Pharmakognostisches Institut der Universitat Wien, tlsterreich und Institut fur Pharmazeu­tische Biologie der Philipps-Universitat Marburg/L., BRD

Wurzeldifferenzierung und Glykosidbildung bei in vitro kultivierten Blattexplantaten von Digitalis purpurea L.

Root Differentiation and Glycoside Formation in Tissues of Digitalis purpurea 1. Cultured in vitro

WALTRAUD RUCKER, KURT ]ENTZSCH und MAX WrcHTL

Mit 5 Abbildungen

Eingegangen am 6. Mai 1976 . Angenommen am 9. Juli 1976

Summary

Leaf explants of Digitalis purpurea were cultured on an agar medium (HELLER) contai­ning additives of indole acetic acid (IAA) of 10-8-10-4 glml and glucose or sucrose at 1-4 per cent. Under such conditions marked root systems but little callus develop on the leaf explants (11 to 14 per cent of the total new tissue production). The longitudinal polar­ity of the leaves is maintained. The influence of increasing IAA concentrations and of in­creasing glucose or sucrose concentrations on the induction and development of the roots was studied. Minimum concentrations of 10-8 glml IAA and 1 per cent of sugar are requir­ed to initiate root formation. The tissues respond to increasing IAA concentrations of up to 10-5 glml IAA with an enhanced root formation and after a further increase in concen­tration to 10-4 glml with a strong inhibition of the root formation. Glucose and sucrose in amounts of 1-4 per cent exhibit a rather uniform influence on the root growth; 5 per cent of either of the sugars not only suppress any kind of root formation, but also produce ne­croses on the leaf explants. The time course of the roOt formation clearly shows two stages of growth: root formation sets in 6-8 days after the beginning of the experiment; this is followed by a period of rapid growth which, after 20-30 days, is succeeded by a period of slower root growth. The point of time of the transition from the first to the second growth period depends on the IAA concentration and on the size of the explants. When larger leaf explants and the optimal IAA concentrations of 10-6 glml and 10-5 glml IAA are employed, the initial more rapid stage of growth terminates earlier than in the case where smaller leaf explants are used or where the highest or the lowest concentrations, i.e. 10-4 glml and 10-7 g/ml IAA, are applied. The roots developed are strongly pilous and consist of a central cylinder and a root parenchym in almost equal amounts. In the paren­chyme of the callus tissue sufficient vascular formation centres were observed.

The glycoside content of the newly developed root and callus tissues was studied. For purposes of comparison the leaves and roots of the initial plants were also examined. The initial leaf tissue has a high glycoside content, whereas the newly formed root tissue con­tains only few cardioactive glycosides which exhibit, however, a similar composition to that of the root tissue of the plant. Only small amounts of cardenolide glycosides can be found in the callus; glucoevatromonoside and digitalinum verum arc present in amounts of

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about 10 mg per 100 g dry tissue and other glycosides were detected In even smaller amounts.

Key words: root differentiation, cardioactive glycoside;, callus tissue, Digitalis purpu­rea.

Einleitung

An Gewebekulturen von Digitalis lanata und Digitalis purpurea konnten STABA und Mitarbeiter (1962, 1963 a, 1963 b) eine Tendenz zu Organstrukturbildungen beobachten. Fiir die morphologische Differenzierung bei der in vitro-Kultur dieser beiden Digitalisarten erwiesen sich Zusammensetzung und Konzentration der ver­wendeten Nahrsalzlosungen als ausschlaggebend (KRTINA, 1973); diese Faktoren entscheiden im wesentlichen dariiber, ob an den Explantaten eher Kalluswachstum - bei Verwendung von Nahrlosungen nach MURASHIGE und SKOOG - oder Wurzel­differenzierung - bei Kultivierung in Nahrlosungen nach HELLER - eintritt. In den neu entwickelten Kallus- und Wurzelgeweben konnten Glykoside nachgewiesen werden (KRTINA, 1973).

In Fortsetzung dieser Untersuchungen erschien es uns angezeigt, Blattexplantate von Digitalis purpurea in einem die Wurzelbildung fordernden Nahrmedium zu kultivieren und den zeitlichen Veri auf der Wurzeldifferenzierungen unter dem Ein­flu~ von Indolessigsaure und Zucker zu untersuchen. Bei dieser Gelegenheit sollte auch die Bildung der Glykoside naher gepriift werden.

