Eur. J. Biochem. 14 (1970) 243-252 Zur Biosynthese der D-Aldgarose Rolf SCHMID und Hans GRISEBACH teilweise mitbearbeitet von Wolfgang KARL Lehrstuhl fur Biochemie der Pflanzen am Biologischen Institut I1 der Univcrsitiit Freiburg i. Br. (Eingegangenam 20. Februar 1970) The biosynthesis of the branched-chain sugar D-aldgarose (3,1f-0-carbo-4,6-dideoxy-3-C- [l'-hydroxyethyl]-~-ribohexose) of aldgamycin E in Streptomyces lavendulae was investigated. ~[-methyl-~~C]methionine, [l-14C]acetate, D-[U-14C]glucose, [2-14C]pyruvate, and [3-14C]pyruvate were tested as possible precursors for the hydroxyethyl-branch of D-aldgarose. When aldgamycin C (containing aldgarose without the cyclic carbonate) was treated with periodate, one mole of acetaldehyde was liberated, which was proved by mass spectrometric investigations to originate solely from the hydroxyethyl-branch of aldgarose. A chemical de- gradation of aldgarose on a microscale was also carried out. 14C-labelled methionine, acetate and glucose did not function as precursors for the hydroxy- ethyl-branch, whereas pyruvate was a good precursor. Furthermore a specific incorporation of the label from both [2-14C]-and [3-14C]pyruvateinto the side-chain of aldgarose was found. We conclude from these results that the hydroxyethyl-branch of aldgarose originates from pyruvate and postulate that hydroxyethylthiamine-pyrophosphate, which could react with a 3-ketohexose intermediate, is the more immediate precursor for this side-chain. Die meisten der natiirlich vorkommenden ver- zweigtkettigen Kohlenhydrate lassen sich biogene- tisch in 2 Gruppen einteilen [l a, 1 b] : (a) Methylver- zweigte Zucker, die durch Einfuhrung einer intakten Methylgruppe aus Methionin [2] in eine unverzweigte Hexosekette entstehen, und (b) Zucker mit Hydroxy- methyl- oder Formylverzweigung,welche durch intra- molekulare Umlagerung eines nucleotidgebundenen Zuckers gebildet werden. Nicht in dieses Scheme einordnen lassen sich Zucker mit einer Hydroxyilthylverzweigung, von denen bisher L-Tridesoxyoctose (2,6-Didesoxy-4-C- [l'-~-hydroxy~thyl]-~-xylo-hexose) aus Isochino- cyclin A [3a,3b,3c] und D-Aldgarose (3,l'-O-Carbo- 4,6-didesoxy-3-C-[l'-hydroxyiithyl]-~-ribo-hexose) aus Aldgamycin E (Fig.2,I) [4,5] beknnnt sind. I n dieser Arbeit berichten wir iiber Versuche zur Biosynthese der D-Aldgarose in Streptomyces laven- dulae mit Hilfe 1%-markierter Vorstufen. Es konnte gezeigt werden, daI3 die Hydroxyiithylverzweigung aus einem Stoffwechselprodukt des Pyruvats stammt. MATERIAL UND METHODEN Die radioaktiven Verbindungen wurden vom Radiochemical Centre, Amersham, bezogen. Ald- gamycin E und Vergleichsproben von Methyl- aldgnrosid und Methylmycinosid erhielten wir von der Lederle Co., U.S.A., Chalcomycin von Prof. Keller-Schierlein, Zurich. Anxucht von Streptomyces lavendulae S. lavendulae, Lederle Isolat AL471, wurde auf Petri-Schalen kultiviert, die Niihragar nach Asheshov [6] folgender Zusammensetzung enthielten : Milupa Hafertrockenschleim 20, italienisches Tomatenmark 20, Difco Bacto Agar 20, Leitungswasser 1000, pH 7,2. I m Laufe 1 Woche nach dem Beimpfen mit einer Stammkultur wuchs bei 30" ein dichtes Luftmycel an, das anfiinglich weiI3, spiiter graublau gefiirbt war. Die fermentative Bildung von Antibiotica erfolgte in 1 1-Erlenmeyer-Kolben mit je vier l c m tiefen Schikanen ad einem Schuttelinkubator bei 30" und 200 Ulmin bei einer Auslenkung von 2,5 cm. Mit einer Impfose voll Luftmycel wurde jeweils ein Kolben beimpft, der 250 ml folgenden Mediums enthielt : Mannit 20, Bacto-Trypton 5, Soja-Dialysat 1000, pH 7,3. (Zur Herstellung des Soja-Dialysats wurden 20 g Hensel2-Vollsoja 20 Std lang bei 4" gegen 1 1 Leitungswasser dialysiert.) Bestimmung der Antibioticabildung Die Antibioticabildung wurde mittels des Agar- diffusionstests gegen Bacillus subtdis bestimmt . Unter den angegebenen Bedingungen produziert S. kvendulae Aldgamycin E und Chalcomycin [7]. Milupa-Pauly GrnbH., 6382 Friedrichsdorf, Germany. Bactisubtil der IPTOR, Pharmazeutische Priiparate 2 Henselwerk, 7031 Magstadt, Germany. AG., St. Ingbert, Germany.
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Eur. J. Biochem. 14 (1970) 243-252
Zur Biosynthese der D-Aldgarose
Rolf SCHMID und Hans GRISEBACH teilweise mitbearbeitet von Wolfgang KARL
Lehrstuhl fur Biochemie der Pflanzen am Biologischen Institut I1 der Univcrsitiit Freiburg i. Br.
