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Versuchsprotokoll 4.2. 30.08.- 03.09.2004 Klonierung eines amplifizierten PCR-Fragments

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0 Inhaltsverzeichnis 0 Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................- 1 - 1 Einleitung ..............................................................................................................................- 2 - 2 Versuch..................................................................................................................................- 2 -

2.1 Versuchsteil 4.2.3.-4.2.4. (PCR und Gel der cDNA)....................................................- 2 - 2.1.1 Einleitung .............................................................................................................- 2 - 2.1.2 Durchführung .......................................................................................................- 2 - 2.1.3 Auswertung ..........................................................................................................- 3 -

2.2 Versuchsteil 4.2.5 (Gel des Plasmids) ..........................................................................- 3 - 2.2.1 Einleitung .............................................................................................................- 3 - 2.2.2 Durchführung .......................................................................................................- 3 - 2.2.3 Auswertung ..........................................................................................................- 4 -

2.3 Versuchsteil 4.2.6 – 4.2.8. und 4.2.10. (Extraktion aus Gel und Gel der Restriktion) .- 4 - 2.3.1 Einleitung .............................................................................................................- 4 - 2.3.2 Durchführung .......................................................................................................- 5 - 2.3.3 Auswertung ..........................................................................................................- 5 -

2.4 Versuchsteil 4.2.11. und 4.2.14. (Hi-Bind Säule, Konzentrationsverhältnis) ...............- 6 - 2.4.1 Einleitung .............................................................................................................- 6 - 2.4.2 Durchführung .......................................................................................................- 6 - 2.4.3 Auswertung ..........................................................................................................- 6 -

2.5 Versuchsteil 4.2.15 (Ligation) ......................................................................................- 7 - 2.5.1 Einleitung .............................................................................................................- 7 - 2.5.2 Durchführung .......................................................................................................- 7 - 2.5.3 Auswertung ..........................................................................................................- 7 -

2.6 Versuchsteil 4.2.12, 4.2.13., 4.2.16. und 4.2.17. (Herstellung der Bakterienkolonien) - 8 - 2.6.1 Einführung ...........................................................................................................- 8 - 2.6.2 Durchführung .......................................................................................................- 8 - 2.6.3 Auswertung ..........................................................................................................- 8 -

2.7 Versuchsteil 4.2.18. (PCR der weißen Kolonien).........................................................- 9 - 2.7.1 Einleitung .............................................................................................................- 9 - 2.7.2 Durchführung .......................................................................................................- 9 - 2.7.3 Auswertung ........................................................................................................- 10 -

2.8 Versuchsteil 4.2.19., 4.2.20., 4.2.21 (DNA-Minipräps, Konzentration d. Plasmid) ...- 10 - 2.8.1 Einleitung ...........................................................................................................- 10 - 2.8.2 Durchführung .....................................................................................................- 11 - 2.8.3 Auswertung ........................................................................................................- 11 -

2.9 Versuchsteil 4.2.22. (Analytisches Gel Minipräp)......................................................- 12 - 2.9.1 Einleitung ...........................................................................................................- 12 - 2.9.2 Durchführung .....................................................................................................- 12 - 2.9.3 Auswertung ........................................................................................................- 12 -

2.10 Versuchsteil 4.2.23. (Restriktion der weißen Kolonie)...............................................- 13 - 2.10.1 Einleitung ...........................................................................................................- 13 - 2.10.2 Durchführung .....................................................................................................- 13 - 2.10.3 Auswertung ........................................................................................................- 13 -

2.11 Versuchsteil 4.2.24. (Orientierungsbestimmung durch PCR).....................................- 14 - 2.11.1 Einleitung ...........................................................................................................- 14 - 2.11.2 Durchführung .....................................................................................................- 14 - 2.11.3 Auswertung ........................................................................................................- 14 -

3 Diskussion ...........................................................................................................................- 16 -


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1 Einleitung Ziel des vorliegenden Versuchs ist es, eine amplifizierte cDNA-Sequenz in kompetente Zellen zu

klonieren.

