Acta histochem. 64, 24H- ttll (1979)

Anatomischcs Institut der Karl-Marx-Universitat Leipzig

(Direktor: Prof. Dr. sc. med. R. BERTOLINI)

Zum Einsatz von N,N'·DiathylpseudoisocyaninchloridfUr den polarisationsoptischen Nachweis

von Polyanionen im histologischen Schnitt

The use of N,N' -diethylpseudoisocyaninchloride for thepolarization optical detection of polyanions in the histological section

Von GEORG SCHEUNER und GERD FLEMMING

Mit;) Abbildungen

(Eingegangen am 15. Jam~ar 1979)

Zusammenfassung

Es wird eine Technik zum polarisationsoptischen qualitativen und quantitativen Nachweis

von Polyanionen mit N,N' -Diathylpseudoisocyaninchlorid im histologischen Schnitt angegeben.Durch Prazipitation mit Kaliumferricyanid gelingt es, Depolymerisationserscheinungen zu ver­hindern und dic optische Anisotropie der entsprechenden Strukturen zu verstarken.

In vitro-Versuche sowie Messungen der Dispersion der Doppelbrechung und des Dichroismus

ermoglichen es, Zusammenhange zwischen den optischen Erscheinungen aufzuzeigen und Angabenzum Anlagerungsmechanismus des Gewebe-Farbstoff-Ferricyanidkomplexes zu machen.

Summary

In the paper a technique of the polarization optical qualitative and quantitative detection ofpolyanions with N,N' -diethylpseudoisocyaninchloride in the histological section is described.It is possible to prevent depolymerisation after precipitation with potassium ferricyanide and tointensify the birefringence of the histologieal structures.

In vitro-attempts and measurements of the dispersion of the double refraction and of the di·chroism indie~te connections between the optical appearances, forthermore it is possible to makestatements about the mechanism of the arrangement of the tissue-dye-ferricyanide-complex.

Einleitung

Ausgehend von unseren Untersuchungen zum Einsatz von N,N'.Diathylpseudo­isocyaninchlorid [(PIC); (SOHEUNER und WEISS 1967)] fUr den polarisationsoptischenNachweis orientiert angeordneter saurer Gruppen im histologischen Schnitt und derahnlichen Verwendung dieses Farbstoffes zur Klarung von Fragestellungen in derMorphologie durch MODIS et al. (1972, 1973) sowie MODIS (1974) erarbeiteten wirnunmehr eine standardisierte Technik, bei der mit Hilfe von PIC auch die quantita­tive polarisationsoptische Analyse von Polyanionen moglich ist.

250 G. SCHEUNER und G. FLEMMING

Literatur

Die Farbstoffmolekel des PIC bilden sogenannte "reversible Polymerisate" (SCHEIBE 1937 a, b,1939, 1941; SCHEIBE et a1. 1937 a, b, 1938; 1939a, b; SCHEIBE und ZANKER 1958). DafUr finden

auch die Begriffe "Polymerisation" bzw. "Assoziatbildung" Verwendung (ZANKER 1952; MOG­LICH et a1. 1942, HOPPE 1942, 1944a, b; ApPEL und SCHEIBE 1958, SCHAUER und SCHEIBE 1959;

STERBA 1961a, 1964; ROllmANYI 1963; SCHEUNER und WEISS 1967; SUSCHKE et a1. 1967; SCHEU­NER 1968; M6DIS 1974). Temperaturerhahung verhindert ebenso wie die Verdiinnung der waJ3­

rigen Farbstofflasung eine Bildung des PIC-Polymerisates (SCHEIBE 1937c, 1938a, b, 1939, 1941,1948; SCHEIBE et a1. 1937a; ZANKER 1952, ZIMMERMANN und SCHEIBE 1956; FREYTAG und RUSSEL

1971). A,ber auch durch Zusatz von Salzen zu verdiinnten wa13rigen Lasungen (FUHRT 1927 a, b, c;

SCHEIBE et a1. 1937a, b, c; REUTTER et a1. 1970; SCHEIBE 1941) bzw. durch Zugabevon Substan­

zen mit dichten elektronegativen Gruppen wie Insulin, Heparin, Hyaluronsaure und Chondroitin­

schwefelsaure kann eine Molekiilaggregation des Farb~toffes erreicht werden (SCHEIBE 1938a,1939, 1941; SCHEIBE et a1. 1939b; SKERLAK 1941; SCHEIBE und SCHAUER 1958; ApPEL und