Von den multiplen Wirkungen der Indolessigsaure gehort die Stimulation der Wurzelbildung zu den hervorstechendsten Eigenschaften (STREET, 1966; MOHR, 1971 a). Von GAUTHERET sind sowohl Auxin als auch Zucker als wesentliche Fakto­ren fur die Wurzelbildung erkannt, und ihre Wirkungsmechanismen im Zusammen­spiel mit Licht und Temperatur am Rhizomgewebe von Topinambur untersucht worden (1965, 1966, 1969).

Material und Methode

1. Gewebekultivierung

Die Versuche werden mit Teilen mittelgroBer Digitalisblatter durchgefiihrt, die von 1/2 bis II/2jahrigen, im Glashaus kultivierten Pflanzen ohne Bliitenansatz stammen. Entlang der Mittelrippe konnen je nach BlattgroBe 3-5 Explantate herausgeschnitten werden, wobei die Gewebe der Blattspitze, Blattbasis und der Blattdinder verworfen werden. Die GroBe der Explantate betragt 1 bis 1,5 em mit durchschnittlichen Frisch- und Trockengewichten von 400 mg bzw. 30 mg. Zum Vergleich werden auch kleine Blatter von steril geziichteten PfHinzchen fiir die Versuche herangezogen. Ais Kulturmedium dient Agar nach einem Re­zept von HELLER (1953), aber mit Zugabe von Spurenelementen nach MURASHIGE und SKOOG (1962) und Zusatzen von 1 bis 5 % Glukose oder Saccharose, sowie Indolessigsaure (IES) in den Konzentrationen 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 und 10-4 g/m!. Von dieser Nahrlosung werden 20 ml in Kultureprouvetten von ca. 23 mm Durchmesser gefiillt. Beim Einsetzen der Explantate wird ihre Polaritiit beriicksichtigt, die, wie wir in Vorversuchen erkannten, von

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den Geweben unter den gegebenen Versuchsbedingungen beibehalten wird: Wurzelbildungen konnen bevorzugt an der Blattbasisseite der Explantate beobachtet werden. Urn die Eihigkei­ten der physiologisch aktiven Blattbasisseite zu nutzen und den Wurzeln das Ausbreiten nach allen Seiten zu ermoglichen, womit die Bewertung der gebildeten Wurzeln erleichtert wird (vgl. Methode Abschnitt 2), haben wir die Blattfragmente senkrecht mit der Blattspit­zenseite nach unten in den Nahragar geschoben. Bei der Beschreibung der Resultate werden die Bezeichnungen basal und apikal der Polaritat des Blattes entsprechend beibehalten, ob­wohl, wie eben beschrieben, bei unserer Versuchsanordnung die apikale Seite nach unten ge­kehrt im Agar steckt, wahrend sich die basale Seite oben und auBerhalb des Nahragars be­findet. 24 bis 48 KuIturen werden pro Experiment angesetzt, die flir die Dauer der Kulti­vierung in Brutraumen bei einer Temperatur von 23-25 DC und einem Tag-Nacht-Beleuch­tungsrhythmus von 12 : 12 Stun den gehalten werden.

2. Quantitative Beurteilung der Wurzelbildung

Urn das Wurzelwachstum wahrend des Versuchs zu erfassen, werden die einzelnen Kul­turen in 6- bis 14tagigen Intervallen im Hinblick auf die gebildeten Wurzeln beurteilt. Da­bei erweist sich bis zu einer Kultivierungsperiode von zwei Monaten die optische Bewertung des gesamten Wurzelsystems und Zuordnung in eine von sechs GroBenklassen - falls sie immer yom gleichen Experimentator durchgefiihrt werden - als die geeignetste Methode; sie bietet den Vorteil, daB die Bewertungen fortlaufend an denselben Kulturen durchgefiihrt werden konnen. Ais Aktivitatsbewertung kann man haufig die Angabe: Wurzel pro Kultur finden (GAUTHERET, 1969). Diese Methode des Auszahlens der Wurzeln, die sich direkt aus den Explantaten entwickeln, ist fiir Versuche mit Digitalis-Blattexplantaten nicht angemes­sen, da auf diese Weise die VergroBerung der Wurzelsysteme nur ungeniigend erfaBt wird; es nimmt namlich die gesamte Wurzelmasse stetig durch Verdickung der bereits gebildeten Wurzeln und Ausbildung neuer Seitenwurzeln, nicht aber die Bildung neuer Hauptwurzeln zu. Urn die geschatzten GroBenklassen in Gewichtsklassen umwandeln zu konnen, werden in einem eigens dafiir angesetzten Versuch, die gebildeten Wurzeln optisch bewertet und an­schlieBend ihre Frisch- und Trockengewichte bestimmt (Tabelle 1 und Abb. 1 a-d). Bei vergleichender Betrachtung der Wurzelgewichte in den einzelnen Klassen erkennt man, daB die perzentuellen Gewichtsunterschiede zwischen den Klassen IV, V und VI viel geringer sind als zwischen den Klassen I, II, III und IV. Nach Beendigung der Versuche werden schlieBlich von den einzelnen Kulturen die Frisch- und Trockengewichte der Wurzeln gra­vimetrisch bestimmt.

