Imidazol-Lipide:
Zur chemischen Implementierung eines Minimalen Chemotons
als Modellsystem für Protozellen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Nils Hellwig aus Kassel
Bochum 2010
Erster Referent: Prof. Dr. G. v. Kiedrowski
Zweiter Referent: Prof. Dr. M. Feigel
Dritter Prüfer: Prof. Dr. R. Heumann
3
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2003 bis Oktober 2010 an der Fakultät
für Chemie der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Prof. Dr. Günter von
Kiedrowski angefertigt.
Ich danke Herrn Prof. Dr. Günter von Kiedrowski für die interessante Themenstellung, die Möglichkeit zur Durchführung dieser Arbeit sowie das Interesse am Fortgang der Untersuchungen. Herrn Prof. Dr. Martin Feigel danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferates und Herrn Prof. Dr. Rolf Heumann für die Bereitschaft, die Drittprüferschaft zu übernehmen.
ALLGEMEINER TEIL 9
1 Einleitung 9 1.1 Die lebende Zelle, ein komplexes Reaktionssystem 9 1.2 Konzeptionelle Rahmenbedingungen zur Definition „lebend“ 12
1.2.1 Ganti´s Chemoton 14 1.3 Experimentelle Ansätze zur Herstellung synthetischer Zellen 19
1.3.1 Das top-down Verfahren zur Herstellung synthetischer Zellen 19 1.3.2 Bottom-up Herstellung von Semi-Synthetischen Minimalen Zellen über in-vitro synthetische Ansätze 21 1.3.3 Bottom-up Herstellung von synthetischen Zellen über chemische Ansätze 25 1.3.4 Modelle zu Protozellen, basierend auf Emulsionen 32 1.3.5 Künstliche Zellen über elektronische, mikrofluidische Systeme 34
1.4 Selbstreplizierende Systeme 35 1.4.1 Nicht-enzymatische, templatgesteuerte Reaktionen 35 1.4.2 Selbstreplizierende Oligonukleotide 36 1.4.3 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden und organischen Reaktionsbausteinen 41
1.5 Modell für ein Minimales Chemoton 44
2 Aufgabenstellung 49 2.1 Synthese von Catalipiden 49 2.2 Membranformendes Subsystem (3) des MCMs: Selbstorganisation von Catalipiden zu
Catalipid-Vesikeln 49 2.3 Metabolisches Subsystem (1): Herstellung von Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugaten 50 2.4 Genetisches Subsystem (2): Ligation des Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugats A mit dem
5`-Amino modifizierten Oligonukleotid NH2-CGGAA B 4 50 2.5 Kombination der Subsysteme (1) bis (3) zum MCM 50
3 Chemische Implementierung des Minimalen Chemoton Modells 51 3.1 Herstellung von strukturvielfältigen Catalipiden 51
3.1.1 Lipide 51 3.1.2 Festphasensynthese von Catalipiden 51 3.1.3 Auswahl einer geeigneten Festphase zur Catalipid Synthese 55 3.1.4 Herstellung L-Histidin beladener Festphasen 56
3.1.4.1 Synthese der L-Histidin-Festphase 11 56 3.1.4.2 Synthese der Nα-Fmoc L-Histidin-Festphase 16 57 3.1.4.3 Synthese der L-Histidinmethylester-Festphase 19 59
3.1.5 Histamin-Festphase 21 60 3.1.6 Übersicht der L-Histidin- und Histamin-Festphasen zur Synthese von Catalipiden 61 3.1.7 Synthese symmetrischer Catalipide auf Basis von L-Histidin und Histamin durch
reduktive Aminierung[107] 61 3.1.8 Synthese von komplexen Catalipiden auf Basis von L-Histidin und Histamin durch
Peptid-Kopplungsreaktionen 64 3.1.8.1 Nα-Fmoc-L-Serin 46 als Verzweigungspunkt in der Festphasensynthese von Catalipiden 68
3.1.9 Synthese von Catalipid-Phosphoglyceriden 70 3.1.9.1 Phospholipide 70 3.1.9.2 Retrosynthese von Glycero-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinolen 56 71 3.1.9.3 Festphasensynthese des racemischen 1, 2 Di-oleyl-glycerol-3-phospho-(Nα-acetyl)-
L-histidinols 64 72 3.1.9.4 Festphasensynthese von enantiomerenreinem 1-Oleoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-
phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinol 65[115] 74 3.1.9.5 Zusammenfassung der Ergebnisse der Festphasensynthese von Catalipiden 76
3.2 Selbstorganisation von Catalipiden zu supramolekularen Aggregaten. Untersuchungen zum membranformenden Subsystem (2) des Minimalen Chemoton Modells 77
3.2.1 Physikochemische Hintergründe der Selbstorganisation amphiphiler Moleküle 77 3.2.1.1 Aggregationsverhalten amphiphiler Moleküle im Dispersionsmedium 77 3.2.1.2 Optimale Kopfgruppenoberfläche a0 amphiphiler Moleküle in supramolekularen Aggregaten 78 3.2.1.3 Geometrie und Packung amphiphiler Moleküle in supramolekularen Aggregaten 80
3.2.1.4 Sphärische Mizellen 83 3.2.1.5 Zylindrische Mizellen 83 3.2.1.6 Vesikel 84 3.2.1.7 Doppellagen 86 3.2.1.8 Invertierte mizellare Strukturen 87
3.2.2 Anforderungen an die zu wählende Herstellungsmethode für Catalipid-Vesikel 87 3.2.3 Herstellungsmethoden von großen unilamellaren Vesikeln (GUV) 88
3.2.3.1 Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode 88 3.2.3.2 Elektroformation 89 3.2.3.3 Mögliche Mechanismen der Vesikelbildung 89
3.2.4 Auswahl geeigneter Catalipide zur Vesikelherstellung 91 3.2.4.1 Auswahlkriterien geeigneter Reaktionsbedingungen zur CatalipidVesikelherstellung 91 3.2.4.2 Herstellung der Catalipid-Dispersionen über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode 92 3.2.4.3 Selektierte Catalipide zur Vesikelherstellung 93
3.2.5 Konfokale Mikroskopie zur Untersuchung der Catalipid-Dispersionen 94 3.2.5.1 Probenpräparation der Catalipid-Dispersionen zur mikroskopischen Untersuchung 95
3.2.6 Aggregationsverhalten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 im pH-Wert Bereich zwischen 4 und 5 96
3.2.6.1 MOH 39 Catalipid-Dispersionen bei pH = 4, 4.2 und 5 97 3.2.6.2 DOSH 54 Catalipid-Dispersionen bei pH = 4, 4.2 und 5 105 3.2.6.3 Gegenüberstellung des Aggregationsverhaltens von MOH 39 und DOSH 54
bei pH = 4, 4.2 und 5 111 3.2.7 Aggregationsverhalten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 bei pH = 7 bis 8 113 3.2.8 Cholesterin 67 als Helfer-Lipid in der Catalipid-Vesikelherstellung 114
3.2.8.1 Einfluss von Cholesterin 67 auf die Aggregation von MOH 39 115 3.2.8.2 Einfluss von Cholesterin 67 auf die Aggregation von DOSH 54 118 3.2.8.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse des Einflusses von Cholesterin auf die Aggregation
von MOH 39 und DOSH 54 121 3.2.9 Herstellung von Catalipid-Vesikeln durch Elektroformation 123
3.2.9.1 Elektroformation an Pt-Elektroden 124 3.2.9.2 Elektroformation auf einer ITO-beschichteten Glasoberfläche 127
3.2.10 Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in MOH 39- und DOSH 54-Vesikel 129
3.2.10.1 Einkapselung nach der Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode 130 3.2.10.2 Einkapselung nach der Gefriertrocknungs-Methode 130 3.2.10.3 Mikroskopische Aufnahmen der mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA befüllten
MOH und DOSH Catalipid-Vesikel 131 3.2.11 Eigenfluoreszenz der MOH 39 und DOSH 54 Catalipid-Vesikel 136 3.2.12 Das Catalipid MON-Im 71 142
3.3 Metabolisches Subsystem (1) des Minimalen Chemoton Modells 145 3.3.1 Synthese reaktiver DNA-Catalipid Konjugate 146 3.3.2 Zusammenfassung der DNA-Catalipid Konjugationsexperimente und
Schlussfolgerungen für das MCM 153 3.3.3 Synthesen reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate mit kurzkettigen Catalipiden 154
3.3.3.1 Synthese der kurzkettigen Histamin-Catalipide und deren korrespondierender Cy5-TTCCG Konjugate 155
3.3.3.2 Synthese kurzkettiger 1, 3-Aminopropylimidazol 72 basierter Catalipide und Experimente zur Synthese der korrespondierenden Cy5-TTCCG Konjugate 158
3.4 Genetisches Subsystem (2) des Minimalen Chemoton Modells: Untersuchungen zur Oligonukleotid Selbstreplikation mit reaktiven DNA-Catalipid Konjugaten 163
3.4.1 Ligationsexperimente mit dem Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74 164 3.4.2 Ligationsexperimente mit kurzkettigen Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten 167
3.5 Experimente zur Kombination des metabolischen- (1), genetischen- (2) und membranformenden (3) Subsystems zu einem Minimalen Chemoton Modell 170
3.5.1 Experimente zur Phosphorimidazolid Bildung auf der äußeren Membran von Catalipid Vesikeln 171
3.6 Catalipid-Mizellen: Kopplung einer Replikation an ein metabolisches und ein kompartmentierendes System 180
3.6.1 Diskussion des Einsatzes von 31P-NMR Experimenten zur Untersuchung des metabolischen Systems sowie der Replikation und von 19F-NMR zur Untersuchung des kompartmentierenden Systems 182
3.6.2 Entwicklung des Catalipid-Mizellen Modells 187
5
3.6.3 Zeitaufgelöste 31P-NMR Spektroskopie zur Untersuchung des Reaktionsverlaufs in Experimenten zum Catalipid-Mizellen Modell 189
3.6.4 19F-NMR Spektroskopie zur Untersuchung des Aggregationsverhaltens fluorierter Amphiphile 199
3.6.4.1 Theoretischer Hintergrund der 19F-NMR Spektroskopie zur CMC Bestimmung fluorierter Amphiphile 199
3.6.4.2 Synthese ω-fluorierter Catalipide 201 3.6.4.3 Löslichkeitsversuche ω-fluorierter MCH-F und MCN-Im-F Catalipide 204
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 206
EXPERIMENTELLER TEIL 216
1 Spektroskopische Methoden 216 1.1 Magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR) 216 1.2 Massenspektrometrie 216
1.2.1 Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB) 216 1.2.2 Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI) 216 1.2.3 Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight (MALDI-TOF) 216
1.3 UV/VIS-Spektroskopie 217
2 Mikroskope 217
3 Chromatographische Methoden 218 3.1 Dünnschichtchromatographie 218 3.2 Säulenchromatographie 218 3.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 218
4 Sonstige Arbeitsgeräte 218
5 Chemikalien 219 5.1 Verwendete Lösungsmittel 219 5.2 Chemikalien 219
6 Synthesen selektiv geschützter Histidin-Derivate 220 6.1 Nim-Trityl-L-Histidin 13[104] 220 6.2 N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)-succinimid (Fmoc-OSu) 12 221 6.3 Nα-Fmoc-Nim-Trt-L-Histidin 14 221 6.4 Nα-Fmoc-L-Histidin 15 222
7 Hexadekanal 23[108] 223
8 N, N-Succinyl-dioktadecylamin (DODA-Suc) 43[111] 224
9 Herstellung der L-Histidin beladenen 2-Chlorotrityl-Festphasen 11, 16 und 19 225 9.1 2-Chlorotrityl-chlorid-Festphase 9. 225 9.2 Herstellung der L-Histidin-Festphase 11 225 9.3 Herstellung der Nα-Fmoc-L-Histidin-Festphase 16 226 9.4 Herstellung der L-Histidinmethylester-Festphase 19 227 9.5 Fmoc-Abspaltung der 2-Chlortrityl-Fmoc-Histamin-Festphase 20 zu 21 227
10 Allgemeine Vorschriften (AV) zur Durchführung der Festphasensynthesen von Catalipiden 228 10.1 Allgemeine Vorschrift (AV 1) zur Festphasensynthese symmetrischer Catalipide durch
reduktive Aminierung[107] 228 10.2 Allgemeine Vorschrift (AV 2) zur Festphasensynthese von Catalipiden durch
Peptid-Kopplungsreaktionen 229 10.3 Allgemeine Vorschrift (AV 3) zur Acylierung der Hydroxylfunktion des immobilisierten L-
Serin-Derivats (Verzweigungspunkt) 230
11 Festphasensynthesen von Catalipiden durch reduktive Aminierung (AV 1) 231
6
11.1 Synthese von N, N-Dihexadecyl-L-histidinmethylester 24 231 11.2 Synthese von 2-Dihexadecylamino-3-(1H-imidazol-4-yl)-propansäure 27 231 11.3 Synthese von [2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-dioktyl-amin 28 „Modell-Catalipid“ 232 11.4 Synthese von [2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-dihexadecyl-amin 29 232
12 Festphasensynthesen von Catalipiden durch Peptid-Kopplungsreaktionen (AV 2) 233 12.1 Synthese von (Z)-9-Oktadecensäure-2-(1H-imidazol-4-yl)-1-[((Z)-9-oktadecen)carbamyl]
-ethyl-amid 37 233 12.2 Synthese des N-[2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-N´,N´´-dioktadecyl-succinamid 40 234 12.3 Synthese von Dodecansäure-[1-dodecylcarbamyl-2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid 38 234 12.4 Synthese von Z-9-Oktadecen-[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MOH 39 235
13 Herstellung der Histidin-Festphasen 47 und 48 mit Nα-Fmoc-L-Serin 46 als Verzweigungspunkt 236 13.1 Synthese der Festphase 47 236
13.1.1 Synthese von Tetradecansäure 2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-1-methoxycarbonyl-ethylamino] -2-tetradekanoylamino-ethyl-ester 53 236
13.2 Synthese der Festphase 48 237 13.2.1 Synthese von Z-9-Oktadecen-2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethylcarbamyl]-2-((Z)-9-oktadecen-
oylamino)-ethyl ester 54 (DOSH) 238 13.2.2 Synthese von Hexadecansäure 2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethylcarbamoyl]-2-
tetradecanoylamino-ethyl-ester 55 239
14 Herstellung eines Phosphoglycerid-Catalipids 240 14.1 Synthese von L-Histidinol 8[112] 240 14.2 Synthese von N-Acetyl-O-(tert-butyldimethylsilyl)-L-histidinol 59 240 14.3 Herstellung der N-Acetyl-O-(tert-butyldimethylsilyl)-L-histidinol-Festphase 58 241 14.4 Festphasensynthese von R,S-1, 2-Di-oleyl-glycerol-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinol 64 242
15 Flüssigphasensynthese kurzketttiger Catalipide MC6, 8, 10 H 84, 85, 86 und MC6, 8, 10 N-Im 91, 92, 93 244
15.1 Allgemeine Vorschrift (AV 4) zur Flüssigphasensynthese kurzketttiger Catalipide 244 15.1.1 Hexansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC6H 84 244 15.1.2 Oktansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC8H 85 245 15.1.3 Decansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC10H 86 246 15.1.4 Hexansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC6N-Im 91 247 15.1.5 Oktansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC8N-Im 92 248 15.1.6 Decansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC10N-Im 93 249 15.1.7 Z-9-Oktadecensäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MON-Im 71 250
16 Synthese der ω-Hydroxycarbonsäureester 104, 105 und 121 251 16.1 Synthesen der Carbonsäuremonoethylester 104 und 105 251
16.1.1 Oktansäuremonoethylester 104[55, 215, 221] 251 16.1.2 Decansäuremonoethylester 105[44, 181, 190] 252
16.2 Synthese der Chlorocarbonylcarbonsäureethylester 102 und 103 253 16.2.1 7-Chlorocarbonylheptansäureethylester 102[216] 253 16.2.2 9-Chlorocarbonyl-nonansäure-ethylester 103[182] 253
16.3 Synthese der ω-Hydroxycarbonsäureethylester 104, 105 254 16.3.1 Synthese des ω-Hydroxyoktansäureethylesters 104 254 16.3.2 Synthese des ω-Hydroxydecansäureethylester 105 255 16.3.3 Methyl-16-hydroxy-hexadecanoat 121[191] 255
17 Synthese des ω-Fluorhexansäureethylesters 108 256 17.1 6-para-Toloylsulfonyloxyhexansäureethylester 107 256 17.2 ω-Fluorohexansäureethylester 108 257
18 Synthese der ω-Fluorocarbonsäureethylester 108, 110 und 111 mit DAST 109 258 18.1 Allgemeine Vorschrift (AV 5): Synthese der ω-Fluorocarbonsäureethylester durch
Fluorierung mit DAST 109[183] 258 18.1.1 ω-Fluorohexansäureethylester 108 258 18.1.2 ω-Fluorooktansäureethylester 110 259 18.1.3 ω-Fluorodecansäureethylester 111 260
7
8
18.1.4 ω-Fluoromethylpalmitat 122[192] 260
19 Synthese der ω-Fluorocarbonsäuren 112, 113, 114 und 122 262 19.1 Allgemeine Vorschrift (AV 6): Verseifung der ω-Fluorocarbonsäureester zu den
korrespondierenden ω-Fluorocarbonsäuren 262 19.1.1 ω-Fluorohexansäure 112 262 19.1.2 ω-Fluorooktansäure 113 263 19.1.3 ω-Fluorodecansäure 114 264 19.1.4 ω-Fluoropalmitinsäure 123 264
20 Synthese ω-fluorierter Catalipide MC6, 8, 10, 16H-F 115, 116, 117, 124 265 20.1.1 ω-Fluorohexansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC6H-F 115 265 20.1.2 ω-Fluorooktansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC8H-F 116 266 20.1.3 ω-Fluorodecansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC10H-F 117 267 20.1.4 ω-Fluoropalmitinsäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC16H-F 124 268
21 Synthese ω-fluorierter Catalipide MC8, 10, 16N-Im-F 118, 119, 125 269 21.1 ω-Fluorooktansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC8N-Im-F 118 269 21.2 Decansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC10N-Im-F 119 270 21.3 ω-Fluoropalmitinsäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC16N-Im-F 125 271
22 Synthese von DNA-Catalipid Konjugaten 272 22.1 Allgemeine Vorschrift (AV 7) zur Aufreinigung und Analyse der DNA-Catalipid Konjugate
mittels RP-HPLC 272 22.2 Allgemeine Vorschrift (AV 8) zur Entsalzung der RP-HPLC gereinigten DNA-Catalipid Konjugate 272 22.3 Modell-Konjugat 78 273 22.4 Synthese der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 74, 88, 89 und 90 274
23 Ligationsexperimente 276
24 Catalipid-Vesikelherstellung 278 24.1 Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode 278
24.1.1 Herstellung der Stammlösungen: 278 24.1.2 Herstellung der Catalipid-Filme (Dehydrierung): 278 24.1.3 Rehydrierung des Catalipid-Films 279
24.2 Elektroformation an Pt-Elektroden 279 24.3 Elektroformation in einer ITO-Elektroformationskammer 280 24.4 Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in MOH 39 / 10 mol % Cholesterin
Vesikel und DOSH 54/ 15 mol % Cholesterin Vesikel 281 24.4.1 Modifizierte Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode: 281 24.4.2 Gefriertrocknungs-Methode:[152] 282
24.5 Einfluss von Übergangsmetall-Ionen auf die MOH 39 / 10 % Cholesterin 67 Catalipid Vesikelbildung 283
24.6 Probenvorbereitung der Catalipid-Dispersionen zur mikroskopischen Analyse 283 24.6.1 Probenvorbereitung: Objektträger mit Abdeckglas 283 24.6.2 Probenvorbereitung: Frame-Seal™ Kammern 284
25 31P-NMR Kinetiken zur Untersuchung des Catalipid-Mizellen Modells 284
ANHANG 286
26 Abkürzungen und Akronyme 286 Literaturverzeichnis 287
Allgemeiner Teil
1 Einleitung
1.1 Die lebende Zelle, ein komplexes Reaktionssystem
Zellen sind die zentralen Grundeinheiten aller bisher bekannten Lebensformen und bestehen
aus sehr komplexen, hoch organisierten Reaktionssystemen. Dies gilt sowohl für einfache
Einzeller als auch für multizelluläre Organismen, bei denen mehrere Zellen zu einer
funktionellen Einheit verbunden sind. Jede Zelle stellt ein räumlich abgrenzbares,
eigenständiges System dar, das in der Lage ist, Nährstoffe aufzunehmen und über einen
Metabolismus in Energie umzuwandeln. Die hierzu notwendigen Informationen sind in jeder
Zelle enthalten und in Form von doppelsträngiger DNA gespeichert. Im Laufe der Evolution
haben sich zwei verschiedene Klassen von Lebewesen entwickelt, die sich über den Aufbau
ihrer Zellen stark unterscheiden: zum einen Prokaryoten zu denen Bakterien und Archaeen
gehören, also meist einzellige Organismen, die keinen Zellkern besitzen; zum anderen
Eukaryoten, die über einen Zellkern verfügen, in dem - unter anderem – die im Chromosom
organisierte DNA vorliegt und die wesentlich komplizierter strukturiert sind. Prokaryoten und
Eukaryoten können sowohl als Einzeller als auch als Mehrzeller auftreten.
Zur Verdeutlichung der Komplexität einer Zelle ist in Abbildung 1 schematisch der
Metabolismus des Bakteriums Buchnera gezeigt. Dieses Bakterium lebt symbiotisch in Zellen
von Blattläusen (Aphis), so dass es bereits komplexere Nährstoffmoleküle verstoffwechseln
kann und daher nur einen relativ primitiven Metabolismus besitzt. Dieser stellt jedoch bereits
ein kompliziertes Reaktionsnetzwerk dar.[1]
9
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Metabolismuses von Buchnera. Dieses Bakterium lebt symbiotisch in Zellen von Blattläusen (Aphis).[1]
Nachfolgend werden einige Fähigkeiten von Zellen aufgezählt, die zudem als grundlegende
Merkmale des Lebens gelten:[2]
(i) Alle Zellen besitzen eine Plasmamembran, die das Innere der Zelle von dem
äußeren Medium räumlich abgrenzt. Die Zellmembran steuert sowohl die
Zuführung von Molekülen von außen nach innen (z.B. von Nährstoffen), als auch
von innen nach außen (z.B. von Abfallprodukten).
(ii) Zellen speichern ihre Erbinformation in Form von doppelsträngiger DNA.
(iii) Alle Zellen zeigen ähnliche molekulare Mechanismen der Transkription und
Translation der genetischen Information.
(iv) Alle Zellen nutzen Enzyme, um chemische Reaktionen im Zellinneren zu
katalysieren. Die Summe all dieser Reaktionen stellt den Metabolismus der Zelle
dar, der durch ein sehr komplexes Netzwerk von Einzelreaktionen realisiert wird
(siehe Abbildung 1).
10
(v) Zellen können als „biochemische Reaktoren“ angesehen werden, die
aufgenommene Nährstoffmoleküle über ihren Metabolismus in spezifische
Moleküle umwandeln, so dass Zellwachstum, die Vervielfältigung der
Erbinformation und schließlich die Zellteilung ermöglicht wird.
(vi) Zellen können als „selbstregulierende“ Systeme aufgefasst werden, die auf
unterschiedliche äußere Einflüsse reagieren können.
(vii) Die Form einzelner Zellen kann – im Zuge ihrer spezifischen Funktion – sehr
unterschiedlich sein, wobei die Größe zwischen 1-5 μm im Fall von Prokaryoten
und 10-30 μm im Fall von eukaryotischen Zellen liegen kann.
(viii) Die chemischen Prozesse und die daran beteiligten Moleküle (z.B. DNA, RNA,
Proteine, ATP, ADP usw.) sind in unterschiedlichen Zellen vergleichbar.
Das Forschungsgebiet der präbiotischen Chemie beschäftigt sich unter anderem mit der
direkten Fragestellung nach der Entstehung der ersten Zelle, der sog. Protozelle. Diese gelten
als hypothetische Vorläuferstrukturen oder Vorläuferkomponenten, von denen angenommen
wird, beim Entstehungsprozess erster Zellen (Ur-Zellen) - vor rund 4 Milliarden Jahren auf
der Erde – mitgewirkt haben zu können.
Die strukturellen und operativen Eigenschaften dieser Protozellen können nicht mit denen
heute lebender Zellen verglichen werden, die im Laufe der Zeit zu höchst spezialisierten
Reaktionsnetzwerken evolvierten. Sie könnten sogar völlig andere Eigenschaften aufweisen,
als die jetzt auf der Erde existierenden Zellen. Auf der Zeitskala ist die Entstehung einer
Protozelle vor dem Erscheinen der ersten Zelle anzusiedeln.[3] Zur Entstehung einer
Protozelle, wenn sie jemals existiert haben sollte, müsste daher theoretisch kein „Leben“
notwendig gewesen sein. Die künstliche Herstellung einer Protozelle muss daher unter
plausiblen präbiotischen Bedingungen zu realisieren sein.[4, 5] Man geht daher davon aus, dass
der Übergang von protozellulären Strukturen zu den ersten lebenden Zellen (Ur-Zellen) als
der entscheidende Schritt von „nicht-lebender“ zu „lebender“ Materie angesehen werden
kann.[3, 6, 7]
Unter anderem wird der Begriff Protozelle auch für ein „experimentell synthetisiertes
zellähnliches Konstrukt“ verwendet, dass „einige, aber nicht zwingend notwendig alle
Eigenschaften einer lebenden Zelle“ besitzt.[8] Diese Definition einer Protozelle beinhaltet,
dass mögliche präbiotische Vorläuferkomponenten zu einer ersten Zelle geführt haben
könnten, andererseits aber auch plausible Reaktionsnetzwerke oder Systeme aus Molekülen
11
und chemischen Vorgängen, die höchstwahrscheinlich noch nicht in präbiotischer Zeit
existiert haben könnten.
Informationen über die Struktur, Funktion, wie auch über das dynamische Verhalten lebender
Zellen auf molekularer Ebene gelten allgemein anerkannt als Grundvoraussetzungen zum
Verständnis der zellularen Hauptmerkmale, die „lebende“ von „nicht-lebender“ Materie
differenzieren.[2] Ohne diese Information ist die Aufstellung eines Modells zur Beschreibung
oder gar die künstliche Synthese einer voll funktionsfähigen, lebenden Zelle, schwer oder gar
nicht zu realisieren.
Zur Entwicklung potentieller Reaktionsmodelle für Protozellen, die eine lebende Zelle
nachstellen sollen, ist jedoch zuerst die Aufstellung konzeptioneller Rahmenbedingungen
notwendig, die eine Differenzierung von „lebender“ und „nicht-lebender“ Materie
ermöglichen.
1.2 Konzeptionelle Rahmenbedingungen zur Definition „lebend“
Ein Ansatz „Leben“ vereinfachend zu beschreiben und somit theoretisch oder auch
experimentell zu Protozellmodellen zu gelangen, besteht darin, eine lebende Zelle durch drei
grundlegende Komponenten und deren spezifische Eigenschaften zu charakterisieren:
Gene:
Alle Prozesse innerhalb einer Zelle stehen unter der Kontrolle der vererblichen Information,
die bei der Reproduktion selbst modifiziert werden kann. Diese besondere Eigenschaft
ermöglicht Selektion und folglich Evolution.
Metabolismus:
Der Metabolismus setzt externe Ressourcen in nutzbare Energie für das chemische
Gesamtsystem der Zelle um. Diese Energie ermöglicht die Selbsterhaltung, das Wachstum
und schlussendlich die Reproduktion der Zelle.
Kompartiment:
Es lokalisiert alle Einzelkomponenten des chemischen Systems der Zelle zu einem
Gesamtsystem. Durch die Lokalisierung kommt es zu einer Diffussionslimitierung der
Reaktionskomponenten, so dass chemische Reaktionen spezifisch innerhalb der Zelle erfolgen
können. Des weiteren kommt es zu einer signifikanten Konzentrationserhöhung der
eingeschlossenen Reaktionsbausteine: Die Konzentration eines einzelnen Moleküls in einem
100 nm großen Kompartiment liegt bereits schon im mikromolaren Konzentrationsbereich.
Der Konzentrationseffekt könnte so die Entstehung von ersten Makromolekülen unterstützt
12
haben.[9] Zudem werden Kompartimente mit geschützten Mikroumgebungen verglichen, die
so erste Reaktionen ermöglichten und darin gebildete Moleküle vor äußeren Einflüssen, wie
z.B. schädlichen chemischen oder mechanischen Einwirkungen, geschützt haben könnten.
Erst das kooperative Zusammenspiel aller Einzelkomponenten (Gene, Metabolismus und
Kompartimentierung) sollte zu einem potentiellen Protozellmodell und somit zu einem
Modell einer „lebenden“ Zelle führen.
Die Bedeutung kooperativ verbundener chemischer Strukturen, als Arbeitshypothese zur
Beschreibung minimalen Lebens, wurde anfänglich 1971 in Eigen´s Hypercyle Theorie
beschrieben, indem die Kooperation informationstragender Strukturen (Gene) im Mittelpunkt
stand.[10]
Maturana und Varela formulierten 1974 die Autopoiesis (alt griech. „selbst“ und „schaffen,
bauen“). Das Konzept der Autopoiesis beschreibt ein „lebendes“ System als den Prozess, d.h.
konkret die Form der Organisation, die diesen verwirklicht, anstatt ihn über die Aufzählung
einzelner Eigenschaften zu definieren.[11]
Das Gesamtsystem wird aus einem Netzwerk von Interaktionen zwischen verschieden
Komponenten gebildet, eine sich selbst erzeugende und erhaltene lebendige Einheit.
Autopoietische Systeme sind rekursiv organisiert: Das Produkt des funktionalen
Zusammenwirkens ihrer Bestandteile ist genau jene Organisation, die die Bestandteile
produziert. Durch diese rekursive Form der Organisation lassen sich „lebende“ von „nicht-
lebenden“ Systemen unterscheiden, nämlich dadurch, „dass das Produkt ihrer Organisation sie
selbst sind, das heißt, es gibt keine Trennung zwischen Erzeuger und Erzeugnis. Das Sein und
das Tun einer autopoietischen Einheit sind untrennbar, und dies bildet ihre spezifische Art
von Organisation“.[11]
Ganti erstellte 1971 minimal-kooperative Strukturen, über die Modelle zu Protozellen
beschrieben werden können, worin drei stöchiometrisch gekoppelte Subsysteme
(metabolisches-, genetisches- und membranformendes Subsystem) das Chemoton
charakterisieren. Die experimentelle Bearbeitung des theoretischen Konzepts des Chemotons
stellt ein zentrales Thema dieser Arbeit dar und wird separat im folgenden Kapitel 1.2.1 näher
beschrieben.
13
1.2.1 Ganti´s Chemoton
Das von Ganti vorgestellte Chemoton ist ein abstraktes Modell einer idealisierten minimalen
Zelle. Das Chemoton beschreibt die Grundanforderungen an die Organisation künstlicher
Systeme, die in ihrer Struktur und ihrem Zusammenwirken spezifische Kriterien lebender
Organismen nachahmen sollen. Das Modell wird so als Ausgangspunkt für die Erforschung
von charakteristischen Prozessen genutzt, die zur Bildung erster primitiver lebender
prokaryotischer Zellen führen könnten.
Der Ursprung des Chemotons als fluid chemical automaton basiert auf der bereits 1966
veröffentlichten Idee von Ganti, ein lebendes System als Kombination zweier grundlegend
verschiedener Prozesse zu beschreiben: Dem Hauptzyklus, der das System durch eine Serie
von ontogenetischen Veränderungen führt und dem equilibrierenden System, das neben den
auf das Gesamtsystem einwirkenden Veränderungen (auch von außerhalb) zur notwendigen
Organisation beiträgt.[12] Nachfolgend verfeinerte Ganti dieses Konzept (hinsichtlich einer
allgemeingültigeren Betrachtung „lebender“ Systeme), das 1971 unter dem Titel als Buch in
ungarischer Sprache The Principle of Life veröffentlicht wurde.[13] Die Veröffentlichung des
Chemotons beinhaltet zwei Hauptteile: Der erste Teil bezieht sich auf die phänomenologische
Charakterisierung „lebender“ Systeme und der zweite auf die Abstraktion dieser Systeme als
einfachstes Modell für „minimales Leben“. Der Begriff Chemoton, kurz für chemical
automaton, bezieht sich auf dieses minimale chemische Modell. 1975 erweiterte Ganti dieses
Konzept zum endgültigen Chemoton, das die Fähigkeit der Selbsterhaltung (self-
maintenance), Selbstreproduktion (self-reproduction) und Evolution beinhaltet und über drei
autokatalytische, stöchiometrisch gekoppelte Subsysteme charakterisiert ist: Ein
metabolisches Subsystem (1), ein genetisches Subsystem (2) und ein membranformendes
Subsystem (3).[14]
Eine umfassendere Beschreibung des Chemotons ist in “A simulation study of the chemoton”
(Csendes, 1984)[15], “The Principles of Life” (Ganti, 2003)[16] und in “Chemoton Theory
Vol I[17] und Vol II[18]” (Ganti, 2004) zu finden.
14
In Abbildung 2 sind die detaillierten Reaktionen des Chemotons gezeigt, die im folgenden für
jedes Subsystem (1 bis 3 ) kurz näher beschrieben werden.
Abbildung 2. Die schematische Darstellung des Chemotons wurde aus “Chemoton Theory Vol I“[17] entnommen. Das Chemoton besteht aus drei stöchiometrisch gekoppelten autokatalytischen, chemischen Subsystemen: einem reversiblen metabolischen Subsystem (1), einen irreversibel verlaufenden, templatgesteuerten Polykondensationszyklus, einem genetischen Subsystem (2) und dem ebenfalls irreversibel verlaufenden, membranformenden Subsystem (3).
Das metabolische Subsystem (1): Nachdem energiereiche Ausgangsmoleküle XA, die als
Nährstoffe angesehen werden können, die Membran Tm durchquert haben, reagieren diese
mit den Metaboliten A1 zu A2. A2 bildet sowohl Y, ein Abfallprodukt, das aus dem
Chemoton hinausdiffundiert als auch A3. A3 produziert V´, ein zur Membran impermeabeles,
monomeres (Vorläufer-) Templat und A4. A4 bildet T´, ein ebenfalls impermeabeles,
monomeres Vorläufer-Membranmolekül und A5. A5 bildet zwei Kopien von A1, so dass der
autokatalytische Zyklus des metabolischen Subsystems geschlossen wird. A1 wirkt somit als
Katalysator für seine eigene Synthese. Aufgrund dieses zyklischen Ablaufs wird
sichergestellt, das Verluste, die durch mögliche Nebenreaktionen auftreten können,
kompensiert werden, und genügend Moleküle A1 wieder für den Beginn des Zyklus zur
Verfügung stehen. Zudem wird eine Materialbasis für das Wachstum und die Reproduktion
für das Chemoton geschaffen. Die Membran Tm des Kompartiments ist impermeabel
15
gegenüber den gebildeten Molekülen A1 bis A5. Das metabolische Subsystem besteht aus
reversiblen Einzelreaktionen, wobei jedoch die Geschwindigkeitskonstanten der
Rückreaktionen kleiner als die der Hinreaktionen sind. Dies gilt, solange die Freie Energie des
energiereichen Ausgangsmoleküls XA größer als die der gebildeten Produkte Y, V´ und T´ im
metabolischen Subsystem ist. Obwohl die Nährstoffmoleküle XA stetig konsumiert werden,
bleibt ihre Konzentration durch die konzentrationsgesteuerte Diffusion vom äußeren Medium
ins Innere des Chemotons konstant. Das gleiche gilt für die Abfallprodukte Y.
Das genetische Subsystem (2): Der Zyklus stellt eine semikonservative, autokatalytische
Replikation eines doppelsträngigen, homopolymeren Templatmoleküls pVn dar, das aus einer
Polykondensation von monomeren, einzelsträngigen Molekülen V´ gebildet wird. Dabei
entsteht ein weiteres Molekül R, das zur Herstellung membranbildender Lipide T notwendig
ist. Die nicht-enzymatische, templatgesteuerte Replikation läuft in zwei aufeinander
folgenden Schritten: Im ersten Schritt werden reversibel monomere Moleküle V´ an das
Templat pVn gebunden, die dann in einem zweiten Schritt irreversibel zu einem neuen
Templatmolekül reagieren. So werden aus monomeren, einzelsträngigen Molekülen V´
doppelsträngige Oligonukleotide pVnVn gebildet, mit einer Sequenzlänge von n / 2. Die
Reaktion läuft nur dann ab, wenn die Konzentrationen von V´ größer als die Konzentration
der kritischen Polykondensationskonzentration [V`]* ist. Die Konzentration von V´ nimmt
somit stetig zu bis [V`]* erreicht wird und die Polykondensation stattfindet, verbunden mit
der Freigabe eines hydrophilen Moleküls R. R kann dann – stöchiometrisch - mit T*
membranbildende Lipide T ausbilden.
Das membranbildende Subsystem (3): Das Molekül T´ reagiert irreversibel zu T*, das dann
an R bindet und so die Bildung des membranbildenden Lipids T ermöglicht. Die Lipid-
moleküle T aggregieren dann spontan zur Membran Tm des Chemotons. Wenn die Membran
wächst und das Volumen des Kompartiments nicht schnell genug zunimmt, um die sphärische
Struktur beizubehalten, kommt es zur Teilung.
Das Chemoton reguliert sich durch die stöchiometrische Kopplung der drei Subsysteme (1)
bis (3) selbst. Wenn die Konzentration von V´ < [V´]* ist - dies gilt, solange kein T* und R
gebildet wird - kann das Volumen des Kompartiments nicht wachsen, da keine neuen
Membranmoleküle T gebildet werden. So steuern die metabolischen Einzelreaktionen über
die Konzentration von V´ das Chemoton, wodurch die gesamten Prozesse reguliert werden
(siehe Abbildung 3, A bis F). Geht man von einer sphärischen Gestalt des Chemotons aus (A),
führen steigende Intermediat-Konzentrationen im Vergleich zum umgebenden Medium zu
einem erhöhten osmotischen Druck innerhalb des Chemotons. Oberhalb der kritischen Poly-
16
kondensationskonzentration [V´]* kann sich das Volumen des Chemotons vergrößern, da das
Intermediat R gebildet wird und hiermit neu gebildetes T in die Membran eintritt (B). Mit –
verbrauchsbedingt - sinkender Konzentration der osmotisch aktiven Intermediate im
Chemoton kann dessen sphärische Struktur nicht mehr erhalten bleiben (C bis E).
F E D
C B A
Abbildung 3. Idealisierte Darstellung einer möglichen Teilung des Chemotons.[19] Aufgrund des osmotischen Drucks strömt Wasser aus dem Kompartiment, das sich daraufhin
ellipsenförmig - über eine Einstülpung in der Mitte – verformt (C, D). Daraufhin schnürt sich
die Membran hantelförmig ein (E), so dass letztendlich eine Teilung des Chemotons in zwei
gleich große Kompartimente erfolgt (A, F). Diese qualitativen Überlegungen konnten durch
Rechnungen bestätigt werden.[20, 21]
Die Anzahl der Moleküle und die Länge von pVn haben durch die stöchiometrische
Kopplung sowohl einen direkten Einfluss auf die Größe des Chemotons als auch auf die
Dynamik des metabolischen Subsystems - und somit wiederum auch auf die Generations-
dauer. Obwohl das Templat pVn keine direkte Information über die Funktion der Subsysteme
(1) und (3) enthält, wie etwa das Genom heute lebender Zellen, kann es dennoch als einfaches
genetisches System betrachtet werden, in dem die Information nicht in der Sequenz, sondern
alleinig in der Länge des Polymers pVn gespeichert ist. Fehler während des
Replikationsvorgangs können zu verkürzten oder verlängerten Templaten pVn führen, die
dann zwangsläufig an die Tochterzellen weitergegeben werden. Diese fehlerhafte
Sequenzveränderung des Templats im Replikationsvorgang kann somit mit einer Mutation im
Vererbungsmechanismus lebender Zellen verglichen werden.
Das Chemoton ist in Bezug auf reale, lebende Zellen ein stark idealisiertes und vereinfachtes
Modell. Dies wird bereits bei dem Vergleich des metabolischen Subsystems (1) mit einem
einfachen metabolischen Reaktionsnetzwerk eines primitiven lebenden Einzellers deutlich
(siehe Abbildung 1). Die Komplexität des metabolischen Subsystems reicht wahrscheinlich
17
nicht aus, strukturvielfältige und hochspezialisierte Reaktionskomponenten bereitzustellen,
wie sie in einer lebendigen Zelle vorkommen und zum Überleben notwendig sind. Dies beruht
im Besonderen auch darauf, dass im Konzept des Chemotons keine enzymatischen
Reaktionen eingeschlossen sind, die hingegen in lebenden Zelle eine unabdingbare Stellung
einnehmen.
Das Chemoton beschreibt über ein abstraktes Netzwerk die wichtigsten Teilaspekte eines
„lebenden“ Systems, ohne auf speziell festgelegte, chemische Reaktionen angewiesen zu sein.
Es ermöglicht damit eine Vielzahl von idealisierten, chemischen und theoretischen Ansätzen
zur Untersuchung und Herstellung von Protozellen.
Eine vollständige chemische Implementierung des Chemotons ist bis heute nicht erreicht. Die
existierenden Modellsysteme zu synthetischen Zellen (siehe Kapitel 1.3.2) beinhalten jeweils
nur Teilbereiche. Aufgrund der Komplexität der einzelnen Subsysteme gelangt die
Umsetzung schnell an chemische, physikalische, technische und analytische Grenzen. Zudem
sind bis heute nur wenige chemische Subsysteme im Sinne des Chemotons bekannt und
erforscht. Die meisten beschriebenen, experimentellen Ansätze zu Protozellmodellen
konzentrieren sich auf die chemische Implementierung eines membranformenden
Subsystems, gekoppelt an ein genetisches Subsystem.[20] Gründe hierfür liegen in der äußerst
schwierigen chemischen Implementierung eines künstlichen Metabolismus, der ohne
enzymatische Reaktionen verläuft und trotzdem den Kriterien des Chemotons gerecht wird.
Beispielhaft wäre die Formose-Reaktion, in der über einen autokatalytischen Reaktions-
mechanismus aus Formaldehyd (unter speziellen Reaktionsbedingungen) unterschiedliche
Kohlenhydrate entstehen, zu erwähnen.[21]
18
1.3 Experimentelle Ansätze zur Herstellung synthetischer Zellen
Jedes experimentelle Konzept, synthetisch eine lebende Zelle herzustellen, fusst in erster
Linie auf der Struktur und Komplexität der verwendeten Einzelkomponenten, aus denen diese
aufgebaut werden soll. Es wird daher grundsätzlich zwischen zwei unterschiedlichen
Herstellungsstrategien unterschieden: Das top-down Verfahren basiert in erster Linie auf „in-
vivo synthetisch biologischen Projekten“.[22] In einem ersten Schritt wird hierbei künstlich das
Genom lebender – möglichst einfacher - prokaryotischer Lebewesen auf die essentiellen Gene
reduziert, so dass man zu einer minimalen Zelle gelangt, die gerade noch genügend Gene
aufweist, die zur Selbsterhaltung und zur Reproduktion notwendig sind. Über rein
molekularbiologische Verfahren wird dann versucht, diese minimale Zelle durch
Zusammenfügen der bereits zellähnlichen Reaktionskomponenten herzustellen.
Im bottom-up Verfahren wird hingegen von einer Kollektion dieser Ausgangsverbindungen
Gebrauch gemacht. Werden zur Synthese Komponenten und Makromoleküle biologischen
Ursprungs wie DNA, RNA, Enzyme oder andere Proteine verwendet, spricht man von „in-
vitro synthetischen Projekten“.[22] Liegen rein synthetische Bausteine vor, spricht man von
systemchemischen Ansätzen.[23]
1.3.1 Das top-down Verfahren zur Herstellung synthetischer Zellen
Das zur Zeit aktuellste Beispiel zum top-down Verfahren zur Generierung einer künstlichen,
minimalen Zelle ist das von Gibbson et al. (Synthetic Biology and Bioenergy Group San
Diego und Rockville, The J. Craig Venter Institute) beschriebene Verfahren zur Herstellung
einer Bakterienzelle, die über ein vollständig chemisch synthetisiertes Genom kontrolliert
wird.[24] Hierfür setzte das Team um J. Craig Venter eigens entwickelte und abgestimmte
molekularbiologische Arbeitsmethoden ein, die in den letzten 15 Jahren erarbeitet wurden und
zusammengenommen zu der erfolgreichen Herstellung einer solchen minimalen synthetischen
Zelle führten.
Die Grundlage zur Herstellung der beschriebenen synthetischen Zelle bildete die
Sequenzierung der Erbsubstanz des Bakteriums Mycoplasma genitalium, mit dem kleinsten
Genom aller bekannter lebender Organismen, das unter geeigneten Laborbedingungen
überleben und sich vervielfältigen kann.[27-30] Nachfolgend entwickelte man spezielle
molekularbiologische Methoden, um die natürliche DNA des Bakteriums Mycoplasma
mycoides in ein artverwandtes Bakterium Mycoplasma capricolum zu transplantieren. Smith
19
et al. gelang es, das Genom des Mycoplasma genitalium, das aus 582970 Nukleobasen
besteht, künstlich herzustellen.[30] Da eine sequentielle Synthese künstlicher DNA in dieser
Kettenlänge nicht möglich ist, wurden zuerst 101 individuell angefertigte DNA Teilfragmente
(5.000 und 7.000 Nukleobasen, sog. cassetten) hergestellt. Diese waren mit spezifischen
Überhangsequenzen versehen, um eine post-enzymatische Ligation zum vollständigen Genom
zu ermöglichen. Um das synthetische Genom vom Wild-Typ des Mycoplasma genitalium
Bakteriums unterscheiden zu können, führte man zusätzlich sog. Wasserzeichen-Sequenzen in
bestimmte Genabschnitte ein, die keine relevanten Informationen des Bakteriums kodierten.
Erste Versuche zur enzymatischen Ligation der einzelnen cassetten erfolgten zunächst in
Escheria Coli. Hier zeigte sich jedoch eine unvollständige Ligation, es konnten aus
unbekannten Gründen nur Sequenzlängen isoliert werden, die ungefähr einem Viertel der
Gesamtlänge des Ziel-Genoms entsprachen. Daher transplantierte man das nicht vollständig
zusammengesetzte Genom in Hefezellen des Typs Saccharomyces cerevisiae. Nachdem Smith
et al. das synthetische Genom – nach beendeter Ligation - aus diesen extrahiert hatten,
konnten sie das vollständig künstlich synthetisierte Ziel-Genom des Bakterium Mycoplasma
genitalium identifizieren. So ist aus einer Kombination in-vitro enzymatischer Methoden und
der abschließenden in-vivo Rekombination in Saccharomyces cerevisiae das Ziel-Genom
hergestellt worden.
Aufgrund der extrem langsamen Wachstumsrate der Mycoplasma genitalium Bakterien setzte
man für weiterführende Experimente schneller wachsende Mycoplasma Bakterienarten ein:
Das M. mycoides subspecies capri (GM-12) als Donor-Zelle und das M. capricolum
subspecies capricolum (CK) als Empfänger-Zelle.
Im Rahmen der Entwicklung geeigneter molekularbiologischer Methoden zur Transplantation
des synthetischen Genoms aus den Hefezellen in andere Bakterienzellen gelang es, die
ursprünglichen Bakterienchromosomen als centromerische Plasmide in Hefezellen zu
klonieren, die zudem das native GM-12 Genom beinhalteten.[31, 32] Erste Versuche, das so
hergestellte künstliche GM-12 Genom in die CK Empfänger-Zellen zu transplantieren,
schlugen fehl. In den Donor- und den Empfänger Mykoplasmen lag ein (bekanntes)
Restriktionssystem vor, das die künstliche DNA erkannte und eliminierte. Es zeigte sich, dass
das Donor-Genom in seiner ursprünglichen Form - vor dem Transplantationsvorgang in die
M. mycoide (GM-12) - methyliert vorlag und somit vor diesem Restriktionssystem geschützt
war.[25] Das in den Hefezellen hergestellte künstliche Genom liegt jedoch unmethyliert vor, so
dass das Genom nach dem Transplantationsvorgang von dem Restriktionssystem der
Empfängerzelle (CK) erkannt und abgestoßen wurde. Um die Abwehrreaktion zu verhindern
20
setzte man die Donor-DNA (GM-12) mit gereinigten Methylasen oder auch mit
unbehandelten Extrakten der GM-12 oder CK Bakterien um. Des Weiteren war es möglich
das Restriktionssystems der Empfänger-Zellen (CK) auszuschalten.[31]
Durch die erfolgreiche Kombination aller beschriebener Arbeitsschritte war die Synthese, die
Assemblierung, die Klonierung und die Transplantation eines aus 1.08 Millionen Basenpaaren
bestehenden M. mycoides Genoms (JCVI-synb1.0) möglich. Damit wurde eine synthetische
Zelle hergestellt, die alleinig über das synthetische Genom kontrolliert wird und die Fähigkeit
besitzt, zu wachsen und sich zu teilen.
1.3.2 Bottom-up Herstellung von Semi-Synthetischen Minimalen Zellen über in-vitro
synthetische Ansätze
In den meisten Modellen zu synthetischen Zellen oder auch Protozellen dienen künstlich
hergestellte Lipid-Vesikel (Liposomen), im Besonderen große, unilamellare, Vesikel (GUV)
als Kompartimente, in denen unterschiedliche Reaktionen stattfinden können. Die GUV
bieten sich hierfür an: Zum einen besteht die Membran des unilamellaren Lipid-Vesikels aus
einer Doppellage amphiphiler Moleküle und ist daher vom prinzipiellen Aufbau mit der
Membran einer natürlich vorkommenden Zelle vergleichbar. Zum anderen sind
unterschiedlichste Präparationsmethoden beschrieben, die die Herstellung von GUV im
Größenbereich natürlicher Zellen ermöglichen und auch die Einkapselung anderer
spezifischer Moleküle (wie Makromoleküle) erlauben, um chemische, zell-typische
Reaktionssysteme im Inneren der Vesikel realisieren zu können.[26-28] Zudem wurde gezeigt,
dass Lipid-Vesikel unter bestimmten Reaktionsbedingungen zu Formveränderungen der
äußeren Membran in der Lage sind, so dass es zur Teilung kommen kann.[29-31]
Semi-Synthetische Minimale Zellen bestehen aus zellähnlichen Systemen, die aus einer
minimalen Anzahl unterschiedlicher Komponenten aufgebaut sind, um spezifische und
definierte Funktionen einer „lebenden“ Zelle nachzustellen. Hierzu gehören unter anderem
Selbsterhaltung, Fortpflanzung und Evolvierbarkeit.
21
Abbildung 4 zeigt die schematische Darstellung einer Semi-Synthetischen Minimalen Zelle, so
wie sie von Luisi et al. als Arbeitshypothese definiert wurde.[23]
Abbildung 4. Schematische Darstellung einer Semi-Synthetischen Minimalen Zelle, so wie sie von Luisi et al. definiert wurde.[23]
Semi-Synthetische Minimale Zellen werden aus bereits bestehenden Genen, Enzymen,
Ribosomen, t-RNAs und niedermolekularen Komponenten, wie Aminosäuren, Nukeotidtri-
phosphaten etc. aufgebaut, indem diese in ein künstliches Kompartiment eingeschlossen
werden. Die Kompartimente selbst sind GUV, aufgebaut aus Lipiden, wobei bevorzugt
Phosphorlipide eingesetzt werden. Diese minimalen Zellen benötigen ein biochemisches
(Nähr-) Medium, das die Grundfunktionen der Zelle, die im Inneren oder auch in der
Membran der Vesikel eingebettet sein können, versorgen. Semi-Synthetische MinimaleZellen
dieser Struktur können so als einfache, heterotrophe1, lebende Systeme angesehen werden,
1
Im Zuge der Diskussion um mögliche Modelle, die zu Protozellen geführt haben könnten, werden zwei
konzeptionell unterschiedliche Ansätze beschrieben: Das autotrophe- und das heterotrophe Modell.[29, 30, 62] Im
autotrophen Modell steht die Entstehung eines autokatalytischen Reaktionsnetzwerks in einer räumlich
begrenzten Umgebung im Vordergrund, so dass in-situ Ausgangsverbindungen in einem Kompartiment gebildet
werden konnten, die zur Zell-Replikation notwendig sind. Im Gegensatz hierzu setzt das heterotrophe Modell die
Entwicklung simpler zell-ähnlicher Strukturen in einer komplexen, vielfältigen Umgebung voraus. Das System
kann externe, energiereiche (bereits komplexe) Nährstoffmoleküle nutzen, so dass daraus erste Zellen oder
zellähnliche Systeme entstanden sein könnten.
22
und gehören zu der Klasse der „in-vitro synthetischen Projekte“ zur Herstellung künstlicher
Zellen.[22]
Der nächste experimentelle Schritt zu einer minimalen künstlichen Zelle ist die Integration
eines Energie produzierenden Subsystems, das ein metabolisches Reaktionsnetzwerk darstellt,
z.B. die Proteinbiosynthese im Inneren einer solchen Semi-Synthetischen Minimalen Zelle.
Hierzu werden alle Komponenten, die zur Expression eines Proteins notwendig sind, in ein
Lipid-Vesikel eingeschlossen. Anfänglich setzte man unspezifisch Zellextrakte ein, um die
zur Proteinexpression notwendigen, chemischen Komponenten bereitzustellen. Erst 2006
wurde von Ueda et al. ein Kit aus Ribosomen und Enzymen entwickelt, das sog. „PURE“-
System.[32] Dieses Kit besteht aus 36 speziellen Proteinen, Ribosomen, t-RNAs und
niedermolekularen Molekülen bekannter Konzentration. Seitdem wird das PURE-System als
Standard-Tool für in-vitro Experimente zur Genexpression in der synthetischen Biologie
eingesetzt.[23] In Tabelle 1 ist eine Auflistung repräsentativer Arbeiten zur Proteinexpression
in Vesikeln gezeigt, die dem chronologischen Verlauf der Veröffentlichungen entspricht.
Tabelle 1. Chronologische Übersicht der Veröffentlichungen zur Protein Expression in Vesikeln.
Jahr der
Veröffentlichung Kurzbeschreibung Referenz
1999 Erste beschriebene Synthese von Polypeptiden
(Polyphenylalanin) in Vesikeln Luisi [33]
2001 Synthese von GFP in multilamellaren Vesikeln Yomo [34]
2003 Synthese von GFP in großen unilamellaren Vesikeln Yoshikawa [35]
2004 zweistufige genetische Kaskadenreaktionen zur
Synthese von T7-RNA und der GFP-Polymerase Yomo [36]
2004
Synthese von α-Hämolase und GFP in Vesikel.
Hämolysin formt Poren in Vesikelmembranen, durch
die über externes Füttern die Biosynthese von GFP im
inneren der Vesikel für 100 h ermöglicht wurde.
Libchaber [37]
2007 Einkapselung des PURE-Systems in Vesikel und
Expression von GFP. Luisi [38]
2008 ribosomale Synthese von Qβ-Replikase aus RNA-
Templatmolekülen im Inneren von Vesikeln. Yomo [39]
2009
Synthese funktionsfähiger Glycerin-3-phosphat-
und Lysophosphatidsäure- Acyltransferasen im
Inneren submikrometer großer Vesikel
Luisi [40]
23
Es konnten unterschiedliche Lipid-Vesikel mit eingeschlossenem Green Fluorescent Protein
(GFP) in funktionsfähiger Form hergestellt werden: In großen Vesikeln [35], großen multi-
lamellaren [34, 36] und in kleinen Vesikeln [41] (zur Übersicht der unterschiedlichen Vesikel
Typen siehe auch Abbildung 39). In allen Fällen verhielten sich die Vesikel wie geschlossene
Reaktoren, so dass kein Materialaustausch mit der Umgebung möglich war. Erst Arbeiten von
Noireaux et al. und Libchaber et al. (von 2004)[37] zeigten, dass durch die in Vesikel
ablaufende Proteinexpression eines Membranproteins der α-Hämolase die Membran-
permeabilität soweit erhöht werden konnte, dass es zu einer ausreichenden Aufnahme von
Aminosäuren und ATP kommen konnte, so dass ribosomal das GFP Protein im Inneren der
Vesikel exprimiert wurde (siehe Abbildung 5). Die Vesikel konnten über einen Zeitraum von
bis zu 100 Stunden „gefüttert“ werden.
Abbildung 5. Schematische Darstellung der Genexpression in einem Lipid-Vesikel. Die beiden Proteine α-Hämolase (α-HL) und GFP werden im Vesikel expremiert.[42]
Yomo et al. setzten unterschiedliche Systeme zu Semi-Synthetischen Minimalen Zellen
zusammen, so dass in künstlich hergestellten Vesikeln komplexe molekularbiologische
Reaktionen stattfinden konnten. Zu nennen wäre z.B. die zweistufige genetische
Kaskadenreaktion, in der die Synthese von T7-RNA und der GFP-Polymerase im Inneren von
Vesikeln ermöglicht wurde [36] sowie die ribosomale Synthese von Qβ-Replikase aus RNA-
Templatmolekülen im Inneren von Vesikeln.[39] Zudem berichtete die Arbeitsgruppe von der
erfolgreichen Synthese funktionsfähiger Glycerin-3-phosphat Acyltransferase und der Lyso-
phosphatidsäure Acyltransferase im Inneren submikrometer großer Vesikel.[40]
2005 berichteten Sugawara et al. von einer enzymatischen Synthese von DNA in GUV.[43]
Zur Realisierung dieses artifiziellen Zellsystems wurde ein speziell synthetisiertes
Cholesterin-PEG-DNA Konjugat über das lipophile Cholesterin auf der Innenseite eines
24
Phosphorlipid-Vesikels verankert (siehe Abbildung 6). Im Inneren dieser Vesikel lagen zum
einen ein 100mer langes einzelsträngiges DNA Templat, eine 5´-3´Polymerase (Teilfragment
der Polymerase I, sog. Klenow-Fragment) und verschiedene Nukleotidphosphate – zur
Sequenz-Elongation – vor.
bbildung 6. Schematische Darstellung einer enzymatischen Synthese von DNA in einem Vesikel. Das holesterin-PEG-DNA Konjugat 2 wurde über das lipophile Cholesterin in der inneren Membran des Vesikles
as mit der auf der Vesikelmembran verankerte Konjugat reagierte als Primer, so dass eine
1.3.3 Bottom-up Herstellung von synthetischen Zellen über chemische Ansätze
ie bisher vorgestellten Modelle zur Synthese einer Protozelle basierten auf biomolekularen
ACverankert. Das linerare, einzelsträngige Templat ist in der Abbildung schematisch als Band und das Klenow-Fragment als Kugel gezeigt.[43]
D
enzymatische Synthese von DNA innerhalb des Vesikels ermöglicht werden konnte.
D
Reaktionen, in denen Moleküle, wie z.B. DNA, RNA oder Enzyme grundlegende Eigen-
schaften einer lebende Zelle in die Systeme einbrachten. Die folgenden experimentellen
Ansätze zu Protozellmodellen basieren auf rein chemischen Systemen, in denen (individuelle)
künstliche Moleküle als Reaktionsbausteine eingesetzt werden.
2009 beschrieben Davis et al. das Design eines protozellularen Systems, das aus einfachen
chemischen Ausgangsmolekülen und Einzelkomponenten aufgebaut wurde.[44] Die zentrale
Reaktion in diesem Modell stellte die autokatalytische Formose-Reaktion dar, die bereits
1861 von Butlerow beschrieben wurde. Die Formose-Reaktion [21] besteht aus einem
25
dynamischen Reaktionsnetzwerk, in dem Formaldehyd in Gegenwart von Metallkationen bei
hohen pH-Werten über einen autokatalytischen Reaktionsmechanismus [45] in eine große
Vielfalt unterschiedlicher – linearerer wie auch verzweigter – Kohlenhydrate transformiert
wird. Breslow [45] erklärte den autokatalytischen Reaktionsmechanismus über ein Modell, in
dem Glykolaldehyd - bestehend aus zwei Formaldehyd-Einheiten - die autokatalytische
Spezies darstellt. Nach jedem Zyklus wird die Anzahl der Glykolaldehyd Moleküle (durch
Retroaldolreaktionen) verdoppelt. Reversibel werden Aldopentosen und Hexosen und weitere
Kohlenhydrate gebildet werden können. Alle Reaktionsschritte sind
Gleichgewichtsreaktionen, die auf Aldolreaktionen und Enolat- basierten Isomerisierungen
beruhen.
Um die Formose-Reaktion als einen autokatalytischen Proto-Metabolismus für ein Protozelle
bbildung 7. Schematische Darstellung des chemischen Protozell-Konzept von Davis et al. Die zur mose-Reaktion notwendigen Reaktionsbausteine wurden in Lipid-Vesikel (L) eingeschlossen, wobei aus
zu nutzen, integrierten Davis et al. die Reaktion in Lipid-Vesikel (siehe Abbildung 7).
AFor
[44]
Formaldehyd komplexe Kohlenhydrate entstanden. Ein Anstieg des pH-Werts des umgebenden Mediums zeigte indirekt die ablaufende Reaktion an. Nachdem die Kohlenhydrate die semipermeable Membran des Vesikels passiert hatten, bildeten sie mit im äußeren Medium vorhandenen Borat-Ionen Kohlenhydrat-Borat Komplexe, wobei die Furanosylboratdiester als Autoinducer auf die in Lösung befindlichen Vibrio harveyi Bakterien wirkten. Über eine sog. Autoinducer-2 Quorum Sensing Antwort [46, 47], die sich in einer blauen Biolumineszenz äußerte, konnte so die Anwesenheit von Furanosylboratdiestern, die über die Formose-Reaktion gebildet wurden und aus den Lipid-Vesikeln hinaus diffundierten, nachgewiesen werden.
26
Als geeignete Lipide zur Herstellung robuster Lipid-Vesikel mit semipermeablen
Membranen, die den Reaktionsbedingungen der Formose-Reaktion standhielten, wurden
stem die Synthese spezifischer Kohlenhydrate
mose-
synthetische Phospholipide eingesetzt (1,2-Di-O-phytanoyl-sn-glycero-3-O-phosphorcholin
(DPhPC)). Es ist bekannt, dass die autokatalytische Formose-Reaktion sensibel auf äußere
Reaktionsbedingungen reagiert, erkennbar an der Produktverteilung der gebildeten
Kohlenhydrate. Um einen möglichen Einfluss der Kompartmentierung auf die Formose-
Reaktion zu untersuchen, verglich man die im Vesikel ablaufende Formose-Reaktion mit der
frei in Lösung ablaufenden. Hierzu wurden die entsprechenden Reaktionsprodukte mittels
GC-MS analysiert und die jeweilige Produktverteilung quantifiziert. Bei der im Vesikel
ablaufenden Reaktion bildeten sich zu 65 % Pentosen und zu 15 % Hexosen, wobei die
verbleibenden Kohlenhydrate sich aus Tetrosen, Heptosen und anderen – nicht genauer
definierten - Komponenten zusammensetzten. Im Fall der frei in Lösung ablaufenden
Reaktion wurde die Produktverteilung zu 15 % Pentosen, 38 % Hexosen, 18 % Tetrosen und
19 % Heptosen ermittelt. Eine Erklärung dieser phänomenologischen Beobachtung der von
der Kompartmentierung beeinflussten Produktverteilung, der in der Formose-Reaktion
gebildeten Kohlenhydrate erfolgte nicht.
Zudem etablierten Davis et al. ein Detektionssystem, das über die direkte Interaktion einer
lebenden Zelle mit dem Protozell-Sy
signalisiert. Hierzu setzten sie das marine Bakterium Vibrio harveyi ein, das auf in Lösung
vorliegende Furanosylboratdiester eine autoinducer-2 Quorum Sensing [46, 47] Antwort zeigt,
die in Form einer blauen Biolumineszenz detektiert werden kann. Als Quorum Sensing
bezeichnet man die Fähigkeit von Einzellern, über chemische, extrazellulare Kommunikation
die Zelldichte der Population messen zu können. Sie erlaubt es den Zellen, bestimmte Gene
nur dann zu aktivieren, wenn eine bestimmte Zelldichte über- oder unterschritten wird.
Nach der gezielten Abstimmung notwendiger Reaktions- und Nährmediumsbedingungen, die
eine Koexistenz lebender Bakterien und der in den Lipid-Vesikel ablaufenden For
Reaktion ermöglichten, wurde gezeigt, dass bestimmte Reaktionsprodukte – in Form ihrer
Borate – eine dem natürlich vorkommenden autoinducer-2 Molekül entsprechend ähnliche
Quorum Sensing Antwort zeigten. In ersten Experimenten mussten hierzu jedoch die Lipid-
Vesikel durch die Zugabe eines Detergenzes zerstört werden, da die Membranpermeabilität
nicht ausreichte, um die gebildeten Reaktionsprodukte der Formose-Reaktion aus dem
Vesikel hinausdiffundieren zu lassen. Nach dem erfolgreichen Einbau des bereits bei anderen
protozellulären Systemen eingesetzten Membranproteins α-Hämolase, konnte die Membran-
27
permeabilität soweit erhöht werden, dass ohne Zerstörung der Vesikel eine positive Quorum
sensing Antwort der Bakterien zu detektieren war.
Die Formose-Reaktion als autokatalytischer Proto-Metabolismus, gekoppelt an ein
vielen Modellen zu synthetischen Zellen oder auch möglichen Protozellen sind die
deren Derivate stellen somit potentielle Kandidaten für
membranbildende Lipide in Modellen zu Protozellen dar - begründet durch ihre mögliche
Entstehung unter plausiblen präbiotischen Reaktionsbedingungen.[9]
kompartmentierendes Lipid-Vesikel System, stellt ein experimentelles Beispiel eines protozell
typischen, chemischen Reaktionsnetzwerks dar, das bei der Entwicklung protozell-ähnlicher
Strukturen eine Rolle gespielt haben könnte.[16, 48] Der experimentelle Hinweis, dass die
Kompartementierung einen signifikanten Einfluss auf die Produktverteilung der Formose-
Reaktion nimmt, in dem bevorzugt Pentosen gebildet werden, könnte ein möglicher Hinweis
zur chemischen präbiotischen Entstehung erster Nukleinsäuren sein. In dem vorgestellten
Protozell-System entstehen neben vielen anderen Zuckern auch, unselektiv, zu einem
gewissen Anteil D-Ribosen. Es wird jedoch vermutet, dass es auch durch spezifische
Interaktionen von Pentosen mit Phosphorlipidmembranen zu Mechanismen kommen kann,
die zu Ribosen führen können.[49] So wäre es möglich, dass das beschrieben Protozell-Modell,
nicht nur als mögliches Modell zur Zuckermolekül Bildung in der präbiotischen Chemie
herangezogen werden kann (sugar world), sondern auch eine mögliche Rolle als sog. missing
chemical link zur RNA-Welt einnehmen könnte.[44]
In
künstlichen Vesikelmembranen aus spezifischen Mischungen von natürlichen oder auch
synthetischen Phosphorlipiden aufgebaut. Die Zusammensetzungen dieser Lipidmischungen
wurden gezielt ausgewählt, um die künstliche Membran möglichst ideal an die
Reaktionsbedingungen der zu untersuchenden Reaktionsmodelle anzupassen. Die Entstehung
der Membranlipide unter plausiblen, präbiotischen Reaktionsbedingungen stand bei diesen
Modellen nicht im Vordergrund. Zur Herstellung und Untersuchung potentieller präbiotischer
Kompartimente, aus denen erste Ur-Zellen hervorgegangen sein könnten, sollten die
eingesetzten Ausgangsverbindungen jedoch möglichst eine einfache Struktur besitzen und
unter chemischen - im Labor nachgestellten - präbiotischen Bedingungen zugänglich sein.
Zum einen ist bekannt, dass unter hydrothermalen Bedingungen einfache Fettsäuren über eine
Fisher-Tropsch ähnliche Reaktion gebildet werden können.[50] Zum anderen berichteten
Deamer et al., dass organische Extrakte des Murchison Meteoriten spontan Vesikel in
wässriger Lösung ausbildeten.[51]
Einfache Fettsäuremoleküle und
28
Auf der anderen Seite ist es jedoch auch bekannt, dass Phospholipidmembranen in lebenden
Zellen hervorragende Barrieren ausbilden, um die unspezifische Aufnahme von polaren und
geladenen Molekülen zu verhindern. Dies reicht von Metallionen bis hin zu komplexen
eren
idazol-aktivierte Nukleotide durchqueren die Membran und reagieren als Substrate (Nährstoffe) in einer nicht-
pezifischer Lipidmischungen. Die quantitative Bestimmung der Ribose-Permeabilität durch
Nährstoffmolekülen. Im Laufe der Evolution sind in lebenden Zellen hochspezifische
Membranen entstanden, die überwiegend aus zweikettigen Phosphorlipiden, Sterinen und
spezifischen Transmembranmolekülen aufgebaut sind. Die komplexe Struktur solcher
Membranen erlaubt neben der Ausbildung von elektrochemischen Gradienten einen gezielten
Stoffaustausch, der zum Überleben der Zelle unabdingbar ist. Die bottum-up Synthese solcher
komplexer, natürlicher Zellmembranen ist bis heute nicht möglich. Künstliche Phospholipid-
membranen, in die nicht zusätzlich α-Hämolysin eingebaut wurde, zeigten eine unzureichende
Membranpermeabilität, so dass kein Stoffaustausch mit der Umgebung erfolgen konnte.
Mansy et al berichteten 2008 von einem Protozell-Modell, in dem eine nicht-enzymatische
templatgesteuerte Synthese eines genetischen Polymers innerhalb von Vesikeln realisiert
werden konnte, die aus einfachen Fettsäuremoleküle und Mischungen mit d
korrespondierenden Alkoholen und / oder Monoglycerinestern hergestellt wurden.[70]
Abbildung 8. Konzept eines Modells zu einer heterotrophen Protozelle [70]. Die Autoren vermuten, dass ein mögliches Wachstum der Protozellmembran durch die Aufnahme von amphiphilen Molekülen aus derUmgebung stattfinden könnte, wobei dann im Folgenden eine Teilung des Reaktionskompartiments über ntrinsische- oder extrinsische physikalische Kräfte stattfinden könnte. Von außen zur Protozelle zugegebene i
Imenzymatischen Reaktion eines im Inneren vorliegenden Templatmoleküls. Vollständige Templat- Vervielfältigung gefolgt durch eine zufällige Teilung und Separation des gebildeten genetischen Materials könnte zur Ausbildung einer „Tochterzelle“ führen.
Der erste Teil der Arbeit beschreibt die systematische Untersuchung der Permeabilität von
Vesikelmembranen gegenüber Ribose - dem Zuckerbaustein der RNA - in Abhängigkeit
s
unterschiedlich aufgebaute Vesikelmembranen wurde indirekt über real-time Fluoreszenz
29
Messungen[49, 52] bestimmt, indem das selfquenching von zuvor in die Vesikel
eingeschlossenen Fluorophoren detektiert wurde.
Es zeigte sich, dass die Permeabilität der Membranen über die chemische Struktur der Lipide
zu beeinflussen war. Durch folgende Faktoren erreichte man eine Erhöhung der Permeabilität:
Mindestlänge von 10 Kohlenstoffatomen zur Ausbildung stabiler Vesikel notwendig
ii)
eigungen erhöhten die Permeabilität.
n die Lipidpackung in der Membran auflockert.
Es zeig ohe Ribose-Permeabilität
eigten, verglichen mit reiner 9-Tetradecensäure (Myristoleinsäure), die als Referenz
Binäre 2:1 Mischung aus Myristoleinsäure und dem
korrespondierenden Glycerolmonoester;
und dem korrespondierenden
Vesikel-Typ 3:
er A MP, ADP und
TP bei pH = 8.5. Hierzu wurden diese zuerst in die unterschiedlichen Vesikel-Typen 1 bis 3
i) durch die Verkürzung der Alkylkettenlängen der Membranlipide, wobei eine
war.
über die chemische Struktur der Membranlipide: Ungesättigte Alkylketten oder auch
Verzw
iii) Vergrößerung der hydrophilen Kopfgruppe: Verwendung von Sorbitanmonoester der
Fettsäuren.
iv) Zusatz von Farnesol (3,7,11-Trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol), das durch sterische
Abstoßunge
te sich, dass drei der untersuchten Vesikel-Typen eine h
z
eingesetzt wurde:
Vesikel-Typ 1:
Vesikel-Typ 2: Ternäre 4:1:1 Mischung aus Dodekansäure (Laurinsäure), dem
korrespondierenden Glycerolmonoester
Alkohol Dodekanol;
Binäre 2:1 Mischung aus Myristoleinsäure und Farnesol.
Im zweiten Teil d rbeit untersuchte man die Permeabilität der Nukleotide A
A
eingekapselt. Nach bestimmten Zeitabständen detektierte man dann mittels Größenaustausch-
chromatographie (GFC)die Konzentration der Nukleotide, die außerhalb der Vesikel in der
umgebenden Lösung vorlagen,. Die Vesikelmembranen waren nahezu impermeabel,
zurückführbar auf die negative Ladung der Nukleotide. Durch die Zugabe von Mg2+-Ionen
konnte die Permeabilität durch die Maskierung der negativen Ladungen erhöht werden.[53] Es
zeigte sich zudem, dass in Abhängigkeit der Netto-Ladungen der Nukleotid-Mg2+-Ionen-
30
komplexe, signifikante Unterschiede im Permeabilitätsverhalten bestanden: Das Mg2+
maskierte ATP war nahezu impermeabel, der AMP- und der ADP-Mg2+-Komplex zeigten
eine ausreichende Permeabilität. Aufgrund dieser Ergebnisse stellen die Autoren eine
essentielle, früh angesiedelte präbiotische Rolle von extern – also außerhalb eines
Kompartiments - gebildeten Nukeotidtriphosphaten (NTPs) in ersten zellähnlichen Systemen
in Frage. Stattdessen wäre es wahrscheinlicher, dass die NTPs zu einem späteren Zeitpunkt in
bereits bestehenden Kompartimenten intern gebildet worden sein könnten.[53] Die
durchgeführten Experimente zeigten, dass die Permeabilität der untersuchten Vesikel-
membranen in erster Linie von der Ladung des Moleküls abhängt, das die Membran
durchqueren soll. Imidazol-aktivierte Nukleotide wurde bereits in der Vergangenheit in
präbiotschen Selbstreplikations-Modellen ausführlich untersucht, um sowohl spontane als
auch templatgesteuerte Polykondensationsreaktionen zu untersuchen (siehe Kapitel 1.4.1).
Neben der im Vergleich zu den NTPs höheren Reaktivität, sind die Imidazol-aktivierten
Nukleotide weniger polar und besitzen nur eine einzige negative Ladung bei neutralem bis
leicht basischem pH-Wert. Die Imidazol-aktivierten Nukleotide zeigten eine ähnliche
Permeabilität wie Ribose in den untersuchten Vesikel-Typen 1 bis 3.
Im dritten Teil ihrer Arbeit untersuchten Mansy et al. eine nicht-enzymatische, templat-
gesteuerte Kondensationsreaktion eines genetisches Polymers im Inneren der optimierten
. das Primer-Templat in Vesikel des Typs 1 bis 3 ein und
Vesikel (Typ 1 bis 3). Das Modell zur spontanen chemischen Reaktion wird im Folgenden
kurz beschrieben: Zuerst bindet ein DNA-Primer, der an seinem Ende ein 3´-Amino-
modifiertes Nukleotid besitzt und zudem 32P-markiert ist, an ein DNA Oligonukleotid, das
aus einer Primer-Bindungsstelle und einer dC15 Templat-Region besteht.[54] Nach der Zugabe
der 2’-Amino-2’,3’-desoxyguanosin 5’-phosphorimidazolid Bausteine 1, wird die Primer-
Region durch eine templatgesteuerte 2´-Phosphoramidat Verknüpfung verlängert. Sowohl 3’-
als auch 2’-Aminomodifizierte Oligonukleotide polymerisieren unter vergleichbarer
Aktivierungschemie schneller als die korrespondierenden unmodifizierten. Dies wird
hervorgerufen durch die höhere Nukleophilie der Aminofunktion.[55] In Lösung, d.h.
außerhalb der Vesikel, verlief die beschriebene chemische Polykondensation am dC15
Templat in der Anwesenheit von 5 mM Imidazol-aktivierten Aminoguanosin Bausteinen
innerhalb von 6 h vollständig.
Dieses Reaktionssystem integrierte man nachfolgend in die unterschiedlichen Vesikel-Typen.
Hierzu kapselten Mansy et al
entfernten nicht eingekapseltes Primer-Templat aus der umgebenden Lösung. Nachfolgend
wurde zu den unterschiedlichen Vesikel-Dispersionen Imidazol-aktiviertes 2’-Amino-
31
modifiziertes Guanosin gegeben. Hierbei zeigte sich, dass die aktivierten Nukleotide die
Vesikelstabilität nicht beeinflussten und zudem die Membranen durchqueren konnten, ohne
das dass zuvor eingekapselte Primer-Templat hinausdiffundierte. Die anschließende,
gelelektrophoretische Analyse zeigte die erfolgreiche Primer-Verlängerung in allen Vesikel
Typen 1 bis 3.
In analogen Experimenten, in denen die Vesikel jedoch aus Phospholipiden (POPC)
aufgebaut wurden, konnten die Autoren keine Elongation des eingekapselten DNA-Primers
und deren Derivaten, einfache Kompartimente darstellen, die sowohl
sierend auf Emulsionen
riebenen Protozell-Modellen, in
enen die Kompartimente aus Lipid-Vesikeln aufgebaut wurden und so zur Lokalisierung
ie in-vitro Transkription und Translation,[57, 58] DNA-
Replikation oder PCR.[59] Abhängig vom eingesetzten Kohlenwasserstoff kann eine w/o-
nach der Zugabe von Imidazol-aktivierten Guanosin Bausteinen zum externen Medium
detektieren - hervorgerufen durch die Impermeabilität der reaktiven Bausteine gegenüber der
Phospholipidmembran.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Vesikel, bestehend aus einfachen, präbiotisch
zugänglichen Fettsäuren
eine ausreichende Impermeabilität gegenüber eingekapseltem DNA Primer-Templat
aufweisen, als auch eine genügend große Permeabilität gegenüber einfachen, aktivierten
Molekülen 1 zeigen, die als Substrate in einer nicht-enzymatischen tempatgesteuerten
Reaktion im Inneren des Kompartiments reagieren können. In der Literatur sind zuvor schon
einige Polymerisationsreaktionen beschrieben worden, die im Inneren unterschiedlichster
Kompartimente abliefen, jedoch realisierten Mansy et al. mit dieser Arbeit als Erste, ein
potentielles präbiotisches Protozell-System, in dem die zur Reaktion notwendigen Ressourcen
dem Kompartiment von außen zugeführt werden konnten. Es wäre daher möglich, dass
heterotrophe1 Reaktionssysteme eine relevante Rolle bei der Entstehung erster Ur-Zellen
eingenommen haben könnten.[56]
1.3.4 Modelle zu Protozellen, ba
Ein anderer experimenteller Ansatz zu den bereits besch
d
eines metabolischen und genetischen Subsystems genutzt werden könnten, besteht in der
Herstellung von Emulsionen. Emulsionen enthalten zwei nicht mischbare flüssige Phasen, in
denen eine Flüssigkeit in Form von Tröpfchen emulgiert in der anderen vorliegt.
Entsprechend der emulgierten Phase unterscheidet man Öl in Wasser-Emulsionen (o/w) und
Wasser in Öl-Emulsionen (w/o).
Analog zu Lipid-Vesikeln sind in w/o-Emulsionen unterschiedlichste enzymatische
Reaktionen beschrieben, wie d
32
Emulsion erstaunlich durchlässig für Sauerstoff,[60] Wasser und in Wasser gelöste Ionen und
auch für geladene NTPs sein.[59] Die Größe der emulgierten Wassertröpfchen kann sowohl
über die gezielte Variation der Zusammensetzung der grenzflächenaktiven Moleküle als auch
durch von außen zugeführte mechanische Energie beeinflusst werden.[72, 73] Selbst der gezielte
Stofftransport zu den Kompartimenten über Nano-Emulsionen ist beschrieben.[74]
Verglichen mit vesikulären Kompartimenten, ist das Wachstum, die Teilung und die Fusion
von emulgierten Wassertröpfchen weniger ausführlich untersucht.
Das wohl bekannteste Beispiel für ein Protozell-Modell in einer o/w-Emulsion ist 2003 von
dreier zentraler Systeme:
ler Einzelsysteme führt.
Abbild Modells für o/w
ls genetisches Material wurde PNA (Peptid-Nukleinsäure) eingesetzt, die zur notwendigen
etabolisches Material verwendeten Rasmussen et al. hydrophobierte Photosensitizer: Einen
organischen Farbstoff (Stilben) oder auch einen metallorganischen Photosensitizer
Rasmussen et al. beschrieben worden, der sog. Los Alamos Bug.[61]
Die Grundlage dieses Protozell-Modells besteht in der Kopplung
Einem genetischen System, das die Information beinhaltet, einem metabolisches System, zum
Energietransfer und einem Container, der zur (Ko-) Lokalisierung al
Im Konzept zum Los Alamos Bug soll die Kompartimentierung über die Ausbildung von
emulgierten Öltröpfchen (oder auch Mizellen) in wässriger Lösung erfolgen. Diese bestehen
aus einfachen Fettsäuremolekülen, wobei das metabolische- und auch das genetische System
auf der äußeren Grenzfläche - oder auch im Inneren der emulgierten Aggregate - lokalisiert
sind.
amphiphiles Templat (PNA)
Lipide (Fettsäuren)
Photosensitizer (kovalent gebunden an PNA)
ung 9. Schematische Darstellung des Konzepts zum Los Alamos Bug als Beispiel eines Protozell--Emulsionen.[8]
A
attraktiven Wechselwirkung mit den Fettsäure-Aggregaten speziell hydrophobiert wurde. Als
m
33
(Tris 2, 2´-bipyridin)-ruthenium), die dem Gesamtsystem äußere Energie in Form von Licht
für Redox-Prozesse bereitstellen sollen. Durch die kovalente Verknüpfung der PNA
(genetisches System) mit dem Photosensitizer sollte eine Lokalisierung beider Komponenten
im Aggregat ermöglicht werden (siehe Abbildung 9). Die chemische Struktur aller
Verbindungen wurde so gewählt, dass sie in wässriger Lösung zur Selbstaggregation befähigt
sind.
Zum einfachen kooperativen Zusammenwirken des genetischen-, metabolischen und
kompartmentierenden Systems, integrierte man im Los Alamos Bug das genetische Material
als festen Bestandteil in den Ladungstransport-Prozess, so dass das genetische System direkt
den metabolischen Prozess katalysiert.
zelle) die Selbstreplikation des genetischen Materials
McCaskill et al. verfolgt.