SCHEIBE 1958; SCHIEBLER und SCHIESSLER 1959; SCHAUER und SCHEIBE 1959; ROMHANYI 1963;

SUSCHKE et a1. 1967; REUTTER et a1. 1970; FREYTAG und RUSSEL 1971). Dabei lagern sich 150

(SCHEIBE 1938b) bis mehrere Hundert Farbstoffkationen (SCHEIBE 1938a) zu geldrollen- bzw.

fadenfarmigen Gebilden aneinander (SCHEIBE 1938b, 1948, 1970; SCHEIBE et a1. 1938, 1939a;ZIMMERMANN und SCHEIBE 1956; SCHAUER und SCHEIBE 1959, M6DIS 1974). Mit der Bildung

reversibler Polymerisate des PIC sind charakteristische A.nderungen der Absorptions. und Fluores­cenzeigenschaften verbunden. Die Entstehung von Riesenionen bewirkt das Auftreten einer ex­

trem schmalen und in den langwelligen Bereich verschobenen Absorptionsbande (SCHEIBE 1937 a,1938a, b, 1939, 1941, 1948; SCHEIBE et a1. 1937b, 1938, 1939a; SKERLAK 1941; MOGLICH et a1.

1942; HOPPE 1944a, b; ZIMMERMANN und SCHEIBE 1956; REUTTER et a1. 1970; FREYTAG undRUSSEL 1971; M6DIS 1974) zusatzlich zu den beiden Absorptionsmaxima, die auch bei verdiinn­ten Lasungen auftreten. Sie liegt in Abhangigkeit von den Versuchsbedingungen zwischen A =

562 [nm] und A = 583 [nm] (SCHEIBE 1938b, 1970; SCHAuERund SCHEIBE 1959; STERBA 1964;SUSCHKE et a1. 1967; M6DIS 1974). Das Auftreten typischer Fluorescenzbanden in diesen Wellen­langenbereichen geben SCHEIBE et a1. (1937 a, b), SCHEIBE (1941, 1970), ZIMMERMANN und SCHEIBE(1956) sowie STERBA (1961a, b, 1964) an.

Die Elektronen der einzelnen Farbstoffmolekiile bilden durch Ineinandergreifen der Elektro­nenwolken eine Absorptions- und Fluorescenzeinheit, wobei eine groJ3e Anzahl Lichtquanten gleich­zeitig aufgenommen, im Polymerisat fortgeleitet und an jeder beliebigen Stelle im Sinne einer

sogenannten "Resonanzfluorescenz" wieder abgegeben werden kann (SCHEIBE 1937b, 1938b).Angaben zur Konzentration der waJ3rigen PIC-Lasung, bei der die Polymerisation einsetzt, sind

unterschiedlich. Die schmale Absorptionsbande ist bei Konzentrationen von 3 X 10-3 mol am deut­

lichsten ausgepragt (SCHEIBE 1970). Diese Konzentration wird wesentlich herabgesetzt bei Ab­sorption der Farbstoffmolekiile an Oberflachen mit dicht angeordneten elektronegativen Gruppen

(SCHEIBE et a1. 1939b; SKERLAK 1941).Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde PIC zum Nachweis biologischer Objekte ein­

gesetzt, die oberflachlich in einem Abstand von weniger als 5 A anionische Gruppen besitzen(SKERLAK 1941; SYLVEN 1954; ApPEL und SCHEIBE 1958; SCHIEBLER und SCHIESSLER 1959;STERBA 1964; FREYTAG und RUSSEL 1971; M6DIS 1974). So erfolgte der Einsatz zum qualitativen

Nachweis von Glykosaminoglycanen durch SCHEIBE und SCHAUER (1958), ApPEL und SCHEIBE(1958), SCHEIBE und ZANKER (1958), SCHAUER und SCHEIBE (1959), SUSCHKE et a1. (1967), SCHEU­NER (1968), REUTTER et a1. (1970), M6DIS et a1. (1972,1973) und M6DIS (1974), aber auch in derNucleinsaurehistochemie (STERBA und SCHAFFNER 1965) und bei der Demonstration des Insulins(SCHIEBLER 1958; SCHIEBLER und SCHIESSLER 1959; COALSON 1966; FREYTAG und RUSSEL 1971)fand PIC Verwendung. Ein Prinzip dieser Untersuchungen besteht in der Oxydation der Disulfid··gruppen zu Sulfatgruppen, an die sich die Farbstoffteilchen anlagern. Auf dem gleichen Mechani~·

mus beruht die Erforschung der Neurosekretion (ADAM 1960; STERBA 1961a, b, 1964; STERBA