Die Vorgehensweise sei nun nachfolgend kurz skizziert:

Eine gp80 cDNA-Sequenz wird durch eine PCR amplifiziert, an ihren Schnittstellen durch das

Restriktionsenzym Pst I geschnitten und dann in das Plasmid pUC19 einkloniert.

Das Plasmid mit Insert wird dann in zuvor kompetent gemachte Zellen (E. coli xl1Blue)

transformiert und somit kloniert.

Durch eine nachfolgende Lyse der Zellen wird das neue Plasmid aufgereinigt und die Orientierung

des Inserts festgestellt.

Im nun folgenden Kapitel „Versuch“ ist die detaillierte Vorgehensweise aufgezeigt und die daraus

resultierenden Teilschritte mit Ergebnissen und Diskussionen dargestellt.

2 Versuch

2.1 Versuchsteil 4.2.3.-4.2.4. (PCR und Gel der cDNA)

2.1.1 Einleitung In diesem Versuchsteil wird die cDNA vervielfältigt (amplifiziert) und dann auf ein Gel

aufgetragen, um ihre Existenz zu beweisen und die Reinheit zu gewährleisten. Ob es sich um

das gesuchte DNA-Stück handelt, kann man an der Größe feststellen, die man anhand des

aufgetragenen Standarts VII ungefähr abschätzen kann.

2.1.2 Durchführung Die Durchführung des Versuchsteils wird wie im Skript Seite 88-90 vorgenommen.

Pipettieransatz:

25µl Hot Start Mix (dNTPs, Puffer, Taq-Polymerase, Magnesium)

2µl Clus-Hund-F (Forward-Primer)

2µl Clus-Hund-R2 (Reverse-Primer bei 1125bp bis 1138bp)

2µl cDNA (20ng)

19µl Wasser

50µl Endvolumen

Zum Auftragen des PCR-Produkts werden

5µl PCR-Produkt

5µl Wasser

2µl Autragspuffer 6fach (im Folgenden immer nur AP genannt) aufgetragen.


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2.1.3 Auswertung Das amplifzierte DNA-Stück ist 785bp lang.

Beim nachfolgenden Gelbild sind der Standart VII und der Standart XIV in Geltasche 6 bzw.

13 aufgetragen.

Abb. 1: Gel v. PCR der cDNA

In der Spur 1 ist keine Bande zu erkennen. Dort hat die PCR der cDNA nicht funktioniert.

Auf Spur 5 ist die Bande nicht so kräftig wie bei den anderen Banden. Hier wurde eine

geringere Menge PCR-Produkt aufgetragen. Ist weniger DNA aufgetragen, kann sich auch

weniger Ethidiumbromid in die Furchen der DNA einlagern. Somit ist auch die Strahlung

unter der UV-Lampe geringer.

Die unterschiedlichen Höhen der restlichen Banden sind auf die Benutzung der 2

verschiedenen Reverse-Primer bei der PCR zurückzuführen. Bei Benutztung des Clus-Hund

R ist das DNA-Fragment einige Basenpaare kleiner und läuft aus physikalischen Gründen

weiter als das größere DNA-Fragment, was durch die Benutzung des Clus-Hund R2

entstanden ist.

Vergleicht man die Proben mit den zwei Standarts und mit der berechneten Basenlänge, so

kann man sagen, dass es sich hier wirklich um das gewollte DNA-Stück handelt.

2.2 Versuchsteil 4.2.5 (Gel des Plasmids)

2.2.1 Einleitung In Versuchsteil 4.2.5. wird auf das Gel die Restriktionslösung des Plasmids (Vektors)

aufgetragen. Auch dieser Schritt dient dazu eine Verunreinigung mit nicht verdautem Vektor

zu vermeiden.