Ein computergesteuertes, elektronisch-mikrofluidisches System, die Omega Maschine, soll
ierung von gelösten
toffen innerhalb mikrofluidischer Kanäle durch Elektroden; die direkte Steuerung des
Der metabolische Prozess produziert Fettsäuren (neben anderen Ausgangsverbindungen), die
zum Container – im Gegensatz zum Vesikel: Kompartiment - selbstaggregieren können, und
in dem das metabolische und genetische System lokalisiert ist. Zudem soll auf oder auch im
Inneren des Öltröpfchens (bzw. der Mi
und auch die metabolischen Prozesse verlaufen. Eine vollständige chemische
Implementierung aller Einzelsysteme zu einem funktionierenden Gesamtsystem und somit zu
einem Protozell-Modell konnte bislang aufgrund der Komplexität der einzelnen
Reaktionskomponenten nicht verwirklicht werden. Ausführliche theoretische und
experimentelle Untersuchungen und eine detaillierte Beschreibung des Konzepts zum Los
Alamos Bug als Protozell-Modell sind im Buch Protocells zusammengestellt.[8]
1.3.5 Künstliche Zellen über elektronische, mikrofluidische Systeme
Ein weiterer Ansatz, eine künstliche Zelle nachzustellen, wird von
bestimmte zelltypische Aufgaben übernehmen: z. B. die Kompartiment
S
Lösungsmittelflusses, so dass gezielt gelöste Stoffe ortsabhängig transportiert werden; externe
Bereitstellung und Entfernung von Reaktanden; ortsabhängige Immobilisierung von
Molekülen; Regulierung der Temperatur (thermocycling) etc. Eine detaillierte Beschreibung
des Designs und der elektronischen Steuerung der verschiedenen mikrofluidischen Strukturen
und deren damit verbundenen Anwendungsmöglichkeiten bezüglich der Untersuchung
artifizieller Zellsysteme und Protozellen sind im Buch Protocells ausführlich beschrieben.[8]
34
1.4 Selbstreplizierende Systeme
Selbstreplizierende Systeme sind definitionsgemäß zur Selbstvermehrung befähigt. Es handelt
sich um Systeme aus Reaktionszyklen, in denen im einfachsten Fall aus zwei Edukten in einer
odukte entstehen, die als Templat zur eigenen
können. Eine wesentliche Eigenschaft solcher
euerte
Reaktion beschrieben, bei der zwei Moleküle Hexathymidylsäure-5’-phosphat an dem
liche Carbodiimid N-Ethyl-N'-(3-dimethyl-
rung
Template aus Pyrimidinbasen verlieren mit
tide durch eine Am
en.
irreversiblen Reaktion ein - oder mehrere - Pr
Synthese, also als Katalysator, fungieren
selbstreplizierender Systeme ist die Autokatalyse.
Im Folgenden werden unterschiedliche selbstreplizierende Systeme näher beschrieben.
1.4.1 Nicht-enzymatische, templatgesteuerte Reaktionen
Im Jahre 1966 wurde von Naylor und Gilham die erste nicht-enzymatische, templatgest
komplementären Templat Polyadenylsäure kondensiert wurden. Die Aktivierung der
Phosphatgruppen erfolgte durch das wasserlös
aminopropyl)carbodiimid (EDC) 2.[62] Die templatgesteuerte Ligation von Nukleinsäuren
wurde insbesondere von Shabarova et al. systematisch untersucht und weiterentwickelt.[77, 78]
Orgel et al. demonstrierten in umfangreichen Untersuchungen, dass Ribonukleosid-5’-
phosphorimidazolide erfolgreich in nicht-enzymatischen, templatgesteuerten
Polymerisationen eingesetzt werden können.[79-82]
Diese Untersuchungen zeigten zum einen das Potential der Phosphorimidazolid-Aktivie ,
jedoch auch die damit verbundenen Grenzen der Reaktionsführung auf: Die
Reaktionsgeschwindigkeit der chemischen Polymerisation ist sehr langsam und nur effizient, wenn das Templat reich an Pyrimidinbasen ist.
steigendem Anteil an Purinbasen ihre Wirkung.[63] Des Weiteren ist die Regioselektivität der
Reaktion gering. Die gebildeten Produkte zeigen überwiegend eine 2’-5’-Verknüpfung
anstelle der angestrebten 3’-5’-Verknüpfung. Orgel et al. versuchten, diese Probleme durch
die Verwendung 2’- oder 3’- Amino-modifizierter Nukleotide zu umgehen. Durch die
Substitution der Hydroxylfunktion der Nukle inofunktion wurde die
Nukleophilie der Reaktionsbausteine erhöht. Dies äußerte sich sowohl in einer Erhöhung der
Reaktionsgeschwindigkeit, als auch in einer höheren Regioselektivität der Polymerisation.
Es stellte sich zudem heraus, dass die Regiochemie (2’-5’- versus 3’-5’-Verknüpfung) durch
zweiwertige Metallionen und durch Substituenten am aktivierenden Imidazol umgekehrt
werden kann.[64-68] Dies zeigt, dass schon kleine Änderungen im System einen großen
Einfluss auf die Konformation der Komplexe in templatgesteuerten Reaktionen nehm
35
Richert et al. berichteten, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der Kondensationsreaktion
3’-Amino-modifizierter Nukleotide sehr schnell sein kann (> 1 min-1 pro Nukleotid)
- herbeigeführt durch optimale Abgangsgruppen und der Verwendung von 3’-Oligo-
nukleotiden oder auch speziellen Schutzgruppen, die eine optimale Orientierung der
Reaktionsbausteine im Kondensationsschritt bewirken.[69]
2009 untersuchten Szostak et al. die templatgesteuerte Polykondensation von 2’-Amino-
2’, 3’-dideoxy-guanosin 5’-phosphorimidazoliden 1 unter Ausbildung einer Phosphoramidat-
bindung.[70] Durch die speziellen Modifikationen der Reaktionsbausteine wurde sowohl die
unerwünschte 2’-5’-Verknüpfung, als auch eine intramolekulare Zyklisierung zurückgedrängt.
. von Kiedrowski stellte 1986 das erste selbstreplizierende chemische Minimalsystem vor,
das eine nicht-enzymatische Selbstreplikation (Autokatalyse mit Informationstransfer) eines
natürliche Replikationsvorgänge wurde die
ondensationsreaktion von zwei synthetischen Tridesoxynukleotiden mit den Sequenzen
So konnte die erfolgreiche nicht-enzymatische, templatgesteuerte Kondensationsreaktion
eines genetischen Polymers, über eine N2’ P5’ Phosphoramidat- Verknüpfung im Inneren
von Vesikeln gezeigt werden (detaillierte Beschreibung siehe Kapitel 1.3.3).
1.4.2 Selbstreplizierende Oligonukleotide
G
Moleküls zeigte.[71] In Anlehnung an
K
MeCCGp A und HOCGGp(2-Cl-Ph) B untersucht. Die Bildung der natürlichen Phosphor-
diesterbindung erfolgte durch eine Aktivierung der Phosphatgruppe des Eduktmoleküls A mit
dem wasserlöslichen Carbodiimid EDC 2 unter Ausbildung des entsprechenden O-Acyliso-
harnstoff-Derivats. Durch den nukleophilen Angriff der freien 5’-Hydroxylfunktion des
Reaktionsbausteins B an die aktivierte Phosphatgruppe von A bildet sich das Oligonukleotid
MeCCGCGGp(2-Cl-Ph) C unter Ausbildung einer Phosphordiesterbindung. Die palin-
dromische Sequenz des Produktmoleküls ermöglicht die nicht-kovalente Anordnung der
Eduktbausteine A und B durch Watson-Crick-Basenpaarung. Im termolekularen Komplex
ABC liegen so die funktionellen Gruppen der Trimer-Bausteine A und B in räumlicher Nähe,
so dass diese in einer templatgesteuerten Reaktion miteinander reagieren (irreversible
Ligation). Der sog. Templateffekt bewirkt somit eine höhere effektive Molarität bezüglich der
Reaktanden und führt damit zu beschleunigter Produktbildung (autokatalytische Wirkung).
Neben der Assoziation zum termolekularen Komplex ABC findet ebenfalls die Dimerisierung
des Hexamer-Templats zum Produktkomplex C2 statt, der aus entropischen Gründen stabiler
ist als der termolekulare Komplex ABC. Aufgrund der Stabilität von C2 stehen die
36
Produktmoleküle nur zu einem geringen Teil als freie Template für die weitere
templatgesteuerte Bildung von neuen Produktmolekülen zur Verfügung, es kommt zur
Produktinhibition. Als Nebenprodukt entsteht immer das 3’-3’-verknüpfte Pyrophosphat des
MeCCGp A.
Abbildung 10
latgesteuerten
C in
eigte sich, dass bei höheren Anfangskonzentrationen des Templats eine vermehrte Bildung
Formel 1
ls, αCp für den
utokatalytischen Reaktionskanal. Der Exponent p entspricht der autokatalytischen Reaktions-
ordnun es
emplats mit der Reaktionsordnung p = 0 ein, liegt ein lineares Wachstum der
. Schematische Darstellung eines minimalen selbstreplizierenden Systems.
Zur analytischen Auswertung und zum Nachweis der Existenz einer temp
ngsgeschwindigkeit der Produktbildung von Reaktion wurde die Abhängigkeit der Anfa
Abhängigkeit der Templatkonzentration zum Zeitpunkt t = 0 mittels RP-HPLC untersucht. Es
z
des Produktmoleküls C zu beobachten war. Die Geschwindigkeitskonstante der auto-
katalytischen Reaktion zeigte bei der kinetischen Auswertung eine Abhängigkeit von der
Quadratwurzel der anfänglichen Templatkonzentration zu Reaktionsbeginn. Hieraus wurde
ein empirisches Geschwindigkeitsgesetz für die Reaktionsgeschwindigkeit, das Quadra-
twurzelgesetz hergeleitet.[71]
Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Anfangskonzentration
des Templats lässt sich dementsprechend vereinfacht wie folgt darstellen:[72]
dC/dt = αCp + β
β steht für die Geschwindigkeit des nicht-autokatalytischen Reaktionskana
a
g, die das spezifische autokatalytische Wachstum festlegt: Geht die Konzentration d
T
37
Produktmoleküle vor; für p = 0.5 gilt parabolisches Wachstum (Quadratwurzelgesetz) und für
p = 1 exponentielles Wachstum.
Ein charakteristisches Merkmal einer autokatalytischen Reaktion ist eine sigmoide Produkt-
bildungskurve, die jedoch nur zu beobachten ist, wenn die nicht-autokatalytische
Hintergrundreaktion gegenüber dem templatgesteuerten Reaktionsweg deutlich verlangsamt
ist. Für die Beschreibung eines selbstreplizierenden Systems wurde die Größe ε, die die
lytischen Reaktionskanals
ks: Geschwindigkeitskonstante des spontanten Reaktionskanals
uf der Grundlage der ersten nicht-enzymatischen Selbstreplikation von kurzen
kelt, um eine
. Die Substitution der
’-Hydroxylgruppe durch eine nukleophilere Aminofunktion des Trimer-Bausteins CGG
auf der Grundlage tripelhelikaler Strukturen nach.[76,
autokatalytische Effizienz beschreibt, definiert:[72]
ε = ka / ks Formel 2
ka: Geschwindigkeitskonstante des autokata
A
Oligonukleotidsequenzen wurden in der Folge weitere Varianten entwic
Verbesserung der Effizienz der autokatalytischen Reaktion zu erreichen
5
führte zu einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit und zur Vermeidung der unerwünschten
Nebenreaktion zu 5’-5’-verknüpften Pyrophosphaten. Beide Effekte führten zur Effizienz-
steigerung des autokatalytischen Systems, so dass zum ersten Mal eine sigmoide Produkt-
bildungskurve auftrat.[73, 74] Die sigmoide Produktbildungskurve ist dadurch zu erklären, dass
zu Beginn der Reaktion mit zunehmender Bildung von Templatmolekülen diese immer
schneller ihre eigene Synthese katalysieren, bis die Lösung soweit an Eduktbausteinen
verarmt, dass die Reaktion wieder langsamer verläuft, wodurch ein Wendepunkt im
Konzentrations-Zeit-Diagramm auftritt.
In den Arbeiten von Achilles und Sievers konnte das minimale Prinzip der Selbstreplikation
durch komplexere Systeme erweitert werden, in welchen das Konkurrenzverhalten[75] und die
Kreuzkatalyse[95, 96] von Oligonukleotiden untersucht wurde. Nicolaou et al. wiesen in
Experimenten erstmals eine Replikation 77] Vor dem Hintergrund einer molekularen Evolution war die Beobachtung des parabolischen
Wachstums bei der Untersuchung der Selbstreplikation von Oligonukleotiden von besonderer
Bedeutung. Eine parabolische Vermehrung (p = 0.5) von konkurrierenden Produktmolekülen
würde nach theoretischen Erkenntnissen zu einer Koexistenz (survival of erverybody) und
nicht, wie im Falle eines exponentiellen Wachstums (p = 1), zur Selektion (survival of the
38
fittest) führen.[78] Der Koexistenz von unterschiedlichen Sequenzen wird eine potentielle Rolle
in einem frühen Stadium der molekularen Evolution eingeräumt, bei der eine Vielzahl an
ähnlichen Sequenzen für den Aufbau von komplexeren Strukturen wichtig war. Ein zu diesem
Zeitpunkt starkes Selektionsverhalten hätte dagegen zu einer Verdrängung von weniger
effizienten Sequenzen geführt und die Entwicklung der molekularen Evolution
eingeschränkt.[79]
1998 beschrieben Luther, Brandsch und von Kiedrowski ein Verfahren zur nicht-
enzymatischen, exponentiellen Replikation von DNA-Analoga an der festen Phase, das
SPREAD-Verfahren (Surface Promoted Replication and Exponential Amplification of DNA-
Analogues).[80] Hierbei wurden zwei komplementäre Templatmoleküle zuerst separat an einer
roduktinhibition zu beobachten war. Somit stellte das SPREAD-
uellen beinhaltet. Als Alternative hierzu stellten Schöneborn, Bülle und
Festphase immobilisiert und mit komplementären Oligonukleotidbausteinen hybridisiert. Die
Ligation erfolgte nach EDC-Aktivierung, so dass die entsprechenden Kopien erhalten wurden.
Die Abtrennung der Ligationsprodukte und ihre anschließende Immobilisierung an einer
unbeladenen Festphase erzeugte weiteres, templatgebundenes Material, welches in folgenden
Zyklen reagieren konnte.
Aufgrund der gewählten disulfidischen Verknüpfung der Templatmoleküle mit der Festphase
konnten diese durch Reduktion abgespalten und nachfolgend durch RP-HPLC analysiert
werden. Die Duplexbildung der Template konnte durch die Immobilisierung verhindert
werden, so dass keine P
Verfahren erstmalig eine nicht-enzymatische, exponentielle Replikation (p = 1) von
Oligonukleotiden dar.
Alle Experimente zur Selbstreplikation von Oligonukleotiden wurden durch RP-HPLC
analysiert. Dieses Verfahren hat einige Nachteile, da die Dauer der HPLC-Elutions-
programme die Zahl der Messpunkte limitiert und zudem die Probenvorbereitung einige
experimentelle Fehlerq
von Kiedrowski 2001 ein Verfahren vor, welches die Verfolgung der Oligonukleotid-
replikation über Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) erlaubte. Das ursprüngliche
hexamere Replikationssystem wurde zu einem oktameren, einem dekameren und einem
dodekameren System erweitert. Dabei bliebt die Kernsequenz d(CCGCGG) erhalten und
wurde endständig um jeweils eine Base mit T bzw. A erweitert.[81] Die FRET-Analytik basiert
auf dem strahlungslosen Energietransfer eines Fluoreszenz-Donors auf einen Akzeptor. Die
Theorien dieses Phänomens gehen auf Förster zurück.[82] Die Effizienz E des strahlungslosen
Energie-Transfers ist dabei mit der sechsten Potenz vom Abstand R der beiden Chromophore
abhängig:
39
6
1
1
R
E Formel 3
0
R
R0 ist eine durch das D d,
bei dem die Effizienz des Energietransfers genau bei 50 % liegt, definiert ist. In den
beschriebenen Selbstreplikationssystemen wurden die strukturell ähnlichen Cyaninfarbstoffe
y3 und Cy5 als korrespondierende Fluoreszenzfarbstoff Paare verwendet, die sich strukturell
, 3-Dimethylindol Reste miteinander verbinden. Das Absorptionsmaximum des Cy3
nd ist
lau. Beide Farbstoffe zeichnen sich durch große molare Extinktionskoeffizienten aus:
onor-Akzeptor-Paar charakteristische Konstante, die als der Abstan
C
in nur einer Vinylgruppe unterscheiden.
Abbildung 11. Chemische Strukturen der Cy3 und Cy5 in der kommerziell erhältlichen Form als MMT-geschützte Phosphoramidite.
Die Zahlen 3 und 5 stehen für die Anzahl der Kohlenstoffatome, die zwei N-alkylierte
3
Farbstoffs liegt bei 548 nm und erscheint rosa, Cy5 absorbiert im Bereich von 644 nm u
b
Extinktionskoeffizienten von Cy3 150.000 l mol-1 cm-1 und Cy5 250.000 l mol-1 cm-1 bezogen
auf die jeweiligen Absorptionsmaxima in Wasser.[83] Der Wert für R0 im FRET-System mit
Cy3 als Donor und Cy5 als Akzeptor wird mit 5 nm angegeben.[84]
Durch die strukturelle Ähnlichkeit beider Fluoreszenzfarbstoffe wird somit ein vergleichbarer
Einfluss der Farbstoffmarkierung auf die Komplexbildung der Reaktionsbausteine erzielt. Die
Farbstoffe wurden synthetisch über ihre Phosphoramidite am 5´-Ende eines Eduktbausteins
und des Templats eingeführt.[81]
Durch die spezielle Farbstoffmodifikation der Reaktionsbausteine verhinderte man ein
Fluoreszenz-Quenching durch benachbarte Farbstoffe, so dass lediglich der Produktduplex C2
N+
N
O O
O
PO
CN
N
N+
O PO
CN
N
N
O
O
Cy3Cy5
40
einen relevanten Beitrag zum detektierten FRET-Signal zeigte, da der termolekulare Komplex
ABC nur sehr gering populiert ist.
Abbildung 12. Schematische Darstellung eines FRET-Replikationssystems.
Neben dem gezeigten heteromolekularen Duplex C2 existieren auch noch die entsprechenden
homomolekularen Komplexe, die nur mit den Donor- oder Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoffen
l leisten. Bei fortschreitender
eaktion verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen den Komplexen und wirkt sich
lizierenden
Systemen sind weiterhin selbstreplizierende Systeme beschrieben, die auf peptidischen- und
markiert sind, und keinen Beitrag zum detektierten FRET-Signa
R
dementsprechend auf das FRET-Signal aus. Durch Aufnahme von Kalibrierkurven war es
möglich, vom Fluoreszenz-Signal auf die Produktkonzentration zu schließen.
Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht somit eine direkte „online“-Visualisierung der
Reaktion. Hierdurch war es möglich, im Vergleich zu den bisher angewendeten HPLC
Analyseverfahren sehr viel mehr und exaktere Datenpunkte aufzunehmen, was zu einer
verbesserten kinetischen Auswertung des Replikationssystems führt.
1.4.3 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden sowie organischen Reaktionsbausteinen
Neben den auf Nukleinsäuren basierenden, nicht-enzymatischen selbstrep
organischen artifiziellen Replikatoren basieren.
41
Das erste selbstreplizierende Peptid wurde von R. Ghadiri 1996 beschrieben und basierte auf
einer leicht veränderten Leucine-Zipper Domäne des Transkriptionsfaktors GCN4 aus
Hefe.[85, 86]
Abbildung 13. Röntgenstruktur des GCN4-Proteins (Leucine-Zipper).[87]
Diese aus 32 Aminosäuren aufgebaute Domäne bildet eine α-Helix. Die Selbstfaltung zum
Leucine-Zipper wird durch hydrophobe Wechselwirkungen lipophiler Aminosäure-
seitenketten (Leucin, Isoleucin oder Valin) bestimmt, so dass im Wässrigen zwei
komplementäre Peptide zu einem Duplex assoziieren können (coiled coils), vergleichbar dem
Prinzip eines Reißverschlusses.
So wurde ein nukleophiles Pentadekamer und ein elektrophiles Heptadekamer an einem
Templat aus 32 Aminosäuren ligiert. Die kovalte Verknüpfung der Peptideinheiten erfolgte
durch die native Ligation nach Kent,[88] unter Ausbildung einer Amidbindung.
Auch dieser Replikator zeigte aufgrund von Produktinhibition ein parabolisches Wachstum,
das jedoch eine Reaktionsordnung p = 0.63 zeigte. Diese Beobachtung wurde über die
Ausbildung eines tetramolekularen Komplex erklärt, der aus den Eduktbausteinen und zwei
Templatmolekülen besteht.
Es folgten zahlreiche weitere selbstreplizierende Peptid Systeme, die auf der Ausbildung von
coiled coils und der Kent Ligation beruhten.[89, 90] So stellte Chmielewski Systeme vor, bei
denen die Selbstreplikation von spezifischen Reaktionsbedingungen, wie pH-Wert oder der
NaClO4-Konzentration, gezielt beeinflusst werden konnte. In anderen Systemen wurde über
Kreuzkatalyse von Peptidreplikatoren berichtet.[112-114] Bei zwei Systemen wurde ein nahezu
exponentielles Wachstum mit der Reaktionsordnung von p = 0.91 nachgewiesen. Ursächlich
hierfür war in einem Fall die Destabilisierung des Templat-Dimers durch Minimierung der
Sequenz auf 26 Aminosäuren. Dieses System ist zur Ausbildung von coiled coils fähig. Die
geringe Stabilität führt aber zu einer effektiven Unterdrückung der Produktinhibition.[91] Im
anderen Fall wurde eine Störung der Sekundärstruktur nach Einführung von L-Prolin in eine
35mer Sequenz erreicht. Der aus dem Austausch einer Aminosäure resultierende Knick von
etwa 30° in der Helixstruktur beeinträchtigt die Wechselwirkungen der hydrophilen
42
Seitenketten.[92] Beide Systeme zeigen so eine außergewöhnlich hohe autokatalytische
Effizienz ε.
Neben der Verwendung von RNA, DNA und Peptiden, die als Grundbausteine für minimale
Replikatoren eingesetzt wurden, sind zudem rein artifizielle Systeme beschrieben, die sich
strukturell stark von Biomolekülen unterscheiden. Detailliertere Informationen sind z.B. im
Microreview „Chemistry of Artificial Replicators“ zusammengestellt.[93]
1990 stellte Rebek das erste artifizielle Selbstreplikationssytem vor, das als Erkennungsmotiv
auf der einen Seite ein Derivat des Adenosins und auf der anderen eine entsprechende
künstliche Erkennungseinheit für Adenin enthielt.[118] Die Verknüpfung der
Reaktionsbausteine zum selbstkomplementären Reaktionsprodukt erfolgte über eine
Amidbindung. Die kinetische Analyse des Systems zeigte parabolisches Wachstum und folgte
dem Quadratwurzelgesetzt.
Das erste vollsynthetische Replikationssystem wurde 1992 durch Terfort und von Kiedrowski
beschrieben.[94] Die Assoziation der organischen Reaktionsbausteine erfolgte über
Salzbrücken zwischen einer Amidiniumfunktion und einem Carboxylatrest. Als
Ligationsreaktion wurde die Ausbildung eines Azomethins eingesetzt, wobei ein konjugierter
und damit planarer Templatbaustein entstand. Die Kinetik des selbstreplizierenden Systems
gehorchte auch hier dem Quadratwurzelgesetzt. Durch Modifizierungen des Templats an den
Seitenketten der Aromaten gelang eine schnellere Reaktion und man konnte eine lineare
Abhängigkeit der Produktbildung von der Templat Zugabe beobachten. In diesem Fall kann
man jedoch nicht mehr von einer Selbstreplikation im eigentlichem Sinn sprechen, da das
Reaktionsprodukt mit dem Templat strukturell nicht identisch ist.
Bei den von Sutherland et al.[95] und von Kiedrowski et al.[96] beschriebenen artifiziellen
Replikationssystemen erfolgt die Ligation über eine Diels-Alder-Reaktion zwischen einem
Cyclohexadien und einem Maleinimid, wobei die Assoziation der Reaktionsbausteine über die
Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen in organischen Medien stattfand. Die
autokatalytische Reaktionsordnung lag oberhalb des parabolischen Wachstums (p= 0.85).
Erklärt wurde diese ungewöhnlich hohe Reaktionsordnung über eine verminderte
Produktinhibition, die aus einer schlechteren Assoziation des Templat-Duplexes aufgrund
sterischer Hinderung, verglichen mit dem termolekularen Komplex, resultiert. 2010
beschrieben Diekmann und von Kiedrowski ein artifizielles Replikationssystem, das auf der
Cycloaddition von einem Fulvenderivat mit einem Maleinimid basierte. Das komplexe
Reaktionsnetzwerk wurde durch Kombination von NMR-Spektroskopie und Computer-
simulationen analysiert.[97]
43
1.5 Modell für ein Minimales Chemoton
Ein neues Konzept auf der Grundlage der von Ganti beschriebenen Chemoton Theorie (siehe
Kapitel 1.2.1) wäre die chemische Implementierung eines Minimalen Chemoton Modells
(MCM). Analog dem Chemoton würde das MCM drei stöchiometrisch gekoppelte
Subsysteme enthalten. Die drei Subsysteme wären durch folgende, – zum Chemoton
differierende - spezielle Eigenschaften charakterisiert:
(1) Ein nicht-autokatalytisches metabolisches Subsystem (1) muss einen hohen
Überschuss an reaktiven, energiereichen Ausgangsverbindungen außerhalb eines
Kompartiments erzeugen. Die gebildeten Reaktionsbausteine sollten die Eigenschaft
besitzen sowohl neue Templat- als auch neue Lipidmoleküle - stöchiometrisch
gekoppelt - zu erzeugen (siehe Abbildung 14).
(2) Ein genetisches Subsystem (2), basierend auf einer nicht-enzymatischen
Selbstreplikation von Oligonukleotiden, muss innerhalb eines Kompartiments
ablaufen und die autokatalytische Triebkraft des MCMs darstellen (siehe Abbildung
15).
(3) Das membranbildende Subsystem (3) muss stöchiometrisch an das genetische
Subsystem (2) gekoppelt sein, so dass im Inneren der Kompartimente pro neu
gebildeter internukleotidischer Bindung auch genau ein neues Lipidmolekül
abgespalten wird (siehe Abbildung 15).
Das genetische Subsystem (2) des MCMs sollte auf der Grundlage der von Bülle und
Schöneborn untersuchten nicht-enzymatischen, templatgesteuerten, selbstreplizierenden
Oligonukleotid Systeme basieren, die mittels FRET kinetisch untersucht wurden (siehe
Kapitel 1.4.2).[81] Als Grundlage könnte der [5, 5] – [10] Replikator eingesetzt werden, der
aus zwei modifizierten Desoxyribonukleotiden der Sequenzen Cy5-TTCCGp 3 und
NH2-CGGAA 4, sowie dem komplementären Templat Cy3-TTCCGCGGAA 5 besteht. Ein
derartiger Replikator auf Nukleinsäure-Basis könnte die für das genetische Subsystem
geforderten Eigenschaften der Autokatalyse mit dem notwendigen Informationstransfer
vereinigen und so die Triebkraft für das MCM erzeugen.
44
Die zur Ligation notwendige chemische Energie, die zu einer neuen internukleotidischen
Phosphoramidatbindung zwischen den modifizierten Oligonukleotiden 3 und 4 führen könnte,
sollte über ein wasserlösliches Carbodiimid, wie z.B. EDC 2, bereitgestellt werden und selbst
das metabolische Subsystem (1) des Minimalen Chemoton Modells darstellen. Hierbei würde
das Aktivierungsreagenz als von außen zum System zugegebene Komponente betrachtet
werden (siehe Abbildung 14).
Abbildung 14. Das metabolische Subsystem (1) des MCMs: Schematische Darstellung der EDC-Aktivierung von A´ 3 zu A* und nachfolgende nukleophile Reaktion mit einem Imidazol enthaltenden Lipid L zum phosphorimidazolid-aktivierten Reaktionsbaustein A. Die Imidazolfunktion ist vereinfachend als gelbe Kreisfläche dargestellt, und steht für die hydrophile Kopfgruppe des Lipids L.
Um eine stöchiometrische Kopplung des genetischen- (2) und des membranbildenden
Subsystems (3) zu gewährleisten, erfolgt die Ligation nicht direkt zwischen dem EDC-
aktivierten Baustein A* und dem 5´-Amino-modifizierten Oligonukleotid A´ 4, wie es bei den
untersuchten Selbstreplikationssystemen von Bülle und Schöneborn der Fall war.[81] Hingegen
könnte nach erfolgter EDC-Aktivierung zu A* zuerst eine - ebenfalls energiereiche –
Phosphorimidazolidbindung ausgebildet werden, in der A* nukleophil mit der Imidazol-
funktion des Lipids L zum Reaktionsbaustein A reagiert - dem reaktiven DNA-Lipid
Konjugat.
45
Die Phosphorimidazolid Aktivierung durch das Lipid L in A würde so zu einer
stöchiometrischen Kopplung der Subsysteme (2) und (3) im MCM führen, indem das DNA-
Lipid Konjugat A in einer nicht-enzymatischen, templatgesteuerten Ligation zu einem neuen
Templatmolekül Cy3-TTCCGCGGAA C 5 ligiert (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15. Schematische Darstellung des genetischen Subsystems (2), - stöchiometrisch - gekoppelt an das membranformende Subsystem (3) über eine nicht-enzymatische, templatgesteuerte Ligation.
Durch die spezielle Sequenzwahl und Modifikation der eingesetzten Oligonukleotidbausteine
A und B sollte es in Anwesenheit des Templatmoleküls C zur Ausbildung eines
termolekularen Komplexes ABC kommen. Hierzu würden die zu ligierenden
Reaktionsbausteine A und B in direkte räumliche Nähe gebracht, so dass nach nukleophiler
Reaktion ein neues Templatmolekül C gebildet wird. Die Ausbildung einer neuen, inter-
nukleotidischen Bindung ist damit, durch die spezielle Aktivierung über das Imidazol-Lipid
L, stöchiometrisch an das membranbildende Subsystem (1) gekoppelt, da L als
Abgangsgruppe in der Ligation gebildet wird. Damit würde die Anzahl der als Templat
dienenden Moleküle C verdoppelt, die wiederum in einem neuen Replikationszyklus die
Bildung neuer Templatmoleküle katalysieren. Zusätzlich wäre durch die Farbstoffmarkierung
der Reaktionsbausteine die Detektion der Ligation mittels FRET - analog den Arbeiten von
Bülle und Schöneborn - möglich.[83, 98]
46
Die Kombination aller Subsysteme (1), (2) und (3) führt zu einem MCM, das aus fünf
verschieden Reaktionskomponenten aufgebaut ist: das 3’-Phosphat-Oligonukleotid A´ 3, das
Carbodiimid EDC 2, das Imidazol-Lipid L, das 5’-Amino-modifizierte Oligonukleotid B 4
und das Templatmolekül C 5.
Die Kombination aller drei Subsysteme (1) bis (3) zu einem MCM, ist in Abbildung 16
schematisch dargestellt:
Abbildung 16. Schematische Darstellung des MCMs mit 5 Komponenten (2, 3, 4, 5 und L).
47
Als Kompartimente sollen große Vesikel (GUV) dienen, die aus Imidazol-Lipiden L
aufgebaut und mit Templatmolekülen C befüllt sind. Die Template C dienen zur
templatgesteuerten Ligation, die - im Idealfall – nur im Inneren der Imidazol-Vesikel abläuft.
Um die stöchiometrische Kopplung des genetischen- (2) und membranbildenden (3)
Subsystems zu gewährleisten, muss die Anzahl der Templatmoleküle C gleich der Anzahl der
membranbildenden Imidazol-Lipide L im Vesikel sein.
Die Bereitstellung der phosphorimidazolid-aktivierten Bausteine A soll außerhalb des
Imidazol-Vesikels in einem nicht-autokatalytischen, metabolischen Subsystem (1) erfolgen,
um das System stetig mit einem hohen Überschuss an „energiereichen“ Ausgangsmolekülen
zu versorgen. Aufgrund der komplementären Sequenzen der Reaktionsbausteine A und B
würde es durch Basenpaarung außerhalb des Imidazol-Vesikles zur Ausbildung der Duplexe
AB kommen. Die Duplexe AB würden aufgrund der hydrophoben Alkylketten des DNA-
Lipid Konjugats A mizellare Strukturen im wässrigen Medium ausbilden und daher bevorzugt
mit der äußeren Membran der in der Lösung befindlichen Imidazol-Vesikel wechselwirken.
Denkbar ist dann - z.B. über einen Flip-Flop Mechanismus – die Durchquerung der Membran.
Damit lägen alle zur Ligation notwendigen Reaktionspartner innerhalb des Kompartiments
vor. Nach Ausbildung des termolekularen Komplexes ABC würde der phosphorimidazolid-
aktivierte Reaktionsbaustein A unter Freisetzung eines Imidazol-Lipids L mit dem 5`-Amino-
modifizierten Oligonukleotid B zu einem neuen Templatmolekül C ligieren. Das
stöchiometrisch bei der Ligation freigesetzte Lipid L würde nach dem Einbau in die Membran
zu einer Vergrößerung des Vesikels führen.
Durch Fluoreszenzfarbstoff-Markierung der einzelnen Oligonukleotidbausteine (A und C) mit
den korrespondierenden Cyaninfarbstoffen Cy 3 und Cy 5 - in Analogie zu den
Untersuchungen von Bülle[83] und Schöneborn[98] – könnte die Ligation im Inneren der
Vesikel mittels FRET untersucht werden: Sowohl der neu gebildete FRET-aktive Duplex C2,
als auch der termolekulare Komplex ABC würden ein charakteristisches FRET-Signal zeigen
(in Abbildung 16 durch die blaue Untermalung der Imidazol-Vesikel angedeutet), das mittels
eines Fluoreszenzmikroskops – bei ausreichender Größe der Vesikel - zu detektieren sein
sollte. Im Idealfall sollten nur im Inneren der Imidazol-Vesikel Templatmoleküle C
vorhanden sein, und das FRET-Signal auch nur im Inneren der Imidazol-Vesikel auftreten.
Durch die stöchiometrische Kopplung des genetischen- (2) und membranbildenen (3)
Subsystems und der damit verbundenen Freisetzung neuer Imidazol enthaltender Lipide L im
Inneren der Vesikel käme es bei Einbau in die Membran zur Vergrößerung (Wachstum) der
Imidazol-Vesikel und in der Folge zu einer möglichen Teilung.
48
2 Aufgabenstellung
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung der verschiedenen Einzelschritte
zur chemischen Implementierung des in Kapitel 1.5 beschriebenen Konzepts zum Minimalen
Chemoton Modell. Dieses Konzept sollte experimentelle Ansätze zu einem neuen Protozell-
Modell (oder auch Vorläuferprotozell-Modell) eröffnen, das durch die drei stöchiometrisch
gekoppelten Subsysteme, dem metabolischen (1)-, membranformenden (2)- und genetischen
(3), charakterisiert ist. Aufgrund der Komplexität des heterotrophen1 MCMs und den damit
verbundenen individuellen Eigenschaften der zu kombinierenden Subsysteme, sollten die
Subsysteme (1) bis (3) separat, d.h. abgekoppelt voneinander - umgesetzt und untersucht
werden, um anschließend die Zusammenführung zu einem MCM abschätzen zu können (siehe
Abbildung 16). Es sollte ein möglichst breiter synthetischer Spielraum zur gezielten
Abstimmung notwendiger strukturspezifischer und damit chemischer Eigenschaften der
Reaktanden eröffnet werden, um damit deren im Detail sehr individuelle Eigenschaften in
Bezug auf Aggregations- und Löslichkeitsverhalten - und damit verbunden auch auf deren
Reaktivität im wässrigen Medium -, steuern zu können.
2.1 Synthese von Catalipiden
Im Rahmen des PACE-Projekts wurden Catalipide als Amphiphile definiert, deren hydrophile
Kopfgruppe durch eine katalytische Gruppe, z.B. eine Imidazolfunktion ausgebildet ist. Die
Imidazolfunktion übt einen maßgeblich Einfluss auf die chemischen und physikalischen
Eigenschaft dieser Substanzklasse aus: In chemischen Reaktionen kann sie sowohl als Säure-
Base Katalysator als auch als nukleophiler Katalysator wirken. Daher die Bezeichnung
„Catalipid“, vom englischen catalyse und lipid.
Es sollten chemisch und strukturell unterschiedliche Catalipide synthetisiert werden, um ihre
Eignung zur Erfüllung der definierten Anforderungen der Subsysteme des MCMs zu
evaluieren.
2.2 Membranformendes Subsystem (3) des MCMs: Selbstorganisation von Catalipiden
zu Catalipid-Vesikeln
Das in dieser Arbeit verfolgte Konzept des MCMs setzt die Selbstorganisation von
Catalipiden zu einem Kompartiment voraus. Supramolekulare Aggregate in Form von GUV
49
stellen potentielle Kompartimente für die geplanten Experimente zur Untersuchungen des
MCMs dar. Hierzu sollten aus den synthetisierten Catalipiden unterschiedlicher Struktur
geeignete Kandidaten mit den gewünschten chemischen und physikalischen Eigenschaften
ausgewählt werden, die im wässrigen Medium GUV ausbilden können, in denen die
Subsysteme (2) und (3) - stöchiometrisch gekoppelt - ablaufen können.
2.3 Metabolisches Subsystem (1): Herstellung von Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugaten
Zur chemischen Implementierung des Konzepts zum MCM ist die Realisierung eines nicht
autokatalytischen, metabolischen Subsystems (1) erforderlich. Die hierzu notwendigen
reaktiven DNA-Catalipid Konjugate A sollen durch die kovalente Verknüpfung der Phosphat-
gruppe des einzusetzenden 3`-terminal-phosphorylierten Cy5-TTTCCGp Oligo-
nukleotids A´ 3 2 und der Kopfgruppe eines entsprechenden Catalipids L hergestellt werden.
Hierzu muss eine geeignete Synthesestrategie entwickelt werden, die die kovalente
Verknüpfung des hydrophilen Oligonukleotids mit dem – ausgewählten - lipophilen Catalipid
ermöglicht.
2.4 Genetisches Subsystem (2): Ligation des Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugats A mit
dem 5’-Amino modifizierten Oligonukleotid NH2-CGGAA B 4
Das genetische Subsystem (2) des MCMs soll über die Ligation zwischen einem reaktiven
Catalipid-Cy5-TTCCG Konjugat A und dem 5`-Amino-modifizierten Oligonukleotid
NH2-CGGAA B 4 unter Ausbildung einer Phosphoramidat-bindung realisiert werden, so dass
ein neues Templatmolekül C 5 gebildet wird (siehe Abbildung 15).2
2.5 Kombination der Subsysteme (1) bis (3) zum MCM
Aus den erarbeiteten Ergebnissen der separat untersuchten Subsysteme (1) bis (3) sollten
geeignete Ansätze erarbeitet werden, die eine Kombination zu einem MCM aufzeigen, bzw.
Möglichkeiten zu vereinfachten Reaktionsmodellen eröffnen, bei denen möglichst die
Kopplung der Subsysteme (1) bis (3) im Vordergrund steht.
2 Die modifizierten Oligonukleotid Bausteine 3, 4 und 5 standen für diese Arbeit in ausreichender Menge zu
Verfügung. Synthesevorschriften befinden hierzu in den Arbeiten von Bülle und Schöneborn.[83, 98]
50
3 Chemische Implementierung des Minimalen Chemoton Modells
3.1 Herstellung von strukturvielfältigen Catalipiden
3.1.1 Lipide
Lipide (griechisch lipos, „Fett“) ist ein allgemeiner Sammelbegriff für ganz oder zumindest
größtenteils wasserunlösliche Naturstoffe. Sie gehören zur Substanzklasse der Amphiphile
(griechisch „beide liebend“) und verfügen über einen hydrophilen als auch einen lipophilen
Teil im gleichen Molekül.
Eine Einteilung der Lipide ist aufgrund ihrer chemischen Struktur in sieben Gruppen möglich:
Fettsäuren, Triacylglyceride (Fette und Öle), Wachse, Phospholipide, Sphingolipide,
Lipopolysaccharide und Isoprenoide (Steroide, Carotinoide etc.).
In der Biologie dienen Fette als Speicherform für Energie. Wachse bilden schützende
Oberflächenschichten, die Glycerinphospholipide und Sphingolipide sind am Aufbau der
Biomembranen beteiligt, andere Lipide fungieren als Vitamine und Hormone. Einige können
auch mit Proteinen sog. Lipoproteine bilden, wird ein Komplex mit einem Zucker gebildet,
spricht man Glykolipiden.
Lipide sind grenzflächenaktive Substanzen und können sich in einem Dispersionsmedium
(meist Wasser) spontan geordnet zusammenlagern. Diese Selbstaggregation kann zu
mizellaren oder vesikulären Strukturen führen, es sind aber auch andere Morphologien
bekannt, deren Ausbildung in erster Linie von der Struktur des Lipids, aber auch von den
äußeren Reaktionsbedingungen abhängen (siehe Kapitel 3.2).
3.1.2 Festphasensynthese von Catalipiden
Zur chemischen Implementierung des in der Aufgabenstellung beschriebenen Minimalen
Chemoton Modells war die Synthese strukturvielfältiger Catalipide essentiell. Es ist bekannt,
dass die Herstellung von Lipiden in flüssiger Phase problematisch sein kann: Neben der
aufwendigen Aufreinigung einzelner Zwischenprodukte, die gerade bei mehrstufigen
Synthesesequenzen besonders ins Gewicht fällt, wurde vor allem von der unzureichenden
Löslichkeit der amphiphilen Moleküle in der Reaktionslösung berichtet.[99-101] Durch
Selbstaggregation können die reaktiven Zentren der Lipide - mehr oder weniger - abgeschirmt
in der Reaktionslösung vorliegen, abhängig von der Polarität des Lösungsmittels und der
51
Struktur des Moleküls. Dies kann zu schlechteren Ausbeuten bis hin zu nicht durchführbaren
Reaktionsschritten in der Lipid Synthese in flüssiger Phase führen. Ein Möglichkeit dieses
spezielle Syntheseproblem zu umgehen, liegt in der Verwendung der Festphasensynthese, die
1963 von Merrifield zur Darstellung von Peptiden entwickelt wurde.[102] Das Verfahren
basiert auf der Verwendung eines unlöslichen polymeren Trägermaterials, an das über einen
Linker der erste Synthesebaustein der Zielverbindung kovalent gebunden wird. In folgenden
Reaktionsschritten werden suksessiv weitere Synthesebausteine an den vorherigen Baustein
gekoppelt, bis die gewünschte Zielsequenz erreicht ist. Abschließend wird das Zielmolekül
durch geeignete Reagenzien von der Festphase abgespalten.
Die Festphasensynthese wird mittlerweile zur Synthese von Polypeptiden, anderen
Biopolymeren wie Nukleinsäuren oder auch nichtoligomeren organischen Verbindungen
eingesetzt.[103]
Zu den Vorteilen der Festphasensynthese zählen einerseits zumeist quantitative Ausbeuten,
die durch Verwendung hoher Überschusse des jeweiligen Kopplungspartners und / oder
dessen Mehrfachkopplung an die endständigen Bausteine erreicht werden. Andererseits
entfällt eine aufwendige Isolierung möglicher Zwischenprodukte durch einfaches Waschen
der fixierten Reaktionsprodukte nach jedem Kopplungsschritt. Auch werden mögliche
Aggregationen der Zwischenprodukte durch die kovalente Verknüpfung an das Träger-
material verhindert, welches einen besonderen Vorteil für die gezielte Synthese amphiphiler
Moleküle bietet. Durch den modularen Aufbau des Moleküls an der festen Phase sind breite
Variationsmöglichkeiten in der Multistep-Synthese gegeben. Nachteile der Festphasen-
synthese liegen in der eingeschränkten Wahl der Reaktionsbedingungen und Reagenzien, die
zu dem eingesetzten Trägermaterial, einschließlich des verwendeten Linkers, kompatibel sein
müssen. Zudem sind die Synthesekosten zur Herstellung größerer Substanzmengen im
Vergleich zur Flüssigphasensynthese höher, aufgrund der zum Teil sehr teuren Festphasen.
Die Orthogonalität der eingesetzten Schutzgruppen muss während der gesamten Synthese
sichergestellt sein, um sowohl einen vorzeitigen Syntheseabbruch, als auch Nebenreaktionen
zu vermeiden. Auch ist die Verfolgung des Reaktionsfortschritts „online“ an der festen Phase
schwierig, kann aber durch FT-IR und HRMAS-NMR (High Resolution Magic Angle
Spinning) Techniken durchgeführt werden.[126-128] Das verwendete Festphasenmaterial zur
Synthese organischer Verbindungen ist in der Regel eine Copolymer aus Styrol und 1 bis 2 %
Divinylbenzol und wird in Form kleiner Kügelchen eingesetzt. Das Trägermaterial quillt in
polaren aprotischen Lösungsmitteln um ein Vielfaches seines Volumens auf. Dem
schlechteren Quellverhalten in Alkanen, acyclischen Ethern, Alkoholen und Wasser kann
52
durch den Zusatz von Cosolventien begegnet werden. Durch Diffusion wird den gelösten
Kopplungsreagenzien so der Zugang ins Innere der Harzkugel ermöglicht. Die Reaktion
findet nicht nur auf der Oberfläche, sondern auch im Inneren der Polymermatrix statt,
abhängig vom Grad der Vernetzung des Polymers.[129, 130]
Zu Begin der Festphasensynthese wird der erste Synthesebaustein mittels sog. Linker
kovalent an das Träger-material gebunden. Linker sind bifunktionale Moleküle, die über die
eine Funktionalität fest an das chemisch modifizierte Polymer gebunden werden, während die
andere der reversiblen Verknüpfung mit dem Substrat dient. Auf der einen Seite müssen die
Linker-Bindungen innerhalb des Syntheseverlaufs stabil bleiben, auf der anderen muss die
Abspaltung des Zielmoleküls von der Festphase unter milden Reaktionsbedingungen erfolgen
können. Kommerziell sind verschiedene Trägermaterialen erhältlich, die durch chemische
Modifikationen auf spezielle Reaktionsbedingungen zugeschnitten sind.[104] Damit ist eine
geeignete Abspaltung des Syntheseproduktes vom Polymer, z.B. sauer, basisch, enzymatisch,
photochemisch etc., möglich.
Zur chemischen Implementierung des Minimalen Chemoton Models sollten Catalipide
variierender Strukturen über die Festphasensynthese hergestellt werden, um von den
beschriebenen Vorteilen des Verfahrens zu profitieren. Um die gewünschten chemischen und
physikalischen Eigenschaften der Catalipide entsprechend der Aufgabenstellung hinsichtlich
der Ligation über reaktive DNA-Catalipid Konjugate, sowie der Ausbildung supra-
molekularer Aggregate in Form von GUV zu überprüfen, sind nur geringe Substanzmengen
notwendig. Dies erlaubt die Verwendung der Festphasensynthese, die so einen einfachen
Zugang zu einer „Substanzbibliothek“ mit größtmöglicher struktureller Diversität ermöglicht.
Über die Multistep-Synthese ist sowohl eine einfache Variation der Hydrophilie der
Kopfgruppen, als auch der Hydrophobie über die eingeführten Alkylketten möglich. Zudem
ist die Einführung zusätzlicher funktionaler Gruppen, wie z.B. L-Serin als weiterer
Verzweigungspunkt, leicht möglich („Spacer“, siehe 3.1.8.1). Neben Löslichkeitsproblemen,
die bekannter Weise bei der Synthese in flüssiger Phase auftreten können, verursacht durch
die Selbstaggregation amphiphilen Reaktanden, wird die aufwendige Isolierung und
Aufreinigung der Zwischenprodukte durch die Festphasensynthese vermieden. Zur Catalipid
Synthese wurden unterschiedliche Imidazol enthaltende Moleküle als Grundgerüste
ausgewählt, die neben der Imidazolfunktion weitere funktionelle Gruppen besitzen, um durch
geeignete chemische Syntheseverfahren die Einführung langer Alkylketten zu ermöglichen.
Die chemische Struktur des Grundgerüsts bestimmt somit direkt den Charakter der
hydrophilen Kopfgruppe, als auch die räumliche Anordnung der einzuführenden Alkylketten.
53
NNH
NH2
OH
O
NHN
NH2NHN
NHN
OHNH2
NH
O
NHN
OH
PG1
NH2
O
NHN
PG2
Imidazolfunktionals hydrophile Kopfgruppe
hydrophobeAlkylketten
L-Histidin Histamin L-Histidinol
ausgewählte Grundgerüste zur Catalipid Synthese
(über die freie Amino- oder Carboxylfunktion ist die Einführung langer Alkylketten gegeben)
6 7 8
Abbildung 17. Schematische Darstellung der ausgewählten Grundgerüste zur Festphasensynthese strukturvielfältiger Catalipide.
Als Grundgerüste setzte man die Aminosäure L-Histidin 6, das Histamin (2-(Imidazol-4-yl)-
ethyl-amin) 7, als auch das L-Histidinol 8 ein, um so den synthetischen Zugang zu möglichst
strukturvielfältigen Catalipiden zu ermöglichen.
Über die Nα-Amino- und Carboxylfunktion des L-Histidins 6 ist eine gezielte Einführung
chemisch modifizierter Alkylketten unterschiedlicher Länge und Struktur möglich. Durch die
Verwendung geeigneter orthogonaler Schutzgruppen kann darüber hinaus selektiv die die
Carboxylfunktion (PG1) oder die Nα-Amino- (PG2) adressiert werden.
Als variierendes Strukturmotiv diente das Histamin 7, das neben der Imidazolfunktion (Nim)
eine aliphatische Nα-Aminogruppe als Funktionalität besitzt, über die eine gezielte
Einführung chemisch modifizierter Alkylketten möglich sein sollte.
54
Durch die Verwendung des L-Histidinol 8 als Grundgerüst sollte zudem die Synthese sog.
Cata-Phosphoglyceride ermöglicht werden, strukturverwandt mit natürlich vorkommenden -
membranbildenden - Phosphoglyceriden (siehe 3.1.9).
Die Syntheserichtung der Catalipide an der festen Phase wurde vom hydrophilen Ende, der
Imidazolfunktion, zum hydrophoben hin, gewählt.
3.1.3 Auswahl einer geeigneten Festphase zur Catalipid Synthese
Zur geplanten Festphasensynthese der Catalipide wurde eine funktionalisierte Festphase
ausgewählt, die eine kovalente Verknüpfung der Imidazolfunktion mit dem Trägermaterial
ermöglicht. Da in der Peptidchemie Schutzgruppen des Trityl-Typs eine breite Anwendung in
der Blockierung des Imidazols von L-Histidin finden, lag es Nahe, eine Trityl-Festphase zu
suchen, die zu den geplanten Synthesestrategien kompatibel ist.[105]
Geeignet erwies sich die 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9 (siehe Abbildung 18), die sich
durch gute Beladungseigenschaften von Imidazol-Derivaten auszeichnet.[106]
Cl
ClClP =
9
Abbildung 18. 2-Chlorotritylchlorid Festphase 9.
Die Immobilisierung erfolgt durch die nukleophile Reaktion des Imidazols mit dem
2-Chlorotritylchlorid-Linker. Unter sauren Reaktionsbedingungen - durch Behandlung mit
verdünnter Trifluoressigsäure (TFA) in organischen Lösungsmitteln - ist die Abspaltung der
Zielverbindung möglich.
55
3.1.4 Herstellung L-Histidin beladener Festphasen
Zur Festphasensynthese Struktur variierender Catalipide mit L-Histidin 6 als Grundgerüst
sollte zuerst eine L-Histidin beladene 2-Chlorotritylchlorid-Festphase hergestellt werden, mit
ungeschützter Nα-Amino- und Carboxylfunktion. Nach der Immobilisierung des L-Histdins 6
sollte dann die „postsynthetische“, selektive Einführung geeigneter Schutzgruppen (PG1 und
PG2) getestet wurden.
3.1.4.1 Synthese der L-Histidin-Festphase 11
Zur nukleophilen Reaktion der Imidazolfunktion des L-Histidins 6 mit dem 2-Chlorotrityl-
chlorid Linker der Festphase 9 verwendete man eine Reaktionsvorschrift zur selektiven
Seitenketten-Tritylierung des L-Histidins 6 (siehe Abbildung 19).[107] Die simultane
Blockierung der Nα- und Carboxylfunktion erfolgte über die Ausbildung des (nicht zu
isolierenden) cyclischen Dimethylsilyl-Derivats 10, durch Reaktion des L-Histidins 6 in
siedendem Dichlormethan mit Dichlorodimethylsilan. Ohne weitere Aufarbeitung der
Zwischenstufe 10 wurde nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zugabe von Triethylamin
(TEA) ein Überschuss der Festphase 9 hinzugegeben. Die Abspaltung der Dimethyl-
silylgruppe erfolgte durch Behandlung mit einer Lösung aus Dichlormethan,
Diisopropylethylamin (DIPEA) und Methanol, wobei gleichzeitig die nicht abreagierten
Tritylchlorid Gruppen des Linkers zu den korrespondierenden inerten Tritylethern umgesetzt
werden.
NH2
OH
O
NHN
ClMe2SiCl2
CH3OH
SiMe2NH
O
O
NHN
O
OH
NH2
NNSiMe2N
H
O
O
NN
Me2Si(OCH3)2
TEA
+
10
11
9
6
Abbildung 19. Herstellung der L-Histidin-Festphase 11.
Die erfolgreiche Immobilisierung des L-Histidins über die Imidazolfunktion wurde durch
einen positiven Kaisertest bestätigt.[107] Hierzu wurden zu der mit Ethanol gewaschenen
56
L-Histidin-Festphase 11 einige Tropfen einer Lösung aus Ninhydrin und Phenol in Ethanol
und eine Lösung aus Kaliumcyanid in Pyridin gegeben, gut vermischt und erhitzt. Die
Blaufärbung zeigte die Anwesenheit freier Aminofunktionen an.
3.1.4.2 Synthese der Nα-Fmoc L-Histidin-Festphase 16
Zur selektiven Blockierung der Nα-Aminofunktion des immobilisierten L-Histidins (Festphase
11) setzte man die im Basischen abspaltbare 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)
Schutzgruppe ein, die über ihr Säurechlorid (Fmoc-Cl) oder auch ihr Succinimid (Fmoc-
Osu 13) eingeführt werden kann. Diese sollte eine selektive Adressierung der Carboxyl- und
Nα-Aminofunktion des an der Festphase gebundenen L-Histidins ermöglichen.
Die bereits mit L-Histidin beladene Festphase 11 wurde hierzu in einem Gemisch aus Dioxan
und DIPEA in Anwesenheit Fmoc-Cl suspendiert. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden
bei Raumtemperatur konnte jedoch keine vollständige Blockierung der Nα-Aminofunktion des
L-Histidins beobachtet werden. Auch die Verwendung von Fmoc-Osu 12 als Acylierungs-
mittel, sowie eine Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 40 ºC zeigte nicht die vollständige
Blockierung. Zur Herstellung einer Nα-Fmoc-L-Histidin beladenen Festphase sollte daher
zunächst das Nα-Fmoc geschützte L-Histidin 15 synthetisiert werden, um dieses dann
nachfolgend an die 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9 zu binden.
Um eine selektive Blockierung der Nα-Aminofunktion des L-Histidins zu ermöglichen, muss
im ersten Reaktionsschritt die Imidazolfunktion mit einer zur Fmoc-Gruppe orthogonalen
transienten Schutzgruppe blockiert werden (siehe Abbildung 20). Hierzu fand die
Synthesestrategie analog zur direkten Immobilisierung des L-Histidins 6 Anwendung.[106] In
einer Eintopfreaktion wurde das L-Histidin 6 mit Dichlorodimethylsilan in Dichlormethan
suspendiert. Das entstehende cyclische Dimethylsilyl-Derivat 11 blockiert gleichzeitig die Nα-
und die Carbonsäurefunktion, so dass die anschließende Reaktion mit Tritylchlorid zur
selektiven Blockierung der Imidazolfunktion führt.
57
Nachdem die Dimethylsilyl Schutzgruppe durch Zugabe von Methanol entfernt wurde, konnte
das Nim-Trityl geschützte L-Histidin 13 in 73 % iger Ausbeute erhalten werden.
NHN
OH
O
NH2
Me2SiCl2 Trt-Cl
CH3OHN
N
O
OH
NH2
SiMe2NH
O
O
NHN
SiMe2NH
O
O
NN
TEA
13 73 %
6 10
Abbildung 20. Synthese des Nim-Trityl-L-Histidins 13.
Die anschließende Blockierung der Nα-Funktion des Nim-Trityl-L-Histidins 13 wurde durch
die Reaktion mit Fmoc-Osu 12 in einem Gemisch aus Dioxan und 10 % iger wässriger
Na2CO3 Lösung durchgeführt (siehe Abbildung 21).
NN
O
OH
NH2Na2CO3 in H2O
Dioxan
Cl
NH
O O
NN
O
OH
NH
O O
NHN
O
OHNH
O O
O
OHNN
N
O
O
O
O
+
TFA
90% DIPEA
1213 14
15 1639 %
88 %
70 %
9
Abbildung 21. Synthese von Nα-Fmoc-L-Histidin 14 und nachfolgende Immobilisierung an die 2-Chlorotrityl-chlorid-Festphase 9. Das Fmoc-Osu 12, das sich im Vergleich zu Fmoc-Cl als das bessere Acylierungsmittel
erwies, wurde aus diesem durch Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid in 88 % iger Ausbeute
hergestellt. Die abschließende Detritylierung der Imidazolfunktion von 14 wurde durch
95 % ige TFA bewirkt und nach chromatographischer Aufreinigung konnte das Nα-Fmoc-L-
58
Histidin 15 in 70 % iger Ausbeute isoliert werden. Die abschließende Immobilisierung von 15
erfolgte durch die nukleophile Addition an die 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9 mit nur 0.9
Äquivalenten DIPEA als Base, die zur Neutralisation des entstehenden Chlorwasserstoffs
eingesetzt wurde. Der während der Reaktion entstehende Chlorwasserstoff wird dadurch nicht
vollständig neutralisiert und so wird unter den leicht sauren Reaktionsbedingungen die
ungewollte nukleophile Reaktion der Carboxylfunktion des Nα-FmocL-Histidins 15 mit der
Festphase 9 zurückgedrängt.[105] Zur Bestimmung der Beladung der Fmoc-L-Histidin-
Festphase 16 wurde eine geringe Menge abgewogen und zur Abspaltung der Fmoc-
Schutzgruppe mit einer 20 % igen Lösung von Piperidin in DMF versetzt. Die
baseninduzierte Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgt über eine β-Eliminierung. Das
eingesetzte Piperidin dient nicht nur als Base, sondern fängt auch das entstehende
Dibenzofulven 17 (zu 17a) ab, um dessen ungewünschte Reaktion mit der jetzt freien
Nα-Aminofunktion zu verhindern (siehe Abbildung 23). Die Beladung der Fmoc-L-Histidin-
Festphase 16 wurde UV-spektrometrisch über das Dibenzofulven-Piperidin Addukt 17a
bestimmt und lag bei 624 μmol / g (39 % der Theorie).
3.1.4.3 Synthese der L-Histidinmethylester-Festphase 19
Um eine selektive Adressierung der Nα-Position gegenüber der Carboxylfunktion des
immobilisierten L-Histidins zu ermöglichen, wurde der L-Histidinmethylester 18 an die
2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9 gekoppelt (siehe Abbildung 22). Hierzu löste man diesen in
absolutem DMF und verwendete nur 0.9 äquivalente DIPEA. Durch den Reaktionsverlauf
vom Basischen ins leicht Saure Reaktionsmilieu wird durch Protonierung der Nα-
Aminogruppe (pKa 9.17[108]) eine unerwünschte Reaktion mit der Festphase 9
zurückgedrängt. Die erfolgreiche Immobilisierung des L-Histidinmethylesters 18 über die
nukleophile Addition der Imidazolfunktion an die Tritylchlorid-Festphase konnte durch einen
positiven Kaisertest[107] bestätigt werden.
NHN
O
O
NH2
NN
O
O
NH2
Cl
90% DIPEA18 19 36 %
9
Abbildung 22. Immobilisierung des L-Histidinmethylesters 18 auf die 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9.
Die quantitative Bestimmung der Beladung der L-Histidinmethylester-Festphase 19 erfolgte
indirekt durch Kopplung von Fmoc-L-Serin 46 (siehe 3.1.8.1, Festphase 47). Nach
59
baseninduzierter Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde die Beladung UV-spektro-
metrisch zu 0.576 mmol / g (36 % der Theorie) bestimmt.
3.1.5 Histamin-Festphase 21
Die Synthese von Catalipiden mit Histamin als Grundgerüst sollte an der kommerziell
erhältlichen Nα-Fmoc-Histamin-Festphase 20 durchgeführt werden. Nach baseninduzierter
Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe ist die primäre Aminofunktion der Festphase 21 zum
modularen Aufbau von Catalipiden zugänglich (siehe Abbildung 23). Die Beladung wurde
UV-spektrometrisch zu 0.5 mmol / g bestimmt.
Piperidin
DMF
ON
N
NH
O
NN
NH2
Piperidin
CO2
N
20
+ +
17
17a
21
Abbildung 23. 2-Chlorotrityl-Fmoc-Histamin-Festphase 20 und anschließende baseninduzierte Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe zur Histamin-Festphase 21.
60
3.1.6 Übersicht der L-Histidin- und Histamin-Festphasen zur Synthese von Catalipiden
In Abbildung 24 sind die vorbeladenen Festphasen gezeigt, die zum modularen Aufbau
strukturvielfältiger Catalipide eingesetzt werden sollten. Durch den Einsatz von orthogonalen
Schutzgruppen ist die selektive Ansteuerung der funktionellen Gruppen des immobilisierten
L-Histidins (Festphase 16 und 19) möglich; die Verwendung der Histamin-Festphase 21
ermöglicht zusätzlich die Synthese von Catalipiden mit einer unterschiedlich polaren
Kopfgruppe.
O
NH
O
NN
O
OH NN
O
O
NH2
NN
NH2NN
O
OH
NH2
11 16 19 21
Abbildung 24. Übersicht der L-Histidin-Festphasen 11, 16, 19 und der Histamin-Festphase 21.
3.1.7 Synthese symmetrischer Catalipide auf Basis von L-Histidin und Histamin durch
reduktive Aminierung[109]
Die Festphasensynthese symmetrischer Lipide, die sich durch zwei identische Alkylketten im
Molekül auszeichnen, kann über die reduktive Aminierung erfolgen. Dieses Verfahren wurde
bereits von Lenßen in einem ähnlichen Zusammenhang bei der Synthese kationischer
Transfektionslipide mittels Festphasensynthese erfolgreich angewendet.[100] Hierbei reagieren
langkettige Aldehyde mit primären oder sekundären Aminofunktionen in Gegenwart des
Reduktionsmittels Natriumtriacetoxyborhydrid (Na(OAc)3BH) 22.[109]
Zur Synthese strukturvielfältiger Catalipide setzte man zunächst die vorbeladenen Festphasen
(11, 19 und 21, siehe Abbildung 24) mit einer frei zugänglichen Aminofunktion ein. Die
Polarität und Struktur, sowie die Wahl der Alkylkettenlänge bestimmen direkt die
unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften der hergestellten Lipide und damit die
Möglichkeiten zur Bildung geeigneter Catalipid-Vesikel.
Am Beispiel der L-Histidinmethylester-Festphase 19 wird – stellvertretend für die anderen
eingesetzten Festphasen 11 und 21 - die Durchführung der reduktive Aminierung an der
Festphase beschrieben: Die Festphase 19 wurde in einer Mischung von absolutem DMF und
Dichlormethan vorgequollen und mit einem langkettigen Aldehyd (hier: Hexadecanal 23) in
61
zehnfachem Überschuss in Gegenwart des Reduktionsmittels Na(OAc)3BH 22 umgesetzt
(siehe Abbildung 25).[109] Das Hexadecanal 23 wurde zuvor durch Swern Oxidation mit
P2O5 / DMSO aus dem entsprechenden Alkohol Hexadecanol und anschließender
chromatographischer Aufreinigung in 67 % iger Ausbeute erhalten.[110]
C15H31
O
H
P2O5 / DMSO
C16H33OH
Na(OAc)3BH
CH2Cl2, DMF
NHN
O
O
NC16H33C16H33
TFA, TES
CH2Cl2
NN
O
O
NH2 NC16H33 C16H33
NN
O
O+
67%
24
2319
88 %
Abbildung 25. Synthese des Catalipids 24 durch reduktive Aminierung. Das Reaktionsprodukt wurde mit einem Gemisch aus Trifluoressigsäure, Dichlormethan und
Triethylsilan (TES) von der Festphase abgespalten.
Generell ist die Abspaltung immobilisierter Imidazol-Derivate von 2-Chlorotrityl-Festphasen
mit 5 % iger TFA schneller als mit 65 % iger, die normalerweise zur Abspaltung anderer
(nicht über die Imidazolfunktion gebundene) immobilisierter Moleküle verwendet wird. Dies
deutet auf ein Gleichgewicht zwischen Abspaltung und Immobilisierung hin. Durch TES wird
25 dem Gleichgewicht entzogen und die Reaktion zum gewünschten, abzuspaltenden
Imidazol-Derivat 26 hin verschoben. Eine Nebenreaktion des TES mit der TFA führt zur
Wasserstoffentwicklung (siehe Abbildung 26).[105]
CF3CO2H Et3SiH CF3CO2SiEt3
NN
RCF3CO2H NH
NR
Et3SiHH CF3CO2SiEt3
OCOCF3
OCOCF3
+ H2+
+
+
25 26
Abbildung 26. Gleichgewichtsreaktion der Abspaltung und simultaner (Re)-Immobilisierung von Imidazol-Derivaten an 2-Chlorotrityl-Festphasen.
62
Die Charakterisierung von 24 erfolgte mittels ESI- und MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
Die Synthese weiterer, symmetrischer Catalipide mit L-Histidin- und Histamin-Grundgerüst
wurde analog der beschriebenen Synthese des Catalipids 24 mittels der reduktiven
Aminierung an der festen Phase durchgeführt. Die eingesetzten Mengen der vorbeladenen
Festphasen, der verwendete Aldehyd, die Ausbeuten und die Charakterisierungsmethode sind
in Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2. Festphasensynthese symmetrischer Catalipide durch reduktive Aminierung.
Festphase Aldehyd Catalipid Ausbeute Charakterisierung
NN
O
O
NH2 Einwaage:
50 mg Festphase 19
Beladung: 576 µmol / g
H
O
C15H31 23
NHN
O
O
NC16H33C16H33
24
15.6 mg (25.3 μmol,
88 % der Theorie)
ESI-MS
MALDI-TOF MS
NN
O
OH
NH2 Einwaage:
50 mg Festphase 11
H
O
C15H31 23
NHN N
H33C16 C16H33
O
OH
27
16.4 mg (27.2 μmol,
85 % der Theorie)
ESI-MS
MALDI-TOF MS
NN
NH2
Einwaage:
100 mg Festphase 21
Beladung: 500 µmol / g
O
H C7H15 30
NHN
NC8H17
C8H17
„Modell-Catalipid“
28
14.9 mg (44.5 μmol,
89 % der Theorie) ESI-MS
NN
NH2
Einwaage:
50 mg Festphase 21
Beladung: 500 µmol / g
H
O
C15H31 30
NHN
NC16H33
C16H33
29
11.9 mg (21.3 μmol,
85 % der Theorie) ESI-MS
Die Strukturvariation der polaren Kopfgruppe verbunden mit den Alkylkettenlängen sollten
Aufschluss über das Aggregationsverhalten der synthetisierten Catalipide in wässriger Lösung
geben. Es ist zwar bekannt, dass diejenigen mit relativ kurzen Alkylketten (< C10) wie im
hydrophoben Molekülabschnitt des Catalipids 28 keine stabilen Überstrukturen im Form von
Vesikeln ausbilden.[111] Dieses „Modell-Catalipid“ 28 wurde jedoch speziell für erste
Konjugationsexperimente mit modifizierter DNA synthetisiert (vergl. Kapitel 3.3.1), um
zunächst mit ausreichender Hydrophilie eine Testmöglichkeit der notwendigerweise im
Wässrigen zu vollziehenden DNA-Catalipid Konjugat Synthesen zu erschließen.
63
3.1.8 Synthese von komplexen Catalipiden auf Basis von L-Histidin und Histamin durch
Peptid-Kopplungsreaktionen
Da gerade die Catalipid Vesikelbildung einen kritischen und zentralen Ansatzpunkt im MCM
einnimmt, wurden weitere Grundlagenversuche unter Einsatz komplexer und asymmetrischer
Catalipide durchgeführt. Die in der Peptidchemie angewendeten Kopplungsreaktionen
ermöglichen im Gegensatz zur reduktiven Aminierung den Aufbau komplexer - auch
asymmetrischer - Catalipide an der Festphase. Durch geeignete Schutzgruppenstrategien und
Kopplungsreagenzien ist es hiermit möglich, selektiv Amidbindungen zwischen den
hydrophoben Alkylketten und den Amino- und Carboxylfunktionen in der hydrophilen
Kopfgruppe der Catalipide auszubilden.
Ausgehend von der vorbeladenen Nα-Fmoc-L-Histidin Festphase 16 wurde ein symmetrisches
Catalipid synthetisiert. Der erste Kopplungsschritt, die Einführung der ersten Alkylkette, ist in
Abbildung 27 dargestellt. Zuerst suspendierte man die Festphase 16 in einem Gemisch aus
absolutem DMF und Dichlormethan mit einem fünffachen Überschuss von Z-9-Oktadecen-1-
amin (Oleylamin) 31. Als Kopplungsreagenz wurde EDC 2 verwendet.[112] Die Aktivierung
der freien Carbonsäure wird über die Reaktion mit EDC 2 zum entsprechenden O-Acyliso-
harnstoff 32 erreicht, der mit dem zugesetzten 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) 33 zur
aktivierten Esterfunktion 34 weiterreagiert. Der Iminoester 34 ist weniger reaktiv als der
O-Acylisoharnstoff 32: Somit wird eine „Überaktivierung“ der Säurefunktion vermieden, die
zu unerwünschten Nebenreaktionen und Racemisierungen führen kann.[19-21]
Im eigentlichen abschließenden Kopplungsschritt reagiert der Iminoester 34 mit dem
Oleylamin 31 selektiv zu 35.
64
EDC
N
NN
O
NH
N NO
O
NN NH
O O
NH
C17H33
O
NN NH
O O
NNNO
O
NN NH
O O
NH
O O
NN
O
OH
NH2 C17H33
+H+
H
16 32
33 31
34 35
2
Abbildung 27. Mechanismus der Reaktion zwischen der Carboxylfunktion der Festphase 16 und EDC 2 in Anwesenheit von HOBT 33 zum Iminoester 34 und mit dem Oleylamin 31 zu 35. Zur basischen Entschützung der Fmoc-Schutzgruppe setzte man 20 % Piperidin in DMF ein
(siehe Abbildung 28). Die nachfolgende Kondensation an der jetzt freien Nα-Aminofunktion
mit der Z-9-Oktadecensäure (Ölsäure) 36 verlief analog zur Kopplung des Oleylamins 31.
PiperidinNH
C17H33
O
NH2
NNNH
O O
O
NH
C17H33NN
EDC
C17H33
O
NH
NH
O C17H33
NN
TFA, TES
DMF DMF, DCM
DMF, DCMNH
O
NHN
O
NH
DIPEA
35
2Ölsäure 36
37 79 %
HOBT 33
Abbildung 28. Nα-Fmoc Deblockierung von 35 und nachfolgende Kopplung der Ölsäure 36. Nach saurer Abspaltung wurde das Catalipid 37 erhalten. Zur Abspaltung von der Festphase verwendete man 5 % ige Trifluoressigsäure in einem
Gemisch aus Dichlormethan und Triethylsilan. Es wurden 16.6 mg (24.80 μmol, 79 % der
65
Theorie) der Verbindung 37 erhalten, die mittels ESI-MS Spektrometrie charakterisiert
wurde.
Um die Lipophilie der Catalipide mit L-Histidin als Kopfgruppe zu variieren, verwendete man
gesättigte Alkylketten als Kopplungspartner (siehe Tabelle 3, 38).
Zur Herstellung von Catalipiden mit Histamin als hydrophiler Kopfgruppe, setzte man die
vorbeladene Histamin-Festphase 21 ein. Die Durchführung der Synthesen verlief analog zu
der beschriebenen Synthese des Catalipids 37. Die eingesetzten Mengen der vorbeladenen
Festphasen 16 und 21, die nach der Synthesefolge nummerierten Einzelreaktionen (1. bis 3.),
sowie die Ausbeuten und die Charakterisierungsmethode sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3. Übersicht der durch Festphasensynthese hergestellten Catalipide durch Peptid-Kopplungsreaktionen.
Festphase Carboxyl-
funktion
Nα-Amino-
funktion Catalipid
Ausbeute,
Analytik
NN
O
OH
NHFmoc
Einwaage:
50 mg Festphase 16
Beladung: 624 µmol / g
1. EDC/HOBT
Oleylamin 31
2.
Fmoc off
3.
EDC/HOBT
Ölsäure 36
(CH2)6
NH
O (CH2)6
NHN
O
NH
(CH2)7
(CH2)6CH3
37
16.6 mg
(24.80 μmol,
79 % d. Th.)
ESI-MS
NN
O
OH
NHFmoc
Einwaage:
50 mg Festphase 16
Beladung: 624 µmol / g
1. EDC/HOBT
Dodecylamin 41
2.
Fmoc off
3.
EDC/HOBT
Palmitinsäure
42
NH
O
NHN
O
NH
C11H23
C15H31 38
15.3 mg
(27.31 μmol,
85 % d. Th.)
ESI-MS
NN
NH2
Einwaage:
100 mg Festphase 21
Beladung: 500 µmol / g
--------
1.
EDC/HOBT
Ölsäure 36
N
N
N (CH2)7
O
(CH2)7CH3
MOH 39
17.1 mg
(45.65 μmol,
91 % d. Th.)
ESI-MS
FAB-MS
MALDI-TOF
MS
NN
NH2
Einwaage:
50 mg Festphase 21
Beladung: 500 µmol / g
--------
1.
EDC/HOBT
DODA-Suc
43
NHN
NH
O
O
N C17H35
C17H35 40
13 mg
(18.3 μmol,
73 % d. Th.)
ESI-MS
FAB-MS
66
Durch Kopplung mit der ungesättigten Ölsäure 36 erhielt man ein einkettiges Catalipid 39
(MOH). Zur Synthese des gesättigten, zweikettigen Catalipids 40 mit Histamin als
Kopfgruppe, setzte man N-Succinyl-dioktadecylamin 43 (DODA-Suc) als Kopplungspartner
ein, um den Einfluss zwischen der hydrophilen Kopfgruppe und den Alkylketten auf das
Selbstaggregationsverhalten des Catalipids 40 zu untersuchen. Zuerst synthetisierte man
hierzu das N-Succinyldioktadecylamin 43 (DODA-Suc), das durch Reaktion von Bernstein-
säureanhydrid 44 mit dem kommerziell erhältlichen N, N-Dioktadecylsuccinamid 45 in
82.7 % iger Ausbeute erhalten wurde (siehe Abbildung 29).[113]
O
O
O
TEA
Pyridin
O
O
N
C17H35
C17H35OHNH
C17H35
C17H35 +
45 44 43 83 %
Abbildung 29. Synthese von DODA-Suc 43.[113]
Die Kopplung führte man analog dem bereits beschriebenen Kopplungsprotokoll mit den
Aktivatoren EDC / HOBT durch; abweichend wurde jedoch aufgrund der schlechten
Löslichkeit des DODA-Suc 43 in DMF der Lösungsmittelanteil an Chloroform erhöht.
67
3.1.8.1 Nα-Fmoc-L-Serin 46 als Verzweigungspunkt in der Festphasensynthese von
Catalipiden
Wird in einem ersten Reaktionsschritt ein Verzweigungsmolekül an die vorbeladenen
Festphasen gekoppelt, werden komplexere Catalipide erhalten. So können asymmetrische
Lipide synthetisiert werden, die zwei unterschiedlich lange Alkylketten im Molekül besitzen.
Das Verzweigungsmolekül muss hierzu drei selektiv ansteuerbare Funktionalitäten tragen. Im
ersten Reaktionsschritt erfolgt die kovalente Verknüpfung mit der vorbeladenen Festphase. In
zwei unabhängigen Reaktionsschritten erfolgt dann die selektive Einführung der Alkylketten.
Hierzu wurde mittels EDC/HOBT-Aktivierung das Nα-Fmoc-L-Serin 46 sowohl an die
L-Histidinmethylester-Festphase 19, als auch an die Histamin Festphase 21 gekoppelt. Die
erhaltenden vorbeladenen Festphasen 47 und 48 sind in Abbildung 30 gezeigt:
bbildung 30. Einführung des Verzweigungsmoleküls: N -Fmoc-L-Serin modifizierte-Festphasen 47 und 48.
ie Beladung der N -Fmoc-L-Serin modifizierten Festphasen 47 und 48 wurde durch
NN
NH
O
NH
O O
OH
NH
O
O
O
NH
NN
O
O
OH
47 48
A α
αD
basische Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe UV-spektroskopisch bestimmt. Ausgehend von
den modifizierten Festphasen 47 und 48 wurden sowohl symmetrische (53 und 54) Catalipide
als auch ein asymmetrisches Catalipid 55 synthetisiert:
68
Tabelle 4. Übersicht der synthetisierten Catalipide mit L-Serin als Verzweigungsmolekül.
Festphase
Hxdroxyl-
funktion von
L-Serin
Nα-Amino-
funktion von
L-Serin
Catalipid Ausbeute,
Analytik
NH
O
NH
NN
O
O
OH
Fmoc Einwaage:
50 mg Festphase 47
Beladung: 576 µmol / g
1.
Cl C13H27
O
Tetradecansäure-
chlorid
49
2.
Fmoc off
3. EDC/HOBT
OH C13H27
O
Tetradecansäure
50
NH
O
O
NH
NHN
O
O
O C13H27
O
C13H27
53
15.3 mg
(22.61 μmol,
78 % d. Th.)
ESI-MS
NN
NH
O
NH
OH
Fmoc
Einwaage:
100 mg Festphase 48
Beladung: 463 µmol / g
1.
Cl C17H33
O
Ölsäurechlorid
51
2. Fmoc off
3. EDC/HOBT
OH C17H33
O
Ölsäure 36
NHN
NH
O
NH
O C17H33
O
C17H33O
DOSH
54
27.4 mg
(37.64 μmol)
81 % d. Th.
ESI-MS
NN
NH
O
NH
OH
Fmoc
Einwaage:
50 mg Festphase 48
Beladung: 463 µmol / g
1.
Cl C15H31
O
Palmitoylchlorid
52
2. Fmoc off
3. EDC/HOBT
OH C13H27
O
Tetradecansäure
50
NHN
NH
O
NH
O
O
C15H31O
C13H27 55
11.5 mg
(17.09 μmol)
74 % d.Th.
ESI-MS
Zur Durchführung der Festphasensynthese zu den Catalipiden 53, 54, 55 wurde im ersten
Reaktionsschritt die Hydroxylfunktion des - an die Festphase gebundenen - Nα-Fmoc-L-
Serins mit einem Säurechlorid verestert. Der bei der Reaktion entstehende Chlorwasserstoff
wurde durch die Zugabe von Pyridin als Pyridiniumhydrochlorid abgefangen. Die im zweiten
Reaktionsschritt durchgeführte baseninduzierte Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe, sowie
die nachfolgende Kopplung der zweiten Alkylkette durch EDC/HOBT Aktivierung und auch
die saure Abspaltung von der Festphase wurde unter Standardbedingungen durchgeführt.
69
Die durch den Einsatz von L-Serin als Verzweigungspunkt verursachte strukturelle
Veränderung der Catalipide 53, 54, 55 sollte einen charakteristischen Einfluss auf deren
Löslichkeit und auf das Selbstaggregationsverhalten dieser Catalipide zeigen.
3.1.9 Synthese von Catalipid-Phosphoglyceriden
Der Grundkörper der herzustellenden Imidazol enthaltenden Phosphoglyceride sollte sich von
der Struktur natürlich vorkommender – membranbildender - Phosphoglyceride ableiten.
Aufgrund der vergleichbaren Grundstruktur der Catalipid-Phospholipide sollte dann
nachfolgend untersucht werden, ob speziell die Bildung von GUV – ähnlich den natürlichen
Phospholipiden – beobachtet werden kann.
3.1.9.1 Phospholipide
Der Hauptbestandteil eukaryotischer Zellmembranen sind sog. Phospholipide, die zur Klasse
der Phosphoglyceride gehören. Der Grundkörper der Phosphoglyceride besteht aus dem
sn-Glycerin-3-phosphat (siehe Abbildung 31). R1 und R2 sind langkettige Alkylreste, X leitet
sich von einem Alkohol ab, der mit der Phosphatgruppe verestert ist. Alle natürlich vor-
kommenden Phosphoglyceride weisen, mit Ausnahme weniger Archaeen, die
sn-Konfiguration auf, wodurch die stereospezifische räumliche Anordnung der Glycerol-
Substituenten festlegt ist. Der Substituent, der die Position am chiralen Zentrum einnimmt,
wird beginnend mit 1 gekennzeichnet. Das einfachste Phosphoglycerid ist die Phosphatid-
säure mit X = H, andere enthalten polare Gruppen wie Serin, Ethanolamin oder Cholin, die
mit der Phosphatgruppe verestert sind. Die Alkylketten der Phospholipide können sehr
unterschiedlich sein. Sie enthalten in den meisten Fällen eine gerade Anzahl von
Kohlenstoffatomen mit einer typischen Kettenlänge von 14 bis 24 und können gesättigt oder
auch einfach, bzw. mehrfach ungesättigt vorliegen.
O P
O
OH
O O R1
O
X
O
O
R2
12
3
Abbildung 31. Grundkörper der Phosphoglyceride: sn-Glycerin-3-phosphat. X leitet sich von einem Alkohol ab, R1 und R2 stellen Alkylreste dar. Für X = H3N
+-(CH2)2-, R1 = -(CH2)14CH3, R2 = -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7CH3 liegt z.B. das Phosphatidylethanolamin vor.
70
3.1.9.2 Retrosynthese von Glycero-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinolen 56
Auch die Synthese der Imidazol enthaltenden Phosphoglyceride sollte an der Festphase
erfolgen, um von den Vorteilen des Multistep-Verfahrens zu profitieren. In Abbildung 32 sind
mögliche retrosynthetische Schnitte des Glycero-3-phospho(Nα-acetyl)-L-histidinols 56 auf-
gezeigt.
NHN NH
O
O P
O
OH
O O R1
O
O
O
R2
NN NH
O
O Si
NN NH
O
O P
O
OH
O OH
OH
O
CN
P
N(CHMe2)2
NN NH
O
O NHN NH2
OH
56
58 8
57
Abbildung 32. Retrosynthese des Glycero-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinols 56.
Der Grundkörper der polaren Kopfgruppe des Phosphoglycerids sollte sich vom
L-Histidinol 8 ableiten. Dieser muss, um eine selektive, kovalente Verknüpfung mit der
Festphase über die Imidazolfunktion zu ermöglichen, mit zwei orthogonalen Schutzgruppen
ausgestattet werden 58 (z.B. mit die Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe zur Blockierung der
Alkohlfunktion und der Acetylgruppe zur Blockierung der Aminofunktion). Die Einführung
der Phosphatgruppe kann über die Phosphitylierung der selektiv entschützten Alkoholfunktion
des auf der Festphase gebundenen Histidinol-Derivats durch gängige Phosphitylierungs-
reagenzien erfolgen. Die anschließende Reaktion mit Glycerol führt zum Glycerin-3-
Phosphat 57, das den Grundkörper des Lipids darstellen soll. Die abschließende Einführung
langkettiger Fettsäuren, z.B. in Form ihrer Säurechloride, führt – nach Abspaltung von der
Festphase - zu Glycero-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinol-Derivaten 56.
Auch hier sollte im ersten Reaktionsschritt die Imidazolfunktion kovalent an die
2-Chlorotritylchlorid Festphase 9 gebunden werden und der Aufbau des Lipids sukzessive in
folgenden Reaktionsschritten erfolgen.
71
3.1.9.3 Festphasensynthese des racemischen 1, 2 Di-oleyl-glycerol-3-phospho-
(Nα-acetyl)-L-histidinols 64
Das L-Histidinol 8 konnte durch Reduktion der Carbonsäurefunktion des L-Histidin-
methylesters 18 mit LiAlH4 in absolutem THF in 67 % iger Ausbeute erhalten werden (siehe
Abbildung 33).[114] Die Alkoholfunktion des Histidinols 8 wurde mit der tert-Butyldimethyl-
silylgruppe (TBDMS) geschützt, die im Vergleich zur häufig eingesetzten Trimethyl-
silylgruppe eine deutlich erhöhte Basenstabilität zeigt. Die selektive Deblockierung ist durch
Behandeln mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) in THF möglich. Die noch freie
Nα-Aminofunktion wurde dann durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Das
Nα-AcetylO-(tert-butyldimethylsilyl)-L-histidinol 59 konnte ausgehend vom L-Histidin-
methylester 18 in einer zweistufigen Synthese in 38 % iger Ausbeute erhalten werden, wobei
die Charakterisierung über NMR-und ESI-MS Spektrometrie erfolgte.
