde die Induktion der

SlSBT3 in Tomatenblättern mittels Western Blot besonders am vierten und

achten Tag nach Inokulation beobachtet (Abb. 3.8). Dies sind Zeitpunkte bei

denen bereits ein Wechsel von biotropher zu nekrotropher Lebensweise bei

P. infestans angenommen werden kann. So muss davon ausgegangen

werden, dass die SlSBT3-Genexpression durch diesen Wechsel der

Nahrungsgrundlage beeinflusst wird und eine rein biotrophe Lebensweise

dieses Pathogens keine stark induzierenden Signale freisetzt. Aus

Phytophthora sojae ist ein Nekrose induzierender Peptid-Elicitor, PsojNIP,

bekannt, der 48 Stunden nach Inokulation auf Transkriptebene in der

Wirtspflanze nachzuweisen ist (Kamoun, 2006, Vleeshouwers et al., 2006).

Aufgrund der nahen Verwandschaft der beiden Oomyceten kann ein solcher

Elicitor auch für P. infestans vermutet werden. Der Einfluss eines solchen

Elicitors würde das Maximum der SlSBT3-Expression auf Transkriptebene

vier Tage nach Inokulation erklären und eine Stabilisierung des Proteins

Diskussion

76

durch eine postranslationelle Veranderungen beweisen. Mit der

Beobachtung , dass am achten Versuchtag grossflächige Nekrosen sihtbar

wurden, kann die Vermutung aus der Expressionsanalyse nach Infektion

durch Bakterien bestätigen, dass die Induktion der SlSBT3 mit dem

Absterben von Geweben einhergeht.

Da die erhöhte Expression der SlSBT3 auch mit dem Wachstum eines

nekrotrophen Pilzes, S. sclerotiorum, im Blattgewebe beobachtet werden

kann (Abb. 3.6.1), ist eine Abhängigkeit der Induktion der SlSBT3 von einer

R-Gen-vermittelten Abwehr auszuschliessen. Eine solche Effektor-vermittelte

Abwehr führt zu keiner erfolgreichen Eingrenzung des Wachstums, da durch

den eingeleiteten programmierten Zelltod in Form von einer HR dem Pilz

nicht die Lebensgrundlage entzogen wird (Mur et al., 2008; Govrin und

Levine, 2000; Jones und Dangl, 2006). Somit bestätigt sich, dass die

induzierte Expression der SlSBT3 nicht auf die spezifische Erkennung des

TTSS-Effektors AvrBs3 des biotrophen Prokaryonten X. campestris pv.

vesicatoria zurückgeführt werden kann. Demnach kann eine Induktion der

SlSBT3 nicht als HR-spezifisch betrachtet werden, sondern ist allgemeiner

gefasst mit einer Einleitung von Zelltod und damit verbundenen Prozessen

assoziiert. Spezifische Pathogen-assozierte Strukturen und Effektoren von

P. infestans können ebenfalls als spezifische induzierende Signale

ausgeschlossen werden.

Die Besiedlung von Wirtspflanzen durch Nekrotrophe erfolgt in der Abtötung

des Gewebes sowohl durch Elicitoren, welche die pflanzliche

Plasmamembran angreifen, als auch durch wirtspezifische oder

wirtsunspezifische Toxine (Govrin und Levin, 2000; Mayer et al, 2001; Cotton

et al., 2002).

Ein bekanntes wirtsunspezifisches Toxin aus S. sclerotiorum ist Oxalsäure

(Hegedus und Rimmer, 2005). Oxalsäure ist ein Elicitor, der programmierten

Zelltod einleitet (Kyoung et al., 2008).

Wie in Kap. 3.6 beschrieben, konnte unter Verwendung der SlSBT3-

Promotor::GUS-Pflanzen eine Reportergen-Induktion in Bereichen um die

gebildetete Nekrose und eine Ausbreitung über die gesamte Blattfläche mit

zunehmenden Wachstum des Pilzes beobachtet werden. Dies würde

Diskussion

77

zusammen mit den vorhergehenden Ergebnissen den Zelltod als

induzierendes Signal bestätigen. Die Zunahme der GUS-Färbung scheint

dabei mit einem zunehmenden Wachstum von S. sclerotiorum korreliert zu

sein. So kann die Induktion des SlSBT3-Promotors durch ein mobiles Signal

nach Befall durch S. sclerotiorum bzw. der Auslösung von Zelltod vermutet

werden, da durch die die GUS-Aktivität im proximalen Fiederblatt verstärkt

wird.