(Eingegangen am 20. Februar 1970)
The biosynthesis of the branched-chain sugar D-aldgarose (3,1f-0-carbo-4,6-dideoxy-3-C- [l'-hydroxyethyl]-~-ribohexose) of aldgamycin E in Streptomyces lavendulae was investigated. ~[-methyl-~~C]methionine, [l-14C]acetate, D-[U-14C]glucose, [2-14C]pyruvate, and [3-14C]pyruvate were tested as possible precursors for the hydroxyethyl-branch of D-aldgarose.
When aldgamycin C (containing aldgarose without the cyclic carbonate) was treated with periodate, one mole of acetaldehyde was liberated, which was proved by mass spectrometric investigations to originate solely from the hydroxyethyl-branch of aldgarose. A chemical de- gradation of aldgarose on a microscale was also carried out.
14C-labelled methionine, acetate and glucose did not function as precursors for the hydroxy- ethyl-branch, whereas pyruvate was a good precursor. Furthermore a specific incorporation of the label from both [2-14C]- and [3-14C]pyruvate into the side-chain of aldgarose was found. We conclude from these results that the hydroxyethyl-branch of aldgarose originates from pyruvate and postulate that hydroxyethylthiamine-pyrophosphate, which could react with a 3-ketohexose intermediate, is the more immediate precursor for this side-chain.
Die meisten der natiirlich vorkommenden ver- zweigtkettigen Kohlenhydrate lassen sich biogene- tisch in 2 Gruppen einteilen [l a, 1 b] : (a) Methylver- zweigte Zucker, die durch Einfuhrung einer intakten Methylgruppe aus Methionin [2] in eine unverzweigte Hexosekette entstehen, und (b) Zucker mit Hydroxy- methyl- oder Formylverzweigung, welche durch intra- molekulare Umlagerung eines nucleotidgebundenen Zuckers gebildet werden.
Nicht in dieses Scheme einordnen lassen sich Zucker mit einer Hydroxyilthylverzweigung, von denen bisher L-Tridesoxyoctose (2,6-Didesoxy-4-C- [l'-~-hydroxy~thyl]-~-xylo-hexose) aus Isochino- cyclin A [3a,3b,3c] und D-Aldgarose (3,l'-O-Carbo- 4,6-didesoxy-3-C-[l'-hydroxyiithyl]-~-ribo-hexose) aus Aldgamycin E (Fig.2,I) [4,5] beknnnt sind.
In dieser Arbeit berichten wir iiber Versuche zur Biosynthese der D-Aldgarose in Streptomyces laven- dulae mit Hilfe 1%-markierter Vorstufen. Es konnte gezeigt werden, daI3 die Hydroxyiithylverzweigung aus einem Stoffwechselprodukt des Pyruvats stammt.
MATERIAL UND METHODEN
Die radioaktiven Verbindungen wurden vom Radiochemical Centre, Amersham, bezogen. Ald- gamycin E und Vergleichsproben von Methyl- aldgnrosid und Methylmycinosid erhielten wir von der Lederle Co., U.S.A., Chalcomycin von Prof. Keller-Schierlein, Zurich.
Anxucht von Streptomyces lavendulae
S. lavendulae, Lederle Isolat AL471, wurde auf Petri-Schalen kultiviert, die Niihragar nach Asheshov [6] folgender Zusammensetzung enthielten : Milupa Hafertrockenschleim 20, italienisches Tomatenmark 20, Difco Bacto Agar 20, Leitungswasser 1000, pH 7,2. Im Laufe 1 Woche nach dem Beimpfen mit einer Stammkultur wuchs bei 30" ein dichtes Luftmycel an, das anfiinglich weiI3, spiiter graublau gefiirbt war.
Die fermentative Bildung von Antibiotica erfolgte in 1 1-Erlenmeyer-Kolben mit je vier l cm tiefen Schikanen a d einem Schuttelinkubator bei 30" und 200 Ulmin bei einer Auslenkung von 2,5 cm.
Mit einer Impfose voll Luftmycel wurde jeweils ein Kolben beimpft, der 250 ml folgenden Mediums enthielt : Mannit 20, Bacto-Trypton 5, Soja-Dialysat 1000, pH 7,3. (Zur Herstellung des Soja-Dialysats wurden 20 g Hensel2-Vollsoja 20 Std lang bei 4" gegen 1 1 Leitungswasser dialysiert.)
Bestimmung der Antibioticabildung
Die Antibioticabildung wurde mittels des Agar- diffusionstests gegen Bacillus subtdis bestimmt . Unter den angegebenen Bedingungen produziert S. kvendulae Aldgamycin E und Chalcomycin [7].
Bactisubtil der IPTOR, Pharmazeutische Priiparate 2 Henselwerk, 7031 Magstadt, Germany.
AG., St. Ingbert, Germany.
244 Biosyntheae der Aldgarose Em. 3. Biochem.
Durch Agardiffusionstest der beiden Antibiotica wurde gefunden, daB die Hemmwirkung von Chalco- mycin auf B. subtilis 7mal groI3er ist als die von Aldgamycin E. Zur Bestimmung der gebildeten Menge Aldgamycin E wurde die im Diffusionstest gefundene Menge Antibioticum durch 7 geteilt, da das durch Bioautogrammtechnik [8] bestimmte Men- genverhaltnis beider Antibiotica etwa gleich 1 ist. Die Trockengewichtsbestimmung erfolgte durch Wii- gung des abzentrifugierten, 3mal mit dest. Wasser gewaschenen und 4 Std bei 120" getrockneten Mycels.