Zum Eillsatz von N,N'.J)iiithylpseudoisocyaninchlorid 251

lIud "TELLNER 1963: 1-tOHXISCH 1964; HANNEFORTH 1965; STERBA und HOHEISEL 1965; NAGY

1965; SCHEUNER und 'WEISS 1967; JAKOVLEVA et al. 1968; KUHLMANN 1971; STERBA et al. 1973).

SCHETiNER (1968) und i'iCHE1.: NER et al. (1976) verwendeten den Farbstoff fur den fluorescenzopti.

schen Nachweis des Sialoml\cinsaumes an Placentazotten. Die PIC-Reaktion ist bei den genann·ten Voraussetzungen iiuf.ler.st ompfindlieh, aber nicht spezifisch flir schwefelsaure Gruppen.

Auch dissoziiert.e Carboxylgruppen werden mit erfaEt (SCHEUNER und WEISS 1967). Der Nachteildes Verfahrens mit PIC besteht darin, daE die Untersuchungen nur in einem sehr begrenzten

pH·Bereich erfolgen. Auf3erdem kommt es unter dem Einfluf3 von UV-Licht bei fluorescenzopti.

scher Technik zu einer Depolymerisation der Farbstoffaggregate (STERBA 1964).

Ausgehend von den Bcohachtungen dureh SCHEUNER und WEISS (1967) weist M6DIS (1974)nach, daf3 PIC optimale Eigenschaften fUr den Einsatz bei topooptischen Reaktionen besitzt.

PIC wircl clurch keinen anderen Farhstoff von seinen Bindungsstellen am histologischen Schnitt

verdrangt. Auch bei der 1fessung der i'itarkc der Anisotropie erreieht PIC von den untersuehtenFarbstoffen die hochsten \Verte. Hier besteht ein direkter Zusammenhang mit der hohen Dielektri·

zitatskonstantc und dem hohen Dipolmoment von PIC (M6DIS 1974).

Material und Technik

Fiir unscrc Untersuchungen stand N,N·.Diathylpseudoisoeyaninehlorid (Dr. Harms, Bayer,

Leverkusen) zur VerfUgung (Molmasse 382,88). Die 0,145%ige waErige Lasung entsprechend der

Konzentration von 3,78 X 10-3 mmoljl hat einen pH = 6,4. Die polarisationsoptisehen Analysen

fUhrten wir mit dem Polarisationsmikroskop Amplival pol d (VEB Carl Zeiss, Jena) unter Ver·

wendung von BRACE-KoHLER.Kompensatoren und Metallinterferenzfiltern dureh. Die Absorp.

tionsmessungcn der waf3rigen Farbstofflasung erfolgten mit dem Specord (VEB Carl Zeiss, Jena).Den Diehroismus ermittelten wir mit Hilfe des Polarisationsmikroskopes Amplival pol dfotometrie,das liber einen SEV an das Digitalvoltmetor 4027 (VEB Carl Zeiss, Jena) gekoppelt war.

Ergebnisse

Um Depolymerisationserscheinungen verhindern und eine quantitative polarisa­tionsoptische Auswertung der PIC.Anlagerung durchftihren zu konnen, war es er·forderlich, einen moglichst wasserunloslichen Komplex zu erzeugen. Das Prinzipeiner solchen "Priizipitationsreaktion", die zur St!Lbilisierung der Fiirbung und zurSteigerung des Anisotropieeffektes ftihrt, wurde von ROMHANYI (1963) im Zusam.menhang mit der Toluidinblaufiirbung eingeftihrt. Neben anderen Metallsalzen eig.nete sich besonder~ Kaliumferricyanid (KFC) zur :Fiillung von Toluidinblau.