Mit der Infiltration von Cantharidin sollte die Induktion der SlSBT3 durch ein

Zelltodsignal, unabhängig von Pathogenbefall, bestätigt werden.

Cantharidin löst in Pflanzenzellen durch Proteindephosphorylierung über

einen Cytochrom c-unabhängigen Weg programmierten Zelltod aus (Robson

und Vanlerberghe, 2002).

Die über GUS-Reportergen analysierten Expressionsmuster der SlSBT3 nach

Infiltration von Cantharidin stimmten mit dem durch S. sclerotiorum nach 48

bzw. 72 Stunden in soweit überein, dass es zu einer Aktivität des SlSBT3-

Promotors über die gesamte Blattfläche kommt (Abb. 3.6.2 und Abb. 3.9.2).

Im Gegensatz dazu führt die durch Cantharidin hervorgerufene Nekrose in

den direkt benachbarten Zellen nicht zu einer verstärkten Induktion des

Promotors, wie sie für die inokulierten Blätter nach 48 und 72 Stunden

auftraten. Das könnte auf Chlorosen in diesem Bereich der Cantharidin-

infiltrierten Blätter gefolgt von einer Beeinträchtigung der Expression des

Reportergens zurückzuführen sein. Mit diesem Ergebnis kann ein mobiles

induzierendes Signal ausgehend von der Nekrose vermutet werden.

Weiterhin zeigt dieser Versuch, dass eine von Pathogenbefall unabhängige

Induktion der SlSBT3 durch ein Zelltod-assoziiertes Signal beobachtet

werden kann.

4.2 Einfluss von Salicylsäure und H2O2 auf die Expression der SlSBT3

Nach Auslösung des „oxidative burst“ durch Pathogenbefall kommt es über

die Akkumulation von Salicylsäure zur Änderung des Redoxstatus der Zelle

und damit verbunden zur Aktivierung des Salicylsäure-abhängigen

Transkriptionsfaktors NPR1, der eine Reihe von Salicylsäure-abhängien

Reaktionen auf Pathogenbefall kontrolliert (Beckers und Spoel, 2005).

Diskussion

78

SA-vermittelte Signale werden daher sowohl mit der R-Gen-vermittelten als

auch mit der basalen Abwehr von biotrophen Pathogenen verbunden

(Glazebrook, 2005). Eine induzierte Expression durch Salicylsäure wurde

bereits für die Subtilasen P69B und P69C über GUS-Reportergenanalysen

gezeigt (Jordá et al., 1998, Jordá et al., 2000). Vergleichbare

Expressionsmuster mit einem Induktionsmaximum nach acht und zwölf

Stunden (Abb. 3.2.2) konnten z. B. für die Carboxypeptidase OsBISCPL1 aus

Oryza sativa in einer inkompatiblen Interaktion gezeigt werden (Liu et al.,

2008). Daneben wird die Auslösung von programmiertem Zelltod, in Form von

HR, auf die Akkumulation von Salicylsäure direkt über die Erkennung

positiver HR-Regulatoren, wie dem Transkriptionsfaktor AtMYB30 in

Arabidopsis, in Verbindung gebracht (Raffaele et al., 2006).

Im Rahmen der hier durchgeführten Versuche wurde auch eine Induktion in

den Kontrollpflanzen festgestellt, die allerdings schwächer war als in den SA-

behandelten Pflanzen. Möglicherweise haben Stressfaktoren wie

mechanische Beanspruchung der Blätter infolge von Besprühen oder

Infiltrieren bzw. Detergenzien wie Tween 20 als chemische Induktoren zu der

beobachteten Induktion der SlSBT3 und dem PR-Protein PR-3a wie bei der

Expressionsanalyse nach Bakterieninfektion mit der Methode der

Vakuuminfiltraion und mit Hilfe des Detergenz Silwet L77 geführt. In

Arabidopsis wurden bereits vergleichbare Beobachtungen zur induzierten

Genexpression durch Detergenzien wie Tween 20 beschrieben (Hunzicker et

al., 2004).

