Zbl. Vet. Med. B, 24, 746-752 (1977) @ 1977 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0514-7166lASTM-Coden : ZVRBA2 Aus dem Institut fur Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus Liebig-Universitat Gieben Direktor: Prof. Dr. Th. Schliesser Zum serologischen Nachweis von Brucella canis-Infektionen bei Hunden mittels I<omplementbindungsreaktion* Von A. WEBER und H. KRAUSS Mit 3 Tabellen (Eingegangen am 21. Dezember 1976) Die wirtschaftliche Bedeutung der Brucella canis-Infektion des Hundes fur Zucht- und Versuchstierhaltungen verlangt zuverlassige und leicht durch- fuhrbare diagnostische Untersuchungsverfahren nicht nur als Grundlage fur eine Kontrolle der Sezlche, sondern auch fur deren wirksame Bekampfung Bei Infektionen mit diesem Erreger treten aui3er Verwerfen und Sterilitat vielfach keine weiteren klinischen Krankheitssymptome auf (MOORE u. GUPTA, 1970; PICKERILL u. CARMICHAEL, 1972; WEBER u. SCHLIESSER, 1975). Die sichere Erfassung BY. canis-infizierter Tiere ist aber nur auf Grund eines kulturellen und/oder serologischen Nachweises moglich (CARMICHAEL u. GEORGE, 1976). Fur den Nachweis von Antikorpern gegen Brucella abortus, BY.melitensis oder Br. suis wird von der WHO/FAO schon seit langem die Komplement- bindungsreaktion als Erganzungsverfahren zur Serumlangsamagglutination empfohlen (ALTON, JONES u. PIETZ, 1975). Ober die Anwendung der Komple- mentbindungsreaktion zum serologischen Nachweis von BY. canis-Infektionen bei Hunden liegen in der Literatur relativ wenige Mitteilungen vor (DEYOE, 1970; PICKERILL, 1970 a, b). Wahrend DEYOE (1970) berichtet, da13 mittels Komplementbindungsreaktion bei experimentell infizierten Hunden spezifische Antikorper festgestellt werden konnten, halt PICKERILL (1970 a, b) nach eige- nen Untersuchungen dieses Verfahren fur nicht sehr zuverlassig. Auf Grund dieser unterschiedlichen Literaturmitteilungen hielten wir es fur angebracht, weitere Untersuchungen zur Brauchbarkeit der Komplement- bindungsreaktion zum Nachweis von BY.canis-Infektionen bei Hunden durch- zufuhren. Im folgenden wird uber die Anwendung dieses Verfahrens bei der :. Die Untersuchungen wurden mit finanzieller Unterstiitzung der Deutschen Forschungs- gemeinschaft durchgefiihrt.
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Zbl. Vet. Med. B, 24, 746-752 (1977) @ 1977 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0514-7166lASTM-Coden : ZVRBA2
Aus dem Institut fur Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus Liebig-Universitat Gieben
Direktor: Prof . Dr. Th. Schliesser
Zum serologischen Nachweis von Brucella canis-Inf ektionen bei Hunden
mittels I<omplementbindungsreaktion*
Von
A. WEBER und H. KRAUSS
Mit 3 Tabellen
(Eingegangen am 21. Dezember 1976)
Die wirtschaftliche Bedeutung der Brucella canis-Infektion des Hundes fur Zucht- und Versuchstierhaltungen verlangt zuverlassige und leicht durch- fuhrbare diagnostische Untersuchungsverfahren nicht nur als Grundlage fur eine Kontrolle der Sezlche, sondern auch fur deren wirksame Bekampfung Bei Infektionen mit diesem Erreger treten aui3er Verwerfen und Sterilitat vielfach keine weiteren klinischen Krankheitssymptome auf (MOORE u. GUPTA, 1970; PICKERILL u. CARMICHAEL, 1972; WEBER u. SCHLIESSER, 1975). Die sichere Erfassung BY. canis-infizierter Tiere ist aber nur auf Grund eines kulturellen und/oder serologischen Nachweises moglich (CARMICHAEL u. GEORGE, 1976).