Analog den Untersuchungen von HEBENSTREIT und KELLER (1968) mit Toluidin­blau prUften wir zuniichst, in welchem Mischungsverhiiltnis PIC und KFC mitein­ander zu einem Fiillungsprodukt reagieren. Es zeigte sich, daB bei einem Molverhiilt­nis KFC : PIC-_c 1: 3 uine sufortig(' Gelierung his zur Ausfiillung eines deutlichenNiederschlages eintritt. Zentrifugiert man den Niederschlag ab, kann man ihn alsgrobscholligen diehten Riiekstand gewinnen. Es entsprieht den theoretischen Er­wartungen, daB KFC als Ill-wertiges negatives Anion mit dem I-wertig positivenFarbstoffkation im MolverhiiJtnis 1: 3 reagiert. Das Priizipitat lost sich vollstiindigin Athanol (70-, 96- und lOO%ig), Butanol (70%ig) und Propanol (70%ig).

Der entwasserte Niederschlag ist in Chloroform und Trichloriithylen gut, in Benzoljedoch nicht 16slich. Die Stabilitiit der PIC·Lasung ist gegeniiber Benzol gut, sie

252 G. SCHEUNER und G. FLEMMING

sinkt bei Trichlorathylen mittelmaBig ab und ist bei Chloroform als schlecht zu be­zeichnen.

AufschluBreich fUr die Bindungsverhaltnisse des PIC-KFC-Komplexes sind Fal­lungsreaktionen zwischen PIC und verschieden geladenen groBen, schwer polarisier­baren lonen.

Dem kationischen PIC stellten wir einen anionischen Farbstoff der Oxonolreihesowie groBe Anionen (KFC) und groBe Kationen (Triphenylbenzylphosphoniumchloridund Tetraphenylarsoniumchlorid) gegeniiber.

Es zeigten sich folgende Reaktionen:

1. (PIC) + und (groBes Anion)- -+ Fallung2. (PIC)+ und (groBes Kation)+ -+ keine Fallung3. (Anionischer Farbstoff)- und (groBes Anion)- -+ keine Fallung4. (Anionischer Farbstoff)- und (groBes Kation)+ -+ Fallung

Die jeweiligen Fallungsprodukte losen sich in Chloroform.

Das Verhalten des Farbstoff-Ferricyanid-Komplexes gegeniiber organischen Lo­sungsmitteln spricht dafiir, daB der Komplex durch lonenpaarbildung entsteht,wie sie von SHIJO (1974, 1975) erortert wird. Besonders die Resultate der Fallungs­reaktionen zwischen PIC und verschiedenen groBen schweren lonen sowie das Ver­halten zu dem anionischen Farbstoff der Oxonolreihe weisen auf die lonenpaarthe,oriehin. Die groBe Alkohollabilitat des Komplexes ist auf die Dipolwirkung des Losungs­mittels zuriickzufUhren und unterstiitzt die Modellauffassung der Bindungsverhalt­nisse des PIC-KFC-Komplexes. Theoretisch ist die Bildung folgender Komplexionenmoglich:

1. [3 Farbstoffkationen-Ferricyanidanion].2. [2 Farbstoffkationen-Ferricyanidanion]-.3. [1 Farbstoffkation-Ferricyanidanion]--.Die Molekiile werden iiber VAN DER WAALssche Krafte zusammengehalten. Die

Versuche zu den reagierenden Molmengen lassen allerdings das Modell 1 als daswahrscheinlichste erscheinen. Vergleichbare Untersuchungen von ZUGIBE und FINK(1966a, b) scheinen diese Aussage zu bestatigen.

Die Absorptionskurve der 0,00145%igen waBrigen PIC-~osung (Abb. 1) zeigtnach Zusatz von KFC eine neue extrem schmale Absorptionsbande zwischen A. =574 [nm] und A. = 576 [nm], deren Maximum durch die KFC-Konzentration nurin der Hohe, nicht jedoch im Wellenltingenbereich beeinfluBt wird. Das Auftretendieser zusatzlichen Absorptionsbande im langwelligen Bereich unterscheidet sich ur­sachlich von einer echten spektralen Verschiebung. So zeigen andere Farbstoffe, z. B.Toluidinblau oder Azur A, bei Molekiilaggregation eine spektrale Verschiebung insKurzwellige (Beziehung zur Metachromasie siehe SCHEUNER und HUTSCHENREITER[1975b]). Die schmale Bande ist Ausdruck der unter Zugabe des Eisenkomplexsalzeserzwungenen Polymerisation des PIC, wie sie auch bei Zusatz anderer Salze im Ex­periment beobachtet wurden (SCHEIBE 1937 c, 1941; SCHEIBE et al. 1937 c; REUTTERet al. 1970).