Mit dem Ziel die Abhängigkeit der SlSBT3-Expression von H2O2 zu

analysieren, wurde das bei der Interaktion mit Pathogenen gebildete H2O2

durch Infiltration von Katalase abgefangen.

ROS spielen bei der effektiven Pathogenabwehr eine tragende Rolle. Durch

sie kommt es z. B. durch Reaktion mit Zellwandstrukturen zur Bildung

mechanischer Barrieren, die ein Eindringen von Pilzen unterdrücken. H2O2

wirkt daneben als Signalmolekül bei der Auslösung des Pathogenbefall

abhängigen Zelltods (Mur et al., 2008, Gechev und Hille, 2005).

Durch das Abfangen von H2O2 an der Kontaktfläche zu S. sclerotiorum

scheint die GUS-Aktivität schneller induziert zu werden (Abb. 3.9.1). Im

Diskussion

79

Umkehrschluss kann dadurch im Pathosystem mit S. sclerotiorum eine

reprimierende Aktivität von H2O2 auf den SlSBT3-Promotor angenommen

werden. Auch ohne zusätzliche Infiltration von Katalase kann bei Besiedlung

durch S. sclerotiorum der „oxidative burst“ mit dem Herabsenken des pH-

Werts mittels Oxalsäure unterdrückt wird (Hegedus und Rimmer, 2005).

Daher kann die Expression der SlSBT3 in diesem Pathogen-Wirtspflanze-

System als H2O2 unabhängig betrachtet werden.

Da die genauen Abläufe der pH-Wert Änderung und der Aktivierung der für

die Bildung von ROS verantwortlichen Enzyme in diesem Pathosystem nicht

genau bekannt sind, kann ein induzierendes Signal auch vor der Bildung von

H2O2 nicht ausgeschlossen werden. So wäre es möglich, dass andere ROS

oder die pH-Wert Absenkung direkt zu einer Induktion der SlSBT3 beitragen.

Das Pilztoxin Fusicoccin verursacht in Tomatensuspensionskulturzellen durch

Aktivierung der H+-ATPase eine Absenkung des pH-Wertes, durch die bereits

zur Induktion von PR-Genen nahgewiesen werden konnte (Schaller und

Oecking, 1999). Es wäre also denkbar, dass die Ansäuerung des Apoplasten

durch die von S. sclerotiorum produzierte Oxalsäure zur Induktion der SlSBT3

führt. Ob diese Induktion physiologische Konsequenzen in einem solchen

Milieu hat, ist fraglich, da in-vitro Untersuchungen keine proteolytische

Aktivität für SlSBT3 im sauren pH-Bereich vorraussagen (Huttenlocher,

unveröffentlicht). Die Induktion durch ein Zelltod-auslösendes Signal wäre

demnach auch unabhängig von H2O2. So wurde bereits in

Tabaksuspensionszellkulturen nach Zugabe von einem Elicitor aus

P. infestans eine H2O2-unabhängige Einleitung von programmiertem Zelltod

durch Hemmung von Serinproteasen beobachtet (Yano et al., 1999; Sasabe

et al., 2000).

4.3 Einfluss der SlSBT3 auf das Wachstum von Pathogenen in Tomatenblättern

Die erfolgreiche Besiedlung der Pflanze äußert sich in einer Etablierung der

Population des Phytopathogens im Blattgewebe. Im Falle einer Funktion der

SlSBT3 in der Pathogenabwehr sollte der Expressionsspiegel der SlSBT3 in

Überexpressions-Linien und RNAi-Linien einen Einfluss auf das Wachstum

und die Ausbreitung der Pathogene haben.