Tab. 1: GroBenklassen zur Charakterisierung der Wurzelsysteme. Versuchsbedingungen: Nahrmedium nach HElLER, IES 10-6 g/ml, Glukose 2 0/0.

(Mittelwerte aus 100 Einzelkulturen flir die Klassen I bis III und aus 50 Einzelkulturen fur die Klassen IV bis VI.)

GroBenklassen

Frischgewicht in mg Trockengewicht in mg 0/0 Trockensubstanz

GroBenklassen

Frischgewicht in mg Trockengewicht in mg 0/0 Trockensubstanz

5,4 ± 55 Ofo 0,39 ± 28 Ofo 9,4 ± 58 Ofo

IV

303 ± 28 Ofo 22,7 ± 21 Ofo

7,6 ± 13 Ofo

II III

27,3 ± 39 Ofo 72,8 ± 26 Ofo 2,1 ± 40 Ofo 5,3 ± 33 0/0

9,3 ± 60 Ofo 7,4 ± 31 Ofo

V VI

395 ±130f0 533 ± 14 Ofo 29,5 ± 18 Ofo 38,8 ± 12 Ofo

7,5 ± 16 Ofo 7,3 ± 150f0

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3. Histologische Untersuchung Zur histologischen Untersuchung werden Paraffinschnitte von den Geweben (Fixierung:

Pikrinsaure/FormollEisessig) mit Methylenblau und Rutheniumrot angefarbt, wodurch die verholzten Elemente (blau) und die Zelluloseanteile (rot) gut voneinander differenziert wer­den konnen.

4. Chemische Au/arbeitung

Da in den Wurzeln und in den Kallusgeweben von vorneherein nur ein geringer Gehalt an Cardenolidglykosiden zu erwarten war, haben wir die Gewebe von mehreren Versuchen vereinigt, urn iiber geniigend Ausgangsmaterial fiir die Analysen zu verfiigen. GroBere Ge­webemengen erzielten wir aber auch durch Verlangerung der Kultivierungszeiten. Da das Kallusgewebe reichlich Chlorophyll entMIt, Wurzelgewebe aber chlorophyllfrei ist, erfolgt eine etwas unterschiedliche Aufarbeitung zur Isolierung etwa vorhandener Glykoside. Beide Gewebearten werden zunachst lyophilisiert, die Proben anschlieBend gepulvert.

10 g Wurzelgewebe werden mit 200 g 70% igem Alkohol 15 Minuten lang unter Riick­fluBkiihlung extrahiert; man wiederholt die Extraktion mit 100 g 700f0igem Alkohol. Die vereinigten Extraktlosungen verdiinnt man zunachst durch Zugabe von 700 ml Wasser und mischt dann 100 g Bleiessig zu. Nach dem Abfiltrieren des Niederschlags wird das iiber­schiissige Bleiacetat durch FaJlung mit 300 ml einer frisch bereiteten 100f0igen Dinatriumhy­drogenphosphatlosung entfernt. Das Filtrat schiittelt man 5mal mit 200 ml Chloroform-Iso­propanol (3 + 2) aus und bringt die organischen Phasen nacheinander bei 40°C unter ver­mindertem Druck zur Trockene. 2,5 g Kallusgewebe werden wie oben beschrieben mit 50 g 700f0igem Alkohol extrahiert. Man filtriert und wascht mit etwa 50 ml Wasser nacho Das Filtrat wird mit Wasser auf 200 g verdiinnt. Nun schiittelt man zuerst 3mal mit je 45 ml Petrolather aus; die Petrolatherphasen werden verworfen. AnschlieBend wird die waBrig-al­koholische Phase 2mal mit je 50 ml Chloroform und 4mal mit je 50 ml Chloroform-Athanol (2 + 1) ausgeschiittelt. Die organischen Phasen werden der Reihe nach bei 40°C unter ver­mindertem Druck zur Trockene eingedampft.