NHN NH
O
O SiNHN NH2
OHNHN NH2
O
OLiAlH4
THF Ac2O
18 8 59 38 %
TBDMS-Cl
Abbildung 33. Reduktion des L-Histidinmethylesters 18 mit LiAlH4 und anschließende Einführung der orthogonalen Schutzgruppen zum Nα-Acetyl-O-(tert-butyldimethylsilyl)-L-histidinol 59.
Eine Phosphitylierung der Alkoholfunktion des orthogonal geschützten L-Histidinols 59 kann
über die gängigen Phosphitylierungsreagenzien 60 oder 61 (siehe Abbildung 34) stattfinden,
die auch in der Nukleinsäurechemie zur Darstellung der Phosphoramidite zur Festphasen-
synthese von Oligonukleotiden Anwendung finden.[115]
POCl
N
CNP
ON
N
CN
60 61
Abbildung 34. Phosphitylierungsreagenzien zur Herstellung von Phosphoramiditen: (2-Cyanoethoxy)-N,N-diisopropylphosphoramidochlorid 49 und (2-Cyanoethoxy)bis-N,N-(diisopropylamino)phosphan 61.
72
Das Chlor-Bannwarth-Reagenz 60 wird mit dem Alkohol umgesetzt, wobei der bei der
Reaktion entstehende Chlorwasserstoff durch die zugesetzte Base wie N-Ethyldiisopropyl-
amin neutralisiert wird. Die Reaktion eines Alkohols mit dem Phosphitylierungsreagenz 61
(Bannwarth-Reagenz) wird durch Diisopropylammoniumtetrazolid 62 katalysiert. Diese
Methode bietet sich für säureempfindliche Phosphitylierungsreaktionen an, da kein Chlor-
wasserstoff gebildet wird. Sie sollte im Zuge der geplanten Festphasensynthese des Phospho-
glycerids Anwendung finden, da eine säurelabile Festphase eingesetzt werden sollte. Das
Bannwarth-Reagenz 61 und das Diisopropylammoniumtetrazolid 62 standen für diese Arbeit
zur Verfügung und wurden daher nicht eigens synthetisiert.
Im ersten Reaktionsschritt der Festphasensynthese zum racemischen 1, 2 Di-oleyl-glycerol-3-
phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinol 64 erfolgte die Immobilisierung des orthogonal geschützten
Histidinols 59 auf der 2-Chlorotritylchlorid Festphase 9 (siehe Abbildung 35).
bbildung 35. Festphasensynthese des racemischen 1, 2 Di-oleyl-glycerol-3-phospho-(N -acetyl)-stidinols 64.
m die nicht abreagierten Bindungsstellen der Festphase in unreaktive Methylether zu
überführen, wurde diese mit einem Gemisch von Dichlormethan, DIPEA und Methanol
NHN
OTBDMS
NH
O
Cl
NN
OTBDMS
NH
O
NN
OH
NH
O
PO
CN
N
N
P
N(CHMe2)2
OCN
NN
O
NH
O
NN
O P
O
O
O
CN
OH
OH
NH
O
CH3(CH2)7CHCH(CH2)7COCl
(CH2)7
(CH2)7
NHN
O P
O
O
OH
O
NH
O
O
O
O
(CH2)7CH3
(CH2)7CH3
(CH2)7
(CH2)7
NN
O P
O
O
O
O
O
NH
O
O
OCN
(CH2)7CH3
(CH2)7CH3
CH2Cl2
Pyridin, CHCl3, DMF
TBAF
THF
DIPEA
TBAF
1. Glycerol, 5-BMT2. Iod in Wasser, 2,4-Lutidin
Diisopropyl-ammonium- tetrazolid
5% TFA, TES
9
59 58
61
63
51
64
62
58 %
AL-hi
α
U
73
mehrfach gewaschen. Durch dieses Capping werden ungewollte Nebenreaktionen, mit den
nicht abreagierten Tritylchloridfunktionen der Festphase, verhindert. Im nächsten
Reaktionsschritt wurde die tert-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe durch eine Lösung von
TBAF in THF abgespalten. Die Phosphitylierung der freien Hydroxyfunktion mit dem
Bannwarth-Reagenz 61 in Anwesenheit des Diisopropylammoniumtetrazolids 62 wurde unter
Argonatmosphäre in Dichlormethan durchgeführt. Die anschließende Kopplung des Glycerols
erfolgte mit dem Aktivator 5-Benzylmercaptotetrazol (5-BMT), der den Amiditstickstoff
protoniert. Der nukleophile Angriff des Tetrazolid-Derivats am Phosphor führt zur
Substitution des Diisopropylamins, so dass eine der freien Hydroxyfunktionen des Glycerols
nukleophil am Phosphor angreifen kann, wobei das Tetrazolid-Derivat als Abgangsgruppe
fungiert. Um den nukleophilen Angriff des Glycerols am primären Alkohol zu gewährleisten,
wurde es im hohen Überschuss eingesetzt. Der gebildete Phosphorigsäuretriester wurde mit
einer wässrigen Iodlösung und 2, 6-Lutidin als Base zum Phosphorsäureester 63 oxidiert. Im
nächsten Reaktionsschritt wurden die beiden freien Hydroxylgruppen des Glycerol-Derivats
mit dem Säurechlorid der Ölsäure in Anwesenheit von Pyridin zur Reaktion gebracht. Die
Entfernung der Cyanoethylschutzgruppe konnte durch anschließendes Behandeln mit TBAF
in THF erfolgen. Im nicht wässrigen Medium reicht die Basizität der Fluorid-Ionen aus, um
die β-Eliminierung einzuleiten.[116] Abschließend wurde das Catalipid 64 nach saurer
Abspaltung mit Methanol coevaporiert und in einem Gemisch aus tert-Butanol und Wasser
lyophilisiert. Es wurden 58 % der Theorie erhalten, die Charakterisierung erfolgte mittels
ESI-MS und MALDI-TOF MS Spektrometrie.
3.1.9.4 Festphasensynthese von enantiomerenreinem 1-Oleoyl-2-myristoyl-sn-glycero-
3-phospho-(Nα-acetyl)-L-histidinol 65[117]
ldenden Phosphoglyceride besitzen eine
n-Konfiguration. Der in Kapitel 3.1.9.3 beschriebene synthetische Zugang zu
Die meisten in der Natur vorkommenden membranbi
s
Phosphoglyceriden mit Imidazol als hydrohiler Kopfgruppe kommt dieser Einschränkung
nicht entgegen, denn nach der Veresterung des an der Festphase gebundenen Glycerol-
Derivats 63 mit Carbonsäurechloriden liegt ein Enantiomerengemisch vor. Auch ist eine
gezielte Veresterung des Glycerol-Derivats 63 mit zwei unterschiedlichen Carbonsäure-
Derivaten zu asymmetrischen Phosphoglyceriden nicht möglich. Um diese synthetischen
Einschränkungen zu umgehen, wurde in einem gemeinsamen Projekt mit Kolmanovskyi im
Rahmen einer Bachelor Arbeit die Synthese eines enantiomerenreinen sn-Glycerin-3-
74
phosphats erarbeitet, das durch die Verwendung orthogonaler Schutzgruppen die selektive
Einführung unterschiedlicher Carbonsäuregruppen, über ihre Säurechloride, ermöglicht.[117]
Ausgehend von (S)-1,2-O-Isopropyliden-sn-glycerol, das über eine dreistufige Synthese aus
D-Manitol zugänglich ist [118], konnte das orthogonal geschützte 2-O-(4-Methoxybenzyl)-1-O-
Abbildung 36. Enatiomerenreines 2-O-(4 tyldiphenylsilyl)-sn-glycerol 66 als Synthesebaustein zur Festphasensynthese I hoglyceride.
66
iehe Abbildung 36) kann entsprechend der zuvor beschriebenen Synthese des Catalipids 64
s 65 (siehe Abbildung 37) in enantiomerenreiner Form konnte die
Abbildung 37. Enantiome
(tert-butyldiphenylsilyl)-sn-glycerol 66 in einer fünfstufigen Synthese hergestellt werden.[28]
Die Wahl der Schutzgruppe des primären Alkohols des sn-Glycerol-3-phosphat Bausteins fiel
auf die sterisch anspruchsvolle tert-Butyldiphenylsilyl-Gruppe, die basisch mit TBAF in THF
entfernt werden kann. Der sekundäre Alkohol wurde als p-Methoxybenzylether geschützt, bei
dem eine oxidative Abspaltung mit Cer-(IV)-ammoniumnitrat möglich ist.
OH O
O
Si
O 66
-Methoxybenzyl)-1-O-(tert-bumidazol enthaltender Phosp
Das enantiomerenreine 2-O-(4-Methoxybenzyl)-1-O-(tert-butyldiphenylsilyl)-sn-glycerol
(s
(siehe Abbildung 35) anstelle des Glycerols an das immobilisierte L-Histidinol-Derivat
gekoppelt werden.
Durch die Synthese des asymmetrischen 1-Oleoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phospho-(Nα-
acetyl)-L-histidinol
erfolgreiche Anwendung des orthogonal geschützten Glycerols 66 als Synthesebaustein in der
Festphasensynthese Imidazol enthaltender Phosphoglyceride gezeigt werden.[117]
O
renreines Phospho-Catalipid 65.
(CH2)7CH3O (CH2)7O
(CH2)12CH3
NHN
O P O
OHNH
O
O
O65
75
3.1.9.5 Zusammenfassung der Ergebnisse der Festphasensynthese von Catalipiden
Die Herstellung strukturvielfältiger Catalipide erfolgte über die Festphasensynthese. Im ersten
Syntheseschritt wurden hierzu geeignete Ausgangsmoleküle (L-Histidin 6, Histamin 7,
Histidinol 8) kovalent über ihre Imidazolfunktion mit dem 2-Chlorotrityl-Linker der
Festphase 9 verknüpft. Durch geeignete orthogonale Schutzgruppen konnten unterschiedliche
Substitutionen zielgenau an den immobilisierten Imidazol-Derivaten durchgeführt werden.
Hierzu setzte man ausgewählte chemische Verfahren ein, die eine Einführung verschieden
langer Alkylketten oder auch weiterer Verzweigungspunkte ermöglichten:
Zum einen konnten über die reduktive Aminierung zwei gesättigte Alkylketten gleicher Länge
kovalent an die freie Aminofunktion des immobilisierten Imidazol-Derivats gebunden
werden. Dies führte zu symmetrischen Catalipiden unterschiedlicher Lipophilie (steuerbar
über die Alkylkette des Aldehyds), wie auch zu unterschiedlicher Hydrophilie (steuerbar über
die Auswahl der Imidazol-Festphase (siehe Tabelle 2)).
Zum anderen erfolgte der synthetische Zugang zu asymmetrischen, gesättigten wie auch
ungesättigten Catalipiden über Peptid-Kopplungsreaktionen, in Verbindung mit orthogonalen
Schutzgruppenstrategien, (siehe Tabelle 3). Auch war die Synthese komplexer, symmetrischer
wie auch asymmetrischer Catalipide mit Histamin und L-Histidin als Kopfgruppe erfolgreich,
indem Nα-Fmoc-L-Serin 46 als Verzweigungspunkt eingesetzt wurde (siehe Tabelle 4).
Zudem konnte gezeigt werden, dass die Festphasensynthese eines Catalipid-Phosphoglycerids
– strukturverwandt mit natürlich vorkommenden, membranbildenden Phospholiden – möglich
war. Als Grundgerüst verwendete man das orthogonal geschützte L-Histidinol 59. Die
anschließende Einführung der Phosphatgruppe wurde chemisch durch den Einsatz eines
geeigneten Phosphitylierungsreagenzes 61 realisiert. Durch die Verwendung des
enantiomerenreien, orthogonal geschützten Glycerol-Derivats 66 ist zudem der voll-
synthetische Zugang zu enantiomerenreinen, asymmetrischen Catalipid-Phosphoglyceriden
gezeigt worden.[117]
Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Struktur der synthetisierten Catalipide, sowohl in
Bezug auf die hydrophile Kopfgruppe, als auch auf die variierende Lipophilie der
eingesetzten Lipide, sollte eine Selektion bestimmter Catalipid-Kandidaten gemäß der
Aufgabenstellung erfolgen.
76
3.2 Selbstorganisation von Catalipiden zu supramolekularen Aggregaten.
Chemoton Modells
eschreibung dieser
e im Dispersionsmedium
Untersuchungen zum membranformenden Subsystem (2) des Minimalen
3.2.1 Physikochemische Hintergründe der Selbstorganisation amphiphiler Moleküle
Einleitend werden physikochemische Hintergründe der Selbstorganisation amphiphiler
Moleküle zu supramolekularen Aggregaten in Wasser beschrieben. Hierbei werden die
unterschiedlich ausgebildeten Strukturtypen und deren Morphologien - von Mizellen bis hin
zu geschlossenen, sphärischen Vesikeln - vorgestellt. Eine umfangreiche B
Selbstaggregationsprozesse ist z.B. in dem von Israelachvili veröffentlichten Buch
„Intermolecular and Surface Forces“ zu finden.[119]
3.2.1.1 Aggregationsverhalten amphiphiler Molekül
In Wasser treten Lipide aufgrund ihres amphiphilen Charakters nur selten als Monomere auf.
Um die Berührungsflächen der hydrophoben Bereiche der Kohlenwasserstoffketten mit dem
umgebenden Wasser zu reduzieren, assoziieren diese umgehend. Nur die polaren
Kopfgruppen ordnen sich so an, dass sie mit den Wassermolekülen in Wechselwirkung treten
können. Dieser Effekt bewirkt die Assoziation, z.B. zu Mizellen mit unterschiedlichen
Strukturen (siehe 3.2.1.4 bis 3.2.1.8). In ihnen ist der hydrophobe Kern - durch die
aussenliegende Korona der hydrophilen Kopfgruppen - vom Wasser abgeschirmt (zu
invertierten Mizellen siehe 3.2.1.8). Eine wesentliche Vorraussetzung dieser spontanen
Selbstaggregation zu mizellaren Strukturen ist die Überschreitung einer kritischen
Konzentration, der CMC („critical micelle concentration“) der Moleküle im
Dispersionsmedium. Neben der spontanen Selbstaggregation zu mizellaren Strukturen, ist
auch die Ausbildun
g von Doppellagen (siehe 3.2.1.7) oder vesikularen Strukturen (siehe
ergie ausgeht. Der Beitrag der Entropie setzt sich aus der
neuen lokalen Anordnung einzelner Wassermoleküle im Dispersionsmedium zusammen, die
dort durch Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) lose, tetraedrische Anordnungen
ausgebildet hatten. Nicht assoziierte Kohlenwasserstoffketten verhindern die Ausbildung
3.2.1.6) möglich.
Die Selbstaggregation zu supramolekularen Aggregaten kann hauptsächlich durch entropische
Effekte erklärt werden, indem man näherungsweise nur von einem Beitrag der Entropie und
Enthalpie zur Freien Gibbs`schen En
77
dieser tetraedrischen Wasserstoffbrückenbindungen und induzieren dadurch eine
Ordnung, die entropisch weniger begünstigt ist. Die Ausbildung von supramolekularen
Aggregaten führt über die Aggregation ei
lokal höhere
nzelner Kohlenwasserstoffketten zu einer
Reduzierung dieser höheren Ordnung und leistet daher einen positiven Beitrag zur Entropie.
Assoziation führen, sowie abstoßenden
nischen oder sterischen Kräften, die eine Dissoziation unterstützen (siehe Abbildung 38
„head-group (hydrophilic) repulsion“).[119]
ben werden können, wird die Kopfgruppenfläche ao durch die Parameter lc (maximale Abbildung aus „Intermolecular & Surface Forces“.[119]
3.2.1.2 Optimale Kopfgruppenoberfläche a0 amphiphiler Moleküle in
supramolekularen Aggregaten
Die treibende Kraft zur Ausbildung spezieller Formen supramolekularer Aggregate ist ein Zu-
sammenspiel aus attraktiven, hydrophoben Wechselwirkungen (siehe Abbildung 38
„interfacial (hydrophobic) attraction“), die zur
io
Abbildung 38. Schematische Darstellung einer Mizelle, sowie einzelner Amphiphile. Die optimale Kopfgruppenfläche ao resultiert aus den abstoßenden und anziehenden Wechselwirkungen der einzelnen Moleküle. Unter der Annahme, dass unter Normalbedingungen die Kohlenwasserstoffketten als ideale Flüssigkeiten beschrieLänge) und v (Volumen) definiert.
Das Konzept der „Opposing Forces“ von Tanford et al.[120, 121] beschreibt die treibende Kraft
der Selbstorganisation amphiphiler Moleküle zu geordneten Strukturen, in dem die
anziehenden hydrophoben Wechselwirkungen zu einer Reduktion und die abstoßenden
ionischen oder sterischen Kräfte zu einer Zunahme der effektiven Grenzfläche pro Molekül in
einer wässrigen Lösung führen. Um dieses Zusammenspiel der Wechselwirkungen zu
78
beschreiben, ist der Begriff der effektiven Kopfgruppenoberfläche a eingeführt worden. Die
attraktiven Wechselwirkungen setzten sich hauptsächlich aus hydrophoben
Wechselwirkungen und Oberflächenspannungen zusammen und können durch die freie
Grenzflächenenergie γ pro Einheitsfläche beschrieben werden. Für die Grenzfläche
ohlenwasserstoff / Wasser besitzt γ charakteristische Werte in einem Bereich zwischen
γ ≈ 20 bis 50 mJm-2 und hängt vom Sättungsgrad der Alkylketten der Lipide ab: Zum Beispiel
on Oktadeken bei
19 m
an die Kohlenwasserstoffketten im Inneren der supramolekularen Aggregate - in
eschrieben werden.[149, 150] a gibt die effektive Kopfgruppenoberfläche des Lipids an. Diese
Nährung gilt für die m it weniger
als 14 Kohlenstoffatom üssen zusätzlich
abstoßende W obiler
In der einfachsten Form des Aggregats als
Funktion der freien a (pro
Molekül) beschrieben werden,
μ0n, A
= γ ormel 5
äfte in
8),
K
liegt γ für Oktadekan in Wasser bei 52 mJm-2, für das ungesättigte Analog
Jm-2.
Betrachtet m
Mizellen wie auch in Doppellagen - als ideale Flüssigkeiten, kann das chemische Standard-
potential μ0n, A des Aggregats (A) pro Molekül n als
μ0n, A = γ a Formel 4
b
eisten gesättigten, einkettigen und doppelkettigen Lipide, m
en je Alkylkette. Zur realen Beschreibung m
echselwirkungen formuliert werden, die auf sterische Beiträge m
Kopfgruppen, Beiträge der Hydratation und, sofern das Molekül über eine geladene
Kopfgruppe verfügt, der elektrostatischen Doppelschicht zurückzuführen sind.
kann dann das chemische Standardpotential μ0n, A
Grenzflächenenergie γ und der effektiven Kopfgruppenoberfläche
a + K/a F wobei K eine stoffspezifische Konstante ist. Der erste Term der Gleichung γ a beschreibt die
anziehenden WW, der zweite K/a die abstoßenden. Unter der Annahme, dass beide Kr
der selben Ebene der hydrophob / hydrophilen Grenzfläche wirken (siehe Abbildung 3
rgibt sich für das Energieminimum: e
μ0n, A (min) = 2 γ a0 ; mit a0 = (K/γ) 1/2 Formel 6
a0 ist die optimale Kopfgruppenoberfläche pro Molekül und wird durch die Grenzfläche
Kohlenwasserstoff / Wasser definiert.
79
Hieraus ergibt sich für das chemische Standardpotential μ0n, A des Aggregats A pro Molekül
näherungsweise:
μ0n, A= 2 γ a0 + γ(a- a0)
2/a Formel 7 Das Konzept der entgegengesetzten Kräfte („Opposing Forces“) führt so zu einer optimalen
Kopfgruppenoberfläche a0, in dem die Wechselwirkungsenergien pro Molekül im Aggregat
minimiert sind. Nicht berücksichtigt sind jedoch weitere Effekte, die zur genauen
Beschreibung der Aggregate notwendig sind, wie:
- spezifische Wechselwirkungen der Alkylketten; (Alkylketten können nicht immer als
0
nschaften der
tten fluid und unkomprimierbar in den Aggregaten vorliegen
nd als ideale Flüssigkeiten beschrieben werden können. Aus dieser Einschränkung ergibt
ich fü
ür eine gesättigte aliphatische Alkylkette aus n Kohlen-
toffatomen folgende empirische Zusammenhänge, die eine Abschätzung der kritischen
Länge
Formel 8
v ≈ (27.4+26.9*n) * 10-3 nm3 Formel 9
- ionische Wechselwirkungen der Kopfgruppe
- WBB zwischen den Kopfgruppen
ideale Flüssigkeiten beschrieben werden.)
- Effekte der Oberflächenkrümmung auf das chemischen Standardpotential μ n, A
3.2.1.3 Geometrie und Packung amphiphiler Moleküle in supramolekularen
Aggregaten
Die Geometrie supramolekularer Aggregate wird durch die Packungseige
amphiphilen Moleküle bestimmt und hängt von deren optimalen Kopfgruppenoberflächen a0,
dem eingenommenen Volumen v der Alkylkette/n sowie von ihrer/n Länge/n l ab. Dabei wird
angenommen, dass die Alkylke
u
s r die effektive Länge der Alkylkette/n eine kritische Länge lc. Diese kritische Länge lc
limitiert die maximale Ausdehnung der Kohlenwasserstoffkette, ist ein semiempirischer Wert
und ist kürzer als die gesamte molekulare Länge der Alkylkette bei maximaler Streckung lmax,
bei der eine all-trans Anordnung der Kohlenstoffatome angenommen wird.
Nach Tanford et al.[120] ergeben sich f
s
lc (siehe Formel 8) und des Volumens v (siehe Formel 9) ermöglichen:
lc ≤ lmax ≈ (0.154 + 0.1265*n) nm
80
Für sehr große n gilt, v/lc ≈ 0.21 nm2 ≈ konstant, dies liegt nahe am minimalen Durchmesser
einer aliphatischen Kohlenwasserstoffkette.
us den messbaren, bzw. abschätzbaren Werten für die optimale Kopfgruppenoberfläche a0,
dem K
Aggregate mit der kleinsten Anzahl von
olekülen (n = M) gebildet. Größere Strukturen sind entropisch ungünstiger, kleinere
Kopfgruppenoberfläche a größer als die
n lässt, sind energetisch ungünstiger.
r Aggregate sich bevorzugt bilden wird:
v/a0lc < 1/3 sphärische Mizellen
1/3 < v/a0lc < 1/2 zylindrische Mizellen
v/a0lc ~ 1 planare Doppellagen
v/a0lc > 1 invertierte Mizellen
A
ettenvolumen v und der kritischen Kettenlänge lc kann die Packung amphiphiler
Moleküle im Aggregat abgeschätzt werden - und dies für verschiedene Strukturen.
Unter der Annahme, dass das chemische Potential μ0n, A
für unterschiedliche supramolekulare
Strukturen bei gleichbleibenden optimalen Kopfgruppenoberflächen a0 als konstant angesehen
werden kann, werden aus entropischen Gründen
M
Strukturen, bei denen die Packung der Lipide deren
optimale Kopfgruppenoberfläche a0 werde
Über den dimensionslosen Packungsparameter („critical shape factor“) v/a0lc kann
abgeschätzt werden, welche Form supramolekulare
1/2 < v/a0lc < 1 Vesikel oder Doppellagen
Jede dieser Strukturen formt das kleinstmögliche Aggregat, in dem die amphiphilen Moleküle
die minimalen freien Energien aufweisen (siehe Tabelle 5).
81
Tabelle 5. Lipidklassen, Packungsparameter („crtical shape factor“) v / a0 lc, Packungsgeometrie der Einzel-Lipide, ausgebildete Strukturen im supramolekularen Aggregat. Modifiziert aus: „Intermolecular & Surface Forces“.[119]
Lipidklasse kritischer
Packungsparameterv / a0 lc
Packungsgeometrieder Einzel-Lipide
bevorzugt ausgebildetes
supramolekulares Aggregat
Typ 1: einkettige Lipide mit
großen Kopfgruppenflächen
< 1/3
Kegel
sphärische Mizelle
Typ 2: einkettige Lipide mit
abgestumpfter Kegel
zylindrische Mizelle
kleinen Kopfgruppenflächen
1/3 bis 1/2
le Doppellagen
Typ 3:
doppelkettige Lipide mit großen
Kopfgruppenflächen und ungesättigten, flexibelen
a
bgestumpfter Kegel flexib
1/2 bis 1
Alkylketten
Typ 4: doppelkettige Lipide mit
kleinen Kopfgruppenflächen und gesättigten, unflexibelen
Alkylketten
~ 1
Zylinder
planare Doppellagen
Typ 5: doppelkettige Lipide mit
kleinen Kopfgruppenflächen;
ungeladene Lipide; Lipide mit poly (cis) ungesättigte
Alkylketten
> 1
invertierter
abgestumpfter Kegel oder Keil
invertierte Mizellen
82
3.2.1.4 Sphärische Mizellen
Für Lipide die späherische Mize (siehe Tabelle 5, Typ 1) gilt röße
der opfgr Alk
demgegenüber klein sein muss, so dass die optimale Packungsgeometrie des ds zu
einem Kegel wird. Der Radius R der Mizelle sollt t die kritische Ketten lc
übersch ine Abschätzung der mittleren Aggregationszahl Mm einer sphärischen
Mi R kann über Formel 10 erfolgen,
Mm = (4 π R2) / a0 = (4 π R3) / 3 v Formel 10 wobei der Radius R durch Formel 11 bestimmt werden kann.
0 Formel 11 Damit sich sphärische Mizellen bilden können, muss für den dimensionslosen
Packungsparameter v / a0 lc < 1/3 gelten (siehe Tabelle 5, Typ 1).
Sphärische Mizellen werden bevorzugt durch einzelsträngige, ge
kegelartige Packungsgeometrie des Einzel-Lipids wird durch kleinere Alkylkettenvolumina v
und größere Kopfgruppenoberflächen a hervorgerufen, wobei große Kopfgruppenoberflächen
a statische h sterischen, abstoßenden, Wechselwirkungen der
hydrophilen Kopfgruppen resultieren können.
3.2.1.5 Zylindrische Mizellen
Lipide die zylind e Mizelle sbilden, besitzen im Gegensatz zu sphärischen ein
kleineres Verhältnis der Kopfgruppenoberfläche a zum Alkylkettenvolumen v. Die
Packungsgeom ipids ist in diesem Fall mit einem abgestumpften Kegel zu
vergleichen, und für den dimensionslosen Packungsparam ter gilt 1/3 < v / a0 lc < 1/2 (siehe
Tabelle ).
Beispielsweise wird durch die Anwesenheit hoher Salzkonzentrationen in Lösung die
el toßung der fgruppen der Einzel-Lipide im Aggregat reduziert.
re optimale Kopfgruppenoberflächen a0 des Lipids, so dass
dadurch keine sphärischen Mizellen mehr ausgebildet werden, sondern bevorzugt zylindrische
oder stäbchenartige Aggregate.
llen ausbilden
uppenoberflächen a0
, dass die G
ylkettenvolumen v
Einzel-Lipi
optimalen K groß und deren
e nich länge
reiten. E
zelle mit dem Radius
R = 3v / a
ladene Lipide gebildet. Die
sowohl aus elektro n als auc
risch
etrie des Einzel-L
n au
e
5, Typ 2
ektrostatische Abs
Hieraus resultiert eine kleine
Kop
83
3.2.1.6 Vesikel
Für bestimmte Kopfgruppen und unter besonderen Reaktionsbedingungen (siehe Tabelle 5,
Typ 3) ist es für derartige amphiphile Moleküle energetisch günstiger, eine geschlossene
sphärische Anordnung in Form einer Doppellage auszubilden, die als Vesikel oder Liposom
bezeichnet wird. Die äußere Lipidlage formt in diesem Fall einen abgestumpften Kegel, in
dem die Kopfgruppenfläche a in der äußeren Lipidlage größer als die optimale
Kopfgruppenfläche a0 sein muss. Für den dimensionslosen Packungsparameter v /a0 lc gilt
ann 1/2 < v /a0 lc < 1. Um den minimalen Radius Rc eines Vesikels abzuschätzen, bei dem
keine u r
als a0 wird -, kann Formel 12
ngewendet werden:
Rc ≈ lc / (1 - (v / a0 lc)) Formel 12
n Radius Rc, können die
M ≈ 4π (R 2 + (R – t)2) / a0) Formel 13
d
ngünstigen Spannungen in der Packung der Lipide innerhalb der Doppellage meh
auftreten - so dass a in der äußeren Lipidlage nicht größerer
a
Liegt der Radius des gebildeten Vesikels über dem minimale
Moleküle der Innen- und Außenlage ihre optimalen Kopfgruppenoberflächen a0 einnehmen.
Auch können sich die Lipide innerhalb der Doppellage so anordnen, dass für die Kettenlängen
l < lc gelten kann. Die Abschätzung der Aggregationszahl Mv der Lipidmoleküle eines
Vesikels mit dem minimalen Radius Rc und einer Dicke der Doppelschicht von t ≈ 2v / a0
kann über Formel 13 erfolgen.
v c c
84
Häufig werden Vesikel bezüglich ihrer Lamellarität und Größe unterschieden (siehe
bbildung 39). Man differenziert zwischen kleinen unilamellaren (SUV, sA mall-unilamellar-
vesicle) und großen unilamellaren (LUV, large-unilamellar-vesicle). Die SUV besitzen einen
Durchmesser zwischen 30-50 nm und die LUV von 100-200 nm. Liegt die Größe der Vesikel
im Mikrometerbreich (5-200 μm), spricht man von GUV (giant-unilamellar-vesicel), die auch
multilamellare (MLGV) oder multivesikulare (MVGV) Strukturen annehmen können.[122]
Abbildung 39. Schematische Darstellung unterschiedlicher Vesikel-Typen: SUV (small-unilamellar-vesicle), LUV (large-unilamellar-vesicle), GUV (giant-unilamellar-vesicel), MLGV (multilamellar-giant-vesicle) undMVGV (m
ulti-vesicle-giant vesicle).
Zweikettige Lipide mit großen Kopfgruppenoberflächen a und flexiblen Alkylketten bilden
bevorzugt Doppellagen, da die Geometrie l
leicht, was die Ausbildung vesikularer Strukturen begünstigt (siehe Tabelle 5, Typ 3).
Zweikettige Lipide zeigen, im Vergleich zu einkettigen, andere Aggregationsparameter.
Durch die größere Hydrophobie der zweikettigen Lipide verringert sich zum einen die CMC,
zum anderen verlängert sich die Aufenthaltsdauer der einzelnen Lipide in den Aggregaten. In
selbstorganisierten Strukturen liegt oftmals eine hohe Lipid-Dynamik vor. Es kommt zum
regen Austausch zwischen frei in Lösung vorliegenden Lipiden und membrangebundenen.
Dieser Austauschprozess kann bei allen Lipiden beobachtet werden, unabhängig, ob sie ein-
oder mehrkettig sind. Betrachtet man die durchschnittliche Aufenthaltsdauer eines Lipids in
der Doppellage kann diese durch τ0 / e-ΔE / kT beschrieben werden. τ0 beschreibt die
Wanderungszeit eines Lipids zwischen zwei Stößen an der Grenzfläche einer Doppellage, ΔE
die bestimmte thermische Aktivierungsenergie, um das Lipid aus dem Verbund zu lösen.
des Einzel-Lipids einem abgestumpften Kege
g
85
Die Aufenthaltsdauer τR eines Lipids in einer Doppellage kann somit wie folgt beschrieben
werden:
τR = τ0 / e-ΔE / kT ≈ 55 τ0 / CMC Formel 14
Typische Wanderungszeiten τ0 für Amphiphile in Mizellen und Doppellagen liegen in -9 -6
der
Größenordnung von τ0 = 10 eines Lipids in einem
gebildeten Aggregat wird weniger durch dessen als vielmehr durch die
bisher diskutierten Eigens Wechselwirkungen des einzelnen
Lipids bestimmt.
Ein weiterer dynami n ist der sog. Interdoppellagentransfer oder
kurz: Flip-Flop Mechanism nderung eines Lipids von der einen
Seite der D als Diffusionsprozess beschrieben werden,
indem ΔE (siehe Formel endig ist, um die
r Doppellage zu transferieren. Flip-Flop
Energien sind generell größer, it dem umgebenden
Medium lich länger und hängen stärker von der Art
er Kopfgruppe des Lipids 153]
enige Millisekunden beträgt.[155, 156]
hen
a und mit gesättigten Alkylketten bilden bevorzugt planare Doppellagen.
bis 10 Sekunden. Die Aufenthaltsdauer
geometrische Struktur,
chaften und intermolekularen
scher Prozess in Doppellage
us. Dieses steht für die Wa
oppellage zur anderen und kann auch
14) durch die Energie ersetzt wird, die notw
hydrophile Kopfgruppe in die hydrophobe Region de
als die für einen reinen Lipid-Austausch m
. Auch die Durchquerungszeiten sind deut
, als von der Natur der Alkylkette ab.[152,d
Zum Beispiel ist der Phospholipid Flip-Flop - bedingt durch stärkere Wechselwirkungen im
Aggregat - langsam (t1/2 > Tage)[123] im Gegensatz zu protonierten Ölsäuren, bei denen er
w
3.2.1.7 Doppellagen
Weisen Lipide eine sehr kleine Kopfgruppenoberfläche a auf (siehe Tabelle 5, Typ 4) oder
besitzen sie so voluminöse Alkylketten, dass diese nicht - im Verhältnis zur idealen
Kopfgruppenoberfläche a0 - in die kleinen Aggregate hineinpassen, können sie keine Mizellen
mehr ausbilden; stattdessen bilden sie Doppellagen. Für die Ausbildung von Doppellagen
muss der dimensionslose Packungsparameter v /a0 lc etwa bei 1 liegen.
Dies bedeutet, dass für die gleiche optimale Kopfgruppenoberfläche a0 und kritische
Alkylkettenlänge lc des Lipids ein in etwa doppelt so großes Volumen v vorliegen muss,
verglichen mit Lipiden, die Mizellen ausbilden. Die einzelnen Lipide weisen dann eine
zylindrische Packungsgeometrie auf. Zweikettige Lipide mit kleinen Kopfgruppenoberfläc
86
3.2.1.8 Invertierte mizellare Strukturen
Für zweikettige Lipide mit sehr kleinen Kopfgruppenoberflächen (a0 < 0.42 nm2) oder mit
sehr v ,
leine lc) wird der Wert des dimensionslosen Packungsparameters v / a0 lc > 1 (siehe Tabelle
gen an die zu wählende Herstellungsmethode für Catalipid-Vesikel
alipiden im wässrigen
oppelschicht als zweiter Phase, bestehend aus den
atalipiden, - umschlossen und dadurch von der dritten äußeren, wässrigen Phase abgrenzt
wäre. Um die Catalipid-Vesikel als Kompartimente hinsichtlich der angestrebten
CM zu nutzen, sind weitere Vorraussetzungen zu erfüllen, die im
erstellungsprozess der Vesikel berücksichtigt werden müssen: Die Herstellung der
zfarbstoff markierter
oluminösen, mehrfach ungesättigten (poly-cis) Kohlenwasserstoffketten (großes v
k
5, Typ 5). Die geometrische Form der Einzel-Lipide gleicht, bezogen auf die Kopfgruppe,
einem invertierten, abgestumpften Kegel oder Keil. Nach Formel 12 mit v / a0 lc > 1 wird nun
Rc negativ, und es kann zur Ausbildung invertierter mizellarer Strukturen kommen.
3.2.2 Anforderun
Das in dieser Arbeit verfolgte Konzept des Minimalen Chemoton Modells setzt die
Selbstorganisation von Catalipiden zu einem Kompartiment voraus. Supramolekulare
Aggregate in Form von GUV (siehe Abbildung 39) sollten daher geeignete Kompartimente
für die geplanten Experimente für Untersuchungen des MCMs darstellen. Einzelne GUV sind
aufgrund ihrer Größe, die im Bereich eukaryotischer Zellen liegt, direkt unter dem
Lichtmikroskop sichtbar.
Die GUV des umzusetzenden MCMs sollten aus den synthetisierten Cat
Medium gebildet werden. Wenn die Membran dieser Vesikel relativ undurchlässig für das
Dispersionsmedium ist, läge dann ein drei Phasen System vor: Eine abgeschlossene wässrige
Phase im Inneren, die von der D
C
Untersuchungen zum M
H
Catalipid-Vesikel, sowie deren strukturelle Stabilität, muss im Bereich des physiologischen
pH-Wertes gegeben sein, um die geplanten Ligationsreaktionen modifizierter DNA-
Fragmente über die Catalipid-Aktivierung durchführen zu können (vgl. Kapitel 3.4,
genetisches Subsystem (2) des MCMs). Des weiteren muss im Herstellungsprozess der
Catalipid-Vesikel die Einkapselung von ausreichend mit Fluoreszen
DNA möglich sein, um die Selbstreplikationsreaktion im Inneren verfolgen zu können (siehe
1.5). Dies setzt eine Mindestgröße der Vesikel voraus, um auch eine Visualisierung der
Vesikel mit herkömmlichen Lichtmikroskopen zu ermöglichen. Für eine gewisse
Permeabilität der Membran, zum Austausch Catalipid-aktivierter DNA-Fragmente sollten die
87
Vesikel möglichst unilamellar sein, um eine hohe Membranfluidität zu gewährleisten („Flip-
lop-Mechanismus“, siehe 3.2.1.6).
Präparationsmethode sind weitere Herstellungsverfahren, wie z.B. die Elektroformation zur
in
ikrofluidischen Systemen beschrieben.[158-161] Eine gute Übersicht verschiedener, aktueller
F
3.2.3 Herstellungsmethoden von großen unilamellaren Vesikeln (GUV)
Pionierarbeit in der Herstellung von Vesikeln basierend auf der sog. Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode, wurde 1965 von Bangham et al. geleistet.[124] Seitdem ist diese
Herstellungsmethode weiter verfeinert und modifiziert worden. Neben dieser
GUV Bildung oder auch die Herstellung von monodispersen, unilamellaren Vesikeln
m
Präparationsmethoden zur Vesikel Herstellung gibt der Review Artikel „Giant Vesicles:
Preparations and Applications“ von Walde et al.[125]
Im Folgenden werden die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode (siehe 3.2.3.1) und die
Elektroformation (siehe 3.2.3.2) beschrieben, die in dieser Arbeit zur Herstellung von
Catalipid-Vesikeln eingesetzt wurden.
3.2.3.1 Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode
Die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode basiert auf dem behutsamen Rehydrieren eines
dünnen Lipid-Films in einem Dispersionsmedium.[26, 28, 126] Hierzu wird zuerst das Lipid in
einem organischen Lösungsmittel - meist Chloroform - ohne Trübung gelöst. Im Fall einer
Trübung ist der Zusatz von Methanol notwenig, um gebildete Überstrukturen der amphiphilen
Moleküle zu zerstören. Nachdem eine bestimmte Stoffmenge des gelösten Lipids in ein
Glasgebinde überführt wurde, wird das Lösungsmittel im Argonstrom – unter ständigem
Drehen - entfernt, so dass sich ein dünner Lipid-Film an der Wandung ausbildet. Im
nachfolgenden Rehydrierungsschritt ist das Volumen des Rehydrierungsmittels so zu wählen,
dass der Konzentrationsbereich des Lipids in der Nähe der CMC liegt. Die
Reaktionstemperatur muss über der Phasenübergangstemperatur Tm des eingesetzten Lipids
bzw. des Lipid-Gemisches liegen.[127] Mit der Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode sind
GUV nach einer Reaktionszeit zwischen zwei und zwölf Stunden in einem Größenbereich bis
zu 15 μm erhältlich.
88
3.2.3.2 Elektroformation
beschrieben.[128]
ierbei wird ein dünner Lipid-Film entweder auf die Oberfläche eines Pt-Drahts (siehe
ng
ildung bis heute noch nicht in allen Einzelheiten
aufgeklärt.
mphiphilen Moleküle auf einer festen
berfläche aufgetragen werden, liegen die Lipide bereits zu einem gewissen Grad
Die Elektroformation wurde ursprünglich 1986 von Angelova and Dimitrov
H
3.2.9.1) oder einer ITO (Indium-Zinnoxid) beschichteten Glasplatte (siehe 3.2.9.2)
aufgebracht.[129] Der Rehydrierungsprozess des Lipid-Films wird unter Anlegen einer
elektrischen Wechselspannung vollzogen. Die Elektroformation ermöglicht, im Vergleich zur
Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode, die Herstellung sehr viel homogenerer und
unilamellarerer GUV-Populationen. Zudem ist die Anzahl der gebildeten GUV höher und der
mittlere Durchmesser ist größer.
3.2.3.3 Mögliche Mechanismen der Vesikelbildu
Trotz der vielen in der Literatur beschriebenen Präparationsmethoden zur Herstellung von
Vesikeln, ist der genaue Mechanismus ihrer B[130]
Wenn die zur Vesikelherstellung eingesetzten, a
O
präorganisiert, in Form von gestapelten, trockenen Lipid-Doppellagen vor (siehe Abbildung
40, A). Nach der Zugabe von Wasser kommt es zuerst zur Hydratation der hydrophilen
Kopfgruppen der Lipide (siehe Abbildung 40 B)) und nachfolgend zu einem kontinuierlichen
Anschwellen des Lipid-Films (siehe Abbildung 40, C) bis E)). Hierbei penetrieren mehr und
mehr Wassermoleküle in den interlamellaren Raum der einzelnen Lipid-Doppellagen.
89
Die Krümmung der Lipid-Doppellagen zu geschlossenen, sphärischen Strukturen (siehe
ierung der energetisch ungünstigen
ren Lipid-Doppellage mit den umgebenen
chematische Darstellung der Vesikelbildung über kontrollierte Hydratation (Rehydrierung) che aufgebrachten Lipid-Films. Optional kann ein angelegtes elektrisches Feld den
Angelova und Dimitrov beschreiben als Einflussgrößen auf die Vesikelbildung
elekroosmotische Effekte (wenn ein externes elektrischen Feld angelegt wird), osmotischen
Druck, Membranelastizität, Hydratationsneigung der Lipid-Doppelschichten zur Separation
der entstehenden (Teil-) Membranen und weitere Faktoren wie z.B. van-der-Waals-Kräfte.[159,
160] Bei der Elektroformation wird vermutet, dass durch das elektrische Feld eine mechanische
Spannung erzeugt wird, die die Ablösung unterschiedlich großer Lipid-Doppelschichten
begünstigt, die sich dann durch Krümmung zu unilamellareren Vesikeln zusammenlagern.
Abbildung 40, F)) erfolgt aufgrund der Minim
Wechselwirkungen der offenen, lipophilen inne
Wassermolekühlen.
Abbildung 40. Seines auf einer festen OberfläHydratationsprozess beeinflussen, man spricht dann von der Elektroformation. Abbildung aus Shimanouchi et al.[130]
Während dieser kontrollierten Hydratation, auch Rehydrierung genannt, sollten äußere
mechanische Einflüsse, wie z.B. das Schütteln des Gebindes, vermieden werden. Diese
Störungen könnten zu einem vorzeitigen Ablösen einzelner Teilfragmente der Lipid-
Doppellagen führen. Diese schließen sich dann durch Krümmung der Lipid-Doppellagen in
freier Lösung zu heterogenen, meist multilamellaren Vesikel-Populationen.
90
3.2.4 Auswahl geeigneter Catalipide zur Vesikelherstellung
Die Reaktionsbedingungen zur Vesikelherstellung, wie pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur
des Rehydrierungsmittels, wie auch das Substrat, auf dem die Vesikel gebildet werden und die
dam setzung usw. sind
Es existieren jedoch
keine allgem r Bildung von
GUV. Allgem
Rehydrierungsm ormation
ss höher als
die Phasenü it sich große Strukturen
in Form
eiden.
orüberlegungen angestellt, die in 3.2.4.1 beschrieben werden.
bhängigkeit vom
ert
zwischen 7-9 angegeben.[133-135]
Um den Einfluss des pH-Werts auf die Selbstaggregation von Catalipiden im
Rehydrierungspuffer in Abhängigkeit des Protonierungsgrades der Imidazolfunktionen zu
klären, wurden Versuche im pH-Wert Bereich zwischen pH 4 und pH 8.5 gemacht. Ein
it erzeugte Beschaffenheit des Lipid-Films, die Lipid-Zusammen
speziell zu beachtende Parameter im Herstellungsprozess von GUV.[131]
ein gültigen Reaktionsbedingungen für unterschiedliche Lipide zu
ein sollte jedoch beachtet werden, dass der pH-Wert des Rehydrierungspuffers
bei protonierbaren Lipiden in der Nähe ihres pKa-Wertes liegt und die Ionenstärke des
ediums nicht größer 10 mM sein soll - insbesondere bei der Elekrof
(siehe Kapitel 3.2.9.1 und 3.2.9.2). Die Konzentration der Lipide in der Rehydrierungslösung
muss in der Größenordnung ihrer CMC liegen und die Reaktionstemperatur mu
bergangstemperatur Tm der eingesetzten Lipide sein. Dam
von GUV ungestört ausbilden können, ist zudem ein Schütteln während der
Vesikelbildung zu verm
Um aus den synthetisierten Catalipiden geeignete Kandidaten mit Potential zur Bildung von
GUV unter den geforderten Reaktionsbedingungen (siehe Kapitel 3.2.2) zu finden, wurden
V
3.2.4.1 Auswahlkriterien geeigneter Reaktionsbedingungen zur Catalipid-
Vesikelherstellung
Alle synthetisierten Catalipide verfügen über eine Imidazolfunktion, die in A
pH-Werte des Rehydrierungsmediums mehr oder weniger protoniert vorliegen kann. Der
pKa-Wert der Imidazolfunktion des L-Histidins 6 liegt bei 6 und des Histamins 7 bei 5.[132]
Assoziieren die Catalipide zu supramolekularen Aggregaten, könnte dies zu einer Änderung
des pKa-Wertes der Imidazolfunktion der assoziierten gegenüber den monomer vorliegenden
Catalipiden führen. Das Phänomen der Änderung des pKa-Wertes in Folge von
Aggregationen ist unter anderem auch für Fettsäuren beschrieben: In freier, monomerer Form
besitzen sie einen pKa-Wert von ~ 4.7; für assoziierte, membranständige wird ein pKa-W
91
unterschiedlicher Protonierungsgrad der Imidazolfunktion hat signifikanten Einfluss auf die
o gations-
supramolekularen Strukturen.
effektive Kopfgruppenöberfläche a (siehe 3.2.1.3) und somit auch auf das Aggre
verhalten zu unterschiedlichen
Um zusätzlich den Einfluss der Ionenstärke des Rehydrierungspuffers auf die Vesikelbildung
zu untersuchen, wurden gepufferte Lösungen in 4 mM und 40 mM Konzentration hergestellt
(siehe Tabelle 6), wobei die Rehydrierungspuffer-Konzentration von 40 mM den Einfluss
hoher Ionenstärken auf die Selbstaggregation der Catalipide zeigen sollte.
Tabelle 6. Verwendete Rehydrierungspuffer, pKa-Werte der Puffer bei 25 ºC und eingestellte pH-Werte. 2-Morpholinoethansulfonsäure (MES), 2-(N´-Hydroxyethyl-piperazino)-ethansulfonsäure (HEPES).
Rehydrierungs-Puffer pKa–Werte bei 25 ºC Eingestellte pH-Werte
Natriumacetat (NaOAc) 4.76 4.2, 4.5, 5
MES 6.10 6.5
HEPES 7.48 7.0, 7.6, 8.3
Nach grober „Vorselektion“ wurden aussichtsreiche Catalipid Kandidaten zur Vesikel-
herstellung näher untersucht.
3.2.4.2 Herstellung der Catalipid-Dispersionen über die Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode
sichtlich der
öglichen, wurde die Dehydrierungs-Rehydrierungs-
ethode (siehe 3.2.3.1) angewandt. Hierzu wurden Stammlösungen der jeweiligen Catalipide
aus denen nach kontrollierter Hydratation und folgender
Um ein möglichst schnelles Screening der synthetisierten Catalipide hin
angestrebten Vesikelbildung zu erm
M
in einem Gemisch aus Chloroform und Methanol hergestellt. Anschließend wurde soviel
Stammlösung in ein 1 ml Glasgebinde überführt, dass nach Zugabe von 500 μl gepufferter
Rehydrierungslösung Lipid-Konzentrationen zwischen ein und fünf mM vorlagen. Das
organische Lösungsmittelgemisch wurde unter ständigem Drehen des Gebindes in leichtem
Argonstrom verdampft, wobei darauf geachtet wurde, dass ein möglichst ungleich dünner
Lipid-Film - durch langsames und schnelleres Drehen des Gebindes - an der Glaswandung
entstand. Der inhomogene Lipid-Film soll die Wahrscheinlichkeit der Vesikelbildung im
Rehydrierungsschritt erhöhen, da so verschieden präorganisierte Lipid-Doppellagen auf der
Glaswandung gebildet werden,
Krümmung der Doppellagen die Vesikel entstehen (siehe Abbildung 40).
Nachdem die verschiedenen Rehydrierungspuffer (siehe Tabelle 6) zu den synthetisierten
Catalipiden gegeben wurden, ließ man diese für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur
92
ruhen. Zeigte sich eine Trübung der Lösung, deutete man dies als Indiz auf die Ausbildung
von mizellaren oder vesikulären Überstrukturen. Blieb die Lösung klar, wurde diese kurz im
Ultraschallbad behandelt, um den nicht abgelösten Lipid-Film zu dispergieren. War dies nicht
ählten
ehydrieungspuffern (siehe Tabelle 6) leichter stabile Dispersionen als Catalipide mit
gesättigten Alkylketten, die gar nicht, oder nur mäßig, n en
Rehydrierungspuffern löslich waren und nach kurzer Zeit wieder ausfielen. Aufgrund
positiver E se wurden die Catalipide MOH 39 und DOSH 54 (s ldung 41)
enauer auf die Eigenschaften der Selbstaggregation zu vesikularen Strukturen untersucht.
möglich, erwärmte man die Probe zusätzlich noch langsam auf maximal 45 ºC, um die
Überschreitung der Phasenübergangstemperatur Tm des Catalipids zu gewährleisten.
3.2.4.3 Selektierte Catalipide zur Vesikelherstellung
Catalipide mit ungesättigten Alkylketten im Molekül bildeten in den ausgew
R
ach Sonifizieren in d
rgebnis iehe Abbi
g
Die Abkürzungen MOH und DOSH für die Catalipide 39 und 54 resultieren aus: M bzw. D
für Mono- bzw. Di- (Anzahl der Alkylketten im Lipid); O für Oleyl; S - im Fall des Catalipids
54 für Serin und H für den Grundkörper der Catalipide dem Histamin.
pide 39 und 54
ausgewählten Rehydrierungspuffern (siehe Tabelle 6)
ildeten.
signifikant auf das
Vorversuche zeigten, dass eine 4 mM Konzentration der ausgewählten Catali
stabile, trübe Dispersionen in den
b
Abbildung 41. Ausgewählte Catalipide MOH 39 und DOSH 54, die stabile, trübe Dispersionen unter den gewählten Reaktionsbedingungen ausbildeten.
Beide Catalipide MOH 39 und DOSH 54 besitzen Histamin als hydrophile Kopfgruppe,
unterscheiden sich jedoch signifikant im hydrophoben Teil des Moleküls: MOH 39 gehört zur
Strukturklasse der einkettigen Lipide, DOSH 54 zu den zweikettigen. Da die Anzahl der
Alkylketten, die die Hydrophobie der Moleküle bestimmt, wirkt sie sich
NH
N
NH
O
NH
O (CH2)7
O
O (CH2)7 (CH2)7CH3
(CH2)7CH3
NHN
NH
(CH2)7
O
(CH2)7CH3
MOH 39 DOSH 54
Aggregationsverhalten der Moleküle aus: Sowohl bzgl. der Struktur und Stabilität der
93
gebildeten Lipid-Doppellagen, als auch auf die unterschiedlichen dynamischen Eigenschaften
der Einzel-Lipide im Aggregat (siehe 3.2.1.6).
Einkettige Lipide sollten aufgrund der geringeren hydrophoben Wechselwirkungen in der
Doppellage eine größere Dynamik besitzen. Diese wäre vergleichbar mit derjenigen in
mizellaren Strukturen und würde sich damit auch unmittelbar auf die Wahrscheinlichkeit des
Lipid Flip-Flop-Mechanismuses auswirken.[119] Dies kann jedoch andererseits auch zu einer
der supramolekularen Aggregation der
ren und Morphologien
ky beschrieben.[136] Im Gegensatz zur normalen Lichtmikroskopie wird nicht das
anze Präparat durchleuchtet, sondern mit einem Beleuchtungspunkt abgerastert, die
Im
luoreszenzfarbstoffe . Solche Fluoreszensmikroskope rastern entweder mit einem
mal,
odurch eine höhere Geschwindigkeit der Bildaufnahme erreicht werden kann. Bei den
reduzierten Stabilität der gebildeten Vesikel führen.
Im folgenden werden die Untersuchungen
ausgewählten MOH und DOSH Lipide beschrieben. Hieraus sollten Informationen erhalten
werden, inwieweit die spezifischen Eigenschaften der Catalipide zur chemischen
Implementierung des Minimalen Chemoton Modells geeignet sind.
3.2.5 Konfokale Mikroskopie zur Untersuchung der Catalipid-Dispersionen
Die Untersuchung der Catalipid-Dispersionen aus 39 und 54 in den ausgewählten
Rehydrierungspuffern erfolgte unter anderem mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop
(Mikroskop 3, siehe Experimenteller Teil 2) um mögliche Feinstruktu
der gebildeten supramolekularen Aggregate qualitativ zu bestimmen.
Das grundlegende Prinzip der konfokalen Mikroskopie wurde 1957 in einer Patentanmeldung
von Mins
g
Lichtintensität nur punktuell gemessen und dann das Gesamtbild nachträglich rekonstruiert.
Strahlengang befindet sich eine Lochblende, so dass das von außerhalb der Schärfeebene
kommende Licht blockiert werden kann. Hierdurch wird die Schärfentiefe erheblich
verringert, wodurch die Auflösung entlang der optischen z-Richtung steigt. Heutzutage
benutzen die meisten Geräte Laserlicht zur Anregung ggfls. in der Probe enthaltener
F
fokussierten Laserstrahl das Präparat ab, oder erstellen eine ganze Bildzeile auf ein
w
konfokalen Mikroskopen mit rotierenden Scheiben, sog. „Spinning-Disk“ Geräten werden
viele Punkte genutzt, um jeweils Teilbereiche der Probe abzurastern. Die Aufnahme der
Schnittbilder erfolgt üblicherweise mit einer CCD-Kamera, die das von dem Objekt in der
Fokusebene reflektierte Licht aufzeichnet.
94
3.2.5.1 Probenpräparation der Catalipid-Dispersionen zur mikroskopischen
Untersuchung
Die ersten Versuche zur Catalipid-Vesikelherstellung wurden im Rahmen eines
Forschungsaufenthalts an der University of Tokio, Komaba, Japan in der Gruppe von Prof.
Tadashi Sugawara und in Kooperation mit Dr. Taro Toyota begonnen und später in der Ruhr-
Universität Bochum weiterverfolgt und erweitert.
Vorversuche zum Dispergierverhalten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 hatten gezeigt,
dass eine 4 mM Konzentration der Lipide in den ausgewählten Rehydrierungspuffern (siehe
Tabelle 6) stabile Dispersionen ausbildeten.
Zur mikroskopischen Untersuchung wurden 25 μl der entsprechenden Dispersion unverdünnt
auf ein Objektträgerglas pipettiert. Zur Verringerung der Scherkräfte, die beim Aufziehen der
g fragiler
olekularer Strukturen führen könnten, wurde der vordere Durchmesser der
s in freier Lösung - als gleichmäßig hell
er dem Mikroskop erscheinen.[137]
Dispersion in die Plastikpipettenspitze auftreten und zu einer Zerstörun
supram
Plastikspitze durch Abschneiden der Spitze vergrößert. Um bei der Probenentnahme eine
möglichst hohe Vesikelkonzentration anzutreffen, fand die Probenentnahme in räumlicher
Nähe zum Boden, bzw. dem Glasrand statt, also direkt am rehydrierten Lipid-Film. Nachdem
die Catalipid-Dispersion auf den Objektträger pipettiert war, ließ man schräg auf den Tropfen
ein Abdeckgläschen fallen, um den Einschluss von Luftblasen möglichst zu vermeiden. Die
Übergänge vom Abdeckgläschen zum Objektträger wurden zur Fixierung mit klarem
Nagellack versiegelt, um ein Verrutschten der Glasplatten gegeneinander und ein Verdampfen
des Lösungsmittels während des Mikroskopierens zu verhindern.
Eine elegantere Methode, die Dispersion auf einen Objektträger zu platzieren, bieten die
doppelseitig-klebenden Frame-Seal™ Kammern, die bei der Firma Bio-Rad erhältlich sind.
Diese werden mit einer Seite auf den Objektträger geklebt, wobei die innere Kammer ein
definiertes Volumen darstellt, das mit der Dispersion befüllt wird. Nachträglich wird die
Kammer mit einem Abdeckgläschen verschlossen. Hierdurch wird eine Zerstörung fragiler
supramolekularer Objekte durch äußere Scherkräfte verhindert, und zusätzlich schweben die
Aggregate frei in der Lösung. So ist deren freie, ungestörte mikroskopische Betrachtung
möglich, da die Strukturen aufgrund der höheren Füllhöhe nicht so schnell auf der
Glasoberfläche adsorbiert werden. Durch die brownsche Molekularbewegung bewegen sich
die Vesikel langsam durch die Lösung, wohingegen die meisten Öltröpfchen an der
Glasoberfläche adsorbiert vorliegen, oder - fall
leuchtende kleine Punkte unt
95
3.2.6 alten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 im pH-Wert Bereich
zwischen 4 und 5
Ausbildung supramoekularer
Werten (4.2, 4.5 und 5).
Aggregationsverh
Zur systematischen, mikroskopischen Analyse der spezifischen Aggregationseigenschaften
der selektierten Catalipide MOH 39 und DOSH 54 wurde zunächst der Einfluss des pH-Werts
und der Salzkonzentration des Rehydrierungspuffers auf die
Aggregate untersucht.
Zunächst erfolgte die Herstellung der Catalipid-Dispersionen in Natriumacetatpuffer bei zwei
unterschiedlichen Konzentrationen (4 und 40 mM) und drei pH-
Zur Herstellung der entsprechenden Catalipid-Dispersionen setzte man die Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode ein (siehe 3.2.4.2). Die Lipidkonzentration hielt man dabei konstant
bei 4 mM. Vorversuche zeigten, dass unabhängig vom eingesetzten Catalipid MOH oder
DOSH, bei dieser Konzentration im zu untersuchenden pH-Wert Bereich (zwischen 4 und
8.5) stabile, trübe Dispersionen erhalten werden konnten. Die erste Probenentnahme aus den
Catalipid-Dispersionen erfolgte nach einer Reaktions- bzw. Entwicklungszeit von mindestens
zwei Stunden. Zur Abschätzung der Langzeitstabilität bzw. zur Untersuchung des
Alterungsprozesses und damit verbundenen, möglichen morphologischen Veränderungen der
supramolekularen Aggregate, wurde den Dispersionen nach einigen Tagen eine weitere Probe
entnommen und mikroskopisch untersucht. Im Folgenden sind ausgewählte - für die
speziellen Reaktionsbedingungen als charakteristisch erachtete - mikroskopische Aufnahmen
der unterschiedlichen Aggregationsformen der Catalipide tabellarisch gegenübergestellt, um
den Einfluss unterschiedlicher Ionenstärke des Rehydrierungspuffers auf das Aggregations-
verhalten der Catalipide und den Alterungsprozess der supramolekularen Aggregate zu
verdeutlichen. Um die Beschaffenheit der Dispersion (mono- oder polydispers) darzustellen,
wurden mikroskopische Aufnahmen mit einer 20fachen Vergrößerung abgebildet, da auf
diesen ein großer Ausschnitt des Objektträgers zu erkennen ist. Zur genauen Bestimmung der
Feinstruktur einzelner supramolekularer Aggregate wurde dann eine 100fache Vergrößerung
verwendet.
Die folgenden mikroskopischen Analysen der Catalipid-Dispersionen und daraus abgeleitete
Schlussfolgerungen zur Einschätzung der strukturspezifischen Eigenschaften der gebildeten
supramolekularen Aggregate (Stabilität, Morphologie, Beschaffenheit der Membranen etc.),
sind rein qualitative Beurteilungen.
96
3.2.6.1 MOH 39 Catalipid-Dispersionen bei pH = 4, 4.2 und 5
In den folgenden Tabellen sind mikroskopische Aufnahmen der supramolekularen Aggregate
ntrationen des Rehydrierungspuffers (40 mM bzw. 4 mM).
des MOH 39 Catalipids (siehe Abbildung 42) gezeigt, die sich bei einem bestimmten pH-
Wert gebildet haben. Um zusätzlich den Einfluss der Ionenstärke des Rehydrierungspuffers
bei gegebenen pH-Wert auf das Aggregationsverhalten zu untersuchen, verwendete man zwei
unterschiedliche Konze
NH
Abbildung 42. Chemische Struktur des MOH 39 Catalipids.
Zuerst wurde das Aggregationsverhalten des MOH 39 (siehe Abbildung 42) in Natriumacetat-
Puffer bei pH = 4.2 untersucht (siehe Tabelle 7).
Tabelle 7. Mikroskopische Aufnahmen 4 mM MOH 39 Dispersionen in 40 mM und 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.2. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 20x Vergrößerung: 70 µm; Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
[c]
NaOAc nach zwei Stunden nach zwei Stunden nach drei Tagen
40 mM
B-1 (20x) B-2 (100x) B-3 (100x)
4 mM
B-4 (20x) B-5 (100x) B-6 (100x)
NHN O
97
In Bild B-1 liegt eine polydisperse Dispersion vor, in der unterschiedlich große und helle
ngungen sind neben wenigen sphärischen
mung zu
sphärischen Vesikel könnte im Entstehungsprozess durch eine zu hohe Ionenstärke in
der Lösung gehemmt worden sein. Auch erkennt man in B-2 neben den unförmigen Vesikeln
nd der brownschen
ltröpfchen deu tionsbedingungen im
l der Öltröpfchen weiter zu, im Einklang mit
er Abnahme der unregelmäßig geformten Aggregate, was auf einen relativ schnellen Zerfall
rkonzentration - unter sonst gleich
bleibenden Reaktionsbedingungen - abgebildet. Bereits bei einer 20x Vergrößerung wirkt die
4 (4 ichen m Ac), mon sind
deutlich größere, ner 100x Vergrößerung kann die
Feinstruktur der gebildeten supramolekularen Aggregate erkannt werden, die verglichen mit
B-2 (40 mM NaOAc) viel flexiblere, unilamellarere Membranen aufweisen und GUV zeigen.
Abbildung 39) zu erkennen, in denen kleinere
Vesikel eingeschlossen sind (B-5, oben rechts). Die Gesamtzahl der entstandenen GUV ist
hoch und liegt in einer gleichm ßigen Größenverteilung. Im Vergleich zu B-2 (40 mM
NaOAc) liegen in Dispersion weni hen vor. Nach dreitägiger Alterung
der Dispersion bei Raumtemperatur (siehe B-6) sind neben den, in B-5 gezeigten,
charakteristischen GUV zum Teil noch größere vesikuläre Strukturen entstanden, die auch
röhrenartige Morphologien besitzen. Unter dem Mikroskop erscheinen diese Membranen
dünnwandig und flexibel. Zum Teil sind diese Strukturen mit kleineren Vesikeln befüllt
erkennen ist. Im Vergleich zu B-3 sind nur
enige Öltröpfchen in der Dispersion zu erkennen, was auf eine höhere Stabilität der
gebildeten GUV in dem geringer konzentrierten 4 mM Natriumacetatpuffer, d.h. bei
Objekte zu sehen sind und deren Feinstruktur erst bei einer 100x Vergrößerung (siehe B-2)
erkennbar wird. Unter diesen Reaktionsbedi
Vesikeln viele unregelmäßig geformte Aggregate entstanden. Die Membranen dieser Objekte
wirken unter dem Mikroskop wenig flexibel - eher starr -, vergleichbar mit dispergierten
Kolloidteilchen. Diese unregelmäßig geformten Aggregate könnten auf eine
Zusammenlagerung von nur partiell ausgebildeten, nicht sphärischen Membranabschnitten
hinweisen. Die Separation der einzelnen Lipid-Doppelschichten und deren Krüm
einem
viele kleinere, hell-leuchtende, runde Öltröpfchen, die sich aufgru
n. Die hohe Anzahl der fein dispergierten
tet zusätzlich auf nicht optimale Reak
Molekularbewegung schnell und ungerichtet bewege
Ö
Entstehungsprozess der Vesikel hin. Nach einem dreitägigen Alterungsprozess der Dispersion
bei Raumtemperatur (siehe B-3) nahm die Anzah
d
dieser Objekte hindeutet.
B-4 ist die MOH 39 Dispersion bei 4 mM NaOAc-PuffeIn
Probe B- mM NaOAc), vergl it B-1 (40 mM NaO odisperser. Auch
sphärische Objekte zu erkennen. Bei ei
Neben GUV sind auch MLGV (siehe 3.2.1.6,
ä
der in der ger Öltröpfc
(MVGV), wie es in B-6 (Mitte, linker Rand) zu
w
98
niedrigerer Ionenstärke, hindeutet. In Tabelle 8 werden mikroskopische Aufnahmen der MOH
39 Catalipid Dispersionen gezeigt, die in Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.6 hergestellt
wurden. Die Dispersionen zeigen bei 20x Vergrößerung B-7 (40 mM NaOAc) und B-10
(4 mM NaOAc) ähnliche Ergebnisse wie jene, die bei einem niedrigeren pH-Wert von 4.2
hergestellt wurden (siehe Tabelle 7, B-1 40 mM, B-4 4 mM).
Tabelle 8. Mikroskopische Aufnahmen 4 mM MOH 39 Dispersionen in 40 mM und 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.6. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 20x Vergrößerung: 70 µm; Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
[c]
NaOAc nach zwei Stunden nach zwei Stunden nach drei Tagen
40 mM
B-7 (20x) B-8 (100x) B-9 (100x)
B-10 (20x) B-11 (100x) B-12 (20x)
4 mM
Wie in B-11 zu erkennen ist, bildeten sich bereits bei einer Pufferkonzentration von 4 mM
nach zweistündiger Entwicklungszeit, große unilamellare Vesikel mit flexiblen Membranen,
die auch MVGV Strukturen aufwiesen. Bei einem niedrigeren pH-Wert von 4.2 waren solche
ausgeprägten Strukturen in dieser Größe erst nach dreitägiger Entwicklungszeit zu erkennen
(siehe B-6, Tabelle 7). Die dreitägige Alterung der 4 mM Dispersion bei pH = 4.6 bei
Raumtemperatur (B-11 zu B-12) zeigte keine gravierenden Veränderungen der Morphologie
der gebildeten vesikulären Strukturen. Auch konnte kein Anstieg der Öltröpfchenanzahl
erkannt werden, was auf eine verbesserte Langzeitstabilität der gebildeten Vesikel bei
pH = 4.6 hinweist. Dieser Befund ist so zu deuten, dass die durch Protonierung verursachten,
abstoßenden Wechselwirkungen der Imidazol-Kopfgruppen in der äußeren Lipid-Doppellage
bei pH = 4.6 (siehe Tabelle 8) weniger ausgeprägt sind als bei pH = 4.2 (siehe Tabelle 7).
Dieser Effekt könnte die höhere Stabilität der MOH-Vesikel bei pH = 4.6 erklären.
99
In Tabelle 9 werden mikroskopische Aufnahmen der 4 mM MOH 39 Dispersionen in
Natriumacetat-Puffer (4 mM und 40 mM) bei pH = 5 gezeigt.
Tabelle 9. Mikroskopische Aufnahmen 4 mM MOH 39 Dispersionen in 40 mM und 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 5. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 20x Vergrößerung: 70 µm; Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
[c]
NaOAc nach zwei Stunden nach zwei Stunden nach drei Tagen
40mM
B-13 (20x)
B-14 (100x)
B-15 (100x)
überstehende Lösung
B-16 (20x)
aufg ND eschüttelter
B-19 (100x)
B-18 (100x)
4mM
B-17 (20x)
B-20 (20x)
100
B-13 (siehe Tabelle 9) zeigt die 20x Vergrößerung der MOH-Dispersion nach zweistündiger
Entwicklungszeit, wobei in Form und Größe sehr unterschiedliche Strukturen zu erkennen
ind. Die Morphologien der einzelnen supramolekularen Aggregate der polydispersen
ßig geformten Vesikeln, die ähnliche
Morphologien zeigen wie jene, welche bei niedrigerem pH-Wert gleicher Pufferkonzentration
lt wu Tabelle 7 ), sind auch röhrenartige
Strukturen (B-14, von links oben nach rechts unten verlaufend), sowie dünnschichtige
Plättchen (B-14, linker oberer Bildrand, rechteckiger Schatten) zu erkennen. Nach dreitägiger
Alterung der Dispersion bei Raumtemperatur fiel ein feiner Niederschlag aus. B-15 (Tabelle
9) zeigt die mikroskopische Aufnahme der überstehenden Lösung in 100x Vergrößerung, in
der jetzt, neben d nterschiedlichs vorzugt dünnschichtige Plättchen,
wie auch wenige Öltröpfchen zu erkennen sind. Nachfolgend wurde der Niederschlag der
Dispersion vorsichtig aufgeschüttelt und nochmals mikroskopiert. In B-16 (Tabelle 9 e
lags bei 20x Vergrößerung gezeigt. In der polydispersen
Lösung (vergleichbar mit B-13) lagen zusätzlich zu den in B-15 zu erkennenden Strukturen
sehr große Strukturen vor, di n Köcher erinnerten.
B-17 zeigt die MOH-Dispersion bei 4 mM NaOAc-Pufferkonzentration nach zweistündiger
Entwicklungszeit. In dieser Dispersion sind unterschiedliche supramolekulare Aggregate zu
erkennen: Zum einen helikale Objekte unterschiedlicher Ganghöhe und Größe, sowie auch
röhren- und schlauchartige Strukturen (teilweise gedreht). Es wurden auch einige dünn- und
dickschichtige Plättchen gebildet, die neben Vesik n zu erkennen sind ( abelle
9). Nach einem dreitägigen Alterungsprozess bei Raumtemperatur fiel aus der Dispersion ein
feiner Niederschlag aus. Bild B-19 zeigt die überstehende Lösung bei in 100 x Vergrößerung,
bei der in ihrer e unterschiedl (MLGV, aber auch unilamellare
Vesikel - siehe Bildmitte -) neben dickeren Plättchen und vielen Öltröpfchen vorliegen. Bild
B-20 zeigt die mikroskopische Aufnahme in 20x Vergrößerung des vorsichtig
aufgeschüttelten Niederschlags. Hier sind viele Vesikel, aber auch dicke und größere
Plättchen zu erkennen. Die gedrehten (helikalen) röhren- und schlauchartigen Strukturen, die
zwei Stunden nach dem Rehydrierungsprozess zu erkennen waren (siehe B-17), sind nicht
mehr vorhanden. Es ist daher zu vermuten, dass die Strukturen zu den stabileren
plättchenartigen umlagerten.
Die pH-Wert abhängige Bildung unterschiedlicher supramolekularer Aggregate - von
Vesikeln zu gedrehten (helikalen) röhren- und schlauchartige Strukturen, bis hin zu
s
Dispersion sind erst bei einer 100x Vergrößerung (B-14) unter dem Lichtmikroskop
rkennbar. Neben größeren MLGV und unregelmäe
hergestel rden (siehe B-2, und B-8, Tabelle 8
en MLGV u ter Größe, be
) ist di
Beschaffenheit dieses Niedersch
e an eine
el siehe B-18, T
Morphologi iche Vesikel
101
plättchenartigen Strukturen - könnte durch den unterschiedlichen Protonierungsgrad der
hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen erklärt werden. Die positive Ladung sollte maßgeblich
einen Einfluss auf die optimale Kopfgruppenoberfläche a0 des Einzel-Lipids nehmen und
somit auch die Geometrie des supramolekularen Aggregats in Richtung gekrümmter
Strukturen beeinflussen (siehe 3.2.1.2 und 3.2.1.3). Der pKa-Wert des freien, in Lösung
vorliegenden Histamins 7 liegt für die Imidazolfunktion bei pKa = 5.[132] Wird nun der MOH
Catalipid-Film in Natriumacetat-Puffer bei pH < 5 rehydriert, liegen die meisten Imidazol-
funktionen der Lipide protoniert vor. Dies führt durch abstoßende Wechselwirkungen der
protonierten hydrophilen Kopfgruppen zu einer großen Kopfgruppenoberfläche a des Lipids
(siehe 3.2.1.3, Abbildung 38 „head-group repulsion“). Die Packungsgeometrie des
protonierten MOH 39 Catalipids sollte somit auf einen abgestumpften Kegel zurückzuführen
sein, wodurch die Bildung entsprechend vesikulärer Strukturen gefördert wird (siehe Tabelle
5, Typ 3).
Ähnliche Strukturen beschrieben Luisi et al. bei der Selbstaggregation von aminosäure-
basierten Phosphatidyl-Lipiden mit negativ geladener Kopfgruppe.[138]
Liegt der pH-Wert des Rehydrierungspuffers in der Nähe des pKa-Wertes der Imidazol-
Kopfgruppen (pKa = 5), so liegen sowohl protonierte als auch unprotonierte MOH Catalipide
nebeneinander in der Lösung vor. Die Unprotonierten weisen im Vergleich zu den
protonierten kleinere Kopfgruppenoberflächen a auf. Die abstoßenden Wechselwirkungen der
positiven Ladungen sind kaum vorhanden. Die Packungsgeometrie des MOH Catalipids wird
dadurch zylinderartig, wodurch die Bildung planarer Doppellagen begünstigt wird (siehe
3.2.1.3, Tabelle 5 Typ 4).
Neben der pH-Wert abhängigen Verkleinerung der Kopfgruppenoberfläche a beim pKa-Wert
der Imidazolfunktion und den damit verbundenen Änderungen der Geometrie der gebildeten
Aggregate, treten zusätzliche, spezifische intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den
MOH Catalipden in der Lipid-Doppellage auf.
102
Im Fall der unprotonierten Imidazolfunktionen können sich starke intermolekulare
Wasserstoffbrückenbindungen (WBB) ausbilden: Zum einen - in der Peripherie der Lipid-
lage - zwischen den unprotonierten Imidazol-Kopfgruppen a; zum anderen in der darunter
liegenden Ebene zwischen dem Wasserstoffatom der Amidbindung des einen Catalipids und
der Carbonylgruppe des nachbarständigen Catalipids b (siehe Abbildung 43).
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
NNH
NHO
a
b
n
NNH
NHO
NNH
NHO
NH
NH+
NHO
NH
NH+
NHO
NH
NH+
NHO
NH
NH+
NHO
c
b
NH+
NH
NH Ob
n
a
Abbildung 43. Links: Intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen der nachbarständigen MOH Catalipide in der Lipid-Doppellage (idealisiert): a zwischen den unprotonierten Imidazol-Kopfgruppen; b zwischen den Amidbindungen der nachbarständi
πgen MOH Catalipide. Rechts: c abstoßende Wechselwirkungen zwischen den
en auftreten und zur linearen Anordnung der
Amidfunktionen im Polymer führen. Diese intermolekularen WBB zwischen den einzelnen
Catalipiden unterstützen die stabile Bildung plättchenartiger Strukturen in der Dispersion.
Liegen die in der Peripherie der Lipid-Doppellage angeordneten Imidazol-Kopfgruppen
protoniert vor, so treten an diesen Stellen abstoßenden Wechselwirkungen auf (siehe
Abbildung 43, c), wodurch eine größere Kopfgruppenoberfläche eingenommen wird. Die
Catalipide werden durch die intermolekularen WBB zwischen den Amidbindungen in der
darunter liegenden Ebene b und den hydrophoben Wechselwirkungen der Alkylketten
zusammengehalten, so dass die abstoßenden Wechselwirkungen der protonierten Imidazol-
Kopfgruppen nicht zur Dissoziation führen, sondern zur Präorganisation einzelner Building-
am N -Stickstoff protonierten Imidazol-Kopfgruppen und b attraktive WBB zwischen den Amidbindungen der nachbarständigen MOH Catalipide.
Die Ausbildung der intermolekularen WBB zwischen den Catalipiden können mit denen
verglichen werden, die in sog. Amid-Polymer
103
Blocks unterschiedlicher Krümmung - je nach Protonierungsgrad. Der Einbau nicht protoniert
vorliegender Imidazol-Kopfgruppen führt daher nicht zu einer idealisiert regelmäßigen
Krümmung der Lipid-Doppellage, die eine Bildung sphärischer Vesikel unterstützten würde,
sondern induziert eine abweichende Richtung der Lipidpackung. Hierdurch können
asymmetrische Packungen entstehen, die zu gedrehten, helikalen Strukturen unterschiedlicher
anghöhe und Windungszahl führen, so wie sie neben Vesikeln zu erkennen sind (siehe B-
17; Tabelle 9; 4 mM bei pH = 5).
Liegt der pH-Wert der MOH Catalipid-Dispersionen in der Nähe des pKa-Wertes der
Imidazolfunktion des Catalipids, bewirkt der sich hier sprunghaft ändernde Protonierungsgrad
der Imidazol-Kopfgruppen - zusätzlich beeinflusst von den intermolekular ausgebildeten
Wasserstoffbrückenbindungen in den zwei Ebenen a und b der Lipidlage - (siehe Abbildung
43), die Ausbildung verschiedener, nebeneinander vorliegender Morphologien der
supramolekularen Aggregate, so wie sie schematisch idealisiert in Tabelle 10 illustriert ist.
Tabelle 10. Idealisierte, schematische Darstellung der bevorzugt gebildeten supramolekularen Aggregate in Abhängigkeit vom Protonierungsgrad der Imidazol-Kopfgruppe des MOH Catalipids. + : protoniertes Catalipid, 0 : unprotoniertes Catalipid.
Protonierungsgrad der Imidazol-Kopfgruppe
hoch: + + + + + +
+ 0 + + + 0 0 0 + +
niedrig: 0 0 0 0 0 0 0 0
G
bevorzugte Struktur
asserstoffbrücken-
sphärische
Ebene b
gedrehte, helikale
plättchenartige
Ebene a und b
W
Bindungen
Die ersten in der Literatur beschriebenen, synthetisch hergestellten Lipide, die chirale
Doppellagen ausbildeten, waren Aminosäure enthaltende Amphiphile, die zwei hydroph[139]
obe
Alkylketten im Molekül enthielten und von Kunitake et al. beschrieben wurden. Diese
Moleküle zeigten morphologische Transformationen von sphärischen, geschlossenen Lipid-
Doppellagen (Vesikeln) zu helikalen Strukturen beim Abkühlen der Dispersionen auf eine
Temperatur, die unterhalb der spezifischen Phasenübergangstemperatur Tm des Lipids lag.[138]
Ähnliche morphologische Transformationen zeigten unterschiedliche chirale, amphiphile
Moleküle, wie z. B. natürlich vorkommende Phosphorlipide,[140, 141] Phosphatidyl-
nukleoside[142-144] oder N-Alkylgluconamide.[145, 146]
104
Das Phänomen des unterschiedlichen Auftretens von Vesikeln und helikalen, röhrenförmigen
supramolekularen Aggregaten wurde beim Rehydrieren des MOH 39 Catalipids bei pH = 5, in
der Nähe des pKa-Wertes, beobachtet.
Eine Erklärung für das vom pH-Wert (pKa-Wert) abhängige, bevorzugte Auftreten von
Vesikeln oder helikalen, röhrenartigen Strukturen der Aggregation von MOH 39 Catalipiden
wäre über den Beitrag der Ausbildung der beschriebenen, unterschiedlich ausgebildeten WBB
in einer und / oder zwei Ebenen a und b (siehe Abbildung 43) zu erklären.
.2.6.2 DOSH 54 Catalipid-Dispersionen bei pH = 4, 4.2 und 5
SH Catalipids (siehe
bbildung 44) in Abhängigkeit des pH-Wertes und der Ionenstärke des Rehydrierungspuffers,
wurden Reaktionsbedingungen, analog zu den Experimenten des einkettigen MOH Catalipids,
gewählt (siehe 3.2.6.1).
sionen zeigte, dass verglichen m
Dispersion viele kleinere Aggre tstanden, die neben wenigen größeren vorlagen. In
dieser Arbeit sind daher nur mikroskopische Abbildungen der DOSH-Dispersionen mit 100x
Vergrößerung gezeigt.
Andererseits scheinen sich diese intermolekularen WBB innerhalb der ausgebildeten
Membran zu lösen, so dass ein lokales Aufbrechen und damit auch ein Stofftransport durch
solche Membranen möglich wäre. Das zeigt sich im Alterungsprozess der 4 mM MOH
Dispersion bei pH = 5 von B-17 (gedrehte Strukturen) nach B-20 (Plättchen) in Tabelle 9.
3
Zur Untersuchung des Aggregationsverhaltens des zweikettigen DO
A
Die mikroskopische Analyse der DOSH-Disper it den MOH-
en gate en
Abbildung 44. Chemische Struktur des Catalipids DOSH 54. In Tabelle 11 werden mikroskopische Aufnahmen der DOSH 54 Catalipid Dispersionen
gezeigt, die in Natriumacetat Puffer bei pH = 4.2 hergestellt wurden.
NHN
NH
O
NH
O
O
O
105
Tabelle 11. Mikroskopische Aufnahmen (100x Vergrößerung) von 4 mM DOSH-Dispersionen in 40 mM und 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.2. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
[c]
NaOAc nach zwei Stunden nach zwei Tagen
B-21 (100x) B-22 (100x)
40 mM
B-23 (100x) B-24 (100x)
4 mM
B-21 zeigt die DOSH-Dispersion nach zweistündiger Entwicklungszeit, in der sehr viele
kleinere und nur vereinzelt größere Vesikel neben vielen Öltröpfchen zu erkennen sind. Die
Bestimmung der Lamellarität der kleinen Vesikel ist aufgrund der zu geringen Größe nicht
möglich, die größeren wirken an auf den
Vesikelmem
frei in Lösu
Vesikelmem
eaktionsbedingungen nicht stabil und es existiert eine intermediäre Phase zwischen Lipid-
oppellage und mizellarer Öl-Phase.
röpfchen stieg nach zweitägiger Alterung
ge Langzeitstabilität der
esikel unter den Reaktionsbedingungen hin und unterstützt die Hypothese instabilerer
unilamellar. Bei näherer Betrachtung erkennt m
branen dunkle Flecken, die auf kleine Öltröpfchen hindeuten. Diese könnten auf
ng vorliegende Öltröpfchen zurückzuführen sein, die auf der bereits bestehenden
bran absorbiert werden; oder die Vesikel könnten unter den bestehenden
R
D
Die Anzahl der in der Dispersion vorliegenden Ölt
der Dispersion bei Raumtemperatur erheblich an, wobei nur noch sehr vereinzelt größere
Vesikel zu erkennen waren (siehe B-22). Dies weist auf eine gerin
V
106
Vesikelmembranen, wenn sich auf deren Oberfläche dunkle Flecken (mizellare Öl-Phase
abzeichnen.
?)
ehydri man das DOSH 54 Catalipid in dem geringer konzentrierten 4 mM
Natri -Puffer n Reaktionsbedingungen, entstand eine größere
Anzahl Vesikel (B-23), die jedoch zum größten Teil einen noch kleineren Durchmesser
besaßen. In der Dispersion waren im Vergleich zu B-21 (40 mM NaOAc) sehr viel weniger
Öltröpfchen zu erkennen, deren Anzahl auch nach einer zweitätigen Alterung bei
Raumtemperatur nicht merklich anstieg. Dies weist auf eine höhere Stabilität der gebildeten
Vesikel in dem geringer konzentrierten Puffer, also bei einer geringeren Ionenstärke der
Lösung, hin.