2.2.2 Durchführung Die Durchführung wird, wie im Skript auf Seite 90 beschrieben, vorgenommen.

10µl Restriktionsansatz (verdauter Vektor)


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2µl AP (6-fach)

12µl Endvolumen

2.2.3 Auswertung

Abb. 2: Gel des restringierten Vektors

Auf dem Gelbild kann man auf der Spur 7 den Standart VII erkennen. Die Spur 1 wurde

freigelassen. Alle anderen Banden sind gleich weit gelaufen. Vergleicht man nun die Banden

mit dem Standart VII, kann man feststellen, daß die Größe des Vektors, welche man anhand

des Gels ablesen kann, mit der bekannten Größe von 2,69kb übereinstimmt. Es handelt sich

somit, um den gewollten Vektor. Bei Bande 6 wurde ein ungeschnittenes Plasmid zur

Kontrolle aufgetragen. Die Konzentration war jedoch zu gering gewählt, dass man die Bande

nicht sehen kann.

2.3 Versuchsteil 4.2.6 – 4.2.8. und 4.2.10. (Extraktion aus Gel und Gel der Restriktion)

2.3.1 Einleitung Die in den vorherigen Versuchsteilen durchgeführten Gel-Elektrophoresen haben für die

Aufreinigung des DNA-Fragment und des Vektors (Plasmids) gedient.

Die so aufgereinigten Substanzen müssen nun aus dem Gel ausgelöst werden, um

miteinander legiert werden zu können. Das Herauslösen des Inserts und des Plasmids

erfolgen durch die sogenannte HiBind-Säule.

Nun erfolgt unter Versuchsteil 4.2.8. die Restriktion des DNA-Fragments an den

Schnittstellen PstI.

Nach der Restriktion wird unter Versuchsteil 4.2.10. eine erneute Gelelektrophorese

durchgeführt, um das geschnittene DNA-Fragement (ab nun als Insert bezeichnet) von dem

ungeschnittenen DNA-Fragmenten zu trennen.


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2.3.2 Durchführung Zur Entfernung der Agarose wird ein Bindepuffer hinzugegeben. Die Menge des

Bindepuffers wird über das Gewicht des herausgeschnittenen Gelstücks bestimmt.

Das Gelstück wiegt 119,8mg. Somit muss

100mg = 400µl

120mg = 480µl hinzugegeben werden.

Für den Restriktionsansatz ist folgendes Pipettierschema angewendet worden:

26µl DNA-Fragment

5µl Puffer H (10-fach)

18µl Wasser

1µl Restriktionsenzym PstI

50µl Endvolumen

Die erneute Gelelektrophorese wird mit dem geschnittenen Insert, dem Standart XIV und den

ungeschnittenen DNA-Fragmenten (Fragment mit Reverse-Primer R und Reverse-Primer

R2) durchgeführt.

Die restlichen Schritte können im Skript auf den Seiten 91-93 nachvollzogen werden.

2.3.3 Auswertung Das nachfolgende Gel enthält bei Bande 4 das ungeschnittenen DNA-Fragment „Reverse-

Primer R“, bei Bande 5 den Standart XIV, bei Bande 6 das ungeschnittene DNA-Fragment

„Reverse-Primer R2“ und bei Bande 1 meine Probe.

Abb. 3: Gel des geschnittenen

Inserts

Nur bei den Spuren 1 und 3 ist ein klarer Unterschied zwischen ungeschnittenem DNA-

Fragment und dem Insert zu erkennen. Die unterschiedlichen Höhen der beiden oberen


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Banden von Spur 1 und 3 kommen durch den unterschiedlichen PCR-Primer zustande (siehe

Versuchsteil 4.2.4.).

Die beiden unteren Banden entsprechen dem geschnittenen Insert. Vergleicht man die

Banden mit dem Standart kann man feststellen, dass auch die Größe auf das Vorhandensein

des Insert spricht.

Auf Spur 9 kann man keine Bande feststellen. Hier hat die PCR der DNA erst gar nicht

funktioniert. (Hier sei vermerkt, dass auch das PCR-Gel keine Bande gezeigt hat.)

2.4 Versuchsteil 4.2.11. und 4.2.14. (Hi-Bind Säule, Konzentrationsverhältnis)

2.4.1 Einleitung Auch hier wird das geschnittene Insert per HiBind-Säule aus dem Gel extrahiert. Bei Versuchsteil

4.2.14. wird eine Gelelektrophorese gemacht, um das Konzentrationsverhältnis zwischen Insert und

Vektor zu bestimmen, damit man für die Ligation die geeigneten Stoffmengen einsetzen kann.