Zu III ~: inoatz von l\',l\".Diiit ity1pseucloisocyaninch1orid

Ext.

1,0

253

B

0,5

0.1

o

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A-------J II ,

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Abb, 1. Darstellung der Absorptionskurven cler wa13rigen PIC.Losung (0,001 45%ig)

A Absorptionskurvc cler Losung des reinen Farbstoffes

B = Absorptionskurve cler wa13rigen Farbstofflosung nach Zusatz von KFC

Durch die eintretende Aggregation kommt es zu Kopplungseffekten (DAHNE undLEUPOLD 1966) libel' Nebenvalenzen (FORSTER 1962) del' FarbstoffmolekUle, die zueiner neuen Absorptionsquelle fUhren (MOGLICH et al. 1942; SCHEIBE 1970) und diebeschriebenen optischen Erscheinungen hervorrufen. Moglichel'weise handelt es siohauoh um eine Form del' "oharge.transfer"-Bande (SHRIVER 1966; LUDI und GU-DEL1973), die bei del' Ausbildung des 3. Absol'ptionsmaximums eine Rolle spielt. Auf Grunddel' geringen Abstiinde del' Molekel im Assoziat (HOPPE 1944 b; SCHEIBE 1948, 1970)sind Uberlappungserscheinungen verschiedener Elektronenorbitale mit Resonanz­aufspaltung del' Terme (DAHNE und LEUPOLD 1966; TEUSCHNER et al. 1975) alsQueUe del' Absorption sehr wahl'scheinlich.

Die Dispersionskurve del' Doppelbrechung des FarbstoffauBstriches (Abb. 3) zeigt,

daB ein zweimaliger Weehsel des Vorzeichens del' Doppelbreehung auftritt. FindetJIlan ohcrlmlb von}, 1580 [nm] positive Doppelbrechung (Bmmgsrichtung parallel zurAusstrichriehtung des Farbstoffes), so erhiilt die Doppelbrechung unterhalb von}, = 550 [11m] cin negntives VOl'zeiehen. Diesel' Kurvenverlauf ist mit dem von MODIS

(1974) angegebenen vergleiehbal'. Del' Weehsel des Vorzeichens del' Doppelbrechungunkrhalb von .Ie 500 [nm] wird von MODIS (1974) nicht erwiihnt. Die Dispersions­kurven unterseheiden sieh auch in einem weiteren Punkt prinzipiell. MODIS (1974)fUhrt wie ROMHANYI (1963) und MODIS et al. (1973) bei den el'mittelten Dispersions­kurven den Kurvenzug im Umschlagbereich des Vorzeichens durch die Nullinie des

254

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G. SCHEUNER und G. FLEMMING

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Abb.2. Dispersion des Dichroismus des getrockneten Ausstriches einer waJ3rigen PIC·LosungE

j= Extinktion bei senkrechter Stellung des Polarisators zur Langsrichtung des Ausstriches

Ell = Extinktion bei paralleler Stellung des Polarisators zU,l' Langsrichtung des Ausstriches

Eu-E j = relative Starke des Dichroismus (L1 E)

0,3

Zum Einsatz von N,N'-Diiithylpseudoisocyaninchlorid

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255

Abb.3, Zusammenhang zwischen Dispersion der Doppelbrechung und Dispersion des Dichrois·

mus am getrockneten Ausstrich einer wa13rigen PIC·Losung

. - - - - : Dispersion der Doppelbrechung---: Dispersion des Dichroismus

Gangunterschiedes weiter. An einem solchen Punkt miiBte danach optische Isotropievorliegen, Zwischen A = 550 [nm] und A = 580 [nm] ist eine Messung des Gangunter­schiedes mit dem Polarisationsmikroskop aber nur deshalb nicht moglich, weil dieaufgehellten Bander des Ausstriches ebenso wie die Gewebsstrukturen nicht zukompensieren sind, obwohl es bei Drehung um 3600 zu einer 4maligen maximalenAufhellung und 4maligen maximalen Abdunklung des Objektes kommt. Der Dichrois­mus des Objektes (Abb, 2, 3) ist allerdings in diesem Wellenlangenbereich sehr gutnachweisbar. Das bedeutet, daB es in diesem Gebiet eine Wellenlange gibt, fUr dieeine Schwingungsrichtung im optisch anisotropen Medium nahezu vollstandigabsorbiert wird. Daraus folgt, daB bei dieser Wellenlange linear polarisiertes Lichtaus dem Untersuchungsobjekt austritt. Es kann deshalb in der Dispersionskurve kei­nen Punkt geben, an dem Isotropie vorliegt. In der Literatur wird dieser Punkt als"Inversions"- bzw. "Inflexionspunkt" bezeichnet (ZacHER und JACOBY 1927; ROM­