Die erhaltenen Eindampfriickstande nimmt man mit Chloroform-Methanol (1 + 1) auf, so daB etwa 2- bis 50/oige Losungen erhalten werden. Von diesen Losungen verwenden wir 5-100 ./11 flir die papierchromatographische Auftrennung. Arbeitsbedingungen: Papier Schleicher u. Schiill, 2043 b MgI, impragniert mit Formamid, FlieBmittel: a) Chloroform­Tetrahydrofuran-Formamid (50 + 50 + 6,5), b) Xylol-Methylathylketon (1 + 1) formamid­gesattigt; Laufstrecke (absteigend) ca. 30 cm. Vergleichssubstanzen: Digitoxin, Gitoxin, Strospesid, Purpureaglykosid A, Purpureaglykosid B, Glucoevatromonosid, Glucoverodoxin, Digitalinum verum. Nach dem Trocknen der Papierchromatogramme (1 Stunde bei 120°C) werden die Glykoside mit folgenden Reagenzien sichtbar gemacht: Trichloressigsaure-Chlo­ramin nach JENSEN (1953); Antimonchlorid nach LAWDAY (1952); Xanthydrolreagens nach GRIMMER und Mitarb. (1960); Reagens nach KEDDE (1947). Bei dem zuletzt genannten Rea­gens ist bei der Interpretation entsprechende Vorsicht am Platze, da die in den Kallusgewe­ben gebildeten Anthrachinonderivate eben falls rote oder rotviolette Farbungen ergeben. Glykosidzonen, die unsicher zu beurteilen waren, haben wir aus unbespriihten Chromato­grammen ausgeschnitten, mit Methanol e1uiert und nochmals chromatographiert. In solchen Fallen war dann stets eine eindeutige Aussage moglich.

Ergebnisse

1. Wachstumsversuche

Die ersten Anzeichen beginnender Kallus- und Wurzelbildung treten an den Blattexplantaten bereits kurz nach dem Ansetzen cler Kulturen in Erscheinung: An

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den SchnittfEichen der basalen Seite der Blattexplantate (vgl. Methode unter Punkt 1) ist eine diinne Kallusschicht ausgebildet, die besonders deutlich an den Leitbiin­deln zu erkennen ist. In der Nahe des Hauptnervenstranges, wiederum an den ba­salen Seiten der Explantate, sind vereinzelt winzige Wurzeln, meist bereits auffal­lend behaart, zu sehen. 1m Verlauf der Kultivierungsperiode vergroBert sich all­mahlich das Kallusgewebe an den SchnittfHichen und die Wurzeln entwickeln ein stattliches Wurzelsystem (Abb. 1 a - e). Durch Verdickung der Hauptwurzeln und Ausbildung immer neuer Seitenwurzeln nimmt die gesamte Wurzel masse stetig zu, wah rend die Zahl der direkt aus den Blatt- oder Kallusgeweben entspringenden Wurzeln nur gering ansteigt. Der Entstehungsort der Gewebeneubildungen befindet sich auch nach langerer Kultivierungszeit in erster Linie an den basalen Teilen der Blattexplantate. Nur selten treten iiberhaupt Wurzel- und Kallusdifferenzierungen auch an der apikalen Seite der Blattfragmente auf. Bei der Entwicklung der Wur­zeIn kann man jede Art von Geotropismus (positiv, negativ und neutral) beobach­ten; da die besonders zu Beginn der Kultur rasch wachsenden Wurzeln sich in dem engen KulturgefaB in dem freien Luftraum oberhalb der eingesetzten Explantate am ehesten ausbreiten konnen (Abb. 1 a - d).

RegelmaBig durchgefiihrte optische Klassifizierungen in 6- bis 14digigen Interval­len erlauben es, den zeitlichen Entwicklungsverlauf der Wurzelsysteme zu verfolgen (Abb. 2); bei einer Reihe von Explantaten setzt die Wurzeldifferenzierung bereits

Fig. 1: Callus and root differentiation on Digitalis leaf explants; cultivation period 5 months. - a) and b) IAA 10-6 g/m!. In both cultures leaf tissue and callus formations are hidden by the strongly developed root system. - c) IAA 10-6 g/m!. Here the callus and leaf tissues are still clearly visible between the coarse network of the roots. - d) IAA 10-4

g/m!. Inhibition of the root formation by an overdose of a growth stimulator; instead of a strongly developed root system only a few thin roots can be seen. - e) IAA 10-5 g/m!' Callus tissues with roots on the basal side of the leaf explants (X 6).