R erte
um-acetat unter sonst gleiche
107
Die mikroskopischen Aufnahmen in Tabelle 12 zeigen 4 mM DOSH-Dispersionen in
Natriumacetat-Puffer (40 mM bzw. 4 mM) bei pH = 4.6.
Tabelle 12. Mikroskopische Aufnahmen (100x Vergrößerung) 4m M DOSH 54 Dispersionen in 40 mM und 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.6. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
[c]
NaOAc nach zwei Stunden nach zwei Tagen
B-25 (100x) B-26 (100x)
40 mM
4 mM
B-27 (100x)
B-29 (100x)
B-28 (100x)
Der generelle Trend zur Ausbildung stabilerer Vesikel bei geringerer Ionenstärke des
Rehydrierungs-Puffers, der schon beim niedrigeren pH-Wert von 4.2 (siehe Tabelle 11)
beobachtet wurde, bestätigte sich bei den Versuchen bei pH = 4.6. Dies ist beim Vergleich der
108
Aufnahmen B-25 (40 mM NaOAc) mit B-27 (4 mM NaOAc) zu erkennen. Es zeigte sich eine
größere Anzahl freier Öltröpfchen und eine damit korrespondierende stärkere Abnahme
esikularer Strukturen nach einem zweitägigen Alterungsprozess bei Raumtemperatur in der
n
n (B-29).
ei pH = 4.6 (Tabelle 12) bildeten sich im Vergleich zu pH = 4.2 (Tabelle 11), unter sonst
gleichen Reaktionsbedingungen, größere Vesikel, die,
Aufn -27 und B-28 (4 mM NaOAc, Tabelle 12) gezeigt, sogar große MVGV
ausbildeten. Diese MVGV konnten jedoch nach zweitägiger Alterung der Dispersion bei
Raumtemperatur nicht mehr in der Probe aufgefunden werden (siehe B-29). In der Dispersion
lagen nur noch wenige GUV, dafür aber viele kleinere Vesikel und deutlich mehr freie
Öltrö or. Dies spricht für eine relativ geringe Langzeitstabilität der DOSH-Vesikel
unter diesen Bedingungen.
Die Stabilität der gebildeten Vesikel scheint bei pH = 4.6 (siehe Tabelle 12) im Vergleich zu
pH = 4.2 (siehe Tabelle 11) höher zu sein. Hierfür spricht sowohl die geringere Anzahl freier
Öltröpfchen in den Dispersionen, als auch die weniger ausgeprägten dunklen Punkte
(Öltröpfchen) auf den Vesikelmembranen.
Die mikroskopische Untersuchung der 4 mM DOSH-Dispersionen in 40 und 4 mM
Natriumacetat-Puffern bei pH = 5 zeigten Vesikel, vergleichbar mit denen, die bei pH = 4.6
entstanden sind (siehe Tabelle 12). Auch lagen keine signifikanten Unterschiede in den bereits
beschriebenen Trends bezüglich des Einflusses der Ionenstärke des Puffers auf die Vesikel-
bildung sowie der Alterung der Dispersionen bei Raumtemperatur zur Abschätzung der
Langzeitstabilität der Vesikel vor. Auf mikroskopische Abbildungen der einzelnen
Dispersionen wurde daher
Die Ausbildung helikaler oder plättchenartiger Strukturen neben Vesikeln, wie sie im Fall des
einkettigen MOH Catalipids bei pH = 5 beobachtet wurde (siehe Tabelle 9), trat beim
zweikettigen DOSH Catalipid nicht auf. Dies ist auf die unterschiedliche Struktur der
Catalipide 39 und 54 zurückzuführen:
Der signifikanteste, strukturelle Unterschied der Catalipide liegt in ihrer unterschiedlichen
Hydrophobie. DOSH besitzt im Gegensatz zum MOH zwei Alkylketten, die über den Serin-
erzweigungspunkt mit dem Histamin-Grundgerüst verbunden sind. Die Tendenz der
v
40 mM Natriumacetat-Puffer Dispersion (B-26), verglichen mit der 4 millimolare
Natriumacetat-Puffer Dispersio
B
wie in den mikroskopischen
ahmen B
pfchen v
verzichtet.
V
Selbstorganisation zu doppellagigen Lipidschichten, hervorgerufen durch alleinige
hydrophobe Wechselwirkungen, ist somit für das DOSH Catalipid größer und die Lipide
liegen daher hauptsächlich aggregiert in der Lipid-Doppellage vor. So kann es - in Folge der
109
Aggregation[133-135] (siehe 3.2.4.1) - zur Erhöhung des pKa-Wertes der Imidazol-Kopfgruppe
kommen. Die DOSH Catalipide lägen somit bei pH = 5 überwiegend protoniert vor und die
abstoßenden Wechselwirkungen der protonierten Imidazol-Kopfgruppen - in der Peripherie
der Lipid-Doppellage – sollten dominieren. Durch die damit verbundenen größeren Kopf-
gruppenoberflächen a der protonierten DOSH Lipide wäre die Geometrie des Einzel-Lipids
mit einem abgestumpften Kegel zu vergleichen, so dass die Ausbildung vesikulärer
Strukturen gegenüber planaren Doppellagen bevorzugt sein sollte (siehe 3.2.1.3, Tabelle 5,
Typ 3 versus Typ 4).
110
3.2.6.3 Gegenüberstellung des Aggregationsverhaltens von MOH 39 und DOSH 54 bei
pH = 4, 4.2 und 5
Zum Aggregationsverhalten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 ergibt sich, zusammen-
gefasst, folgendes Bild: Beide Catalipide MOH und DOSH bildeten Vesikel im pH-Wert
Bereich zwischen 4 und 5, die über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode hergestellt
wurden. Es zeigte sich, dass die ausgewählten Reaktionsbedingungen einen signifikanten
Einfluss auf die Entstehung, Morphologie und Stabilität der gebildeten Aggregate ausübten.
Bei 40 mM Rehydrierungspuffer Konzentration wurden generell weniger Vesikel ausgebildet
als bei einer 4 mM, unabhängig vom eingestellten pH-Wert und dem verwendeten Catalipid.
Auch konnten bei höherer Pufferkonzentration nach zweistündiger Entwicklungszeit mehr
freie Öltröpfchen in der Dispersion aufgefunden werden, deren Anzahl nach zweitägigem
Alterungsprozess bei Raumtemperatur noch weiter zunahm und mit der Abnahme größerer,
vesikularer Strukturen korrespondierte. Dies deutet auf eine geringere Stabilität der Catalipid-
Vesikel bei höheren Pufferkonzentrationen - also bei einer höheren Ionenstärke des
Dispersionsmediums - hin. Im Fall des einkettigen MOH-Catalipids entstanden bei pH = 4.2
und 4.6 in 40 mM Natriumacetat-Puffer bevorzugt unförmige, nicht-sphärische Aggregate
(siehe B-1, Tabelle 7; B-8, Tabelle 8) mit starren, unflexiblen Membranen. Diese könnten aus
Fragmenten von Teilmembranen entstanden sein - bedingt durch die höhere Konzentration
des Rehydrierungspuffers bei der Vesikelbildung. In den durchgeführten Experimenten zeigte
sich, dass auch der pH-Wert der Dispersion, wie bereits in 3.2.4.1 vermutet, einen besonderen
Stellenwert bei der Selbstaggregation der Catalipide zu supramolekularen Aggregaten
einnimmt: Dies wurde besonders im Fall des einkettigen MOH 39 Catalipids bei pH = 5 in der
Nähe des pKa-Wertes der Imidazolfunktion deutlich - hier entstanden vesikuläre, helikale und
plättchenartige Strukturen nebeneinander. Eine mögliche Erklärung liegt in dem
gleichzeitigen Vorkommen von protonierten und unprotonierten Imidazol-Kopfgruppen,
sowie der Möglichkeit der Ausbildung intermolekularer Wasserstoffbrückenbindungen in
zwei Ebenen (siehe 3.2.6.1, Abbildung 43 Ebene a und b) zwischen den MOH 39 Catalipiden
in der Lipid-Doppellage.
Das zweikettige DOSH 54 bildete ausschließlich Vesikel; andere Morphologien konnten in
den Dispersionen nicht aufgefunden werden. Dies könnte auf eine im Vergleich zu dem
einkettigen MOH 39 stärkere Protonierung der Imidazol-Kopfgruppe (assoziationsbedingte
Erhöhung des pKa-Wertes) zurückzuführen sein und somit zu einer vergrößerten Kopf-
gruppenoberfläche a führen. Damit träten bevorzugt kugelförmige, kleinere Strukturen auf.
111
Die Ergebnisse der Vesikelherstellung über die Dehydrierung-Rehydrierungsmethode mit den
Vesikel herstellen zu können. Ein höherer pH-Wert ist für die geplanten Ligationsreaktionen,
Inneren der Catalipid-Vesikel ablaufen sollen, unabdingbar.
Catalipiden 39 und 54 zeigten Wege auf, auch bei höherem pH-Wert ≥ 7 stabile Catalipid-
die im
112
3.2.7 Aggregationsverhalten der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 bei pH = 7 bis 8
Da sich deutlich bessere Stabilitäten und Qualitäten hinsichtlich Größenverteilung und
Unilamellarität der Vesikel mit geringer Ionenstärke des Rehydrierungspuffers (4 mM
NaOAc) unabhängig vom eingestellten pH-Wert erzielen ließen (siehe 3.2.6.1, 3.2.6.2), wurde
die Selbstaggregation der MOH 39 und DOSH 54 Catalipide im pH-Wert Bereich zwischen 7
und 8 ausschließlich in 4 mM HEPES-Puffer durchgeführt. Auch hier wendete man die in
3.2.4.2 beschriebene Dehydrierung-Rehydrierungsmethode zur Herstellung der
entsprechenden 4 mM Catalipid-Dispersionen an.
Erste Untersuchungen von 4 mM MOH 39 Catalipid-Dispersionen in 4 mM HEPES-Puffer
bei pH = 7 zeigten sehr wenige Vesikel (siehe Tabelle 13, B-30), die zudem eine sehr
eingeschränkte Langzeitstabilität besaßen. Nach einer nur 12 stündigen Alterung sind neben
vielen größeren mehrschichtigen Plättchen und Öltröpfchen nur noch sehr vereinzelte Vesikel
in der Dispersion verblieben. Dieser Befund deutet auf eine unzureichende Stabilität der
Vesikelmembranen in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7 hin. Eine Erklärung hierfür wären die
bei pH = 7 vollständig unprotoniert vorliegenden hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen der
einzelnen MOH 39 Catalipide. Durch die damit verbundene vergleichsweise kleine
Kopfgruppenoberfläche a des Einzel-Lipids, ist die Tendenz zur Ausbildung planerer Lipid-
Doppellagen zu plättchenartigen Strukturen zu erklären (siehe B-30 Tabelle 13; vgl. hierzu
auch 3.2.6.1).
Um die Herstellung von GUV mit den Catalipiden 39 und 54 im pH-Wert Bereich > 7 zu
optimieren, wurde die gezielte Beimischung verschiedener Zusätze von Cholesterin 67 (siehe
Abbildung 45) als Helfer-Lipid untersucht, um den erwünschten, größeren
Kopfgruppenabstand durch sterische Effekte zu erreichen.[147]
113
3.2.8 Cholesterin 67 als Helfer-Lipid in der Catalipid-Vesikelherstellung
Cholesterin ist ein polyzyklischer Alkohol und gehört zur Gruppe der Sterine und ist somit
ein Steroid.
H
H H
OH Abbildung 45. Chemische Struktur des Cholesterins (5-Cholesten-3β-ol) 67.
Cholesterin ist ein lebenswichtiges Lipid im menschlichen und tierischen Körper und ist
maßgeblich an der Stabilität der Plasmamembranen beteiligt. Auch ist es, zusammen mit
membrangebundenen Proteinen, an der Ein- und Ausschleusung von Signalstoffen von Zellen
beteiligt. Die Interaktionen des Cholesterins mit Membranlipiden reichen von starken
Assoziationen wie mit z.B. mit Sphingomyelin[148] bis zu sehr schwachen Wechselwirkungen
mit Lipiden, die mehrere Doppelbindungen in ihren Alkylketten aufweisen.[149] Das
Grundgerüst der Sphingomyeline (siehe Abbildung 46) bildet das Sphingosin.
OR1 oder R2
NH
O
O
OH
P
O
O
NH3
+
R =1
R2 =N
+
Abbildung 46. Allgemeine Strukturformel der Sphingomyeline. Die noch freie Phosphatgruppe kann mit einem weiteren Alkohol verestert sein, z.B. mit R1 = Ethanolamin oder R2 = Cholin.
Die starken Wechselwirkungen des Cholesterins mit Sphingomyelin können auf
intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Hydroxylgruppe des
Cholesterins und der Amidbindung des Sphingomyelins zurückgeführt werden. Bei anderen
Lipiden wechselwirkt das Cholesterin mit seiner polaren Hydroxylgruppe bevorzugt mit den
hydrophilen Kopfgruppen membranbildender Lipide und interkaliert demnach bevorzugt in
die äußere Lipid-Doppellage, wobei die hydrophoben Molekülabschnitte beider Partner
114
ebenfalls wechselwirken. Durch diese Einlagerung kommt es zu einer konformativen
id-Doppellage eine höhere Unordnung / Verdrillung der
lte Einlagerung des Cholesterins in die Lipid-Doppellage die
Permeabilität von Wasser durch die Membran, einschließlich darin gelöster Stoffe, verringert
wird.[150, 151]
In der Vesikelherstellung wird Cholesterin als Helfer-Lipid eingesetzt, um die mechanische
Formsteifigkeit der Membran zu erhöhen und entsprechend einen positiven Einfluss auf die
Stabilität der gebildeten Vesikel zu nehmen.
.2.8.1 Einfluss von Cholesterin 67 auf die Aggregation von MOH 39
rn
r Dispersionen
rfolgte anlog den MOH 39 und DOSH 54 Catalipid Dispersionen.
Wie in der m
erkennen ist, zeigte ein 5 39 einen
deutlichen Ei
Einschränkung der Beweglichkeit und einer Spreizung der Kopfgruppen, wobei zusätzlich im
hydrophoben Inneren der Lip
einzelnen Lipidalkylketten zur Stabilität der Membran beiträgt.[147] Dies wird auch dadurch
bestätigt, dass durch die gezie
3
Um homogen verteiltes Cholesterin in den zu rehydrierenden Lipid-Film einzubringen, wurde
das in Chloroform gelöste Cholesterin zu der organischen Lipid-Stammlösung gegeben und
gut vermischt. Falls eine Trübung auftrat, wurde bis zum Aufklaren der Lösung Methanol
zugegeben. Nachdem das Chloroform entfe t wurde, führte man die unter 3.2.4.2
beschriebene Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode zur Herstellung der Vesikel durch. Die
Probenpräparation und die folgenden mikroskopischen Untersuchungen de
e
ikroskopischen Aufnahme B-32 (siehe Tabelle 13) im Vergleich zu B-30 zu
mol %iger Zusatz von Cholesterin zum Catalipid MOH
nfluss des Helfer-Lipids auf die Vesikelbildung.
115
Tabelle 13. Einfluss unterschiedlicher Cholesterin Konzentrationen bei der Vesikelherstellung von 4 mM MOH-Dispersionen in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7.0. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden mit einer 100x Vergrößerung gemacht. Die Dispersionen wurden nach einer zweistündigen und zweitägigen Alterung untersucht. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
Cholesterin zwei Stunden Alterung zwei Tage Alterung
B-30 (100x)
B-31 (100x) (Aufnahme nach 12 h Alterung)
0 mol %
B-32 (100x) B-33 (100x)
5 mol %
B-34(100x) B-35 (100x)
10 mol %
15 mol %
B-36 B-37
116
Die Anzahl und Größe der gebildeten GUV erhöhte sich signifikant; es waren auch weniger
Öltröpfchen in der Dispersion vorhanden. Einige wenige Vesikel zeigten
Deformationen in der Membran (große Struktur im unteren Bildausschnitt B-32). Diese
jedoch
lokal unterschiedliche Cholesterin Konzentrationen beim Herstellungsprozess
zurückzuführen sein, die den hom des Helfer-Lipids in die Lipid-Doppellage
erschweren. Hierdurch wär ung gleichmä nen
behindert. Nach 48 stündiger Alterung waren, im Vergleich zur Probe ohne Cholesterin
Zusatz, sehr viel mehr Vesikel in der Dispersion zu erkennen und viel weniger Öltröpfchen
und plättchenartige Strukturen. Auch liegen einige Vesikel mit sehr dünnen Membranen vor
(siehe Pfeil Mitte der Aufnahme B-33). Dies deutet auf eine deutlich erhöhte
Bildungswahrscheinlichkeit und Stabilität von Vesikeln durch den Cholesterin Zusatz hin.
Das Cholesterin wird in die Lipidschicht der aggregierten MOH 39 Catalipide eingebaut,
indem es mit seiner H e vermutlich intermo it den
Amidbindungen der MOH Catalipide in der Doppellage der Membran ausbildet, vergleichbar
mit den starken Wechselwirkungen, die zwischen Cholesterin und Sphingomyelinen
ausgebildet werden (siehe hierzu auch 3.2.8). Zusätzlich unterstützend wirken hydrophobe
Wechselwirkungen zwischen dem liphophilen Molekülabschnitt des Cholesterins und der
Alkylkette des Lipids. Die Einlagerung könnte zu einer sterischen Spreizung der
Kopfgruppenoberflächen a führen und so die höhere Tendenz der Ausbildung gekrümmter
Doppellagen gegenüber der Ausbildung planarer Lipid-Doppellagen begünstigen und somit
die Bildung von sphärischen Aggregaten schon unter leicht sauren Reaktionsbedingungen
erklären.
Die Erhöhung der Cholesterin Konzentration auf 10 mol % führte zu sehr vielen GUV mit
definierten sphärischen Membranen (siehe B-34, Tabelle 13). Es wurden keine Vesikel mit
deformierten Membranen beobachtet. Die Erhöhung der Cholesterin Konzentration zeigte
auch den erwarteten Einfluss auf die Beschaffenheit der Membran: sie wirkte formstabiler als
ohne Cholesterin Zusatz. Nach 48 rung (siehe B-35) zeigt
Beschaffenheit, ähnlich der mit 5 mol % igem Cholesterin Zusatz (siehe B-31). Neben vielen
Vesikeln waren auch dickere plättchenartige Strukturen zu erkennen.
Die weitere Erhöhung der Cholesterin Zugabe auf 15 mol % verhinderte die Bildung
vesikulärer Strukturen vollständig (siehe B-36). Neben sehr vielen Öltröpfchen liegen
undefinierte, größere Aggregate vor. Eine zu hohe Cholesterin Konzentration in der Lipid-
schicht könnte eine zu starke Spreizung der Kopfgruppen herbeiführen, so dass die
Ausbildung einer geordneten Lipid-Doppellage verhindert wird. Nach 48 Stunden bildeten
könnten auf
ogenen Einbau
e die usbildA ßig gekrümmter Vesikelmembra
ydroxylgrupp lekulare WBB m
stündiger Alte e die Dispersion eine
117
sich jedoch sehr viele große, meist nicht sphärische, supramolekulare Objekte, die aus sehr
starren, unflexiblen Membranen zu bestehen schienen (siehe B-37). Daher wurde der Einfluss
noch höherer Cholesterin Konzentration auf die Vesikelbildung nicht weiterverfolgt.
Die MOH-Vesikelbildung in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7.6 - analog den beschriebenen
Experimenten der MOH-Vesikel Bildung bei pH = 7 - konnte auch durch die Zugabe von
(5, 10 oder 15 mol %) Cholesterin 67 nicht erreicht werden. Die mikroskopische
Untersuchung der unterschiedlichen Dispersionen zeigten ausschließlich Öltröpfchen und
keine Vesikel. Von einer Abbildung dieser mikroskopischen Aufnahmen wurde daher
abgesehen.
3.2.8.2 Einfluss von Cholesterin 67 auf die Aggregation von DOSH 54
Die mikroskopischen Untersuchungen der 4 mM DOSH Catalipid-Dispersionen in 4 mM
HEPES-Puffer bei pH = 7 - ohne Cholesterin Zugabe - zeigten nur vereinzelt größere Vesikel,
auf deren Membranen viele dunkle Punkte (Öltröpfchen) zu erkennen waren (siehe B-38,
Tabelle 14). Diese deuten bereits auf die Instabilität der Vesikel unter den gegebenen
Reaktionsbedingungen hin. Nach eintägiger Alterung der Dispersion waren - bis auf sehr
wenige dünnwandige größere Vesikel (Bildmitte B-39) - sehr viele Öltröpfchen in der Probe
vorhanden. Die mikroskopische Untersuchung der Dispersion nach zweitägiger Alterung
zeigte ausschließlich Öltröpfchen und keine vesikulären Strukturen. Auf eine Abbildung
wurde daher verzichtet. Bei pH = 7 liegt die Mehrzahl der Kopfgruppen der DOSH 54
Catalipide vermutlich unprotoniert vor, so dass die fehlenden abstoßenden Wechselwirkungen
t (siehe B-40, B-41,
Zusatz keine signifikanten Unterschiede, auf die Abbildung mikroskopischer Aufnahmen
der Imidazol-Kopfgruppen in der äußeren Lipid-Doppellage zu einer deutlichen
Verkleinerung der Kopfgruppenoberflächen a führen. Daher wurde, analog zu den einkettigen
MOH 39 Catalipiden (siehe 3.2.8.1), Cholesterin 67 zugesetzt, um eine sterische Spreizung
der Kopfgruppen zu erreichen, die zur Ausbildung vesikulärer Strukturen notwendig ist.
Die Herstellung der DOSH-Vesikel mit Cholesterin Zusatz erfolgte über die Dehydrierung-
Rehydrierungsmethode (siehe 3.2.4.2). Ein 5 mol % iger Zusatz Cholesterin 67 bewirkte
keine signifikanten Änderungen der Vesikelbildung und Vesikelstabilitä
Tabelle 14). Nach zweistündiger Entwicklungszeit konnten lediglich einige größere DOSH-
Vesikel in der Dispersion erkannt werden (B-40), die sich schon nach einer zweitägigen
Alterung bei Raumtemperatur zu kleineren Öltröpfchen umlagerten, die zum Teil - verursacht
durch das Cholesterin - größere Agglomerate bildeten (siehe B-41, oben links). Eine
Erhöhung der Cholesterin Konzentration auf 10 mol % zeigte im Vergleich zum 5 mol % igen
118
wurde daher verzichtet. Bei einem 15 mol % igen Zusatz von Cholesterin bildeten sich viele
und große Vesikel (siehe B-42, Tabelle 14) mit ausreichender Stabilität. Nach zweitägiger
Alterung lagen sie noch in der Dispersion vor, neben relativ wenigen Öltröpfchen. Eine
nfluss unterschiedlicher Cholesterin 67 Konzentrationen auf die Vesikelbildung von DOSH 54 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7. Die unterschiedlichen Alterungszeiten sind neben den
mikroskopischen Abbildungen angegeben. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-
Cholesterin zwei Stunden Alterung Alterung siehe Anmerkung
weitere Erhöhung der Cholesterin Konzentration auf > 15 mol % hemmte - in Analogie zu
den MOH-Vesikeln (siehe 3.2.8.1) - die Bildung definierter, sphärischer DOSH-Vesikel.
Diese zu hohe Cholesterin Konzentration in der Lipid-Doppellage verursachte offenbar eine
zu ausgeprägte sterische Spreizung der Imidazol-Kopfgruppen, die die Ausbildung
sphärischer Aggregate verringerte.
Tabelle 14. EiCatalipiden in
Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
0 mol %
B-38 (100x) B-39 (100x, 24 Stunden)
5 mol %
B-40 (100x) B-41 (100x, 48 Stunden)
15 mol %
B-42 (100x)
B-43 (100x, 48 Stunden)
119
Untersuchungen 4 mM DOSH Dispersionen in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7.6 mit
unterschiedlicher Cholesterin Konzentration zeigten, dass erst ein 15 mol % iger Zusatz zur
Bildung von Vesikeln führte.
Tabelle 15. Einfluss des 15 mol % igen Cholesterin Zusatzes auf die Vesikelbildung von DOSH Catalipiden in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7.6. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
Cholesterin
zwei Stunden Alterung Zweitägige Alterung
B-44 (100x) B-45 (100x)
15 mol %
In B-44 (siehe Tabelle 15) sind einige DOSH-Vesikel in der Dispersion zu erkennen. Größere
Vesikel treten nur sehr vereinzelt auf und zeigen dunkle Flecken (Öltröpfchen) auf den
Membranen, die auf die Instabilität der Strukturen bei diesen Reaktionsbedingungen
hinweisen. Viele Öltröpfch ise in größeren Agg nieren
das Bild der Dispersion. Nach zweitägiger Alterung der Dispersion bei Raumtemperatur sind
neben sehr wenigen GUV (B-45, Bildmitte) unförmige, starre, supramolekulare Aggregate
entstanden. Diese Objekte zeigen eine vergleichbare Struktur zu dem einkettigen MOH 39
Catalipid bei pH = 7 und einem 15 % igen Cholesterin Zusatz (siehe B-37, Tabelle 13). Auch
hier beeinflussen offensichtlich die zu hohen Konzentrationen des in der Lipid-Doppellage
eingelagerten Cholesterins die Form und Morphologie der gebildeten supram ekularen
Aggregate, so dass die Ausbildung sphärischer, vesikulärer S orzugt
wird.
en, die teilwe lomeraten auftreten, domi
ol
trukturen nicht mehr bev
120
3.2.8.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse des Einflusses von Cholesterin auf die
Aggregation von MOH 39 und DOSH 54
eine stabilen Vesikel ausgebildet wurden. Vergleicht man das Aggregationsverhalten beider
Lip en Reaktio auf, dass in d nach
einer nur kurzen Lagerung (12 S viele große, plättchenart n vorlagen
und nur wenige Vesikel (B-31, Tabelle 13). Hingegen war die Stabilität der DOSH-Vesikel
- unter den gleichen Reaktionsbedingungen – höher; hier waren nach 24 stündiger Lagerung
noch einige große und viele kleine Vesikel - neben Öltröpfchen - zu erkennen. Es konnten
jedoch keine plättchenartigen Strukturen, wie im Fall des MOH 39 Catalipids, aufgefunden
werden (B-39, Tabelle 14).
Dies ist auf die unterschiedliche Kopfgruppenoberflächen a der Catalipide 39 und 54
urückzuführen. Bei pH = 7 sollte die Mehrzahl der hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen
Mischungen gefunden werden, die stabile Catalipid-Vesikel bei pH = 7 ausbildeten. Die
Hydroxylgruppe des Cholesterins sollte sich bevorzugt zum polaren Segment der Catalipide
orientieren und könnte über sterische Abstoßungen eine Spreizung der Kopfgruppen
herbeiführen. Diese Vergrößerung der Kopfgruppenoberfläche a verändert den
Packungsparameter des Lipids in Richtung eines abgestumpften Kegels (siehe Tabelle 5, Typ
3). Hierdurch sollte die Krümmung der Lipid-Doppellage ermöglicht werden, die zur
Ausbildung sphärischer Vesikel notwendig ist. Durch die Einlagerung des Cholesterins in die
Erste Untersuchungen der 4 mM Catalipid-Dispersionen aus MOH 39 und DOSH 54 zeigten,
dass in 4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7 - ohne den Zusatz des Helfer-Lipids Cholesterin 67 -
k
ide unter dies nsbedingungen, so fällt er MOH 39 Dispersion
tunden) sehr ige Strukture
z
beider Catalipide MOH 39 und DOSH 54 unprotoniert vorliegen. Bei fehlenden abstoßenden
WW durch positive Ladungen in der äußeren Lipid-Doppellage ist die Kopfgruppen-
oberfläche a im Fall des MOH 39 so klein, dass der Packungsparameter der Einzel-Lipide mit
der Geometrie eines Zylinders verglichen werden kann (siehe Tabelle 5, Typ 4). Eine
Krümmung zu einer geschlossenen, sphärischen Anordnung in Form eines Vesikels wird
demzufolge zurückgedrängt, so dass plättchenartige Strukturen entstehen.
Die höhere Lipophilie des zweikettigen DOSH 54 Catalipids, verglichen mit dem einkettigen
MOH 39, könnte sowohl die größere Stabilität der DOSH-Vesiklel - ohne Cholesterin
Zusatz - bei pH = 7 als auch die fehlende Ausbildung planarer Lipid-Doppellagen zu
plättchenartigen Strukturen über ausgeprägtere hyrophobe Wechselwirkungen erklären.
Durch den gezielten Zusatz von Cholesterin 67 zu den Catalipid Stammlösungen, konnten
Lipid-
121
Lipid-Doppellage wird eine Stabilitätserhöhung der Vesikelmembran erreicht. Sie wirkt unter
Durch den gezielten Z en, konnten mit beiden
10 µM) über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode unter
ente zur chemischen Implementierung des MCMs
öglichst unilamellar
dem Mikroskop jedoch formsteifer und weniger flexibel.
usatz von Cholesterin zu den Lipid-Film
Catalipiden große Vesikel (um
physiologischem pH-Wert hergestellt werden. In diesem pH-Bereich wäre die für die
chemische Implementierung des MCMs geplante Ligation zwischen einem Catalipid
aktivierten Oligonukleotid A und dem 5´-Amino-modifizierten Oligonukleotid 4 B möglich,
da ausreichend Aminofunktionen des nukleophilen Reaktionspartners B unprotoniert
vorlägen.
Experimente zur Stabilität der Catalipid-Vesikel bei erhöhten Salzkonzentrationen in der
Dispersion (bevorzugt im millimolaren Konzentrationsbereich),[81] die zu einer erfolgreichen
Ligation notwendig sind, mussten noch durchgeführt werden (siehe Kapitel 3.5).
Das Volumen der gebildeten Vesikel genügt den theoretisch geforderten Ansprüchen, die zur
Verwendung der Vesikel als Kompartim
notwendig wären. Informationen über die Membranfluidität der gebildeten Catalipid-Vesikel
sind noch nicht bekannt. Es war aufgrund der erzielten Ergebnisse davon auszugehen, dass
durch intermolekulare WBB zwischen den Catalipiden innerhalb der Vesikelmembran
stabilere Strukturen vorliegen. Aufgrund der deutlichen Umlagerungen im Alterungsprozeß
(vergleiche B-17 (gedrehte Strukturen) nach B-20 (Plättchen) in Tabelle 9) könnte die
erforderliche Permeabilität der Vesikelmembran aber dennoch gegeben sein. Um die
notwendige Membrandurchquerung der Catalipid aktivierten Oligonukleotidkonjugate A ins
Innere der Catalipid-Vesikel zu ermöglichen, sollten die Membranen m
und somit dünnwandig sein. Die Elektroformation ermöglicht die Bildung solcher großer und
unilamellarer Vesikel und wurde daher zur Catalipid-Vesikelherstellung eingesetzt (siehe
3.2.9).
122
3.2.9 Herstellung von Catalipid-Vesikeln durch Elektroformation
Das in 3.2.3.2 vorgestellte Verfahren der Elektroformation ermöglicht die Herstellung von
sphärischen und unilamellaren Vesikeln im Größenbereich zwischen 20-50 μm. Bei der
Elektroformation erfolgt die Rehydrierung eines Lipid-Films, der entweder auf eine
Pt-Elektrode oder auf ITO-beschichteten Glasoberflächen aufgebracht wurde, bei angelegter
Wechselspannung. In den in der Literatur beschriebenen Verfahren zur Herstellung von
Vesikeln über Elektroformation, werden beispielsweise Lipid-Mischungen aus
n
wie in einer ITO-Elektroformationskammer (siehe 3.2.9.2),
erarbeitet.
Phosphatidylcholin, negativ geladenen Lipiden, sowie Phosphatidylethanolamin mit
Cholesterin Zusätzen verwendet. Der postulierte sog. electro-swelling Mechanismus der
Vesikelbildung ist maßgeblich bestimmt durch (i) elektroosmotische Effekte, (ii) de
osmotischen Druck, (iii) die Membranelastizität, (iv) die Hydratation der Lipid-Doppellage
zur Membranbildung und (v) weiteren Faktoren, wie z.B. van der Waals Kräften (siehe
3.2.3.3).[129, 152] Der elektroosmotische Effekt nimmt einen besonderen Stellenwert in der
Vesikelbildung ein und hängt auch von Spannung und Frequenz des angelegten
Wechselstroms ab. Gute Ergebnisse zur Herstellung maximal großer und unilamellarer
Vesikel wurden beispielsweise bei einer Spannung von 1.5 V und einer
Wechselspannungsfrequenz von 15 Hz erhalten, wobei der interne Abstand der Pt-Elektroden
2 mm betrug.[152, 153] In fast allen Herstellungsverfahren der Elektroformation wird
bidestilliertes Wasser als Rehydrierungsmedium eingesetzt, um den schädigenden Effekt
eines möglichen osmotischen Drucks bei der Vesikelbildung zu minimieren.[130]
Ausgehend von den in der Literatur beschriebenen Standardprotokollen, wurden abgestimmte
Reaktionsbedingungen zur Catalipid-Vesikelherstellung mittels Elektroformation an Pt-
Elektroden (siehe 3.2.9.1), so
123
3.2.9.1 Elektroformation an Pt-Elektroden
Zur Herstellung von Catalipid-Vesikeln über Elektroformation an Pt-Elektroden wurde die in
Abbildung 47 gezeigte Elektroformationskammer eingesetzt.
Abbildung 47. Photographie der Elektroformationskammer.
Als Fixierung für die zwei durchgeführten Pt-Drähte diente ein parallel durchbohrtes Teflon-
Küken. Jeder Pt-Draht (Teflon-Küken linke Seite) wurde über eine Krokodilklemme mit
Kabel an einen Frequenzgenerator angeschlossen. Die auf der rechten Seite des Kükens
austretenden Pt-Drähte wurden in einem Abstand von ca. 2 mm möglichst parallel durch die
Petrischale geführt. Zur Fixierung und genauen Ausrichtung in der Petrischale diente ein
parallel durchbohrtes Plastikröhrchen. Die Verwendung eines durchsichtigen Reaktions-
gefäßes ermöglichte eine direkte mikroskopische Beobachtung der Entstehung von Vesikeln
67 zur Unterstützung einer „gekrümmten“ Membranausbildung zugesetzt. Auf
jede Pt-Elektrode wurden unterschiedliche Stoffmengen der entsprechenden Catalipid
Stammlösung an verschiedenen Stellen aufgebracht, um einen möglichst inhomogenen Lipid-
Film zu bilden. Durch die so zufällig ausgebildeten unterschiedlichen Schichtdicken des
Lipid-Films sollte die Wahrscheinlichkeit erhöht werden, Reaktionsbedingungen zu schaffen,
die die Ausbildung von Vesikeln ermöglichen. Anschließend wurden die Elektroden im
Vakuum getrocknet. Bevor die parallel ausgerichteten Pt-Elektroden in die mit bidestiliertem
Wasser befüllte Petrischale platziert wurden, schaltete man die Wechselspannung ein, um ein
spannungsfreies Rehydrieren des Lipid-Films zu vermeiden. Die Elektroformation wurde mit
am Pt-Draht.
Unter Berücksichtigung der in 3.2.7 beschriebenen Ergebnisse der MOH- und DOSH-
Vesikelbildung wurden dem MOH Catalipid 10 mol % und dem DOSH Catalipid 15 mol %
Cholesterin
124
einer Wechselspannungsfrequenz von 10 Hz und einer Spannung von 0.5 V gestartet. Die
Frequenzen und Reaktionszeiten. ür die 40x Vergrößerung: 70 µm.
Wechselspannung und Frequenz
(Reaktionszeit der Aufnahme)
Wechselspannung und Frequenz
(Reaktionszeit der Aufnahme)
Spannung wurde alle 30 min in 0.5 V Schritten bis auf 3.5 V erhöht.
Tabelle 16. Mikroskopische Aufnahmen (40x-Vergrößerung) der Catalipid-Vesikelbildung durch Elektroformation am Pt-Draht bei unterschiedlichen Wechselspannungen, Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken f
MOH 39
10 mol %
Cho
B-46 (40x)
1.5 V, 10 Hz (1.5 h Rkt.-Zeit)
B-47 (40x)
3.0 V, 10 Hz (3 h Rkt.-Zeit)
lesterin
DO
15
Cho
SH 54
mol %
B-48 (40x)
1.5 V, 10 Hz (1.5 h Rkt.-Zeit)
B-49 (40x)
nach beendeter Reaktion (3.5 h Rkt.-Zei
lesterin
t)
Die mikroskopische Aufnahmen in Tabelle 16 zeigen jeweils einen kleinen, charakteristischen
Abschnitt der Pt-Elektroden, auf dem die Catalipid-Filme aufgetragen wurden. Unter dem
Mikroskop pulsieren die Lipid-Filme im Rehydrierungsprozess, verursacht durch die
angelegte Wechselspannung. Die hierdurch induzierte mechanische Spannung soll für die
bevorzugte Ausbildung unilamellarer und großer Vesikel sorgen (siehe 3.2.3.3).[129, 152] In B-
46 ist der MOH 39 Catalipid-Film nach einer Reaktionszeit von 1.5 h gezeigt. Es sind einige
sphärische Vesikel zu erkennen. An dieser ausgewählten Stelle der Pt-Elektrode war die
125
Auftragungsmenge der Lipid-Stoffmenge besonders groß, so dass sich die Vesikel primär im
Lipid-Film und nicht direkt auf der Pt-Elektrodenoberfläche formierten. B-47 zeigt diesen
Lipid-Film und einige GUV nach 3 stündiger Rehydrierung bei einer Spannung von 3.0 V.
5 h. Hier ist
eigt
ieselbe Stelle aktionszeit
Frequenzgenerators) bei leicht veränderter Schärfeebene. n
Vesikel von der Elektrode gelöst, und eine Entnahme konzentrierter Vesikel Lösung in
direkter Nähe de
Über die Elektroformation an Pt-Elektroden konnten unilamellare MOH- und DOSH-Vesikel
in einem Größenbereich von 20 bis 40 µm hergestellt werden. Die präparative Durchführung
ikelherstellung zeigte jedoch einige Schwierigkeiten auf: Zum einen war der gezielte
eines dünnschichtigen Lipid-Films auf dem runden, dünnen Pt-Draht kaum möglich,
keine reproduzierbaren Lipid-Filmschichtdicken erzeugt werden konnten. Zum
anderen differierte die Anzahl der in der Lösung enthaltenen Catalipid-Vesikel drastisch -
trotz Entnahme der Lösung in direkter Nähe des Pt-Drahtes. Um diese prinzipiellen Probleme
zu umgehen, setzte man die Präparationsm thode der Elektroformation auf einer ITO-
beschichteten Glasoberflä
B-48 zeigt einen dünneren DOSH-Catalipid Film nach einer Reaktionszeit von 1.
die Entstehung einzelner DOSH-Vesikel direkt auf der Pt-Elektrode zu erkennen. B-49 z
d der Pt-Elektrode nach einer Re von 3.5 h (nach Abschalten des
Jetzt haben sich die gebildete
r Pt-Elektrode ist möglich.
der Ves
Auftrag
so dass
e
che ein.
126
3.2.9.2 Elektroformation auf einer ITO-beschichteten Glasoberfläche
Eine anderes experimentelles Setup zur Herstellung von GUV durch Elektroformation stellt
die in Abbildung 48 gezeigte Elektroformationskammer dar, die aus ITO (Indiumzinnoxid)
beschichteten Glasplatten aufgebaut ist. Die einseitige ITO-Beschichtung gewährleistet die
elektrische Leitfähigkeit der Glasplatten, bei gleichzeitiger Transparenz. Dies erlaubt die
direkte Beobachtung des Entstehungsprozesses der Vesikel unter dem Lichtmikroskop.
Abbildung 48. Links: ITO-beschichtete Glasplatten (oben: der Rand aus Silikonfett; unten: der aufgesetzte Teflon-Rahmen); rechts: zusammengesetzte ITO-Elektroformationskammer. Der obere Rand beider ITO-Glasplatten wurde mit einem Kupferblech ummantelt. Über die
Ösen ist eine Befestigung von Krodilklemmen mit Kabel möglich, um den Frequenzgenerator
anzuschließen. Der Lipid-Film wurde möglichst inhomogen auf die nach unten zeigende,
ITO-beschichtete Seite der unteren Glasplatte aufgetragen. Als Abstandhalter zwischen den
zwei ITO-Glasplatten diente ein ca. 2 mm dicker rechteckiger Teflonrahmen, der auf zwei
Flächen mit Silikonfett zur (reversiblen) Fixierung und Abdichtung des Reaktionsraums zu
den ITO-Glasplatten versehen war. Der Teflonrahmen war auf den beiden kürzeren Seiten zur
Befüllung der Kammer mittig durchbohrt. Nach Anlegen des Wechselstroms wurde die
Kammer mit bidestilliertem Wasser durch die eine Bohrung befüllt, durch die zweite konnte
die verdrängte Luft austreten. Die Befüllung der Kammer wurde zügig, aber ohne stärkere
Verwirbelungen durchgeführt, um ein unerwünschtes, vorzeitiges Ablösen des Lipid-Films zu
verhindern. Es wurde darauf geachtet, die gesamte Kammer mit Wasser zu befüllen, so dass
keine größeren Luftblasen zurückblieben.
127
Die Herstellung von Vesikeln in der ITO-Elektroformationskammer wurde ausschließlich mit
an die Experimente auf das einkettige MOH 39 Catalipid, da nur mit diesem die
-Elektroden siehe 3.2.9.1).
Abbildung 49 zeigt mikroskopische Aufnahmen der mit dem Catalipid-Film beschichteten
unteren ITO-Glasplatte. Die Aufnahmen wurden direkt nach Abschalten des
Frequenzgenerators aufgenommen. In Aufnahme B-50 sind viele GUV zu erkennen, die zum
Teil noch auf der ITO-Glasoberfläche absorbiert sind. Die Tendenz zur Ausbildung großer,
sphärischer, unilamellarer Vesikel ist bereits auf dieser Aufnahme zu erkennen. Die
Aufnahme B-51 zeigt eine andere Position der gleichen Glasoberfläche und Probe. Hier ist
linksseitig eine dicke, nicht rehydrierte Lipid-Ablagerung zu sehen, auf der keine Vesikel zu
erkennen sind. Am rechten Rand dieser Ablagerung, d.h. bei dünner werdendem Lipid-Film,
ist die Entstehung von einzelnen Vesikeln zu erkennen. Diese Aufnahme verdeutlicht, dass
die Dicke des Lipid-Films eine ausschlaggebende Rolle in der Vesikelbildung spielt.
MOH-Catalipiden (zzgl. 10 mol % Cholesterin) durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt der Arbeit
fokussierte m
Synthese der reaktiven DNA-Catalipid Konjugate möglich war - und somit nicht mit dem
zweikettigen DOSH-Catalipid 54 (siehe Kapitel 3.3.1).
Die Elektroformation wurde bei einer angelegten Wechselspannungsfrequenz von 10 Hz und
einer Spannung von 0.5 V gestartet und fortschreitend alle 30 min in 0.5 V Schritten auf die
Endspannung von 3.5 V erhöht (anlog dem Spannungs- / Frequenz Programm zur Herstellung
von Catalipid-Vesikeln an Pt
Abbildung 49. Mikroskopische Aufnahmen (40 x) von zwei unterschiedlichen Stellen der ITO-Glasoberfläche nach beendeter Elektroformation. Als Catalipid setzte man das MOH 39 zuzüglich 10 mol % Cholesterin 67 ein. Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2) Zur Entnahme von MOH-Vesikeln löste man vorsichtig die obere ITO-Glasplatte und
entnahm – in direkter Nähe zur unteren Glasoberfläche – die Vesikel-Dispersion.
Die Herstellung von Vesikeln in der ITO-Elektroformationskammer ist der Elektroformation
an Pt-Elektroden wegen der leichteren Handhabung der ITO-Elektroformationskammer
B-50 B-51
128
vorzuziehen. Die große und plane ITO-Glasoberfläche erlaubt ein einfacheres und
reproduzierbareres Aufbringen des Lipid-Films im Vergleich zu den dünnen, runden Pt-
Drähten. Zudem war die Entnahme in direkter Nähe der Glasoberfläche sehr einfach, um
gezielt Proben mit hohen Vesikel Konzentrationen zu entnehmen.
Die Größe und Morphologie der gebildeten MOH-Vesikel zeigte sich unabhängig vom
öglichen
nkapselung von einzelsträngiger DNA wurden im Rahmen eines
Forschungsaufenthalts an der University of Tokio, Komaba, Japan in der Gruppe von Prof.
Tadashi Sugawara und in Kooperation mit Dr. Taro To egonnen und später in der Ruhr-
Universität Bochum weiterverfolgt und erweitert.
Um das präparative Verfahren der Einkapselung von DNA in Imidazol-Vesikel zu erarbeiten,
wurde ein Tetramethylrhodamin (TAMRA) markiertes, 15 mer Oligonukleotid (TAMRA-
CGTATGAACGTCATC) 68 eingesetzt.
gewählten Herstellungsprozess. Maßgeblich war allein die aufgetragene Schichtdicke des
Catalipid-Films.
3.2.10 Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in MOH 39- und
DOSH 54- Vesikel
Zur chemischen Implementierung des Minimalen Chemoton Modells ist die Einkapselung
von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in die Catalipid-Vesikel notwendig, um das
genetisches Subsystem, basierend auf einer templatgesteuerten Selbstreplikation, zu
implementieren. Hierzu sollten die Catalipid-Vesikel mit dem Cy3-TTCCGCGGAA
markiertem Oligonukleotid, das als Templat in der Ligation eingesetzt werden soll, befüllt
werden (siehe Aufgabenstellung 2.2). Hierzu wurden unterschiedliche Präparationsmethoden
untersucht, die eine Einkapselung von markierter DNA in Catalipid-Vesikel erm
sollten. Erste Versuche zur Ei
yota b
129
3.2.10.1 Einkapselung nach der Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode
Zur Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA wurde eine leicht
lgende Rehydrierungsprozess, in dem die
nkapselung von markierter DNA modifiziert.
Hierzu führte man die Rehydrierung des Lipid-Films in zwei aufeinander folgenden
A ,
sich die Vesikel ausgebildet hatten (ca. zwei
tunden bei Raumtemperatur), wurde die Dispersion vor der fluoreszenzmikroskopischen
analog der modifizierten
kel aufzubrechen und kleinere, homogenisierte
Abschnitte von Teilmembranen zu bilden. Die mit Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA wird
so statistisch zwischen den Teilmembranen verteilt und durch Membranbildung
eingeschlossen. In darauf folgenden Präparationsschritten wurde die Dispersion in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und in einer Gefriertrocknungsanlage getrocknet. Die
Gefriertrocknung ermöglicht eine sehr schonende Trocknung von Substanzen, indem die
Eiskristalle direkt sublimieren, so dass ein Aufbrechen der neu gebildeten Vesikelteil-
membranen - mit der darin eingeschlossenen farbstoffmarkierten DNA - vermindert wird. Der
erhaltene feinporöse Rückstand wurde in gepufferter Lösung dispergiert und abschließend
mikroskopisch analysiert.
abgewandelte Variante der bereits beschriebenen Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode zur
Vesikelherstellung angewendet. Die Präparation des Lipid-Films wurde anlog, wie in Kapitel
3.2.4.2 beschrieben, durchgeführt. Der darauf fo
Vesikel gebildet werden, wurde jedoch zur Ei
rbeitsschritten durch: Im ersten rehydrierte man den Lipid-Film in einer gepufferten Lösung
in der die markierte DNA gelöst war. Nachdem
S
Untersuchung mit dem schon zuvor eingesetzten Puffer stark verdünnt. Die im Inneren der
Vesikel eingeschlossene, markierte DNA liegt so - im Gegensatz zu der frei in Lösung
verbliebenen - in höherer Konzentration vor.
Um ein vorzeitiges Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu verhindern, vermied man im
Herstellungsprozess lange Belichtungsphasen und lagerte die Proben im Dunkeln.
3.2.10.2 Einkapselung nach der Gefriertrocknungs-Methode
Ein weiteres Verfahren zur Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in
Vesikel ist die sog. Gefriertrocknungs-Methode, die in Anlehnung an das von Deamer et. al.
beschriebene Verfahren erarbeitet wurde.[154] Hierzu wurde zunächst
Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode (siehe 3.2.10.1) der Lipid-Film in Anwesenheit
markierter DNA rehydriert. Nachfolgend wurde die Dispersion für 5 min im Ultraschallbad
behandelt, um die bereits gebildeten Vesi
130
3.2.10.3 Mikroskopische Aufnahmen der mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA
befüllten MOH- und DOSH Catalipid-Vesikel
skoeffizienten von εmax = 80.000 lmol-1cm-1 in
von 520-
550 nm ermöglichte. Die Emission wurde > 580 nm aufgenommen.
ol % Cholesterin Catalipid-
mM HEPES-Puffer bei pH = 7, in die TAMRA markierte DNA 68 eingekapselt
Im folgenden werden mikroskopischen Aufnahmen von mit TAMRA markierter DNA 68
befüllten Catalipid-Vesikeln gezeigt, die zum einen über die modifizierte Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode (siehe 3.2.10.1) und zum anderen über die Gefriertrocknungs-
Methode (siehe 3.2.10.2) hergestellt wurden. Um sowohl den unterschiedlichen Einfluss
beider Präparationsverfahren auf die Größe und Morphologie der gebildeten Catalipid-
Vesikel, als auch die Einkapselung der Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA 68 zu
analysieren, wurden die licht- und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen tabellarisch
gegenübergestellt. Die lichtmikroskopische Aufnahme zeigt die Beschaffenheit der Catalipid-
Vesikel, die nebenstehende fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des gleichen Ausschnittes
die Fluoreszenz der TAMRA markierten DNA 68. TAMRA hat ein Absorbtionsmaximum bei
λmax = 555 nm und einen molaren Extinktion
Wasser.[155] Zur Visualisierung des Fluoreszenzfarbstoffs setzte man einen Filter in den
Strahlengang des Mikroskops, der die Anregung in einem Wellenlängenbereich
Tabelle 17 zeigt mikroskopische Aufnahmen 4 mM MOH / 10 m
Vesikel in 4
wurde.
131
Die Catalipid-Vesikel wurden sowohl mit der modifizierten Dehydrierungs-Rehydrierungs-
abelle 17. Licht- und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (gleicher Ausschnitt) unterschiedlicher
Methode als auch mit der Gefriertrocknungs-Methode hergestellt.
TMOH / 10 mol % Cholesterin Catalipid-Vesikel (4 mM HEPES-Puffer, pH = 7) mit eingekapseltem TAMRA markiertem 15 mer Oligonukleotid 68, die sowohl über die modifizierten Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode als auch über die Gefriertrocknungs-Methode hergestellt wurden. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
Einkapselungs-
Methode
Lichtmikroskopische
Aufnahme
Fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme
modifizierte
Dehydrierungs-
Rehydrierungs-
Methode
(siehe 3.2.10.1)
B-52 (100x) B-53 (100x)
Gefriertrocknungs-
Methode
(siehe 3.2.10.2)
B-54 (100x) B-55 (100x)
In Aufnahme B-52 sind viele sphärische MOH-Vesikel zu erkennen, die über die modifizierte
Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode hergestellt wurden. Nur vereinzelt sind wenige
stäbchenartige Strukturen zu erkennen (ähnlich den plättchenartigen MOH-Aggregaten, die in
4 mM HEPES-Puffer bei pH = 7 nach zweitägiger Alterung beobachtet wurden, vergleiche
3.2.8.1, Tabelle 13, B-35). Die nebenstehende, fluoreszenzmikroskopische Aufnahme B-53
des gleichen Ausschnitts der Dispersion zeigt in einigen MOH-Vesikeln die eingeschlossene
TAMRA markierte DNA 68. B-54 zeigt die über die Gefriertrocknungs-Methode hergestellt
MOH-Vesikel. Diese Vesikel wirken unter dem Mikroskop flexibler und unilamellarer, als die
über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode hergestellten (siehe B-52). Die fluoreszenz-
132
mikroskopische Aufnahme B-55 des gleichen Ausschnitts wie in B-54 zeigt, dass die
TAMRA markierte DNA 68 eingeschlossenen wurde.
Betrachtet man die genaue Anordnung der Vesikel der lichtmikroskopischen Aufnahme B-54
Vesikel
s der
ufnahme eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt, in der die Vesikel ihre Positionen aufgrund
d olekularb durch wird he
Aufn blich beeinflusst ngere Beobachtung eine
erschwert.
Die wiederholte mikroskopische Untersuchung der in Tabelle 17 gezeigten Dispersionen nach
48 stündiger Lagerung bei Raumtemperatur im Dunkeln, zeigte sowohl in Bezug auf
Fluoreszenz als auch auf morphologische Veränderungen keine charakteristischen
Ände
B , mit TAMRA markierter DNA 68 befüllte MOH-Vesikel ließen sich mit
beiden Herstellungsmethoden nicht synthetisieren. Die mikroskopischen Untersuchungen der
Dispersionen zeigten ausschließlich Öltröpfchen. Diese Beobachtung korrespondiert mit den
Ergebnissen, die in Kapitel 3.2.8.1 ausgeführt sind.
In Tabelle 18 sind die Experimente zur Einkapselung von TAMRA markierter DNA 68 in
gestellt (4 mM DOSH / 15 mol % Cholesterin). Die Herstellung verlief
analog der MOH-Vesikel. Die Ergebnisse sind mit denen der MOH-Vesikel vergleichbar
(s ); die Einkapselung der fluoreszenzmarkierten DNA 68 gelang unter
Verwendung beider Präparationsmethoden. Die mit der Gefriertrocknungsmethode
hergestellten, befüllten DOSH-Vesikel zeigten sehr dünnwandige, unilamellare Membranen.
mit der dazugehörigen fluoreszenzmikroskopischen B-55, so fällt auf, dass einzelne
leicht unterschiedliche Positionen einnehmen. Dies ist dadurch zu erklären, das
Filterwechsel und die damit verbundene neu-Fokussierung zur fluoreszenzmikroskopischen
A
er brownschen M ewegung ändern. Hier die fluoreszenzmikroskopisc
ahme erhe und eine lä s bestimmten Vesikels
rungen.
ei pH > 7 stabile
DOSH-Vesikeln dar
iehe Tabelle 17
133
Zum Teil entstanden sogar MVGV, die mit markierter DNA gefüllt waren (siehe B-59).
Tabelle 18. Licht- und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (gleicher Ausschnitt) unterschiedlicher DOSH / 15 mol % Cholesterin Catalipid-Vesikel (4 mM HEPES-Puffer, pH = 7) mit eingekapseltem TAMRA markiertem 15 mer Oligonukleotid 68, die sowohl über die modifizierten Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode als auch über die Gefriertrocknungs-Methode hergestellt wurden. Mikroskop 1 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalierungs-Balken für die 100x Vergrößerung: 10 µm.
Einkapselungs-
Methode
Lichtmikroskopische
Aufnahme
Fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme
Dehydrier
B-56 (100x) B-57 (100x)
ungs-
Rehydrierungs-
Methode
(siehe 3.2.10.1)
Gefriertrocknungs-
B-58 (100x) B-59 (100x)
Methode
(siehe 3.2.10.2)
Die Herstellung von DOSH-Vesikeln bei pH-Werten > 7 unter Verwendung beider
Präparationsmethoden 3.2.10.1 und 3.2.10.2 zeigte, dass nur sehr wenige sphärische Vesikel
gebildet wurden, die TAMRA markierte DNA enthielten. Es lagen viele größere, unförmige
Aggregate in der Dispersion vor, vergleichbar mit denen, die in Tabelle 15 B-45 abgebildet
sind. Zudem zeigten DOSH-Vesikel eine eingeschränkte Langzeitstabilität; nach 24 h lagen
keine fluoreszierenden Vesikel mehr in der Dispersion vor, sondern ausschließlich
Öltröpfchen. Von einer Abbildung dieser mikroskopischen Aufnahmen wurde abgesehen.
Um repräsentativ die Einkapselung eines mit einem Cyaninfarbstoff markierten
Oligonukleotids aufzuzeigen (siehe Aufgabenstellung 2.2), wurde das Cy3-TTCCGp
Oligonukleotid 69 über die Gefriertrocknungs-Methode in ein MOH-Vesikel (4 mM
MOH / 10 mol % Cholesterin in 4 mM HEPES-Puffer, pH = 7) eingeschlossen.
134
Der Cy3-Fluoreszenzfarbstoff besitzt ein Absorbtionsmaximum bei 548 nm und wurde zur
uoreszenzmikroskopischen Aufnahme bei einer Wellenlänge von 543 nm mit einem He / Ne
Gefriertrocknungs-Methode. Mikroskop ler Teil Kap für die 40x V
Einkapselungs-
Methode
Lich sche Fluoresze pische
fl
Laser angeregt.
Abbildung 50. Repräsentative Einkapselung des Cy3-TTCCGp Oligonukleotids 69 in MOH-Vesikel (4 mM OH / 10 mol % Cholesterin in 4 mM HEPES-Puffer, pH = 7) über die M
3 (siehe Experimentel itel 2). Skalierungs-Balken ergrößerung: 20 µm.
tmikroskopi
Aufnahme
nzmikrosko
Aufnahme
Gefriertrocknungs-
(siehe 3.2.10.2)
B-60 (40 x) B-61 (40 x)
Methode
n mikroskopisch analysiert wurde, verdünnte man diese auf 1/100 des
Ausgangsvolumens mit dem zuvor eingesetzten 4 mM HEPES-Puffer, um die störende
Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.
Die Experimente zur Vesikelherstellung mit den Catalipiden MOH 39 und DOSH 54 bei pH-
Werten > 7 zeigten, dass die Zugabe des Helfer-Lipids Cholesterin 67 notwendig war. Im
r Abstimmung spezieller Reaktionsbedingungen
lung von Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in MOH- und
es
(1)
Bevor die Dispersio
Anschluss wurden diese Ergebnisse zu
genutzt, so dass die Einkapse
DOSH-Vesikel bei pH 7 ermöglicht wurde. Über die Gefriertrocknungs-Methode (siehe
3.2.10.2) konnten, verglichen mit der Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode (siehe 3.2.10.1)
unilamellare MOH- und DOSH-Vesikel hergestellt werden.
Um die Catalipid-Vesikel gemäß der Aufgabenstellung 2.2 und 2.3 als Reaktions-
kompartimente zum MCM einsetzen zu können, müssen die zur Ligation notwendigen
Reaktionsbedingungen erarbeitet werden, um eine Abschätzung der Kompatibilität d
membranformenden Subsystems (2) mit dem genetischen (3) und dem metabolischen
Subsystems zu ermöglichen.
135
3.2.11 Eigenfluoreszenz der MOH 39 und DOSH 54 Catalipid-Vesikel
In Experimenten zur Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA wurde
asser auf Eigenfluoreszenz untersucht.
Tabelle d fluoreszenzmikros ahmen einer 4 mM MOH 39 it 10 mol % igem Cholesterin Zusatz in W swellenlänge lag bei 4 op 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2). Skalieru die 40x Vergrößerung: 25
Lichtmikroskopische
ahme
Fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme
unerwartet eine Eigenfluoreszenz beobachtet. Daraufhin wurden ausschließlich MOH 39- und
DOSH 54 Catalipid-Vesikel mit 10 bzw. 15 mol % Cholesterin Zusatz in bidestilliertem
W
19. Licht- un kopische Aufn Dispersion masser. Die Anregungngs-Balken für
88 nm. Mikroskµm.
Aufn
B-62 (40 x) B-63 (40 x)
B-64 (40 x) B-65 (40 x)
Die MOH 39 Catalipid-Dispersionen mit 10 mol % igem Zusatz Cholesterin zeigt eine
deutlich sichtbare, grüne Fluoreszenz bei einer Anregung von 488 nm unter dem
Fluoreszenzmikroskop. Für DOSH 54 Catalipid-Dispersionen mit 15 mol % igem Cholesterin
Zusatz wurde ebenfalls eine deutlich sichtbare, grüne Fluoreszenz bei einer Anregung von
488 nm unter dem Fluoreszenzmikroskop beobach
tet, jedoch nicht näher ausgewertet (es
ikroskopischen Aufnahmen vor). liegen keine fluoreszenzm
136
In Tab 17 sind Licht- und Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von MOH / Cholesterin
Catalip
tte in bidestilliertem Wasser hergestellt wurden, um möglichst große, unilamellare
ängiges Phänomen, d.h. substanzspezifisch.
ikroskops wurde ein Filter eingesetzt, der eine
n
(z-Scan), so dass zum einen die Membran einzeln vorliegender großer Vesikel scharf
abgebildet werden konnte (B-62 und B-63), und zum ande
unilamellarer Vesikel (B-64 und B-65) möglich wurde. Neben den in der Dispersion
vorliegenden GUV sind auch Öltröpfchen zu erkennen, die in der photographierten,
horizontalen Ebene als helle, leuchtende Punkte in der licht- und fluoreszenzmikroskopischen
Aufnahme erscheinen. In den fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen erkennt man deutlich
die im Wellenlängenbereich grün (490 - 560 nm) leuchtenden Vesikelmembranen und die
sowohl frei in Lösung, als auch auf den Vesikelmembranen vorliegenden Öltröpfchen.
Die Aufnahme eines Fluoreszenzspektrums der MOH 39 Catalipid-Dispersion in einer
Küvette mit eine er, zur Bestimmung der exakten Extinktions- und Emmisions-
wellenlänge der MOH/Cholesterin Catalipid-Vesikel, konnte nicht durchgeführt werden. Im
Fall der MOH/Cholesterin Catalipid-Vesikel liegt eine Dispersion mit relativ dünnlagigen
Vesikelmembranen vor, die, wie in den mikroskopischen Aufnahmen in Tabelle 19 zu
erkennen, nur eine relativ intensitätsschwache Fluoreszenz zeigen. Für eine Fluoreszenz-
detektion in einer Küvette war die Fluoreszenzintensität zu schwach.
Dieses Phänomen der nichtklassischen Fluoreszenz (ohne An
urde bereits von anderen Arbeitsgruppen beschrieben und lag dort im blauen
Dendrimers zurückzuführen sei - eine genaue Beschreibung des Phänomens konnte nicht
id-Vesikeln abgebildet, die über die Elektroformation auf einer ITO-beschichteten
Glaspla
Vesikel zu erhalten (siehe 3.2.9.2). Die beobachtete Eigenfluoreszenz konnte auch bei
MOH / Cholesterin Catalipid-Vesikeln beobachtet werden, die über die Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode (Kapitel 3.2.4.2) in bidestilliertem Wasser hergestellt wurden, und ist
somit ein vom Herstellungsprozess unabh
In den Strahlengang des Fluoreszenzm
Anregung bei einer Wellenlänge von 488 nm ermöglicht. Die mikroskopischen Aufnahme
eigen den gleichen Ausschnitt der Dispersion in unterschiedlichen, horizontalen Ebenen z
ren die Betrachtung vieler
m Fluorimet
wesenheit fluorophorer
Gruppen) w
Spektralbereich und wurde bei verschiedenen dendritischen Strukturen beobachtet.
2004 berichteten Bard et al., dass nach Oxidation mit (NH4)2S2O8 kommerziell erhältliche
Poly(amido)amin Dendrimere (PAMAM), die durch Hydroxylgruppen terminiert waren, eine
starke blaue Fluoreszenz von 420 nm zeigten. Die Intensität der Fluoreszenz zeigte bei einer
Anregung von 380 nm eine Abhängigkeit vom Verzweigungsgrad des Polymers (G4 stärkere
Photoluminiszenz als G2). Es wurde vermutet, dass die Fluoreszenz auf die Oxidation des
137
gegeben werden.[156] Gleichzeitig wurde 2004 von Imae et. al. eine starke blaue Fluorszenz
von G4-NH2 terminierten PAMAM-Dendrimeren unter pH-Wert abhängigen Reaktions-
bedingungen beschrieben und gezeigt, dass mit fallendem pH-Wert (Protonenerhöhung) eine
stärkere Fluoreszenzintensität auftritt (siehe Abbildung 51).[157]
Abbildung 51. Fluoreszenz-Emissionsspektrum (Anregung bei 390 nm) eines G4 NH2-terminierten PAMAM-Dendrimer bei unterschiedlichen pH-Werten: 2, 4, 5, 9 und 11. Das Foto zeigt eine 0.7 mM Lösung des Dendrimers bei pH = 2 in wässriger Lösung (Anregung über eine 4.5 W UV-Lampe).[157]
2006 beschrieben Shoukuan Fu et al. die Synthese und das auftreten einer intensiven blauen
Fluoreszenz von „hyperbranched“ Poly(amido)aminen. Abbildung 52 zeigt die chemische
Struktur des h-PAMAM-Dendrimers 70, die in saurer Lösung (5 mg / ml) unter einer UV-
Lampe eine intensive blaue Fluoreszenz zeigt.[190]
Abbildung 52. Links: Chemische Struktur des h-PAMAM Dendrimers 70; rechts: intensitätsstarke, blaue Fluoreszenz des h-PAMAM Dendrimers 70 in saurer Lösung bei einer Konzentration von 5 mg / ml (linke Hand), im Vergleich zu reinem Wasser (rechte Hand) unter einer UV-Lampe.[158]
138
Liu et. al. berichteten 2005 von „hyperbranched“ Poly(amino-estern)“, die nach Einstrahlung
von Licht bei einer Wellenlänge von 336 nm eine Fluoreszenz bei 460 nm zeigten, ohne dass
die Substanz oxidiert oder protoniert wurde. Sie vermuteten, dass die induzierte Fluoreszenz
auf die besondere dreidimensionale Struktur der Dendrimere zurückzuführen sei.[191] Yue-
Sheng Li et al. berichteten 2009 auch von einer starken blauen Fluoreszenz die bei
„hyperbranched“ Poly(aminoestern) beobachtet wurde. Sie deuteten die Fluoreszenz über die
dreidimensionale Struktur des Polymers: Es sei allgemein anerkannt, dass hoch verzweigte
Polymere wie die eingesetzten Poly(amino)ester „hyperbranched polymers“ kaskadenartig
aufgebaute, kugelförmige, dreidimensionale Strukturen besitzen. Aufgrund dieser Struktur sei
die Ausbildung starker intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Amid-
Wasserstoffatomen und den Carbonylfunktionen zwischen benachbarten Verzweigungen
begünstigt. Die dadurch resultierende rigide Struktur schränke die Freiheitsgrade der
Dendrimere ein und führe zu „intrinsischer“ Fluoreszenz. Ein strahlungsloser Übergang der
üsste jedoch noch
ufgeklärt werden.[159]
) benfalls nach Anregung im UV-Vis
Spektralbereich fluoreszierte.[193] Das APS behandelte TEA zeigte im Vergleich zum APS
behandeltem G4-PAMAM-Dendrimer eine deutlich geringe Fluoreszenzintensität. Die
beobachtete Fluoreszenz wurde auf die Anwesenheit tertiären Amino-Verzweigungspunkte
zurückgeführt, die in Anwesenheit von Sauerstoff (oder Sauerstoff-enthaltenden Molekülen)
in Lösung fluoreszenzaktive Komplexe mit Sauerstoff (oder Peroxyl-Radikalen) ausbilden.
Die beobachtete Eigenfluoreszenz der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 lassen auf
vergleichbare Mechanismen mit der beschriebenen Fluoreszenz der dendritischen
Kaskadenpolymere schließen. Im Gegensatz zu den rigiden, dendritischen
Kaskadenpolymeren mit – bezogen auf das Polymerteilchen - intramolekularen WBB, werden
we
icht
gestört. Die in Abbildung 43 postulierte Aggregation durch intermolekulare WBB zwischen
eingestrahlten Energie z.B. in Form von Schwingungsenergie, wie es in linearen Polymeren
auftritt, wäre dadurch weniger begünstigt. Die Ursache der Fluoreszenz m
a
2009 zeigten Imae et. al. das Triethylamin (TEA), das aufgrund des vergleichbaren
Strukturmotivs der typischen tertiären Amino-Verzweigungspunkte innerhalb der PAMAM-,
PPI- und Polyaminoether-Dendrimere ausgewählt wurde, nach 7 tägiger Behandlung mit
wässriger Ammoniumpersulfatlösung (APS e
in den durch Selbstaggregation gebildeten, niger rigiden Vesikelmembranen der MOH-
und DOSH / Cholesterin Catalipid-Vesikel, nur intermolekulare WBB ausgebildet. Die
Eigenfluoreszenz wird offensichtlich selbst durch partielle Einlagerung von Cholesterin n
139
den Amidbindungen der MOH Catalipide (siehe Abbildung 43, Ebene b), führt zur
regelmäßigen Packung (Fixierung) der hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen. Die beobachtete
Eigenfluoreszenz sollte auf Wechselwirkungen benachbarter Imidazolfunktionen
zurückzuführen sein. Schlussfolgerungen aus den zitierten Veröffentlichungen (siehe
Abbildung 51, Protonen-abhängige Fluoreszenz) unterstützen die Hypothese, dass zum
Energieabbau der aufgenommenen Strahlung ein energetisch bevorzugter Wechsel der
Protonen zwischen den benachbarten Imidazolfunktionen erfolgen könnte (siehe Abbildung
43, Ebene a). Dieser Wechsel ließe sich weiter über die Nτ / Nπ-Stickstoffatome benachbarter
Imidazol-Kopfgruppen im Aggregat fortsetzten. Im Endeffekt würde damit dieser Vorgang zu
„springenden Protonen“ - von Imidazol-Kopfgruppe zu Imidazol-Kopfgruppe - unter
Eigenfluoreszenz im geometrisch fixierten Assoziat führen.
Der Protonentransport in Materialen wird in der Literatur über zwei Modelle beschreiben:
1) Dem Grotthuß-Mechanismus [160] (Perkolationsmechanismus):
Das bekannteste über diesen Mechanismus ablaufende Beispiel ist der
Protonentransport in Wasser. Hierbei wandern nicht einzelne, hoch solvatisierte
Protonen durch die Lösung, sondern der Protonentransport verläuft durch
er
mphotere Charakter der stickstoffhaltigen Heterocyclen die Protonenleitfähigkeit
Umlagerungen von Bindungen in einer langen Kette von über WBB assozierten
Wassermolekülen. Das Wassermolekül fungiert so als Protonenträger.
2) „Vehicle“-Mechanismus:
Statt der Perkolation des einzelnen Protons sind bei diesem Modell „mobile“ Spezies,
„Protonencarrier“ für den Transport des Protons durch das Material verantwortlich.
Der Protonentransport ist insbesondere für wasserfreie Polymerelektrolyte interessant. Hierbei
werden Materialen wie z.B. herterocyclische Lewis-Basen wie Imidazol- bzw.
Pyrazoleinheiten als protonenleitendes, Polymerelekrolytmaterial in Brennstoffzellen
eingesetzt.[161, 162] Die in der Literatur beschriebenen Arbeiten zeigen, dass insbesondere d
a
ermöglichen. Die Effizienz der Protonenleitung wird maßgeblich durch die geometrische
Anordnung der einzelnen Stickstoff-Heterocyclen im Polymer bestimmt.[163, 164]
Als Leitfähigkeitsmechanismus der Protonen in Imidazol-Derivaten wird bevorzugt der
Grotthuß-Mechanismus[160] diskutiert, der übertragen auf die MOH Catalipid
Vesikelmembran wie in Abbildung 53 schematisch dargestellt verlaufen könnte.
140
Die Imidazol-Kopfgruppen werden durch intermolekulare WBB (Amidbindungen)
ausgerichtet und halten die Catalipide im Verbund. Der Protonentransport könnte entweder
über Nτ / Nπ-Stichstoffatome (magenta Pfeile) und / oder direkte Nπ / Nπ-Weitergabe („π-
Stacking“ durch senkrecht zur Zeichenebene angeordnete Imidazol Kopfgruppen) des Protons
im Aggregat vollzogen werden.
NH
N
NHO
H
NH
N
NHO
NH
N
NHO
NH
N
NHO
H+
H+
+
. Schematische Darstellung eines möglichen Protonentransfers durch protoniertAbbildung 53 e und nicht
r MOH Vesikelmembran nach dem Grottuß-Mechanismus. Durch AMOH C Möglicherweise lässt sich über die beob
aher eher nicht
Protonenweitergabe über die Nτ / Nπ-Stichstoffatome (magenta Pfeile, siehe Abbildung 53).
protonierte Imidazol-Kopfgruppen innerhalb deusbildung intermolekularer WBB zwischen den Amidbindungen werden die Imidazol-Kopfgruppen der atalipide im Verbund regelmäßig ausgerichtet und im geometrischen Verbund gehalten.
achtete Eigenfluoreszenz die geometrische
Anordnung der Imidazol Kopfgruppen im Assoziat – auch unter Cholesterin-Einlagerung –
näher bestimmen.
Die Hypothese des Protonentransfers innerhalb der Catalipid Vesikelmembranen, verbunden
mit der beobachteten Eigenfluoreszenz, wird durch die ausbleibende Eigenfluoreszenz des
Catalipids 71 (1, 3-Aminopropylimidazol als Kopfgruppe, siehe 3.2.12), das im Imidazolring
keine Protonierung ausbilden kann, bestätigt. Von einer alleinig durch - in supramolekulare
Strukturen – eingeschlossenen Sauerstoff verursachten Fluoreszenz ist d
auszugehen. Die Beobachtung der ausbleibende Eigenfluoreszenz von 71 deutet zudem darauf
hin, dass eine mögliche Nπ / Nπ-Weitergabe von Protonen zwischen den Imidazol
Kopfgruppen unter Eigenfluoreszenz weniger bevorzugt sein sollte, als die
141
3.2.12 Das Catalipid MON-Im 71
Um ein strukturverwandtes Catalipid, ähnlich dem langkettigen MOH 39, auf Basis von
1, 3-Aminopropylimidazol 72 zu synthetisieren, wurde an die primäre Aminofunktion von 72
unter Verwendung des Aktivierungsreagenzes N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) 73
Ölsäure 36 gekoppelt. Die Synthese erfolgte in flüssiger Phase, um einen kostengünstigen
Zugang zu größeren Substanzmengen - im Vergleich zur bisher angewendeten
Festphasensynthese - zu ermöglichen. Nach chromatographischer Aufreinigung wurde das
MON-Im Catalipid 71 mittels NMR-Spektroskopie und MALDI-TOF MS charakterisiert
(siehe Abbildung 54).
Abbildung 54. Chemische Struktur des MON-Im Catalipids 71.
Um die Aggregationseigenschaften des MON-Im 71 zu supramolekularen Objekten mit denen
man
Zugaben an
uffer (4 mM) bei pH = 4.8 konnte unter Zusatz von 5 mol % Cholesterin
O
des DOSH 54 und MOH 39 Catalipids zu vergleichen (siehe Kapitel 3.2.6.3), wendete
die Dehydrierung-Rehydrierungsmethode (siehe 3.2.4.2) zur Vesikelherstellung an.
Hierzu wurden 4 mM Dispersionen des MON-Im 71 mit unterschiedlichen
Cholesterin 67 (5-15 %) in Puffern wie Natriumacetat bei pH = 4.8, HEPES bei pH = 7.2 und
MES bei pH = 6.2 untersucht.
Im Natriumacetat-P
eine stabile, trübe Dispersion erhalten werden. Ohne Zugabe des Helfer-Lipid Cholesterin
lagen nur viele Öltröpfchen in der sonst klaren Dispersion vor.
Die lichtmikroskopische Analyse der Dispersion mit Zusatz von 5 mol % Cholesterin ist in
Abbildung 55 gezeigt. Nach einer 4 stündigen Entwicklungszeit bei Raumtemperatur lagen,
neben einigen sphärischen Vesikeln, mehrere größere, nicht-sphärische, unregelmäßig
geformte Aggregate vor (siehe B-66).
NN N
H71 78 %
142
Nach 24 stündiger Lagerung bei Raumtemperatur nahmen Anzahl und Größe dieser
Strukturen weiter zu; es ware noch wenige sphärische Vesikel in der Dispersion n nur
vorhanden (B-67).
B-66 B-67
Abbildung 55. Lichtm on von MON-Im 71 (5 mol % Cholesterin) i n Entwicklungszeiten:
-66 nach 4h; B-67 nach 24 h. Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).
emerkenswert ist, dass zur Herstellung einer stabilen, trüben Dispersion im Fall des MON-
härischer
n. Die Catalipide MOH 39 und DOSH 54 besitzen Histamin 6
iven Ladungen der Imidazol-
t sein, so dass hier hingegen die
Kopfgruppen bei pH = 4.8 unprotoniert vorliegen, woraus eine weniger große
Kopfgruppenoberfläche a resultiert. Erst durch die Einlagerung des Cholesterins zwischen die
MON-Im Catalipide in der Membran, werden diese Kopfgruppen durch sterische
Abstoßungen so vergrößert, dass es zur Ausbildung sphärischer Aggregate kommen kann.
ikroskopische Aufnahmen (40 x Vergrößerung) einer 4 mM Dispersin 4 mM Natriumacetat-Puffer bei pH = 4.8 nach unterschiedliche
B
B
Im Catalipids 71 bereits bei pH = 4.8 die Zugabe von Cholesterin 67 als Helfer-Lipid
notwendig war. Im Vergleich hierzu zeigten die MOH 39 und DOSH 54 Catalipide ohne
Cholesterin Zugabe, unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen, die Ausbildung sp
Vesikel (siehe 3.2.6.1; 3.2.6.2).
Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedliche chemische Struktur der Kopfgruppen der
Catalipide zurückgeführt werde
als Grundgerüst, das MON-Im Catalipid basiert hingegen auf 1, 3-Aminopropylimidazol 72.
Bei pH < 5 liegt die Imidazol-Kopfgruppe der Histamin basierten Catalipide 39 und 54
weitgehend protoniert vor, so dass die Abstoßung der posit
Kopfgruppen zu einer Vergrößerung der Kopfgruppenoberflächen a der Lipide führt und so
bevorzugt sphärische Aggregate gebildet werden (MOH: siehe Tabelle 8; DOSH: siehe
Tabelle 12). Die Protonierung des Nπ-Stickstoffatoms der Imidazol-Kopfgruppe im MON-Im
Catalipid 71 sollte bei diesem pH-Wert weniger bevorzug
143
Interessanter Weise zeigten die in Abbildung 55 gezeigten Membranen der supramolekularen
Aggregate keine Eigenfluoreszenz, im Gegensatz zu den MOH-Vesikeln und DOSH-Vesikeln
in Wasser (siehe Kapitel 3.2.11). Die Beobachtungen der fehlenden Eigenfluoreszenz der
ON-Im Catalipidmembranen bei 488 nm unterstützt zusätzlich die Hypothese, dass die
intermolekulare Wanderung von Protonen zwischen den Imidazolstrukturen der
Ve embranen, die Eigenfluoreszenz bei 488 n rsachen sollte.
M
sikelm m veru
144
3.3 Metabolisches Subsystem (1) des Minimalen Chemoton Modells
Zur chemischen Implementierung des in der Aufgabenstellung beschriebenen Konzepts zum
MCM war die Realisierung eines metabolischen Subsystems (1) erforderlich, über das eine
Herstellung reaktiver DNA-Catalipid Konjugate A ermöglicht wird. Die Reaktion zu
reaktiven Catalipid-Konjugaten sollte in jedem Fall außerhalb des Catalipid-Vesikels ablaufen
und - nach der Membrandurchquerung - das im Inneren des Imidazol-Vesikels ablaufende
genetische Subsystem (2) mit genügend energiereichen Molekülen versorgen (siehe
Abbildung 15 und 16). Konzeptionell bestehen somit zwei prinzipiell unterschiedliche
Möglichkeiten, wie die zur Ligation notwendigen reaktiven DNA-Catalipid Konjugate A dem
MCM zugeführt werden können: Zum einen könnte die Synthese reaktiver DNA-Catalipid
Konjugate A extern des Systems erfolgen, wobei dann die „prä“-synthetisierten“ DNA-
Catalipid Konjugate A zu den anderen Komponenten des MCMs gegeben werden müssten. In
diesem Fall wäre die zugeführte „Energie“, zur chemischen Umsetzung des metabolischen
Subsystems (1), als externe Komponente zum MCM zu betrachten. Zum anderen könnte die
Synthese reaktiver DNA-Catalipid Konjugate A in Anwesenheit aller Komponenten
stattfinden. Diese (interne) „in-situ“ Synthese reaktiver Catalipid-DNA Konjugate A müsste
dann außerhalb des Catalipid-Vesikels, aber in der Reaktionslösung in Anwesenheit eines
wasserlöslichen Aktivierungsreagenzes (z.B. EDC 2) stattfinden. Das Aktivierungsreagenz ist
notwendig, um eine nukeophile Reaktion zwischen zu aktivierender Phosphatgruppe und
Imidazolfunktion des Catalipids zum reaktiven Catalipid-DNA Konjugat A zu ermöglichen
(siehe Aufgabenstellung Abbildung 14).
Unabhängig von der gewählten Synthesestrategie zu aktivierten DNA-Catalipid
Konjugaten A, d.h. ob „prä-synthetisiert“ oder „in-situ“ erzeugt, sollte die zur Ligation
notwendige Aktivierungsenergie ausschließlich über die Phosphorimidazolid-Aktivierung des
DNA-Catalipid Konjugats bereitgestellt werden. Nur so wäre die geforderte stöchiometrische
Kopplung des genetischen Subsystems (2) und des membranformenden Subsystems (3) zu
gewährleisteten.
Die Untersuchung des metabolischen Subsystems (1) sollte zunächst abgekoppelt von den
weiteren Subsystemen (2) und (3) des MCMs erfolgen, um die spezifischen Reaktions-
bedingungen für die Synthese der DNA-Catalipid Konjugate zu klären. Über eine isolierte
Betrachtung der Konjugate, könnten ihre speziellen chemischen Eigenschaften untersucht
werden: die Löslichkeit im Reaktionspuffer, die Reaktivität der Phosphorimidazolidbindung
im Vergleich zu in Wasser eintretender Hydrolyse. Auch wären über diese Vorgehensweise
145
- falls notwendig - Modifikationen der als Kopplungspartner eingesetzten Catalipide zu
(2)), abzustimmen.
suchung nicht-enzymatischer, templatgesteuerter
erproben, um deren Eigenschaften, z.B. Verbesserung der Löslichkeit oder Reaktivität (siehe
genetisches Subsystem
3.3.1 Synthese reaktiver DNA-Catalipid Konjugate
Die reaktiven DNA-Catalipid Konjugate sollten durch die kovalente Verknüpfung der
Phosphatgruppe des einzusetzenden 3`-terminal-phosphorylierten Cy5-TTTCCGp Oligo-
nukleotids 3 und der Imidazol-Kopfgruppe eines Catalipids unter Ausbildung einer reaktiven
Phosphorimidazolidbindung gebildet werden. Die Anforderungen an die Catalipide waren
unter anderem so gestellt, dass sie unter physiologischem pH-Wert große Vesikel ausbilden
und zudem mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA befüllt werden können. Sowohl das
einkettige MOH-Catalipid 39, als auch das zweikettige DOSH-Catalipid 54 erfüllten diese
speziellen Eigenschaften und wurden daher als potentielle Kopplungspartner zur Synthese
von reaktiven DNA-Catalipid Konjugaten eingesetzt.
Zur Auswahl und Ausarbeitung geeigneter Synthesestrategien mit speziellen
Reaktionsbedingungen, die zur erfolgreichen Herstellung reaktiver Phosphorimidaziolide - im
Speziellen reaktiver DNA-Catalipide - notwendig sind, wurden folgende Vorüberlegungen
angestellt: Generell erfordert die erfolgreiche kovalente Verknüpfung eines hydrophilen
Gebildes mit hydrophoben Reaktionspartnern in einer Lösung besondere Ansprüche an das zu
wählende Lösungsmittel. Die Synthese von Imidazol-aktivierten Nukleotiden wurde bereits
von Orgel beschrieben, zur Unter
Polymerisationen von Ribonukleotiden (siehe Abbildung 56).[165, 166]
PO
O
O
O
O
OH
PO
O
O
O
O
OH
N N PO
O
O
O
OH
N NH N NH
PPh3, PySSPy,DMF, Et N
EDC,0.1 M HEPES
BB B
3
Abbildung 56. Darstellungsmöglichkeiten von Imidazol-aktivierten Nukleotiden im organischen, als auch im wässrigen Reaktionsmedium.[165, 166]
Die Synthese der Imidazol-aktivierten Nukleotide konnte sowohl im organischen
Lösungsmittel als auch im Wässrigen durchgeführt werden.