Diskussion

80

Das Wachstum der biotrophen Bakterien zeigte sich in der RNAi-Linie bei

allen Untersuchen Stämmen von X. campestris pv. vesicatoria 85-10

erniedrigt. Das Wachstum in SlSBT3-Überexpressionspflanzen und

Wildtyppflanzen zeigte durch Infektion mit dem virulenten und avirulenten

Stamm keine signifikanten Unterschiede (Abb. 3.4.1 und Abb. 3.4.2). Im

Wachstum des hrp-defizienten Stamms wurden die Unterschiede die sich im

Wachstum der beiden anderen pathogenen Stämme andeuteten am besten

deutlich (Abb. 3.4.3). Auch wenn die beobachteten Populationsgrösse in der

RNAi-Linie am zweiten Probentag, um ein vielfaches das der

Untersuchungen mit dem virulenten und avirulenten Stammes unterschreitet,

kann der allgemeine Trend totzdem an den anderern erzielten Datenpunkten

erkannt werden. Zudem konnte ein verbessertes Wachstum in

Überexpressionspflanzen beobachtet werden.

Das Wachstum des virulenten Stamms zeigt nur in den SlSBT3-RNAi-Linien

ein geringeres Wachstum und spiegelt das Ergebnis der Beobachtungen der

Wachstumskurven der beiden anderen Stämme.

Das Wachstum des avirulenten Stamm von X. campestris pv. vesicatoria 85-

10 mit einem Maximum nach sechs Tagen lässt einen Effekt hervorgerufen

durch eine spezifische Erkennung des AvrBs3-Genprodukts ausschließen.

Das stimmt mit der Aussage der Expressionsanalysen in soweit überein, als

das auch hier kein Einfluss des AvrBs3-Effektors auf die Expression der

SlSBT3 beobachtet werden kann. Die beobachtete Populationsgröße von 104

cfu/ cm2 scheint hierbei die Vermutung der Expressionsanalyse zu

bestätigen, wonach die Erkennung des AvrBs3-Genproduktes nur

unvollständig in dem verwendeten Tomatenkultivar UC82B stattfindet. Durch

die Expression dieses AVR-Genproduktes findet keine effektive Abwehr von

Xcv durch Auslösung einer vollständigen inkompatiblen Interaktion statt. Die

Einleitung einer hypersensitiven Reaktion scheint davon unbetroffen zu sein.

Die Tatsache, dass in diesen Pflanzen mit einer niedrigen koloniebildenden

Einheit (cfu/ml) der infiltrierten Bakteriensuspension nach acht Tagen in den

untersuchten Pflanzen HR zu beobachten war, die bei der Untersuchungen

mit dem virulenten Stamm ausblieben, wie die Inkubation auf

Diskussion

81

unterschiedlichen Selektionsmedien, schliessen ein Vertauschen von

virulentem und avirulentem Stamm aus.

Damit lassen sich die Ergebnisse der Expressionsanalyse bestätigen. TTSS-

sekretierte Effektoren haben keinen diekten Einfluss auf eine durch SlSBT3

geänderte Pathogenantwort, unter der Berücksichtigung, dass die Erkennung

des AvrBs3-Gens nur unvollständig erfolgt.

Mit dem besseren Wachstum des hrp-defizienten Stamm in der

Überexpressionslinie ließe sich prinzipiell eine Pathogen abwehrende

Funktion ausschließen. Liu et al. teilten die Pathogen-induzierten Proteine

basierend auf ihrer Funktion in fünf Gruppen. Die erste Gruppe stellen

Enzymen dar, die an der Synthese von Phytoalexinen beteiligt sind. Zur

zweiten Gruppen gehören Proteine, die zur Lyse der Zellwand von

Pathogenen beitragen, wie Chitinasen oder β1-3 Glucanasen. Defensine, die

eine Limitierung der Ausbreitung von Pathogenen erreichen, indem sie mit

der mikrobiellen Zellmembran interagieren, gehören zur dritten Gruppe. Bei

der vierten Gruppe, der durch Pathogenbefall induzierten oder aktivierten

Proteine, handelt es sich um Proteasen, die in ihrer Beteiligung am Zelltod als

HR-assozierten Proteine klassifiziert werden (Liu et. al., 2001). Die

Expressionsanalyse berücksichtigend, könnte SlSBT3 in diese vierte Gruppe

der HR involvierten Proteasen zu gezählt werden. Mit der Beobachtung der

Unterstützung der Population durch Überexpression der SlSBT3 wäre

SlSBT3 in die letzte Gruppe nicht weiter spezifizierter Proteine einzuordnen.