Fur den Nachweis von Antikorpern gegen Brucella abortus, BY. melitensis oder Br. suis wird von der WHO/FAO schon seit langem die Komplement- bindungsreaktion als Erganzungsverfahren zur Serumlangsamagglutination empfohlen (ALTON, JONES u. PIETZ, 1975). Ober die Anwendung der Komple- mentbindungsreaktion zum serologischen Nachweis von BY. canis-Infektionen bei Hunden liegen in der Literatur relativ wenige Mitteilungen vor (DEYOE, 1970; PICKERILL, 1970 a, b). Wahrend DEYOE (1970) berichtet, da13 mittels Komplementbindungsreaktion bei experimentell infizierten Hunden spezifische Antikorper festgestellt werden konnten, halt PICKERILL (1970 a, b) nach eige- nen Untersuchungen dieses Verfahren fur nicht sehr zuverlassig.
Auf Grund dieser unterschiedlichen Literaturmitteilungen hielten wir es fur angebracht, weitere Untersuchungen zur Brauchbarkeit der Komplement- bindungsreaktion zum Nachweis von BY. canis-Infektionen bei Hunden durch- zufuhren. Im folgenden wird uber die Anwendung dieses Verfahrens bei der
::. Die Untersuchungen wurden mit finanzieller Unterstiitzung der Deutschen Forschungs- gemeinschaft durchgefiihrt.
Zum serologischen Nachweis von Brucella canis-Infektionen bei Hunden 747
Untersuchung von Serumproben experimentell und naturlich infizierter Beagle- Hunde unter Verwendung eines loslichen BY. canis-Antigens berichtet.
Material und Methodik Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung gelangten 112 Serumproben von 6 oral mit Brucella canis (Stamm RM 6/66, pro Tier etwa 2 X lo* Keime) infizierten Beagle- Hunden. 7 Tage vor und am Tage der Infizierung wurden von jedem Hund Blutproben genommen. Nach der Infizierung erfolgte die Blutentnahme bis zur 6. Woche in regelmafligen Abstanden von 7 Tagen, anschliei3end bis zur 58. Woche jeweils im Abstand von 4 Wochen.
Aui3erdem standen im Rahmen dieser Untersuchungen aus diagnostischen Einsendungen 1091 Serumproben von Beagle-Hunden aus verschiedenen Ver- suchstierhaltungen zur Verfugung.
Kornplementbindungsreaktion (KBR) In Vorversuchen erwies sich korpuskulares BY. canis-Antigen stets als
antikomplementar. Aus diesem Grunde wurde fur die KBR ein losliches Anti- gen hergestellt. Als Ausgangsmaterial wurde eine fur die Langsamagglutina- tion zubereitete konzentrierte Antigenstammlosung, deren Dichte etwa 3 X 1010 Keime/ml betrug, verwendet. 5 ml dieser Suspension wurden bei 10 000 g 1 Std. lang zentrifugiert (Beckmann-Zentrifuge, Model1 5-21) und der Oberstand anschliei3end verworfen. 1 Teil des abgewogenen Sedimentes wurde in 5 Gewichtsteilen einer 1 O/oigen Natriumdesoxycholatlosung in 0,Ol M Phosphatpuffer (pH 7,2) suspendiert und zweimal etwa 30 Sek. be- schallt (Branson Sonifier ,,Power Sonic", 2 OKC, Stufe 3). Nach 4stundigem Schutteln bei 45 OC wurde die Suspension 1 Std. bei 10 000 g zentrifugiert, der Uberstand zu gleichen Teilen mit Frigen 113@ (Hoechst AG) versetzt, 30 Sek. mit dem Ultraturrax homogenisiert und anschliei3end 30 Min. bei 10 000 g zentrifugiert. Der gewonnene Oberstand wurde als losliches Br. canis-Antigen verwendet. Die Durchfuhrung der KBR erfolgte im Mikrotitersystem bei An- wendung der Warmebindung (I Std. bei 37 "C) unter Verwendung von je 2 Einheiten Antigen und Komplement. Alle Serumproben wurden nach In- aktivierung (30 Min. im Wasserbad bei 56 "C) in den Verdunnungen 1 : 5 und 1 : 10 getestet. Bei positivem Ausfall der Reaktion wurden die Seren aus- gehend von der Verdunnung 1 : 5 in 2er Stufen bis 1 : 640 titriert und erneut in der 0. a. Weise getestet.