Zur Herstellung reaktiver DNA-Catalipid Konjugate wurde in ersten Versuchen die
Synthesestrategie im organischen Lösungsmittel verfolgt, da hierbei die im Wässrigen
146
auftretende Hydrolyse der Phosphorimidazolidbindung verhindert wird. Hierzu wurde das
Oligonukleotid 3 mehrfach mit absolutem TEA coevaproiert und anschließend im Vakuum
getrocknet. Zur anschließenden Reaktion zum DNA-Catalipid Konjugat setzte man zuerst das
terisch weniger anspruchsvolle MOH 39 Catalipid ein. Dieses löste man in einem Gemisch
aus DMF, DMSO und Triethylamin in Anwesenheit von 2,2´-Dipyridyldisulfid (PySSPy) und
3 3. Nach einer
eaktionszeit von 2 h bei 35 ºC konnte kein Produkt isoliert oder massenspektrometrisch
s
Triphenylphosphan (PPh ) und gab diese Lösung zu dem Oligonukleotid
R
nachgewiesen werden, auch eine Verlängerung der Reaktionszeiten auf 24 h oder eine
Temperaturerhöhung auf 55 ºC zeigte nicht die Reaktion zum Cy5-TTTCCGp-MOH
Konjugat 74. Auch die analog durchgeführte Kopplung des zweikettigen DOSH 54 Catalipids
zeigte keine Produktbildung.
In folgenden Kopplungsexperimenten sollte daher die Synthese von reaktiven DNA-
Catalipiden im wässrigen Medium durchgeführt werden. Als Aktivierungsreagenz setzte man
das wasserlösliche EDC 2 ein, so dass die Möglichkeit der zuvor beschriebenen „in-situ“
Reaktion zu reaktiven DNA-Catalipiden im MCM möglich wäre.
147
Die EDC-Aktivierung der Phosphatgruppe mit dem wasserlöslichen Carbodiimid EDC 2 und
mögliche Folgereaktionen in Anwesenheit von Catalipiden im Wässrigen ist in Abbildung 57
gezeigt.
OO P
O
O
NH
NHOO P
O
O
NHNH
NH
O
NH+
NH
N
NH
R+
+
++ EDC
+ H2O
(CH2)7CH3
(CH2)7CH3
O
NH
O (CH2)7
O
O (CH2)7
N
N
NH
RO P
O
ONH
N
NH
R
(CH2)7CH3(CH2)7
O
R1 = R2 =
- EDU
-
+ H2O
- EDU
753
2a
1, 2
39
54
1, 2
1, 2
MOH
DOSH
2a
TTCCGCy5TTCCGCy5
TTCCGCy5
Abbildung 57. Mechanismus der EDC-Aktivierung der 3´-terminalen-Phosphatgruppe des Cy5-TTCCGp Oligo-nukleotids 3 und mögliche Folgereaktionen im wässrigen Medium in Anwesenheit von Catalipiden (MOH 39 und DOSH 54).
Die Reaktion der 3´-terminalen-Phosphatgruppe des Oligonukleotids 3 mit dem Carbo-
diimid 2 führt zur Bildung des Isoharnstoffs 75, der weitere Reaktionen eingehen kann. Die
direkte Hydrolyse führt zum Harnstoffderivat EDU 2a und der Ausgangsverbindung 3 zurück.
Reagiert der Isoharnstoff 75 jedoch in einer nukleophilen Reaktion mit einem in Lösung
vorliegenden Catalipid, entsteht das reaktive Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugat. Da die
gebildete Phosphorimidazolidbindung hydrolyseempfindlich ist, kann es auch wieder zur
Rückbildung der Ausgangsverbindung 3 und dem eingesetzten Catalipid kommen. Das
reaktive Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugat sollte unter geeigneten Aufreinigungsbedingungen
mittels HPLC isolierbar sein - im Gegensatz zum O-Acylisoharnstoffs 75 -, so dass eine
anschließende Untersuchung der chemischen Eigenschaften der Konjugate möglich wäre.
Um speziell die Löslichkeiten des lipophilen Catalipids und des hydrophilen Cy5-markierten
Oligonukleotids 3 im gemeinsamen Reaktionsmedium zu optimieren, wurden Vor-
148
untersuchungen zur Auswahl geeigneter Reaktionsbedingungen durchgeführt. Hierzu ersetzte
man in ersten Versuchen das teure, Cyaninfarbstoff-markierte Cy5-TTCCGp Oligo-
nukleotid 3 durch das preisgünstigere Nukleotid 5’-GMP 76 als Modell-Verbindung. Um
zunächst eine möglichst gute Löslichkeit des Catalipids im wässrigen Medium zu erreichen,
wurde das durch die kurzen Alkylketten recht hydrophile Modell-Catalipid 28 eingesetzt
(siehe 3.1.7, Tabelle 2). Als Reaktionspuffer 77 verwendete man eine 0.2 M EDC-Lösung in
0.1 M HEPES-Puffer (pH = 7.2) mit 20 vol % Acetonitril. Das zugesetzte Acetonitril sollte
sowohl die Adhäsion der Cyaninfarbstoff markierten Oligonukleotide, die in folgenden
Konjugationsexperimenten eingesetzt werden sollten, als auch der Catalipide an den
Kunststoffreaktionsgefäßen verhindern.[81, 83]
In einem typischen Konjugationsexperiment wurden 1 µmol (1 eq) 5’-GMP 76 mit 10 µmol
(10 eq) „Modell-Catalipid“ 28 in 50 µl Reaktionspuffer 77 bei Raumtemperatur für 24 h zur
Reaktion gebracht. Das Konjugationsprodukt 78 konnte mittels ESI-MS analysiert werden
(siehe Abbildung 58).
Abbildung 58. Chemische Struktur des 5´GMP-„Modell-Catalipid“ Konjugats 78.
OSH 54 als Kopplungspartner eingesetzt. Hier zeigte sich jedoch direkt die schlechtere
O
Nachfolgend wurden, unter gleichen Reaktionsbedingungen, die Catalipide MOH 39 und
D
Löslichkeit beider Catalipide gegenüber dem Modell-Lipid 28 im Reaktionspuffer 77. Auch
eine Temperaturerhöhung auf 35 ºC sowie ausgiebiges Sonifizieren brachten keine
Löslichkeitsverbesserung. Eine massenspektrometrische Auswertung der Reaktionslösungen
mittels MALDI-TOF bestätigte die Beobachtungen: Es erfolgte keine Produktbildung.
Um die unzureichende Löslichkeit der Catalipide 39 und 54 zu überwinden, wurden die
Catalipide auf der Oberfläche des Reaktionsgefäßes präorganisiert. Hierbei sollten sich deren
hydrophile Imidazol-Kopfgruppen zu einer bevorzugten Anordnung nach außen, d.h. zur
Lösung hin orientieren, um so die nukleophile Reaktion mit den EDC-aktivierten
Phosphatgruppen zu ermöglichen. Neben hydrophoben, intermolekularen Wechselwirkungen
zwischen den Alkylketten benachbarter Catalipide (siehe Abbildung 59, 3), die zu einer
Präorganisation führen könnten, wären zusätzliche intermolekulare attraktive
NNN P
OO
O
O
N
N
N
NH
NH2
OH 78
149
Wechselwirkungen zwischen den hydrophilen Kopfgruppen 1, als auch den Amidbindungen
der Catalipide 2 denkbar (siehe Abbildung 59 und Abbildung 43).
N
NH
NHO
N
NH
NHO
N
NH
NHO
1
2
3
1
2
3
Abbildung 59. Schem rkungen, die zu einer Präorganisation einzelner ten.
Zum Auftragen eines dünnen Lipi
Rehydrierungs-Methode
ngewendet. Um n der Catalipide
he des Innenraums des
eaktionsgefäßes durch Einwirkung von Perfluordecyltrichlorsilan hydrophobiert. Hierbei
ng 5’-
atische Darstellung attraktiver intermolekularer Wechselwi Catalipide im Trocknungsprozess des Lipid-Films führen könn
d-Films in definierter Stoffmenge auf die Oberfläche des
Reaktionsgefäßes, wurde die in 3.2.4.2 beschriebene Deydrierungs-
hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Alkylkettea
und der Glasoberfläche zu erzeugen, wurde zudem die Glasoberfläc
R
reagieren die durch Hydrolyse entstandenen Hydroxylsilane mit den Hydroxylgruppen der
Glasoberfläche. Es entstehen jedoch durch Silan-Cluster keine hydrophoben Monolagen,
sondern eher hydrophobe Schichten unterschiedlicher Dicke.[199, 200]
Zu den jeweiligen Lipid-Filmen 39, 54 und 28 (jeweils 200 µmol), die sowohl auf die
hydrophobierten als auch auf die unbehandelten Glasoberflächen aufgebracht wurden, gab
man unter ständigem Drehen des Reaktionskolbens 100 µl einer 0.1 molaren Lösu
GMP 76 im Reaktionspuffer 77. Nach einer Reaktionszeit von 24 h bei Raumtemperatur
wurden die unterschiedlichen Reaktionslösungen mittels ESI-MS und MALDI-TOF MS
analysiert: Im Fall des Modell-Lipids 28 konnte sowohl bei unbehandelter, als auch bei
hydrophobierter Glasoberfläche das Konjugationsprodukt 78 massenspektrometrisch
detektiert werden. Die Analyse der Reaktionsmischungen, in denen die Catalipide MOH 39
und DOSH 54 als Kopplungspartner eingesetzt wurden, zeigten keinen Massenpeak des
Konjugationsprodukts, unabhängig von der Beschaffenheit der Glasoberfläche. Im
150
Reaktionsverlauf kam es hingegen zur Ablösung der Lipid-Filme. Dies machte eine Analyse
mittels HPLC - aufgrund zu vieler unlöslicher Bestandteile in der Lösung - unmöglich.
usammengefasst, zeigten die Vorversuche, dass die Löslichkeit der Catalipide MOH 39 und
DOSH 54 im Reaktion Catalipid Konjugate eine
entscheidende Rolle nte zum Lösen der Catalipide
MOH 39 und DOSH
Um die Catalipide MOH und DOSH im zu lösen, wurden unterschiedliche
an den Einfluss der
Temp ögliche, störende
2 zum
Harnstoffderivat EDU Nachhinein – nach
beendetem
Es konnten 10 mM 77 hergestellt
erden, wobei die Zugabe von insgesamt 50 vol % Acetonitril und eine Temperaturerhöhung
nerwünschte Nebenreaktionen im Konjugationsschritt zwischen dem EDC 2 und dem
wurden 100 µL des
Z
spuffer 77 zur Synthese reaktiver DNA-
spielt. Im folgenden wurden Experime
54 durchgeführt.
Reaktionspuffer 77
Mengen Acetonitril, DMSO oder DMF eingesetzt. Zudem untersuchte m
eraturerhöhung auf das Löslichkeitsverhalten. Um sowohl m
Nebenreaktionen, als auch eine temperaturbedingte, verstärke Hydrolyse des EDC
2a zu vermeiden, wurde der Aktivator erst im
Lösungsvorgang – zugesetzt.
Lösungen der Catalipide 39 und 54 im Reaktionspuffer
w
auf 55 ºC notwendig war. Es ist bekannt, dass diese hohen Reaktionstemperaturen
u
eingesetzten Oligonukleotid beschleunigen.[83] Stattdessen musste ein effizienteres
Lösungsmittelgemisch eingesetzt werden. In einem Gemisch aus 15 vol % DMF und 20 %
Acetonitril in 0.1 M HEPES-Puffer (pH = 7.2) 79 konnten bei 35 ºC 10 mM Lösungen der
Catalipide 39 und 54 hergestellt werden. Hierzu wurden die Catalipide zuerst unter längerem
Sonifizieren im Lösungsmittelgemisch fein dispergiert und anschließend auf 55 ºC - zum
vollständigem Lösen - erhitzt. Erst nach dem Abkühlen der Lösung auf 35 ºC wurde das EDC
2 zu der Lösung gegeben, wobei keine sichtbare Änderung des Löslichkeitsverhalten eintrat.
Zur Synthese reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate
Reaktionspuffers 79, in dem 0.2 M EDC und 0.01 M Catalipid 39 oder 54 gelöst waren, zu
100 nmol Cy5-TTCCGp 3 gegeben und für 4 Stunden bei 35 ºC zur Reaktion gebracht. Zur
Reaktionskontrolle wurde ein kleiner Teil der Lösung mit einem Gemisch aus
Wasser / Acetonitril (8/2, v/v) verdünnt und direkt über RP-HPLC analysiert. Die
Auftrennung erfolgte an C18-Säulen der Firma Macherey&Nagel. Als Elutionsmittel dienten
ein 0.1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer (pH = 7) und Acetonitril, wobei die
Absorption des Cy5-Farbstoffs bei 644 nm detektiert wurde. Die Verwendung des Triethyl-
ammoniumhydrogencarbonat-Puffer anstelle des sonst üblichen Ammoniumhydrogen-
carbonat-Puffers (NH4HCO3-Puffer) sollte einen nukleophilen Angriff des Amins an die
reaktive Phosphorimidazolidbindung verhindern. Da der Cy5-Farbstoff einen großen
151
Extinktionskoeffizienten (250000 lmol-1cm-1) besitzt, reichten bereits geringe Stoffmengen
zur Reaktionskontrolle aus. Zudem sind im Idealfall einer guten Auftrennung nur zwei
644 nm, die unter den gewählten Bedingungen einen
den gewählten Reaktionsbedingungen lag die
Signale im Chromatogramm zu erkennen, das Signal des Edukts Cy5-TTCCGp 3 und das des
gebildeten DNA-Catalipid Konjugats.
Das Chromatogramm der Reaktionslösung des einkettigen MOH 39 Catalipid zeigte zwei
Signale unterschiedlicher Intensität bei
Unterschied in den Retentionszeiten von ca. fünf Minuten zeigten. Die
massenspektrometrische Analyse der Reaktionsprodukte mittels MALDI-TOF MS zeigte,
dass es sich bei den Substanzen um das eingesetzte Edukt Cy5-TTCCGp 3 und das
gewünschte Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74 handelte. Zur quantitativen Einschätzung der
Produktbildung verglich man die Integrationen der entsprechenden Peakflächen der
zugehörigen RP-HPLC Signale. Unter
durchschnittliche Ausbeute zwischen 48 und 51 % der Theorie. Zur Isolierung der RP-HPLC
gereinigten Konjugate 74 wurde der Elutionspuffer (Triethylammoniumhydrogencarbonat-
Puffer) der RP-HPLC Aufreinigung in ersten Versuchen – standardgemäß - im Vakuum
entfernt. Die nachfolgende RP-HPLC Analyse zeigte jedoch, dass es zu einer ausgeprägten
Hydrolyse des Konjugats 74 zu den Edukten 3 und 39 kam. Um eine möglichst schonende
und schnelle Entsalzung zu ermöglichen, setzte man Oasis TM-Extrationskartuschen der Firma
Waters ein. Nach der Entsalzung wurde das in einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser
gelöste Konjugat 74 im Vakuum eingeengt, da eine vollständige Entfernung des
Lösungsmittels das Rehydrieren verhinderte. Nach der UV-metrischen Konzentrations-
bestimmung wurde das Konjugat umgehend als Reaktant für die in Kapitel 3.4.1 ausführlich
beschriebenen Ligationsexperimente eingesetzt, um die sofort eintretende Hydrolyse zu
verringern.
Setzte man in der Kopplungsreaktion anstatt des MOH 39 Catalipids das hydrophobere
DOSH 54 Catalipid ein, konnte unter gleichen Reaktionsbedingungen keine Reaktion mit dem
Oligonukleotid 3 festgestellt werden, wie die RP-HPLC sowie auch die
massenspektrometrische Analyse mittels ESI-MS und MALDI-TOF MS zeigte. Auch eine
Verlängerung der Reaktionszeit auf max. 24 h, oder eine Temperaturerhöhung auf max. 45 ºC
zeigten nicht die Reaktion zum Cy5-TTCCG-DOSH Konjugat, obwohl eine klare
Reaktionslösung vorlag. Eine Erklärung hierfür könnte die, im Vergleich zum einkettigen
MOH-Catalipid, größere sterische Abschirmung des zweikettigen DOSH 54 Catalipids sein,
die eine nukleophile Reaktion mit dem Cy5-TTTCCGp Oligonukleotid 3 verhindert.
152
3.3.2 Zusammenfassung der DNA-Catalipid Konjugationsexperimente und
Schlussfolgerungen für das MCM
Zusammenfassend zeigten die Experimente zur Herstellung reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid
indung ausreichend zu verringern. Das Cy5-TTCCG-DOSH Konjugat konnte über
spartner
Konjugate, dass die Reaktion im Wässrigen, verglichen mit der im organischen Medium,
vorzuziehen ist. Erste Kopplungsversuche zur Untersuchung abgestimmter Reaktions-
bedingungen wurden mit geeigneten Modell-Verbindungen durchgeführt: Hierbei ersetzte das
kostengünstige 5’-GMP 76 das teure Oligonukleotid 3. Zusätzlich setzte man in ersten
Versuchen das kurzkettige Modell-Catalipid 28 als möglichst hydrophilen Kopplungspartner
ein. Die Reaktion zum Modell-Konjugat 78 wurde damit erfolgreich durchgeführt. Produkt-
bildung konnte jedoch mit den hydrophoberen, und daher schlechter löslichen Catalipiden
MOH 39 und DOSH 54 unter gleichen Reaktionsbedingungen nicht beobachtet werden. Auch
Versuche zur Präorganisation der Catalipide 39 und 54 über die Ausbildung eines dünnen
Lipid-Films auf einer unbehandelten oder auch hydrophobierten Glasoberfläche zeigte keine
Reaktion zum Konjugat. Dies wies darauf hin, dass ein vollständiges Lösen beider
Kopplungspartner im wässrigen Reaktionspuffer zur erfolgreichen Konjugation essentiell zu
sein schien. Dies konnte durch den gezielten Zusatz organischer Lösungsmittel zum
Reaktionspuffer 77 in Verbindung mit abgestimmten Reaktionsbedingungen erreicht werden,
so dass die Synthese des Cy5-TTCCG-MOH Konjugats 74 gelang. Durch die Auswahl und
Modifizierung eines geeigneten Auftrennungsverfahrens mittels RP-HPLC konnte zudem die
Isolierung und Charakterisierung des Konjugats 74 ermöglicht werden. Hierbei erwies sich
die schonende Entsalzung des Konjugats 74 nach der vorherigen Isolierung mittels RP-HPLC
über Oasis TM Kartuschen als das geeignete Verfahren, um die Hydrolyse der Phosphor-
imidazolidb
das ausgearbeitete Syntheseverfahren nicht synthetisiert werden. Dies könnte auf die – im
Vergleich zum einkettigen MOH 39 Catalipid – zu hohe Lipophilie des zweikettigen DOSH-
Catalipids zurückzuführen sein.
Ligationsexperimente zwischen dem Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74 und dem 5´-Amino-
terminierten Oligonukleotid 4 im Ligationspuffer 80 (0.1 M HEPES-Puffer pH = 7.2, 50 mM
NaCl, 20 vol % CH3CN) waren aufgrund der unzureichenden Löslichkeit des Konjugats 74
im erforderlichen Konzentrationsbereich nicht möglich (ausführliche Beschreibung der
Experimente siehe Kapitel 3.4.1). Daher werden im folgenden experimentelle Ansätze
beschrieben, in denen die Löslichkeit und Reaktivität des als Konjugation
153
eingesetzten Catalipids – und somit auch die der daraus herzustellenden DNA-
hinsichtlich einer erfolgreichen Ligation op
Konjugate -,
timiert werden.
3.3.3 Synthesen reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate mit kurzkettigen
Catalipiden
Um die Unlöslichkeit des Cy5-TTCCG-MOH Konjugats 74 im Ligationspuffer 80 (siehe
Kapitel 3.4.1) zu überwinden, sollten kurzkettigere und somit im Wässrigen löslichere
Catalipide hergestellt werden. Aufgrund der Verkürzung der Alkylketten war allerdings davon
auszugehen, das diese Catalipide nicht mehr die optimalen Eigenschaften der langkettigeren
Catalipide MOH 39 und DOSH 54 zeigen, große Vesikel auszubilden. Um das
Löslichkeitsproblem der DNA-Catlipide im Ligationspuffer 80 zu umgehen, war so eine
Abkopplung des genetischen Subsystems (2) vom membranformenden Subsystem (3) des
MCMs erforderlich.
Der einfachste synthetische Zugang zu Catalipiden mit variierenden Alkylkettenlängen ist die
kovalente Verknüpfung unterschiedlich langer Fettsäuren mit der Aminofunktion des
Histamins 7, unter Ausbildung einer Amidbindung. Diese kurzkettigen Catalipide auf Basis
des einkettigen MOH 39 sollten Alkylkettenlängen zwischen 6 und 10 Kohlenstoffatomen
aufweisen. Hierdurch wäre ein systematischer Vergleich der Löslichkeit der Catalipide, in
Abhängigkeit von ihrer Lipophilie, möglich. Die Synthese der kurzkettigen Catalipide sollte
in flüssiger Phase erfolgen, um einen kostengünstigen Zugang zu größeren Substanzmengen
- im Vergleich zur bisher angewendeten Festphasensynthese - zu ermöglichen. Löslichkeits-
probleme, die durch die Aggregation einzelner Reaktanden entstehen könnten, sind aufgrund
der kurzen Alkylketten in einer einstufigen Synthese nicht zu erwarten.
154
3.3.3.1 Synthese der kurzkettigen Histamin-Catalipide und deren korrespondierender
Cy5-TTCCG Konjugate
Aminofunktion des Histamins 7 wurden unter Verwendung des
ktivierungsreagenzes DCC 73 unterschiedliche Carbonsäuren mit Alkylkettenlängen von C6
hrt. Auch in diesen
Experimenten sollte die Temperatur einen signifikanten Einfluss auf das Löslichkeitsverhalten
zeigen; daher wurden die 0.02 M Lösungen der jeweiligen der MCH-Catalipide 84, 85, 86
durch Sonifizieren dispergiert und anschließend auf 55 ºC erwärmt. Die EDC-Zugabe erfolgte
nach Abkühlung auf 35 ºC (analog dem Lösungsvorgang der MOH-Catalipide; siehe 3.3.1).
Zeigte sich eine Eintrübung der Lösung - oder traten sogar unlösliche Bestandteile auf -,
wurde sukzessiv DMF zum Reaktionspuffer 87 zugegeben, um ungetrübte 0.02 M Catalipid-
Lösungen zu erhalten. Die Löslichkeitsversuche zeigten einen direkten Zusammenhang
zwischen Alkylkettenlänge der MCH-Catalipide und der zum ungetrübten Lösen
erforderlichen Menge DMF: Das kurzkettigste MC6H 84 Catalipid löste sich vollständig im
Puffer 87, im Fall des MC8H- Catalipids 85 war bereits 2.5 vol % DMF und beim MC10H 86
schon 10 vol % DMF zum vollständigen Lösen notwendig.
An die primäre
A
(n-Hexansäure), C8 (n-Oktansäure), C10 (n-Dekansäure) gekoppelt (siehe Abbildung 60).
Nach säulenchromatographischer Aufreinigung wurden die Catalipide mittels NMR-
Spektroskopie und MALDI-TOF MS charakterisiert.
OH R
O
NHN
NH2 NHN
NH
R
OCHCl3, TEA
R -(CH2)4CH3 1 81 R -(CH2)4CH3
1 84 78 %R -(CH2)6CH3
R -(CH2)8CH3
23
82
83
R -(CH2)6CH3
R -(CH2)8CH3
23
8586 66 %
81 %
+ 1, 2, 3
1, 2, 3DCC
2
73
Abbildung 60. Synthese kurzkettiger Catalipide MC6H 84, MC8H 85 und MC10H 86 in Lösung.
Im folgenden werden die Abkürzungen MCH für die kurzkettigen Catalipide verwendet: M
steht für: Mono, Cx für die Anzahl (x) der Kohlenstoffatome, und H für Histamin. Alle MC6H
84, MC8H 85 und MC10H 86 Catalipide konnten in guter Ausbeute nach
säulenchromatographischer Aufreinigung erhalten werden, die Charakterisierung erfolgte
mittels NMR- und Massenspektrometrie.
Zur Synthese reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate wurden zuerst Löslichkeitsversuche
in 0.1 M HEPES-Puffer 87 (pH 7.2 mit 20 vol % ACN) durchgefü
155
Zur Synthese reaktiver Cy5-TTCCG-MCH Konjugate wurden in 100 µL des Reaktions-
Cy5-TTTCCGp
-HPLC, in Anlehnung an die Experimente mit
an auch hier die Entsalzung mit den
asis TM-Extrationskartuschen der Firma Waters durch, um die Hydrolyse der gebildeten
Konjugate zu m
Et3NHHCO
Hydrolyseverhalten
eaktivkonjugate über die Oasis TM Kartuschen zur Reduzierung der Hydrolyse führte. Die
DI-TOF MS
9 e
puffers 87 0.2 M EDC und 0.02 M der MCH-Catalipide 84, 85 oder 86 gelöst, zu 100 nmol
3 gegeben und für 4 Stunden bei 35 ºC zur Reaktion gebracht.
Die Analyse der Lösungen erfolgte über RP
dem MOH-Konjugat 74 (siehe Kapitel 3.3.1). Zur quantitativen Einschätzung der Produkt-
bildung verglich man auch hier die Integralverhältnisse der entsprechenden Signale von Edukt
3 und Cy5-TTCCG-MCH Produkt-Konjugat. Die durchschnittlichen Ausbeuten - unter den
gewählten Reaktionsbedingungen – lagen zwischen 65 und 78 % der Theorie. Nach Isolierung
der jeweiligen Cy5-TTCCG-MCH Konjugate führte m
O
inimieren. Es zeigte sich auch hier, das anstelle des zuvor eingesetzten
3-Puffers der NH4HCO3-Puffer als Elutionspuffer für die RP-HPLC Aufreinigung
eingesetzt werden konnte. Es wurden keine gravierenden Unterschiede im
der gebildeten Konjugate beobachtet. Dies zeigte, dass alleinig die schonende Entsalzung der
R
Charakterisierung der MCH-Konjugate 88, 89 und 90 erfolgte mittels MAL
(siehe Tabelle 20).
Tabelle 20. Zusammenstellung der MALDI-TOF MS und RP-HPLC Analysedaten der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 8 und 90. * Das entsprech nde RP-HPLC Programm zur Auftrennung der Rohlösungen ist im Experimentellen Teil angegeben.
Molekül Mr (theoretisch) m/z (gefunden) Retentionszeit RP-HPLC *
Cy5-TTCCG-MC H 88 2258.91 6 2259.013 15 min
Cy5-TTCCG-MC8H 89 2286.96 2287.808 18 min
Cy5-TTCCG-MC10H 90 2315.01 2316.296 19 min
Cy5-TTCCGp 3 2065.64 2066.745 11.5 min
156
Stellvertretend für die Reaktionen zu den Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten 88 und 90 ist in
Abbildung 61 ein typisches RP-HPLC Chromatogramm der Reaktion zum Konjugat 89 nach
einer Reaktionszeit von 4 h bei 35 ºC (links) und der isolierten, entsalzten Verbindung
(rechts) gezeigt. Die Signale wurden bei einer Wellenlänge von 648 nm detektiert.
Abbildung 61. RP-HPLC Chromatogramme nach der Reaktion zum MC8H-DNA Konjugat 89. Die Detektion erfolgte bei 648 nm. Links: Reaktionslösung nach 4 h; rechts: nach Isolierung und Entsalzung. Das Signal bei einer Retentionszeit von 11 min entspricht dem Edukt Cy5-TTCCGp 3, das bei 18 min dem MC8H-Cy5-TTCCG Konjugat 89. Die Detektion erfolgte bei 648 nm.
Abbildung 62 zeigt das MALDI-TOF MS Spe
ktrum des isolierten, entsalzten Cy5-TTCCG-
ren
G -MC8H Konjugats 89 (Mr = 2286.96 g/mol).
MC8H Konjugats 89. Der Massenpeak bei 2287.808 m/z entspricht der berechneten mola
Masse (Mr = 2286.96 g/mol).
22
87
.80
8
0
20
40
60
80
100
120
Inte
ns.
[a.u
.]
Abbildung 62. MALDI-TOF MS Spektrum des Cy5-TTCC
1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400
m/z
NNN
H
O
PO
O
O
ON
N N
NH
O
NH2O
O
O
OP 89
TTCC5Cy
157
Durch die kovalente Verknüpfung kurzkettiger Fettsäuren (C6 bis C10) mit der
Aminofunktion des Histamins 6 wurde der synthetische Zugang zu den Catalipiden MCH 84,
85 und 86 in flüssiger Phase mit guten Ausbeuten möglich.
In Abhängigkeit von der Lipophilie des Catalipids (Alkylkettenlänge) musste dem
Reaktionspuffer 77 DMF zugesetzt werden, um eine vollständige Lösung zu erreichen. Die
Kopplungsreaktion zu den reaktiven Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten 88, 89 und 90 und der
Aufreinigungsschritt lehnte sich eng an die ausgearbeitete Präparationsmethode zum
Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74 an.
Über die systematische Variation der Alkylkettenlänge der Catalipide konnten abgestufte
Informationen zu den spezifischen Löslichkeitseigenschaften der Catalipide und deren
Konjugaten erhalten werden.
3.3.3.2 Synthese kurzkettiger 1, 3-Aminopropylimidazol 72 basierter Catalipide und
usgehend vom 1, 3-Aminopropylimidazol 72 sollten MCxN-Im Catalipide synthetisiert und
CCGp Oligonukleotids 3 unter Ausbildung einer Phosphor-
imidazolidbindung, liegt die Imidazolfunktion dieser Konjugate, im Gegensatz zu den zuvor
beschriebenen Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten mit Histamin 7 als Grundgerüst, positiviert vor
(siehe Abbildung 63).
Abbildung 63. Chemische Struktur eines MCxN-Im Konjugats. Durch die zwitterionische Ladung im Molekül sollten die Reaktionseigenschaften dieser DNA-Catalipid Konjugate maßgeblich bestimmt werden.
Die EDC-Aktivierung der 3´-terminalen Phosphatgruppe des Cy5-TTCCGp Oligo-
3 und mögliche Folgereaktionen im wässrigen Medium in Anwesenheit von
rmuliert werden (siehe Abbildung 57). Durch die zwitterionische Ladung wird das MCN-Im
Experimente zur Synthese der korrespondierenden Cy5-TTCCG Konjugate
A
anschließend zu den korrespondierenden DNA-Catalipid Konjugaten umgesetzt werden. Nach
der nukleophilen Reaktion der Imidazol-Kopfgruppe der Catalipide mit der aktivierten
Phosphatgruppe des Cy5-TT
O
nukleotids
MCxN-Im Catalipiden, können analog den Reaktionen zu Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten
fo
NN
+O P
O
TTCCGCy5
NH
R
OR = Alkylkette
158
Catalipid zur besseren Abgangsgruppe und sollte so die Reaktionseigenschaften des
Konjugats maßgeblich beeinflussen: Im Besonderen sollte hierbei die Reaktivität der
Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugate in der nukleophilen Reaktion mit dem 5´-Amino-
ide wurde analog zur Synthese der MCH-Catalipide 84,
eigenschaften der sich nur in der hydrophilen Kopfgruppe
nterscheidenden MCH- und MCN-Im-Catalipide.
ufreinigung mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie
harakterisiert. Auffällig war, dass die MCN-Im-Catalipide 92 und 93 (mit 1, 3-Aminopropyl-
imidazol 72 als Grundgerüst) be 92 bzw. als hochviskoses
Öl 93, die analogen MCH-Catalipide (Histam als Grundgerüst) jedoch im festen
Aggregatzustand vorlagen. Löslichkeitsversuche wurden in Anlehnung an die Experimente
der MCH-Catalipide 84, 85 -Catalipide 91, 92 und 93
ºC, ohne weiteren Zusatz von DMF zum Reaktionspuffer 77.
önnte auf
eniger ausgeprägte intermolekulare WBB – im Besonderen zwischen den hydrophilen
OH
terminierten Oligonukleotid 4 im Ligationsschritt untersucht werden. Inwieweit die zur
Ligation konkurrierende Hydrolyse des Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugats im wässrigen
Puffer auch verstärkt auftritt und eine Isolierung der Reaktivkonjugate möglich ist,[167] war
Gegenstand der Untersuchung.
Die Herstellung der MCN-Im Catalip
85 und 86 in Lösung durchgeführt, wobei ebenfalls die Carbonsäuren 81 (C6), 82 (C8) und 83
(C10) eingesetzt wurden (siehe Abbildung 60). Dies ermöglicht systematische Erkenntnisse zu
Reaktions- und Löslichkeits
u
Abbildung 64. Synthese der MC6N-Im 91, MC8N-Im 92 und MC10N-Im 93 Catalipide in Lösung durch DCC 73vermittelte Kopplung der entsprechenden Carbonsäuren 81 (R1), 82 (R2), 83 (R3) an die primäre Aminofunktion des 1, 3-Amino-propyl-imidazols 72.
Die MCN-Im Catalipide 91, 92 und 93 wurden in guten Ausbeuten erhalten und nach
chromatographischer A
c
i Raumtemperatur als hellgelbes Öl
in 7
und 86 durchgeführt. Alle MCN-Im
lösten sich vollständig bei 35
Die bessere Löslichkeit und der flüssige Aggregatzustand bei Raumtemperatur k
w
Imidazol-Kopfgruppen der MCN-Im-Catalipide - im Vergleich zu den MCH-Catalipiden
zurückzuführen sein.
Versuche zur Synthese reaktiver Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugate wurden analog zu den
ausgearbeiteten Reaktionsbedingungen zur Synthese der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88,
R
O
NN NH2
NN N
HR
O
+ 1, 2, 31, 2, 3DCC 73
R -(CH2)4CH3 R -(CH2)6CH3
R -(CH2)8CH3
1
23
82
83
81 R -(CH2)4CH3 R -(CH2)6CH3
R -(CH2)8CH3
1
23
57 %
74 % 62 %
919293
CH3Cl, TEA72
159
89 und 90 durchgeführt. Die RP-HPLC Analyse der entsprechenden Reaktionslösungen fand
nach einer Reaktionszeit von 4 h bei 35 ºC bei einer Wellenlänge von 648 nm statt und zeigte
zwei Signale unterschiedlicher Retentionszeit in den Chromatogrammen. Die Retentionzeiten
entsprachen denen der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate (siehe Tabelle 20); Isolierung und
Charakterisierung der Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugate war jedoch nicht möglich. Selbst die
sofortige Re-Injektion des (vermeintlichen) Produktpeaks - ohne Entfernung des
Elutionsmittels oder Entsalzung - zeigten nur das Signal des Edukts 3. Es war daher davon
atalipid Konjugationsexperimente ist in
bbildung 65 das Chromatogramm der Reaktionslösung des MC8N-Im Catalipids mit dem
Cy5-TTTCCGp
auszugehen, dass das Konjugat unter den RP-HPLC Analysebedingungen (auch mit
Triethylammoniumhydrogencarbonat-Puffer, pH = 7 als Elutionsmittel) nicht stabil ist - oder
eine Überstruktur vorlag -, die nicht isoliert werden konnte. Ursächlich könnte eine durch die
positive Kopfgruppe verstärkte Hydrolyse des Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugats sein.
Stellvertretend für die durchgeführten MCN-Im-C
A
3 nach 4 h Reaktionszeit bei 35 ºC gezeigt.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240
50
100
150
250
200
Inte
nsitä
t
Zeit [min]
Abbildung 65. RP-HPLC Chromatogramm der Rohlösung nach 4 h Reaktionszeit bei 35 ºC. Die Detektion erfolgte bei 648 nm. Das Signal bei 12 min entspricht dem eingesetzten Edukt Cy5-TTCCGp 3. Die Verbindung, die dem Signal bei 18 min entspricht, konnte nicht isoliert oder charakterisiert werden.
Das Signal bei einer Retentionszeit von 12 min entspricht dem Edukt Cy5-TTCCGp 3, das
zweite Signal geringe
[
rer Intensität bei längerer Retentionszeit (18 min), konnte nicht isoliert
und charakterisiert werden. Jedoch zeigt das Cy5-TTCCG-MC8H Konjugat 89 (siehe
mV
]
160
Abbildung 61, rechtes Chromatogramm) mit 18 min ein ähnliches Laufverhalten. Diese
Beobachtung könnte darauf hinweisen, dass sich unter den gewählten Reaktionsbedingungen
zwar Cy5-TTCCG-Konjugate bildeten, aber deren Isolierung und Charakterisierung nicht
möglich war - verursacht durch verstärkte Hydrolyse im Vergleich zu den Cy5-TTCCG-MCH
Konjugaten.
Zusätzlich sollte die Reaktivität des MON-Im Catalipids 71 (siehe Abbildung 54),
strukturverwandt mit dem langkettigen MOH 39 Catalipid (mit 1, 3-Aminopropylimidazol 72
als hydrophile Kopfgruppe), in den Konjugationsexperimenten untersucht werden. Versuche
zum Löslichkeitsverhalten, die anlog den beschriebenen Experimenten der kurzkettigen
MCN-Im Catalipide 91, 92 und 93 durchgeführt wurden, zeigten, dass das MON-Im
Catalipid 71 ohne DMF Zugabe zum Reaktionspuffer 77 als ein fein-dispergiertes Öl vorlag.
Das MOH 39 (Histamin 7 als Grundgerüst) zeigte hingegen unter den gleichen
Reaktionsbedingungen eine weitaus schlechtere Dispergierbarkeit: Hier lagen viele
n zu Öltröpfchen - und nicht wie
eim MOH 39 Catalipid mit intermolekularen WBB (in zwei Ebenen a und b, siehe hierzu
Abbildung 43) zu einem Feststoff führt.
Nach Zugabe von 5 vol % DMF zum Reaktionspuffer 77 konnte das MON-Im Catalipid 71
vollständig gelöst werden. Die EDC vermittelte Kopplungsreaktion mit dem Cy5-TTCCGp
Oligonukleotid 3 zur Synthese des Cy5TTCCG-MON-Im Konjugats wurde analog den
Versuchen mit den kurzkettigeren MCN-Im Catalipiden durchgeführt. Die RP-HPLC Analyse
der Reaktionsmischung zeigte neben dem Hauptsignal des Edukts 3 ein kleineres Signal
(Retentionszeit von 22 min), das dem Produktpeak des MON-Im-Cy5-TTCCG Konjugats
entsprechen könnte. Eine Isolierung und Charakterisierung der Verbindung war jedoch auch
hier nicht möglich.
Die Synthese der MCN-Im Catalipide wurde in flüssiger Phase durchgeführt, indem
langkettige Fettsäuren mittels DCC 73 an die primäre Aminofunktion des 1, 3-Aminopropyl-
imidazols 72 gekoppelt wurden. Hierbei setzte man die Fettsäuren 81, 82 und ein, die
pezifischen physikochemischen Eigenschaften der Catalipide bei gleicher Lipophilie
- speziell in Bezug auf Löslichkeit und Reaktivität – vergleichend untersucht werden:
unlösliche, feste Bestandteile in der Dispersion vor. Diese Beobachtung stützt zusätzlich die
in Kapitel 3.2.11 aufgestellte Hypothese weniger ausgeprägterer intermolekularer WBB
zwischen den MON-Im Catalipiden 71, die zur Aggregatio
b
83
bereits in der Synthese zu MCH-Catalipiden (Histamin 7 als Grundgerüst) als
Kopplungspartner dienten. Damit sollte der alleinige Einfluss der Kopfgruppe auf die
s
161
Einerseits lagen die MCN-Im Catalipide 92 und 93 bei Raumtemperatur im flüssigen
Aggregatzustand vor, die analogen MCH Catalipide 84 und 85 hingegen als Feststoffe.
Andererseits zeigten alle MCN-Im Catalipide eine bessere Löslichkeit, bzw. konnten leicht im
Reaktionspuffer 77 emulgiert werden (bis auf das MON-Im 71 sogar ohne DMF Zugabe).
Diese Beobachtungen deuten auf weniger ausgeprägte intermolekulare WBB zwischen den
MCN-Im Catalipiden hin, verglichen mit den MCH-Catalipiden.
Die Experimente zur Herstellung reaktiver Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugate zeigten, dass
die Isolierung und Charakterisierung der Konjugate nicht möglich war. In den RP-HPLC
ieden werden, was die Analyse der Reaktion
Analysen der unterschiedlichen Reaktionslösungen konnte jedoch ein Signal detektiert
werden, das ein ähnliches Laufverhalten zeigte, wie die analogen – isolierbaren –
Cy5-TTCCG-MCH Konjugate. Es konnte daher davon ausgegangen werden, dass die
schnellere Hydrolyse der MCN-Im Konjugate im Aufreinigungsschritt eine Isolierung der
Verbindungen verhinderte. Die leichter eintretende Hydrolyse der MCN-Im Konjugate, im
Vergleich zu den MCH Konjugaten könnte auf die zwitterionische Struktur zurückzuführen
sein, die das Lipid zur besseren Abgangsgruppe macht.[203]
Wenn es zur stabilen Bildung der MCN-Im Konjugate unter den beschriebenen
Reaktionsbedingungen gekommen wäre, sollten diese – im Vergleich zu den MCH
Konjugaten – die reaktivere Spezies darstellen. Sie könnten somit in Anwesenheit von EDC 2
als Aktivierungsmittel zu einer „in-situ“ Aktivierung der Phosphatgruppe eingesetzt werden
(siehe Kapitel 3.6 Catalipid-Mizellen). Hierbei müsste jedoch die EDC-vermittelte Ligation
von der Imidazol-vermittelten untersch
erschweren würde.
162
3.4 Genetisches Subsystem (2) des Minimalen Chemoton Modells: Untersuchungen zur
Oligonukleotid Selbstreplikation mit reaktiven DNA-Catalipid Konjugaten
Die nicht-enzymatische, templatgesteuerte Selbstreplikation sollte gemäß der Aufgaben-
stellung in Anlehnung an die von Bülle[83] und Schöneborn[81] beschriebnen Selbst-
replikationssysteme konzipiert werden und das genetische Subsystem (2) des Minimalen
Chemoton Modells darstellen (siehe Abbildung 66).
Abbildung 66. Ligation eines Cy5-TTCCG-MCH Konjugats A mit dem 5´-Amino-modifizierten Oligo-nukleotid 4 B zum Ligationsprodukt 94 C. Simultan zur Ausbildung der Phosphoramidatbindung wird genau ein Catalipid L freigesetzt. Als Templat soll das Cy3-modifizierte Oligonukleotid 5 C eingesetzt werden.
Die Ligation sollte zwischen einem reaktiven Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugat und einem
5`-Amino-modifizierten Oligonukleotid NH2-CGGAA 4 stattfinden, so dass in einer templat-
gesteuerten Reaktion eine neues Templatmolekül C gebildet wird. Simultan zur Ausbildung
der neuen Phosphoramidatbindung sollte ein Catalipid L freigesetzt werden, das als
Abgangsgruppe fungiert.
Die Ligation sollte gemäß der Aufgabenstellung, im Inneren der Catalipid-Vesikel stattfinden,
in denen bereits Templatmoleküle 5 C vorhanden sind, um die templatierte Reaktionen zu
ermöglichen (siehe Abbildung 16). Die Catalipid-Vesikel sollten aus den gleichen
Catalipiden L bestehen, die in der Ligation als Abgangsgruppe freigesetzt werden, um eine
stöchiometrische Kopplung des genetischen Subsystems (2) mit dem membranbildenden
Subsystems (3) im MCM zu ermöglichen. Um diese stöchiometrische Kopplung zu
gewährleisten, muss zudem die zur Reaktion erforderliche Aktivierung des Oligonukleotids
163
Cy5-TTCCGp 3 alleinig über die reaktive Phosphorimidazolidbindung geschehen, also in
ino-modifizierte Oligonukleotid 4 als nukleophiler Reaktionspartner im Ligationsschritt
en des MCMs anzupassen.
In den folgenden Ligationsexperimenten setzte man ausschließlich die Cy5-TTCCG-MCH
Konjugate (mit Histamin 7 als Grundgerüst, siehe 3.3.3.1) ein, da diese Verbindungen, im
Gegensatz zu den Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugaten (1, 3-Aminopropylimidazol 72 als
Grundgerüst, siehe 3.3.3.2) isoliert und vollständig charakterisiert werden konnten. Auf eine
Untersuchung der Ligation in Anwesenheit von EDC 2 und Catalipiden, also einer „in-situ“
Aktivierung, in der die zur nukleophilen Reaktion notwendige Energie über den reaktiven Iso-
harnstoff 75 und / oder der Phosphorimidazolidbindung bereitgestellt wird, musste aufgrund
der zu komplexen Analyse, die zur Unterscheidung der einzelnen Aktivierungen notwendig
gewesen wäre, abgesehen werden.
3.4.1 Ligationsexperimente mit dem Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74
Wie in Kapitel 3.2.8.1 beschrieben, konnte das einkettige MOH 39 unter physiologischem
arkierter DNA befüllt werden sollten (siehe Kapitel 3.2.10.3). Auch war die Synthese
eines Replikationssystems, abgekoppelt von den Subsystemen (1)
Abwesenheit des Aktivators EDC 2. Die einzusetzenden Catalipide L müssen zudem die
Eigenschaft besitzen, bei physiologischem pH-Wert große, stabile Vesikel auszubilden, da das
5’-Am
unprotoniert vorliegen muss.
Aufgrund der Komplexität des Gesamtsystems wurde auch die Ligation einzeln, d.h.
abgekoppelt von den Subsystemen (1) und (3) untersucht, um die spezifischen Reaktions-
bedingungen und -eigenschaften zu klären und im Rahm
pH-Wert ausreichend große Vesikel ausbilden, die zusätzlich mit Fluoreszenzfarbstoff
m
reaktiver Cy5-TTCCG-MOH Konjugate 74 möglich (siehe Kapitel 3.3.1). Die Aktivierung
des Oligonukleotids 3 mit dem MOH 39 Catalipid erschien daher als aussichtsreicher
Kandidat zur Untersuchung der Ligation.
Ungeachtet dessen blieben noch viele Reaktionsparameter zu bestimmen, die zur
erfolgreichen Umsetzung
und (3), zu klären blieben. Im Besonderen mussten spezifische Reaktionsbedingungen
gefunden werden, unter denen es zur Assoziation der Reaktionsbausteine A und B zum
termolekularen Komplex ABC kommen kann (siehe Abbildung 66), wie Temperatur, pH-
Wert-Bereiche und die Salzkonzentrationen des Ligationspuffers. Einen besonderen
Stellenwert nimmt jedoch die - zu bestimmende - Ausgangskonzentration des DNA-Catalipid
Konjugats A in der Ligation ein. Zum einen muss die Konzentration groß genug sein, um dem
hydrolyseempfindlichen Konjugat A eine ausreichend Reaktivität zu verleihen; zum anderen
164
muss das lipophile Konjugat jedoch im wässrigen Ligationspuffer eine ausreichende
Löslichkeit zeigen. Weiterhin limitiert die FRETDetektionsmethode die maximale
Konzentration der Reaktionspartner, da bei zu hohen Konzentrationen von einer signifikanten
Intensitätsabschwächung des FRET-Signals - durch Fluoreszenz-Quenching – berichtet
wurde.[81, 83] Es war zu erwarten, dass auch die Reaktivität des Konjugats 74 in der Ligation
rde.
Um Hydrolysate der Cy5-TTCCG-MOH Konjugate 74 zu vermindern, mussten die Konjugate
end kam
ie Aufbereitung des nach der Entsalzung in Acetonitril und Wasser gelösten Konjugats 74
. Eine Herstellung von Stammlösungen, die zur
stark vom Löslichkeitsverhalten im Ligationspuffer 80 (0.1 M HEPES-Puffer, pH = 7.2
(NaOH) mit 50 mM NaCl und 20 vol % CH3CN)[83, 98] abhängen wird. Unter diesen
Voraussetzungen wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
Die minimale Konzentration des Konjugats 74 im Ligationspuffer 80 wurde auf 50 µM
festgelegt, da in diesem Konzentrationsbereich die „online“ Untersuchung des Replikations-
systems über Detektion des FRET Signals möglich ist.[83] Die maximale Konzentration von 74
im Ligationspuffer wird über die Löslichkeit des amphiphilen Konjugats selbst bestimmt. Bei
höheren, millimolaren Konzentrationen ist mit einer unzureichenden Löslichkeit der
Konjugate durch Selbstaggregation zu rechnen. Dieser Konzentrationsbereich hätte vorteilhaft
sein können, da ein möglicher Einfluss der aggregiert vorliegenden Konjugate 74 auf die
Ligation stattfinden könnte, in dem die Reaktion auf „reaktiven“ supramolekularen
Aggregatoberflächen stattfinden wü
unmittelbar vor jedem einzelnen Ligationsexperiment synthetisiert werden. Erschwer
d
hinzu. Nach vollständigem Entfernen des Lösungsmittels war es nur unter Temperatur-
erhöhung und Sonifizieren rehydrierbar, was zur deutlichen Hydrolyse führte, wie die
Analyse mittels RP-HPLC zeigte. Daher mussten die entsprechend konzentrierten Konjugate
(Lösungen oder Dispersionen) durch gezielten Zusatz des Ligationspuffers 80 eingestellt
werden. Nach UV-spektrometrischer Konzentrationsbestimmung zeigte die RP-HPLC
Analyse die Hydrolyse des Konjugats 74
kinetischen Untersuchung der Ligation notwendig sind, war somit nicht möglich.
165
Die Löslichkeit des Konjugats 74 im Ligationspuffer 80 konnte schon rein visuell bewertet
werden (siehe Tabelle 21).
Tabelle 21. Visuelle Begutachtung unterschiedlicher Lösungen / Dispersionen des Cy5-TTCCG-MOH Konjugats 74 im Ligationspuffer (0.1 M HEPES-Puffer, pH = 7.2 (NaOH) mit 50 mM NaCl und 20 vol % CH CN) 80 bei Raumtemperatur.
Konzentration
Cy5-TTCCG-MOH 74
Visuelle Begutachtung der
Lösung / Dispersi
3
on
1 mM trübe Lösung
0.5 mM leicht getrübte Lösung
0.25 mM klare Lösung
0.05 mM re Lösung kla
Bei Konzentrationen von 1 mM und 0.5 mM lag das Konjugat 74 im Ligationspuffer 80
dispergiert vor, bei Konzentration von 0.25 mM und 0.05 mM augenscheinlich vollständig
gelöst. Zentrifugieren der verschieden konzentrierten Lösungen / Dispersionen bestätigten
diese Beobachtungen.
Zur Prüfung der Ligationsreaktion wurden zu 10 nmol NH2-CGGAA 4 10 μl der
die gezielte
Zugabe von Templat zu katalysieren, wurden der Ligationslösung / -dispersion 5 bis max
40 mol % Templat Cy3-TTCCGCGGAA 5 zugegeben. Auch dies führte nicht zur Ligation
- es konnte jeweils nur die Hydrolyse des Konjugats 74 zum eingesetzten Edukt
Cy5-TTCCGp 3 beobachtet werden.
Es wurde offensichtlich, dass die zu geringe Löslichkeit des Cy5-TTCCG-MOH 74 Konjugats
in Verbindung mit der beobachteten Hydrolyse ein zentrales Problem in den durchgeführten
Ligationsexperimenten bildete. Zudem zeigten die durchgeführten Experimente, dass eine
verschiedenen, in Tabelle 21 angegebenen Konzentrationen 74, zum Ligationspuffer 80
gegeben und bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Reaktionskontrolle erfolgte
mittels RP-HPLC. Hierzu entwickelte man einen entsprechenden Gradienten, der die
Beobachtung aller Edukte und Produkte im Chromatogramm ermöglichte. Die Detektion von
Produkt und Hydrolyse erfolgte bei einer Wellenlänge von 648 nm, bei der Absorption des
Cy5-Farbstoffs.
Unter den beschriebenen Bedingungen konnte die Reaktion zum Ligationsprodukt
Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 bei allen in Tabelle 21 aufgeführten Konzentrationen des
eingesetzten Konjugats 74 nicht detektiert werden. Auch die sukzessive Temperaturerhöhung
(auf max. 45 ºC) führte nur zu schnellerer Hydrolyse. Um die Reaktion durch
166
kinetische „online“ Analyse der Ligation über FRET nicht möglich erschien, da das
Detektionssystem nach Bülle[83] und Schöneborn[98] nur in einem hierfür zu engen
onzentrationsfenster anzuwenden ist. Die beobachtete Hydrolyse der Phosphorimidazolid-
igation höhere Konzentrationen Konjugat eingesetzt
erden müssen.
Um die nukleophile Lig isch talipid Konjugaten
und dem Oligonuk zu n die kurzkettigeren,
hydrophileren Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89 und ynthese in
Kapitel 3.3.3.1 beschrieben wurde. Über diese grundsächlich vereinfachte Betrachtung der
Ligation, sollte zum einen die Löslichkeit der Reaktanden und zum anderen der sterische
ugang zu den reaktiven Zentren optimiert werden.
so eine Abkopplung des genetischen Subsystems (2) vom
K
bindung des Cy5-TTCCG-MOH Konjugats 74 führt zu verringerter Reaktivität, so dass zur
Beobachtung einer erfolgreichen L
w
ationsreaktion zw en reaktiven Cy5-TTCCG-Ca
leotid NH2-CGGAA 4 demonstrieren, wurde
90 eingesetzt, deren S
Z
Durch die Verkürzung der Alkylketten war allerdings davon auszugehen, das die Catalipide
nicht mehr die ursprünglich geforderten Eigenschaften des langkettigen MOH 39 zeigen,
große Vesikel auszubilden.[9] Um die Ligation mit reaktiven Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten
zu untersuchen, war
membranformenden Subsystem (3) erforderlich.
Auch das Konzept der „online“ Untersuchung wurde verworfen, da zur Ligation zu hohe
Konzentrationen der Reaktanden erforderlich zu sein schienen, die eine kinetische Analyse
der Selbstreplikation über die Detektion des FRET-Signals unwahrscheinlich gemacht hätten.
3.4.2 Ligationsexperimente mit kurzkettigen Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten
Versuche zum Löslichkeitsverhalten der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89 und 90 im
Ligationspuffer (0.1 M HEPES-Puffer, pH = 7.2 (NaOH) mit 50 mM NaCl und 20 vol %
CH3CN) 80 zeigten, dass bei Raumtemperatur klare, 1 mM Lösungen hergestellt werden
konnten. Die Handhabung der gereinigten und entsalzten reaktiven Konjugate 88, 89 und 90
erwies sich - analog der Cy5-TTCCG-MOH Konjugate 74 - als schwierig, denn die Hydrolyse
verhinderte sowohl die exakte UV-metrische Konzentrationsbestimmung als auch den Einsatz
von Stammlösungen, die zu umfangreichen, kinetischen Untersuchung der Ligation
notwendig wären.
In typischen Experimenten gab man zu 10 nmol NH2-CGGAA 4 10 µl einer 1 mM Lösung
der entsprechenden, im Ligationspuffer 80 gelösten Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89
oder 90, und entnahm jeweils nach unterschiedlichen Reaktionszeiten 1 µl der Reaktions-
167
lösung zur RP-HPLC Analyse. Die maximale Reaktionszeit wurde auf 24 h gesetzt;
abschließend analysierte man die Reaktionslösung zusätzlich massenspektrometrisch mittels
MALDI-TOF MS.
In den Experimenten, in denen das MC6H- 88 und MC8CH- 89 als reaktives Konjugat
eingesetzt wurde, konnte nach 24 stündiger Reaktionszeit das Ligationsprodukt
Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 sowohl im RP-HPLC Chromatogramm, als auch nach Isolierung
g jeweils eine Probe entnommen und analysiert. Hierbei zeigte sich, dass
massenspektrometrisch nachgewiesen werden. Das MC10H Konjugat 90 zeigte unter gleichen
Reaktionsbedingungen keine Produktbildung. Um den qualitativen Einfluss der Templat-
Zugabe auf die langsam ablaufende Ligation zu untersuchen, wurden 40 mol %
Cy3-TTCCGCGGAA 5 der Reaktionsmischung zugesetzt. Innerhalb von 3 bis 4 Stunden
konnte in allen Fällen Produktbildung von Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 im Chromatogramm
beobachtet werden. In
Abbildung 67 ist (stellvertretend für die Cy5-TTCCG-MCH Konjugate) die Reaktion
zwischen dem Cy5-TTCCG-MC8H Konjugat 89 und dem NH2-CGGAA Oligonukleotid 4 in
Anwesenheit von 40 mol % Templat 5 abgebildet, die zeitlich mittels RP-HPLC verfolgt
wurde.
A B C A B C
Abbildung 67. Zeitabhäniges RP-HPLC Chromatogramm der in Abbildung 66 gezeigten Ligation, wobei das reaktive Cy5-TTCCG-MC8H 89 Konjugat eingesetzt wurde. Die Produktbildung wurde bei einer Wellenlänge von 648 nm detektiert (Cy5-Absorbtion). Das Signal A bei einer Retentionszeit von 8 min entspricht dem Ligationsprodukt Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94; das Signal B bei 10 min dem Hydrolyseprodukt Cy5-TTCCGp 3; das Signal C bei 12 min dem reaktiven Cy5-TTCCG-MC8H 89 Konjugat.
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 648 nm (Cy5-Absorbtion). Zur
Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der Reaktion wurde nach 20 min, 1, 2, 3, 4, 6, 8 und 24
Stunden der Lösun
trotz verwendeter DNA- und Protein- Low-Bind®-Tubes der Firma Eppendorf eine starke
Filmbildung an der Wandung auftrat. Dies erschwerte - neben der Hydrolyse - die Re-
168
produzierbarkeit der Experimente, wobei auch die Verwendung von Glaskapillaren keine
Verbesserung zeigte. Nach einer Reaktionszeit von ungefähr drei Stunden konnte Produkt-
bildung beobachtet werden (Signal A, Retentionszeit 8 min), das nach Isolierung und
templatgesteuerte Ligation über Catalipid-Aktivierung zu neuen
Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS dem Ligationsprodukt Cy5-TTCCGp-
nCGGAA 94 zugeordnet wurde. Das Signal B (Retentionszeit von 10 min) entspricht dem
Hydrolyseprodukt Cy5-TTCCGp 3; das Signal C (Retentionszeit von 12 min) dem reaktiven
Cy5-TTCCG-MC8H 89 Konjugat.
Aufgrund der vielschichtigen, ungelösten Probleme zur Durchführung reproduzierbarer,
kinetischer Untersuchungen von Probenvorbereitung bis Analytik konnte keine quantitative
kinetische Untersuchung der Ligation durchgeführt werden. Dennoch demonstriert die
Untersuchung der experimentell vereinfachten Ligation mit kurzkettigen Cy5-TTCCG-MCH
Konjugaten, dass die
Templat Molekülen führt.
169
3.5 Experimente zur Kombination des metabolischen- (1), genetischen- (2) und
membranformenden (3) Subsystems zu einem Minimalen Chemoton Modell
Zur chemischen Umsetzung des in dieser Arbeit verfolgten Konzepts zum MCM ist die
stöchiometrische Kopplung aller Subsysteme, des metabolischen- (1), genetischen- (2) und
membranformend n- (3), notwendig. Ime folgenden werden die grundlegenden Ergebnisse und
zudem mit Templatmolekülen befüllt werden können.
Diese Eigenschaften kamen am nächsten dem einkettigen MOH 39 und dem zweikettigen
DOSH 54 Catalipid, wobei ein gewisser Anteil Cholesterin 67 als Helfer-Lipid zur
Stabilisierung der Vesikelmembranen notwendig war (siehe Kapitel 3.2.7). Die durch-
geführten Experimente zur Vesikelstabilität zeigten, dass eine zu hohe Ionenstärke oder auch
der Zusatz von geringen Mengen organischen Lösungsmittels, zu einer drastischen
Destabilisierung der Catalipid-Vesikel führten, sowohl beim Einsatz des einkettigen MOH 39,
als auch des zweikettigen DOSH 54 Catalipids. Informationen über die Membran-
permeabilität der Catalipid-Vesikel gegenüber reaktiven Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugaten,
die als Reaktionsbausteine die Membran der gebildeten Catalipid-Vesikel durchqueren
müssen, um an der im Inneren des Vesikels ablaufenden Ligation teilzunehmen, waren nicht
verfügbar. Die gemachten Beobachtungen wiesen jedoch auf über intermolekulare WBB
stabilisierte Catalipid-Vesikelmembranen hin (siehe Abbildung 43).
Reaktive Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate stellen das metabolische Subsystem (1) dar. Die
Herstellung der Konjugate erfolgte über die EDC 2 vermittelte Kopplung der Phosphatgruppe
des Oligonukleotids Cy5-TTCCGp 3 und der Imidazolfunktion eines entsprechenden
Catalipids. Die erfolgreiche Synthese reaktiver Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugate, in denen
ein Catalipid als Kopplungspartner eingesetzt wurde, das unter den geforderten Reaktions-
bedingungen hinreichend stabile GUV ausbilden kann, war aufgrund der eingeschränkten
Löslichkeit der Catalipide MOH 39 und DOSH 54 alleinig mit dem einkettigen MOH-
Catalipid 39 möglich. Die MOH-Catalipide wurden hierzu in einem speziell ausgearbeiteten
Lösungsprozedere unter der Zugabe von 15 vol % DMF zum Reaktionspuffer 77 gelöst und
bei 35 ºC umgesetzt (siehe Kapitel 3.3.1). Diese speziellen Reaktionsbedingungen sind nicht
Schlussfolgerungen der separat nebeneinander durchgeführten Experimente in den einzelnen
Subsystemen zusammengefasst, um die Kombinationsmöglichkeiten zu einem MCM
aufzuzeigen.
Die Kompartimente (zugehörig zum membranformenden Subsystem (3)) des MCMs sollten
aus Catalipid-Vesikeln hergestellt werden, die unter physiologischem pH-Wert eine
ausreichende Stabilität zeigen und
170
kompatibel mit der Stabilität der Catalipid-Vesikel, so dass eine „in-situ“ Herstellung
binationsmöglichkeit der Kompartementierung (Subsystem (3)) mit dem metabolischen
reaktiver Konjugate in einem System nicht umsetzbar war.
Deshalb wurde ein anderer experimenteller Zugang zur direkten Untersuchung der
Kom
Subsystem (1)) untersucht.
3.5.1 Experimente zur Phosphorimidazolid Bildung auf der äußeren Membran von
Catalipid-Vesikeln
Zur Verknüpfung des metabolischen Subsystems (1) und des membranformemden Sub-
systems (2) sollten im Rahmen der Kompartementierung die Phosphorimidazolidbindung
direkt auf den bestehenden Catalipid-Vesikeln erzeugt werden. Hierzu sollten die nach außen
zur Lösung zeigenden hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen der Catalipide - die die äußere
Membran der Vesikel bilden - mit einem EDC-aktivierten Oligonukleotid Cy3-TTCCGp 69
reagieren. Die nachfolgende fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Dispersionen
sollte dann die charakteristische Fluoreszenz des Cy3-Farbstoffs des Oligonukleotids 69,
lokalisiert auf den Vesikelmembranen, zeigen, und so indirekt auf die Ausbildung einer
Phosphorimidazolidbindung hinweisen (siehe Abbildung 68).
Abbildung 68. Schematische Darstellung der Phosphorimidazolid-Bildung zwischen einem EDC aktivierten Cy3-TTCCGp Oligonukleotid 69 und einem in der Vesikelmembran eingebundenen Catalipid. Durch die Cy3- Fluoreszenzfarbstoff Markierung des Oligonukleotids sollte die Reaktion unter dem Fluoreszenzmikroskop über fluoreszierende Vesikelmembranen indirekt zu beobachten sein. Die durch den Cy3-Farbstoff fluoreszierenden Catalipid Membranen sind durch den Magenta gefärbten Ring illustriert.
171
Die reaktiven Cy3-TTCCG-Catalipid Konjugate wären direkter Bestandteil der Vesikel-
Cy5-TTCCGp Oligonukleotids 3 das Cy3- markierte gleicher
equenz, Cy3-TTCCGp 69, da die Anregung des Cy3-Farbstoffs bei einer Wellenlänge von
548 nm mit den Filtersätzen der zugänglichen Fluoreszenzmikroskope durchzuführen war. Es
hydrierungs-Methode in Wasser hergestellt
urden.
= 7.2) hergestellt. Höhere
ufferkonzentrationen konnten nicht eingesetzt werden, da dann die Vesikelbildung
verhindert wurde. Zudem verringerte man die EDC- und Pufferkonzentrationen der
zuzugebenden Reaktionslösung soweit wie möglich. Beispielsweise wurde zu 100 µl einer
MOH-Catalipid Dispersion (4 mM HEPES-Puffer (pH = 7.2)) 100 µl einer 1 mM
Cy3-TTCCGp 69 und 10 mM EDC Lösung in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7.2) gegeben
(Dispersion 1, mit EDC). Höhere Puffer- und EDC-Konzentrationen der Lösung führten
umgehend zum Zerfall der Vesikel in der Dispersion nach dem Mischvorgang.
membranen – mit erhöhter Wahrscheinlichkeit der Membrandurchquerung, um so die
reaktiven Konjugate bevorzugt ins Innere der Vesikel gelangen zu lassen.
Man verwendete statt des
S
wurden ausschließlich MOH-Vesikel mit 10 mol % Cholesterin eingesetzt, die über die in
Kapitel 3.2.4.2 beschriebene Dehydrierungs-Re
w
Zur ersten Abschätzung der Vesikelstabilität mischte man die wässrige Dispersion der MOH-
Vesikel (10 mol % Cholesterin) mit dem gleichen Volumen einer 0.2 M EDC Lösung in
0.1 M HEPES-Puffer (pH 7.2). Die direkte mikroskopische Analyse der Dispersion zeigte
ausschließlich Öltröpfchen; Vesikel waren nicht mehr in der Dispersion vorhanden. Dies
deutet auf eine unzureichende Stabilität der MOH-Vesikel hin, verursacht durch die zu hohe
Ionenstärke des zugegebenen Puffers mit dem darin gelösten EDC. Zur Verringerung des
osmotischen Drucks, der auf die unterschiedlichen Salzkonzentrationen zwischen dem
Innerem der Vesikel und dem umgebendem Medium zurückzuführen ist, wurden die MOH-
Vesikel (10 mol % Cholesterin) in 4 mM HEPES-Puffer (pH
P
172
Abbildung 69 zeigt die licht – (B-69) und fluoreszenzmikroskopische (B-70) Aufnahme des
führen. Diese
Streuung ist auch an gleicher Position, als blasser Schatten, in der lichtmikroskopischen
Aufnahme B-69 zu erkennen und stammt nicht von einer fluoreszierenden Vesikelmembran.
Als Kontrollexperiment wurde der Versuch unter gleichen Reaktionsbedingungen ohne
Zugabe von EDC wiederholt, so dass die Phosphatgruppe des Oligonukleotids 69 unaktiviert
vorlag (Dispersion 2, ohne EDC Zugabe).
in beiden Aufnahmen gleichen, ausgewählten Vesikels der Dispersion 1 in 40x Vergrößerung
(siehe Pfeil in linker Aufnahme B-69 in Abbildung 69).
B-69 B-70
Abbildung 69. Mikroskopische Aufnahmen der Dispersion 1 (mit EDC). Links: B-69 lichtmikroskopische Aufnahme. Der Pfeil zeigt auf einen MOH-Vesikel (10 mol % Cholesterin); rechts: B-70 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des gleichen MOH-Vesikels. Die Oberflächenfluoreszenz zeigt die Anwesenheit des Cy3-TTCCGp Oligonukleotids 69 auf der Vesikelmembran. Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).
B-70 zeigt die Vesikelmembran mit der charakteristischen Fluoreszenz des
Oligonukleotids 69. Neben dem ausgewählten Vesikel sind in beiden Aufnahmen einige hell-
leuchtende, freie Öltröpfchen zu sehen. Da diese sowohl in der licht- (links) als auch in der
fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme B-70 (rechts) zu erkennen sind, könnte dies auf
Wechselwirkungen des Oligonukleotids 69 mit den frei in Lösung vorliegenden Öltröpfchen
hinweisen.
Anmerkung zur Fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme B-70: Die hell-leuchtende Korona
rechts unterhalb des fluoreszierenden Vesikels in B-70 ist nur virtuell (Lichtstreuung) und auf
ein, direkt am Objektträger haftendes, fluoreszierendes Öltröpfchen zurückzu
173
In Abbildung 70 ist die licht- und fluoreszenzmikroskopische Aufnahme dieser Dispersion 2
bei 40x Vergrößerung gezeigt.
B-71 B-72
Al
bbildung 70. Mikroskopische Aufnahmen der Dispersion 2 (ohne EDC Zugabe). Links: B-71 ichtmikroskopische Aufnahme: ausgewählter unilamellarer MOH-Vesikel (10 mol % Cholesterin), auf dessen
zenzmikroskopischen (B-72) Aufnahmen zeigt,
ehr Öltröpfchen vorliegen und kleinere Vesikel gebildet werden,
t. Auch die MALDI-TOF MS Analyse der
Reaktionslösung zeigte nicht die Masse des Konjugats.
Membran (unten rechte Seite) ein öl-artiger Tropfen absorbiert ist, der in der rechts nebenstehenden fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme B-72 die Fluoreszenz des Cy3-TTCCGp Oligonukleotids 69 zeigt. Diese Aufnahmen verdeutlichen – ohne Zugabe von EDC – die unspezifische Absorbtion von 69 auf MOH-Vesikelmembranen. Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).
Der Vergleich der licht- (B-71) und fluores
dass bestimmte Teilabschnitte der Vesikelmembran fluoreszieren. Auch andere – hier nicht
abgebildete – MOH-Vesikel zeigten auf den Membranen lokalisierte Fluoreszenz des
Oligonukleotids 69. Dies deutet auf unspezifische Wechselwirkungen von 69 mit den
Membranen der MOH-Vesikel hin. Der qualitative Vergleich der Beschaffenheit der
Dispersionen 1 (mit EDC Zugabe) und Dispersionen 2 (ohne EDC Zugabe) zeigt, dass in
Anwesenheit von EDC m
d.h., dass die Anwesenheit von EDC die Bildung der MOH-Vesikel negativ beeinflusst.
Diese Ergebnisse erwiesen die Fluoreszenzmikroskopie nicht als sonderlich geeignetes
Analyseverfahren, um zwischen einer unspezifischen Absorbtion oder der Ausbildung einer
kovalenten Bindung in Form einer Phosphorimidazolidbindung mit den MOH-Catalipiden zu
unterscheiden.
Um die mögliche Reaktion zum Cy3-TTCCG-MOH Konjugat nachzuweisen, wurde die
Dispersion 1 (mit EDC, siehe Abbildung 69) mittels RP-HPLC analysiert. Es zeigte sich
jedoch, dass keine Reaktion stattgefunden ha
174
Eine nachhaltige Aktivierung der Phosphatgruppe des Oligonukleotids 69 sollte über eine
Erhöhung der EDC-Konzentration erreicht werden – schlug jedoch fehl, da die Stabilität der
OH-Vesikel (10 mol % Cholesterin) nicht mehr gegeben war.
Es ist bekannt, dass Übergangsmetallionen, wie Co(II), Ni(II), Zn(II) und Cu(II) mit der
Imidazolfunktion wechselwirken und spezifische Komplexe ausbilden.[168] Es wurde daher
überprüft, ob mit Hilfe von Metallionen, über verbrückende Verknüpfungen zwischen
einzelnen Catalipid-Kopfgruppen, eine Stabilitätserhöhung der Vesikelmembran erreicht
werden kann, so dass höher konzentrierte, gepufferte EDC-Lösungen einsetzbar wären.
Hierzu wurden die Übergansmetallsalze als in Wasser gelöste Chloride zu einer wässrigen
MOH-Catalipid Dispersion gegeben (Cu2+ wurde als CuSO4 zugesetzt). Die Herstellung der
Vesikel erfolgte über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode in 4 mM HEPES-Puffer bei
H = 7.2, die MOH-Catalipid Konzentration lag bei 4 mM (zuzüglich 10 mol % Cholesterin). -6 -4 -3
kroskop beobachtet werden. Es
eigte sich, dass aus den sphärischen Vesikeln unförmige Aggregate entstanden, die zum Teil
M
p
Die Übergangsmetallionen wurden als wässrige Lösungen 10 M, 10 M und 10 M - nach
Ausbildung der Vesikel - zu der Dispersion gegeben und nach 2 h bei Raumtemperatur
mikroskopisch untersucht. Erst beim Erreichen von millimolaren Konzentrationen konnten
morphologische Veränderungen der Vesikel unter dem Mi
z
als Feststoff ausfielen.
Um einen möglichen Einfluss der Übergangsmetallionen auf den Aggregationsprozess der
MOH-Catalipide zu Lipid-Doppellagen qualitativ zu untersuchen, wurde die MOH-Vesikel
im Folgenden unter direkter Anwesenheit der Metallionen gebildet. Hierzu setzte man 4 mM
Lösungen der entsprechenden Übergansmetallsalze - gelöst in 4 mM HEPES-Puffer
(pH = 7.2) - als Rehydrierungspuffer ein, wobei die MOH-Vesikel (10 mol % Cholesterin)
über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode hergestellt wurden.
175
Die lichtmikroskopische Analyse erfolgte nach einer Reaktionszeit von 2 bis 4 Stunden bei
Raumtemperatur bei einer 40x Vergrößerung (siehe Tabelle 22).
Tabelle 22. Lichtmikroskopische Aufnahmen (40x Vergrößerung) zur Untersuchung des Einflusses von Metallionen (Na(I), Zn(II), Co(II), Ni(II), und Cu(II) auf den Aggregationsprozess von MOH-Catalipiden (10 mol % Cholesterin). Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).
B-73 (40x)
(4 mM HEPES, pH = 7.2)
B-74 (40x)
(4 mM NaCl in 4 mM HEPES, pH = 7.2)
B-75 (40x)
(4 mM ZnCl2 in 4 mM HEPES, pH = 7.2)
B-76 (40x)
(4 mM CoCl2 in 4 mM HEPES, pH = 7.2)
B-77 (40x)
(4 mM NiCl in 4 mM HEPES, pH = 7.2)
B-78 (40x)
(4 mM CuSO in 4 m4 M HEPES, pH = 7.2) 2
Abbildung B-73 zeigt einen Ausschnitt der MOH-Dispersion, die in 4 mM HEPES-Puffer
(pH = 7.2), ohne den Zusatz von Metallionen, hergestellt wurde. Es sind neben einigen
176
Öltröpfchen MOH-Vesikel unterschiedlicher Größe zu erkennen. Die Aufnahme B-74 zeigt
die MOH-Dispersion, in der 4 mM NaCl im 4 mM HEPES-Puffer (pH = 7.2) gelöst wurden.
er Vergleich der Referenz-Dispersion B-73 mit B-74 zeigt keine signifikanten Änderungen
-Ionen
ich zur Referenz-Dispersion
usbildung von größeren Aggregaten, die zum Teil sphärische- aber auch einige
unregelm igten. Die O r
dem Mikroskop uneben und rau. Diese als rein qualitativ zu wertenden Beobachtungen
könnten auf kolloidartige Aggregate hinweisen, die keine Membran – und damit auch kein
inneres Volumen - wie Vesikel, aufweisen. Zum Teil ballten sich mehrere Aggregate zu
größeren Agglomeraten in der Dispersion zusammen, die jedoch hier nicht gezeigt sind. Die
Zugabe von Co(II)-Ionen (siehe B-76) zeigte Aggregate vergleichbarer Morphologie, wie
beim Zusatz von Zn(II)-Ionen (B-75). In B-76 ist ein besonders großes Aggregat gezeigt, mit
einer Größe von ca. 20 µM. In Anwesenheit von Ni(II)- (B-77) und Cu(II)-Ionen (B-78) im
Herstellungsprozess der MOH-Vesikel, fiel ein feiner Ni aus, der nach
A . Beide Dispersionen zeigten keine sphärischen
Aggregate unter dem Lichtmikroskop. In Anwesenheit von Ni(II)- (B-77) bestand der
Niederschlag augenscheinlich aus feinen Nadeln, die neben gröberen, undefinierbaren
Aggregaten auftraten. In Anwesenheit von Cu(II)-Ionen (B-78) bestand der Niederschlag aus
kleineren, unregelmäßig geformten Partikeln, die sich zum Teil zu größeren Teilchen
zusammenballten. Im Vergleich zu den MOH-Vesikeln der Dispersion B-73 und B-74,
zeigten alle Aggregate der Dispersion B-75 bis B-78 eine eingeschränkte Mobilität in den
Dispersionen. Eine genauere strukturelle Einordnung der in B-75 bis B-78 gezeigten
su urch
möglich. In Anwesenheit von Zn(II)- (B-75) und Co(II)-Ionen (B-76) im Rehydrierungs-
prozess der MOH-Catalipide bildeten sich größere, sphärische Aggregate. Daher wurden
diese Dispersionen in weiteren Experimenten zur Oberflächenmodifikation mit dem
Cy3-TTCCGp Oligonukleotid 69 eingesetzt. Beispielhaft wurden zu 100 µl der
entsprechenden Übergangsmetall-Ionen MOH-Catalipid Dispersionen 100 µl einer 10 mM
Cy3-TTCCGp 69 und 100 mM EDC gelöst in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7.2) gegeben. Die
Stabilität der Aggregate war bei erhöhten Puffer- und EDC- Konzentrationen gegeben und
eigte eine deutliche Fluoreszenz bei 548 nm, hervorgerufen durch die Absorption des Oligo-
D
der Morphologie und Größe der gebildeten MOH-Vesikel. Die Anwesenheit von Zn(II)
im Aggregationsprozess (siehe B-75) führte hingegen im Vergle
B-73 zur A
äßig geformte Strukturen ze berflächen dieser Aggregate wirkten unte
ederschlag
ufschütteln mikroskopisch untersucht wurde
pramolekularen Aggregate war über die d geführten mikroskopischen Analysen nicht
z
nukleotids 69 auf den Oberflächen der Aggregate (mikroskopische Aufnahmen nicht
abgebildet). Die Blindproben, in denen zu den Dispersionen das Oligonukleotid 69 ohne EDC
177
zugegeben wurde, zeigten jedoch nicht unterscheidbare Ergebnisse: Die Oberflächen der
MOH-Aggregate fluoreszierten auch.
In Abbildung 71 sind die licht- und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen der MOH-
Dispersion in Anwesenheit von 4 mM CoCl2 in 4mM HEPES-Puffer (pH =7.2) - ohne EDC
Zugabe - gezeigt. In der linken Aufnahme B-79 erkennt man neben Öltröpfchen viele
sphärische MOH-Aggregate. Die schwarzen Pfeile markieren ausgewählte Aggregate, die in
der nebenstehenden, fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme B-80 eine deutliche Fluoreszenz
des Cy3-Farbstoffs zeigen.
Abbildung 71. Fluoreszenz- und lichtmikroskopische Aufnahme (40x Vergrößerung) einer MOH-Dispersion, hergestellt in 4 mM HEPES-Puffer (pH = 7.2) und 4 mM CoCl2, zu der das gleiche Volumen einer 10 mM Cy3-TTCCGp 69 – ohne EDC-Aktivierung – gegeben wurde. In der linken lichtmikroskopische Aufnahme B-79 sind die ausgewählten zu betrachtenden Aggregate mit schwarzen Pfeilen markiert; deren fluoreszensmikroskopische Aufnahme ist rechts (548 nm, Absorbtion Cy-3) abgebildet: B-80 Die Aggregate zeigen eine gleichmäßige Fluoreszenz, die auf Absorption des Oligonukleotids 69 auf der äußeren Membran zurückzuführen ist. Mikroskop 2 (siehe Experimenteller Teil Kapitel 2).
Der Vergleich der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen B-72 (MOH-Vesikel ohne
Übergangsmetall-Ionen und ohne EDC-Zugabe; siehe Abbildung 70) und B-80 (4 mM Co(II)-
Ionen, ohne EDC; siehe Abbildung 71) zeigt den direkten Einfluss der Co(II)-Ionen auf die
Absorption des Cy3-TTCCGp Oligonukleotids 69. In der Dispersion mit Co(II)-Ionen wiesen
die Oberflächen der Aggregate eine gleichmäßigere Fluoreszenz auf (B-80), als die der MOH-
Vesikelmembranen in B-72. Qualitativ ähnliche Beobachtungen wurden in Anwesenheit von
4 mM Zn(II)-Ionen gemacht. Dies könnte auf eine gleichmäßig, über die Oberfläche des
Aggregats auftretende Wechselwirkung des Oligonukleotids 69 hinweisen und auf Wechsel-
wirkungen zwischen den Imidazol-Kopfgruppen der MOH-Catalipide und den Zn(II)- oder
Co(II)-Ionen zu erklären sein: Die zweiwertigen Metallkationen könnten gleichmäßig verteilt
in die Oberfläche der MOH-Aggregate eingebaut sein und dort zu einer positiven Ladung
B-79 B-80
178
führen, die mit den negativ geladenen Phosphatgruppen des Cy3-TTCCGp 69
Oligonukleotids wechselwirkt.
Klärende Informationen zur nukleophilen Reaktion zwischen dem EDC-aktivierten
Oligonukleotid Cy3-TTCCGp 69 und den MOH-Catalipiden (10 mol % Cholesterin), unter
Ausbildung einer Phosphorimidazolidbindung, wurden aus den fluoreszenzmikroskopischen
Auswertungen nicht erhalten.
Eine Kombination der erarbeiteten und separat voneinander untersuchten Subsysteme (1), (2)
und (3) zu einem MCM, war im untersuchten Aufbau nicht möglich. Die einzelnen
Subsysteme unterschieden sich zu stark in ihren spezifisch aufeinander abgestimmten
Reaktionsbedingungen. Es lag daher nahe, ein vereinfachtes Modell-System zu untersuchen,
in dem die Replikation nur an ein metabolisches- und ein kompartmentierendes Subsystem
gekoppelt ist.
179
3.6 Catalipid-Mizellen: Kopplung einer Replikation an ein metabolisches und ein
ischer Art in Bezug auf Löslichkeit, Aggregationsverhalten,
e Catalipide synthetisiert, um die Herstellung und Isolierung reaktiver
Cy5-TTCCG-MCH Konjugate zu ermöglichen. Die hierzu erarbeiteten, individuellen
Reaktionsbedingungen - im speziellen der Lösungsvorgang der Catalipide in Anwesenheit
organischer Lösungsmittel, selbst unter Sonifizieren - sind inkompatibel zur Catalipid-
Vesikelstabilität. Aufgrund der kurzen Alkylkettenlänge zeigten diese hydrophileren
Catalipide zudem nicht die notwendigen Eigenschaften der Vesikelbildung, so dass eine
stöchiometrische Kopplung der Subsysteme (2) und (3) nicht möglich war.
Durch die Hydrolyse der reaktiven DNA-Catalipid Konjugate im Wässrigen mussten die
Konzentrationen der Reaktanden in der Ligation (genetisches Subsystem (2)) soweit erhöht
werden, dass eine „online“ Detektion über FRET unmöglich wurde. Die technische und
experimentelle Durchführung der Analyse der Ligation mittels RP-HPLC warfen einige
Probleme auf, die in erster Linie aus der zu geringen Löslichkeit der DNA-Catalipid
Konjugate und deren schneller Hydrolyse in wässriger Lösung resultierten und eine
reproduzierbare, kinetische Untersuchung nicht erlaubten.