Eine mögliche Erklärung wäre, dass einer Alkalisierung des Apoplasten durch

Pathogenbefall eine erhöhte proteolytischen Aktivität folgt, die der

Prozessierung von wachstumsfördernden Faktoren für X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 in Tomate dient. Eine direkte Pathogen abwehrende Rolle

der SlSBT3 in diesem Pathogen-Wirtspflanze-System hätte dabei eine

untergeordnete Funktion.

Die beobachtenden Krankheitssymptome von X. campestris pv. vesicatoria

85-10 zeigten in der Bildung der Nekrosen ausgelöst durch den virulenten

und avirulenten Stamm keine qualitativen makroskopischen Unterschiede

Diskussion

82

(Abb. 3.5.1). Da keine explizite Beobachtung der Krankheitssymptome in

einem geringeren Abstand als 24 Stunden durchgeführt wurde, ist eine

zeitlich versetzte Symptombildung bedingt durch die biologische Variabilität

der beiden Interaktionspartner nicht berücksichtigt worden. Dadurch konnte in

allen drei SlSBT3-Genotypen für den virulenten und avirulenten Stamm kein

phänotypischer Unterschied offengelegt werden.

Die Beobachtung, dass sich in der RNAi-Linie Krankheitssymptome durch

den hrp-defizienten Stamm zeigten, die sich im Wildtyp vermindert

ausgeprägt erwiesen (Abb. 3.5.1 und 3.5.2), spricht für eine mögliche

Beteiligung der SlSBT3 in der basalen Resistenz durch die Erkennung von

Bakterien oder als eine Antwort auf den Stressfaktor des Wachstums bzw.

Stoffwechsels der hrp-defizienten Bakterien im Blattgewebe, wie sie mit der

erhöhten Expression der SlSBT3 angedeutet wurde. Das Auftreten von

Krankheitssymptomen durch nicht pathogene Mikroorganismen kann als

erfolgreiche Abwehr einer Nichtwirtspflanzen-Resistenz betrachtet werden

und ist mehrfach beschrieben (Desaki et al., 2006; Abramovitch und Martin,

2004).

Mit der Beobachtung, dass es bei Infektion durch S. sclerotiorum in der RNAi-

Linie zur besseren Wachstum kommt (Abb. 3.6), lässt sich dagegen die

Annahme untermauern, dass die Funktion der SlSBT3 in der Auslösung des

Zelltods zu vermuten ist. Der Mangel der SlSBT3 führt zu einer

erfolgreicheren Besiedlung des Blattgewebes durch S. sclerotiorum.

Demnach könnte SlSBT3 als induziertes Abwehrprotein eine Funktion in der

basalen Resistenz gegenüber S. sclerotiorum, bzw. das Ergebnis der

Expressionsanalyse von P. Infestans mit einbeziehend, gegenüber

nekrotroph lebenden Eukaryonten haben. Hiermit kann eine Zelltod

unterdrückende Funktion für SlSBT3 angenommen werden.

4.4 Die Rolle der SlSBT3 in der Pathogenabwehr

Basierend auf den hier vorgelegten Beweisen für eine von Pathogenbefall

abhängige Induktion der SlSBT3, kann dieses Enzym, wie die

Tomatensubtilasen aus der P69-Subfamilie, als PR-Protein, bezeichnet

Diskussion

83

werden (Hock und Elstner, 1995). Eine offensichtliche Pathogen abwehrende

Funktion muss dabei nicht nachgewiesen sein (van der Loon et al., 2006).

Zusammenfassend kann eine direkte Beteiligung der SlSBT3 an der

Pathogenabwehr von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 85-10

ausgeschlossen werden. SlSBT3 kann als Ziel einer direkten TTSS-

vermittelten Effektor-Immunität in diesem Pathogen-Wirtspflanze-System

ausgeschlossen werden. Diese Schlussfolgerung wird mit den

Wachstumskurven bestätigt. Durch das verbesserte Wachstum des hrp-

defizienten Stamms in der SlSBT3-Überexpressions-Linie findet auch keine

Einschränkung des Wachstums von nicht pathogenen Bakterien statt. Damit

ist die Beteiligung an einer direkten PAMP-vermittelten basalen Abwehr von

Prokaryonten ebenfalls anzunehmen. Damit könnte die die erhöhte

Expression der SlSBT3 nach Inokulation mit dem hrp-defizienten Stamm nur

auf eine indirekte Erkennung der Bakterien zurückgeführt werden.