Inkubation mit radioaktiven Vorstufen
Die radioaktiven Vorstufen wurden in sterilem dest. Wasser gelost. Im Fall von ~-[Methyl-'~C]- methionin wurde die gesamte Menge der Vorstufe 14 Std nach Beginn der Fermentation zugegeben. Bei den anderen Vorstufen erfolgte die Zugabe in der folgenden Weise : jeweils der Gesamtaktivitat nach 14, 15, 16, 17 und 18Std nach Beginn der Fermentation [9]. Nach 38-41 Std wurden die Fermentationen abgebrochen and aufgearbeitet.
Aufarbeitung der Fermentationsansatze
Das Fermentationsmedium (1 Kolben = 250 ml) wurde nach Abzentrifugieren des Mycels (20' bei 10000 x g) mit 5 mg Aldgamycin E Standard ver- setzt. AnschlieBend lieB sich das Antibioticum durch Zugabe von 250 ml Chloroform und einstiindiger Perforation mit dem Vibromischer extrahieren. Nach 3 maliger Wiederholung dieser Prozedur zeigte der w8Brige Riickstand keine Aktivitat mehr im DXu- sionstest. Die vereinigten Chloroform-Extrakte wur- den iiber Natriumsulfat getrocknet, das Chloroform im Vakuum abgezogen und der Riickstand durch Dunnschichtchromatographie aufgetrennt. Auf Diinn- scbicht-Fertigplatten 0,25 mm Kieselgel (Merck AG., Darmstadt) hatte Aldgamycin E im Laufmittel Essig- saureathylester einen RF-Wert von 0,70 (das mit- extrahierte Chalcomycin zeigte einen RF-Wert von 0,50). Bei der Detektion mit 10 Oloiger Schwefelsiiure und 15 min Erhitzen bei 130" gab Aldgamycin E eine braune, Chalcomycin eine rote Fiirbung.
Bei der praparativen Gewinnung von markiertem Aldgamycin wurden 2 mm starke Diinnschicht-Glas- platten verwendet und zur Sichtbarmachung der Sub- stamen 2 Seitenstreifen mit dem Glasschneider ab- getrennt. Die Zone des Aldgamycin E eluierte man mit Aceton, versetzte das Eluat mit 10-25 mg nicht- markiertem Aldgamycin E und konzentrierte die Losung. Nach Filtration durch eine G-4-Fritte wurde zur Trockne gebracht. Drei- bis achtmalige Kristalli- sation aus Methanol - Wasser ergab Aldgamycin E mit konstanter spezifischer Radioaktivitat, das radio- diinnschichtchromatographisch einheitlich war.
Abbau von Aldgamycin E
Methanolyse. Aldgamycin E (10-20 mg) werden in 50 ml 2 N Schwefelsiiure in abs. Methanol 3 Std lang am RiickfluD zum Sieden erhitzt. Die gelbe Losung wird anschlieBend gekuhlt, rnit 100 ml Wasser versetzt und 6mal mit je 100 ml Essigsiiureathylester im Scheidetrichter extrahiert. Die vereinigten Essig- ester-Extrakte werden mit 100 a 1 gesattigter Bi- carbonatlosung gewaschen und die dabei anfallende waBrige Phase noch 2mal mit je 100 ml Essigester extrahiert.
Die vereinigten Essigester-Extrakte werden iiber Natriumsulfat getrocknet und das Losungsmittel im Vakuum abgezogen. Der Riickstand wurde diinn- schichtchromatographisch aufKieselge1-Diinnschicht- Platten 0,25 mm (Merck) mit Essigsaureiithylester vorgereinigt .
,$D-Methylaldgarosid hat unter diesen Bedin- gungen einen RF-Wert von 0,75, b-D-Methylmycinosid einen RF-Wert von 0,60. Die Rp-Werte der cr-Methyl- glykoside sind unbekannt, da keine Vergleichssub- stanzen zur Verfiigung standen. Sichtbarmachung und praparative Darstellung erfolgten wie unter Aldgsmycin E beschrieben.
Die diinnschichtchromatographisch vorgereinigten Zuckerfraktionen wurden durch Gaschromatographie gereinigt. Gerat: Varian Aerograph 1520 mit FID- Detektor. Siiule: 6 FuB, lI4 Zoll, 5% SE 52 auf Chromosorb AW DMCS 60-80. Triigergas: 100 ml/ min N2. Injektor : 220". Detektor : 250". p-D-Methyl- mycinosid: Trennung isotherm bei 90". Unter diesen Bedingungen zeigt das Glycosid eine Retentionszeit von 3,5 min. p-D-Methylaldgarosid: Trennung 5 min isotherm bei go", d a m mit Temperaturprogrammie- rung 4"lmin bis 250". Unter diesen Bedingungen zeigt das Glycosid eine Retentionszeit von 19 min. Durch- brnchstemperatur : 145".