Die daraufhin entwickelten Experimente zur Kombination aller Subsysteme über eine „in-
situ“ Bildung von Phosphorimidazolid-Bindungen auf der Oberfläche bereits bestehender
Catalipid-Vesikel zeigten, das keine konkreten Anhaltspunkte einer Phosphorimidazolid-
Bildung über fluoreszenzmikroskopische Messungen erhalten werden konnten. Dies war
begründet durch die – nicht reaktive - Absorption des Cyaninfarbstoff markierten
Oligonukleotids 69 auf den MOH-Vesikelmembranen und die nicht ausreichende MOH-
Vesikelstabilität bei höheren EDC- und Pufferkonzentrationen, die zur nachhaltigen
Aktivierung des hydrolyseempfindlichen Konjugats – und damit zum gewünschten
Reaktionsverlauf - notwendig gewesen wäre. Informationen über die Membranpermeabilität
der Catalipid-Vesikel konnten so nicht bestimmt werden. Aufgrund der beobachteten, pH-
kompartmentierendes System
Die separate Entwicklung der Subsysteme (1) bis (3) ergab die Existenz individueller
Einschränkungen physikochem
Reaktivität etc. Diese Einschränkungen führten dann zwangsläufig zu Reaktionsbedingungen,
die auf die einzelnen Subsysteme (1) bis (3) zugeschneidenden waren, wobei folgende,
ungelöste Fragestellungen für eine Kombination zu einem MCM aufgeworfen wurden:
Zur chemischen Implementierung des metabolischen Subsystems (1) war das vollständige
Lösen aller Reaktanden notwendig. Hierzu wurden speziell auf das Einzelsystem optimierte,
hydrophilere, kurzkettig
180
Wert abhängigen Selbstaggregationseigenschaften der Catalipide zu Vesikeln
igenfluoreszenz, ging man jedoch
embranen einerseits zusätzlich über intermolekulare
unterschiedlicher Morphologie und anderen supramolekularen Aggregaten, wie plättchen-
artigen und gedrehten Strukturen sowie der beobachten E
davon aus, dass die Catalipid-Vesikelm
WBB stabilisiert sind, was andererseits aber auch eine Membrandurchquerung erschweren
sollte.
Diese Ergebnisse legten einen weiteren experimentellen Ansatz, das Catalipid-Mizellen
Modell, nahe. In diesem Modell sollte eine Replikation mit einem vereinfachten
metabolischen- und kompartmentierenden Reaktionssystem verbunden werden. Die bereits
untersuchten, grundlegenden chemischen Reaktionen und Reaktionsbedingungen wurden hier
eingebracht. Durch das Zusammenführen der so vorhandenen, analysierten Reaktions-
bausteine sollte ein vereinfachtes, weniger komplexes Gesamtsystem entworfen werden, das
dann über NMR- spektroskopische Analyseverfahren untersucht werden sollte.
181
3.6.1 Diskussion des Einsatzes von 31P-NMR Experimenten zur Untersuchung des
metabolischen Systems sowie der Replikation und von 19F-NMR zur Untersuchung
des kompartmentierenden Systems
Matzen beschrieb, dass die Kondensation zwischen Nukleotiden in Anwesenheit von EDC 2
in gepufferten wässrigen Lösungen kinetisch über 31P-NMR Messungen untersucht werden
Abbildung 72. Reaktionsschema der EDC-Aktivierung sowie Deaktivierung der Phosphatgruppe P des eingesetzten Nukleotids, als auch mögliche Folgereaktionen mit in Lösung anwesenden Nukleophilen. Das EDC 2 reagiert mit dem Nukleotid P unter Addition zum aktivierten Isoharnstoffs P*.
Dieser kann sowohl über Hydrolyse zum eingesetzten Nukleotid P zurückreagieren - wobei
EDU 2a entsteht -, als auch mit in Lösung anwesenden Nukleophilen weiterreagieren. Die
kann.[169] In Abbildung 72 ist das vereinfachte Reaktionsschema der EDC-Aktivierung und
Deaktivierung (Hydrolyse) der Phosphatgruppe P des Nukleotids, sowie mögliche
Folgereaktionen mit in Lösung anwesenden Nukleophilen gezeigt.
OO P
O
O
R
NNNH NH
NH
O
NH
N N+
NH
NH
NHOO P
O
O
R
NH
+
+
OO P
O
O
RN
N
R1
N
N+
O P
O
O
R
R1
N
NH
R2
N
NO P
O
O
R R2
OO P
O
OH
O P
O
O
R R
N
N
NO
NH
O
NH2
OH
O
R
OO P
O
R
+ +
PEDC
ED
2
U 2a
H2O2b
3´-5´-Phosphordiester
bzw. bzw.
bzw.
P*
PIm
PP
R = R1, R2 = Substitutionsposition des eingesetzten Imidazol-Derivats
182
Hydrolyse des eingesetzten EDC 2 zum EDU 2a kann direkt beobachtet werden. Reagiert die
so
5’-Phosphordiester. Liegen in Lösung Imidazol-
n Phosphatgruppe P des
bei, dass
gesetzt wurde.
Pyrophosphat idazolid-
bindung
it einer
Besonderen
geeignete K hosphor-
imidazolid gsmittel.
Aufgrund z llten diese
reaktiven K n 7 als
müsste jedo terschieden
nalyse der Reaktion erschwert wird.
rivaten,
EDC-aktivierte Phosphatgruppe P* jedoch z.B. mit der Phosphatgruppe P des Nukleotids,
können zum einen 5´-5´-verknüpfte Pyrophosphate PP gebildet werden oder auch - über eine
3’-5’-Verknüpfung - die entsprechenden 3’-
Derivate vor, können diese mit dem aktivierten Phosphat P* zu den korrespondierenden
Phosphorimidazoliden PIm reagieren, die ihrerseits Kondensations- und Hydrolysereaktionen
eingehen können (nicht abgebildet). Die in der Reaktion auftretenden, Phosphor enthaltenden
Verbindungen (fett gekennzeichnet) zeigten separierbare Signale im 31P-NMR-Spektrum.[169]
So konnte von Matzen das charakteristische Signal der freie
Nukleotids (Edukt), das des EDC aktivierten Nukleotids P*, wie auch das des entstehenden
5’-5’-Pyrophosphats PP (Produkt) beobachtet werden. Zudem wurde der Einfluss geringer
Mengen von 1-Methylimidazol 95 auf die Reaktion untersucht. Es zeigte sich hier
das eingesetzte Nukleotid schnell zum reaktiven Phosphorimidazolid PIm um
Hierdurch eröffneten sich neue Reaktionskanäle, die zur bevorzugten Ausbildung einer 5’-5’-
PP Bindung führten. Auch das Signal, das der reaktiven Phosphorim
PIm zugeordnet wurde, konnte im 31P-NMR Spektrum detektiert werden.
Zusammenfassend zeigten die von Matzen durchgeführten 1H- und 31P-NMR kinetischen
Untersuchungen zur Aktivierung von Nukleotiden mit EDC 2, dass in Gegenwart des
Aktivators (EDC) eine schnelle Reaktion zwischen Nukleotiden und Imidazol-Derivaten zu
den korrespondierenden reaktiven Phosphorimidazoliden stattfindet, verbunden m
deutlich erhöhten 5’-5’-Pyrophosphat PP Bildung. Eine Reaktion zu 3’-5’-verküpften
Nukleotiden konnte nicht beobachtet werden.[169]
Ähnliche Reaktionseigenschaften wurden von den Catalipiden erwartet. Im
sollten sich die MCN-Im Catalipide (mit 1, 3-Aminoproplyimidazol 72 als Grundgerüst) als
andidaten zur „in-situ“ Aktivierung der Phosphatgruppe über eine P
bindung darstellen, also in Anwesenheit von EDC als Aktivierun
witterionischer Struktur und besserer Löslichkeit im Wässrigen so
onjugate - verglichen mit den MCH-Catalipid Konjugaten (Histami
Grundgerüst) - eine höhere Reaktivität in möglichen Kondensationsreaktionen zeigen. Hierbei
ch die EDC-vermittelte Ligation von der Imidazol-vermittelten un
werden, wodurch die A
Da die Catalipide, im Gegensatz zu den bisher von Matzen untersuchten Imidazol-De
amphiphile Eigenschaften aufweisen, wäre eine Kompartmentierung einzelner Reaktions-
partner und ein damit verbundener möglicher Einfluss der Aggregation auf die
183
Kondensationsreaktion der Nukleotide (Replikation), gerade im Hinblick auf eine mögliche
3’-5’-Verknüpfung einzelner Nukleotide zu di- oder oligomeren Polynukleotiden, denkbar.
Diese Arbeitshypothese der 3’-5’-Verknüpfung von Nukleotiden ist als sog. Catalipid-
Mizellen Modell schematisch in Abbildung 73 dargestellt.
Abbildung 73. Das Catalipid-Mizellen Modell: Schematische Darstellung der Ausbildung einer möglichen mizellaren Anordnung von Nukleotid-Catalipid KonjugatenNukleotid (Replikationsreaktion).
A (Kompartmentierung) und Kondensation zum Di-
den stattfinden. Zum einen kann
Das metabolische System des Catalipid-Mizellen Modells soll die Reaktion zu reaktiven
Phosphorimidazoliden ermöglichen, die über nukleophile Reaktion des eingesetzten
Catalipids mit dem EDC-aktivierten 5’-GMP 76 gebildet werden. Diese (Konjugations-)
Reaktion ist mit den beschriebenen Synthesen zu Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugaten (siehe
Kapitel 3.3.3) vergleichbar, so dass die bereits erarbeiteten, strukturspezifischen Eigen-
schaften der Catalipide bzgl. Reaktivität und Löslichkeit genutzt werden könnten. Die
nukleophile Reaktion zwischen dem eingesetzten Catalipid und dem aktivierten 5’-GMP 76
könnte prinzipiell auf zwei unterschiedlichen Reaktionspfa
das als Nukleophil reagierende Catalipid frei in Lösung vorliegenden und mit dem EDC-
aktivierten Nukleotid zum Nukleotid-Catalipid- Konjugat A reagieren. Erst dann käme es zur
Selbstaggregation z.B. in Form von mizellaren Strukturen. Dieser Reaktionspfad ist in
184
Abbildung 73 gezeigt, wobei die eigentliche Reaktion zwischen dem EDC-aktivierten
5’-GMP 76 und dem Catalipid (in A) zum Nukleotid-Catalipid Konjugat A nicht abgebildet
- stattfinden. Hierzu müssten die
Catalipide aggregiert in Lösung vorliegen, also im Konzentrationsbereich ihrer CMC. Beide
Reaktionspfade führen zu einer Situation, in der es zur Kompartmentierung der reaktiven
Nukleotid-Catalipid Konjugate kommt. Es ist davon auszugehen, dass beide Reaktionspfade
im Catalipid-Mizellen Modell nebeneinander auftreten können, da in mizellaren Aggregaten
eine hohe Lipid-Dynamik herrscht, die zu einem regen Austausch von frei gelösten und
aggregiert vorliegenden Molekülen führt (siehe Kapitel 3.2.1.6). Die Aggregation der
Catalipide bzw. der Nukleotid-Catalipid Konjugate wäre mit einem einfachen
kompartmentierenden Subsystem vergleichbar. Hier liegen jedoch keine geschlossenen
(Reaktions-) Kompartimente in Form von Vesikeln vor, wie es im Konzept zum MCM
beschrieben ist, so dass nur die Aggregation der einzelnen Reaktionsteilnehmer, also die
Kompartmentierung untersucht werden kann.
Durch einen nukleophilen Angriff der 3’-Hydroxylfunktion eines Nukleotids an die Phosphor-
imidazolidbindung des nachbarständigen Nukleotids (roter Pfeil in Abbildung 73), das heißt
durch eine 3’-5’-Verknüpfung beider Nukleotide, und vielleicht auch durch Ausbildung
oligomerer Reaktionsprodukte wäre das genetische Subsystem des Catalipid-Mizellen
Modells dargestellt. Fände die Reaktion (Replikation) auf der Oberfläche der gebildeten
ekoppelt (siehe Abbildung 73). Käme es nicht zu den gezeigten 3’-5’-Verknüpfungen der
ist. Zum anderen könnte die Reaktion zu Nukleotid-Catalipid Konjugaten auch direkt auf der
Oberfläche eines Aggregats - z.B. in Form einer Mizelle
Aggregate (Mizelle) statt, wäre diese Replikationsreaktion dann direkt mit einem
metabolischen- (Reaktion zum Konjugat A) und einem kompartmentierenden System
g
aktivierten Nukleotide, sollte zumindest eine 5’-5’-Pyrophosphaten (PP) Bildung im 31P-
NMR zu beobachten sein, vergleichbar mit den Experimenten von Matzen.[169] Hierbei sollte
dann der mögliche Einfluss der Kompartmentierung der reaktiven Reaktionsteilnehmer auf
die Replikationsreaktion beobachtet werden können.
185
In Abbildung 74 liegt das PIm-Konjugat im mizellaren Zustand vor, so dass die Reaktion auf
den - oder zumindest durch die Aggregate beeinflusst - werden könnte, was Gegenstand der
Untersuchung sein sollte.
O
Abbildung 74. Reaktion zwischen 5’-GMP P 76 und einem Nukleotid-MCN-Im PIm zum Pyrophosphat 5’-5’-P-P 96. Als Abgangsgruppe fungiert das Catalipid MCN-Im (R = Alkylkette, PIm liegt in mizellarer Form vor).
Die Kompartmentierung in Form von Mizellen hätte im Vergleich zu den bisher untersuchten
Vesikeln, die die Reaktionskompartimente im MCM darstellen, folgende Vorteile: Zum
einem fände die Reaktion auf der Oberfläche des Aggregats statt, und die experimentell
schwer umzusetzende Membrandurchquerung reaktiver Reaktionsbausteine ins innere
Volumen der Catalipid-Vesikel (z.B. in Form eines Membran „Flip-Flops“), wie er für das
MCM vorgesehen ist (siehe Abbildung 16), wäre somit nicht notwendig. Zum anderen
könnten in Experimenten zu Catalipid-Mizellen höhere EDC-Konzentrationen in Lösung
verwendet werden, da supramolekulare Aggregate in Form von Mizellen aufgrund ihrer
erhöhten Lipid-Dynamik weniger sensibel auf höhere Ionenstärken in Lösung als Vesikel
reagieren. Die Verwendung höherer EDC-Konzentrationen kann sowohl der stetig
ablaufenden Hydrolyse EDC EDU (siehe Abbildung 72), als auch der Hydrolyse der
Phosphorimidazolidbindung entgegenwirken und so dem Catalipid-Mizellen Modell - im
Vergleich zum MCM- eine erhöhte Reaktionsdynamik über die beschriebene „in-situ“
Aktivierung in der gewünschten Richtung verleihen.
N
N
N
NH
O
NH2
OH
OP
O
OH
OP
O
O
ON
NNH
N
O
NH2 O
OH
5´ 5´
ON
N
N
NH
O
NH2
OH
OP
O
O
OH R NH
N+
O
N P O
O
O
ON
N
N
NH
O
NH2
OH
R NH
N
O
N
5´-GMP PIm
5'5'
liegt aggregiert vor76
+
5'-5'-PPMCN-Im 96
186
Über 31P-NMR Spektroskopie wäre sowohl der zeitliche Verlauf des metabolischen Systems
(Reaktion zu P* und PIm) als auch der des genetischen Systems (Reaktion zu 3’-5’-
Verknüpfung Nukleotiden oder zur 5’-5’-Pyrophosphat-Bindung PP 96) möglich. Eine
m19 er.
ationen zum metabolischen- und genetischen- Subsystem zum MCM
talipide erfolgte in flüssiger Phase (siehe
Kapitel 3.3.3.1 und 3.3.3.2), so dass genügend große Stoffmengen sowohl für Experimente
abschließende Analyse der Reaktionsmischung auf oligomere Reaktionsprodukte könnte
zudem über MALDI-TOF MS Analysen erfolgen.
Informationen zum Aggregationsverhalten der Catalipide und der Nukleotid-Catalipid
Konjugate in den Catalipid-Mizellen, sollten über 19F-NMR-Messungen der Dispersionen
erhalten werden. Hierzu sollten spezielle Catalipide synthetisiert werden, die in ω-Position der
Alkylkette mit Fluor markiert sind (siehe Abbildung 72). Es war geplant, über aggregations-
beeinflusstes Shift-shifting Informationen über die Kompartmentierung des Catalipid-
Mizellen Modells zu erhalten (vergleiche Kapitel 3.6.4).
Die NMR-spektroskopischen Untersuchungen würden es ermöglichen den Reaktionsverlauf
der Replikation, der an ein metabolisches- und ein kompartmentierendes System gekoppelt
ist, zu verfolgen: Über 31P-NMR Messungen wären detaillierte Informationen zur Bildung des
etabolischen- und genetischen Systems des Catalipid-Mizellen Modells erhältlich und über
F-NMR-Messungen Informationen über die Kompartmentierung der Reaktionsteilnehm
it 1H vergleichbaren Empfindlichkeiten der Nuklide 31P und 19F sollten Aufgrund der m
entsprechend angewendete NMR-Analysen diesbezüglich eine kontinuierliche Reaktions-
beobachtung ermöglichen. Auf mikroskopische Untersuchungen, über die keine detaillierten
und eindeutigen Inform
erhalten werden konnten (siehe Kapitel 3.5.1), könnte somit verzichtet werden.
In ersten Experimenten zum Catalipid-Mizellen Modell (Abbildung 72) setzte man die bereits
synthetisierte unfluorierte, kurzkettige MCH 84, 85, 86 und MCN-Im 91, 92, 93 Catalipide
ein, um allgemeine Reaktionsbedingungen zu erarbeiten, die eine 31P-NMR spektroskopische
Untersuchung des Reaktionsablaufs ermöglichen. Nachfolgend sollte getestet werden, ob
dann fluorierte-Catalipide die unfluorierten zur Untersuchung der Kompartementierung
ersetzten können.
3.6.2 Entwicklung des Catalipid-Mizellen Modells
Zur systematischen Untersuchung der spezifischen Aggregationseigenschaften strukturell
unterschiedlicher Catalipide in gepufferter Lösung wurden die MCH 84, 85, 86 und MCN-Im
91, 92, 93 Catalipide eingesetzt. Die Synthese der Ca
187
zum Aggregationsverhalten, als auch für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur
Verfügung standen. Die Alkylkettenlänge der Catalipide (variierend von 6 bis zu 10
Kohlenstoffatomen) steht in direktem Zusammenhang mit deren spezifischer CMC. Zur
Herstellung mizellarer Lösungen wurde das einzusetzende Catalipid im Reaktionspuffer
dispergiert und anschließend auf Beschaffenheit und Trübung visuell begutachtet. Als
Reaktionspuffer 97 wurde unter
homogen und
40 mM zu einer trüben Lösung kam, die jedoch nach ca. 2 h wieder
eparierte. 60 mM Konzentrationen zeigten eine länger anhaltende Trübung (ca. 10 h). Höhere
Konzentrationen > 60 mM zeigten eine inhomogene Emulsion des Catalipids 92 in Form
ation von 5 mM zeigte das MC N-Im 93 Catalipid eine leichte,
Reaktionspuffer wurde analog der von Matzen durchgeführten NMR-spektroskopischen
Experimente ein 0.1 M MES-Puffer pD = 6.25 97 verwendet, der mit deuteriertem Wasser
hergestellt wurde. Die Verwendung von deuteriertem Wasser war für die geplanten 31P-NMR
Untersuchungen notwendig, da ansonsten ein zusätzlicher interner Standard zum Einloggen
auf das Lösungsmittel hätte hinzugefügt werden müssen.
Die Untersuchung der Löslichkeit der Catalipide im
Berücksichtigung der in Kapitel 3.3.3.1 und 3.3.3.2 beschriebenen Ergebnisse durchgeführt.
In ersten Experimenten setzte man daher die MCN-Im-Catalipide ein, die im Vergleich zu den
MCH-Catalipiden eine bessere Löslichkeit im wässrigen Reaktionspuffer 77 zeigten, so dass
kein DMF zugesetzt werden musste. Durch die zwitterionische Struktur der Nukleotid-
MCN-Im Konjugate (siehe Kapitel 3.3.3.2) sollte auch deren Reaktivität höher als die der
Nukleotid-MCH Konjugate sein. Bei einer hinreichend lang anhaltenden, homogenen
Trübung (ca. 24 h bei Raumtemperatur) der Catalipid-Dispersionen ging man davon aus, dass
es zur angestrebten stabilen Aggregation der Catalipide gekommen war.
Das kurzkettige MC6N-Im 91 Catalipid zeigte eine gute Löslichkeit im 0.1 M MES-Puffer
pH = 6.25 97. Erst ab einer Konzentration von 10 mM wurde die Emulsion in
zeigte kleine Öltropfchen. Wurde diese 10 mM Emulsion im Ultraschallbad behandelt,
entstand eine Trübung durch sehr fein verteilte Öltröpfchen, die jedoch durch Phasentrennung
sehr schnell wieder aufklarte. Diese Beobachtungen wurden dahingehend gedeutet, dass ab
einer Konzentration von 10 mM eine instabile Emulsion vorlag.
Löslichkeitsversuche mit dem MC8N-Im 98 Catalipid zeigten, dass es erst ab einer
Konzentration von
s
größerer Öltröpfchen im MES-Puffer 97.
Bereits ab einer Konzentr 10
jedoch dauerhafte Trübung im MES-Puffer 97. Zusätzlich wurden 8 mM und 10 mM
Dispersionen hergestellt, die auch eine dauerhafte Trübung in Form von dispergierten
188
Catalipiden in der Lösung zeigten. Bei Konzentrationen > 10 mM bildete sich auch hier ein
unlöslicher Niederschlag.
In Tabelle 23 sind die unterschiedlich konzentrierten Dispersionen und deren visuelle
Beurteilung zusammengestellt, die bei 31P-NMR zur Untersuchung des Catalipid-Mizellen
Modells eingesetzt wurden.
Tabelle 23. Zusammenstellung der unterschiedlich konzentrierten MCN-Im Catalipid-Dispersionen im MES-Puffer 97 und deren visuelle Beurteilung.
MCN-Im Catalipid Konzentration [mol / l] Visuelle Beurteilung der Dispersionen
MC6N-Im 91 10 mM - instabile Emulsion, schnell aufklarend
MC8N-Im 92 40 mM
60 mM
- instabile Emulsion
- trübe Emulsion für ca. 10 h
MC10N-Im 93 5 mM
8 mM
10 mM
- alle Konzentrationen zeigten eine
inhomogene, dauerhafte Trübung der Dispersion
31P-NMR Untersuchungen zeigten, dass 10 mg 5’-GMP 76 in 600 µL (c = 0.048 mM) MES-
Puffer 97 ausreichten, um bei hinreichender Messzeit pro Einzelexperiment (mindestens 64
Scans) Signale mit ausreichendem Signal-Rauschverhältnis zu detektieren. Als Reaktions-
gefäß wurde ein 5 mm NMR-Röhrchen eingesetzt, das mit einem Mindestvolumen von
chmessung. Hierbei verblieb die
500 µL pro NMR-Experiment befüllt wurde. Die EDC-Konzentration betrug 0.2 M im
Reaktionspuffer.
3.6.3 Zeitaufgelöste 31P-NMR Spektroskopie zur Untersuchung des Reaktionsverlaufs in
Experimenten zum Catalipid-Mizellen Modell
Zur Probenvorbereitung wurden zu 550 µl MES-Puffer 97, in dem je nach Experiment das
Catalipid emulgiert bzw. dispergiert vorlag (siehe Tabelle 23), 10 mg 5’-GMP 76 gegeben
und in ein NMR-Röhrchen transferiert. Nach der Aufnahme eines ersten „Referenz“-
Spektrums, gab man zu der entsprechenden Reaktionslösung 23 mg EDC 2 (0.2 M), gelöst in
50 µL MES-Puffer 97 und startete umgehend die Mehrfa
Probe während der gesamten Messung im Spektrometer. Die Aufnahme der Spektren erfolgte
nach definierten Zeitintervallen, mit Messzeiten von 7 min (64 Scans) bzw. 10 min
(128 Scans) pro Einzelexperiment. Zur Bestimmung des Konzentration-Zeit-Verlaufs
189
(c (t)-Kurve) der betreffenden Reaktion, wurden die Integrale der charakteristischen
Phosphorsignale als Funktion der Zeit ausgewertet und in Konzentrationen umgerechnet.
Reaktanden (P, P*, PIm, 5’-5’-PP und ggfls. der 3’-5’-P-Ester)
ber ihre charakteristischen Verschiebungen δ im 31P-NMR Spektrum bestimmen zu können,
fer
D = 6.25 (NaOH) 97 aufgenommen. Dieses zeigte ein breites Triplett bei δ = 2.8 ppm mit
e 4 r
Hintergrundreaktion, ohne Anwesenheit von Imid tersuchte
man den Re 76 (0.06 M) in MES-Puffer 97 mit 0.2 M EDC. In
den z ander folgende MR Spektren (alle 10 min, entsprechend 128 Scans)
wurden insgesamt drei Signale zu unterschiedlichen Reaktionszeiten detektiert, die zudem
verschiedene Intensitätsverläufe . Die Reaktion r
inzelmessungen gezeigt, wobei die ersten 11 Spektren dem chronologischen
76 (0.06 M) in MES-Puffer 97 (0.2 M EDC), ohne Anwesenheit von Imidazol-Derivaten.
Es ist bekannt, dass die chemische Verschiebung δ der fünfwertigen Phosphoratome stark
vom pH-Wert abhängt.[170, 171] Um eine eindeutige Identifizierung aller in der Reaktion
eingesetzten und gebildeten
ü
wurde zuerst das 31P-NMR Spektrum einer 0.06 M Lösung 5’-GMP 76 in 0.1 M MES-Puf
p
iner vicinalen P-O-C-H Kopplung 3JPH von .9 Hz. Um den zeitlichen Verlauf de
azol-Derivaten zu bestimmen, un
aktionsverlauf von 5’-GMP
eitlich aufein n P-N31
zeigten ist in Abbildung 75 als Stack-Plot de
E
Reaktionsverlauf entsprechen und ab Spektrum 12 nur jedes fünfte Spektrum bis zu einer
Reaktionszeit von 350 min abgebildet wurde. Längere Messzeiten brachten keine
signifikanten Änderungen.
Abbildung 75. Graphische Abbildung des zeitlichen Reaktionsverlaufs (Stack-Plot) der Reaktion von 5’-GMP
Referenz10 min
60 min
P P* PP350 min
300 mi
250 min
n
200 min
150 min
100 min
20 min
30 min
40 min
50 min
70 min
80 min
90 min
190
Das erste Spektrum zeigt das Triplett der Phosphatgruppe des 5’-GMPs 76 P bei δ = 2.8 ppm,
ohne Anwesenheit von EDC. Nach der Zugabe des in MES-Puffer 97 gelösten EDC zur
on 10 min - die Ausgangskonzentration von 5’-GMP 76 P von 60 mM auf ca. 50 mM fiel,
erbunden mit gleicher Zunahme der Phosphatkonzentration der EDC-aktivierten Spezies P*,
Reaktionslösung (zweites Spektrum, 10 min) wurde ein Shift des Phosphat-Signals P zu
höheren ppm-Werten beobachtet, der auf einen Verdünnungseffekt und / oder Änderungen
der Ionenstärke der Lösung zurückzuführen sein könnte. Neben dem Signal um δ = 3 ppm ist
ein weiters Signal bei δ = - 7.5 ppm entstanden, das der EDC-aktivierten Phosphatgruppe des
5’-GMPs P* zugeordnet wurde. Nach etwa 60 min nimmt die Intensität dieses Signals P*
(δ = -7.5 ppm) ab, in Korrelation mit der Entstehung eines neuen Signals - geringerer
Intensität - bei δ = - 11 ppm. Dieses Signal wurde dem Pyrophosphat 5’-5’-PP 96
zugeordnet[170], das durch die Reaktion von P* mit P gebildet wird. Zur Veranschaulichung
des Reaktionsverlaufs ist in Abbildung 76 der Konzentrations-Zeit-Verlauf (c (t)-Kurve)
abgebildet.
60
Abbildung 76. Konzentrations-Zeit-Verlauf (c (t)-Kurve) der Reaktion von 5’-GMP 76 in MES-Puffer 97 (0.2 M EDC).
Die c (t)-Kurve zeigt, dass bereits nach der ersten Messung - entsprechend einer Reaktionszeit
0 100 200 300 400 500 600
0
5
10
50
v
v
in gleicher Größenordnung. Bereits nach 20 min ist die Maximalkonzentration von P*
mm
ol
PP*PP
Ko
nze
ntra
tion
/
Zeit / min
191
erreicht, die im weiteren Reaktionsverlauf stetig abnimmt - in Korrelation mit der Zunahme
Abbildung Puffer 97 (0.2
Signal bei zugeordnet
urde.[172, 173] Die Konzentration der EDC-aktivierten Phosphatgruppe P* ist über den
hne Imidazol-Derivat. Dies deutet auf eine schnelle Reaktion zwischen dem N-
30
der P Konzentration. Nach einer Reaktionszeit von ca. 200 min ist nahezu die
Ausgangskonzentration von 60 mM erreicht. Wie im Stack-Plot zu erkennen, ist nur eine sehr
geringe Menge PP gebildet worden (siehe Abbildung 76). Die dominierende Reaktion ist die
Hydrolyse von P* zu P.
Im nächsten Experiment wurde die Reaktion von 5’-GMP 76 (0.048 M) in MES-Puffer 97
(0.2 M EDC) in Anwesenheit von 10 mM N-Methylimidazol 95 untersucht. Der zeitliche
Verlauf der Reaktion ist in Abbildung 77 (c (t)-Kurve) gezeigt.
40
50
77. Konzentration-Zeit-Verlauf (c (t)-Kurve) der Reaktion von 5’-GMP 76 (0.048 M) in MES- M EDC ) in Anwesenheit von 10 mM N-Methylimidazol 95.
Bereits zu Beginn der Reaktion ist neben den aus Abbildung 76 bekannten Signalen der
Phosphatgruppe P, dem EDC-aktivierten Phosphat P* δ = - 7.5 ppm ein weiteres, neues
δ = - 10.5 ppm zu erkennen, das dem Phosphorimidazolid PIm
0 100 200 300 400 500 600
0
5
10
15
w
gesamten Reaktionsverlauf sehr gering, verglichen mit der untersuchten Hintergrundreaktion
o
Methylimidazol 95 und dem aktivierten Phosphat P* zum Phosphorimidazolid PIm hin. Eine
deutlich erhöhte Reaktionsrate zum Pyrophosphat 5’-5’-PP 96 ist, im Vergleich zur Reaktion
ohne N-Methylimidazol Zugabe (siehe Abbildung 76), nicht zu beobachteten. Die starke
mo
lK
on
zent
ratio
n /
m
Zeit / min
P P* PIm PP
192
Streuung der Messpunkte ist auf das nicht zufriedenstellende Signal / Rauschverhältnis in den 31P-NMR Einzelspektren zurückzuführen und verhindert die genaue Interpretation der
Reaktion, da die Integration der einzelnen Signale zu ungenau wird.
In folgenden Experimenten wurden die in Tabelle 23 aufgeführten MCN-Im-Catalipid
Emulsionen / Dispersionen eingesetzt, um den möglichen Einfluss amphiphiler Imidazol-
Derivate auf die Kondensation von 5’-GMP 76 in Anwesenheit von EDC 2 zu untersuchen -
ine lang anhaltende, Trübung
im
in
im Besonderen die 3’-5’-Verknüpfung zu di- oder oligomeren Polynukleotiden (siehe
Abbildung 73).
Zuerst setzte man die 10 mM MC6N-Im 91 Emulsion ein, die ke
MES-Puffer 97 zeigte (siehe Tabelle 23).
In Abbildung 78 ist die zeitliche Änderung der 31P-NMR Signale im Stack-Plot gezeigt. Die
ersten 11 Spektren zeigen den chronologischen Reaktionsverlauf, wobei alle 7 m
(entsprechend 64 Scans) ein Spektrum aufgenommen wurde, nachfolgend ist nur jedes fünfte
Spektrum abgebildet, bis zu einer Gesamtreaktionszeit von 385 min.
Referenz
28 min
35 min
14 min
7 min
42 min
49 min
70 min
63 min
56 min
105 min
140 min
175 min
210 min
245 min
280 min
315 min
350 min
385 min
P P* PPPIm
21 min
Abbildung 78. Graphische Abbildung des zeitlichen Reaktionsverlaufs (Stack-Plot) der Reaktion von 5’-GMP 76 (0.048 M) in MES-Puffer 97 (0.2 M EDC) in Anwesenheit von 10 mM MC6N-Im 91. In der Abbildung sind vier verschiedene Signale zu erkennen: das Triplett bei δ = 3 - 3.3 ppm, entspricht der Phosphatgruppe des 5’-GMPs 76 P, das breite Singulett δ = - 7.5 der EDC-aktivierten Phosphatgruppe P* des 5’-GMPs 76, das breite Singulett bei δ = - 10.2 PIm dem 5`-GMP-MC6N-Im Konjugat und das breite Singulett bei δ = -11 ppm dem Pyrophosphat 5’-5’-PP 96.
Neben den bereits beschriebenen Signalen der Phosphatgruppen der Reaktanden P δ = 3 bis
3.3 ppm, P* δ = -7.5 ppm und 5’-5’-PP δ = - 11 ppm, ist ein breites Singulett bei
δ = - 10.2 ppm PIm zu erkennen, das dem 5’-GMP-MC6N-Im-5’-GMP Konjugat zugeordnet
193
wurde. Ein weiteres Signal, das auf eine 3’-5’-Verknüpfung der 5’-GMP Nukleotide 76
deuten könnte, wurde nicht detektiert. Dies wäre nach Literaturangabe bei einer chemischen
Verschiebung δ in der Region um δ = - 0.96 ppm zu erwarten (Poly (G) in D20, pH = 7).[174]
30
35
40
45
50
0 100 200 300 400 500 600
P
-5
0
5
10
15
20
25 P* PIm PP
des EDC-aktivierten P* bei δ = - 7.5 ppm war so intensitätsschwach,
öglich war. Ein Signal, das einer Phosphordiesterbindung 3’-5’-
detektiert werden. Auch die MALDI-TOF MS Analyse der Reaktionslösung nach 24
Ko
nze
ntr
atio
n / m
mo
l
Zeit / min
Abbildung 79. Konzentration-Zeit-Verlauf c (t)-Kurve der Reaktion von 5’-GMP 76 in MES-Puffer 97 (0.2 M EDC) in Anwesenheit von 10 mM MC6N-Im 91. Es lag eine ungetrübte Reaktionslösung vor.
Der Vergleich der Konzentration-Zeit Diagramme Abbildung 77 (10 mM N-Methyl-
imidazol 95) mit Abbildung 79 (10 mM MC6N-Im 91, es lag eine ungetrübte Reaktionslösung
vor) zeigt keinen, auf eine mögliche Kompartmentierung einzelner Reaktionsteilnehmer
zurückzuführenden, Unterschied im Reaktionsverlauf. Es ist daher davon auszugehen, dass
das kurzkettige MC6N-Im 91 Catalipid frei in Lösung vorlag und seine Reaktivität mit der des
N-Methylimidazols 95 vergleichbar ist. Dieses Ergebnis deckt sich mit der visuellen
Beobachtung der 10 mM MC6N-Im 91 Lösung, die keine, auf eine mögliche Aggregation
hinweisende anhaltende Trübung zeigte.
Die 31P-NMR Experimente mit dem MC8N-Im Catalipid Emulsionen (siehe Tabelle 23)
zeigten, dass eine schnelle Reaktion zwischen dem EDC-aktivierten 5’-GMP P* und dem
Catalipid zum 5’-GMPMC8N-Im Konjugat stattfand, vergleichbar mit der des MC6-N-Im
Catalipids. Das Signal
dass eine Integration nicht m
verknüpfter 5’-GMP Nukleotide entsprechen könnte (um δ = - 0.96 ppm) konnte nicht [172]
194
stündiger Reaktionszeit der 40 mM und 60 mM Catalipid Emulsionen zeigte nur das Signal
der Masse des Di-Nukleotids des 5’-GMPs 76. Durch massenspektrometrische Analysen kann
nicht zwischen einer 5’-5’- oder 3’-5’-Verknüpfung unterschieden werden. Da jedoch keine
Anzeichen höhermolekularer Massen im MALDI-TOF MS Spektrum zu erkennen waren und
vor allem das charakteristische Signal der chemischen Verschiebung der 3’-5’-Phosphor-
dieesterbindung im 31P-NMR Spektrum fehlte, ging man davon aus, dass alleinig das
Pyrophosphat 5´-5´-PP 96 gebildet wurde.
Um den Einfluss aggregierter MC8N-Im Catalipide auf die Pyrophasphat 5’-5’-PP Bildung,
im Vergleich zum frei in Lösung vorliegenden N-Methylimidazol 95 zu verdeutlichen, sind in
Abbildung 80 die entsprechenden Reaktionsverläufe in einem Konzentrations-Zeit Diagramm
gezeigt.
en im Vergleich zur 40 mM N-Metylimidazol 95 Referenz
5
6
7
8
9
10
Abbildung 80. Zeitlicher Verlauf der 5’-5’-Pyrophosphat-Bildung PP 96 in Abhängigkeit unterschiedlich konzentrierter MC8N-Im 92 Catalipid EmulsionLösung NIm.
0 100 200 300 400 500 600-1
0
1
2
40 mM MC N Im-8
3
460 mM MC
8N-Im
40 mM NIm Rent
rat
eferenz
Ko
nzio
n /
mm
ol
Zeit / min
In allen Reaktionen setzte man eine 0.048 M 5’-GMP 76 Lösung in MES-Puffer 97 (0.2 M
EDC) ein. Die untere blaue Datenpunkt-Reihe entspricht der Reaktion, bei der 40 mM
N-Methylimidazol 95 in der Reaktionslösung vorhanden war. Die starke Streuung der
Messpunkte ist auf ein sehr intensitätsschwaches Signal des Pyrophosphats 5’-5’-PP 96 im
195
31P-NMR Spektrum zurückzuführen. Über die Messung ist jedoch eine vergleichende,
qualitative Abschätzung der gebildeten Pyrophosphatmenge möglich. Die darüber liegende
schwarze (40 mM)- und rote (60 mM) Messreihe entspricht dem zeitlichen
Konzentrationsverlauf des 5’-5’-PP Signals 96 der Reaktionen, in denen 40 bzw. 60 mM
Konzentrationen von MC8N-Im-Catalipid 92 in mehr oder weniger stabilen Emulsionen
vorlagen. Der Vergleich zeigt, wenn das Catalipid 92 emulgiert in 40 millimolarer oder auch
60 millimolarer Konzentration in der Reaktionslösung vorliegt, eine - im Vergleich zur
N-Methylimidazol NIm Katalyse – erhöhte Pyrophosphat 5’-5’-PP 96 Bildung. Die
Bereits bei der 40 mM Konzentration lagen so viele emulgierte Öltröpfchen in
Lösung vor, dass die Reaktion zum Pyrophosphat 96 bevorzugt auf der Phasengrenzfläche
und som
zum
r
intens
MC8
60 m
Em
Catalip
ach 8
erden konnten, dispergierte man den Film im Ultraschallbad. Die anschließende 31P-NMR
Konzentration des Catalipids 92 zeigte keinen signifikanten Einfluss auf den Reaktions-
verlauf.
Eine Reaktion auf der Phasengrenzfläche könnte die bevorzugte Bildung des 5’-5’-PP 96
erklären:
it über die Phosphorimidazolid-Aktivierung verlaufen könnte. Der Reaktionskanal
5’-5’-PP 96 über die alleinige EDC-Aktivierung ist hingegen nahezu zu vernachlässigen.
Dies zeigt sowohl die Hintergrundreaktion - ohne Imidazol-Derivate - als auch das seh
itätsschwache Signal P* in den 31P-NMR Einzelmessungen in der Untersuchung der
N-Im Catalipid Emulsionen. Eine weitere Erhöhung der Catalipid Konzentration auf
M führt wahrscheinlich nur zu größeren Öltröpfchen mit nicht signifikant vergrößerter
Oberfläche, so dass in diesem Bereich keine, messbare, konzentrationsabhängige Pyro-
phosphat Bildung 5’-5’-PP 96 zu erkennen ist.
Inwieweit und in welcher speziellen supramolekularen Anordnung (Öltröpfchen, Mizellen,
größere unlösliche Bestandteile etc., siehe Tabelle 23) die MC8N-Im-Catalipide 92 in der
ulsion vorlagen und so ggfls. einen Einfluss auf den Reaktionsverlauf nehmen können, ist
über die durchgeführten Experimente nicht zu klären. Diese vergleichenden Beobachtungen
zeigen jedoch, dass eine erhöhte Konzentration von emulgiert in Lösung vorliegenden
iden 92 zu erhöhten Konzentration der Pyrophosphat Bildung 5’-5’-PP 96 führt.
beendeter Messung zeigten beide NMR-Röhrchen mit 40 mM bzw. 60 mM MC N-ImN
Emulsionen eine deutliche Ablagerung in Form eines klebrigen Films. Um auszuschließen,
dass sich hierin wasserlösliche Reaktionskomponenten befanden, die so nicht detektiert
w
Untersuchung der milchig-trüben Emulsionen zeigte weder Unterschiede in der Signal-Anzahl
noch in der –Intensität der zuvor aufgenommen Spektren. Man ging daher davon aus, das der
wasserunlösliche Film aus MC8N-Im 92 Catalipid-Ablagerungen bestand, die während der
196
Reaktion ausgefallen sind und keine weiteren, wasserlöslichen Phosphatverbindungen
enthielten.
In folgenden Experimenten sollte der Einfluss dispergierter MC10N-Im 93 Catalipide im
MES-Puffer 97 auf die Kondensation von 5’-GMP 76 in Gegenwart von 0.2 M EDC
untersucht werden. Aufgrund der größeren Lipophilie der MC10N-Im 93 Catalipide mit einer
Alkylkettenlänge von zehn Kohlenstoffatomen, ist eine Selbstaggregation zu
supramolekularen Aggregaten zu erwarten, die jedoch stark von den äußeren Bedingungen
(Konzentration, Ionenstärke, Temperatur etc, ) abhängig ist.[9]
In Abbildung 81 ist der zeitliche Verlauf der Pyrophosphat 5’-5’-PP 96 Bildung der Reaktion
von 0.048 M 5`-GMP 76 in MES-Puffer 97 (0.2 M EDC) in Abhängigkeit unterschiedlicher
MC10N-Im 93 Konzentrationen (5, 8 und 10 mM, siehe Tabelle 23) gezeigt.
iedlich
10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Abbildung 81. Zeitlicher Verlauf der Pyrophosphat-Bildung 5’-5’-P-P 96, in Abhängigkeit untersch
0 200 400 600 8000
1
5 mM MC10
N-Im
8 mM MC10
N-Im
10mM MC10
N-Im
Ko
nze
ntra
tion
/ m
mol
Zeit / min
konzentrierter MC10N-Im 93 Catalipid Dispersionen.
Alle eingesetzten MC10N-Im Catalipid Dispersionen zeigten eine homogene, stabile Trübung
der Reaktionslösung (siehe Tabelle 23). Diese Experimente zeigen im Vergleich zu den
emulgiert eingesetzten MC8N-Im Catalipiden (siehe Abbildung 80) jedoch eine deutliche,
konzentrationsabhängige Zunahme der gebildeten Pyrophosphatmenge 5’-5’-PP 96: Bei einer
Konzentration von 5 mM MC N-Im 93 stieg die Konzentration des gebildeten Pyro-
197
phosphat 96 auf einen maximalen Wert von ca. 2.5 mM (schwarze Messreihe), bei einer
8 mM 93 ungefähr auf die doppelte Konzentration: 5 mM (rote Messreihe) und bei 10 mM
auf eine maximale PP Konzentration von ca. 7 mM (blaue Messreihe). Höher konzentrierte
Emulsionen, die
eine konzentrationsabhängige 5’-5’-PP 96 Bildung zeigten, ging man hingegen nur von
einer Volum
In allen MC
nachfolgend
, analog den
untersuch
odell der
Catalipids
- Catalipid -
Pyrophosphat
konzentr zellar oder nur
r eine verstärkte Mizellen-Bildung einzelner
lären ist (siehe Abbildung 81).
MC10N-Im Dispersionen wurden aufgrund der unzureichenden Löslichkeit des Catalipids
nicht untersucht.
Es war zu erwarten, dass die Reaktion zum 5’-5’-PP 96 - analog der MC8N-Im Emulsionen -
durch die Aggregation des Catalipids 93 beeinflusst wird. Die konzentrationsabhängige
Zunahme der gebildeten Pyrophosphat Stoffmenge 97 könnte dahingehend gedeutet werden,
dass die lipophileren MC10N-Im Catalipide Aggregate in Form von Mizellen ausbilden: Durch
die Konzentrationserhöhung wird die Anzahl der Mizellen in Lösung erhöht und damit - im
direkten Zusammenhang - die Oberfläche potentieller Reaktionsräume - und nicht lediglich
das Volumen der Mizellen. Im Fall der hydrophileren MC8N-Im Catalipid
k
envergrößerung der Öltröpfchen in den Emulsionen aus.
10N-Im Dispersionen (siehe Abbildung 81) fiel nach 24 stündiger Reaktion ein
weißer Feststoff im NMR-Röhrchen aus. Dieser wurde im Ultraschallbad dispergiert und
mittels MALDI-TOF MS und 31P-NMR Spektroskopie analysiert. Auch hier
zeigte sich keinerlei Hinweis auf oligomere Reaktionsprodukte des 5’-GMPs 76
ten MC8N-Im Catalipid Emulsionen.
Zusammenfassend ergeben die 31P-NMR spektroskopischen Untersuchung zum M
Catalipid-Mizellen folgende Ergebnisse: Die gewünschte 3’-5’-Verknüpfung des eingesetzten
5’-GMP Nukleotids 76 zu oligomeren Reaktionsprodukten konnte nicht beobachtet werden.
Statt dessen wurde in Abhängigkeit von der Lipophilie des eingesetzten MCN-Im
und zwar verstärkt vom MC6N-Im 91 über MC8N-Im 92 hin zum MC10N-Im 93
5’-5’-PP 96 gebildet. Inwieweit die in Tabelle 23 aufgeführten, unterschiedlich
ierten, verschiedenartigen Catalipid Emulsionen oder Dispersionen mi
fein dispergiert als kleine Öltröpfchen oder auch als unlösliche Feststoffe in den
anhand der visuellen Begutachtung nur grob qualitativ Reaktionslösungen vorlagen, konnte
bestimmt werden. Es ist wahrscheinlich, dass eine mit der Ausgangskonzentration korrelierte
Erhöhung der Pyrophosphat-Bildung übe
Reaktionspartner zu erk
Die Herstellung von Dispersionen mit MCH-Catalipiden (Histamin 7 als Grundgerüst) konnte
aufgrund der unzureichenden Löslichkeit der MC8H 85 und MC10H 86 Lipide im MES-Puffer
97 nicht durchgeführt werden. Auch die Verwendung eines 0.1 M HEPES-Puffers (pH = 7.2)
198
zeigte keine signifikante Verbesserung der Löslichkeit. Es konnten nur schnell
sedimentierende Dispersionen hergestellt werden. Die weitaus schlechtere Löslichkeit der
MCH-Catalipide (Histamin 7 als Grundgerüst) im Vergleich zu den MCN-Im Catalipiden
(1, 3-Aminopropylimidazol 72 als Grundgerüst) im wässrigen Medium, kann über die
Ausbildung von zusätzlichen intermolekularen WBB zwischen den Imidazol-Kopfgruppen
erklärt werden – so, wie sie in Kapitel 3.3.3.2 bereits beschrieben wurde.
yrophosphat Bildung
er aggregiert vorliegende Amphiphile
3.6.4 19F-NMR Spektroskopie zur Untersuchung des Aggregationsverhaltens fluorierter
Amphiphile
Die Einführung eines Fluoratoms in die Catalipid-Alkylkette, sollte durch 19F-NMR
Untersuchungen Informationen zu dem bis dahin nur rein visuell begutachteten Aggregations-
verhalten - und somit zur Kompartmentierung - über in ω-Position fluorierte Catalipid-
Analoga eröffnen, um die damit in direktem Zusammenhang stehende P
5’-5’-PP zu klären.
3.6.4.1 Theoretischer Hintergrund der 19F-NMR Spektroskopie zur CMC Bestimmung
fluorierter Amphiphile
In Aggregationsstudien von amphiphilen Molekülen wird über 19F-NMR Messungen die hohe
Sensitivität der chemischen Verschiebung des Fluor-Kerns durch die umliegende Umgebung
ausgenutzt. Die pysikochemische Mikroumgebung der in Wasser gebrachten amphiphilen
Moleküle wird maßgeblich von dem Grad ihrer Selbstaggregation bestimmt: Einzelne,
monomer auftretende Amphiphile befinden sich in einer hydrophilen Umgebung; aggregierte
Amphiphile hingegen, sind so angeordnet, dass sich ihre hydrophoben Alkylketten in eine
möglichst unpolare Umgebung begeben. Damit kommt es zur Ausbildung von Mizellen,
wobei die Alkylketten der so aggregierten Amphiphile ins Innere des Aggregats weisen, und
sich also in einer anderen chemischen Umgebung als die monomer, frei in Lösung
vorliegenden Amphiphile befinden. Die Abschirmung von Fluor Atomen der Amphiphile im
Inneren der Mizelle ist somit eine andere, als die außerhalb. Dies führt zu einem Hochfeld-
Shift des 19F-Resonanz Signals. So zeigen monomer od
diskrete, unterschiedliche Resonanzfrequenzen υ (υmon. bzw. υmic.; mon = monomer,
mic = Mizelle) und so auch unterschiedliche chemische Verschiebungen δ im 19F-NMR
199
Spektrum ( δmon bzw. δmic ). Da jedoch die Austauschrate der amphiphilen Moleküle zwischen
monomerem und mizellarem Zustand zeitlich gesehen schneller ist (τ ≈ 10-6 s, siehe Kapitel
3.2.1.6) als die Relaxationszeit der 19Fluor-Nuklide bei der NMR-Messung, kann die
detektierte chemische Verschiebung des 19F-Signals δobs (obs = observiert) nur als ein
Mittelwert aus den chemischen Verschiebungen der jeweils monomer δmon bzw. mizellar δmic
auftretenden Moleküle gesehen werden. Die auftretende Linienverbreiterung des Fluor
Signals im Konzentrationsbereich der CMC zeigt somit einen schnellen Austauschprozess
wischen monomer- und mizellar auftretenden Amphiphilen an.[175, 176] Die konzentrations-
ge Änderung Δδ der chemischen Verschiebung des Fluor-Signals des zu
obs (bei einer bestimmten Konzentration) und der gemessenen
ischen Verschiebung des Moleküls in monomerer Form (unterhalb der
Δδ-Werten zeigen einen Hochfeld-Shift der chemischen
erschiebung des Fluor-Signals, im Vergleich zum monomer vorliegenden Amphiphil.
chem mel 16 gezeigt, beschrieben werden. Hierbei wird
δmon in ähnlicher Größenordnung
z
abhängi
untersuchenden Amphiphils kann aus der Differenz der observierten chemischen
Verschiebung δ
charakteristischen chem
CMC) δmon berechnet werden:
Δδ = δobs - δmon Formel 15
Mizellenbildung mit negativen
V
In Systemen, in denen nur eine fluorierte Spezies oberhalb ihrer CMC vorliegt, kann die
ische Verschiebung δobs wie in For
zentration bei der Messung von vorausgesetzt, dass die Kon
wie die der CMC ist.
δobs = (CMC / Ct) (δmon – δmic) + δmic Formel 16
Ct entspricht der totalen Konzentration des eingesetzten Amphiphils und δmic der chemischen
Verschiebung des Fluor-Signals im mizellaren Aggregat.[175, 177] Zur Bestimmung der CMC
mittels der erhaltenen NMR-Daten wird Δδ gegen die reziproke Konzentration des
Amphiphils aufgetragen. Nach Formel 15 und 16 besteht der Auftragung von Δδ gegen 1/Ct
ein linearer Zusammenhang und δobs entspricht δmon. Ein Abweichen von der Linearität - in
Form eines Knicks - entspricht der Bildung von Mizellen, d.h. der CMC des Amphiphils.[178-
180]
200
3.6.4.2 Synthese ω-fluorierter Catalipide
Um den beobachteten Zusammenhang zwischen Aggregation und erhöhter Pyrophosphat
Bildung von 5’-GMP 76 mit EDC 2 zu deuten (siehe Kapitel 3.6.3), wurden MCH- und
MCN-Im Catalipide synthetisiert, in deren Alkylketten in ω-Position ein Fluoratom eingeführt
wurde, um so über 19F-NMR Messungen gezielte Informationen sowohl über die
Aggregationseigenschaften dieser mit Fluor markierten Catalipide, als auch über die in der
Reaktion gebildeten Nukleotid-Fluor-Catalipid Konjugate zu erhalten.
Die Synthese der ω-fluorierten Catalipide wurde analog den unfluorierten in flüssiger Phase
durchgeführt. Zunächst erfolgte die Synthese von ω-Hydroxycarbonsäureethylestern
unterschiedlicher Alkylkettenlänge, variierend von 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, die
nachfolgend in die korrespondierenden ω-fluorierten Carbonsäuren überführt wurden, um
diese an s Histamin 7 oder 1,da 3-Aminopropylimidazol 72 zu koppeln (siehe Abbildung 82).
98 und 99, waren über eine selektive Verseifung die
Carbonsäuremonoethylester 100 und 101 zugänglich.
bbildung 82 Synthese der ω-Hydroxycarbonsäureethylester 104 und 105.
h Reduktion mit Natriumborhydrid durchgeführt. Die Reinigung der Rohprodukte
erfolgte chromatographisch.
O
Ausgehend von den käuflichen Diestern
O
A
Die Isolierung der Malonat-Analoga 100, 101 konnte aufgrund der unterschiedlichen
Löslichkeit der entsprechenden Di- bzw. Mono-Kaliumsalze in Ethanol erfolgen, eine
chromatographische Aufreinigung war nicht erforderlich.[45, 181] Die Umsetzung zu den Säure-
chloriden 102 und 103 erfolgte durch Behandlung mit Thionylchlorid.[182] Die anschließende
Synthese zu den korrespondierenden ω-Hydroxycarbonsäureethylestern 104 und 105 wurde
durc
O
OHn
O
O
Cln
O
O
O
OHn
O
O On
OKOH SOCl2
Ethanol
n = 6 n = 6 n = 6n = 8n = 8
68 %98 100 10253 %99 101 103n = 8
NaBH4DMF, THF
n = 6n = 8
45 %52 %
104105
201
Zur Ausarbeitung einer effizienten Synthesestrategie zur nukleophilen Substitution der
104, 105 und 106 gegen Fluor,
man - um mögliche Löslichkeitsprobleme zu umgehen - den kurzkettigen
it Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF)
als Reagenz und gleichzeitig als Phasentransferkatalysator in THF fluoriert und der ω-Fluor-
Hydroxylfunktion der ω-Hydroxycarbonsäureethylester
verwendete
ω-Hydroxyhexansäureethylester 106. Die Hydroxylfunktion wurde durch die Reaktion mit
para-Toluolsulfonsäurechlorid in Anwesenheit von Pyridin in eine aktivierte Abgangsgruppe
überführt (siehe Abbildung 83).
Abbildung 83. Fluorierung des ω-Hydroxyhexansäureethylesters 106.
Nach chromatographischer Aufreinigung wurde 107 m
ohexansäureethylester 108 chromatographisch aufgearbeitet.
Zur Verbesserung der Ausbeute setzte man Diethylamino-schwefeltrifluorid (DAST) 109
Fluorierungsmittel ein.[183] DAST ist bei Raumtemperatur flüssig und kompatibel m
aprotischen Lösungsmitteln wie Chloroform oder Dichlormethan, in denen die zu
fluorierenden langkettigeren ω-Hydroxycarbonsäureethylester 104, 105 und 106 eine sehr
gute Löslichkeit zeigen.
In einer typischen Reaktion zur Fluorierung mit DAST 109, wurde der ω-Hydroxy-
als
it inerten,
arbonsäureethylester unter Argonatmosphäre in Dichormethan gelöst, abgekühlt und dann
is 24 h bei Raumtemperatur
c
DAST 109 zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 12 b
unterbrach man die Reaktion durch Zugabe von Methanol. Die Aufreinigung erfolgte säulen-
chromatographisch.
OOH
O
OO
O
S
O
O
OF
O
S
O
O
Cl
CH Cl , Pyridin2 2
n-But4NF
THF
72 %
48 %
106 107
108
202
In Abbildung 84 ist repräsentativ für die anderen ω-Hydroxycarbonsäureethylester 104, 105
und 106 die Fluorierung mit DAST 109 am Beispiel des ω-Hydroxyoktansäureethylester 104
gezeigt.
Abbild nsäure-ethylesters
zu den
OH bei RT und verlief innerhalb von zwei Stunden nahezu quantitativ. Hierbei zeigte sich,
ω-Fluorocarbonsäure-
Abbildung 85. Synthetisierte ω-fluorierte Catalipide MCH-F 115, 116, 117 und MCN-Im-F 118, 119.
Alle beschriebenen Verbindungen, die zur Synthese von ω-fluorierten MCH-F 115, 116 und
117 und MCNIm-F 118 und 119 notwendig waren, wurden NMR-spektroskopisch analysiert.
NSF3
OOH
O
OF
O
CH2Cl2, RT104 110
109
83 %
ung 84. Direkte, selektive Fluorierung der ω-Hydroxylfunktion am Beispiel des ω-Hydroxyokta104 mit DAST 109 zum ω-Fluorooktansäureethylester 110.
ω-fluorierten Carbonsäureethylester 108, 110 und 111Die Verseifung der
korrespondierenden ω-fluorierten Carbonsäuren erfolgte in einer Mischung aus Methanol und
K
dass eine Temperaturerhöhung oder auch längere Reaktionszeiten zu einer Defluorierung der
Produkte führte.
Zur Synthese ω-fluorierter Catalipide wurden die entsprechenden
derivate 112, 113 und 114 mit dem Kopplungsreagenz DCC 73 an das Histamin 7 (R1) und an
das 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (R2) gekoppelt (siehe Abbildung 85).
O
Fn
NN N
H
NH
O
F n = 4 MC6 H-F n
NH
N
68 %115
n = 6 MC8 H-Fn = 8 MC10H-F
n = 6 MC8 NIm-Fn = 8 MC10NIM-F
73 %
32%
51 %
117
118
119
55 %116
R1
R2
203
3.6.4.3 Löslichkeitsversuche ω-fluorierter MCH-F und MCN-Im-F Catalipide
Das Aggregationsverhalten der dispergierten Fluor-Catalipide in gepufferter Lösung sollte
über 19
Beim zellar oder
aggregiert v lten der
eine stabilen, trüben Dispersionen bzw. Emulsionen mit den MCN-Im-F Catalipiden bei
nterschiedlichen Konzentrationen im 0.1 M MES-Puffer pD = 6.25 97. Die MC8N-Im-F
il emulgiert werden konnten.
eigten im MES-Puffer 97 ähnliche Löslichkeitseigenschaften wie die
H-F- und MCNIm-F-
atalipide, dass durch die Einführung des Fluor Atoms so erhebliche Änderungen im
unfluorierten Catalip
Um trotz unzureichend
it unfluorierten
gemi F-NMR Messungen
detektiert werden.
ur Durchführung solcher „Doping“-Experimente – im speziellen zur Mischung mit den
bereits
ω-fluorierten Catalipiden MCH-F und MCN-Im-F (siehe Kapitel
fluorierten Catalipide eine höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit im Aggregat oder der Lipid-
Doppellage zeigen, als kurzkettigere, hydrophilere Analoga.
F-NMR Untersuchungen geklärt werden.
Versuch trübe, stabile Dispersionen herzustellen, in denen die Lipide mi
orliegen, zeigte sich ein deutlich unterschiedliches Löslichkeitsverha
fluorierten Catalipide im Vergleich zu den unfluorierten (siehe Kapitel 3.6.3). Es bildeten sich
k
u
Catalipide 118 bildeten bereits ab einer Konzentrationen von 15 mM im MES-Puffer 97 große
ltröpfchen, die trotz Behandlung im Ultraschallbad nicht stabÖ
Das MC10N-Im-F Catalipid 119 zeigte eine weitaus schlechtere Löslichkeit im MES-
Puffer 97: Bei 5 mM Konzentration lagen nur größere, nicht zu dispergierende, feste
Bestandteile vor - selbst nach der Behandlung im Ultraschallbad.
Auch die synthetisierten MCH-F Catalipide 115, 116 und 117 - mit Histamin 7 als
Grundgerüst – z
unfluorierten MCH-F Catalipide. Es konnten keine stabilen, trüben Emulsionen bzw.
Dispersionen hergestellt werden.
So zeigte sich in den Experimenten zum Löslichkeitsverhalten der MC
C
Löslichkeitsverhalten entstanden, dass ein Rückschluss auf das Aggregationsverhalten der
ide nicht möglich war.
er Dispersionsstabilität fluorierte Catalipide zur Untersuchungen der
Aggregationseigenschaften von Catalipiden – ob in Mizellen oder auch in Vesikeln - zu
nutzen, sollten in „Doping“-Experimenten fluorierte Catalipide nur anteilig m
scht werden. Die Aggregation sollte so mit wenigen Sonden über 19
[209, 218]
Z
langkettigen MOH 39 und DOSH 54 Catalipiden - wurden zusätzlich zu den
hergestellten kurzkettigen
3.6.4.2) - zwei langkettigere - und damit hydrophobere ω-fluorierte Catalipide synthetisiert
(siehe Abbildung 86). Aufgrund der größeren Hydrophobie sollten diese langkettigen,
204
Ausgehend vom cyclischen Lacton Oxacycloheptadekan-2-on 120 konnte nach säure-
itat 121
e Abbildung 86).
ω-Fluoromethylpalmitat 122 chromatographisch gereinigt
25 Catalipiden umgesetzt wurde. Nach
r unfluorierten gegen die fluorierten Catalipide in den 31P-NMR
hgeführt.
katalysierter Ringöffnung und simultaner Veresterung das ω-Hydroxymethylpalm
erhalten werden (sieh
Abbildung 86. Synthese langkettiger ω-fluorierter Catalipide 124 und 125.
Die Substitution der Hydroxylfunktion durch Fluor erfolgte durch die Reaktion mit
DAST 109, wobei das erhaltende
wurde. Die anschließende Verseifung mit KOH in Methanol führte zu der ω-Fluoro-
palmitinsäure 123, die nachfolgend mit dem Kopplungsreagenz DCC 73 durch Reaktion mit
Histamin 7 oder entsprechend mit 1, 3-Aminopropylimidazol 72 zu den korrespondierenden
MC16H-F 124 und MC16N-Im-F 1
chromatographischer Reinigung erfolgte die Analyse der Fluor-Catalipide 124 und 125 NMR-
spektroskopisch. Auch die Fluor-Catalipide 124, 125 zeigten ein stark verändertes Löslich-
keits- und Aggregationsverhalten, was die Herstellung stabiler Emulsionen oder Dispersionen
im MES-Puffer 97 verhinderte.
Eine direkter Austausch de
Experimenten war daher nicht möglich, so dass auch über 19F-NMR Experimente keine
Untersuchung und damit keine Aufklärung der Kompartmentierung des Catalipid-Mizellen
Modells – und damit verbundener, erhöhter Pyrophosphat-Bildung 96 im Catalipid-Mizellen
Modell - erfolgen konnte. „Doping“-Experimente zur gezielten Herstellung eingestellter
fluorierter und unfluorierter Catalipid Mischungen, die zu stabilen Emulsionen oder
Dispersionen führen könnten, wurden aufgrund der vielfältigen und komplexen neuen
Reaktionsparameter im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durc
O
(CH2)14
NN N
HF
(CH2)14NH
ONH
N
F
OH (CH2)14 O
OO
O
(CH2)10
F (CH2)14 OH
O
F (CH2)14 O
O
DCC, TEA in CHCl3
a) Histaminb) 1, 3-Aminopropyl- imidazol
reflux
81 %
83 %
DAST, CHCl3
KOH in MeOH
96 %
55 %
63 %
5%ige H2SO4
in MeOH120
121
122
1237
72
124
125
205
Zusammenfassung und Ausblick
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung verschiedener Einzelschritte zur
chem alen
Chem neuen
me
charak (3).
individu e (1)
bis (3)
zu
können.
vielfältiger
(3) zu
on unterschiedlichen
atalipiden möglich: Im ersten Syntheseschritt wurden hierzu Imidazol-Derivate kovalent
h
ättigten wie auch ungesättigten, Catalipiden (siehe Tabelle 3).
realisiert. Durch die
ischen Implementierung des in Kapitel 1.5 beschriebenen Konzepts zum Minim
oton Modell (MCM). Dieses Konzept sollte experimentelle Ansätze zu einem
Protozell-Modell eröffnen, das durch die drei stöchiometrisch gekoppelten Subsyste
terisiert ist: das metabolische (1)-, das membranformende (2)- und das genetische
Aufgrund der Komplexität des heterotrophen1 MCMs und den damit verbundenen,
ellen Eigenschaften der zu kombinierenden Subsysteme, sollten die Subsystem
separat, d.h. abgekoppelt voneinander, umgesetzt und untersucht werden, um
anschließend die Zusammenführung zu einem MCM (siehe Abbildung 16) abschätzen
Ein zentraler Schritt zur Untersuchung des MCMs war die Synthese struktur
Catalipide (Lipide mit Imidazol als hydrophiler Kopfgruppe, siehe Aufgabenstellung 2.1), um
ten Anforderungen an die Subsysteme (1) - ihre Eignung zur Erfüllung der definier
evaluieren. Über Festphasensynthese war der modulare Aufbau v
C
über ihre Imidazolfunktion mit dem 2-Chlorotrityl-Linker der Festphase 9 verknüpft. Durch
orthogonale Schutzgruppen konnten – zielgerichtet - unterschiedliche Reaktionen am
immobilisierten Imidazol durchgeführt werden (siehe Abbildung 24). Zum einen konnten über
reduktive Aminierung zwei gesättigte Alkylketten gleicher Länge kovalent an die freie
Aminofunktion des immobilisierten Imidazol-Derivats gebunden werden. Dies führte zu
symmetrisc en Catalipiden unterschiedlicher Lipophilie (steuerbar über die Alkylkette des
Aldehyds), wie auch zu unterschiedlicher Hydrophilie (steuerbar über die Auswahl der
Imidazol-Festphase) (siehe Tabelle 2). Zum anderen erfolgte über Peptid-Kopplungs-
reaktionen, in Verbindung mit orthogonalen Schutzgruppenstrategien, der synthetische
Zugang zu asymmetrischen, ges
Auch war die Synthese komplexer, symmetrischer wie auch asymmetrischer Catalipide mit
Histamin und L-Histidin als Kopfgruppe erfolgreich, indem Nα-Fmoc-L-Serin 46 als
Verzweigungspunkt eingesetzt wurde (siehe Tabelle 4). Des Weiteren wurde ein Catalipid-
Phosphoglycerid – strukturverwandt mit natürlich vorkommenden, membranbildenden
Phospholiden – über die Festphasensynthese hergestellt. Hierzu immobilisierte man
orthogonal geschütztes L-Histidinol 8 über die Imidazolfunktion an den 2-Chlorotrityl-
Linkern der Festphase 9. Die anschließende Einführung der Phosphatgruppe wurde chemisch
durch den Einsatz eines geeigneten Phosphitylierungsreagenzes 50
206
Ver gonal geschützten Glycerol-Derivats 66 war
zudem der vollsynthetische Zugang zu enantiomerenreinen, asymmetrischen Catalipid-
unktion. Derartige Verbindungen können zur Destabilisierung des Endosoms führen
wendung des enantiomerenreinen, ortho
Phosphoglyceriden möglich (siehe Abbildung 35, Abbildung 36).[117]
Eine potentielle Anwendung der Festphasensynthese von Imidazol-enthaltenden Lipiden
könnte im Bereich der Synthese nicht-viraler Vektoren zur Transfektion liegen. Hierbei
werden bestimmte Nukleinsäuren (DNA, RNA, siRNA etc.) über die Ausbildung spezifischer,
elektrostatischer Lipid-Komplexe zum Gentransfer eingesetzt. Diese DNA-Lipidpartikel
werden über Endocytose in Zellen eingeschleust, wobei die Transfektionseffizienz stark von
der chemischen Struktur des Vektors – also vom eingesetzten Lipid - abhängt.[184, 185] Es ist
bekannt, dass Imidazol enthaltende Polymere, Peptide und Lipide besondere Transfektions-
eigenschaften zeigen, beeinflusst durch die schwach basischen Eigenschaften der
Imidazolf
und so die Transfektion von Wirkstoffen ins Cytosol der Zelle erleichtern, hervorgerufen
durch den sog. proton sponge effect.[186] Somit werden Lipide mit einer Imidazolfunktion im
Molekül, als pH-sensitive, fusogene Helfer-Lipide bei der Transfektion eingesetzt. Das
entwickelte Verfahren zum modularen Aufbau von Imidazol-enthaltenden Lipiden an der
festen Phase bietet einen synthetischen Zugang zu neuen Imidazol-Transfektionslipiden.
Die in dieser Arbeit hergestellten, strukturvielfältigen Catalipide wurden gemäß der
Aufgabenstellung (siehe 2.2) auf Ausbildung von großen, unilalamellaren Vesikeln (GUV)
untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl das einkettige MOH 39 als auch das zweikettige
DOSH 54 diesen Anforderungen gerecht wurde. Die Herstellung der MOH 39 und DOSH 54
Vesikel erfolgte zuerst über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode (Trocknung einer
organischen Lipidlösung und anschließende, vorsichtige Ablösung des Lipidfilms im
wässrigen Rehydrierungsmittel, siehe 3.2.4.2). Um den Einfluss von pH-Wert und
Konzentration des Rehydrierungsmittels auf die Vesikelbildung zu untersuchen, rehydrierte
man den Catalipid-Film in zwei unterschiedlichen Puffern: Natriumacetat-Puffer (4 und 40
mM; pH = 4 bis 5) und HEPES-Puffer (4 mM; pH = 7, 7.6). Die verschiedenen pH-Werte
wurden so gewählt, dass einerseits die Selbstaggregation im Bereich des pKa-Werts der
hydrophilen Imidazolfunktion (pKa = 5 für Histamin 7[132]) untersucht werden konnte, um so
den prinzipiellen Einfluss des Protonierungsgrades der Imidazol-Kopfgruppe auf das
Aggregationsverhalten der Catalipide zu erkennen. Andererseits wurde die Selbstaggregation
beim pH-Wert ≥ 7 untersucht, um gemäß der Aufgabenstellung die chemische
Implementierung des MCMs zu ermöglichen, da die Aminofunktion des nukleophilen
207
Reaktionspartners B hier möglichst unprotoniert vorliegen sollte (siehe genetisches
Subsystem (2), Abbildung 15).
Es zeigte sich, dass die ausgewählten Reaktionsbedingungen einen signifikanten Einfluss auf
onen
bidestilliertem Wasser. Die Größe und Morphologie der gebildeten Vesikel zeigte sich
die Entstehung, Morphologie und Stabilität der gebildeten MOH 39 - und DOSH 54 -
Aggregate ausübten. Das einkettige MOH 39 Catalipid bildete bei pH = 5 - in der Nähe des
pKa-Wertes der Imidazolfunktion - vesikuläre, helikale und plättchenartige Strukturen
nebeneinander, während sich bei pH < 5 ausschließlich Vesikel bildeten (siehe 3.2.6.1,
Tabelle 9). Eine mögliche Erklärung liegt in dem gleichzeitigen Vorkommen von protonierten
und unprotonierten Imidazol-Kopfgruppen, sowie der Möglichkeit der Ausbildung
intermolekularer Wasserstoffbrückenbindungen in zwei Ebenen (siehe 3.2.6.1, Abbildung 43
Ebene a und b) zwischen den MOH 39 Catalipiden in der Lipid-Doppellage. Das zweikettige
DOSH 54 hingegen, bildete ausschließlich Vesikel; andere Morphologien konnten in den
Dispersionen nicht aufgefunden werden. Dies könnte auf eine stärkere Protonierung der
Imidazol-Kopfgruppe (assoziationsbedingte Erhöhung des pKa-Wertes[133-135]) hindeuten, die
zu einer vergrößerten Kopfgruppenoberfläche a führen würde. Damit träten bevorzugt
kugelförmige, kleinere Strukturen auf.
Erste Untersuchungen bei pH = 7 von 4 mM MOH 39 und DOSH 54 Catalipid-Dispersi
in 4 mM HEPES-Puffer zeigten nur vereinzelt Vesikel (siehe Tabelle 13, B-30, Tabelle 14, B-
38), die zudem eine eingeschränkte Langzeitstabilität besaßen. Den Catalipid-Stammlösungen
wurden vor dem Dehydrierungs-Schritt unterschiedliche Konzentrationen Cholesterin 67
zugesetzt (siehe 3.2.8), um damit eine ausreichende sterische Spreizung der Imidazol-
Kopfgruppen zu erreichen, die zur Ausbildung vesikulärer Strukturen bei pH ≥ 7 notwendig
ist. Durch den gezielten Zusatz von Cholesterin zu den Lipid-Filmen konnten mit beiden
Catalipiden MOH 39 (10 mol % Cholesterin 67) und DOSH 54 (15 mol % Cholesterin 67)
große Vesikel (um 10 µm) über die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode auch unter
physiologischem pH-Wert hergestellt werden.
Um die notwendige Membrandurchquerung der Oligonukleotid-Catalipid Konjugate ins
Innere der Catalipid-Vesikel zu ermöglichen, sollten die Membranen möglichst unilamellar
und somit dünnwandig sein. Hierzu setzte man zusätzlich die Präparationsmethode der
Elektroformation am Pt-Draht (3.2.9.1) wie auch in einer ITO-Elektroformationskammer
(siehe 3.2.9.2) ein. Es zeigte sich, dass hiermit die Herstellung von großen und unilamellaren
Catalipid-Vesikeln (20 bis 40 µm) aus MOH 39 und DOSH 54 mit Cholesterin möglich war.
Die Rehydrierung der Catalipid-Filme erfolgte in beiden Verfahren unter Wechselspannung in
208
unabhängig vom gewählten Herstellungsprozess. Maßgeblich war allein die aufgetragene
Schichtdicke des Catalipid-Films.
er unbekannten - Eigenfluoreszenz könnte man auf
en benachbarten Imidazolfunktionen erfolgen
Zur Untersuchung der chemischen Implementierung des MCMs war im Rahmen des
genetisches Subsystem (2) die Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in
Catalipid-Vesikel notwendig. Hierzu etablierte man zwei unterschiedliche Präparations-
verfahren: Die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode (siehe 3.2.10.1) und die Gefrier-
trocknungs-Methode (siehe 3.2.10.2). Über die Gefriertrocknungs-Methode konnten
unilamellare, mit der markierten DNA 68 und 69 befüllte Vesikel aus MOH 39 / 10 mol %
Cholesterin und DOSH 54 / 15 mol % Cholesterin, hergestellt werden, die - verglichen mit
der Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode – unilamellar vorlagen.
Unerwarteter Weise zeigten die MOH 39- und DOSH 54 Catalipid-Vesikel (mit 10 bzw. 15
mol % Cholesterin Zusatz) in bidestilliertem Wasser eine grüne Eigenfluoreszenz bei einer
Excitationswellenlänge von 488 nm (siehe 3.2.11, Tabelle 19). Die Eigenfluoreszenz derartig
selbstaggregierter Moleküle könnte zur Visualisierung der Gestalt – auch komplexer
Aggregate - ohne zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe (Membrane Staining) genutzt werden.
Eine mögliche Erklärung dieser - bish
intermolekulare WBB in den Vesikelmembranen der MOH- und DOSH / Cholesterin
Catalipid-Vesikel finden, so wie sie in Abbildung 43 für das MOH 39 Catalipid schematisch
dargestellt sind. Die Aggregation durch intermolekulare WBB zwischen den Amidbindungen
der MOH Catalipide (siehe Abbildung 43, Ebene b), führt zur regelmäßigen Packung
(Fixierung) der hydrophilen Imidazol-Kopfgruppen. Die beobachtete Eigenfluoreszenz sollte
auf Wechselwirkungen benachbarter Imidazolfunktionen zurückzuführen sein.
Schlussfolgerungen aus den zitierten Veröffentlichungen (siehe Abbildung 51, Protonen-
abhängige Fluoreszenz eines G4 NH2-terminierten PAMAM-Dendrimers) unterstützen die
Hypothese, dass zum Energieabbau der aufgenommenen Strahlung ein energetisch
bevorzugter Wechsel der Protonen zwischen d
könnte (siehe Abbildung 43, Ebene a). Dieser Wechsel ließe sich weiter über die Nτ / Nπ-
Stickstoffatome benachbarter Imidazol-Kopfgruppen im Aggregat fortsetzten. Im Endeffekt
würde damit dieser Vorgang zu „springenden Protonen“ - von Imidazol-Kopfgruppe zu
Imidazol-Kopfgruppe - unter Eigenfluoreszenz im geometrisch fixierten Assoziat führen.
Als Leitfähigkeitsmechanismus der Protonen in Imidazol-Derivaten wird bevorzugt der
Grotthuß-Mechanismus[160] diskutiert, der übertragen auf die MOH Catalipid
Vesikelmembran, wie in Abbildung 53 schematisch dargestellt, verlaufen könnte. Die
Imidazol-Kopfgruppen werden durch intermolekulare WBB (Amidbindungen) ausgerichtet
209
und halten die Catalipide im Verbund. Der Protonentransport könnte entweder über Nτ / Nπ-
Stickstoffatome und / oder direkte Nπ / Nπ-Weitergabe („π-Stacking“ durch senkrecht zur
ldung 53).
zu
Zeichenebene angeordnete Imidazol-Kopfgruppen) des Protons im Aggregat vollzogen
werden. Die Hypothese des Protonentransfers innerhalb der Catalipid Vesikelmembranen,
verbunden mit der beobachteten Eigenfluoreszenz, wird durch die ausbleibende Eigen-
fluoreszenz des Catalipids 71 (1, 3-Aminopropylimidazol 72 als Kopfgruppe, siehe 3.2.12),
das im Imidazolring keine Protonierung ausbilden kann, bestätigt. Dieses Ergebnis deutet
zudem darauf hin, dass eine mögliche Nπ / Nπ-Weitergabe von Protonen - unter
Eigenfluoreszenz - zwischen den Imidazol-Kopfgruppen, weniger bevorzugt sein sollte, als
die Protonenweitergabe über die Nτ / Nπ-Stickstoffatome (siehe Abbi
Es wäre denkbar, dass ein gezielter Aufbau Imidazol-enthaltender Membranen über Selbst-
aggregationsprozesse Imidazol-enthaltender Lipide zu neuen protonenaktiven Membranen
führen könnte: Durch das sukzessive, selbstaggregations-bestimmte Abscheiden von
Catalipiden auf einer Matrix, wäre ein mehr oder weniger lamellarer Aufbau „geschichteter“
Membranen möglich. Eine abschließende, chemische Fixierung der Catalipide könnte - mit
kovalenter Bindung innerhalb und zwischen den Einzelschichten - durch UV- und / oder
chemische Vernetzungen erfolgen.
Zur Realisierung eines metabolischen Subsystems (1) war die Herstellung reaktiver DNA-
Catalipid Konjugate A notwendig (siehe Abbildung 14), wobei die einzusetzenden Catalipide
den speziellen Anforderungen des MCMs genügen sollten. Über umfangreiche
Vorexperimente mit Modellverbindungen wurden geeignete Reaktionsbedingungen etabliert,
die im Wässrigen nach EDC-Aktivierung eine Reaktion zwischen dem Cy5-TTCCGp
Oligonukleotid 3 und dem MOH 39 Catalipid zum Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74
ermöglichten (siehe 3.3.1, 3.3.2). Das Cy5-TTCCG-DOSH Konjugat konnte – möglicher-
weise aus sterischen Gründen – mit dem ausgearbeiteten Syntheseverfahren nicht hergestellt
werden.
Ligationsexperimente (siehe genetisches Subsystem (2), Abbildung 15) zwischen dem Cy5-
TTCCG-MOH Konjugat 74 und dem 5´-Amino-terminierten Oligonukleotid 4 im
Ligationspuffer 80[83, 98] waren aufgrund der unzureichenden Löslichkeit des Konjugats 74 im
erforderlichen Konzentrationsbereich nicht möglich (siehe Kapitel 3.4.1). Aufgrund
geringer Löslichkeit des Cy5-TTCCG-MOH Konjugats 74, wurden kurzkettigere,
hydrophilere und somit im Wässrigen löslichere Catalipide auf Basis von C6 (n-Hexansäure),
C8 (n-Oktansäure) und C10 (n-Dekansäure) mit Histamin 7 als Kopfgruppe hergestellt (siehe
3.3.3.1, Abbildung 60), um hiermit systematisch den Einfluss auf die Ligation zu untersuchen.
210
Es konnten erfolgreich alle reaktiven Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89 und 90
synthetisiert und isoliert werden. Analog dem Cy5-TTCCG-MOH Konjugat 74 zeigten auch
die hydrophileren Konjugate 88, 89 und 90 eine im wässrigen auftretende Hydrolyse der
Phosphorimidazolidbindung.
Um zusätzlich den Einfluss von Catalipiden mit 1, 3-Aminopropylimidazol 72 als hydrophile
Kopfgruppe in Konjugationsexperimenten mit dem Cy5-TTCCGp Oligonukleotid 3 zu
untersuchen, synthetisierte man die MC6, 8, 10 N-Im Catalipide 91, 92 und 93 (siehe 3.3.3.2,
Abbildung 64).
Die Experimente zur Herstellung reaktiver Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugate zeigten, dass
die Isolierung und Charakterisierung dieser Konjugate nicht möglich war, obwohl in RP-
regatzustände bei Raumtemperatur: die MC8, 10N-Im
aktionspuffer 77 zur Catalipid Konjugat Herstellung nur durch Zusatz von polaren
HPLC Analysen ein Signal mit ähnlichem Laufverhalten der analogen, isolierbaren
Cy5-TTCCG-MCH Konjugate detektiert werden konnte. Dies könnte auf eine schnellere
Hydrolyse der MCN-Im Konjugate im Aufreinigungsschritt hindeuten, wobei die
zwitterionische Struktur das MCN-Im Catalipid zur besseren Abgangsgruppe macht.[187]
Des Weiteren zeigten die MC8, 10N-Im Catalipide 92 und 93 (1, 3-Aminoprppylimidazol 72
als Kopfgruppe), verglichen mit den MC8, 10H Catalipiden 84 und 85 (Histamin 7 als
Kopfgruppe) unterschiedliche Agg
Catalipide lagen im flüssigen Aggregatzustand vor, die analogen MC8, 10H Catalipide 84 und
85 hingegen als Feststoffe. Zudem zeigten alle MCN-Im Catalipide eine bessere Löslichkeit,
im Reaktionspuffer 77 und konnten leicht emulgiert werden (bis auf das MON-Im 71 sogar
ohne DMF Zugabe). Sowohl die bessere Löslichkeit als auch der flüssige Aggregatzustand
der MC8, 10N-Im Catalipide 92 und 93 (1, 3-Aminopropylimidazol 72 als Kopfgruppe) deuten
- verglichen mit den MCH-Catalipiden - auf weniger ausgeprägte intermolekulare WBB
zwischen den Imidazol-Kopfgruppen hin.
Experimente zeigten, dass eine ausreichende Löslichkeit der MC6, 8, 10H Catalipide 84, 85 und
86 im Re
Lösungsmitteln (DMF, Acetonitril) erreicht werden konnte. Unter diesen
Reaktionsbedingungen sind die Catalipid-Vesikel jedoch nicht stabil, so dass eine „in-situ“
Reaktion zu Konjugaten neben den hergestellten Catalipid-Vesikeln in einem MCM nicht
umsetzbar war.
Um die nukleophile Ligationsreaktion (genetisches Subsystem (2), siehe 3.4, Abbildung 66)
zwischen reaktiven Cy5-TTCCG-Catalipid Konjugaten und dem Oligonukleotid
NH2-CGGAA 4 zu demonstrieren, konnten nur die kurzkettigeren - und damit hinreichend
löslichen - Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89 und 90 eingesetzt werden. Durch die
211
Verkürzung der Alkylketten war allerdings davon auszugehen, das diese Catalipide nicht
mehr in der Lage sein würden, große Catalipid-Vesikel auszubilden, wie das langkettige
MOH 39. Damit war eine Abkopplung des genetischen Subsystems (2) vom membran-
formenden Subsystem (3) erforderlich. In den Experimenten, in denen das MC6H- 88 und
iven Einfluss der Templat-Zugabe auf die langsam ablaufende Ligation zu
ipid-
hungen zeigten die charakteristische Fluoreszenz
dass Übergangsmetallionen, wie Co(II), Ni(II), Zn(II) und Cu(II) mit der
MC8CH- 89 als reaktives Konjugat eingesetzt wurde, konnte nach 24 stündiger Reaktionszeit
das Ligationsprodukt Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 nachgewiesen werden. Das MC10H
Konjugat 90 zeigte unter gleichen Reaktionsbedingungen schon keine Produktbildung mehr.