Serurnlangsarnagglutination (BSLA) Durchfuhrung und Beurteilung der Rohrchenlangsamagglutination sind
bereits an anderer Stelle ausfuhrlich beschrieben (WEBER, 1976).
Ergebnisse 1. Experimentell infizierte Hunde
Bei allen Serumproben, die vor der Infizierung gewonnen worden waren, fie1 sowohl die KBR (Serumverdunnung 1 : 5) als auch die BSLA (Serumver- dunnung 1 : 50) negativ aus. Die Ergebnisse der sich bis zur 58. Woche post inf. erstreckenden serologischen Verfolgsuntersuchungen sind fur beide Verfahren und fur alle 6 infizierten Beagle-Hunde in Tabelle 1 vergleichend dargestellt.
7 Tage nach der Infizierung konnten bei keinem der 6 experimentell infizierten Hunde komplementbindende Antikorper ermittelt werden, wah- rend bei 3 Tieren die Langsamagglutination jeweils in der Serumverdunnung
74 8 WEBER und KRAUSS
neg I neg neg I 100 neg I 100 10 I 200 40 I 400 40 I 800 80 I 800 80 I 400 80 I 800 160 I 400 160 I 800 160 I 800 160 I 800 160 I 400 80 I 400 80 I 400 40 I 100 20 I 100 20 I 100
Tabelle I
neg I 50 10 I 100 40 I 100 80 I 400 80 I 800 160 I 800 160 / 800 160 / 800 320 I 800 160 I 800 160 I 800 160 I 800 160 I 800 160 I 800 160 I 400 80 I 400 40 I 200 40 I 200 80 I 800'
Serologische Verfolgsuntersuchung mittels Komplementbindungsreaktion und Langsamaggluti- nation bei 6 experimentell mit BY. canis infizierten Hunden
neg I 50 neg I 100 neg I 100 10 I 400 20 I 800 80 / 800 80 I 800 160 I 400 320 I 800 320 / 800 320 I 1600 160 I 800
0
i I Langsams Hund Nr. 9
neg I neg neg / 100 10 I 100 10 I 200 40 I 400 80 I 800 80 I 800 80 I 400 160 / 400 160 I 400 80 I 800 80 I 800 80 I 400 80 I 400 80 I 200 40 I 100 10 I 100 10 / 50 10 / 100
Ilu tinat ion Hund Nr. 10
neg I 50 neg I 100 10 I 400 20 I 400 40 I 800 80 I 800 80 I 800 80 I 800 160 I 800 160 I 400 160 I 800 160 I 800 160 I 800 80 I 400 80 I 200 40 I 200 20 I 100 40 I 100 40 I 100
Hund Nr. 14 neg I neg 10 I 200 20 I 400 80 I 400 80 I 800 160 I 800 80 I 800 80 I 400 80 I 400 160 I 800 80 I 800 80 I 800
0
Erklarung: neg = negariv in der KBR bzw. BSLA in der Serumverdiinnung 1 : 5 bzw. 1 : 50. 0 = n i h t rnehr untersucht, d a das Tier in der 30. Woche post inf. eingeschlafert wurde. '* = dieses Tier hat in der 56. Woche post inf. abortiert.
von 1 : 50 positiv ausfiel. Nach weiteren 7 Tagen erbrachte die KBR erstmals Lei 2 Hunden positive Ergebnisse, wahrend die BSLA bei allen 6 Hunden positiv verlief, und zwar bei 5 Tieren in der Serumverdunnung von 1 : 100 und bei 1 Tier in der Serumverdunnung von 1 : 200. 3 Wochen post inf. wiesen 4 Tiere und 1 Woche spater alle 6 Tiere komplementbindende Antikorper auf. Wahrend der gesamten Verfolgsuntersuchung bis zur 58. Woche post inf. fielen beide Verfahren stets positiv aus. Die hochsten KBR-Titer (1 : 160 bis 1 : 320) wurden in der 18.-22. Woche post inf. nachgewiesen.