HANYI 1963; VIDAL 1972a, b; MELLO und VIDAL 1973). Er soIl die Stelle des Um­schlages von positiver zu negativer Doppelbrechung kennzeichnen. Ein solcher Punkt,der nur durch isotropes Verhalten des PIC-Ausstriches erklarbar ware, ist jedoch

256 G. SCHEUNER und G. FLEMMING

c

b

a

Abb. 4. Schematische Darstellung einer Moglichkeit des Gewebe.Farbstoff.Ferricyanid.Kom.

plexes

a: Gewebsoberflache mit elektronegativen Gruppenb: PIC.Polymerisate

c: Ferricyanidionen

nicht vorhanden. Es ist deshalb nicht gerechtfertigt, in diesem Sinne den Kurven­zug die Abszisse schneiden zu lassen (SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1975a, b).

Es war nicht moglich, einen KFC-prazipitierten Farbstoffausstrich herzustellen,da sich auf dem Objekttrager die KFC-Molekiile nicht an die Farbstoffassoziate ge­richtet anlagern, sondern unabhangig vom Farbstoff stark doppelbrechende Kristall­konfigurationen bilden, die eine polarisationsoptische Messung unmoglich machen.

Der Verlauf der Dispersion des Dichroismus am PIC-Ausstrich (Abb. 2) entsprichtder allgemeinen Erfahrung, daB parallel zur Bezugsrichtung des Objektes auftreffen­des Licht starker absorbiert wird als senkrecht dazu schwingendes (SCHEUNER undHUTSCHENREITER 1972). Es ergeben sich Extremwerte des Dichroismus in dep. Be­reichen 570 < A. < 590 [nm] und 490 < A < 510 [nm], auBerdem findet sich einWendepunkt zwischen 550 < A < 555 [nm]. Das Verhalten des Dichroismus vonPIC entspricht damit im wesentlichen den von ZOCHER und JACOBY (1927) aufgestell­ten Regeln. FoIgende Zusammenhange (Abb. 3) sind besonders deutlich:

1. Die Doppelbrechung ist nicht meBbar in den Wellenlangenbereichen, in denender Dichroismus einen Extremwert zeigt.

2. Vor den Extremwerten des Dichroismus hat die Doppelbrechung dasselbe,dahinter das entgegengesetzte Vorzeichen wie der Dichroismus.

Fur die Bindungsverhaltnisse des PIC·KFC.Komplexes an die Gewebsoberflache laBt sich fol­

gende Hypothese aufstellen: An die dichtstehenden freien, elektronegativen Gruppen del.' Gewebs·oberflache lagert sich del.' Farbstoff in polymerer Form an. rm entsprechenden Molverhaltnis wird

Kaliumferricyanid an dieses System gebunden, so daB sich ein Gewebe.Farbstoff.Ferricyanid­

Komplex ergibt (Abb. 4). Die Anlagerung des Eisenkomplexsalzes scheint die Angriffsmoglich­keiten del.' Wasserdipole stark herabzusetzen, denn die ohne Prazipitation beobachtete Depoly­merisation bleibt nach diesel.' Behandlung aus.

Als standardisierte Technik zum polarisationsoptischen Nachweis von Polyanionen im Ge-webeschnitt empfehlen wir folgendes Vorgehen:

1. Anfertigung von Paraffinschnitten nach del.' ublichen Technik.2. Einstellen del.' Schnittc 30 min in Xylol, anschlieBend 5 min in absoluten Alkohol.3. Vollstandige Entparaffinierung mit Methanol/Chloroform = 1: 1 bei 50°,24 h.