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Fig. 2: Growth curves characteristic of the development of root formation up to 65 days of cultivation, expressed in mg root tissue/culture. Medium: Heller + 10-6 g/ml IAA + 2 per cent glucose. Fresh weight = closed symbols, dry weight = open symbols; '" 6.: ex­plants from small leaves of young plants cultured in sterile environment, .0: explants of medium sized leaves.

in den ersten sechs Tagen ein. Acht Tage spater haben aile Explantate Wurzeln ge­bildet, die am zwanzigsten Versuchstag bereits ein beachtliches AusmaB erreicht ha­ben. Die Kultivierung laBt sich tiber ftinf Monate hinaus ausdehnen. Bis zum Ende des zweiten Versuchsmonats ist eine fortschreitende VergroBerung der Wurzelsyste­me zu beobachten, wobei die zur Kontrolle durchgefilhrten Gewichtsbestimmungen gute Obereinstimmung mit den geschatzten Werten aufweisen. Spater laBt sich die Gewichtszunahme optisch nicht mehr exakt erfassen; die Gewichte der frischen und der getrockneten Wurzeln liegen am Versuchsende wesentlich hoher, als auf Grund der optischen Klassifizierung zu erwarten ware. Das Versagen der optischen Beur­teilungsmethode in vorgeschrittenen Kultivierungsstadien kann man wohl so erkla­ren, daB nach zweimonatiger Kultur die Gewichtszunahme in erster Linie auf Ver­dickung der bereits gebildeten Wurzeln beruht, wobei nicht nur das Rindenparen­chym, sondern auch der gewichtsmaBig bedeutendere, zum Teil bereits verholzte Zentralzylinder stark zunimmt (Abb. 4 c). Die zur Charakterisierung des Entwick­lungsverlaufes der Wurzelbildung bis zu einem Zeitraum von 60 Tagen aufgestell­ten Kurven (Abb. 2) zeigen sowohl im Frischgewicht als auch im Trockengewicht

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deutlich das Auftreten von zwei Wachstumsphasen: Die Blattexplantate aus voll ausgebildeten BEittern beenden die stark ansteigende initiale Wachstumsphase frti­her und entwickeln in derselben Kultivierungsperiode groBere Gewebemengen als die Explantate der kleinen Blattchen .

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Fig. 3: Root formation under the influence of different IAA concentrations evaluated in mg root tissue/culture. Fresh weight = closed symbols, dry weight = open symbols; .0: 10-7 g/ml IAA; • 6: 10-6 g/ml IAA;. 0: 10-5 g/ml IAA; ~ \I: 10-4 g/ml IAA.

Abb. 3 zeigt die Wirkung steigender IES-Konzentrationen auf die Wurzeldiffe­renzierung iiber einen Zeitraum von 30 Tagen bis zu 5 Monaten. Auch hier werden zur Beurteilung sowohl die Frisch- als auch die Trockengewichte herangezogen, wo­bei sich die Ergebnisse der optischen und der gravimetrischen Methode gut ergan­zen. Die ftir eine ausgepragte Wurzeldifferenzierung notwendige Aktivitat erhalten die Zellen erst durch 10-7 IES; 10-8 g/ml IES reichen ftir eine, bei allen Kulturen einsetzende Wurzelbildung noch nicht aus, weshalb die Ergebnisse in Abb. 3 nicht angefiihrt sind. Bei Erhohung der IES-Konzentration auf 10-6 g/ml nimmt das Wurzelwachstum zu und erreicht bei 10-5 g/ml IES das Optimum. 10-4 g/ml IES fiihren jedoch zu einer eindeutigen Hemmung der Wurzeldifferenzierung. Die Be­ziehung zwischen Dosis und Wirkung bleibt ftir die gesamte Versuchsdauer erhal­ten. Zu beach ten ist allerdings, daB sich die Kulturen unter dem EinfluB von 10-7

und 10-4 g/ml IES nach 30 Tagen noch in der initialen Wachstumsphase befinden, wahrend unter dem EinfluB von 10-6 und 10-5 g/ml IES diese Phase nach 30 Ta-