Abbau zu Aldgamycin C und Perjodutspultung. Aldgamycin E (10 mg) wird in 500 pl Athano1 gelost und mit 1 ml0,05 N NaOH versetzt. Nach 1 Std bei Raumtemperatur ist diinnschichtchromatographisch nur noch Aldgamycin C nachzuweisen (Kieselgel 0,25 mm, Laufmittel Essigsaureathylester, Sichtbar- machung mit 10 O/,,ger Schwefelsiiure, RF 0,20). An- schlieBend erfolgt m demselben ReaktionsgefaB die Perjodatspaltung von Aldgamycin C.
Der Ansatz wird mit 1 ml0,05 N HC1 neutralisiert und mit 1 mMol NaJO, und etwa 0.20 mMol Butan- 2,3-diol versetzt. Nach 4stiindiger Reaktion bei 40" unter Durchleiten von Stickstoff ist in einer an das ReaktionsgefaB angeschlossenen Spiralfalle mit schwefelsaurer 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Losung ein Niederschlag ausgefallen, der etwa 80 mg wiegt (ca. 0,40 mMol berechnet fur Acetaldehyd-2,4-Dini- trophenylhydrazon). Auch ohne vorherigen Zusatz von Butan-2,3-diol zeigt das Produkt gleichen Misch- schmelzpunkt, gleiches Infrarot-Spektrum und glei-
Vol.14, “0.2, 1970 R. SCHMID, H. GRISEBACH und W. KARL 245
ches dunnschichtchromatographisches Laufverhalten wie authentisches Acetaldehyd-2,4-Dinitrophenyl- hydrazon (Kieselgel 0,25 mm, Laufmittel Benzol- Petrolather [go-70’1 [3: 1, v/v]; Rp 0,40).
Der Ruckstand der Perjodatspaltung ist dunn- schichtchromatographisch einheitlich (Kieselgel 0,25 mm, Laufmittel Essigester [RF 0,051, oder Essig- ester-Methanol [3 : 2, v/v], [Rp 0,251 Sichtbar-, machung mit 10 o/oiger Schwefelsaure und Erhitzen).
Durch Extralition im Flussig-flussig-Extraktor nach Kutscher-Steudel wahrend 16 Std mit Essig- ester gelang es, 7,3 mg des Spaltungsproduktes zu isolieren (Ausbeute 96 Ole, bezogen auf Aldgamycin E). Von diesem Produkt wurde nach dunnschicht- chromatographischer Reinigung ein Massenspektrum angefertigt.
Massenspektrometrie des Perjodatspaltungspro- duktes. Massenspektren wurden mit einem Spektro- meter vom Typ Varian-MAT SM-IB aufgenommen. Die Ionisierungsenergie betrug 70 eV, der Ionisierung rungsstrom 300 pA. Die Temperatur der Ionenquelle war ZOO”, die der Probe ca. 140”. Als EinlaBsystem diente die Ofenschleuse.
Quantitative Bestimmung von Methylaldgarosid und, Jf ethylmycinosid. Die Bestimmung erfolgte colori- mctrisch mit der Schwefelsiiure-Cystein-Reaktion nach Dische [lo].
Die Ausbeuten betrugen nach der gaschromato- graphischen Reinigung : Methylaldgarosid (A,,, 351 nm ; E 8600) 150 pg (5 der Theorie bezogen auf Aldgamycin E) ; Methylmycinosid (A,,, 400 nm; E 16000) 700pg (26O/, der Theorie bezogen auf Aldgamycin E).
Abbau von Methylaldgarosid a) Methylaldgarosid (50-300 mpM) in 100 p1
Methanol wird in einem Polyathylen-Reaktions- gefaB von 1 ml Inhalt (Fa. Eppendorf, Typ 3810) mit 100 p10,05 N NaOH versetzt und bei Raumtempera- tur stehengelassen.
Die Perjodatspaltung der entstandenen Tri- desoxyoctose erfolgt in Anlehnung an die Vorschrift von Bhattacharyya und Aminoff [ll]. Nach 1 Std wird der Inhalt des ReaktionsgefaBes in den auBeren Ring einer Mikrodiffusionsschale nach Conway [ 171 uberfuhrt, deren innerer Ring mit 1 ml einer 0,076 M Losung von Semicarbazid-Hydrochlorid in 0,l M Natriumphosphatpuffer von pH 7,O gefullt ist. I n den auBeren Ring gibt man nun nacheinander 100 pl 0,05 N HCI, 1 ml 0,l Natriumphosphatpuffer von pH 6,O und 100 pl einer 0,05 M Natriumperjodat- losung. Darauf wird die Diffusionsschale sofort ver- schlossen und 2,5 Std lang in einemSchuttelinkubator bei 30” und 120U/min inkubiert. Danach wird der Inhalt des inneren Rings quantitativ in ein 2 ml- MeBkolbchen uberfuhrt, wobei mit 0,l M Natrium- phosphatpuffer von pH 7,O nachgewaschen wird.
Die Bestimmung des gebildeten Acetaldehyd- Semicarbazons erfolgt spektrophotometrisch [l I] : der Inhalt des 2 ml-MeBkolbchens wird in eine Cuvette uberfuhrt und gegen einen Nullwert bei 224 nm gemessen.
Die Eichkurve wurde mit Rhamnose- und Fucose- Losungen bekannter Konzentration aufgenommen.
Zur Bestimmung der Radioaktivitat des gebil- deten Acetaldehyd-Semicarbazons wird der Cuvetten- inhalt direkt in ein Zahlglaschen uberfuhrt und mit Dioxan nachgewaschen.
b) Die Bestimmung des direkt aus Aldgamycin C abgespaltenen Acetaldehyds erfolgte in der glei- chen Weise uber das Acetaldehyd-Semicarbazon. 168 mpMol Aldgamycin C ergaben 156 mpMol Acet- aldeh ydsemicarbazon .