Um den qualitat
untersuchen, wurden 40 mol % Cy3-TTCCGCGGAA 5 der Reaktionsmischung zugesetzt.
Innerhalb von 3 bis 4 Stunden konnte jetzt in allen Fällen Produktbildung von
Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 nachgewiesen werden. Eine kinetische Untersuchung der
Ligation konnte aufgrund der geschilderten Probleme nicht durchgeführt werden. Dennoch
demonstrierte die Untersuchung der experimentell vereinfachten Ligation mit kurzkettigen
Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten, dass die templatgesteuerte Ligation über Catal
Aktivierung zu neuen Templat Molekülen führt.
Die Ergebnisse der separat untersuchten Subsysteme zeigten, dass ein Kombinationserfolg zu
einem MCM – wenn überhaupt - nur in einem sehr engen Toleranzbereich gemeinsamer
Reaktionsbedingungen möglich sein würde.
Zur Verknüpfung des metabolischen Subsystems (1) mit dem membranformemden Sub-
system (2) sollte die Phosphorimidazolidbindung direkt auf den bestehenden Vesikeln erzeugt
werden, indem die nach außen zur Lösung zeigenden Imidazol-Kopfgruppen der Catalipide,
mit dem EDC-aktivierten Oligonukleotid Cy3-TTCCGp 69 reagieren (siehe 3.5, Abbildung
68). Fluoreszenzmikroskopische Untersuc
des Cy3-Farbstoffs des Oligonukleotids 69, lokalisiert auf den MOH-Vesikelmembranen (mit
10 mol % Cholesterin Zusatz). Hieraus ließ sich nicht entscheiden, ob es zu einer Phosphor-
imidazolid-Bildung oder nur zu unspezifischen Wechselwirkungen der Cy3-TTCCGp 69
Oligonukleotide mit den Membranen kam. Eine Erhöhung der EDC- und Puffer-
konzentrationen zur Reaktionsbeschleunigung führte zu einer Zerstörung der MOH-Vesikel.
Es ist bekannt,
Imidazolfunktion wechselwirken und spezifische Komplexe ausbilden.[168] Eine Stabilitäts-
erhöhung der MOH-Vesikelmembran (mit 10 mol % Cholesterin Zusatz) durch
überbrückende Metallionen konnte weder durch Zugabe vor noch nach Rehydrierung der
Catalipid-Filme erzielt werden.
212
Eine Kombination der zunächst separat voneinander erarbeiteten Subsysteme (1), (2) und (3)
zu einem MCM war mit den erhaltenen Ergebnissen nicht möglich. Die einzelnen Subsysteme
unterschieden sich zu stark bezüglich ihrer spezifisch erforderlichen Reaktionsbedingungen.
Es wurde daraufhin ein vereinfachtes Modell-System - unter Berücksichtigung der grund-
legenden, chemischen Reaktionen und Reaktionsbedingungen der separat untersuchten
Subsysteme (1) bis (3) - entworfen, in dem die Replikation an ein vereinfachtes
metabolisches- und kompartmentierendes Subsystem gekoppelt ist: Das Catalipid Mizellen
Modell (siehe 3.6, Abbildung 73). Das metabolische System stellte die Reaktion von 5’-GMP
76 mit EDC 2 in Anwesenheit von emulgierten und /oder dispergierten Catalipiden dar
(Reaktion zu P* und PIm, Abbildung 72) und sollte über zeitaufgelöste 31P-NMR
Spektroskopie untersucht werden. Das genetischen Systems würde – im Idealfall - die
Reaktion zu 3’-5’-verknüpften Nukleotiden oder auch zur 5’-5’-Pyrophosphat-Bindung PP)
darstellen, beeinflusst durch die Aggregationseigenschaften der eingesetzten Catalipide (siehe
Abbildung 74).
In ersten Experimenten zum Catalipid-Mizellen Modell setzte man sowohl die unfluorierten,
urzkettigen MCN-Im 91, 92, 93 Catalipide, als auch die unfluorierten kurzkettigen MCH 84,
lipids entsprechende Emulsions- und Dispergier-
osphat Bildung 5’-5’-PP 96 zu erkennen ist.
k
85, 86 Catalipide (Histamin 7 als Kopfgruppe) ein.
Konzentrationsabhängige Löslichkeitsuntersuchungen der MCN-Im Catalipide im MES-
Puffer 97 [169] zeigten der Lipophilie des Cata
eigenschaften (siehe 3.6.2, Tabelle 23). Das MC6N-Im 91 Catalipid emulgierte nur zu einer
instabilen, schnell aufklarenden Emulsion.
Die 31P-NMR Analyse der 10 mM MC6N-Im 91 Emulsion mit 5’-GMP 76 in MES-Puffer 97
(0.2 M EDC) (siehe Abbildung 79) gab im Reaktionsverlauf keinen signifikanten Hinweis auf
eine Kompartmentierung einzelner Reaktionsteilnehmer, verglichen mit der analog
durchgeführten Referenzreaktion (10 mM N-Methylimidazol 95, siehe Abbildung 77). 31P-NMR Experimente mit 40 mM und 60 mM der mehr oder weniger stabilen MC8N-Im
Catalipid Emulsionen (siehe Tabelle 23) zeigten hingegen, eine im Vergleich zur 40 mM
N-Methylimidazol 95 Referenzreaktion erhöhte Pyrophosphat 5’-5’-PP 96 Bildung. Die
Konzentration des MC8N-Im Catalipids 92 (40 mM oder 60 mM) zeigte keinen signifikanten
Einfluss auf den Reaktionsverlauf (siehe Abbildung 80). Dies ließ auf eine
Phasengrenzflächen-Reaktion schließen, wobei die Erhöhung der Catalipid Konzentration auf
60 mM wahrscheinlich nur zu größeren Öltröpfchen mit für den Reaktionsverlauf nicht
relevant erhöhter Oberfläche führt, so dass in diesem Bereich keine signifikant
konzentrationsabhängige Pyroph
213
Die MC10N-Im 93 Catalipide konnten in Konzentrationen von 5, 8 und 10 mM stabil im
MES-Puffer 97 dispergiert werden (siehe Tabelle 23). Hier zeigte sich im Vergleich zu den
kurzkettigeren MC8N-Im 92 Catalipiden in 31P-NMR Untersuchungen eine konzentrations-
abhängige Zunahme des gebildeten 5’-5’-PP Pyrophosphats 96 (siehe Abbildung 81). Dieses
Beobachtung wurde dahingehend gedeutet, dass die lipophileren MC10N-Im Catalipide
Aggregate in Form von Mizellen ausbilden: Durch die Konzentrationserhöhung wird die
Anzahl der Mizellen in Lösung erhöht und damit - im direkten Zusammenhang - die
Oberfläche potentieller Reaktionsräume - und nicht lediglich das Volumen der Mizellen, wie
für die 31P-NMR-Untersuchungen zum hydrophileren MC8N-Im Catalipid Emulsionen
interpretiert.
In den 31P-NMR Untersuchungen zum Catalipid-Mizellen Modell konnte die gewünschte
3’-5’-Verknüpfung zu oligomeren Reaktionsprodukten nicht beobachtet werden: Statt dessen
wurde in Abhängigkeit von der Lipophilie des eingesetzten MCN-Im Catalipids - und zwar
verstärkt vom MC6N-Im 91 über MC8N-Im 92 hin zum MC10N-Im 93 Catalipid – Pyro-
stoffe in den Reaktionslösungen vorlagen,
durch
phosphat 5’-5’-PP 96 gebildet. Inwieweit die in Tabelle 23 aufgeführten, unterschiedlich
konzentrierten, verschiedenartigen Catalipid-Dispersionen mizellar oder nur fein dispergiert
als kleine Öltröpfchen oder auch als unlösliche Fest
konnte anhand der visuellen Begutachtung nur grob qualitativ bestimmt werden. Es ist
wahrscheinlich, dass eine mit der Ausgangskonzentration korrelierte Erhöhung der
Pyrophosphatbildung über eine verstärkte Mizellenbildung einzelner Reaktionspartner zu
erklären ist (siehe Abbildung 81).
Dispersionen aus MCH-Catalipiden (Histamin 7 als Grundgerüst) konnten weder im MES-
Puffer 97 noch im 0.1 M HEPES-Puffer (pH = 7.2) hergestellt werden.
Detaillierte Informationen zum Aggregationsverhalten - und somit zum kompartmentierenden
System des Catalipid-Mizellen Modells - sollten über ω- fluorierte Catalipid-Analoga19F-NMR Untersuchungen erhalten werden. Die Synthese dieser ω-fluorierten Catalipide
erfolgte über ω-Hydroxycarbonsäureester unterschiedlicher Alkylkettenlänge (variierend von
6 bis 16 Kohlenstoffatomen), die nachfolgend in die korrespondierenden, ω-fluorierten
Carbonsäuren 112, 113, 114 und 123 überführt wurden und abschließend mittels DCC 73 an
das Histamin 7 oder das 1, 3-Aminopropylimidazol 72 gekoppelt wurden.
Im MES-Puffer 97 zeigten sowohl die ω-fluorierten MCH-F 115, 116, 117 und 124 als auch
die ω-fluorierten MCN-Im-F 118, 119, 125 Catalipide ein im Vergleich zu den analogen,
unfluorierten ein deutlich verschlechtertes Löslichkeitsverhalten. Es konnten keine trüben,
214
stabilen Emulsionen und / oder Dispersionen hergestellt werden, so dass konzentrations-
abhänige 19F-NMR Analysen nicht durchgeführt werden konnten.
Es wurde nicht untersucht, in wieweit über „Doping“-Experimente - d.h. unfluorierte
Catalipide werden mit ω-fluorierten gemischt – das Aggregationsverhalten dennoch über 19F-NMR Messungen detektiert werden kann.[209, 218]
Obwohl letztendlich kein in sich abgeschlossenes MCM chemisch implementiert werden
konnte, ergaben sich einerseits, sowohl in den separat entwickelten Subsystemen (1) - (3) als
auch in dem ergänzend untersuchten Catalipid-Mizellen Modell, interessante Zusammen-
hänge im Rahmen der Selbstorganisation sowie von Reaktionsabläufen in der Ligation.
Anderseits stieß man auch auf klare Grenzen, deren Überwindung weiterer, intensiver
Forschung bedarf.
215
Experimenteller Teil
1 Spektroskopische Methoden
1.1 Magnetische Kernresonanzspektroskopie (NMR)
n: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett,
mc = zentriertes Multiplett, br = verbreitertes Signal, J = Kopplung in Hertz. Die 13C-Spektren
wurden unter 1H-Breitbandentkopplung aufgenommen.
1.2 Massenspektrometrie
1.2.1 Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB)
Die FAB-Massenspektren wurden mit dem Gerät VG Autospec bei einer Beschleunigungs-
spannung von 8 kV gemessen. Die Ionisierung erfolgte durch Beschuss mit Cs+-Ionen. Als
Matrizes wurden 3-Nitrobenzylalkohol, Glycerin und Milchsäure verwendet.
1.2.2 Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI)
Die Aufnahme der ESI-Massenspektren erfolgte mit dem Massenspektrometer LC Esquire der
Firma Bruker.
1.2.3 Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight (MALDI-TOF)
Die Massenspektren wurden mit folgenden Massenspektrometern aufgenommen:
a) Voyager-DETM-Massenspektrometer der Firma PerSeptive Biosystems
Laser: N2 (337 nm)
Negative Ion- und Reflector-Mode.
b) Autoflex II-Massenspektrometer der Firma Bruker
Laser: N2 (337 nm)
Als Matrices wurden 3-Hydroxypicolinsäure (HPA) und 2,4,6-Trihydroxyacetophenon
(THAP) verwendet.
Alle 1H- und 13C-Spektren wurden an den Geräten DPX 200 (200 MHz), DRX 400 (400
MHz) der Firma Bruker aufgenommen. Die 31P- und 19F-Spektren wurden mit einem DPX-
250 Gerät (250 MHz) der Firma Bruker aufgenommen. Die Angabe der chemischen
Verschiebung δ erfolgt in ppm. Die charakteristischen chemischen Verschiebungen der
Lösungsmittel wurden zur Kalibrierung der Spektren verwendet.[188] Kennzeichnung der
Signalmultiplizitäte
216
1.3 UV/VIS-Spektroskopie
Die UV-Spektren wurden mit dem Modell Cary 13E der Firma Varian aufgenommen. Die
fgereinigten Oligonukleotide und Catalipid-DNA
ktionskoeffizient Inkremente ε
Konzentrationsbestimmung der au
Konjugate erfolgte durch Addition folgender Extin-1[l mol-1cm ] bei pH 7 und 25°C unter Verwendung des Lambert Beer’schen Gesetzes:
Tabelle 24. Inkremente für die Bestimmung der molaren Extinktionskoeffizienten der Oligonukleotide, sowie der DNA-Catalipid Konjugate.
Nucleotid Inkrement [l mol-1cm-1]
G 13679
A 13200
T 7250
C 6541
Cy3 4930a, 136000b
Cy5 10000a, 250000c
[a] angegeben für λ = 260 nm. [b] angegeben für λ = 548 nm. [c] Für λ = 648 nm[155]
2 Mikroskope
oskopen durchgeführt:
d dem Objektiv
e Aufnahmen wurden mit einer gekühlten
ommen. Zur fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung positionierte man ein
U-MWIG-Filterset (ex; 520–550 nm, dichroitische Teilung bei 565 nm; Sperrfilter von > 580
40; optische Linse
it einer CCD-Kamera (U-CMAD3, Olympus Japan) mit einem
ystem aufgenommen.
anning-Mikroskop (Leica TCS SP2 AOBS). Anregungswellenlängen 458
von Christina Klein-Schmidt (Biochemie I, Ruhr-Universität Bochum)
durchgeführt.
Die mikroskopischen Analysen wurden an unterschiedlichen Mikr
Mikroskop 1:
Inverses Fluoreszenzmikroskop IX71 der Firma Olympus. Optische Linse x40; optische Linse
x100 (N. A. = 1.35). Zur x100 Vergrößerung wurde zwischen Objektträger un
Immersionsöl (Olympus Co., Japan) eingesetzt. Di
CCD-Kamera (DP30BW, Olympus Japan) mit einem Image-Recording und –processing
System aufgen
nm, Olympus, Japan) in den Strahlengang.
Mikroskop 2:
Inverses Fluoreszenzmikroskop IX51 der Firma Olympus. Optische Linse x
x20. Die Aufnahmen wurden m
Image-Recording und –processing S
Mikroskop 3:
Konfokales Laser-Sc
nm, 476 nm, 488 nm, 514 nm, 543 nm, 568 nm, 594 nm, 633 nm. Die mikroskopischen
Aufnahmen wurden
217
3 Chromatographische Methoden
ßendes
)
54 nm).
3.2 Säulenchromatographie
Verwendetes Kieselgel: ICN Biomedicals, Silica 60Å, Korngröße 0.032 – 0.063 mm.
3.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC System: mpe: 4
Mischkammer: 494 (
430 (Kontron)
Software: Kroma System 2000
,
(Cy3) und 648 nm (Cy5).
Arbeitsgeräte
ort, Eppendorf
MinicyclerTM, PTC 150, MJ Research
gsanalge Alpha 1-2, Christ
3.1 Dünnschichtchromatographie
Es wurden Fertigfolien SIL G/UV254 der Firma Macherey & Nagel (40 x 80 mm, Schichtdicke
0.25 mm Kieselgel, Fluoreszenzindikator) verwendet. Detektion erfolgte (a) durch Anfärben
mit einer Lösung von 5 g Molybdatophosphorsäure in 100 ml Methanol und anschlie
Erhitzen auf T > 120°C, (b) durch Behandlung mit elementarem Iod (Iodkammer) oder (d
Bestrahlen mit UV-Licht (2
Pu 20 (Kontron)
M Kontron)
Autosampler: 460 (Kontron)
UV-Detektor:
Die Detektion der Oligonukleotide bzw. der Oligonukleotidkonjugate erfolgte bei 254 nm
270 nm, 548 nm
Eingesetzte Säulen für die analytische RP-HPLC:
Machery-Nagel: Nucleosil 120-5, C18, 4.0 x 250 mm
Zur Auftrennung verwendete man einen 0.1 M NH4CO3-Puffer (pH 8.5) gegen einen
Acetonitril Gradienten.
Gradient A: 25 % → 30 % in 35 min
Gradient B: 20 % → 65 % in 1 h
4 Sonstige
Zentrifugen GS 15R, Beckmann und 5415 C, Eppendorf
Pipetten Eppendorf
Schüttler Thermomixer Comf
Thermocycler
SpeedVac Konzentrator Savant
Vortex Vortex Genie 2, Scientific Industry
Frequenzgeneratur PC Function Generator PCG 10/8016, Vellemann
Gefriertrocknun
218
5 Chemikalien
5.1 Verwendete Lösungsmittel
Acetonitril, Dichlormethan, N-Ethyl-diisopropylamin, Pyridin und Triethylamin wurden über
Calciumhydrid refluxiert und destilliert.
Aceton wurde über Phosphorpentoxid refluxiert und destilliert.
Cyclohexan und Ethylacetat wurden destilliert.
Diethylether und Tetrahydrofuran wurden über Natrium refluxiert und destilliert.
EDC Merck
Biotech GmbH
Aldrich
Iris Chemicals
vabiochem
ABCR
Aldrich
ABCR
AppliChem, Biomol
5.2 Chemikalien
Die folgenden Chemikalien wurden bei den jeweils angegebenen Herstellern bezogen:
DCC Aldrich
HBTU Biosolve
5-Benzylmercaptotetrazol emp
Tritylchlorid Fluka
5`-GMP (x H O, 2 x Na+) Aldrich2
Bernsteinsäureanhydrid Merck
Histamin (Base) Aldrich
1, 3-Aminoproppylimidazol
2-Chlorotrityl-Fmoc-Histamin Festphase
2-Chlorotrityl-chlorid Festphase No
Diethylsuberat ABCR
Diethylsebacat
Oktylaldehyd
DAST
HEPES
MES AppliChem
5-Benzylmercaptotetrazol (5-BMT) emp Biotech GmbH
Glycerin Baker
N,N-Dimethylformamid Biosolve
Dichlormethan Biosolve
Alle übrigen Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, in p.a.- bzw. „zur
Synthese“-Qualität verwendet.
219
6 Synthesen selektiv geschützter Histidin-Derivate
6]
Unter Argon wurden 3.1 g (20 mmol) L-Histidin (155.16 gmol ) 6 und 2.42 ml (20 mmol)
(M = 129.06 gmol-1; ρ = 1.06 gcm-3) in 30 ml Dichlormethan
peratur
hitze die Suspension für weitere
kose Masse. Nachfolgend wurde
ml Dichlormethan und 2.78 ml
temperatur wurde zu
nd nachfolgend das Lösungsmittel
Wasser suspendiert und ein pH-
mit 60 ml Chloroform gewaschen
d wusch diesen ein weiteres Mal
den 5.82 g (14.6 mmol, 73.21 %)
, ArH, N=CHNH, C=CHNH), 3.8
6.1 N -Trityl-L-Histidin 13 im [10
-1
Dichlorodimethylsilan
suspendiert und für vier Stunden unter Refluxieren erhitzt. Nachdem auf Raumtem
abgekühlt wurde, gab man 5.58 ml TEA hinzu und er
15 Minuten zum Refluxieren. Es entstand eine weiße, vis
5.58 g (20 mmol) Tritychlorid (278.78 gmol-1), gelöst in 20
TEA, langsam zugetropft. Nach einer Reaktionszeit von 12 h bei Raum
der Lösung ein Überschuss von 10 ml Methanol gegeben u
in Vakuum entfernt. Der weiße Feststoff wurde in 120 ml
Wert von 8 durch Zugabe von TEA eingestellt. Nachdem
wurde, saugte man den Feststoff über eine D4-Fritte ab un
mit Chloroform. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum wur
eines weißen Feststoffes erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3,CD3OD):δ= 7.7-7.1 (m, 17H
(m, 1H, CH2HCCOO), CH2im (m, 2H, 3.1-2.8).
C25H23N3O M = 397.48 gmol-1
O
OH
NH2
NN
220
6.2 N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)-succinimid (Fmoc-OSu) 12
Zu einer Lösung aus 8 g (30.9 -1) in 50 ml Dioxan und 4.3 ml
TEA wurde unter Eisbadkühlung 3.91 id (115.08 gmol-1),
l
ol 1
α-Fmoc-Nim-Trt-L-Histidin 14
In 10 ml 10 % iger Na2CO3-Lösung und 10 ml Dioxan wurden 2 g (5 mmol) Nim-Trityl-L-
Histidin 13 suspendiert. Hierzu wurden unter Eisbadkühlung 1.61 g (5 mmol) Fmoc-OSu 12,
gelöst in 8 ml Dioxan, getropft. Nach einer Reaktionszeit von zwei Stunden wurde mit 100 ml
Wasser verdünnt und nacheinander mit je 100 ml Diethylether und Essigsäureethylester
gewaschen. Die wässrige Phase wurde anschließend mit verdünnter Salzsäure auf pH 2
OO
mmol) Fmoc-Cl (258.7 gmol
g (34 mmol) N-Hydroxysuccinim
gelöst in 20 ml Dioxan, getropft und anschließend für zwei Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Der ausgefallene weiße Niedersch ag wurde über eine D3-Fritte abgesaugt und
mehrfach mit Dioxan gewaschen. Das Filtrat, ein gelbliches Öl, wurde mit 20 ml Petrolether
verrührt und der ausfallende weiße Feststoff abgesaugt und ein weiters Mal mit Petrolether
gewaschen. Nach Trocknen im Vakuum wurden 8.73 g (27.17 mmol, 88 %) eines weißen
Feststoffes erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3,):δ= 7.76 (d, 2H, ArH), 7.62 (d, 2H, ArH), 7.45 (d, 2H, ArH),
7.32 (d, 2H, ArH), 6.82 (d, 2H, CHCH2CO), 4.52 (t, 1H, CHCH2CO), 2.84 (s, 4H,
COCH2CH2CO).
C19H15NO4 M = 321.24 gm -
6.3 N
ON
O
O
NH
O
NN
O
OH
221
gestellt und mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
ittels wurde das
Lösungsmittel im Vakuum g (3.9 mmol, 78 %) eines gelben
Feststoffes erhalten.
istidin 15
mol) Nα 4 wurden 10 ml 95 % ige TFA gegeben und
r eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Säure im Vakuum
entfernt und mehrmals nacheinander mit Essigsäureethylester und Dichlormethan
einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser und
1 N Salzsäure (6:3:1) wurde das Rohprodukt it einem Gemisch von
Chloroform/Methanol/33 % iger utionsmittel chromatographiert,
wobei 850 mg (2.25 mmol, 70.3 eines weißen Feststoffes
isoliert wurden.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3,CD ,2H, ArH), 7.4 (2H, ArH),
wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und nach Abfiltrieren des Trockenm
entfernt. Es wurden 2.4
1H-NMR (200 MHz,DMSO):δ= 7.7-7.1 (m, 25H, ArH, N=CHNH, C=CHNH), 6.4 (d, 2H,
CHCH2CO), 4.7 (t, 1H, CHCH2CO), 3.9 (m, 1H, CH2HCCOO), CH2im (m, 2H, 3.1-2.8).
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+:620.73. Gefunden: 619.9
C40H33N3O M = 619.73 gmol-1
6.4 Nα-Fmoc-L-H
O
Zu 2 g (3.2 m -Fmoc-Nim-Trt-L-Histidin 1
fü
coevaproiert. Nach Lyophilisieren mit
an Kieselgel60 m
Essigsäure (95:5:1) als El
%) der Zielverbindung in Form
3OD):δ= 7.7 (d ,2H, ArH), 7.5 (d
7.2 (sbr, 1H, N=CHNH), 7.1 (2H, ArH), 6.9 (sbr, 1H, C=CHNH), 6.6 (d, 2H, CHCH2CO), 4.5
(t, 1H, CHCH2CO), 4.1 (m, CH2HCCOO), CH2im (m, 3-2.8).
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+:378.40. Gefunden: 378.1.
C21H19N3O4 M = 377.40 gmol-1
NH
O O
OHNHN
222
7 Hexadekanal 23[110]
In 200 ml Dichlormethan wurden 10 g (41 mmol) 1-Hexadekanol (242.44 gmol-1) gelöst und
mittels eines Eisbades auf 0 ºC abgekühlt. Nachfolgend wurden 5.84 ml absolutes DMSO
(
mol)
u der Lösung getropft und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von
i ein und extrahierte mehrfach
han. ie ve n Phasen wurden dreimal mit gesättigter
chloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem das
Trockenmittel abfiltriert wurde, entfernte man das Lösungsmittel im Vakuum. Das
0 mit einer Mischung von Cyclohexan/Ethylacetat (4:1) als
Elutionsmittel chromatographiert. E mmol, 67 % der Theorie) eines
wachsartigen, weißen Feststoffes erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ , 2H, CH2CHO), 1.5 – 1.25 (m,
26 H (CH2)13), 0.9 (t, 3H, CH3).
H
O
82 mmol) und 11.7 g (82 mmol) Phosphorpentoxid hinzugegeben und bei Raumtemperatur
für eine Stunde gerührt. Nach erneutem Abkühlen auf 0 ºC wurde 20 ml TEA (143.5 m
z
50 ml 10 % iger Salzsäure stellte man einen pH-Wert von zwe
mit Dichlormet D reinigten organische
Natrium
Rohprodukt wurde an Kieselgel6
s wurden 6.60 g (27.47
= 9.7 (t, 1H, CH2CHO), 2.4 (m
C16H32O M = 240.43 gmol-1
223
8 N, N-Succinyl-dioktadecylamin (DODA-Suc) 43[113]
, 3 COOH, 172.69 (NCO), 48.32 (CH2CH2N), 46.69
CH2CH2N), 31.94 (NCOCH2), 30.39, 29.72, 29.38, 28.82, 27.66, 27.03, 26.91
(
40H79NO3 M = 622.08 g mol-1
Zu einer Lösung von 1.04 g (2 mmol) N, N-Dioktadecylamin 45 (kommerziell erhältlich) in
20 ml absolutem Pyridin wurden 400 mg (4 mmol) Bernsteinsäureanhydrid gegeben und für
zwölf Stunden zum Refluxieren erhitzt. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum entfernt
wurde, löste man den weißen Feststoff in Dichlormethan und wusch mehrfach mit
1 N Salzsäure und abschließend mit Wasser. Nach Umkristallisation aus Aceton wurden
1.02 g (1.65 mmol, 82.7 % der Theorie) eines weißen Feststoffes erhalten, der der
Titelverbindung entsprach.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 3.26 (mc, 4H, CH2N), 2.67 (mc, 4H, CH2CO), 1.53 (mc, 4H,
CH2CH2N), 1.25 (mc, 60 H CH3(CH2)15), 0.87 (mc, 6 H CH3).
13C NMR (55.3 MHz CDCl ): δ = 176.47 (
OH
(
CH3(CH2)13CH2N), 22.70 (CH3CH2CH2), 14.79 (CH3CH2), 1.58 (CH3CH2).
C
O
N
O
224
9 Herstellung der L-Histidin beladenen 2-Chlorotrityl-Festphasen 11, 16 und 19
9.1 2-Chlorotrityl-ch
istidin-Festphase 11
304 μl (2.5 mmol) Di-chloro-
fluxieren. Nach
bkühlen auf Raumtemperatur gab man zu der weißen Suspension 3.12 g 2-Chlorotrityl-
h se 9 (5 mmol bezogen auf eine 1.6 mmol Beladung der Festphase 9) und
hrte weitere 4 h bei Raumtemperatur. Zur Abspaltung der zyklischen Dimethylsilyl-
Schutzgruppe versetzte man die Suspension mit 10 ml einer Lösung aus Dichlormethan,
Diisopropylethylamin (DIPEA) und Methanol (85:5:15, v/v), wobei hierbei gleichzeitig die
nicht abreagierten Tritylchlorid-Gruppen des Linkers der Festphase 9 zu den korres-
pondierenden, inerten Tritylethern umgesetzt wurden. Nachfolgend transferierte man die
Lösung in eine Festphasenfritte, spülte die Festphase ausgiebig nacheinander mit Methanol,
Dichlormethan und Chloroform.
Zur Kontrolle der erfolgreichen kovalenten Verknüpfung des L-Histidins 6 über die
Imidazolfunktion mit der 2-Chlorotrityl-chlorid-Festphase 9 wurde der Kaisertest
durchgeführt.[107] Hierzu stellte man drei Lösungen her, die direkt vor dem Test 1:1.1 (v/v)
gemischt wurden. Lösung 1: 50 mg Ninhydrin in 1 ml Ethanol; Lösung 2: 8 g Phenol in 2 ml
Ethanol; Lösung 3: 2 ml einer 0.001 M Lösung aus Kaliumcyanid in 98 ml Pyridin.
lorid-Festphase 9.
Die Polymermatrix besteht aus Polystyrol, quervernetzt mit einem Prozent Divinylbenzol, die
mittlere Beladung liegt zwischen 1.00 – 1.60 mmol / g bei 100 – 200 mesh.[189]
9.2 Herstellung der L-H
Unter Argon wurden 388 mg (2.5 mmol) L-Histidin 6 und
dimethylsilan (M = 129.06 g mol-1; ρ = 1.06 g cm-3) in 20 ml Dichlormethan suspendiert und
für vier Stunden unter Refluxieren erhitzt. Nachdem auf Raumtemperatur abgekühlt wurde,
gab man 1.4 ml TEA hinzu und erhitze für weitere 15 Minuten zum Re
A
chlorid Festp a
rü
NN
O
OH
NH2
Cl
ClClP =
225
Die L-Histidin-Festphase 11 wurde in Ethanol gewaschen und zwei Tropfen der gemischten
e Anwesenheit freier Aminofunktionen an.
an ging von einer 640 μmol / g (40 % der Theorie, bezogen auf die 2-Chlorotritylchlorid
Beladung von 1.60 mmol
9.3 Herstellung der Nα
2 g der 2-Chlorotrityl-chlorid-Festphase (3.2 mmol bezogen auf eine 1.6 mmol / g Beladung
cm-1). Für die Beladung der Festphase 16 wurde unter Ver-
Lösungen 1 bis 3 zugegeben. Nach gutem Verrühren wurde auf 120 ºC erhitzt. Die
Blaufärbung der Festphasenkügelchen zeigt di
M
/ g) für weitere Experimente aus.
-Fmoc-L-Histidin-Festphase 16
9
der Festphase 9) wurden in einer Festphasenfritte in 3 ml DMF für 10 min vorgequollen und
anschließend mit 1.2 g (3.2 mmol) Nα-Fmoc-L-Histidin 15 versetzt, das zuvor in 2 ml DMF
und 2.88 mmol DIPEA gelöst wurde. Anschließend ließ man die Suspension über Nacht bei
Raumtemperatur rühren. Nach beendeter Reaktion saugte man das Lösungsmittel ab und
wusch die Festphase zweimal mit je 10 ml einer Lösung aus Dichlormethan, Diisopropyl-
ethylamin (DIPEA) und Methanol (85:5:15, v/v) und anschließend ausgiebig nacheinander
mit Methanol, Dichlormethan und Chloroform. Nachdem die Festphase im Vakuum
getrocknet wurde, erfolgte die UV-metrische Bestimmung der Beladung durch die Abspaltung
der Fmoc-Schutzgruppe mit 20 % Piperidin in DMF. Hierzu wurde eine kleine Menge
(zwischen 1 und 2 mg) Festphase 16 abgewogen und in einem definierten Volumen 20 %
Piperidin in DMF für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend erfolgte die
Konzentrationsbestimmung über die Absorbtion des Dibenzofulven-Pipieridin Derivat 17a
bei λ = 301 nm (ε = 7800 l mol-1
wendung des Lambert Beer’schen Gesetzes ein Wert von 624 μmol / g (39 % ermittelt
(bezogen auf die Beladung der 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9 von 1.60 mmol / g).
O
NH
O
NN
O
OH
226
9.4 Herstellung der L-Histidinmethylester-Festphase 19
2 g 2-Chlorotrityl-chlorid-Festphase 9 (3.2 mmol bezogen auf eine 1.6 mmol / g Beladung der
estphase 9) wurden in einer Festphasenfritte in 3 ml DMF für 10 min vorgequollen und
anschließend mit 775 mg (3.2 mmol) L-Histidinmethylester Dihydrochlorid 18 versetzt, das
e. Anschließend ließ man die
Suspension über Nacht bei Raum eaktion saugte man das
Lösungsmittel ab und wusch die Fes l einer Lösung aus Dichlor-
methan, Diisopropylethylami thanol (85:5:15, v/v) und anschließend
ausgiebig aufeinanderfolgend m ethan und Chloroform. Nachdem die
Festphase getrocknet wurde, führte m Kaisertest durch (siehe 9.2), der durch die
rmethan
ewaschen. Die Entschützung und das Waschen der Festphase wiederholte man insgesamt
dreimal. Abschließend wurde die Festphase im Hochvakuum getrocknet. Die Beladung der
Festphase 21 wurde nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe UV-metrisch zu 0.5 mmol / g
bestimmt.
F
zuvor in 2 ml DMF und 2.88 mmol DIPEA gelöst wurd
temperatur rühren. Nach beendeter R
tphase zweimal mit je 10 m
n (DIPEA) und Me
it Methanol, Dichlorm
an den
intensive Blaufärbung der Festphasenkügelchen die Anwesenheit freier Aminofunktionen
anzeigte.
Die quantitative Bestimmung der Beladung der L-Histidinmethylester-Festphase 19 erfolgte
indirekt durch Kopplung von Fmoc-L-Serin 46. Nach baseninduzierter Abspaltung der Fmoc-
Schutzgruppe wurde die Beladung UV-spektrometrisch zu 0.576 mmol / g (36 % der
angegebenen maximal Beladung von 1.6 mmol /g der 2-Chlorotritylchlorid-Festphase 9)
bestimmt.
9.5 Fmoc-Abspaltung der 2-Chlortrityl-Fmoc-Histamin-Festphase 20 zu 21
50 mg der kommerziell erhältlichen 2-Chlorotrityl-Fmoc-Histamin-Festphase 20 wurden in
eine Festphasenfritte überführt. Nachfolgend wurden zur Fmoc-Abspaltung 5 ml einer Lösung
aus 20 % Piperidin in DMF unter Argonatmosphäre hinzugegeben und 15 min bei
Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittelgemisches wurde die
Festphase ausgiebig nacheinander mit je 10 ml Methanol, THF und Dichlo
g
NN
O
O
NH2
NN
NH2
227
228
10 Allgemeine Vorschriften (AV) zur Durchführung der Festphasensynthesen von
10.1 Allgemeine Vorschrift (AV 1) nthese symmetrischer Catalipide
n gab man zuerst einen zehnfachen Überschuss (10 eq) des langkettigen Aldehyds
ltung des synthetisierten Catalipids von der Festphase wurde diese für zwei
tunden bei Raumtemperatur mit 5 ml einer Lösung aus Trifluoressigsäure (TFA),
Dichlormethan und Triethylsilan (5:92:3, v/v) behandelt. Nachdem das Lösungsmittel
1:1, v/v).
Nach Abdestillieren der Lösungsm r Rückstand - zur vollständigen
Catalipiden
zur Festphasensy
durch reduktive Aminierung[109]
Die Reaktion verlief unter Argonatmosphäre und es wurden ausschließlich getrocknete
Lösungsmittel eingesetzt.
Zur Synthese symmetrischer Catalipide durch reduktive Aminierung wurden die vorbeladenen
Festphasen 11, 19 und 21 verwendet. Abhängig von der Beladung der verwendeten Festphase
wurden die entsprechenden Equivalente des Reduktionsmittels Natriumtriacetoxyborhydrid
(211.9 g mol-1) 22, sowie der zu koppelnde, langkettige Aldeyhyd eingesetzt.
50 mg der jeweiligen Festphase wurden in 5 ml einer Mischung von DMF und Dichlormethan
(2:1, v/v) in einer Festphasenfritte unter Argonatmosphäre vorgequollen. Zu dieser
Suspensio
23 oder 30 und im direktem Anschluss 10 eq Natriumtriacetoxyborhydrid 22. Nachdem für
zwölf Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, saugte man die Lösung ab, wusch die
Festphase ausgiebig nacheinander mit Methanol, THF und Dichlormethan und trocknete diese
im Vakuum.
Zur Abspa
S
abgesaugt wurde, wusch man die Festphase ausgiebig mit Chloroform / Methanol (
ittel im Vakuum wurde de
Entfernung der TFA - noch mehrmals mit Methanol coevaproiert und abschließend im
Hochvakuum getrocknet.
Das Catalipid wurde abschließend in einem Gemisch aus tert-Butanol und Wasser (4:1, v/v)
lyophilisiert.
10.2 Allgemeine Vorschrift (AV 2) zur Festphasensynthese von Catalipiden durch
Peptid-Kopplungsreaktionen
opplungsreaktionen:
mobilisierten Imidazol-Derivats (abhängig von der eingesetzten
für 5 min unter
berschuss (bezogen auf die Beladung der eingesetzten Festphase) zu der
ng der Fmoc-blockierten Aminofunktion, suspendierte man 50 mg
temperatur spülte man die Festphase ausgiebig nacheinander mit Methanol,
HF und Dichlormethan. Anschließend wiederholte man die Entschützung (insgesamt
dreimal), um eine quantitative Deblockierung der Aminofunktion zu gewährleisten. Nach
sorgfältigem Waschen mit Methanol, THF und Dichlormethan wurde die entsprechende
Festphase im Hochvakuum getrocknet.
Abspaltung des hergestellten Catalipids von der Festphase:
Zur Abspaltung des Catalipids von der Festphase wurde diese für zwei Stunden bei
Raumtemperatur mit 5 ml einer Lösung von TFA, Dichlormethan und Triethylsilan
Alle Reaktionen verliefen unter Argonatmosphäre und es wurden ausschließlich getrocknete
Lösungsmittel eingesetzt.
K
Die Kopplungsreaktion zwischen der freien Carboxyl- / bzw. der freien Nα-Aminofunktion
des auf der Festphase im
Festphase 11, 16, 19 oder 21) mit langkettigen Aminen, respektive Carbonsäurederivaten,
wurde präparativ gleich durchgeführt:
Hierzu ließ man 50 mg der eingesetzten Festphase, die zuvor in eine Festphasenfritte
überführt wurde, in 5 ml einer Lösung aus DMF und Dichlormethan (2:1, v/v)
Argonatmosphäre vorquellen. Anschließend gab man einen fünffachen Überschuss (bezogen
auf die Beladung der eingesetzten Festphase) N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodi-
imid Hydrochlorid (EDC) 2 (M = 191.70) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) 33
(M = 135.12) zu der Suspension. Nach einer Voraktivierung von 5 min gab man das
entsprechende (langkettige) Amin (zur Kopplungsreaktion mit einer Carboxylfunktion) bzw.
die (langkettige) Carbonsäure (zur Kopplungsreaktion mit einer Nα-Aminofunktion) im
fünffachen Ü
Suspension und ließ diese für mindestens 12 h bei Raumtemperatur rühren. Wurden sterisch
anspruchsvolle Kopplungen durchgeführt, verlängerte man die Kopplungszeiten (siehe
Beschreibung der Einzelreaktionen). Nachdem die Lösung abgesaugt wurde, wusch man die
Festphase ausgiebig nacheinander mit je 10 ml Methanol, THF und Dichlormethan und
trocknete die Festphase abschließend im Hochvakuum.
Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe:
Zur selektiven Entschützu
der entsprechenden Festphase in 20 % Piperidin in DMF. Nach einer Reaktionszeit von 15
min bei Raum
T
229
(5:92:3, v/v) behandelt. Nachdem das Lösungsmittel abgesaugt wurde, wusch man die
Gemisch aus tert-Butanol und Wasser (4:1, v/v)
zur Acylierung der Hydroxylfunktion des
Festphase ausgiebig mit Chloroform / Methanol (1:1, v/v). Nach Abdestillieren der
Lösungsmittel im Vakuum wurde der Rückstand zum vollständigen Entfernen der
Trifluoressigsäure noch mehrmals mit Methanol coevaproiert und abschließend im
Hochvakuum getrocknet.
Das Catalipid wurde abschließend in einem
lyophilisiert.
10.3 Allgemeine Vorschrift (AV 3)
immobilisierten L-Serin-Derivats (Verzweigungspunkt)
Die Reaktion verlief unter Argonatmosphäre und es wurden ausschließlich getrocknete
Lösungsmittel eingesetzt.
Zur Acylierung der freien Hydroxylfunktion des L-Serins, das als Verzweigungsmolekül in
immobilisierten Imidazol-Derivaten eingesetzt wurde, überführte man zuerst 50 mg der
entsprechenden Festphase 47 oder 48 in eine Festphasenfritte und ließ diese in 5 ml einer
Lösung aus DMF und Dichlormethan (1:1, v/v) vorquellen. Hierzu gab man einen 10 fachen
Überschuss des entsprechenden Carbonsäurechlorids, gelöst in 5 ml Dichlormethan und 10 eq
Pyridin (Stoffmengenangaben beziehen sich auf die entsprechenden Beladungen der
eingesetzten Festphasen). Nach einer Reaktionszeit von 12 h bei Raumtemperatur wurde das
Lösungsmittel entfernt und die Festphase ausgiebig mit jeweils 10 ml Methanol, THF und
Dichlormethan gewaschen und abschließend im Hochvakuum getrocknet.
230
11 Festphasensynthesen von Catalipiden durch reduktive Aminierung (AV 1)
11.1 Synthese von N, N-Dihexadecyl-L-histidinmethylester 24
O
Die Titelverbindung 24 wurde nach AV 1 (reduktive Aminierung) hergestellt.
Es wurden 50 mg Festphase 19 (Beladung 28.8 μmol / 50 mg) eingesetzt, entsprechend 61 mg
q) Hexa-
usbeute nach Abspaltung m = 15.66 mg (25.34 μmol), entsprechend 88 % der Theorie.
+
Die Titelverbindung 27 wurde nach AV 1 (reduktive Aminierung) hergestellt.
Es wurden 50 mg Festphase 11 (Beladung 32 μmol / 50 mg) eingesetzt, entsprechend 67.8 mg
(320 μmol, 10 eq) Natriumtriacetoxyborhydrid 22 und 77 mg (320 μmol, 10 eq) Hexadecanal
23.
Ausbeute nach Abspaltung m = 16.43 mg (27.2 μmol), entsprechend 85 % der Theorie.
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 605.02. Gefunden: 604.8.
MS (ESI) m/z berechnet für [M-H]-: 603.02. Gefunden: 603.0.
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C38H73N3O2 ([M]+): 605.02. Gefunden (DHB):605.204,
606.218, 607.220.
C38H73N3O2 M = 604.02 gmol-1
(288 μmol, 10 eq) Natriumtriacetoxyborhydrid 22 und 69.2 mg (288 μmol, 10 e
decanal 23.
A
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H] : 619.05. Gefunden: 618.8.
MS (ESI) m/z berechnet für [M-H]- : 617.05. Gefunden: 616.9.
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C39H75N3O2 ([M]+): 619.05. Gefunden (DHB): 619.259.
C39H75N3O2 M = 618.05 gmol-1
11.2 Synthese von 2-Dihexadecylamino-3-(1H-imidazol-4-yl)-propansäure 27
ON
NHN
O
OHN
NHN
231
11.3 Synthese von [2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-dioktyl-amin 28 „Modell-Catalipid“
Die Titelverbindung 28
Es wurden 100 mg ) eingesetzt und die AV 4
angegebenen Lösungsm g (500 μmol, 10 eq)
ρ
Die Titelverbindung 29 wurde nach AV 1 (reduktive Aminierung) hergestellt.
Es wurden 50 mg Festphase entsprechend 53 mg
(250 μmol, 10 eq) Natrium mol, 10 eq) Hexadecanal
23.
Theorie.
(ESI) m/z berechnet für [M-H]-: 559.01. Gefunden: 558.9.
H N M = 560.01 gmol-1
NHN
N
wurde nach AV 1 (reduktive Aminierung) hergestellt.
Festphase 21 (Beladung 50 μmol / 100 mg
ittelmengen verdoppelt. Es wurden 106 m
Natriumtriacetoxyborhydrid 22 und 64 mg (500 μmol, 10 eq) Oktylaldehyd 30 (M = 128.21,
= 0.822; kommerziell erhältlich) eingesetzt.
Ausbeute nach Abspaltung m = 14.95 mg (44.5 μmol), entsprechend 89 % der Theorie.
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+:336.58. Gefunden: 336.5.
C21H41N3 M = 335.58 gmol-1
11.4 Synthese von [2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-dihexadecyl-amin 29
21 (Beladung 25 μmol / 50 mg) eingesetzt,
triacetoxyborhydrid 22 und 60 mg (250 μ
Ausbeute nach Abspaltung: m = 11.94 mg (21.3 μmol), entsprechend 85 % der
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 561.01. Gefunden: 560.8.
MS
C37 73 3
NHN
N
232
12 Festphasensynthesen von Catalipiden durch Peptid-Kopplungsreaktionen (AV 2)
12.1 Synthese von (Z -4-yl)-1-[((Z)-9-
oktadecen)carbamyl]-ethyl-amid 37
eladung / 50 mg) eingesetzt.
leyl-
min) 31 (M = 267.5 g mol-1) mit 30 mg (156 μmol, 5 eq) EDC 2 und 21 mg (156 μmol, 5 eq)
se immobilisierten Nα-Fmoc-
eschützten Histamins gekoppelt.
- chutzgruppe erfolgte nach AV 2.
abschließenden Kopplungsschritt wurde 44 mg (156 μmol, 5 eq) Z-9-Oktadecensäure
q) EDC 2 und 21
mg (156 μmol, 5 eq) HOBT 33 an die freie Nα-Funktion des auf der Festphase
immobilisierten Histam n die Kopplungszeit auf
24 h.
g (24.80 μmol)
)-9-Oktadecensäure-2-(1H-imidazol
O
Die Titelverbindung 37 wurde nach AV 2 (Peptid-Kopplungsreaktionen) hergestellt.
Es wurden 50 mg Festphase 16 (31.2 μmol B
Im ersten Kopplungsschritt wurde 41.73 mg (156 μmol, 5 eq) Z-9-Oktadecen-1-amin (O
a
HOBT 33 an die freie Carboxylfunktion des auf der Festpha
g
Die anschließende Deblockierung der Nα-Fmoc S
Im
(Ölsäure) 36 (M = 282.46 gmol-1, ρ = 0.89 gcm-3) mit 30 mg (156 μmol, 5 e
in-Derivats gekoppelt. Hierbei erhöhte ma
Die Abspaltung von der Festphase erfolgte nach AV 2, es wurden m = 16.59 m
80 % der Theorie (bezogen auf die Beladung der Festphase 16) der Titelverbindung 37
erhalten.
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 670.10. Gefunden: 669.8.
C42H76N4O2 M = 669.10 gmol-1
NH
O
NH
NHN
233
12.2 Synthese des N-[2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-N´,N´´-dioktadecyl-succinamid 40
Die Titelverbindung
Es wurden 50 mg
Zur Kopplung wurden 77.7 m min 43 (DODA-
ol, 5 eq)
lisierten Histamins
g (18.3 μmol) entsprechend 73.2 % der Theorie
2.3 Synthese von Dodekansäure-[1-dodecylcarbamyl-2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-
Die Titelverbindung 38 wurde nach AV 2 (Peptid-Kopplungsreaktionen) hergestellt.
Es wurden 50 mg Festphase 16 (31.2 μmol Beladung / 50 mg) eingesetzt.
Im ersten Kopplungsschritt wurde 29 mg (156 μmol, 5 eq) Dodecylamin 41 (M = 185.35
g mol-1, ρ = 0.806 g cm-3) mit 30 mg (156 μmol, 5 eq) EDC 2 und 21 mg (156 μmol, 5 eq)
HOBT 33 an die freie Carboxylfunktion des auf der Festphase immobilisierten Nα-Fmoc-
geschützten Histamins gekoppelt.
Die anschließende Deblockierung der Nα-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AV 2.
40 wurde nach AV 2 (Peptid-Kopplungsreaktionen) hergestellt:
Festphase 21 (Beladung 25 μmol / 50 mg) eingesetzt.
g (125 μmol, 5 eq) N-Succinyl-dioktadecyla
Suc, M = 622.08 g mol-1) mit 24 mg (125 μmol, 5 eq) EDC 2 und 17 mg (125 μm
HOBT 33 an die freie Aminofunktion des auf der Festphase immobi
gekoppelt. Abweichend von AV 2 setze man aufgrund der schlechteren Löslichkeit des
DODA-Sucs 43 in DMF ein Lösungsmittelgemisch von Chloroform und DMF (4:1, v/v) ein
und erhöhte zudem die Kopplungszeit auf 24 h.
Ausbeute nach Abspaltung m = 13.09 m
(bezogen auf die Beladung der Festphase 21).
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 716.21. Gefunden: 715.9.
MS (FAB) m/z berechnet für [M+H]+: 716.21. Gefunden: 715.6 (98), 604.5 (52), 194 (76),
95.1 (55).
C45H86N4O2 M = 715.21 gmol-1
1
amid 38
NHN
NH
O
N
O
O
NH
O
NHN
NH
234
Im abschließenden Kopplungsschritt wurde 40 mg (156 μmol, 5 eq) Hexadecansäure
2
und 21 mg
immobilisierten Histam gszeit auf
24 h.
g (27.31 μmol)
38
ol-4-yl)-ethyl]-amid MOH 39
g Festphase 21 (Beladung 50 μmol / 100 mg) eingesetzt und die doppelten
ina der in AV 2 angegebenen Lösungsmittelmengen verwendet.
Z-9-Oktadecensäure (Ölsäure) 36 (M =
ol-1, ρ = 0.89 gcm-3) mit 48 mg (250 μmol, 5 eq) EDC 2 und 34 mg (250 μmol, 5
ins
beute nach Abspaltung m = 17.15 mg (45.65 μmol) entsprechend 91 % der
MS (ESI) m/z
MALDI-TOF MS m/z ): 375.60. Gefunden (THAP): 375.6
(47).
(Palmitinsäure) 42 (M = 256.43 g mol-1, ρ = 0.85 g cm-3) mit 30 mg (156 μmol, 5 eq) EDC
(156 μmol, 5 eq) HOBT 33 an die freie Nα-Funktion des auf der Festphase
in-Derivats gekoppelt. Hierbei erhöhte man die Kopplun
Die Abspaltung von der Festphase erfolgte nach AV 2, es wurden m = 15.32 m
87.5 % der Theorie (bezogen auf die Beladung der Festphase 16) der Titelverbindung
erhalten.
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 561.91. Gefunden: 561.7.
C34H64N4O2 M = 560.91g mol-1
12.4 Synthese von Z-9-Oktadecen-[2-(1H-imidaz
Die Titelverbindung 39 wurde nach AV 2 (Peptid-Kopplungsreaktionen) hergestellt.
Es wurden 100 m
Volum
Zur Kopplung wurden 70.6 mg (250 μmol, 5 eq) )
282.46 gm
eq) HOBT 33 an die freie Aminofunktion des auf der Festphase immobilisierten Histam
gekoppelt. Aus
Theorie (bezogen auf die Beladung der Festphase 21).
berechnet für [M+H]+: 376.60. Gefunden: 376.5.
berechnet für C23H41N3O ([M]+
MS (FAB) m/z berechnet für [M+H]+:375.60. Gefunden: 376.3 (100), 95.1 (46), 55.0
C23H41N3O M = 375.60 gmol-1
NHN
NH
O
235
13 Herstellung der Histidin-Festphasen 47 und 48 mit N -Fmoc-L-Serin 46 als
Verzweigungspunkt
Zur Einführung eines Verzweigungspunktes wurde das Nα-Fmoc-L-Serin 46 über die freie
Carbo
α
xylfunktion an die entsprechende freie Aminofunktion der Festphasen 19 oder 21
Es wurden 50 mg Festphase 19 (28.8 µmol / 50 mg) eingesetzt.
= 327.3
g mol-1) mit 55.2 m l, 10 eq) HOBT 33
eingesetzt.
urch die
er
estphase 47 gebundenen Nα-Fmoc-L-Serins mit 71 mg (288 μmol, 10 eq) (M = 246.82
ad cansä echlo it von 24 µl (288 μmol, 10 eq) Pyridin (M =
9.1 g mol-1, ρ = 0.98 g cm-3).
Die anschließende Deblockierung der Nα-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AV 5.
gekoppelt. Die Kopplung erfolgte nach AV 2.
13.1 Synthese der Festphase 47
O
Zur Kopplung wurden 94.2 mg (288 μmol, 10 eq) des Nα-Fmoc-L-Serin 46 (M
g (288 μmol, 10 eq) EDC 2 und 40 mg (288 μmo
Die UV-spektrometrische Bestimmung der Beladung der Festphase 47 erfolgte dαAbspaltung der N -Fmoc-Schutzgruppe und wurde zu einem Wert von 576 µmol/g bestimmt.
13.1.1 Synthese von Tetradecansäure 2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-1-methoxycarbonyl-
ethylamino]-2-tetradecanoylamino-ethyl-ester 53
Es wurden 50 mg Festphase 47 (28.8 μmol Beladung/50 mg) eingesetzt.
Im ersten Reaktionsschritt erfolgte die Acylierung (AV 3) der Hydroxylfunktion des auf d
F
g mol-1) Tetr e ur rid 49 in Anwesenhe
7
NH
O
O
O
NH
NN
O
OH
O
NH
O
NH
NHN
O
O
O
O
236
Im abschließenden Kopplungsschritt wurde 33 mg (144 μmol, 5 eq Tetradecansäure
EDC 2
33 an die freie Nα-Funktion des auf der Festphase
mobilisierten L-Serins gekoppelt.
S (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 677.99. Gefunden: 677.6.
MS (ESI) m/z berechnet für [M-H]
C38H68N4O6
E die
elmengen verwendet.
Zur Kopplung wurden 82 mg (250 μmol, 5 eq) des N -Fmoc-L-Serin 46 (M = 327.3 g mol-1)
mit 48 mg (250 μmo 33 eingesetzt.
Die UV-metrischen B 48 erfolgte durch die
Abspaltung der Nα-Fm rt von 463 µmol/g bestimmt
(93 % der Theorie).
(Myristinsäure) 50 (M = 228.38 g mol-1, ρ = 0.86 g cm-3) mit 28 mg (144 μmol, 5 eq)
und 19 mg (125 μmol, 5 eq) HOBT
im
Die Abspaltung von der Festphase erfolgte nach AV 2, es wurden m = 15.3 mg (22.61 μmol)
78 % der Theorie (bezogen auf die Beladung der Festphase 47) der Titelverbindung 53
erhalten.
M-: 675.99. Gefunden: 675.6.
M = 676.99 gmol-1
13.2 Synthese der Festphase 48
s wurden 100 mg Festphase 21 (Beladung 50 μmol/100 mg) eingesetzt. Es wurden
doppelten Volumina der in AV 2 angegebenen Lösungsmittα
l, 5 eq) EDC 2 und 34 mg (250 μmol, 5 eq) HOBT
estimmung der Beladung der Festphase
oc-Schutzgruppe und wurde zu einem We
NN
NH
O
NH
OH
O O
237
13.2.1 Synthese von Z-9-Oktadecen-2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethylcarbamyl]-2-((Z)-9-
oktadecenoylamino)-ethyl ester 54 (DOSH)
O
NHN
NH
O
NH
O
O
Es wurden 100 mg Festphase 48 (46.3 μmol Beladung / 100 mg) eingesetzt.
ersten Reaktionsschritt erfolgte die Acylierung (AV 3) der Hydroxylfunktion des auf der
51 (500 μmol)
μmol) Pyridin (M =
ol-1, ρ = 0.98 g cm-3).
AV 2.
sschritt wurde 71 mg (250 μmol) Z-9-Oktadecensäure (Ölsäure)
cm-3) mit 48 mg (250 μmol) EDC 2 und 34 mg (250
μmol) HOBT 33 an die freie Nα-Funktion des auf der Festphase immobilisierten L-Serins
gekoppelt.
Die Abspaltung von der Festphase erfolgte nach = 27.37 mg (37.64 μmol)
81.3 % der Theorie (bezogen auf 48) der Titelverbindung 54
erhalten.
S (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 728.14 Gefunden: 727.7.
Im
Festphase 48 gebundenen Nα-Fm c-L-Serins mit 150 mg Ölsäurechlorid o
(M = 300.91 g mol-1, ρ = 0.92 g cm-3) in Anwesenheit von 41 µl (500
79.1 g m
Die anschließende Deblockierung der Nα-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach
Im abschließenden Kopplung
36 (M = 282.46 g mol-1, ρ = 0.88 g
AV 5, es wurden m
die Beladung der Festphase
M
MS (ESI) m/z berechnet für [M-H]-: 726.14. Gefunden: 725.5.
C44H78N4O4 M = 727.14 gmol-1
238
13.2.2
(100) 112.1 (75).
Synthese von Hexadecansäure 2-[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethylcarbamoyl]-2-
tetradecanoylamino-ethyl-ester 55
NHN
NH
O
NH
O
O
O
Es wurden 50 mg Festphase 48 (23 μmol Beladung / 50 mg) eingesetzt.
Im ersten Reaktionsschritt erfolgte die Acylierung (AV 3) der Hydroxylfunktion des auf der
Festphase 48 gebundenen Nα-Fmoc-L-Serins mit 69 mg (250 μmol) Palmitoylchlorid 52
(M = 274.88 g mol-1) in Anwesenheit von 20 µl (250 μmol) Pyridin (M = 79.1 g mol-1, ρ =
0.98 g cm-3).
Die anschließende Deblockierung der Nα-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte nach AV 2.
Im abschließenden Kopplungsschritt wurde 29 mg (125 μmol) Tetradecansäure 50 (M =
228.38 g mol-1, ρ = 0.86 g cm-3, Myristinsäure) mit 24 mg (125 μmol) EDC 2 und 17 mg (125
μmol) HOBT 33 an die freie Nα-Funktion des auf der Festphase immobilisierten L-Serins
gekoppelt.
Die Abspaltung von der Festphase erfolgte nach AV 2, es wurden m = 11.46 mg (17.09 μmol)
74 % der Theorie (bezogen auf die Beladung der Festphase 48) der Titelverbindung 55
erhalten.
MS (ESI) m/z berechnet für [M+H]+: 648.01. Gefunden: 647.6.
MS (FAB) m/z berechnet für [M+H]+: 648.01. Gefunden: 647.5
C38H70N4O4 M = 647.01 gmol-1
239
14
14.1 Synthese von L-Histidinol 8
In 150 ml absolutiertem iniumhydrid
g (43.37 mmol)
mit einer Mischung aus THF/Wasser (9:1, v/v) vorsichtig
m
g (27.54 mmol, 63.5 % der Theorie) eines gelblichen Feststoffs, der der
3OD):δ= 8.83 (m, 1H, N=CHNH), 7.46 (m, 1H, C=CHNH), 3.74-
.68 (m, 1H, CH2CH), 3.59-3.50 (m, 2H, CH2OH), 3.12-3.09 (m, 2H, CH2im).
C=CHNH), 119.21
2 2 2im
7 11 3 2
14.2 Synthese von N-Acetyl-O-(tert-butyldimethylsilyl)-L-histidinol 59
Durch Sonifizieren wurden 1.54 g (10.87 mmol) L-Histidinol 8 in 8 ml absolutem Pyridin
suspendiert und 4.07 g (27 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid hinzugegeben, wobei
umgehend eine hellgelbe Lösung entstand. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten, wurden
Herstellung eines Phosphoglycerid-Catalipids
[114]
NHN NH2
OH
THF wurden 3.29 g (86.74 mmol) Lithiumalum
suspendiert und mittels eines Eisbades auf 0 ºC abgekühlt und 10.5
L-Histidinmethylester Dihydrochlorid 18 langsam unter Argonatmosphäre zugegeben, wobei
eine deutliche Gasentwicklung erkennbar war. Es wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur
nachgerührt und daraufhin zwei Stunden zum Refluxieren erhitzt. Das nicht abreagierte
Lithiumaluminiumhydrid wurde
hydrolysiert und der gelartige, weiße Niederschlag über eine D4-Fritte abgesaugt. Um das a
LiAl(OH)4 absorbierte L-Histidinol 8 möglichst quantitativ abzutrennen, wurde der gelartige,
weiße Feststoff in eine Soxhlethülse überführt und für zwölf Stunden mit Methanol extrahiert.
Nachdem das Lösungsmittel der vereinigten organischen Extrakte im Vakuum entfernt wurde,
erhielt man 4.65
Titelverbindung 8 entsprach.
1H-NMR (200 MHz, CD
3
13C-NMR (55.3 MHz, CD OD): δ = 135.60 (N=CHN), 129.52 (3
(NCH=CH), 61.28 (CH OH), 53.28 (CH CH), 25.52 (CH ).
C H N O M = 169.18 gmol-1
NHN NH
O
O Si
240
1.51 ml Essigsäureanhydrid (16 mmol) schnell zugetropft. Die Lösung trübte sich umgehend
das Lösungsmittel am
urde, nahm man das Rohprodukt in Essigsäure-
ethylester auf und wusch mehrfach mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung. Die
vereinigten organischen Phasen wurd sulfat getrocknet und nach Filtration
S (ESI) m/z berechnet für [M-H]-: 296.48. Gefunden: 296.4.
ol
-L-histidinol-Festphase 58
0 mg 2-Chlorotrityl-chlorid Festphase 9 (128 μmol bezogen auf eine 1.6 mmol g-1 Beladung
ml DMF und
Dichlormethan (2:5, v/v) und 25 μl (153 μmol, 1.2 eq) und DIPEA (M = 129.24, ρ = 0.782)
für 5 min vorgequollen und anschließend m (1.28 mmol, 10eq) N-Acetyl-O-(tert-
butyldimethylsilyl)-L-histidinol an für 24 h bei
Raumtemperatur rühren. Nach beendeter ugte man das Lösungsmittel ab und
und es wurde über Nacht bei Raumtemperatur nachgerührt. Nachdem
Trockeneisrotationsverdampfer entfernt w
en über Magnesium
das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der gelbe, wachsartige Feststoff wurde säulen-
chromatographisch gereinigt (Dichlormethan/Methanol 100:5 (v/v)) und man erhielt 1.24 g
(4.16 mmol, 38 % der theoretischen Ausbeute) eines gelben Schaums, der der Titelverbindung
59 entsprach.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 7.81 (m, 1H, N=CHNH), 6.89 (m, 1H, C=CHNH), 4.27-4.24
(m, 1H, CH2CH), 4.19 (bs, 1H, NH-Amid), 3.64-3.51 (m, 2H, CH2OH), 2.93-2.89 (m, 2H,
CH2im), 1.95 (s, 3H, CH3), 0.89 (s, 9H, tBu), 0.05 (s, 6H SiCH3).
MS (FAB) m/z berechnet für [M+H]+: 298.48. Gefunden: 320.2 (75), 298.2 (100), 166.1
(25),73.1 (29).
M
C14H27N3O2Si M = 297.48 gm -1
14.3 Herstellung der N-Acetyl-O-(tert-butyldimethylsilyl)
8
der Festphase 9) wurden in einer Festphasenfritte in einer Lösung aus 10
it 380 mg
59 versetzt. Anschließend ließ m
Reaktion sa
wusch die Festphase dreimal mit je 10 ml einer Lösung aus Dichlormethan, DIPEA und
Methanol (85:5:15, v/v) und anschließend ausgiebig aufeinanderfolgend mit Methanol,
NN NH
O Si
O
241
Dichlormethan und Chloroform. Abschließend trocknete man die Festphase 58 im
Hochvakuum.
14.4 Festphasensynthese von R,S-1, 2-Di-oleyl-glycerol-3-phospho-(Nα-acetyl)-L-
histidinol 64
Das Reaktion
O
O
NHN
O P
O
O
OHNH
O
O
sschema der Festphasenreaktion zu 64 ist in Kapitel 3.1.9.3 Abbildung 35
bgebildet. Die gesamte Reaktion wurde unter Argonatmosphäre durchgeführt und es wurden
-(tert-butyldimethylsilyl)-L-
istidinol Festphase 64 in eine Festphasenfritte überführt und in 5 ml THF für 10 min
HF zu der Festphase. Nach 30 min unter Argongegenstrom wurde die Lösung
bgesaugt und die Festphase aufeinanderfolgend mit je 10 ml DMF, THF, Methanol und
t.
hosphitylierung der freien Hydroxylfunktion des immobilisierten (Nα-acetyl)-L-
ie Festphase wurde in 8 ml Dichlormethan für 10 min gequollen und mit 120 mg (400 μmol,
5 eq) Bannwarth-Reagenz 61 (M = 301.42 g mol-1) und 68 mg (400 μmol, 5 eq) Diisopropyl-
e
das Lösungsmittel abgesa ethan gewaschen.
Kopplung des Glycerols mit 5- l (5-BMT):
Zu der in 5 ml Dichlorm v/v) vorgequollen Festphase wurden 147 mg
O
a
ausschließlich getrocknete Lösungsmittel eingesetzt.
Abspaltung der TBDMS-Schutzgruppe:
Zuerst wurden 50 mg (80 μmol / 50 mg) der N-Acetyl-O
h
vorgequollen. Nachdem das Lösungsmittel abgesaugt wurde, gab man 10 ml einer Lösung aus
1 M TBAF in T
a
Dichlormethan gewaschen und im Ölpumpenvakuum getrockne
P
histidinols mit Bannwarth-Reagenz 61:
D
ammoniumtetrazolid 62 (M = 169 g mol-1) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wurd
ugt und die Festphase mit Dichlorm
Benzylmercaptotetrazo
ethan und DMF (1:1,
(1.6 mmol, 20 eq) Glycerol (M = 92.1 g mol-1, ρ = 1.26 g cm-3) und 308 mg (1.6 mmol, 20 eq)
Aktivator 5-Benzylmercaptotetrazol (5-BMT) (M = 192.2 g mol-1) gegeben und für 3 h
gerührt. Nachdem die Reaktionslösung abgesaugt wurde, wusch man die Festphase ausgiebig
mit je 10 ml Methanol, THF und Dichlormethan.
Oxidation des Phosphorigsäuretriesters zum Phosphorsäureester:
Die Festphase wurde zweimal aufeinander folgend mit 5 ml der wässrigen Oxidationslösung
(206 mg Iod, 4.2 ml 2,6-Lutidin, 52 ml Acetonitril und 24 ml Wasser) für 15 min gerührt.
242
Nachfolgend wurde die Festphase aufeinander folgend mit je 10 ml Methanol, THF und
Dichlormethan gewaschen und im Ölpumpenvakuum getrocknet.
Acylierung der freien Hydroxylgruppen des Glycerol-Derivats:
l, 10
ol-1, ρ = 0.92 g cm-3) Oleylchlorid 51 und 65 µl (800 μmol, 10 eq)
Pyridin (M = 79.1 g m
gewaschen
und im
BAF in THF zu der Festphase.
abgesaugt und die Festphase aufeinander-
ittel abgesaugt wurde,
Zu der in 10 ml Chloroform vorgequollen Festphase wurden 240 mg (262 μl) (800 μmo
eq) (M = 300.91 g m
ol-1, ρ = 0.98 g cm-3) gegeben und für 24 h gerührt. Nachfolgend wurde
die Festphase aufeinanderfolgend mit je 10 ml Methanol, THF und Chloroform
Ölpumpenvakuum getrocknet.
Abspaltung der Cyanoethylschutzgruppe:[116]
Die Festphase wurde in 5 ml THF für 10 min vorgequollen. Nachdem das Lösungsmittel
abgesaugt wurde, gab man 10 ml einer Lösung von 1 M T
Nach 30 min Reaktionszeit wurde die Lösung
folgend mit je 10 ml DMF, THF, Methanol und Dichlormethan gewaschen und im
Ölpumpenvakuum getrocknet.
Abspaltung der Titelverbindung 64 von der Festphase:
Zur Abspaltung des Phosphoglycerid-Catalipids 64 von der Festphase wurde diese für zwei
Stunden bei Raumtemperatur mit 5 ml einer Lösung von Trifluoressigsäure, Dichlormethan
und Triethylsilan (5:92:3, v/v) behandelt. Nachdem das Lösungsm
wusch man die Festphase ausgiebig mit Chloroform / Methanol (1:1, v/v). Nach
Abdestillieren der Lösungsmittel im Vakuum wurde der Rückstand zur vollständigen
Entfernung der Trifluoressigsäure noch mehrmals mit Methanol coevaproiert und
abschließend in einem Gemisch aus tert-Butanol und Wasser (4:1, v/v) lyophilisiert.
Es wurden 40 mg (46.4 μmol) der Titelverbindung 64 (58 % der Theorie bezogen auf die
Beladung der Festphase 9) erhalten.
2- MS (ESI) m/z berechnet für [M-2H] : 863. Gefunden: 863.2.
C47H84N3O9P M = 866.18 g mol-1.
243
15 Flüssigphasensynthese kurzketttiger Catalipide MC6, 8, 10 H 84, 85, 86 und
73 und 1.2 eq TEA in Chloroform gelöst und für 10
nd wurde 1 eq Histamin 7 (zur Synthese der
lgel60 chromatographiert (Angabe des Elutionsmittels in
der TLC-Chromatographiefertig-
(1.03 g,
6.33 gmol-1) und 1.23 ml (10.69 mmol, 1,2 eq) TEA (M
101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 50 ml Chloroform eingesetzt.
Chloroform / Methanol (95:5,
.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel chromatographisch gereinigt. Es wurden 1.65 g
1 % d Theo g 84 in Form eines gelben Öls erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, CD3OD):δ= 7.42 (m, 1H, N=CHNH), 6.67 (m, 1H, C=CHNH),
4.41 (br s, 1H, CH2NHCOO), 3.36 (t, 3J=7.07 Hz 2H, CH2NHCO), 2.67 (t, 3J=7.18 Hz, 2H,
CH2im), 2.06 (t, 3J=7.08 Hz, 2H, COCH2), 1.49 (dt, 3J=15.01 Hz, 5J=7.62 Hz, 2H,
COCH2CH2), 1.19 (mc, 4H, CH2CH2CH3), 0.78 (t, 3J=7.01 Hz, 3H, CH2CH3).
MC6, 8, 10 N-Im 91, 92, 93
15.1 Allgemeine Vorschrift (AV 4) zur Flüssigphasensynthese kurzketttiger
Catalipide
Unter Argonatmosphäre wurden 1 eq der einzusetzenden langkettigen Carbonsäure mit 1.5 eq
N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
min bei Raumtemperatur voraktiviert. Nachfolge
MCH-Catalipide 84, 85, 86) bzw. das 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (zur Synthese der MCN-
IM-Catalipide 91, 92, 93) zugegeben und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der
entstandene Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und ausgiebig mit
Chloroform gewaschen. Anschließend entfernte man das Lösungsmittel im Vakuum und das
Rohprodukt wurde an Kiese
detaillierter Beschreibung des Catalipids). Die Anfärbung
folien erfolgte mit einer Lösung aus Molybdatophosphorsäure in Methanol.
15.1.1 Hexansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC6H 84
Die Herstellung der Titelverbindung erfolgte nach AV 4.
Es wurden 989 mg (8.9 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1), 1.11 ml
NHN
NH
O
8.9 mmol, 1 eq) n-Hexansäure (Capronsäure, M = 116.16 g mol-1, ρ = 0.93 g cm-3) 81, 2.7 g
(13.3 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 20
=
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von
0
(6.95 mmol, 78. er rie) der Titelverbindun
244
13C NMR (101.6 MHz, CDCl CD OD): δ = 174.54 (HNCOCH ), 134.77 134.79 (N=CHNH,
2 2 2 2CH3),
2im 2 H2), 22.37 (CH2CH3), 13.93 (CH2CH3).
m/z berechnet für C11H19N3O ([M]+): 210.29. Gefunden: 211.46.
,2 eq) TEA (M =
101.19 g m -1 -3
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es w mmol, 81.3 % der Theorie) der
en Feststoffs erhalten.
2im), 2.07 (t, 3J=7.83 Hz,
,
=CHNH), 117.07 (C=CHNH), 39.20 (CH2NHCO), 36.53 (COCH2), 31.64 (CH2CH2CH3),
8.47.
C13H23N3O M = 237.35 gmol-1
3, 3 2
C=CHNH), 117.07 (C=CHNH), 39.37 (CH NHCO), 36.57 (COCH ), 31.41 (CH CH
26.74 (CH ), 25.51 (COCH C
MALDI-TOF MS
C11H19N3O M = 209.29 gmol-1
15.1.2 Oktansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC8H 85
Die Herstellung der Titelverbindung erfolgte nach AV 4.
Es wurden 1.67 g (15 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1), 2.95 ml (2.16 g,
15 mmol, 1 eq) n-Oktansäure 82 (Caprylsäure, M = 144.2 gmol-1, ρ = 0.91 g cm-3), 4.65 g
(22.5 mmol, 1.5 eq) DCC (M = 206.33 gmol-1) 73 und 1.82 ml (18 mmol, 1
NHN
NH
O
ol , ρ = 0.73 g cm ) in 80 ml Chloroform eingesetzt.
% Methanol in Chloroform, 0.1
urden 2.89 g (12.19
Titelverbindung 85 in Form eines hell-gelben bis weißlich
1H-NMR (400 MHz, CDCl3,CD3OD):δ= 7.48 (m, 1H, N=CHNH), 6.70 (m, 1H, C=CHNH),
3.35 (t, 3J=7.07 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.69 (t, 2 H, 3J=7.08 Hz, CH
2H, COCH2), 1.50 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.18 (mc, 8H, CH2CH2CH2CH2CH3), 0.78 (t, 3J=6.82 Hz, 3H, CH2CH3).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3, CD3OD): δ = 174.54 (HNCOCH2), 134.77 134.79 (N=CHNH
C
29.16 28.95 (CH2CH2), 26.56 (CH2im), 25.78 (COCH2CH2), 22.53 (CH2CH3), 13.92
(CH2CH3).
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C13H23N3O ([M]+): 238.35. Gefunden: 23
245
15.1.3 Decansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC10H 86
NHN
NH
O
Die Herstellung der Titelverbindung erfolgte nach AV 4.
ol, 1 eq)
-Decansäure 83 (Caprinsäure, M = 177.26 gmol-1), 6.18 g (30.0 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = -1 l (24 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in
20 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 m hloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es w mmol, 65.8 % der Theorie) der
Titelverbindung 86 in Form
CH2CH2), 1.22 (mc, 12H,
CH2), 22.60
H2CH3), 13.98 (CH2CH3).
M = 265.40 gmol
Es wurden 2.223 g (20 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1), 3.55 g (20 mm
n
206.33 gmol ) und 3.33 m
1
it einem Gemisch von C
urden 3.49 g (13.16
eines weißen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3,CD3OD):δ= 7.44 (m, 1H, N=CHNH), 6.69 (m, 1H, C=CHNH),
4.09 (br s, 1H, CH2NHCO), 3.36 (t, 3J=7.07 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.69 (t, 2 H, 3J=7.08 Hz,
CH2im), 2.07 (t, 3J=7.83 Hz, 2H, COCH2), 1.51 (mc, 2H, CO3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 0.79 (t, J=6.82 Hz, 3H, CH2CH3).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3, CD3OD): δ = 174.42 (HNCOCH2), 134.67 134.60 (N=CHNH,
C=CHNH), 116.99 (C=CHNH), 39.27 (CH2NHCO), 36.57 (COCH2), 31.82 (CH2CH2CH3),
29.41 29.30 29.23 29.15 (CH2CH2CH2CH2), 26.67 (CH2im), 25.78 (COCH2
(C
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C15H27N3O ([M]+): 266.40. Gefunden: 266.45.
C15H27N3O -1
246
15.1.4 Hexansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC6N-Im 91
O
NN N
H
Die Titelverbindung wurde durch die in der AV 4 beschriebene Synthese hergestellt.
idazol 72 (M = 125.17
1
J=7.58 Hz, 2H, COC
.87 (t, J=7.07 Hz, 3H,
CH2CH3).
13
2N
2im), 26.66 (COCH2CH2), 23.39 (CH2CH3), 14.27 (CH2CH3).
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C12H21N3O ([M]+): 224.32. Gefunden: 224.89.
Es wurden 1.429 ml (1.5 g , 12 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylim
gmol-1, ρ = 1.049 gcm-3), 1.49 ml (1.39 g, 12 mmol, 1 eq) n-Hexansäure 81 (Capronsäure, M
= 116.16 g mol-1, ρ = 0.93 g cm-3), 3.71 g (18 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1)
und 1.99 ml (14.4 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 50 ml
Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 1.51 g (6.78 mmol, 56.5 % der Theorie) der
Titelverbindung 91 in Form eines gelben Öls erhalten.
H-NMR (400 MHz,, CD3OD):δ= 7.63 (m, 1H, N=CHN), 7.10 (m, 1H, NCH=CH), 7.10 (m,
1H, NCH=CH), 4.01 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2im), 3.13 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.14
(t, 3 H2), 1.94 (q, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.57 (dt, 3J=14.91 Hz, 5J=7.57 Hz, 2H, COCH2CH2), 1.28 (mc, 4H, CH2CH2CH3), 0 3
C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.47 (HNCOCH2), 138.55 (N=CHN), 129.04
(NCH=CH), 120.61 (NCH=CH), 45.58 (CH2im), 37.42 (CH HCO), 37.08 (COCH2), 32.54
(CH2CH2CH3), 31.97 (CH2CH
C12H21N3O M = 223.32 gmol-1
247
15.1.5 Oktansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC8N-Im 92
NN N
H
O
Die Titelverbindung wurde durch die in der AV 4 beschriebene Synthese hergestellt.
Es wurden 1.906 ml (2.0 g , 16 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17
gmol-1, ρ = 1.049 gcm-3), 2.54 ml (2.307 g, 16 mmol, 1 eq) n-Oktansäure 82 (Caprylsäure, M
= 144.2 gmol-1, ρ = 0.91 g cm-3), 4.95 g (24 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1) und
2.66 ml (19.2 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 100 ml
Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-10 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 2.95 g (11.76 mmol, 73.5 % der Theorie) der
Titelverbindung 92 in Form eines gelben Öls erhalten.
1H-NMR (400 MHz,, CD3OD):δ= 7.73 (m, 1H, N=CHN), 7.17 (m, 1H, NCH=CH), 6.99 (m,
1H, NCH=CH), 4.06 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2im), 3.17 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.18
(t, 3J=7.58 Hz, 2H, COCH2), 1.96 (q, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.60 (dt, 3J=14.91 Hz, 5J=7.57 Hz, 2H, COCH2CH2), 1.31 (mc, 8H, CH2CH2CH2CH2CH3), 0.89 (t, 3J=7.07 Hz, 3H,
CH2CH3).
13C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.49 (HNCOCH2), 138.36 (N=CHN), 128.70
(NCH=CH), 120.73 (NCH=CH), 45.70 (CH2im), 37.37 (CH2NHCO), 37.12 (COCH2), 32.86
(CH2CH2CH3), 31.96 (CH2CH2im), 30.29 30.08 (CH2CH2), 26.97 (COCH2CH2), 23.63
ALDI-TOF MS m/z berechnet für C14H25N3O ([M]+): 252.37. Gefunden: 252.44.
14H25N3O M = 251.37 gmol-1
(CH2CH3), 14.38 (CH2CH3).
M
C
248
15.1.6 Decansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC10N-Im 93
NN N
H
O
Die Titelverbindung wurde durch die in der AV 4 beschriebene Synthese hergestellt.
Es wurden 2.386 ml (2.5 g , 20 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17 gmol-
1, ρ = 1.049 gcm-3), 3.55 g (20 mmol, 1 eq) n-Decansäure 83 (Caprinsäure, M = 177.26
gmol-1), 6.18 g (30.0 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1) und 3.33 ml (24 mmol, 1,2
eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 150 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(400 MHz,, CD3OD):δ= 7.66 (m, 1H, N=CHN), 7.14 (m, 1H, NCH=CH), 6.96 (m,
1 2im 2
H
C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.44 (HNCOCH2), 138.45 (N=CHN), 129.12
(N
3 2 3
net für C16H29N3O ([M]+): 280.43. Gefunden: 280.51.
16H29N3O M = 279.43 gmol-1
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 3.48 g (12.5 mmol, 65.8 % der Theorie) der
Titelverbindung 93 in Form eines weiß-viskosen Öls erhalten.
1H-NMR
H, NCH=CH), 4.05 (t, 3J=7.07 Hz, 2H, CH ), 3.17 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH NHCO), 2.18
(t, 3J=7.83 Hz, 2H, COCH2), 1.97 (q, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.60 (dt, 3J=14.91 Hz, 5J=7.57 Hz, 2H, COCH2CH2), 1.29 (mc, 12H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 0.89 (t, 3J=7.07
z, 3H, CH2CH3).
13
CH=CH), 120.58 (NCH=CH), 45.57 (CH2im), 37.42 (CH2NHCO), 37.12 (COCH2), 32.98
(CH2CH2CH3), 32.00 (CH2CH2im), 30.57 30.43 30.36 30.32 (CH2CH2CH2CH2), 26.98
(COCH2CH2), 23.69 (CH2CH ), 14.42 (CH CH ).
MALDI-TOF MS m/z berech
C
249
15.1.7 Im 71 Z-9-Oktadecensäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MON-
NN N
H
O
Die Titelverbindung wurde durch die in der AV 4 beschriebene Synthese hergestellt.
Es wurden 0.953 ml (1.0 g , 8 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17 gmol-1,
ρ = 1.049 gcm-3), 2.25 g (8 mmol, 1 eq) ) Z-9-Octadecensäure (Ölsäure) 36 (M = 282.46
gmol-1, ρ = 0.89 gcm-3), 2.47 g (12 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1) und 1.33 ml
(9.6 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 50 ml Chloroform
eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 2.43 g (6.24 mmol, 78 % der Theorie) der
itelverbindung 71 in Form eines gelblich-weißen Feststoffs erhalten.
=CHCH2), 1.59 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.28 (mc, 21H, Alkylkette), 0.86 (t,
1 (CH2CH2im), 29.86 29.81 29.61 29.59
H2CH2),
2.77 (CH CH3), 14.19 (CH2CH3).
F S m/ berec 24 43 3+): 390.63. Gefunden: 390.62.
C24H43N3O M = 389.63 gmol-1
T
1H-NMR (400 MHz,, CDCl3):δ= 7.45 (m, 1H, N=CHN), 7.03 (m, 1H, NCH=CH), 6.92 (m,
1H, NCH=CH), 6.04 (br s, 1H, CH2NHCO), 5.32 (m, 2H, CH2CH=CHCH2), 3.97 (t, 3J=6.82
Hz, 2H, CH2im), 3.23 (mc, 2H, CH2NHCO), 2.14 (t, 3J=7.83 Hz, 2H, COCH2), 1.98 (mc, 6H,
CH2imCH2, CH2CH3J=7.07 Hz, 3H, CH2CH3).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 173.75 (HNCOCH2), 137.14 (N=CHN), 130.13 129.80
(CH2CH=CHCH2), 129.57 (NCH=CH), 118.94 (NCH=CH), 44.82 (CH2im), 36.78 36.61
(CH2NHCO, COCH2), 31.99 (CH2CH2CH3), 31.4
29.45 29.40 29.37 29.25 (Alkylkette), 27.33 27.27 (CH2CH=CHCH2), 25.83 (COC
2 2
MALDI-TO M z hnet für C H N O ([M]
250
16
16.1 Synthesen der Carbonsäuremonoethylester 104 und 105
Synthese der ω-Hydroxycarbonsäureester 104, 105 und 121
16.1.1 Oktansäuremonoethylester 104[55, 215, 221]
O
O
OH
O
In 60 ml Ethanol wurden 20 g (86.8 mmol) Diethylsuberat 98 (M = 230.31 gmol-1) gelöst und
auf 0 ºC abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde eine Suspension aus 6.5 g KOH (0.116 mol) in
Ethanol getropft und nachfolgend für 12 h zum Refluxieren erhitzt. Hierbei löste sich das
d extrahierte mehrfach
it Diethylether, um nun das nicht verseifte Ausgangsmaterial (Diethylsuberat 98)
68 % der Theorie) eines weißen Feststoffs erhalten, der nach
z, 3H, CH3-CH2).