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gen bereits iiberschritten ist; vermutlich setzt bei der niedrigsten und der hochsten IES-Konzentration die Teilungsaktivitat spater als bei den optimalen Konzentratio­nen ein. Eine iiber die ganze Versuchsdauer registrierte und in Abb. 3 dargestellte Anderung des Wachstums zeigt, da~ die Kurven facherartig auseinanderstreben; un­ter dem Einflu~ von 10-6 und 10-5 g/ml IES ist das Wurzelwachstum auch in der zweiten phase starker gefordert als unter dem Einflu~ von 10-7 und 10-4 g/ml IES. Da bei jeder Beobachtungszeit die Dosiswirkungsbeziehung ahnlich ist, werden die an sich relativ geringen Unterschiede der Wurzelgewichte zwischen den verschiede­nen IES-Konzentrationen starker betont.

Die Kallusbildung erfahrt durch Erhohung der IES Konzentrationen nur eine ge­ringe Stimulation. Der Anteil der Kallusgewebe an der gesamten Gewebeneupro­duktion betragt nie mehr als 11 bis 14 Ofo.

Wahrend die Versuche mit IES recht gute Zusammenhange zwischen Konzentra­tion und Wurzeldifferenzierung erkennen lassen, ist dies bei Zusatz verschiedener Zuckerkonzentrationen nicht der Fall; durch 1 bis 4 010 Glukose oder Saccharose, werden an den Blattexplantaten Wurzelbildungen induziert, wah rend au~erhalb dieses Konzentrationsbereiches iiberhaupt keine Wurzeln entstehen. 50/oige Losungen beider Zucker bewirken haufig Nekrosen, die zu einem raschen Absterben der Ex­plantate fiihren. In Tabelle 2 sind die Frisch- und Trockengewichte der nach einer Kultivierungsdauer von 5 Monaten unter dem Einflu~ steigender Glukosekonzen­trationen gebildeten Wurzeln dargestellt. Eine optima Ie Zuckerkonzentration la~t sich nicht herausfinden: Die zwischen den einzelnen Versuchsserien erhaltenen Ge­wichtsunterschiede sind recht gering und eine eindeutige Abhangigkeit von den Zuckerkonzentrationen ist nicht feststellbar.

Tab. 2: Wirkung von Glukose auf die Wurzelbildung bei Digitalis purpurea: Produktion der Wurzelmasse in mg/per Kultur. Medium: Heller + IES 1O-6g/ ml, Kultivierungsdauer 5 Monate.

°/0 Glukose Trockengewicht Frischgewicht °/0 Trocken-mg/Kultur mg/Kultur substanz

0 1 °/0 77,6 ± 20 °/0 1014 ± 20 °/0 7,7 ± 18 0/0 2 01o 72,9 ± 22 °/0 1035 ± 31 % 7,4 ± 19 % 4% 83,4 ± 28 % 1201 ± 26 % 7,2 ± 13 % 5%

2. Histologische Untersuchungen

Die Induktion der Gewebeneubildungen geht von den Gefa~biindelpartien der basalen Seite knapp unterhalb der Schnittflache aus. Dies wird auch bei alteren Blattexplantaten deutlich, bei denen reichlich meristematische Bildungszonen zwi­schen den Leitstrangen in den Gefa~biindeln an der Blattbasis eingelagert sind. Bei

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den histologischen Schnitten des Kallusgewebes fallen besonders Anhaufungen von Leitelementen auf, die von meristematischen Zellschichten in Art eines Kambiums umhiillt sind und in hohem Ausma6 am gesamten Aufbau des harten Kallusgewebes beteiligt sind. 1m Querschnitt gleichen diese Anhaufungen verschieden gestalteter,

Fig. 4: Callus and root differentiations. Medium: Heller + 10-5 glml IAA + 2 per cent glucose; duration of cultivation 5 months. - a) and b) Callus cross-sections: in the parenchyme vascular formation centres and a vascular bundle are to be observed (a) X 20, b) X50). - c) Part of a root cross-section: central cylinder and root parenchyme are clear­ly delineated (X 100).