Tabelle 2 Ausfall der Komplementbindungsreaktion und der Serumlangsamagglutination bei 1091 Serurn-
proben aus diagnostischen Einsendungen
Zum serologischen Nachweis von Brucella canis-Infektionen bei Hunden 749
l i ter in der Langsarnagglutination
1 : 50 1 : 100 1 : 200
2. Diagnostische Einsendungen Die Ergebnisse der KBR sowie der BSLA bei 1091 Serumproben von
Beagle-Hunden aus verschiedenen Versuchstierhaltungen sind vergleichend in Tabelle 2 gegenubergestellt. I n 198 Fallen erbrachten beide Verfahren iiberein- stimmend positive, in 782 Fallen ubereinstimmend negative Ergebnisse.
Der Reaktionsausfall der KBR bei Vorliegen von niedrigen Agglutina- tionstitern (I : 50 bis 1 : 200) ist zusammenfassend in Tabelle 3 wiedergegeben. Bei allen 106 Serumproben mit einem Agglutinationstiter von 1 : 400 und hoher fuhrte die KBR stets zu positiven Ergebnissen.
Zahl der Kornplement bindungsreaktion Seren positiv negativ
50 9 41 93 33 60 60 50 10
Diskussion Zum Nachweis spezifischer Antikorper gegen Bvucella abortus, BY. meli-
tensis oder BY. suis werden in der Komplementbindungsreaktion (KBR) i. d. R. korpuskulare Brucellenantigene verwendet (ALTON, JONES u. PIETZ, 1975). Ebenso wie DEYOE (1970) fanden wir, dai3 korpuskulares BY. canis-Antigen sich auch in hohen Verdunnungen als antikomplementar und somit fur die KBR als unbrauchbar erwies. PICKERILL (1970) stellte fest, dai3 ein wasserlos- licher Antigenextrakt aus ultraschallbehandelten BY. canis-Bakterien, die mit Aceton abgetotet worden waren, bei der Anwendung in der KBR vielfach zu falsch-positiven Ergebnissen fiihrte. DEYOE (1970) verwendete in der KBR BY. canis-Kochantigene, die aber ebenfalls nicht zu befriedigenden Resultaten fuhrten, da mit diesen Antigenpraparationen serologische Verfolgsunter- untersuchungen bei experimentell infizierten Hunden, auch bei langer beste- hender Infektion, haufig negativ ausfielen.
An anderer Stelle berichteten wir, dai3 ein unter Verwendung von Natriumdesoxycholat und Frigen 113 hergestelltes losliches BY. canis-Antigen sich in der Agargel-Prazipitation als brauchbar erwies (WEBER u. KRAUSS, 1975). Derart hergestellte Antigenpraparationen ergaben nach Austitrierung in der KBR im Blocktest Antigentiter, die zwischen 1 : 32 und 1 : 64 lagen. Dagegen erbrachten BY. canis-Antigene, die durch Hitzebehandlung gewonnen worden waren, in der Blocktitration Antigentiter von 1 : 2 bis hochstens 1 : 16. Aus diesem Grunde wurde das durch Natriumdesoxycholat- und Frigen- behandlung gewonnene Antigen dem Kochantigen vorgezogen. Die Brauch- barkeit dieser Antigenpraparation bei Verwendung von 2 Einheiten in An- wesenheit von 2 Komplementeinheiten zeigte sich bei der vergleichenden Oberprufung der insgesamt 1205 Serumproben von Beagle-Hunden.
Mittels der KBR konnten erstmals 14 Tage nach der experimentellen In- fizierung spezifische Antikorper gegen BY. canis nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt erbrachte die BSLA Titer von 1 : 100 bis 1 : 200. Ab der 4. Woche post inf. fuhrte die KBR bei allen entnommenen Serumproben zu positiven Ergebnissen, auch im chronischen Krankheitsstadium (in der 42. bis 58. Woche), als nur noch Agglutinationstiter von 1 : 50 bis 1 : 200 vorlagen. Bei solchen niedrigen Serumtitern fallen kulturelle Untersuchungen von Citrat-
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blutproben haufig negativ aus (VON KRUEDENER, 1976; WEBER, 1976). Aus diesem Grunde werden niedrige Agglutinationstiter von 1 : 50 bis 1 : 200 z. T. nicht als spezifisch fur das Vorliegen einer Br. canis-Infektion angesehen (MOORE u. GUPTA, 1970; HALL, 1971). In derartigen Fallen kann der positive Ausfall der Komplementbindungsreaktion die serologische Diagnose fur das Vorliegen ein%Infektion absichern.