Abbau von Methylmycinosid Die Spaltung des Methylglykosids erfolgt durch
Zstundiges Erhitzen am RuckfluB rnit 40 O/,iger waB- riger Trifluoressigsiiure und Verdampfen der fluch- tigen Anteile. Aus 800 pg Methylrnycinosid erhielt man 700 pg Mycinose (88 O/,, der Theorie), die durch diinnschichtchrornatographischen Vergleich mit au- thentischer Mycinose identifiziert wurde.
Die Reduktion zum Mycinitol erfolgte durch Be- handlung mit einem 10fachenOberschuB anNatrium- borhydrid bei Raumtemperatur webrend 12 Std. Das entstandene Produkt war dunnschichtchromato- graphisch einheitlich.
Die Perjodatspaltung des Mycinitols und die Be- stimmung des entstehenden Acetaldehyds erfolgte in gleicher Weise wie bei Aldgarose beschrieben.
Radioaktivitatsmessungen Die Bestimmung von Aceta ldehyd-2 ,4-d0-
phenylhydrazon erfolgte durch Schoninger-Ver- brennung [ 141.
Bariumcarbonat wurde in einem geschlossenen Kolben mit verdunnter Schwefelsaure zersetzt und das entstandene CO, in einem Zahlglaschen mit 5 ml 9 Oloiger methanolischer Athanolamin-Losung ab- sorbiert. Nach Versetzen mit “Toluol-Cocktail” (s. u.) wurde im Flussigkeitsscintillationszahler gemessen. Alle anderen Proben wurden direkt durch Fliissig- keitsscintillationszithlung ausgemessen. Als Szintilla- toren wurden verwendet : (a) “Dioxan-Cocktail” (5 g PPO, 100 g Naphthalin in 1 1 Dioxan). (b) “Toluol- Cocktail” (5 g PPO, 1 1 Toluol). Gemessen wurde im Flussigkeitsszintillationszahler LS 100 der Fa. Beck- man.
ERGEBNISSE Der uns zur VerMgung stehende Xtreptomyces
lavendulae-Stamm (Lederle, Isolat AL 471) produziert neben Aldgamycin E auch Chalcomycin [7]. Wie
246 Biosynthese der Aldgarose Eur. J. Biochem.
I 6ot
Zeit (h)
Fig. 1. Abhiingigkeit der Bildung von Aldgamycin E plus Chulcomycin von Zellwachstum und Permentationsdauer.
o+, Aldgamycin E + Chalcomycin; +----+, Trockengewicht der Zellen
stanzen zur Verfiigung stand und die Isolierung des Methylaldgarosids nur mit sehr schlechten Ausbeuten gelang.
Mit [2-14C]Pyruvat als Vorstufe wurde nach Methanolyse des Aldgamycin E (Fig. 2, I) B-D-Methyl- aldgarosid (Fig. 4, IV) und P-D-Methylmycinosid (Fig. 5, VII) durch Diinnschichtchromatographie iso- liert und durch Gaschromatographie gereinigt (Fig. 3).
Hierbei zeigte das Methylaldgarosid und auch eine Vergleichsprobe von Lederle stets einen Doppel- gipfel. Die getrennt aufgefangenen Gipfelfraktionen ergaben beide im Dische-Test [lo] das fur Aldgarosid ermittelte Absorptionsmaximum bei 351 nm. Mog- licherweise handelt es sich bei der zweiten Kompo- nente um das a-Glykosid.
Nach Spaltung des cyclischen Carbonats im Methylaldgarosid mit verdunnter Lauge wurde das Methyltridesoxyoctosid (Fig. 4, V) mit Perjodat ge- spalten und der aus der Hydroxyiithylverzweigung stammende Acetaldehyd als Semicarbazon isoliert.
Tabelle I. Einbaurate verschiedener markierter Vorstufen in Aldgamycin E
Einbaurate C Inkubations- zugesetze gebildete Mengeb
a 1 = Zugabe der Vorstufe nach 14 Std Fermentation. 2 = Portionsweise Zugabe der Vorstufe zwischen 14 und 18 Std nach Beginn der Fermentation.
Ermittelt mittels Plattendiffusionstest am Ende der Fermentation.
GesamtaktivitBt isoliertes Aldgamycin E Z./min x 100 Gesamtaktivitst Vorstufe Z./min
o =
durch Bioautogrammtechnik [S] festgestellt wurde, ist der zeitliche Verlauf der Bildung beider Anti- biotica identisch. Die Abhangigkeit der Bildung von Aldgamycin E plus Chalcomycin vom Zellwachstum und der Fermentationsdauer zeigt Fig. 1.
Fur die Bildung der Hydroxyiithyl-Seitenkette der Aldgarose zogen wir als Vorstufen L-Methionin, Acetat, Pyruvat oder andere Stoffwechselprodukte aus D-Glucose in Erwagung. Diese Verbindungen wurden in l4C-markierter Form dem Fermentations- medium zu geeigneten Zeiten (9. Versuchsteil) zu- gesetzt und die Einbaurate in das Aldgamycin E bestimmt. Die in Tabelle 1 zusammengefafiten Er- gebnisse zeigen einen etwa gleich hohen Einbau von Methionin, Glucose, Pyruvat, und Acetat.