Die starke Induktion der SlSBT3 nach Infektion mit einem Oomyceten und

einem echten Pilz könnten auf eine Beteiligung bei der PAMP-vermittelten

basalen Abwehr gegenüber Eukaryonten hinweisen. Dies bestätigte das

verbesserte Wachstum von S. sclerotiorum in der RNAi-Linie.

Da es sich bei den untersuchten Interaktionspartnern der Pathogen-

Wirtspflanze-Beziehungen um Vertreter verschiedener Reiche und Klassen

von Pathogenen mit enormen Unterschieden in der Besiedlungsstrategie

handelt, ist ein gemeinsames Pathogen-assoziertes Signal weitgehend

auszuschließen. In der Literatur sind einzelne PAMPs nur für einzelne

Vertreter von bestimmter Klassen beschrieben (Nürnberger et al., 2004). Ein

über Reiche oder Klassen übergreifende verbreitetes PAMP ist nicht

beschrieben und ist durch die vielseitigen strukturellen Unterschiede von

Mikroorganismen einleuchtend erklärbar. Demzufolge kann ein induzierendes

Signal nur durch ähnliche Infektionsstrategien oder wie im Fall des

avirulenten Interaktionspartners durch die Gemeinsamkeit der ausgelösten

Reaktion gesucht werden (Schwessinger und Zipfel, 2008).

Diskussion

84

Alle Ergebnisse gemeinsam betrachtet, weisen auf eine starke Zelltod-

assozierte Expression und Funktion der SlSBT3 in der Pflanze hin, die

unabhängig von einer Bildung von H2O2 zu sein scheint.

Zelltod-Regulierung ist in Pflanzen und Tieren verbunden mit effektiver

Pathogenabwehr ein weit verbreiteter Mechanismus (Greenberg et al. 1994;

Lam et al., 1999). Demnach könnte die Pathogen abwehrende Rolle in der

Beteiligung der SlSBT3 bei der Auslösung von Zelltodprozessen vermutet

werden.

In der Literatur sind viele Zelltod-assoziierte Proteasen beschrieben, die sich

durch identifizierte Elicitoren aus Oomyceten und Pilzen induziert zeigen

(Beers et al., 1997; Beers et al.; 2000; Bonneau et al., 2008). Solche

Proteasen werden, aufgrund der tierischen Proteasen analoge Funktion in der

Auslösung von Zelltod beteiligt zu sein, Caspasen genannt. Eine den

tierischen Caspasen ähnliche Cathepsin B-ähnliche Protease zeigt sich in

Solanum tuberosum durch avirulenten Stamm von Erwinia amylovora und

P. infestans induziert (Avrova et al., 2004, Gilroy et al., 2007). Serinproteasen

mit Zelltodfunktion sind aus Avena sativa bekannt (Coffeen und Wolpert,

2004).

Eine Reihe von Proteasen werden bei der Regulierung des Zelltods in

Pflanzen diskutiert. Interessanterweise zeigten bisher postulierte Vertreter

solcher Proteasen eine ähnliche Expression nach Pathogenbefall. Zwei

sogenannte Metacaspasen, AtMCO1a und AtMCP1b, zeigen sich in Northern

Blot Analysen sowohl durch virulente als auch durch avirulente Stämme

bakterieller Pathogene induziert. Eine andere vermutete Metacaspase aus

Tomate, LeMCA1, konnte nach Befall durch Botrytis cinerea, einem

nekrotrophen Ascomyceten, mit einer Erhöhung des Transkriptspiegels

nachgewiesen werden (Watanabe und Lam, 2004). Die Beteiligung solcher

Cystein-Proteasen an der Regulierung des Zelltods wird nur aufgrund von

Sequenzähnlichkeit zu tierischen Caspasen hergeleitet. Homologe Proteine

zu Caspasen oder Regulatoren mit anti- oder proapoptischer Funktion sind

nicht bekannt. Eine Identifikation von Funktions- und Strukturhomologen wird

zudem aufgrund der unterschiedlichen Entwicklung von tierischen und

Diskussion

85

pflanzlichen Systemen bis auf oben genannte Strukturvergleiche

ausgeschlossen (Watanabe und Lam, 2004).