Die Ergebnisse der serologischen Verfolgsuntersuchungen an 6 experimen- tell infizierten Beagle-Hunden lassen den Schlui3 zu, dai3 frische Br. canis- Infektionen mit der Komplementbindungsreaktion nicht erfaat werden. Fru- hestens 2-4 Wochen nach einer stattgefundenen Infektion sind erstmals kom- plementbindende Antikorper nachweisbar. Die Komplementbindungsreaktion fiihrt dann nach den vorliegenden Beobachtungen wahrend der gesamten Krankheitsdauer, d. h. also auch im chronischen Stadium, zu positiven Resul- taten.
Bei 18 O / o von 1091 uberpruften Serum roben aus diagnostischen Ein- sendungen fuhrte die Komplementbindungsrea ‘i: tion zu einem positiven Ergeb- nis. Alle 106 Proben, die in der Langsamagglutination in einer Serumverdun- nung von 1 : 400 oder hoher Titer aufwiesen, reagierten in der Komplement- bindungsreaktion positiv. Bei 782 Seren fielen Komplementbindungsreaktion und Langsamagglutination ubereinstimmend negativ aus. Nach diesen Be- funden sind falsch-positive Resultate bei Anwendung der Komplementbin- dungsreaktion weitgehend auszuschlieaen.
Durch den positiven Ausfall der Komplementbindungsreaktion konnte in 45 O/o von 203 Fallen der bei niedrigen Serumverdiinnungen von 1 : 50 bis 1 : 200 ermittelte Agglutinationstiter als spezifisch bestatigt werden. Bei die- sen Tieren durfte die Infektion in Anlehnung an die bei experimentell infi- zierten Versuchshunden erhobenen Befunde entweder erst 2-4 Wochen zuvor stattgefunden oder bereits im chronischen Stadium, 42 Wochen oder noch mehr vorgelegen haben. Bei den restlichen 11 1 Serumproben mit niedrigen Agglutinationstitern von 1 : 50 bis 1 : 200 fie1 die KBR negativ aus. In diesen Fallen fuhrten 3-6 Wochen spater mit beiden Verfahren durchgefuhrte Wie- derholungsuntersuchungen durchwegs zu einem negativen Ausfall. Bei einem Teil dieser Proben wurden zusatzlich neben der Komplementbindungsreaktion und Langsamagglutination auch noch die indirekte Immunfluoreszenz (WEBER u. HUSSEIN, 1976) sowie Agargel-Prazipitation (WEBER u. KRAUSS, 1975) durchgefuhrt, die jedoch negativ ausfielen. Vermutlich durfte bei diesen Tieren keine Br. canis-Infektion vorgelegen haben.
Fur den positiven Ausfall der Langsamagglutination in den Serumver- dunnungen von 1 : 50 bis 1 : 200 konnen auch Kreuzreaktionen mit heterolo- gen gramnegativen Bakterien, insbesondere Bordetella bronchiseptica oder Actinobacillus spec. mit verantwortlich gemacht werden (CARMICHAEL u. BRUNER, 1968; PICKERILL, 1970 a, b). Solche als unspezifisch anzusehende Agglutinationstiter konnen dann in Wiederholungsuntersuchungen im Abstand von 3-6 Wochen nicht nur durch die Langsamaglutination, sondern auch durch eine Komplementbindungsreaktion abgeklart werden.
Nach den Untersuchungsergebnissen Lei experimentell als auch bei natur- lich infizierten Hunden erweist sich die KBR insbesondere fur die Erfassung von chronischen Br. canis-Infektionen als brauchbar, wie dies schon von der Rinder- und Schweinebrucellose her bekannt ist (ALTON, JONES u. PIETZ, 1975). In solchen Fallen kann zur Abklarung niedriger Br. canis-Agglutina- tionstiter von 1 : 50 bis 1 : 200 die KBR zweifelsohne als eine wertvolle Er- ganzung zur Diagnose herangezogen werden. Dies ist besonders dann ange- bracht, wenn serologische Verfolgsuntersuchungen nicht moglich sind.