Die Bestimmung der Radioaktivitiitsverteilung im Aldgamycin wurde sehr erschwert durch den Um- stand, dafi uns nur eine kleine Menge des Anti- bioticums zur Verdiinnung der radioaktiven Sub-
Wegen Substanzmangels ermittelte man bei den anderen Versuchen die Radioaktivitiit in der Hy- droxyiithylverzweigung der Aldgarose durch direlcte Perjodatspaltung von Aldgamycin C und Isolierung des Acetaldehyds (Fig. 2). Folgende Befunde beweisen, daB der Acetaldehyd nur aus der Hydroxyiithyl- verzweigung der Aldgarose stammt: a ) Aus Ald- gamycin E (I) mit cyclischer Carbonatgruppe wird mit Natriumperjodat kein Acetaldehyd freigesetzt, dagegen aus Aldgamycin C (11) (ohne cyclische Car- bonatgruppe) genau l Moliiquivalent.
b) Das Massenspektrum des nach Perjodatspal- tung neben Acetaldehyd isolierten Produktes be- weist, daB es sich hierbei um Mycinosyl-aldganolid4 (Fig.2, X) handelt (s. Anhang). Durch die Yerjodat-
Interessanterweise zeigt Mycinosylaldganolid im Ver- gleich zum Aldgamycin E gegenuber Bac. subtilis keine antibiotische AktivitLt mehr. Durch Abspaltung der Aldga- rose geht also die antibiotische Wirkung verloren.
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Me
0 0
0 Y
OMe I
HO OH
HO@Z] C20H3004
OMe
I
Methylaldgarosid (IV)
+ Methylmycinosid (VII)
I
I1
+ CH,CHO
OMe
X
Fig.2. Abbau von Aldgamycin E ( I ) . Die genaue Struktur des Makrolidringes ist unbekannt
247
I11
Retentionszeit (min)
Fig. 3. Gaschromtogramm von diinnschichtchromatographisch vorgetrenntem B-D-Methylaldgarosi. Die anderen Verbindungen wurden nicht identifiziert
0 IV V
Fig.4. Abbau von Methylaldgarosid
VI
Biosynthese der Aldgarose Eur. J. Biochem. 248
Tabelle 2. Einbau verschiedener markierter Vorstufen in Methylaldgarosid und in C-lf-C-2' der Aldgarose
Radioaktivitllt in Methylaldgarosid, Aldgamycin E = 100°/o
* Nach Verdbnung mit Acetaldehyd aus Perjodatspaltung des Butan-2,S-diol. Silberacetat: 14.7 x lo-' Z./min xmMol.
CHzOH I
CHOMe I
CFSCOOH NaB% CHOMe I
CHOH I
CHOH I
CHzOH I
N~JO, CHO-Me - I
CHO OMe
OMe OMe
VII VIII CH3
IX
Fig.5. Abbau von ,%D-Methylmycinosid (VII ) uber Mycinitol ( I X )
spaltung i ird also weder der Makrolidring, noch er- wartungsgemal3 der Mycinosyl-Rest angegrsen.
Die in Tabelle 2 zusammengestellten Ergebnisse zeigen folgendes : Die Methylgruppe des L-Methionins wird nicht in Aldgarose eingebaut. Einen guten Ein- bau in die Hydroxyathylverzweigung der Aldgarose zeigt nur [2-14C]- und [3-14C]Pyruvat. Mit [2J4C]- Pyruvat als Vorstufe ist etwa 45O/, der Radio- aktivitat der Aldgarose in der Bthylverzweigung lokalisiert.
Die Radioaktivitatsverteilung innerhalb der Bthylverzweigung wurde durch Kuhn-Roth-Oxyda- tion [ 121 desAcetaldehyd-2,4-dinitrophenylhydrazons und anschliel3enden Schmidt-Abbau [13] der Essig- siiure ermittelt. Mit [2-14C]Pyruvat waren 88 O l 0 der Radioaktivitat im C-1', mit [3-14C]grluvat etwa
93 Ol0 in der Met,hylgruppe ((2-2') der Hydroxyathyl- seitenkette lokalisiert (Tab. 3).
Zur Bestimmung der Aktivitatsverteilung inner- halb der Hexosekette reichte die isolierte Menge an Aldgarose nicht mehr aus. Es wurde daher ein teil- weiser Abbau der Mycinose auf dem in Fig.5 ge- zeigten Wege durchgefiihrt. Mit [2-14C]Pyruvat fan- den sich 38O/, der Aktivitgt der Mycinose in den C-Atomen 5 und 6 (Tab.4). Zwischen diesen beiden C-Atomen verteilte sich die AktivitBt etwa halftig auf C-5 und (3-6, wie durch weiteren Abbau des Acetaldehyds entsprechend dem Abbau bei Aldgarose gezeigt wurde (Tab.5).
Mit ~-[Methyl-~~C]methionin als Vorstufe fand sich die gesamte Aktivitat in den 0-Methylgruppen der Mycinose (Tab.4). Daraus folgt auch, dal3 die eine
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Tabelle 4. Einbau van Radioaktivitat in die Hycinose Acetaldehyd-Semicarbazon
a Nach l46facher Verdlinnung mit Acetaldehyd au8 Butan-2,3-diol.