(4.2.15.)

2.4.2 Durchführung Die Extraktion wird wie unter 2.4. durchgeführt. Anleitung bitte Skript Seite 93 entnehmen.

Das nun extrahierte und geschnittene Insert wird zusammen mit dem Vektor zur

Konzentrationsbestimmung in gleicher Menge nebeneinander auf das Gel aufgetragen.

Pipettierschema:

3µl Vektor bzw. Insert

7µl Wasser

2µl AP (6-fach)

12µl Endvolumen

2.4.3 Auswertung Das nachfolgende Gel zeigt das Ergebnis:

Abb. 4: Gel zur Bestimmung des

Konzentrationsverhältnisses zwischen Insert

und Vektor

2

1


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Die Helligkeit der Banden zeigt die Konzentration an.

Allerdings ist dabei zu berücksichtigen, dass der Vektor ungefähr 4mal so groß ist wie das Insert.

Somit entspricht die gleiche Helligkeit der beiden Banden einem Konzentrationsunterschied von

4:1 (Insert : Vektor). Da man bei der Ligation jedoch genau dieses Verhältnis einsetzen soll, ist

eine gleiche Helligkeit arbeitserleichternd.

Betrachtet man das Gel so kann man bei Spur 9 und 10 (Pfeil 1 und 2) genau die gleiche Helligkeit

feststellen. Die Spur 9 entspricht dem Insert, die Spur 10 dem Vektor. Die ungefähren Größen, die

man am Standart XIV ablesen kann, entsprechen den bekannten bzw. errechneten Größen des

Inserts bzw. des Vektors.

Somit ist die Stoffmenge für die Ligation bestimmt. Nachfolgende Rechnung macht dies noch

einmal deutlich:

Vektor (ca. 2,69kb) und Insert (ca. 650bp) gleiche Helligkeit der Banden. Konzentration bei der

Ligation soll wenigstens im Bezug auf das Insert 3-fach sein.

Vektor ist ca. 4mal so groß. Also nimmt man die gleiche Menge und hat somit ein Verhältnis von

ca. 4:1.

2.5 Versuchsteil 4.2.15 (Ligation)

2.5.1 Einleitung Bei der nachfolgenden Ligation werden Insert und Vektor „vereinigt“. Dies kann nur deswegen

geschehen, weil beide mit dem gleichen Restriktionsenzym PstI geschnitten wurden. Somit

besitzen sie die gleichen sticky ends (überhängende Enden, die die Ligation vereinfachen) und

werden somit ligiert.

2.5.2 Durchführung Die Durchführung wird wie im Skript auf Seite 95 durchgeführt. Das Pipettierschema sieht wie

folgt aus:

10µl Plasmid

10µl Insert

2,3µl Ligationspuffer (10-fach)

1µl Ligase

23,3µl Endvolumen

2.5.3 Auswertung 1bp entspricht 660g/mol


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642bp * 660g/mol = 433.720g/mol

2690bp *660g/mol = 1.775.400g/mol

Die Größe des Vektors ist ca. 4mal so groß.

Insertlänge = 642bp,

Vektorlänge = 2690bp = 3332bp (Länge des puc19 mit Insert)

2.6 Versuchsteil 4.2.12, 4.2.13., 4.2.16. und 4.2.17. (Herstellung der Bakterienkolonien)

2.6.1 Einführung Die Bakterien E.coli xl1Blue wurden über Nacht in Overnight-Röhrchen in LB-Medium vermehrt.

Aus diesem entstandenen Medium wird dann 1ml entnommen und in einem neuen LB-Medium

gezüchtet, bis der OD600-Wert zwischen 0,5 und 0,7 liegt. Bei diesen Werten ist die Bakterienkultur

im besten logarithmischen Wachsen und am geeignesten für die Transformation (4.2.17.). Die

Transformation des Vektors mit dem Insert in die Bakterienzelle erfolgt durch Calciumchlorid. Die

Bakterien werden mit dem Ligationsansatz leicht gemischt und durch die entstandene Permeabilität

der Membran durch das Calciumchlorid gelangt das Plasmid mit Insert in die Zellen. Zusätzlich

wird auch eine Positivkontrolle durchgeführt.