Zurn serologischen Nachweis von Brucella canis-Infektionen bei Hunden 75 1
Zusammenfassung 112 Seren von experimentell mit Br. canis infizierten Beagle-Hunden
sowie 1091 Serumproben von Beagle-Hunden aus diagnostischen Einsendungen wurden parallel in der Komplementbindungsreaktion (KBR) und in der Serumlangsamagglutination (BSLA) untersucht.
Komplementbindende Antikorper traten erstmals 2-4 Wochen nach der Infizierung der Versuchshunde auf und lionnten wahrend der bis zur 58. Woche dauernden Verfolgsuntersuchung regelmai3ig nachgewiesen werden.
980 von 1091 untersuchten Serumproben aus diagnostischen Einsendungen zeigten in der KBR und in der BSLA hinsichtlich positiver oder negativer Befunde Obereinstimmung. Bei 11 1 Serumproben mit unspezifischen Aggluti- nationstitern von 1 : 50 bis 1 : 200 fie1 die KBR negativ aus.
Auf Grund der durchgefuhrten Untersuchungen erweist sich die KBR als brauchbare Erganzung zur BSLA, insbesondere ‘bei Vorliegen von chronischen BY. canis-Infektionen.
Summary The complement fixation test for the detection of Brucella canis infections
in dogs Serum samples from 112 Beagles experimentally infected with B . canis,
and 1091 serum samples from diagnostic cases were investigated with the complement fixation test (CFT).
2-4 weeks after infection C F antibodies were detected for the first time, then regularly until termination of the experiment in the 58th week.
With 980 out of 1091 diagnostic serum samples the CFT was in complete agreement with the serum tube agglutination test (SAT) regarding positive or negative. 111 serum samples with SAT titers of 1 : 50 to 1 : 200 were negative in the CFT. The significance of the results is discussed.
The CFT is a useful additional method to the SAT, especially for diagno- sis of chronic cases of B . canis infection.
Resume
chez des chiens A I’aide de la reaction de fixation du complement
112 serums de chiens <<Beagle>> infectks expkrimentalement avec BY. canis et 1091 kchantillons de skrum de chiens <<Beagle>> envoyks pour le diagnostic ont k tk testis parallklement avec la rkaction de fixation du complkment et l’agglutination lente.
Les anticorps fixant le complkment sont aparus 2-4 semaines aprhs l’infection des chiens d’expkrience et ont pu &re mis en evidence rkgulikrement jusqu’d la 5 8 &me semaine. 980 kchantillons de skrum sur 1091 envoyks pour le diagnostic ont prksentk des rksultats positifs ou nkgatifs concordant dans la fixation du complkment et l’agglutination lente. Chez 11 1 kchantillons de d r u m avec des titres d’agglutination non spkcifiques (1 : 50 jusqu’d 1 : 200), la rkaction de fixation du complkment fut nkgative.
Sur la base de ces recherches, la rkaction de fixation du complkment s’est rkvklke &re un complkment valable de l’agglutination lente, en particulier lors d’infections chroniques A BY. canis.
A propos d’une recherche sirologique d’infections Brucella canis
752 WEBER und KRAUSS
Resumen Sobre la identificaci6n serol6gica de infecciones por Brucella canis
en perras mediante la reacci6n de fijaci6n del complemento
Se examinaron paralelamente 1 12 sueros sanguineos de perras beagles infectadas de forma experimental con Br. canis, asi como 1091 muestras skricas de perras beagles de envios diagndsticos, en la reacci6n de fijacibn del complemento (RFC) y en la aglutinaci6n skrica lenta (ASL).
Aparecieron por vez primera anticuerpos fijadores del complemento 2-4 semanas despuCs de la infecci6n de las perras de ensayo y se pudieron identifi- car con regularidad durante el examen de seguimiento que dur6 hasta la semana 58".
980 de 1091 muestras skricas analizadas, de envios diagnbticos, mostraban concordancia en la RFC y en la ASL con respecto a hallazgos positivos o negativos. En 11 1 muestras skricas, con titulos inespecificos de aglutinaci6n de 1 : 50 hasta 1 : 200, result6 negativa la RFC.
A la vista de 10s estudios realizados, se revela la RFC como suplemento utilizable de la ASL, sobre todo cuando existen casos de infecciones crbnicas de BY. canis.
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Anschrift der Verfasser: Frankfurter Stral3e 89/91, D 6300 Giegen/Lahn.