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oft bereits verholzter Tracheiden mit ihren Umhiillungen aus meristematischen Zell­schichten, Nestern von unterschiedlicher Gro6e, die im Parenchym ganz unregelma­mg verstreut sind (Abb. 4 a u. b). Chloroplasten sind nur in den au6ersten Kallus­schichten zu beobachten. Die Wurzelquerschnitte zeigen je nach Dicke entweder einen Zentralzylinder oder nur einige zentral verlaufende Leitstrange, immer von einem Rindenparenchym umgeben. Zentralzylinder und Wurzelparenchym sind je nach Wurzeldicke verschieden stark entwickelt, am Aufbau der Wurzeln sind je­doch beide Anteile ziemlich gleichma6ig vertreten (Abb. 4 e). 1m Gegensatz zu den Kallusgeweben treten in den Rindenparenchymzellen der Wurzeln keine Chloropla­sten auf.

3. Chemische Untersuchungen

Nach den in Abschnitt 4 geschilderten Methoden wurden die Gewebe auf den Gehalt an Cardenolidglykosiden gepriift. Dabei ergab sich erwartungsgema6 ein hoher Gehalt im Ausgangsblattgewebe, wahrend das neu gebildete Wurzelgewebe nur wenig herzwirksame Glykoside enthalt, allerdings in ahnlicher Zusammenset­zung wie in den Wurzeln der Ausgangspflanze (Abb. 5). Nur sehr geringe Mengen an Cardenolidglykosiden findet man im Kallus, wobei Glucoevatromonosid und Di­gitalinum verum zu etwa 10 mg pro 100 g Trockengewebe, andere Glykoside in noch geringeren Mengen enthalten sind (Abb. 5).

Erwahnenswert ist das Vorkommen von Anthrachinonderivaten, sowohl im Kal­lus, als auch im Wurzelgewebe.

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Fig. 5: Survey of the cardenolide-glycoside content in the tissues of the initial plant and of the tissue cultures. The figures indicate the glycoside content in mg per 100 g dry tissue. Abbreviations: Dtx = digitoxine, Gtx = gitoxine, Str = strospeside, PA = purpureagly­cos ide A, PB = purpureaglycoside B. GGtl = glucogitaloxine, Gev = glucoevatromonosi­de, Gdv = glucoverodoxine, DYe = digitalinum verum.

Diskussion

An Blattexplantaten von Digitalis purpurea wurde der EinfluB von IES und Zuckern auf Induktion und Entwicklung von Kallus- und Wurzeldifferenzierungen untersucht und die gewonnenen Wurzel- und Kallusgewebe auf ihren Glykosidge­halt gepriift. Die W urzelgewichte wurden wahrend des Versuchs auf Grund einer optischen Bewertung festgestellt; Einzelgewichtsbestimmungen konnten gravime­trisch von den Kulturen erst am Versuchsende durchgefiihrt werden. Die Ergebnisse

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der optischen und der gravimetrischen Methode erganzen einander in befriedigen­der Weise.

Die Resultate wei sen auf eine wesentliche Beteiligung sowohl der Auxine als auch der Zucker an Induktion und Wachstum der Wurzel- und Kallusdifferenzierungen bei in vitro kultivierten Digitalis purpurea-Blattgeweben hin, wie GAUTHERET be­reits an Rhizomgeweben von Topinambur beschrieben hat (1965, 1966, 1969)~ Urn entsprechende Wurzel- und Kallusbildungen auszulosen sind Mindestkonzentratio­nen beider Substanzklassen erforderlich, die in unseren Versuchen bei 10-7 g/ml IES und 1 % Zucker liegen. Erhohung der IES-Konzentration bis auf 10-5 g/ml wird von den Explantaten mit zunehmender Stimulation, der weitere Anstieg auf 10-4 g/ml mit deutlicher Hemmung der Wurzelbildung beantwortet. Ein ahnliches Verhalten, aber in viel geringerem AusmaB, laBt sich bei der Kallusbildung erken­nen. Als Ursache fiir die nicht vollstandige Dbereinstimmung der Dosiswirkungsbe­ziehungen mit den Ergebnissen von GAUTHERET sind die Unterschiede in den iibri­gen Versuchsbedingungen anzusehen. Die stimulierende IES-Wirkung auf das Wur­zelwachstum kann sich, wie STREET (1966) zeigte, auch in einer vermehrten Bildung von Seitenwurzeln auBern. Bei den Digitalis-Blattgeweben diirfte diese Art IES Sti­mulation zur Ausbildung des stark verzweigten Wurzelsystems gefiihrt haben.