Die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der Bakterien würde eine

solche physiologische Funktion für SlSBT3 mit den beobachteten frühen

Symptomen in der SlSBT3 RNAi-Linie unter dieser Annahme erklären.

Eine mögliche antiapoptotische Wirkung der SlSBT3 wäre in der

Überexpressions-Linie verstärkt und würde eine effektive Abwehr von

biotrophen Pathogenen in Form von vermindertem Wachstum verhindern,

wohingegen in der RNAi-Linie eine antiapoptotische Wirkung vermindert ist

was eine Bildung von Symptomen verstärkt oder einen früheres Auftreten

bedingt. Solche Unterschiede wären bei Untersuchungen mit kompatiblen

oder inkompatiblen biotrophen Phytopathogenen unter Umständen nur in

einem zeitlich versetzten Auftreten oder nur auf mikroskopischer Ebene

deutlich.

Mit der hier durchgeführten Probennahme in einem 24 Stunden-Rhythmus

kann eine solche phänotypische Erscheinung für den virulenten und

avirulenten Stamm von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria nicht

ausgeschlossen werden.

Das frühe Auftreten von Nekrosen durch den hrp-defizienten Stamm,

beobachtet in der SlSBT3-RNAi-Linie, könnte mit einer solchen

antiapoptotischen Funktion der SlSBT3 in Verbindung gebracht werden.

Beispiele von vergleichbaren Phänotypen finden sich in Mutanten von

Zelltodregulatoren nach Zellstod-Stimuli wie Pathogenbefall.

So konnte durch Expression des antiapoptotischen p35 aus Baculoviren eine

verstärkte Resistenz in Form von geringeren Symptomen nach Alternaria–

Befall in Tomatenfrüchten gezeigt werden (Lincoln et al., 2002). Infiltration

von tierischen Caspase-Hemmern führte zu verminderten

Krankheitssymptomen von P. syringae in Tabak und X. campestris pv.

vesicatoria in Tomate (Richael et al. 2001).

In Zelltod-Mutanten wie der ACD2 (accelareted cell death), ein Protein der

Plasmamembran aus Arabidopsis, konnte in der Überexpessions-Linie

Diskussion

86

ebenfalls keine messbaren Unterschiede im Wachstum von avirulenten

Bakterien im Blattgewebe offen legen, zeigten aber eine verminderte Bildung

von Krankheitssymptomen in Überexpressionspflanzen (Mach et al., 2001).

Ausblick

87

Ausblick

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass SlSBT3 durch Pathogenbefall

induziert wird. Weitere Arbeiten mit Pathogenen wie Pseudomonas syringae

oder Alternaria solani könnten die beobachteten Ergebnisse letztendlich

bestätigen. Desweiteren wäre interessant zu sehen, ob sich der beobachtete

Phänotyp in der SlSBT3-RNAi-Linie nach Infektion durch Sclerotinia

sclerotiorum mit Real-time-PCR quantitativ erfassen lässt und ob eine

Infiltration mit aktivem SlSBT3 eine komplementierende Wirkung in der

SlSBT3 RNAi-Linie hat. Ähnliche Ansätze wären auch für das beobachtete

Wachstum und der Ausprägung von Symptomen mit dem hrp-defizienten

Stamm von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria möglich. Da alle bis

jetzt durchgeführten Wachstumsexperimente nur in jeweils einer SlSBT3-

Linie gemacht wurden, sollten zukünftig die gleichen Versuche in mehreren

unabhängigen SlSBT3-RNAi und -Überexpressions-Linien getestet werden.

Unterschiede in der Entwicklung von Krankheitssymptomen durch den

virulenten und avirulenten Stamm von X. campestris pv. vesicatoria könnten

eventuell durch Beobachtung in einem zeitlich engeren Rahmen und in

histologischen Schnitten besser beobachtet und herausgestellt werden.