Z II III E iw-;atz von N,1\' -DiiithylpHeudoisoeyaninehlorid 257

Abb. 5. PolariHationsoptisehe Darstellung del' cpithelialcn Basalmembl'an (Pfeil) in del' Chorion­

zotte einer jugendliehen mensehlichen Placenta naeh KMn0 4-Oxydation und anschlieBender PIC·Farbung. Paraffinschnitt. Ie = 589 [nm]. EinHchluBmedium Gummi arabieum. 1082: 1.

a. Polarisatoren X, keine Kompensation. Basalmembran hellb. Polarisatoren X. Kompensation mit },!8-Brace-Kahler-Kompensator. Basalmembran dunkel

(negatives Vorzeichen del' Doppelbreehung; Bmmgsl'iehtung Flachennormale del' Membl'an).

4. Nach Spiilen im ahsolutfm Alko)101 Trocknen del' Sehnitte und Einstellen in Aqua dest.5. Histochemische Vorbehandlung je naeh Problemstellung.6. 5 min flieBend \Vassern und in Aqua nest. Spiilen.7. 2 bis 3 Tropfen del' 0,145%igen waJ3rigen PIC-Lasung werden mit Hilfe einer Pipette auf

das Priiparat getropft, so dal3 del' ganze histologisehe Schnitt bedeekt ist.8. Farbstoff 5 min einwirken lassen. (Das Praparat muJ3 gleiehmaBig rot gefarbt sein.)9. Das Praparat, mehrmals kurz in Aqua dest. tauehen bis del' iibersehiissige Farbstoff ab­

gespiilt ist.

10. Sehnitt 1 min in 2%ige wal3rige Kaliumferrieyaninlosung stellen.

11. Pl'aparat kurz in A qua nest. tauehen bis iibersehiissiges Kaliumferrieyanid abgespiiltist.

12. Del' Sehnitt ist jetzt kurz mit, FlieJ3papier anzutroeknen, dabei besonders auf Reste von

KaliumferrieyanidlOsung aehten.13. Ansehlief30nd wird das Praparat Bofort, mit einer diinnen Sehieht von Gummi arabieum uber­

zogen, dem Kaliumferricyanid zugosotzt wurde (1 Tropfen 1 %ige Lasung auf 20 ml Gummiarahieum).

14. Naeh dem vollstandigen Eintroeknen des Gummi arabieum (erkennbar an feinen Rissen

an del' Oberflache) wird das Praparat mit Canadabalsam ubersehiehtet und mit einem Deekglas­chen abgedeekt.

Auf diose \Voise gelingt die Herstellung von Dauerpraparaten, die naeh unseren Erfahrungenbisher 2 Jahre die vollo Anfiirbbarkeit bei erhaltener polarisationsoptisoher Auswertungsmaglieh-

17 Acta histochem. Be!. 6+

258 G. SCHEUNER und G. FLEMMI~G

keit und gleichbleibendem Gangunterschied bewahrten. Vor der Anwendung von Alkoholen (auchdurch unsaube)'e Kiivetten oder ungeniigendes Wassern nach absteigender Alkoholreihe) wahrendund nach dem Farben mochten wir warnen, da Alkohole eine Depolymerisation der Farbstoff­assoziate herbeifiihren.

Die erarbeitete Technik eignet sich gut fUr den qualitativen und quantitativen polarisations­optischen Nachweis freier anionischer Gruppen an Gewebestrukturen im histologischen Schnitt(Abb. 5). Sie konnte bereits bei der Analyse der molekularen Struktur der maternofetalen Stoff­wechselschranke erfolgreich eingesetzt werden (FLEMMING 1978, SCHEUNER et al. 1979, SCHMIDT1978). Es empfiehlt sich, die Untersuchungen bei .Ie = 589 [nm] durchzufUhren.

Literatur

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D.AHNE, S., und LEUPOLD, D., Kopplungsprinzipien organiseher Farbstoffe. Angew. Ohern. 78,1029-1039 (1966).

FLEMMING, G., Beitrag zur Anwendung von N,N'-Diathylpseudoisocyaninchlorid in der Polari­sationsmikroskopie und sein Einsatz fiir qualitative und quantitative Untersuchungen an dermaterno-fetalen Stoffwechselschranke der menschlichen Plazenta. Med. Diss. Prom. A, Leipzig

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Anschrift del' Vel'fasser: Doz. Dr. sc. med. GEORG SCHKCNER und Dr. med. GERD FLEMMING,

Anatomisehes Institllt del' Karl·1\Ial'x-Univel'sitat, DDR - 701 Leipzig, LiebigstraLle 13.