H,C " Y X $ - C - Me&zR kk&E~
HO OH o.cP CH3
0 OH II 0
XI D -Aldgarose
6. &ZR Fig. 6. H y p t h t i s c h r Biosyntheseweg fiir D-Aldgarose unter Beteiligung van H y d r o ~ ~ t ~ y l t h i a m ~ ~ r o ~ ~ s ~ h a t
C-Methylgruppe des Lactons [4] nicht aus dem C,-Stoffwechsel stammt.
DISKUSSION Die Athylseitenketten der C-29 Phytosterine
bilden sich durch eine 2malige C-Methylierung [15]. Eine derartige Reaktion fur die Bildung derHydroxy- iithylverzweigung der Aldgarose war a priori unwahr- scheinlich, da sich bei einem Zucker ein befriedigender Mechanismus hierfiir nur schwer formulieren 133t. Der Versuch, mit ~-[MethylJ~C]methionin (Tab. 1 und 4) beweist, da13 eine C-Methylierung nicht an der Biosynthese der Aldgarose beteiligt ist.
Die vorliegenden Ergebnisse sprechen eindeutig fiir eine Herkunft der Hydroxyiithylverzweigung der Aldgarose aus einem Stoffwechselprodukt des Pyru- vats. Dies folgt einmal aus dem guten Einbau von Pyruvat in diese Verzweigung (Tab.2) und aus der spezifischen Verteilung der Radioaktivitat auf C-1' und (3-2' mit [2-14C]Pyruvat oder [3-14C]Pyruvat. Glucose ist eine bedeutend schlechtere Vorstufe fur die Verzweigung, so da13 ein Einbau von Pyruvat uber die Resynthese zu Glucose auszuschliefien ist.
I n der Mycinose ist mit [2-14C]Pyruvat fast eine Gleichverteilung der Radioaktivitat auf die C-Atome 5 und 6 eingetreten (Tab.5). Dies ist verstandlich, wenn eine Resynthese von Glucose (der wahrschein-
lichsten Vorstufe der Mycinose) iiber Oxalacetat er- folgt, welches in schnellem und reversiblem Gleich- gewicht mit Malat und dem symmetrischen Fumarat steht. Im Gegensatz hierzu ist eine derartige Ver- teilung der Radioaktivitat in der Hydroxyiithyl- seitenkette der Aldgarose kaum eingetreten (Tab. 3). Diese Seitenkette mu13 also auf einem direkten Wege aus Pyruvat gebildet werden.
As unmittelbare Vorstufe fiir die Hydroxyathyl- verzweigung kBme Hydroxyathylthiaminpyrophos- phat (,,aktiver Acetaldehyd") [16] in Frage, dessen Reaktion mit einer 3-Keto-hexose zum Zwischen- produkt X I (Fig.6) fuhren konnte. Reduktion der Carbonylgruppe in X I und Bildung des cyclischen Carbonats ergaben dann Aldgarose.
Die weitere Klarung des Biosyntheseweges der Aldgarose diirfte nur mit einem geeigneten zellfreien System moglich sein. Versuche hierzu sind im Gange.
ANRANG Massenspektrometrische Untersuchungen zur Perjodatspaltung von Aldgamycin C
(beurbeitet von W . KARL) Als Voraussetzung fiir das Verstandnis der wei-
teren Untersuchungen wird zunachst das Massen- spektrum von Aldgamycin E besprochen. Im Spek- trum dieser Verbindung (Fig. 7 A) iindet sich in Uber-
250 Biosynthese der Aldgarose Eur. J. Biochem.
A
100- 88
,--" 80- I
+- :m .= .
60- -
I B I
Fig.7. A. Mwsenapektrum von Aldgamycin E. B. Masenspektrum von Mycinosyl-Aldganolid
]-lo -201ME+
+
Aldgarose
0 m / e 350 m / e 551 17 \"..., Aldgaros e
O\ Mycinose no :r-----l 0
m / e 742
Mycinose
m / e 525 m / e 333
Fig. 8. Fragmentierungsschema von Aldgamycin E
Vol. 14, No. 2, 1970 R. SCHMID, H. GRISEBACH und W. WL 261
* O H + OMe OMe
m/e 175
Fig. 9. Praymentionen von Aldgarose und Mycinose
l ' o ] ~ ~ o - H a 0 ~ IT?,, - -Mycinosyl +[-I Mycinose 0
Mycinose
m/e 542 m/e 524 m/e 3 3 3
Fig. 10. Fragmentierung von Mycinosyl-Aldganolid
einstimmung mit dem Wert von Kunstmann et al. [I71 das Molekiilion (M) bei m/e 742. Der Verlust von Mycinose fiihrt zum stiirksten Ion des oberen Massen- bereiches bei m/e 551 (M-191). Ein schwiicheres Signal bei m/e 525 zeigt die Abspaltung des Aldgarose-Restes (M-217) an. Das Ion bei m/e 551 kann unterAbspaltung der Aldgarose zum Ion mle 350 zerfallen, wobei ein Acetal-Sauerstoff am Aglycon verbleibt. Andererseits kann auch der ganze Aldgarosyl-Rest (217 ME) unter gleichzeitiger Eliminierung eines H-Radikals aus dem Makrolidring abgespalten werden, was zu dem Ion bei m/e 333 fiihrt (Fig. 8). Der untere Massenbereich zeigt die charakteristischen Oxonium-Ionen von Aldgarose (m/e 201) und Mycinose mle 175 (Fig.9).