Unter dem EinfluB steigender Zuckerkonzentrationen erfolgt keine zunehmende Wachstumsstimulation der Wurzeln bis zu einem Optimum und bei weiterer Steige­rung Wachstumshemmung. Diese Ergebnisse stehen nicht im Einklang mit den Be­funden von GAUTHERET und anderen Autoren, die bei Topinambur neben einer fiir die Wurzelbildung optimalen Auxin-Konzentration auch eine optimale Zuckerkon­zentration feststellen konnten (GAUTHERET, 1966, 1969; LOVELL et aI., 1971).

Das Vorhandensein einer longitudinalen Polaritat, bei Regenerationsversuchen an Wurzel- und Blattgeweben schon mehrfach beobachtet (GAUTHERET, 1959 a; HEss, 1974; MOHR, 1971 b), konnten wir auch in unserer Versuchsanordnung feststellen: Wurzel- und Kallusdifferenzierungen bleiben bei den Fragmenten auf die der Blattbasis zugekehrten Seite beschrankt, wobei die Teilungsaktivitat in den Leitbiin­deln zuerst einsetzt. Die auffallende Behaarung, die in den ersten Kultivierungswo­chen bei allen Wurzeln, nach langerer Kultivierung immer noch bei einem GroBteil der Wurzeln zu beobachten ist, diirfte auf die hohe Luftfeuchtigkeit in den Kultur­gefaBen zuriickzufiihren sein. Auch bei Keimpflanzchen, die auf optimal befeuchte­ten Substraten wachsen, laBt sich eine starke Behaarung iiber die ganze Wurzellan­ge fest stell en (HACCIUS und TROLL, 1961).

1m Innern der reichlich im Kallus vert ret en en und gegen das Parenchym hin deutlich abgegrenzten meristematischen Zonen, die bei Gewebeneubildungen in vitro hliufig beobachtet werden (GAUTHERET, 1959 b), fallen besonders Differenzie­rungen von Tracheiden auf. Es ist anzunehmen, daB die neu entstandenen Kambien neben den auffalligen Xylemanteilen auch Phloemzellen differenzieren, die aber nicht besonders in Erscheinung treten. Der EinfluB von Zucker und IES auf die Bildung liberovascullirer Zentren ist bei verschiedenen Pflanzenarten untersucht

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worden (HALPERIN, 1969). Bei allen unseren Versuchen waren diese Zonen am Ge­samtaufbau der Kallusgewebe in reichem MaBe vertreten; eine Knderung durch steigende Zucker- oder IES-Konzentrationen lieB sich nicht feststellen.

Die gegenliber der Ausgangspflanze beobachtete erhebliche Verminderung der Glykosidbildung in den Digitalis-Kallusgeweben konnte auch bei anderen Pflanzen in bezug auf verschiedene Sekundarstoffe festgestellt werden und bildet Gegenstand vieler Diskussionen (REINHARD, 1967; TEUSCHER, 1973).

Die neu gebildeten Wurzelsysteme enthalten Cardenolidglykoside, die auffallen­derweise eine ahnliche Zusammensetzung zeigen, wie man sie im Samen (KAISER, 1967) und Keimblattern (WICHTL, 1972) beobachten kann. Khnlich war auch die Zusammensetzung der Glykoside in den in vitro an den Blattexplantaten gebildeten Wurzeln und in jenen von der Ausgangspflanze.

Anthrachinonderivate, die sowohl im Kallus als auch im Wurzelgewebe reichlich vorhanden sind, wurden aus Kallusgewebe bereits isoliert (FURUYA et aI., 1971, 1972).

Frau BRIGITTE GRAUWALD und Herrn JULIUS MARKOTAI sei fiir die Sorgfalt bei der Durchfuhrung der Versuche gedankt. Herrn Ing. WERNER DIETRICH von der Firma TONKO dank en wir fiir seine Hilfe bei der Einrichtung der automatischen Datenerfassung und Ver­arbeitung. Die finanziellen Zuwendungen des Fonds zur Forderung der wissenschaftlichen Forschung und der tlsterreichischen Nationalbank waren fur die vorliegende Arbeit eine wertvolle Unterstutzung. Der tlsterreichischen Studiengesellschaft fur Atomenergie sei fiir die Nutzungsmoglichkeit einzelner Einrichtungen des Instituts fiir Landwirtschaft gedankt.

Literatur

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