Unabhängig von Pathogenen wäre es interessant zu sehen, ob andere

Zelltodsignale zu einem ähnlichen Verlauf der Bildung von Symptomen in

SlSBT3-RNAi und –Überexpressionspflanzen führen.

Mit dem Ziel eine eindeutige Aussage über die Abhängigkeit der SlSBT3-

Expression von Salicylsäure zu bekommen, sollte die Expressionsanalyse in

verschiedenen Mutanten in der endogenen Salicylsäure-Perzeption des

ausgelösten Signals endgültig bestimmt werden. In der nahG Mutante kann

Salicylsäure nicht akkumulieren. Dadurch bleibt die Salicylsäure-abhängige

Induktion von PR-Proteinen aus (Achuo et al., 2004). Mit dieser Mutante

wäre bei einer Abhängigkeit von Salicylsäure keine Induktion von SlSBT3

nach Pathogenbefall nachweisbar.

Ausblick

88

Die hier im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche der Aktivität des

SlSBT3-Promotors nach Behandlung mit Cantharidin und H2O2 sind nur als

erster Versuche zu verstehen. Eine endgütige Aufklärung der Abhängigkeit

von H2O2 könnten spezifische Nachweise der SlSBT3-Expression auf

Transkript- oder Proteinebene bestätigt werden. Daneben müssten

unabhängig von einer Infektion vergleichbare Untersuchungen mit

Oxalsäure, Superoxiddismutase und H2O2–generierenden Substanzen wie

Glucose und Glucose-Oxidase durchgeführt werden. So könnte auch

untersucht werden, ob sich eine Induktion auch durch andere Zellgifte

nachweisen ließe.

Im Hinblick auf die von Phytophthora infestans sekretierten Kazal-Inhibitoren

müsste nach den hier vorgelegten Daten ein Phänotyp in den SlSBT3-RNAi-

und -Überexpressions-Linien zu identifizieren sein. Dabei könnte mit der

Bestätigung der Inhibierung des SlSBT3 durch Kazal-Inhibitoren in vivo die

Relevanz dieser Protease in der Pathogenabwehr auf ein wirtschaftlich

interessantes Pathogen-Wirtspflanzen-System bezogen werden.

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XII

Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig

angefertigt, keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt und

sowohl wörtliche, als auch sinngemäß entlehnte Stellen als solche kenntlich

gemacht habe.

Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen

Prüfungsbehörde vorgelegt und auch nicht veröffentlicht.

Hohenheim, ____ September 2008

Monika Neugebauer

XIII

Danksagung

Danke an Herrn Prof. Dr. Schaller sowohl für die Überlassung dieses

interessanten Themas als auch für die vorbehaltslose Unterstützung und die

Freiheit, die er mir bei der Bearbeitung der Fragestellung gelassen hat.

Frau Dr. Anja Cedzich danke ich neben der hervorragenden

wissenschaftlichen Hilfe und Anleitung für die gute Zusammenarbeit, ihrem

Glauben an mein Fortkommen und Ihrem Vertrauen in mich und meine

Arbeit.

Herrn Dr. Andreas Walz vom Fachbereich für Phytopathologie des Instituts

für Phytomedizin danke ich für die Zweitkorrektur.

Sein ernstes, aufrichtiges Interesse an dem Thema, sein Engagement und

sein Vertrauen in meine Fähigkeiten haben mein Vorankommen wesentlich

beeinflusst.

Ohne seine wissenschaftliche Hilfe wären viele Fragen der Pathogen-

Wirtspflanze-Beziehungen offen geblieben.

Mathias und Benni vom Reitscheuerflügel danke ich für die Tipps und

kleinen ungezählten Hilfen im Laboralltag, dem Team vom Gewächshaus für

die Hilfe bei der Anzucht der Tomaten und dem ganzen Institut dafür mich

bei Laune zu gehalten zu haben.

Danke an Sebastian. Danke an Sabrina.

Zum Schluss danke ich meinen Eltern, die mir das Studium in dieser Form

möglich gemacht haben.

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Zur Rolle der Subtilase 3 aus Tomate (Solanum lycopersicum · Katalase in Tomatenblätter gefolgt...

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