3), 60.65
O C 3 CH2COOH), 29.1 29.05 (CH2CH2CH2CH2),
25.12 24.85 (CH2CH2CH2CH2), 14.63 (COOCH2CH3).
C10H18O4 M = 202.25 gmol-1
Mono-Kaliumsalz der Titelverbindung 104 im heißen Ethanol, wobei das Di-Kaliumsalz als
unlöslicher Rückstand ausfiel. Die heiße Suspension wurde zentrifugiert und die überstehende
Lösung abdekantiert. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde, suspendierte
man den erhaltenden weißen Feststoff unter Sonifizieren in Wasser un
m
abzutrennen. Die wässrige Phase kühlte man mittels eines Eisbades ab und säuerte die
Suspension durch Zugabe von 12 M HCl an. Die saure, wässrige Phase wurde mehrfach mit
Dichlormethan extrahiert. Anschließend trocknete man das organische Lösungsmittel über
Magnesiumsulfat und nach Filtration entfernte man das Lösungsmittels im Vakuum. Es
wurden 11.93 g (59 mmol,
spektroskopischer Analyse der Titelverbindung 104 entsprach.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.09 (q, 2H, 3J=7.07 Hz CH3-CH2), 2.31 (mc, 4H,
CH2COOCH2CH3; CH2COOH), 1.65 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2), 1.54 (m, 2 H,
CH2CH2CH2CH2), 1.21 (t, 3J=7.13 H
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 180.28 (CH2COOH), 174.22 (CH2COOCH2CH
O H2CH ), 35.17 34.65 (CH2COOCH2CH3; (C
251
16.1.2 Decansäuremonoethylester 105[45, 181, 190]
O
OOH
O
D noethylester 104 (siehe 16.1.1).
Es wurden 15 g (65 mmol) Diethylsebacat 99 (M = 258.36 gmol-1) eingesetzt und 7.93 g
(34.45 mmol, 53 % der Theorie) der Titelverbindung 105 in Form eines weißen Feststoffs
ie Synthese erfolgte analog dem Oktansäuremo
erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 11.39 (sbr, 1H, CH2COOH), 4.11 (q, 2H, 3J=7.1 Hz CH3-
CH2-), 2.31 (mc, 4H, CH2COOCH2CH3; CH2COOH), 1.63 (mbr, 4H,
CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1.59 (mbr, 8H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1.23 (t, 3J=7.1 Hz, 3H,
CH3-CH2).
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 180.48 (CH2COOH), 174.37 (CH2COOCH2CH3), 60.59
(COOCH2CH3), 34.70 34.43 (CH2COOCH2CH3; CH2COOH), 29.39-29.32
(CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 25.28 24.98 (CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 14.59 (COOCH2CH3).
C12H22O4 M = 230.31 gmol-1
252
16.2 thylester 102 und 103
16.2.1 7-Chlorocarbonylheptansäureethylester 102[216]
Synthese der Chlorocarbonylcarbonsäuree
O
OCl
O
Zu 5 g (24 mmol) Oktansäuremonoethylester 98 wurden 10 ml frisch destilliertes
Thionylchlorid gegeben und für 12 h zum Refluxieren erhitzt. Nachfolgend destillierte man
as Thionylchlorid ab und setzte den Chlorocarbonylethylester 102 in der nächsten Stufe ein.
C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 173.84 173.68 (COOCH2CH3, CH2COCl), 60.35
(C
10H17ClO3 M = 220.70 gmol-1
6.2.2 9-Chlorocarbonyl-nonansäure-ethylester 103[182]
d
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.09 (q, 2H, 3J=7.07 Hz CH3-CH2-), 2.87 (t, 3J=6.9 Hz, 3H,
CH2COCl), 2.27 (t, 3J=7.1 Hz, 3H, CH2COOCH2CH3), 1.67 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2), 1.34
(m, CH2CH2CH2CH2), 1.27 (t, 3J=7.1 Hz, 3H, CH3-CH2-).
13
OOCH2CH3), 47.07 (CH2COCl), 34.23 (CH2COOCH2CH3), 28.63 28.15
(CH2CH2CH2CH2), 24.94 24.69 (CH2CH2CH2CH2), 14.34 (COOCH2CH3).
C
1
O
O
Cl
O
Zu 7 g (28.14 mmol) Decansäuremonoethylester 101 wurden 12 ml frisch destilliertes
Thionylchlorid gegeben und für 12 h zum Refluxieren erhitzt. Nachfolgend destillierte man
das Thionylchlorid ab und setzte den Chlorocarbonylethylester 103 in der nächsten Stufe ein.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.12 (q, 2H, 3J=7.0 Hz CH3-CH2-), 2.87 (t, 3J=7.1 Hz, 3H,
CH2COCl), 2.27 (t, 3J=7.1 Hz, 3H, CH2COOCH2CH3), 1.69 (mbr, 4H,
-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-), 1.59 (mbr, 8H, CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 1.24 (t, 3J=7.0 Hz,
3H, CH3-CH2).
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 174.18 174.02 (COOCH2CH3, CH2COCl), 60.57
(COOCH2CH3), 47.46 (CH2COCl), 34.69 (CH2COOCH2CH3), 29.36 29.32 29.25 28.73 25.39
25.26 (CH2CH2CH2CH2CH2CH2), 14.59 (COOCH2CH3).
C12H21ClO3 M = 248.75 gmol-1
253
16.3 Synthese der ω-Hydroxycarbonsäureethylester 104, 105
16.3.1 4 Synthese des ω-Hydroxyoktansäureethylesters 10
O
O
OH
480 mg (12.7 mmol, 0.7 eq) Natriumborhydrid (M = 37.83 gmol-1) wurden in 20 ml einer
ehr zu erkennen war, rührte man die Lösung weitere 4 h bei
Raum
3 nd dann über Magnesiumsulfat
g
ung 104 als klares
1 -CH2O), 3.61 (t, 3J=7.1 Hz, 2H,
CH2OH), 2.27 (t, 3J=6.94 Hz, 2H CH3CH2OCOCH2), 1.56 (mc, 4H, CH2CH2OH,
CH3CH2OCOCH2CH2), 1.34 (mc, 6 H, CH2CH2CH2), 1.25 (t, 3 =7.01 Hz, 3H, CH3-CH2O).
Lösung von THF./DMF (1:1, v/v) suspendiert und unter Argonatmosphäre auf 0 ºC abgekühlt.
Nachfolgend wurden 4 g (18.12 mmol) des 7-Chlorocarbonylheptansäureethylesters 102 in
einer Lösung aus THF / DMF (1:1, v/v) langsam zu der Suspension getropft. Nachdem keine
Wasserstoffentwicklung m
temperatur. Nachfolgend wurde die Suspension mit 10 ml kalter 1 N HCl angesäuert
und mit Diethylether extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zuerst mit
gesättigter NaHCO - und NaCl-Lösung gewaschen u
etrocknet. Nachdem das Trockenmittel abfiltriert wurde, entfernte man das Lösungsmittel im
Vakuum. Abschließend wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch (n-Hexan/EE, 1:1)
gereinigt. Es wurden 1.54 g (8.15 mmol, 45 % der Theorie) der Titelverbind
Öl erhalten.
H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.09 (q, 2H, 3J=7.07 Hz, CH3
J
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 173.84 (CH3CH2OCO), 62.88 (CH2OH), 60.15 (COCH2),
34.47 (CH3CH2OCO), 33.23 (COCH2CH2), 29.03 28.99 28.80 28.78 (CH2CH2CH2CH2),
14.21 (CH3CH2OCO).
C10H20O3 M = 188.27 gmol-1
254
16.3.2 Synthese des ω-Hydroxydecansäureethylester 105
O
OOH
Die Durchführung der Synthese verlief analog zum ω-Hydroxyoktansäureethylester 104
(siehe 16.3.1).
C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 173.31 (CH3CH2OCO), 63.01 (CH2OH), 60.12 (COCH2),
C H O M = 216.32 gmol
droxy-hexadecanoat 121[191]
Es wurden 530 mg (14 mmol, 0.7 eq) Natriumborhydrid (M = 37.83 gmol-1) in 20 ml einer
Lösung von THF/DMF (1:1, v/v) eingesetzt, die zu 5 g (20 mmol, 1 eq) des 9-Chloro-
carbonylnonansäureethylesters 103 getropft wurden. Das Rohprodukt wurde säulenchromato-
graphisch (n-Hexan/ Ethylacetat, 7:3) gereinigt. Es wurden 2.25 g (10.4 mmol, 52 % der
Theorie) der Titelverbindung 105 als klares Öl erhalten (nach Lagerung im Eisschrank
kristallisierte ein feiner, weißer Feststoff aus dem klaren Öl aus).
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.12 (q, 2H, 3J=7.07 Hz, CH3-CH2O), 3.64 (t, 3J=7.1 Hz, 2H,
CH2OH), 2.27 (t, 3J=6.94 Hz, 2H CH3CH2OCOCH2), 1.59 (mc, 4H, CH2CH2OH,
CH3CH2OCOCH2CH2), 1.32 (mc, 10 H, CH2CH2CH2CH2CH2), 1.26 (t, 3J=7.01 Hz, 3H, CH3-
CH2O).
13
35.07 (CH3CH2OCO), 33.51 (COCH2CH2), 29.05 28.92 28.92 28.80 28.68 28.53 (CH2CH2-
CH2CH2CH2CH2), 14.32 (CH3CH2OCO).
-1
12 24 3
16.3.3 Methyl-16-hy
OOH
O
Unter Argonatmosphäre wurden 10 g (39.4 mmol) Oxacycloheptadecan-2-on 120 in 400 ml
absolutiertem Methanol unter Sonifizieren gelöst. Zu der Lösung wurden 10.8 g (78.8 mmol)
wasserfreies Kaliumcarbonat schnell hinzugegeben und für fünf Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Anschließend wurde mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und dreimal mit je 100 ml
Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem
das Trockenmittel abfiltriert wurde, entfernte man das Lösungsmittel im Vakuum. Es wurden
9.2 g (32.1 mmol, 81.4 %) der Zielverbindung 121 in Form eines weißen Feststoffes erhalten.
255
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.05 (s, 3H, H3CO), 3.74 (t, 3J=7.2 Hz, 2H, CH2OH), 2.27 (t, 3J=7.01 Hz, 2H CH3OCOCH2), 1.6 (mc, 4H, CH2CH2OH, CH OCH2CH2), 1.3 (mc, 22 H,
MHz, CDCl3): δ = 175.07 (CH3OCO), 63.01 (CH2OH), 60.09 (CH3O), 57.92
17.1 6-para-Toloylsulfonyloxyhexansäureethylester 107
3OC
CH2-Alkyl).
13C NMR (50.3
(COCH2), 34.43 (COCH2CH2), 30.01 – 27.34 (CH2-Alkyl).
C17H34O3 M = 286.46 gmol-1
17 Synthese des ω-Fluorhexansäureethylesters 108
OO
O
S
O
O
1 g (6.24 mmol, 1 eq) des käuflichen ω-Hydroxyhexansäureethylesters 106 (M = 160.21
gmol-1) wurden in 50 ml Dichlormethan und 755 μl (9.36 mmol, 1.5 eq) Pyridin (M = 79.1 g
rt. Durch Zugabe von 15 ml Methanol wurde die
eaktion unterbrochen. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde, reinigte man
(Chloroform/Methanol, 100:8). Es wurden 1.48 g
.5 mmol, 72 % der Theorie) der Titelverbindung 107 in Form eines weißen Feststoffs
erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 7.72 (d, 2H, CHarom.), 7.25 (d, 2H, CHarom.), 4.09-3.91 (m,
4H, CH CH OCO; CH O), 2.41 (s, 3 H, -CH ), 2.18 (t, 3J=7.1 Hz, 2H, COCH ), 1.55 (m, 4H,
mol-1, ρ = 0.98 g cm-3) unter Argonatmosphäre gelöst. Nachfolgend wurden 1.78 g (9.36
mmol, 1.5 eq) para-Toluolsulfonsäurechlorid (M = 190.64 gmol-1) hinzugegeben und es
wurde für 24 h bei Raumtemperatur gerüh
R
das Rohprodukt säulenchromatographisch
(4
3 2 2 3 2
CH2CH2O, COCH2CH2), 1.34 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 1.28 (t, 3J=7.07 Hz, 3H, CH3-CH2O).
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 173.80 (COOCH2CH3), 145.13 133.52 130.24 128.27
Carom, 70.69 (CH2O), 60.70 (COOCH2CH3), 34.38 (COCH2CH2), 28.93 (CH2CH2O), 25.31
(CH2CH2CH2), 24.64 22.02 (CH2CH2CH2), 14.62 (COOCH2CH3).
C15H22O5S M = 330.40 gmol-1
256
ω-Fluorohexansäureethylester 108
OF
O
650 mg (1.96 mmol) 6-para-Toloylsulfonyloxyhexansäureethylester 107 wurden in 10 ml
fernte man die Lösungsmittel im
Vakuum und reinigte das Rohprodukt säulenchromatographisch (Chloroform/Methanol,
g (940 μmol, 48 % der Theorie) der Titelverbindung 108 in Form
leicht viskosen Öls erhalten.
.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F), 3 3 , 2H, COCH2), 1.66 (mc, 4H,
CH2CH2CH2), 1.40 (mc, 2H, CH2CH2CH2).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 173.94 (COOCH2), 85.71 82.60 (1J(C,F)=163.31 Hz,
THF unter Argonatmosphäre gelöst und zu 5 ml einer 1 M TBAF-Lösung in THF gegeben.
Nachdem für 12 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, ent
100:5). Es wurden 152.6 m
eines klaren,
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.55 4.31 (dt, 2J(H,F)=47
4.13 (q, 2H, J=7.07 Hz, CH3-CH2O), 2.30 (t, J=7.32 Hz
CH2F), 60.66 (CH3-CH2O), 34.57 (COCH2), 30.68 30.28 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 25.24
25.14 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.95 (COCH2CH2), 14.63 (COOCH2CH3).
C8H15FO2 M = 162.21 gmol-1
257
18 Synthese der ω-Fluorocarbonsäureethylester 108, 110 und 111 mit DAST 109
18.1 Allgemeine Vorschrift (AV 5): Synthese der ω- luorocarbonsäureethylester
ng langsam auf Raumtemperatur erwärmte. Das
berschüssige DAST 109 wurde vorsichtig mit Methanol unter Eisbadkühlung hydrolysiert
sulfat getrocknet. Nachdem das Trockenmittel
a
8.1.1 ω-Fluorohexansäureethylester 108
F
durch Fluorierung mit DAST 109[183]
Zu einer gekühlten Lösung des ω-Hydroxycarbonsäureethylesters (1 eq) gelöst in Chloroform
wurde unter Argonatmosphäre tropfenweise 3 eq Diethylaminoschwefeltrifluorid (DAST)
109, (M = 161.12, ρ= 1.23 gcm-3, bp = 31-33 ºC / 3mm Hg) gegeben. Man ließ über Nacht
rühren, wobei sich die Reaktionsmischu
ü
(vollständiges Abklingen der Gasentwicklung). Anschließend wurde mit gesättigter Natrium-
hydrogencarbonat-Lösung neutralisiert, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen
und die organische Phase über Magnesium
abfiltriert wurde, entfernte m n Lösungsmittel im Vakuum. Abschließend wurde das
Rohprodukt an Kieselgel60 chromatographiert.
1
O
OF
Die Titelverbindung 108 wurde wie in AV 5 beschriebenen hergestellt.
Es wurden 2 g (12.48 mM, 1eq) ω-Hydroxyhexansäureethylester 106 (M = 160.21 gmol-1)
und 4.9 ml (6 g, 37.45 mM, 3 eq) DAST 109 (M = 161.12, ρ= 1.23 gcm-3) in 30 ml
Chloroform eingesetzt. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von
n-Hexan / Ethylacetat (7:3, v/v) als Elutionsmittel chromatographisch gereinigt. Es wurden
1.45 g (8.98 mmol, 72 % der Theorie) der Titelverbindung 108 in Form eines hell-gelben Öls
erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.55 4.31 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
4.13 (q, 2H, 3J=7.07 Hz, CH3-CH2O), 2.30 (t, 3J=7.32 Hz, 2H, COCH2), 1.66 (mc, 4H,
CH2CH2CH2), 1.40 (mc, 2H, CH2CH2CH2), 1.28 (t, 3J=7.07 Hz, 3H, CH3-CH2O).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 173.94 (COOCH2), 85.71 82.60 (1J(C,F)=163.31 Hz,
CH2F), 60.66 (CH3-CH2O), 34.57 (COCH2), 30.68 30.28 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 25.24
25.14 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.95 (COCH2CH2), 14.63 (COOCH2CH3).
C8H15FO2 M = 162.21 gmol-1
258
18.1.2 ω-Fluorooktansäureethylester 110
O
OF
Die Titelverbindung 110 wurde wie in AV 5 beschriebenen hergestellt.
s wurden 3.2 g (17 mM, 1eq) ω-Hydroxyoktansäureethylester 104 und 6.68 ml (8.22 g, 51
mM, 3 eq) DAST 109 (M = 161.12, ρ= 1.23 gcm-3) in 50 ml Chloroform eingesetzt.
2 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 29.37 29.25
H2CH2CH2), 25.44 25.33 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 25.24 (COCH2CH2), 14.64
(COOCH2CH3).
C10H19FO2 M = 190.26 gmol-1
E
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von n-Hexan / Ethylacetat (7:3,
v/v) als Elutionsmittel chromatographisch gereinigt. Es wurden 2.68 g (14.1 mmol, 83 % der
Theorie) der Titelverbindung 110 in Form eines gelben, leicht-viskosen Öls erhalten.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ= 4.54 4.30 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
4.03 (q, 2H, 3J=7.07 Hz, CH3-CH2O), 2.27 (t, 3J=7.09 Hz, 2H, COCH2), 1.65 (mc, 4H,
CH2CH2F, COCH2CH2), 1.30 (mc, 6 H, CH2CH2CH2), 1.17 (t, 3J=7.07 Hz, 3H, CH3-CH2O).
13C NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 174.19 (COOCH2), 86.14 82.88 (1J(C,F)=163.31 Hz, CH2F),
60.57 (CH3-CH2O), 34.69 (COCH2), 30.91 30.5
(C
259
18.1.3 ω-Fluorodecansäureethylester 111
O
OF
Die Titelverbindung 111 wurde wie in AV 5 beschriebenen hergestellt.
Es wurden 2.8 g (13 mM, 1eq) ω-Hydroxydecansäureethylester 105 und 6.68 ml (6.25 g, 39 -3mM, 3 eq) DAST 109 (M = 161.12, ρ= 1.23 gcm ) in 50 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von n-Hexan / Ethylacetat (7:3,
v/v) als Elutionsmittel chromatographisch gereinigt. Es wurden 2.15 g (9.88 mmol, 76 % der
Theorie) der Titelverbindung 111 in Form eines gelben, viskosen Öls erhalten.
1 = 4.50 4.26 (dt, 3
CH2CH2F, COCH2CH2), 1.33 (mc, 10 H, CH2CH2CH2CH2CH2), 1.19 (t, J=7.07 Hz, 3H,
C
δ
3-CH2O), 34.35 (COCH2), 30.47 30.28 ( J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 29.48
CH2CH2CH2CH2), 25.13 25.08 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.94
), 14.23 (COOCH
C12H23FO2 M = 218.31 gmol-1
18.1.4 ω-Fluoromethylpalmitat 122[192]
H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ2J(H,F)=47.27 Hz, J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
4.13 (q, 2H, 3J=7.07 Hz, CH3-CH2O), 2.31 (t, 3J=7.09 Hz, 2H, COCH2), 1.58 (mc, 4H, 3
H3-CH2O).
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): = 173.82 (COOCH2), 84.97 83.34 (1J(C,F)=163.28 Hz,
CH2F), 60.11 (CH 2
29.38 29.13 29.12 (
(COCH2CH2 2CH3).
OF
O
Zu einer gekühlten Lösung von 5.0 g (17.5 mmol) Methyl-16-hydroxyhexadecanoat 121 in
25 ml Chloroform wurde unter Argonatmosphäre tropfenweise 6.84 ml (52.2 mmol) DAST
109 zugegeben. Man ließ über Nacht rühren, wobei sich die Reaktionsmischung langsam auf
Raumtemperatur erwärmte. Das überschüssige DAST 109 wurde vorsichtig mit 10 ml
Methanol unter Eisbadkühlung hydrolysiert. Anschließend wurde mit gesättigter Natrium-
hydrogencarbonat-Lösung neutralisiert, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen
und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem das Trockenmittel
abfiltriert wurde, entfernte man das Lösungsmittel im Vakuum. Das Rohprodukt wurde an
260
Kieselgel60 mit einer Mischung von Chloroform/Methanol (100:5, v/v) als Elutionsmittel
chrom %) der Zielverbindung 122 in Form
eines weißen Feststoffes erhalten.
H2CH2F,
F)=163.28 Hz,
H2F), 54.23 (CH3O), 33.48 (COCH2), 30.49 30.30 ( J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 28.85 -
CH2-Alkyl), 25.15 25.10 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.21 (COCH2CH2).
H
atographiert. Es wurden 4.2 g (14.6. mmol, 83.2
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.48 4.24 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
3.85 (s, 3H, H3CH-O), 2.28 (t, 3J=7.09 Hz, 2H, COCH2), 1.62 (mc, 4H, C
COCH2CH2), 1.31 (mc, 22 H, CH2-Alkyl).
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 174.82 (COOCH3), 84.11 82.48 (1J(C,
2C
28.38 (
C17 33FO2 M = 288.45 gmol-1
261
19 Synthese der ω-Fluorocarbonsäuren 112, 113, 114 und 122
19.1 Allgemeine Vorschrift (AV 6): Verseifung der ω-Fluorocarbonsäureester zu den
ω
ter wurde in einer Mischung von 10 N KOH
Lösung in Wasser und Methanol (1:1, v/v) suspendiert bzw. gelöst (abhängig von der
A
ch mit
hloroform. Die vereinten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet.
s Trockenmittel fernte man das Lösungsmittel im Vakuum.
19.1.1 ω-Fluorohexansäure 112
korrespondierenden -Fluorocarbonsäuren
Der zu verseifende ω-Fluorocarbonsäurees
lkylkettenlänge des eingesetzten Esters) und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktionskontrolle wurde mittels DC durchgeführt (n-Hexan / Ethylacetat (7:3, v/v).
Anschließend säuerte man die Lösung mit 1 N HCl an und extrahierte mehrfa
C
Nachdem da abfiltriert wurde, ent
OHF
O
Die Titelverbindung 112 wurde nach AV 6 hergestellt.
Es wurden 1.45 g (8.98 mM, 1eq) ω-Fluorohexansäureethylester 108 in 10 ml einer Mischung
von 10 N KOH-Lösung in Wasser und Methanol (1:1, v/v) gelöst.
Es wurden 1.07 g (8 mmol, 89 % der Theorie) der Titelverbindung 112 in Form eines Öls
erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.50 4.38 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
2.37 (t, 3J=7.32 Hz, 2H, COCH2), 1.68 (mc, 4H, CH2CH2CH2), 1.47 (mc, 2H, CH2CH2CH2).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 173.94 (COOH), 85.71 82.60 (1J(C,F)=163.31 Hz, CH2F),
33.86 (COCH2CH2), 30.12 29.92 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 24.76 24.70 (3J(C,F)=5.37 Hz,
CH2CH2CH2F), 24.23 (COCH2CH2).
C6H11FO2 M = 134.15 gmol-1
262
19.1.2 ω-Fluorooktansäure 113
O
OHF
Die Titelverbindung 113 wurde nach AV 6 hergestellt.
s wurden 3.2 g (17 mM, 1eq) ω-Fluorooktansäureethylester 110 in 10 ml einer Mischung
2 2 2
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 180.05 (COOH), 84.88 83.25 (1J(C,F)=163.31 Hz, CH2F),
3 CH2CH2F), 28.88 28.81 (CH2CH2CH2), 24.99
24.94 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 25.24 (CH2CH2CH2).
E
von 10 N KOH-Lösung in Wasser und Methanol (1:1, v/v) suspendiert.
Es wurden 2.73 g (16.8 mmol, 98 % der Theorie) der Titelverbindung 113 in Form eines
viskosen Öls erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.52 4.28 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
2.28 (t, 3J=7.09 Hz, 2H, COCH2), 1.65 (mc, 4H, CH2CH2F, COCH2CH2), 1.30 (mc, 6 H,
CH CH CH ).
3.96 (COCH2), 30.39 30.21 (2J(C,F)=19.93 Hz,
C H FO M = 162.21 gmol-1 8 15 2
263
19.1.3 ω-Fluorodecansäure 114
OH
OF
Die Titelverbindung 114 wurde nach AV 6 hergestellt.
ylester 111 in 10 ml einer Mischung
g 114 in Form eines
DCl3):δ= 4.48 4.24 (dt, 2J(H,F)=47.23 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
.28 (t, 3J=7.13 Hz, 2H, COCH2), 1.64 (mc, 4H, CH2CH2F, COCH2CH2), 1.33 (mc, 4H,
COCH2), 30.47 30.28 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 29.71 29.29 29.13 29.08
4 -Fluoropalmitinsäure 123
Es wurden 2.8 g (13 mM, 1eq) ω-Fluorodecansäureeth
von 10 N KOH-Lösung in Wasser und Methanol (1:1, v/v) suspendiert.
Es wurden 2.35 g (12.4 mmol, 95.4 % der Theorie) der Titelverbindun
weißen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz, C
2
CH2CH2CH2CH2CH2).
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 179.77 (COOCH2), 84.98 83.35 (1J(C,F)=163.28 Hz,
CH2F), 34.35 (
(CH2CH2CH2CH2), 25.13 25.08 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.94 (COCH2CH2).
C10H19FO2 M = 190.26 gmol-1
19.1. ω
OH
O
F
Die Titelverbindung 123 wurde nach AV 6 hergestellt.
Es wurden 4.2 g (14.6. mmol) ω-Fluoromethylpalmitat 122 in 10 ml einer Mischung von 10 N
KOH-Lösung in Wasser und Methanol (1:1, v/v) suspendiert.
Es wurden 3.84 g (14 mmol, 96 % der Theorie) der Titelverbindung 123 in Form eines
weißen, wachsartigen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 4.49 4.25 (dt, 2J(H,F)=47.27 Hz, 3J(H,H)=7.18 Hz 2H, CH2F),
2.31 (t, 3J=7.09 Hz, 2H, COCH2), 1.61 (mc, 4H, CH2CH2F, COCH2CH2), 1.38 (mc, 22 H,
CH2-Alkyl).
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ = 179.32 (COOH), 84.11 82.48 (1J(C,F)=163.28 Hz, CH2F),
33.48 (COCH2), 30.49 30.30 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F), 29.04 -27.98 (CH2-Alkyl), 25.323
25.18 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F), 24.74 (COCH2CH2).
C16H31FO2 M = 274.42 gmol-1
264
20 Synthese ω-fluorierter Catalipide MC6, 8, 10, 16H-F 115, 116, 117, 124
20.1.1 ω-Fluorohexansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC6H-F 115
NH
NHN O
F
1 g (7.45 mM, 1 eq)
ol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in
Elutionsmittel chromatographisch gereinigt. Es wurden 1.15 g
(400 MHz, CD3OD):δ= 7.57 (m, 1H, N=CHNH), 6.83 (m, 1H, C=CHNH), 4.46
,F 3J H2F), 3.42 (t, 3J=7.08 Hz 2H, CH2NHCO),
2.77 (t, 3J=7.08 Hz, 2H, CH ), 2.18 (t, 3J=7.33 Hz, 2H, COCH2), 1.68 (mc, 2H, CH2CH2F),
1.62 (mc 2 2 c H2CH2CH2F).
13C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.02 (HNCOCH2), 136.04 135.92 (N=CHNH,
C=CHNH), 118.02 (C=CHNH), 85.48 83.86 (1J =163.32 Hz, C 2F), 40.28 (CH2NHCO),
CH CH F), 27.77 (CH ), 26.61
M = 227.28 gmol-1
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 829 mg (7.45 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1),
ω-Fluorohexansäure 112 (M = 134.15 gmol-1), 2.3 g (11.18 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M =
206.33 gmol-1) und 1.24 ml (8.94 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g m
80 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol (95:5,
0.1 % Essigsäure) als
(5.06 mmol, 68 % der Theorie) der Titelverbindung 115 in Form eines leicht-viskosen Öls
erhalten.
1H-NMR
4.34 (dt, 2J(H )=47.74 Hz (H,H)=7.18 Hz 2H, C
2im
, 2H, COCH CH ), 1.38 (m , 2H, C
H(C,F)
36.93 (COCH ), 31.34 31.14 (2J =19.93 Hz, 2 (C,F) 2 2 2im
(COCH2CH2), 25.95 25.90 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F).
19 2F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.1 (septett, J(HF)=47.0 Hz, 3J(HF)=24.0 Hz 1F,
-CH2-CH2-F)
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C11H18FN3O ([M]+): 228.28. Gefunden: 228.48.
C11H18FN3O
265
20.1.2 ω-Fluorooktansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC8H-F 116
NHN
NH
O
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
ol-1), 2.5 g ( 15.41 mM, 1
ieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
1
,F
13
H
6.2 H2CH2CH2F).
19 2 3F
Es wurden 1.713 g (15.51 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gm
eq) ω-Fluorooktansäure 113 (M = 162.21 gmol-1), 4.77 g (23.11 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M =
206.33 gmol-1) und 2.56 ml (18.5 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in
120 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an K
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 2.16 g (8.48 mmol, 55 % der Theorie) der
Titelverbindung 116 in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ= 7.61 (m, 1H, N=CHNH), 6.85 (m, 1H, C=CHNH), 4.46
4.34 (dt, 2J(H )=47.50 Hz 3J(H,H)=6.31 Hz 2H, CH2F), 3.42 (t, 3J=7.08 Hz 2H, CH2NHCO),
2.77 (t, 3J=7.08 Hz, 2H, CH2im), 2.16 (t, 3J=7.58 Hz, 2H, COCH2), 1.69 (mc, 2H, CH2CH2F),
1.59 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.35 (mc, 6H, CH2CH2CH2).
C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.26 (HNCOCH2), 135.99 135.82 (N=CHNH,
C=CHNH), 117.99 (C=CHNH), 85.64 84.01 (1J(C,F)=164.09 Hz, CH2F), 40.21 (CH2NHCO),
37.05 (COCH2), 31.59 31.39 (2J(C,F)=19.17 Hz, CH2CH2F), 30.09 30.01 (CH2C 2), 27.72
(CH2im), 26.89 (COCH2CH2), 2 0 26.15 (3J(C,F)=5.37 Hz, C
F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.7 (septett, J(HF)=47.3 Hz, J(H )=24.1 Hz 1F,
-CH2-CH2-F)
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C13H22FN3O ([M]+): 256.34. Gefunden: 256.02.
C13H22FN3O M = 255.34 gmol-1
266
20.1.3 ω-Fluorodecansäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC10H-F 117
NHN
NH
O
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 584.2 mg (5.25 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1), 1 g (5.25 mmol, 1
eq) ω-Fluorodecansäure 114 (M = 190.26 gmol-1), 1.63 g (7.88 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M =
206.33 gmol-1) und 874 µl (6.3 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in
60 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 1.09 g (3.84 mmol, 73 % der Theorie) der
Titelverbindung 117 in Form eines weißen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz CD OD, CDCl ):δ= 7.61 (m, 1H, N=CHNH), 6.85 (m, 1H, C=CHNH),
4.46 4.34 (dt,
2 2 2
13C NMR (101.6 MHz CD OD, CDCl ): δ = 176.26 (HNCOCH ), 135.99 135.82 (N=CHNH,
C (C,F) 2 2
2 2 2 2 2
2im 2 2 (C,F) 2 2 2
5.35 MHz, CDCl3): δ = -218.4 (septett, 2J(HF)=47.1 Hz, 3J(HF)=24.4 Hz 1F,
-CH2-CH2-F)
15 26 3
, 3 3
2J(H,F)=47.50 Hz 3J(H,H)=6.31 Hz 2H, CH2F), 3.42 (t, 3J=7.08 Hz 2H,
CH2NHCO), 2.77 (t, 3J=7.08 Hz, 2H, CH2im), 2.16 (t, 3J=7.58 Hz, 2H, COCH2), 1.69 (mc, 2H,
CH2CH2F), 1.59 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.35 (mc, 6H, CH CH CH ).
, 3 3 2
=CHNH), 117.99 (C=CHNH), 85.64 84.01 (1J =164.09 Hz, CH F), 40.21 (CH NHCO),
37.05 (COCH ), 31.59 31.39 (2J(C,F)=19.17 Hz, CH CH F), 30.09 30.01 (CH CH ), 27.72
(CH ), 26.89 (COCH CH ), 26.20 26.15 (3J =5.37 Hz, CH CH CH F).
19F-NMR (23
C H FN O M = 283.39 gmol-1
267
20.1.4 4 ω-Fluoropalmitinsäure[2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid MC16H-F 12
NHN
NH
O
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 405 mg (3.64 mmol, 1 eq) Histamin 7 (M = 111.15 gmol-1), 1 g (3.64 mmol, 1 eq)
ω-Fluoropalmitinsäure 123 (M = 274.42 gmol-1), 1.13 g (5.46 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M =
206.33 gmol-1) und 606 µl (4.37 mmol, 1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in
50 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-15 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 806 mg (2.11 mmol, 58 % der Theorie) der
Titelverbindung 124 in Form eines weißen, wachsartigen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ= 7.51 (m, 1H, N=CHNH), 6.75 (m, 1H, C=CHNH), 4.45 4.33
(dt, 2J(H,F)=47.50 Hz 3J(H,H)=6.31 Hz 2H, CH2F), 3.57 (mc, 2H, CH2NHCO), 2.74 (t, 3J=7.08
Hz, 2H, CH2im), 2.11 (t, 3J=7.58 Hz, 2H, COCH2), 1.64 (mc, 2H, CH2CH2F), 1.59 (mc, 2H,
COCH2CH2), 1.21 (mc, 22H, CH2-Alkyl).
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 174.04 (HNCOCH2), 135.82 134.40 (N=CHNH,
C=CHNH), 118.39 (C=CHNH), 85.34 83.71 (1J(C,F)=164.09 Hz, CH2F), 39.00 (CH2NHCO),
36.41 (COCH2), 31.69 31.49 (2J(C,F)=19.17 Hz, CH2CH2F), 30.31-29.24 (CH2-Alkyl), 26.38
(CH2im), 25.52 (COCH2CH2), 26.10 26.05 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F).
19F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.5 (septett, 2J(HF)=46.9 Hz, 3J(HF)=24.3 Hz 1F,
-CH2-CH2-F)
C22H40FN3O M = 381.58 gmol-1
268
21
21.1 ω-Fluorooktansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC8N-Im-F 118
Synthese ω-fluorierter Catalipide MC8, 10, 16N-Im-F 118, 119, 125
O
NN N
H
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 736µl (771 mg ,6.16 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17
gmol-1, ρ = 1.049 gcm-3), 1 g (6.16 m -1
1.90 g (9.25 mmol, 1.5 eq) DCC
M, 1 eq) ω-Fluorooktansäure (M = 162.21 gmol ) 113,
73 (M = 206.33 gmol-1) und 1 ml (7.4 mmol, 1,2 eq) TEA
Titelverbindung 118 in Form eines gelben Öls erhalten.
9 Hz 3J(H,H)=6.06 Hz 2H, CH2F), 4.05 (t, 3J=6.82 3 3
(q, 2
=CHN), 129.13
(NCH=CH), 120.60 (NCH=CH), 85.63 84.01 (1J(C,F)=163.32 Hz, CH2F), 45.59 (CH2im), 37.43
CH2NHCO), 37.05 (COCH2), 31.99 (CH2CH2im), 31.58 31.38 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F),
3
septett, 2J(HF)=47.1 Hz, 3J(HF)=24.2 Hz 1F,
H2-CH2-F)
MALDI-TOF MS m/z berechnet für C14H24FN3O ([M]+): 270.37. Gefunden: 270.50.
C14H24FN3O M = 269.37 gmol-1
(M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 50 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Choroform / Methanol
(Stufengradient von 1-10 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 531 mg (1.97 mmol, 32 % der Theorie) der
1H-NMR (400 MHz,, CD3OD):δ= 7.66 (m, 1H, N=CHN), 7.14 (m, 1H, NCH=CH), 6.96 (m,
1H, NCH=CH), 4.46 4.34 (dt, 2J(H,F)=47.4
Hz, 2H, CH2im), 3.17 (t, J=6.82 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.18 (t, J=7.83 Hz, 2H, COCH2), 1.97 3J=6.85 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.70 (mc, 2H, CH CH2F), 1.62 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.37
(mc, 6H, CH2CH2CH2).
13C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.43 (HNCOCH2), 138.49 (N
(
0.18 30.00 (CH2CH2), 26.85 (COCH2CH2), 26.23 26.19 (3J(C,F)=5.37 Hz, CH2CH2CH2F).
19F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.4 (
-C
269
21.2 Decansäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC N-Im-F 119 10
O
NN N
H
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 753 µl (789 mg ,6.3 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17
orodecansäure 114 (M = 190.26 gmol-1),
ure) als Elutionsmittel
, 3 , 1H, NCH=CH), 6.96 (m,
H, NCH=CH), 4.46 4.34 (dt, 2J(H,F)=47.49 Hz 3J(H,H)=6.06 Hz 2H, CH2F), 4.05 (t, 3J=6.82
H=CH), 85.63 84.01 (1J(C,F)=163.32 Hz, CH2F), 45.59 (CH2im), 37.43
F,
H2-CH2-F)
MS m/z berechnet für C16H28FN3O ([M]+): 298.42. Gefunden: 298.30.
16H28FN3O M = 297.42 gmol-1
gmol-1, ρ = 1.049 gcm-3), 1.2 g (6.3 mmol) ω-Flu
1.95 g (9.46 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1) und 1.04 ml (7.56 mmol, 1,2 eq)
TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 50 ml Chloroform eingesetzt.
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Choroform / Methanol
(Stufengradient von 1-10 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsä
chromatographisch gereinigt. Es wurden 957 mg (3.21 mmol, 51 % der Theorie) der
Titelverbindung 119 in Form eines gelben, gelartigen Feststoffs erhalten.
1H-NMR (400 MHz, CD OD):δ= 7.66 (m, 1H, N=CHN), 7.14 (m
1
Hz, 2H, CH2im), 3.17 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2NHCO), 2.18 (t, 3J=7.83 Hz, 2H, COCH2), 1.97
(q, 3J=6.85 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.70 (mc, 2H, CH2CH2F), 1.62 (mc, 2H, COCH2CH2), 1.37
(mc, 6H, CH2CH2CH2).
13C NMR (101.6 MHz, CD3OD): δ = 176.43 (HNCOCH2), 138.49 (N=CHN), 129.13
(NCH=CH), 120.60 (NC
(CH2NHCO), 37.05 (COCH2), 31.99 (CH2CH2im), 31.58 31.38 (2J(C,F)=19.93 Hz, CH2CH2F),
30.39 30.24 30.18 30.00 (CH2CH2), 26.85 (COCH2CH2), 26.23 26.19 (3J(C,F)=5.37 Hz,
CH2CH2CH2F).
19F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.1 (septett, 2J(HF)=47.0 Hz, 3J(HF)=24.0 Hz 1
-C
MALDI-TOF
C
270
21.3 ω-Fluoropalmitinsäure(3-imidazol-1-yl-propyl)-amid MC16N-Im-F 125
NN N
H
O
F
Die Titelverbindung wurde nach AV 4 hergestellt.
Es wurden 434 µl (455 mg, 3.64 mmol, 1 eq) 1, 3-Aminopropylimidazol 72 (M = 125.17
gmol-1, ρ = 1.049 gcm-3), 1 g (3.64 mmol, 1 eq) ω-Fluoropalmitinsäure 123 (M = 274.42
gmol-1), 1.13 g (5.46 mmol, 1.5 eq) DCC 73 (M = 206.33 gmol-1) und 606 µl (4.37 mmol,
1,2 eq) TEA (M = 101.19 g mol-1, ρ = 0.73 g cm-3) in 80 ml Chloroform eingesetzt.
n.
,
l).
F-NMR (235.35 MHz, CDCl3): δ = -218.4 (septett, 2J(HF)=47.2 Hz, 3J(HF)=24.2 Hz 1F,
-C
22H40FN3O M = 381.58 gmol-1
Das Rohprodukt wurde an Kieselgel60 mit einem Gemisch von Chloroform / Methanol
(Stufengradient von 1-10 % Methanol in Chloroform, 0.1 % Essigsäure) als Elutionsmittel
chromatographisch gereinigt. Es wurden 875 mg (2.29 mmol, 63 % der Theorie) der
Titelverbindung 125 in Form eines gelben, wachsartigen Feststoffs erhalte
1H-NMR (400 MHz,, CDCl3):δ= 7.48 (m, 1H, N=CHN), 7.05 (m, 1H, NCH=CH), 6.93 (m,
1H, NCH=CH), 5.65 (sbr, 1H, NH), 4.48 4.36 (dt 2J(H,F)=47.49 Hz 3J(H,H)=6.06 Hz 2H, CH2F),
3.98 (t, 3J=6.82 Hz, 2H, CH2im), 3.27 (mc, 2H, CH2NHCO), 2.14 (t, 3J=7.83 Hz, 2H, COCH2),
1.97 (q, 3J=6.85 Hz, 2H, CH2imCH2), 1.71 (mc, 2H, CH2CH2F), 1.60 (mc, 2H, COCH2CH2),
1.24 (mc, 22H, CH2-Alky
13C NMR (101.6 MHz, CDCl3): δ = 173.70 (HNCOCH2), 137.20 (N=CHN), 129.80
(NCH=CH), 118.96 (NCH=CH), 85.18 83.56 (1J(C,F)=163.93 Hz, CH2F), 44.88 (CH2im), 36.91
(CH2NHCO), 36.87 (COCH2), 31.49 (CH2CH2im), 30.65 30.45 (2J(C,F)=19.76 Hz, CH2CH2F),
29.74-29.37 (CH2-Alkyl), 25.84 (COCH2CH2), 25.31 25.25 (3J(C,F)=5.85 Hz, CH2CH2CH2F).
19
H2-CH2-F)
C
271
22 Synthese von DNA-Catalipid Konjugaten
Die modifizierten Oligonukleotide Cy5-TTCCGp 3, NH2-CGGAA 4 und
Cy3-TTCCGCGGAA 5 standen gelöst in einem Gemisch aus Wasser / Acetonitril (80:20,
der Verwendung eines Oligonukleotids im
ie Aufreinigung der DNA-Catalipid Konjugate erfolgte mittels RP-HPLC. Zur Auftrennung
B
Die Flussrate betrug 1 ml / min und das Injektionsvolumen 200 µl. Die Detektion erfolgte bei
2
zur Entsalzung der RP-HPLC gereinigten DNA-
Die Entsalzung der RP-HPLC gereinigten DNA-Catalipid Konjugate 74, 88, 89 und 90
erfolgte über HLB-Oasis Tm Extrationskartuschen der Firma Walters.
Im ersten Schritt wurden das HLB-Füllmaterial (H
v/v) bekannter Konzentration zur Verfügung. Vor
entsprechenden Experiment, entnahm man diesen Stammlösungen ein der einzusetzenden
Stoffmenge entsprechendes Volumen und entfernte das Lösungsmittel im SpeedVac.
Die Synthesen der Oligonukleotide 3, 4 und 5 sind in den Arbeiten von Bülle und Schöneborn
beschrieben.[81, 83, 98]
22.1 Allgemeine Vorschrift (AV 7) zur Aufreinigung und Analyse der DNA-Catalipid
Konjugate mittels RP-HPLC
D
verwendete man einen 0.1 M NH4CO3-Puffer (pH 8.5) gegen einen Acetonitril Gradienten. Es
wurden zwei unterschiedliche Gradienten-Programme eingesetzt: Zur Isolierung und Analyse
der DNA-Catalipid Konjugate Gradient A; zur Analyse der Ligationsexperimente Gradient B.
Gradient A: 25 % → 30 % in 35 min
Gradient : 20 % → 65 % in 1 h
54 nm und 648 nm (Cy5-Extinktion).
Zur Analyse der Ligation erfolgte die Detektion bei 254 nm, 648 nm (Cy5-Extinktion) und
zusätzlich bei 548 nm (Cy3-Extinktion).
22.2 Allgemeine Vorschrift (AV 8)
Catalipid Konjugate
ydrophilic-Lipophilic-Balanced) durch
Durchsaugen von 1 ml Methanol (abhängig vom Kartuschenvolumen; hier: 1 ml)
konditioniert. Nachfolgend wurde mit 1 ml Wasser äquilibriert, bevor die Probe in flüssiger
Form auf die Kartusche aufgebracht wurde. Die nach der RP-HPLC Aufreinigung im
Elutionsmittel gelösten Proben wurden vor der Entsalzung mit bidestiliertem Wasser
272
verdünnt, da ein zu großer Anteil Acetonitril die Adhäsion des DNA-Catalipid Konjugats auf
an im ersten Arbeitsgang das
s
(80:20,
samten Vorgangs vermieden.
dem HLB-Füllmaterial verhinderte. Zur Entsalzung entfernte m
vollständige Volumen des Elutionsmittels, wobei die Adhäsion des Konjugat auf dem
Füllmaterial der Kartusche aufgrund der Fluoreszenzfarbstoff Markierung (Cy5) gut
beobachtet werden konnte. Nachfolgend spülte man in einem zweiten Arbeitsgang mit 1 bis
2 ml bidestiliertem Wasser (Waschlösung), bei einer Flussrate von ~ 1 ml / min.
Abschließend wurde das Konjugat mit einer Mischung von Acetonitril und Wasser
v/v) von der HLB-OasisTm Extrationskartuschen eluiert. Ein Trockenlaufen der Kartuschen
wurde während des ge
22.3 „Modell-Konjugat“ 78
O
NNN P
OO
O
O
N
N
N
NH
NH2
OH
Zu 10 µmol 2-(1H-Imidazol-4-yl)-ethyl]-dioktylamin 28 („Modell“-Catalipid) wurden 50 µl
einer 0.02 M Lösung (1 µmol) Guanosin-5`-monophosphat 76 gelöst in einer 0.2 M EDC
7.2 (NaOH), 20 vol % CH CN) gegeben und für 24 h zur
AV 2) entsalzt und nachfolgend direkt mittels ESI-
(ESI) m/z berechnet für [M-H]-: 663.79. Gefunden: 663.7.
M = 664.79 gmol-1
Lösung (0.1 M HEPES-Puffer pH 3
Reaktion gebracht. Die Reaktionslösung wurde nach Verdünnen mit Wasser (1 : 100 v/v) über
eine Oasis Tm-Extraktionskartusche (siehe
MS analysiert.
MS
C31H53N8O6P
273
22.4 Synthese der Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 74, 88, 89 und 90
Die MCH-Catalipide 74, 88, 89 und 90 zeigten in Abhängigkeit ihrer Lipophilie
unterschiedliche Löslichkeiten im 0.1 M HEPES-Puffer pH 7.2 (NaOH), 20 vol % CH3CN.
Zur Herstellung 10 mM ungetrübter Lösungen wurden somit unterschiedliche Volumina DMF
zum Puffer zugegeben (siehe Tabelle 25).
Tabelle 25. Angabe der prozentualen Zusätze von DMF zum 0.1 CH3CN zur Herstellung 10 mM ungetrübter Catalipid-Lösunge
M HEPES-Puffer pH 7.2 (NaOH), 20 vol % n.
Catalipid Zugabe DMF in [vol %]
MOH 39 15 vol %
MC6H 84 ------
MC8H 85 2.5 vol %
MC10H 86 5 vol %
n wurden 100 µL der ungetrübten 10 mM Catalipid-Lösung (0.2 m EDC) zu
ol Cy5-TTCCGp 3 gegeben und für 4 Stunden bei 35 ºC in einem Thermoschüttler zur
einer Teil der Lösung mit
asser / Acetonitril (80:20, v/v) verdünnt und direkt über RP-HPLC analysiert. Zeigte die
s hende Produk
ie Auftrennung mittels RP-HPLC (siehe AV 7).
Die Entsalzung der RP-HPLC gereinigten Cy5-TTCCG-MCH Konjugate erfolgte mit HLB-
Oasis Tm Extrationskartuschen der Firma Walters (siehe AV 8).
Die UV-spektrometrische Konzentrationsbestimmung der DNA-Catalipid Konjugate wurde
bei einer Wellenlänge von 646 nm durchgeführt. Die Berechnung der Konzentration erfolgte
unter Verwendung des Lambert Beer’schen Gesetzes mit dem molaren
Extinktionskoeffizienten des Cy5-Farbstoffs.[155] Die Charakterisierung der Cy5-TTCCG-
MCH Konjugate 74, 88, 89 und 90 erfolgte mittels RP-HPLC (Gradient A) und MALDI-TOF
Massenspektrometrie.
Zur Herstellung ungetrübter Lösungen suspendierte man zuerst das entsprechende Catalipid in
dem in Tabelle 25 angegebenen Puffer im Ultraschallbad für 30 min. Lagen unlösliche
Bestandteile vor, erwärmte man die Dispersion bis zum vollständigen Lösen auf 55 ºC. Erst
nach Abkühlen auf ≤ 35 ºC setzte man dann diesen Lösungen abgestimmte Mengen EDC 2
zu, so dass eine finale EDC-Konzentration von 0.2 M im jeweiligen Puffer erreicht wurde.
Zur Konjugatio
100 nm
Reaktion gebracht. Zur Reaktionskontrolle wurde ein kl
W
Analy e ausreic tbildung (Reaktionszeiten zwischen 3 und 5 Stunden), erfolgte
d
274
Die Analysedaten sind in Tabelle 26 angegeben.
-MCH Konjugate 74, 8, 89 und 90 und dem eingesetzten Edukt Cy5-TTCCGp 3.
r
Tabelle 26. Zusammenstellung der Analysedaten zur Charakterisierung der Cy5-TTCCG8 DNA-Catalipid
Konjugat
M
(theoretisch)
m/z
(gefunden)
Retentionszeit
(Gradient A)
Ausbeute
[nmol]
Cy5-TTCCGp-
MOH 74 2423.19 2424.390 23 min 35 nmol
Cy5-TTCCGp-2258.91 2259.013 15 min 78 nmol
MC6H 88
Cy5-TTCCGp-
MC8H 89 2286.96 2287.808 18 min 63 nmol
Cy5-TTCCGp-
MC10H 90 .01 2316.296 19 65 nmol 2315 min
Cy5-TTCCGp 3 .64 2066.745 10.5 m ----- 2065 in
Die im Vergleich zu den kurzkettigeren DNA-Catalipid Konjuga gere Ausbeute des
y5-TTCCGp-MOH Konjugats 74 ist unter anderem auf starke Wechselwirkungen mit dem
72
ten MCN-Im Catalipid war eine Isolierung
ten gerin
C
HLB-Material der Oasis-Kartusche zurückzuführen. Selbst ein hoher DMF-Anteil im
Elutionsmittel ermöglichte nicht die vollständige Ablösung des Konjugats 74 von der
stationären Phase - gut zu beobachten durch die intensive Blaufärbung.
Die Durchführung der Experimente zur Synthese von Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugaten mit
den MC6, 8, 10 N-Im Catalipiden 91, 92 und 93 und MON-Im 72 (1, 3-Aminopropylimidazol
als Grundgerüst) als Kopplungspartner, wurde analog den MCH-Catalipid Konjugations-
experimenten durchgeführt.
Die Zugabe von DMF zum 0.1 M HEPES-Puffer pH 7.2 (NaOH), 20 vol % CH3CN zur
Herstellung ungetrübter MCN-NIm Lösungen war jedoch nur im Fall des langkettigen MON-
Im Catalipids 72 notwendig (5 vol % ); die kurzkettigeren MCN-Im Catalipide 91, 92 und 93
lösten sich ungetrübt. Unabhängig vom eingesetz
und / oder Charakterisierung von Cy5-TTCCG-MCN-Im Konjugaten nicht möglich.
275
23 Ligationsexperimente
In den durchgefü
5-TTCCG-M
hrten L onsexperimen tzte ma die ren
Cy CH un
D y5-TTC Konjug nmittelba m Ligatio ent
synthetisiert, gereinigt (siehe AV 7) und entsalzt (siehe AV 8). Die Konzentration wurde UV-
spektrom bestim
Nach der Entsalzung lagen die Cy5-TTCCG-MCH Konjugate gelöst in einer Lösung von
Wasser / Acetonitril (80:20, (v:v) vor. Die Entfernung des Lösungsmittels im S
da de Re im Lig r 80 (0 PES-Puf 7.2
(Na M NaCl und 20 vol % CH3CN) zeigte eine deutlich verstärkte Hydrolyse aller
K 9 und P-HPLC zeigten möglichst schonende
erstellung von Cy5-TTCCGMCH Konjugat Lösungen - bekannter Konzentration - im
GGAA 4 10 µl einer
n 4 nmol (40 mol %) Cy3-TTCCGCGGAA 5 und 10 nmol
t wurde.
Dann injizierte man 100 µl dieser Lösung in die HPLC und nahm das Elutionsdiagramm auf.
Zur Kontrolle konnte das HPLC-Einzelexperiment mit der verbliebenen Lösung wiederholt
werden.
Die RP-HPLC Analyse erfolgte mit Gradient B (20 % → 65 % in 1 h), wobei die
Wellenlängen bei 254 nm, 648 nm (Cy5-Extinktion) und zusätzlich bei 548 nm
(Cy3-Extinktion) detektiert wurden.
igati
Konjugate 88, 89
ten se n ausschließlich kurzkettige
d 90 ein.
as reaktive C CG-MCH at wurde u r vor de nsexperim
etrisch mt.
peedVac und
s nachfolgen
OH), 50 m
hydrieren ationspuffe .1 M HE fer, pH =
onjugate 88, 8 90, wie R Analysen . Um eine
H
Ligationspuffer zu ermöglichen, pipettierte man daher direkt zu den in Wasser / Acetonitril
(80:20, (v:v) gelösten Konjugaten das berechnete Volumen HEPES-Puffer pH = 7.2 (NaOH)
und NaCl in Wasser / Acetonitril (80:20, (v:v), so dass 1 mM Lösungen Cy5-TTCCG-MCH
Konjugate im Ligationspuffer 80 erhalten wurden.
In einem PCR-Eppendorf Reaktionsgefäß wurden zu 10 nmol NH2-C
1 mM Lösung der entsprechenden Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89 und 90 in
Ligationspuffer 80 gegeben, sonifiziert und bei 20 ºC im Thermocyler (mit aufgesetzter Heat-
Bonnet) inkubiert.
Zur Templat-Zugabe wurde
NH2-CGGAA 4 in 10 µl einer 1 mM Lösung der entsprechenden Cy5-TTCCG-MCH
Konjugate 88, 89 und 90 in Ligationspuffer 80 gegeben, sonifiziert und ebenfalls bei 20 ºC im
Thermocyler (mit aufgesetzter Heat-Bonnet) inkubiert.
Zur Reaktionskontrolle entnahm man jeweils nach bestimmten Reaktionszeiten 1 µl der
Reaktionslösung, die umgehend mit 200 µl Wasser / Acetonitril (80:20, v/v) verdünn
276
Es zeigte sich, dass trotz verwendeter DNA- und Protein- Low-Bind®-Tubes der Firma
andung auftrat, unabhängig vom eingesetzten
onjugat 88, 89 und 90. Dies erschwerte - neben der Hydrolyse der Konjugate - die
ersuchung der Ligation durchgeführt werden.
Eppendorf eine starke Filmbildung an der W
K
Reproduzierbarkeit der Experimente. Auch die Verwendung von Glaskapillaren zeigte eine
ähnliche Filmbildung.
Aufgrund der vielfältigen ungelösten Probleme zur Durchführung reproduzierbarer,
kinetischer Untersuchungen bezüglich der Probenvorbereitung und Analytik konnte keine
quantitative, kinetische Unt
In Tabelle 27 sind die Retentionszeiten der eingesetzten Cy5-TTCCG-MCH Konjugate 88, 89
und 90 und die des Ligationsproduktes Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 angegeben. Die
Charakterisierung der Reaktanden erfolgte mittels MALDI-TOF MS.
Tabelle 27. Zusammenstellung der Analysedaten der Ligationsexperimente mit Cy5-TTCCG-MCH Konjugaten 88, 89 und 90.
Verbindung Mr (theoretisch) m/z (gefunden) Retentionszeit (Gradient B)
NH2-CGGAA 4 1510.5 1510.644 2-3 min
Cy3-TTCCGCGGAA 5 3533.6 3535.763 6-7 min
Cy5-TTCCGp-nCGGAA 94 3558.6 3561.573 8-9 min
Cy5-TTCCGp 3 2065.6 2067.485 10-10.5 min
Cy5-TTCCG-MC6H 88 2258.9 2258.394 11-12 min
Cy5-TTCCG-MC8H 89 2286.9 2286.510 12-13 min
Cy5-TTCCG-MC10H 90 2315.01 2316.296 13-14 min
277
24 Catalipid-Vesikelherstellung
24.1 Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode
Die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode zur Vesikelherstellung basiert auf dem
behutsamen Rehydrieren eines dünnen Lipid-Films in einem Dispersionsmedium (siehe
3.2.4.2).[26, 28, 126] Die Durchführung erfolgte in separaten Arbeitsschritten, die im folgenden
s wurden 0.02 M Stammlösungen der Catalipide MOH 39 (M = 375.60 gmol-1) und
ergestellt. Zum vollständigen Lösen sonifizierte man die Lösungen 10 min.
Stam 02 M f 9
Stam 2 M DOSH Chloroform nol (9:1, v/v)
Die Herstellung von MOH 39 54- 67 Lipid-Mischungen, erfolgte
durc be abges Volum r 4 mM Cholesterin-Lösung
(Chloroform / Methanol (1:1, v den Stamm 1 und 2:
S 39 / 10 Cholester
Z ung 1 m 39) wurden ner 4 mM
Cholesterin-Lösung pipettiert (entsprechend 10 mol % Cholesterin 67).
Stammlösung 4 DOSH 54 / 15 % mol Cholesterin 67:
Zu 100 µl Stammlösung 2 (entspricht 2 µmol DOSH 54) wurden 75 µl einer 4 mM
Cholesterin-Lösung pipettiert (entsprechend 15 mol % Cholesterin 67).
Nach gutem Vermischen wurden die klaren Lösungen zur Herstellung von Catalipid-Filmen
eingesetzt.
24.1.2 Herstellung der Catalipid-Filme (Dehydrierung):
Die Herstellung der Catalipid-Vesikel erfolgte in verschraubbaren 2 ml Glasfläschchen, die
vor dem Gebrauch zum Entfernen möglicher Verunreinigungen ausgiebig, nacheinander mit
Methanol und Chloroform gespült wurden. Anschließend wurde 100 µl der 0.02 M Catalipid
Stammlösungen 1 oder 2, entsprechend 2 µmol Catalipid oder 150 µl der Stammlösung 3
oder 4, entsprechend 2 µmol Catalipid mit jeweiligem Cholesterin-Zusatz, in diese
Glasfläschchen pipettiert.
detailliert beschrieben werden.
24.1.1 Herstellung der Stammlösungen:
E
DOSH 54 (M = 727.14 gmol-1) in einem Gemisch von Chloroform / Methanol (9:1, v/v)
h
mlösung 1: 0. MOH 39 in Chloro orm / Methanol ( :1, v/v)
mlösung 2: 0.0 54 in / Metha
- und DOSH Cholesterin
h die Zuga timmter ina eine
/v)) zu lösungen
tammlösung 3 MOH mol % in 67:
u 100 µl Stammlös (entspricht 2 µ ol MOH 50 µl ei
278
Zur Herstellung des Lipid-Films wurde das organische Lösungsmittel unter ständigem,
Argonstrom verdampft (dehydriert). Es wurde
arauf geachtet, dass ein möglichst ungleich dünner Catalipid-Film - durch langsames und
et wurde. Der inhomogene
soll die Wahrscheinlichkeit der Vesikelbildung im Rehydrierungsschritt erhöhen
24.1.3
e Lipid-
noch nicht rehydrierte Lipid-Film-
47 gezeigte Elektroformationskammer eingesetzt. Als Rehydrierungsmittel wurde
ausschließlich bidestilliertes W ilm auf die Pt-Drähte
Schichtdicken entstanden. Die durchgeführten Experimente
langsamem Drehen des Gebindes in leichtem
d
schnelleres Drehen des Gebindes - an der Glaswandung ausgebild
Lipid-Film
- über verschieden präorganisierte Lipid-Doppellagen. Um das Lösungsmittel vollständig aus
dem aufgebrachten - teilweise blasenartigen - Catalipid-Film zu entfernen, wurde die Probe
über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Spuren von organischen Lösungsmitteln im
Rehydrierungsprozess verhindern die Vesikelbildung.
Rehydrierung des Catalipid-Films
Zu 2 µmol des auf die Glaswandung des Reaktionsgefäßes abgeschiedenen Catalipid-Films
gab man 500 µl des entsprechenden Rehydrierungsmittels. Die Zugabe des
Rehydrierungsmittels erfolgte langsam und äußerst vorsichtig, so dass sich der dünn
Film nicht vorzeitig ablöste. Nachdem der Rehydrierungspuffer vollständig zugegeben wurde,
konnte umgehend das Quellen des Lipid-Films beobachtet werden, erkennbar an der
Schlierenbildung (Phasengrenzfläche Lipid-Film / Rehydrierungspuffer). In diesem Zeitraum
vermied man im Besonderen größere Erschütterungen der Probe, um unnötige, äußere,
schädliche Einflüsse im Vesikelbildungsprozess zu vermeiden. Nach einer Reaktionszeit von
90 min vortexte man die Dispersion (vorsichtig!), um
bestandteile zu dispergieren. Nach weiteren 30 min wurde die Dispersion mikroskopisch
untersucht (Probenvorbereitung siehe 24.6).
24.2 Elektroformation an Pt-Elektroden
Zur Herstellung von Catalipid-Vesikeln über Elektroformation an Pt-Elektroden wurde die in
Abbildung
asser verwendet. Um den Lipid-F
aufzutragen, verwendete für das MOH Catalipid die Stammlösung 3 (MOH 39 /
10 mol % Cholesterin); für das DOSH Catalipid die Stammlösung 4 (DOSH 54 /
15 % mol Cholesterin) (siehe 24.1.1).
Auf beide Pt-Drähte wurden unterschiedliche Volumina (zwischen 10 µl und 50 µl) der
entsprechenden CatalipidStammlösung - möglichst partiell und inhomogen - aufgetragen, so
dass unterschiedliche Lipid-Film
279
zeigten, dass möglichst dünne Lipid-Filme zur bevorzugten Ausbildung von unilamellareren
CatalipidVesikeln führten. Nachdem die Pt-Drähte mit den Lipid-Filmen beschichtet wurden,
trocknete man diese zusätzlich im Hochvakuum für 12 h, um die vollständige Entfernung des
Lösungsmittels zu gewährleisten.
Bevor die Pt-Drähte in die mit bidestilliertem Wasser gefüllte Petri-Schale getaucht wurden,
schaltete man den Frequenzgenerator ein, um ein vorzeitiges rehydrieren des Lipid-Films,
ohne angelegte Wechselspannung, zu verhindern. Die Pt-Drähte wurden so in der Petri-Schale
ausgerichtet, dass ihr innerer Abstand ca. 2 mm betrug.
Zur Steuerung des Frequenzgenerators PCG 10/8016 setzte man die vom Hersteller vellemann
erhältliche Software Pc-Lab 2000 ein. Die Elektroformation wurde mit einer Wechsel-
s ung von 0.5 V gestartet. Die Spannung wurde
in Photo des Aufbaus der verwendeten ITO-Elektroformationskammer ist in Abbildung 48
gezeigt. Der oberer Rand beider ITO-Glasplatten (5.5 cm x 5 cm x 1 mm, I
pannungsfrequenz von 10 Hz und einer Spann
alle 30 min in 0.5 V Schritten bis auf eine Endspannung von 3.5 V erhöht, bei gleich-
bleibender Frequenz von 10 Hz.
Nach Beendigung des Programms wurde der Frequenzgenerator ausgeschaltet und nach
weiteren 5 min entnahm man, möglichst in direkter Nähe der Pt-Elektroden, die Dispersion.
Hierzu verwendete man eine 100 µl Eppendorf-Spitze, deren Durchmesser durch
Abschneiden der oberste Spitze vergrößert wurde, um Scherkräfte, die beim Einsaugen der
Dispersion in die Spitze auftreten, möglichst zu unterbinden. Nachfolgend wurde die
Dispersion mikroskopisch untersucht (Probenvorbereitung siehe 24.6).
24.3 Elektroformation in einer ITO-Elektroformationskammer
E
ndium Tin Oxide,
er, PA, USA) wurde mit einem Kupferblech
antelt, an das jeweils eine Öse gelötet wurde, um über Krodilklemmen einen Anschluss
das vollständige Entfernen des Lösungsmittels zu
ITO 15– 0 Ω/cm, SPI Supplies, West Chest
umm
an den Frequenzgenerator zu ermöglichen. Zur Auftragung des Lipid-Films wurde die
untenliegende Glasplatte - möglichst zentriert - mit 50 µl der Stammlösung 3 (MOH 39 /
10 mol % Cholesterin, siehe 24.1.1) auf ihrer ITO-beschichteten Seite inhomogen benetzt.
Das Lösungsmittel wurde in leichtem Argonstrom so verdampft, dass ein möglichst dünner
Lipid-Film durch Trocknung entstand. Die mit dem Catalipid-Film beschichtete ITO-Platte
wurde im Hochvakuum getrocknet, um
gewährleisten.
Um die Elektroformationskammer zusammenzusetzen, wurde ein ca. 2 mm dicker
rechteckiger Teflon-Rahmen, der auf beiden Stegen mit wasserunlöslichem Silikonfett zur
280
besseren Fixierung und Abdichtung des Reaktionsraums versehen war, zwischen beide ITO-
Glasplatten geklebt. Der Teflon-Rahmen war auf den beiden kürzeren Seiten mittig
durchbohrt. Nach Anlegen des Wechselstroms (um ein Ablösen des Lipid-Films ohne
angelegte Wechselspannung zu vermeiden), wurde die Kammer mit bidestilliertem Wasser
die gesamte Kammer mit Wasser zu
auf eine Endspannung von 3.5 V erhöht wurde, bei gleich-
10 mol % Cholesterin Vesikel und DOSH 54/ 15 mol % Cholesterin Vesikel
ethylrhodamin (TAMRA) markierter DNA setzte man eine
durch die eine Durchbohrung befüllt, durch die zweite konnte die entweichende Luft
austreten. Beim Befüllen der Kammer wurde darauf geachtet, dass keine starken
Verwirbellungen im Inneren der Kammer auftraten, um ein ungewolltes, vorzeitiges Ablösen
des Lipid-Films zu verhindern. Auch ist es notwendig
befüllen, so dass keine größeren Luftblasen zurückbleiben.
Zur Steuerung des Frequenzgenerators PCG 10/8016 setzte man die vom Hersteller vellemann
erhältliche Sofware Pc-Lab 2000 ein. Die Elektroformation wurde mit einer Wechsel-
spannungsfrequenz von 10 Hz und einer Spannung von 0.5 V gestartet, wobei die Spannung
alle 30 min in 0.5 V Schritten bis
bleibender Frequenz von 10 Hz.
Nach beendeter Elekroformation löste man vorsichtig beide ITO-Glasplatten voneinander und
entnahm in direkter Nähe der unterer Glasplatte, auf die der Lipid-Film aufgetragen wurde,
die Dispersion und untersuchte diese mikroskopisch (Probenvorbereitung siehe 24.6).
24.4 Einkapselung von mit Fluoreszenzfarbstoff markierter DNA in MOH 39 /
24.4.1 Modifizierte Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode:
Zur Einkapselung Fluoreszenzfarbstoff-markierter DNA wurde eine leicht abgewandelte
Variante der bereits beschriebenen Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode zur
Vesikelherstellung angewandt. Die Herstellung der Catalipid-Filme verlief analog 24.1.2,
wobei 150 µl Stammlösung 3 (2 µmol MOH 39 / 10 mol % Cholesterin) und 150 µl
Stammlösung 4 (2 µmol DOSH 54 / 15 % mol Cholesterin) eingesetzt wurden (siehe 24.1.1).
Zur Einkapselung von DNA wurde der Rehydrierungsprozess modifiziert und erfolgte in zwei
aufeinander folgenden Arbeitsgängen: Im ersten rehydrierte man den Lipid-Film in einer
gepufferten Lösung, in der mit Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA gelöst war:
Zur Einkapselung von Tetram
2 µM Lösung des einzelsträngigen 15 mer Oligonukleotids (TAMRA-
CGTATGAACGTCATC) 68 gelöst in 4 mM HEPES-Puffer pH = 7 (NaOH) ein. Im ersten
281
Rehydrierungsschritt wurden 50 µl dieser Lösung zum Catalipid-Film (2 µmol MOH 39,
10 mol % Cholesterin; bzw. 2 µmol DOSH 54, 15 mol % Cholesterin) gegeben. Nach einer
ersten Entwicklungszeit von 30 min wurde dann alle 30 min das Gebinde vorsichtig gedreht,
so dass der Rehydrierungspuffer den aufgebrachten Lipid-Film vollständig von der Wandung
löste. Der Rehydrieungsprozess dauerte so ca. 2 h. Nachfolgend verdünnte man die
Dispersion mit 450 µl 4 mM HEPES-Puffer pH = 7 (NaOH) und untersuchte die Dispersion
licht- und fluoreszenzmikroskopisch (Probenvorbereitung siehe 24.6).
24.4.2 Gefriertrocknungs-Methode:[154]
Die Gefriertrocknungs-Methode wurde in Anlehnung an das von Deamer et. al. beschriebene
Verfahren erarbeitet.[154] Hierzu wurde analog der modifizierten Dehydrierungs-
Rehydrierungs-Methode (siehe 24.4.1) die entsprechenden Catalipid-Filme (150 µl Stamm-
lösung 3 entsprechend 2 µmol M
OH 39, 10 mol % Cholesterin bzw. 150 µl Stammlösung 4
zw. B,
abhängig vom einzukapselnden Oligonukleotid:
ehydrierungslösung B:
2 µM TAMRA-CGTATGAACGTCATC 68 in bidestilliertem Wasser.
Zur Herstellung hom ossener Fluoreszenz-
markierter DNA, wurde die Dispersion nach einer Reaktionszeit von 2 h für 5 min
entsprechend 2 µmol DOSH 54, 15 mol % Cholesterin) auf die Glaswandung des Gebindes
aufgebracht.
Die Rehydrierung des Catalipid-Films erfolgte in 50 µl der Dehydrierungslösung A b
Dehydrierungslösung A:
2 µM Lösung Cy3-TTCCGp 69 in bidestilliertem Wasser.
D
ogener Teilmembranen mit statistisch eingeschl
farbstoff-
im Ultraschallbad bei RT sonifiziert.
Zur Gefriertrocknung wurden dann die entsprechenden Catalipid-Dispersion in flüssigem
Stickstoff schock-gefroren und in einer Gefriertrocknungsanlage (Alpha 1-2, Firma Christ)
über Nacht getrocknet. Der so erhaltene fein-poröse Rückstand wurde dann zur
Vesikelbildung in 500 µl 4 mM HEPES-Puffer pH = 7 (NaOH) gelöst, wobei sich die
gebildeten Teilmembranfragmente zu Vesikelmembranen zusammenschlossen. Abschließend
untersuchte man die Dispersion licht- und fluoreszenzmikroskopisch (Probenvorbereitung
siehe 24.6).
282
24.5 Einfluss von Übergangsmetall-Ionen auf die MOH 39 / 10 % Cholesterin 67
Catalipid Vesikelbildung
Zur Herstellung der Übergangsmetallsalz enthaltenden Rehydrierungspuffer löste man
entsprechende Stoffmengen der Metallsalze in HEPES-Puffer (4 mM, pH = 7.2 (NaOH), so
dass 4 mM Metallsalz-Lösungen vorlagen. Es wurden folgende Metallsalze eingesetzt:
CoCl2 x 6 H20 (M = 273.93), NiCl2 x 6 H2O (M = 237.69), ZnCl2 (M = 136.2), CuSO4 x 6 H20
(M = 249.69).
2 µm MOH 39 / 10 % Cholesterin
atalipid-Films (150 µl Stammlösung 3, siehe 24.1.2) wurden in 500 µl des entsprechenden
nvorbereitung der Catalipid-Dispersionen zur mikroskopischen Analyse
it Abdeckglas
an 45 µl der Dispersion auf einen Objektträger aus Glas
rma Menzel-Gläser). Den 45 µl
an vorsichtig auf einer Fläche von ca. 20x20 mm aus und ließ auf
a Menzel-Gläser)
hl ein Verrutschen der Glasplatten gegeneinander als
ol des auf der Wandung des Glasfläschchens aufgebrachtem
C
4 mM Metallsalz-enthaltenden 4 mM HEPES-Puffers pH = 7.2 rehydriert (siehe 24.1.3). Die
mikroskopische Analyse der Dispersionen erfolgte nach einer Reaktionszeit von 2 h bei RT
(Probenvorbereitung siehe 24.6).
24.6 Probe
24.6.1 Probenvorbereitung: Objektträger m
Zur Probenvorbereitung pipettierte m
(transparent, unbekantet, 76x26 mm, 1 mm dick, Fi
Dispersionstropfen breite m
diesen schräg ein Abdeckgläschen (24x24 mm, 0.13-0.16 mm dick, der Firm
fallen. Der Einschluss von Luftblasen wurde hierbei vermieden. Zur Fixierung des
Abdeckgläschens wurden die Übergänge vom Abdeckgläschen zum Objektträger mit klarem
Nagellack versiegelt. So wurde sowo
auch ein Verdampfen des Lösungsmittels während der mikroskopischen Analyse verhindert.
Objektträger und Abdeckgläser wurden zuvor mit einer Lösung von Methanol und
Chloroform gesäubert.
283
24.6.2 Probenvorbereitung: Frame-Seal™ Kammern
id-Dispersion auf einen Objektträger zu
0.13-0.16 mm dick, der Firma Menzel-Gläser) ver-
™ Kammer schweben; zum anderen ist so auch eine
eie, ungestörte mikroskopische Betrachtung der Strukturen möglich, da diese aufgrund der
höheren Füllhöhe nicht so schnell auf der Glasoberfläche adsorbiert werden.
25 izellen Modells
zusammen mit der Catalipid-Dispersion in ein NMR-Röhrchen. Die
Emulsion / Dispersion (abhängig vom eingesetzten Catalipid) wurde für 5 min im
Ultraschallbad sonifiziert.
Der Probenkopf des 250 MHz NMR-Spektrometers (Bruker DPX 250) wurde mit der Probe
beschickt und ein Referenzspektrum aufgenommen.
Nach beendeter Aufnahme des Referenzspektrums entnahm man dem Probenkopf das NMR-
Röhrchen und gab 50 µL einer frisch angesetzten 0.2 M EDC MES-Puffer Lösung (0.1 M
MES-Puffer pD = 6.25) 97 hinzu, mischte die Emulsion / Dispersion und bestückte umgehend
Eine andere, elegantere Methode die Catalip
platzieren, bieten die doppelseitig-klebenden Frame-Seal™ Kammern, die bei der Firma Bio-
Rad erhältlich sind. Diese werden mit einer Seite auf den Objektträger geklebt, wobei die
innere Kammer ein definiertes Volumen darstellt (9x 9 mm, für 25 µl Lösung; 15x15 mm, für
65 µl Lösung), die mit der zu analysierenden Dispersion befüllt wird. Die Kammer wurde mit
einem Abdeckgläschen (24x24 mm,
schlossen, wobei dieses schräg auf die Frame-Seal™ Kammern fallen gelassen wurde, um
Lufteinschlüsse zu verhindern. Diese Methode der Probenvorbereitung bietet im Vergleich
zur Methode 24.6.1 folgende Vorteile bei der mikroskopischen Analyse: Zum einen wird eine
Zerstörung fragiler supramolekularer Aggregate durch äußere Scherkräfte vermindert, da die
Objekte frei in der (tieferen) Frame-Seal
fr
31P-NMR Kinetiken zur Untersuchung des Catalipid-M
Die experimentelle Durchführung der kinetischen 31P-NMR Untersuchung zum Catalipid-
Mizellen Modell (siehe Kapitel 3.6) wurden in standardisierten, aufeinander folgenden
Arbeitsschritten durchgeführt:
Im ersten Arbeitsgang dispergierte man die exakte Stoffmenge des einzusetzenden Catalipids
in 500 µL 0.1 M MES-Puffer pD = 6.25 97. Der Puffer 97 wurde mit deuteriertem Wasser
hergestellt, da so nicht die Zugabe eines zusätzlichen internen Standards zum Einloggen auf
das Lösungsmittel zugesetzt werden musste.
Im zweiten Arbeitsgang löste man 10 mg (0.048 mol) 5’-GMP 76 in 50 µL MES-Puffer 97
und gab diese Lösung
284
erneut den Probenkopf des Spektrometers mit der Probe und startete die Mehrfachmessung.
Als Startzeit der Reaktion nahm e des ersten Spektrums nach man den Zeitpunkt der Aufnahm
EDC-Zugabe. Die folgenden Spektren wurden in definierten Zeitintervallen, die je nach
Anzahl der aufgenommen Scans variierten (7 min bei 64 Scans bzw. 10 min 128 Scans). Die
Probe verblieb während der gesamten Reaktionszeit im Spektrometer.
Nach beendeter Messung sonifizierte man die Probe und nahm abschließend ein weiteres 31P-NMR Spektrum auf.
Zur Auswertung der Mehrfachmessungen verwendete man das Programm WinNMR der Firma
Bruker. Die Integralintensitäten der entsprechenden Signale einer Kinetik wurden mit dem
Programm (NITE 0.1, a tool for generating kinetic data from BRUKER-NMR-files by Arne
Dieckmann) ausgelesen, in Konzentrationen umgerechnet und abschließend in einer
Konzentration-Zeit-Verlauf Kurve (c (t)-Kurve) abgebildet.
285
Anhang
26 Abkürzungen und Akronyme
Abb. Abbildung
abs. absolut
AV allgemeine Vorschrift
d Dublett
DAST Diethylaminoschwefeltrifluorid
DC Dünnschichtchromatographie
DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
dest. destilliert
DMAP 4-Dimethylaminopyridin
DMF N,N-Dimethylformamid
DNA Desoxyribonucleic Acid
dsDNA double-stranded DNA
EE Essigsäureethylester
EDC N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
EDU N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-harnstoff
eq. Äquivalent
ESI Electrospray Ionization
eV Elektronenvolt
FAB Fast Atom Bombardment
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FRET Fluorescence Resonance Energy-Transfer
G Guanin
GV großer Vesikel
GUV großer unilamellarer Vesikel
h Stunde
HOBT 1-Hydroxybenzotriazol
aq. wässrig
ATP Adenosintriphosphat
B Nucleobase
BMT, 5-BMT 5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazol
CPG Controlled Pore Glass
286
HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]-ethansulfonsäure
HP 3-Hydroxypicolinsäure
High Pressure Liquid Chromatography
Hz Hertz
tt
ization Time-of-
moton Modell
Pyridin
A
HPLC
ITO Indiumzinnoxid
Lsg. Lösung
LUV large –unilamellar-vesicle
M molar
m Multiplett
m zentriertes Multiplec
MALDI-TOF Matrix-assisted Laser Desorption Ion
Flight
MCM Minimales Che
MeIm Methylimidazol
MeOH Methanol
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
min Minute
MLGV multilamellar-giant-vesicle
MS Massenspektrometrie
MVGV multi-vesicle-giant vesicle
n Stoffmenge
N.A. nummerische Apparatur
ND Niederschlag
NEt Triethylamin 3
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NTP Nukleotidtriphosphat
PEG Polyethylenglykol
Pt Platin
PPh Triphenylphosphan 3
PySSPy 2,2'-Dipyridyldisulfid
q Quartett
Ph Phenyl
Py
RNA Ribonucleic Acid
287
RT Raumtemperatur
RP reversed phase
s Singulett, Sekunde
Smp. Schmelzpunkt
ar-vesicle
iumfluorid
äure (trifluoroacetic acid)
ckenbindungen
ssDNA single-stranded DNA
SUV small-unilamell
t Triplett
tBu tert-Butyl
TBAF Tetrabutylammon
TES Triethylsilan
THF Tetrahydrofuran
TFA Trifluoressigs
Trt-Cl Tritylchlorid
Trityl Triphenylmethyl
UV Ultraviolett
V Volt
WBB Wasserstoffbrü
WW Wechselwirkungen
x optische Vergrößerung
288
Literaturverzeichnis
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294
Danksagung
Ich danke den Partner des PACE-Projektes: BioMIP John McCaskill, UNIVERSITA CA'
FOSCARI DI VENEZIA Irene Poli, ECLT, UNIVERSITY OF COPENHAGEN Peter
Nielsen, CHALMERS TEKNISKA HÖGSKOLA AB Kristian Lindgren, UNIVERSITAT
POMPEU FABRA Ricard Solé, UNIVERSITY OF ZURICH Rolf Pfeifer, VILNIUS
UNIVERSITY ITPA Arvydas Tamulis, PROTOSTREAM GmbH Patrick Wagler,
PROTOLIFE S.R.L. Norman Packard, UNIVERSITY OF SOUTHERN DENMARK Ole
Mouritsen, UNIVERSITY OF SOUTHERN DENMARK Henrik Lund, DUBLIN CITY
UNIVERSITY Barry McMullin, LOS ALAMOS NATIONAL LABORATORY Steen
Rasmussen, ARGONNE NATIONAL LABORATORY Liaohai Chen, REED COLLEGE
Mark Bedau, COMUNE DI VENEZIA Andrea Del Mercato. Prof. Dr. Tadashi Sugawara und
Dr. Taro Toyota und für die nette und offene Aufnahme in der UNIVERSITY OF TOKIO,
KOMABA, JAPAN.
Ich danke den aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Organische
Chemie I: Dr. Karin Achilles, Dr. Sergey Antsypovitsch, Grant Bare, Rolf Breuckmann, Jan
Castonguay, Martin Cebulla, Dr. Arne Dieckmann, Dr. Lars Eckardt, Johanna Eckardt, Dr.
Eric Hayden, Florian Kaschuba, Carsten Lodwig, Beate Materne, Dr. Sven Mönninghoff, Dr.
Kai Naumann, Dr. Matthias W. Pankau, Dr. Volker Patzke, Tobias Plöger, Dr. Malte
Reimold, Dr. Insa Reimold-Stahl, Dr. Michael Rein, Dr. Stephanie Schorr, Katarzyna Schulz,
Olga Taran, Dagmar Vössing, Tim Wilmsen, Michael Wüstefeld und Dr. Jan Zimmermann.
Für das Korrekturlesen des Manuskripts danke ich ganz besonders Dr. Volker Patzke und
Dr. Matthias W. Pankau.
Margot Bock, Sigrid McCaskill und Stefanie Wittmann danke ich für die Unterstützung bei
allen administrativen Angelegenheiten. Michael Wüstefeld sei unter anderem für die
lückenlose Versorgung mit Kaffee gedankt. Weiterhin danke ich Rolf Breuckmann für die
Aufnahme von ESI-Massenspektren. Florian Kaschuba danke ich für die geduldige
Unterstützung bei allen IT-Problemen. Dr. Malte Reimold danke ich für seine Unterstützung
bei computer- und grafiktechnischen Problemen.
Dr. Volker Patzke und Dr. Jan Zimmermann danke ich für hervorragende Zusammenarbeit im
Labor, die ständige Diskussionsbereitschaft und das gute Arbeitsklima.
Meinen Eltern Gabriele und Dr. Volker Hellwig danke ich für die Ermöglichung dieses
Studiums und die dabei stetig gewährte Unterstützung.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Frau Christina, die mich während meiner gesamten
Studienzeit begleitete und unterstützte und meinen Söhnen Tim und Jan!
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