Wie schon erwahnt, fuhrt die Perjodatspaltung von Aldgamycin C zur Bildung von 1 Mol Acet- aldehyd. Nach Abtreiben des Acetaldehyds mit N2 wurde durch Extraktion der Reaktionslosung mit Essigester und wiederholter Dunnschichtchromato- graphie dieses Extraktes in etwa 700/, Ausbeute eine Substanz erhalten, deren Massenspektrum (Fig. 7 B) beweist, dal3 es sich hierbei um das Mycinosyl- aldganolid handelt. Das Molekiilion bei mle 542 geht unter Verlust von H,O in das Ion bei mje 524 iiber, aus dem durch Abspaltung des Mycinosyl-Restes das intensive Fragment m/e 333 entsteht (Fig. 10). Bei mle 175 erscheint das Oxonium-Ion der Mycinose, wiihrend das entsprechende Ion der Aldgarose bei m/e 201 fehlt.
Die Existenz der Ionen bei m/e 333 und mle 350 in beiden Spektren zeigt, daB der Makrolidring durch die Perjodatspaltung nicht angegriffen wird ; auch der Mycinosyl-Rest ist erwartungsgemal3 intakt. Der Acetaldehyd kann also nur aus der Aldgarose stam- men. Die Isolierung von Mycinosylaldganolid als zweites Spaltprodukt wird durch folgende uber- legungen verstandlich.
Nach Abspaltung des Acetaldchyds muB das in Fig. 2 gezeigte Spaltprodukt zuriickbleiben. Diese
Verbindung ist ein Vollacetal des Glyoxals, das unter den schwach sauren Bedingungen der Perjodatspal- tung sicher zu Glyoxal, P-Hydroxybuttersiiure und Mycinosylaldganolid hydrolysiert wird. An Hand von Molekiilmodellen kann zudem gezeigt werden, da13 das acide Carboxyl-Wasserstoffatom in direkte Nachbarschaft zu einem der beiden Acetal-Sauerstoff- atome gebracht werden kann. Glyoxal, das in wBl3- riger Losung als Dihydrat vorliegt, wird von Perjodat weiter zu AmeisensBure gespalten.
Die Arbeit wurde unterstiitzt durch die Deutsche For- schungsgemeinschaft und den Fonds der Chemischen Indu- strie. Den Lederle Laboratories, Pearl River, N. Y., U.S.A., danken wir fur die 'Zfberlassung von Aldgamycin und Ver- gleichsproben der Zucker und Prof. W. Keller-Schierlein, Zurich, fiir Chalcomycin.
LITERATUR la. Grisebach, H., Helv. Chim. Acta, 51 (1968) 928. 1 b. Grisebach, H., Biosynthetic Patterns in Microorganisms
and Higher Plants, J. Wiley and Sons, Inc., New York 1967, 66.
2. Pape, H., Schmid, R., Grisebach,H., und Achenbach, H., Eur. J . Biochem. 10 (1969) 479.
3a. Cosulich, D. B., Mowat, J. H., Broschard, R. W., Pa- trick. J. B.. und Mever. w. E.. Tetrahedron Letters.
U I
(1963) 453. ' 3b. Webb. J. S.. Broschard. R. W.. Cosulich. D. B.. Mo-
wat, J. H.,' and Lancaster, J. E., J . Amer. Chem. SOC. 84 (1962) 3183.
3c. Tulinsky, A., J . Amer. Chem. SOC. 86 (1964) 5368. 4. Kunstmann, M. P., Mitscher, L. A., and Patterson,
5. Ellestad, G. A., Kunstmann, &!L P., Lancaster. J. E., E. L., Antimicrobe. Agents and Chemother. (1964) 87.
Mitscher, L. A., und Morton, G.,. Tetrahedron, 23 (1967) 3893.
7. Lederle Laboratories, Pearl River, N. Y. U.S.A., Privat- mitteilung.
8. Wallhauser, K. H., In Dunnschichtchromatograllhie (her- ausgegeben von E. Stahl), Springer Verlag, Berlin- Heidelberg-New York 1967, 2. Aufl., S. 541.
252 R. SCFIMID, H. GRISEBACH und W. KARL: Biosynthese der Aldgarose Eur. J. Biochem.
10. Dische, Z., In Methods in Carbohydrate Chemistry (edited by R. L. Whister and M. L. Wolfrom), Academic Press, New York and London 1962. Vol. I, S. 477.
11. Bhattacharyya, A. K., und Aminoff, D., Anal. Biochem.
12. Simon. H.. und Floss. H. G.. Bestimmuna der IsotoDen- 14 (1966) 278.
vertiilung in markierten Veibindungen, Siringer-Vehg, Berlin-Heidelberg-New York 1967, S. 12.
13. Phares, E. I?., Arch. Biochem. Biophys. 33 (1951) 173. 14. Kalberer, F., und Rutschmann, J., Helv. Chim. Acta, 44
16. Krampitz, L. O., Ann. Rev. Biochem. 38 (1969) 692. 17. Conway, E. J., Microdiffusion Analysis and Volumetric
Error, Crosby Lockwood and Son, Ltd., London 1957.
R. Schmid und H. Grisebach Lehrstuhl fur Biochemie der Pflanzen am Biologischen Institut I1 der Universitat BRD-7800 Freiburg i. Br., SchanzlestraSe 9/11, Deutschland
W. Karl Medizinische Abteilung Chemisches Laboratorium der Universitat BRD-7800 Freiburg i. Br., Albertstralje 21, Deutschland