Die genaue Vorgehensweise findet man im Skript auf den Seiten 93, 94 und 96.

2.6.2 Durchführung Die Durchführung geschieht laut Skript Seite 93, 94 und 96.

Bei Versuchsteil 4.2.16. werden 2mal 100µl in CaCl2 aufgenommen und in ein Greinerröhrchen

überführt.

Im Versuchsteil 4.2.17 wird folgendermaßen vorgegangen:

Von der Bakterienkultur mit dem OD600-Wert von 0,5 bis 0,7 werden 2mal 1,5ml in Eppis gegeben

und bei 4000rpm 2 Minuten zentrifugiert. Das Pellet entspricht den Bakterien mit dem neuen

Plasmid.

Von dem Ligationsansatz werden 100µl ausplattiert, von der Positivkontrolle (Nummer 3) 90µl

und von einer 1:10 verdünnten Positivkontrolle ebenfalls 100µl auf eine Agarplatte mit LB-

Medium und Ampicillin ausplattiert.

2.6.3 Auswertung Ligationansatz: gewachsen (blaue und weiße Kolonien)

Positivkontrolle: nicht gewachsen

Positivkontrolle (verdünnt): nicht gewachsen

Religation: gewachsen


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Übersicht der gesamten Versuchsgruppe:

Was? Gewachsen Nicht gewachsen

Religation 3 0

Ligation 7 1

Positivkontrolle Nummer 1 2 3



Dass die Kontrollen nicht bzw. nur schlecht gewachsen sind, kann nur auf das nicht Vorhandensein

eines Plasmids und somit einer Ampicillinresistenz beruhen.

Dies erklärt auch das Wachsen des Ligationsansatzes und der Religation, die beide diese Resistenz

besitzen.

Warum weisen manche Kolonien eine blaue bzw. keine Färbung auf?

Wurde bei der Ligation nur eine Religation vollzogen, also kein Insert eingebaut, so ist das lacZ-

Gen intakt. Dieses kodiert für die ß-Galactosidase, die das auf den Platten aufgetragene X-Gal

enzymatisch abbaut. Das Abbauprodukt erscheint dann blau.

Wurde hingegen ein Insert eingebaut, ist das lacZ-Gen nicht mehr aktiv, da es vom Insert

unterbrochen wird. Ein Abbau des X-Gal ist nicht möglich. Diese Kolonien verbleiben weiß.

Die Funktion des zusätzlich aufgetragenen IPPD ist die Blockierung des Repressors des lacZ-Gens.

Kann der Repressor nicht am Operator andocken, ist eine Bildung von ß-Galactosidase erst

möglich.

2.7 Versuchsteil 4.2.18. (PCR der weißen Kolonien)

2.7.1 Einleitung Dieser Schritt dient der Kontrolle! Hier entscheidet sich erstmals, ob die weiße Kolonie wirklich

ein Plasmid mit Insert trägt. Da diese PCR der weißen Bakterienkolonie allerdings nicht als

besonders sicher gilt, werden im Versuchsteil 4.2.19. die gleichen Kolonien für die Animpfung von

Minipräps genutzt, um das Ergebnis zusätzlich abzusichern.

2.7.2 Durchführung

Die Durchführung wird laut Skript Seite 97 durchgeführt.

Änderung des Pipettieransatzes:


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12,5µl Hot start Mix

10,5µl Wasser mit Bakterien

1µl Reverse Primer

1µl Universal Primer

25µl Endvolumen

2.7.3 Auswertung

Theoretisch ist das Amplifikat dieser PCR ca. 746bp groß. Auf die Zahl kommt zustande, wenn

man das Insert zwischen den beiden Pst I-

Schnittstellen berechnet (ca. 642bp) und das Stück

Plasmid zwischen dem Reverse- und Forward-

Primer-Praktikum hinzurechnet (104bp).

Ist das Insert nicht vorhanden, ist das Amplifikat

nur 104bp groß.

Abb. 5: PCR der weißen Bakterienkolonie

Dies kann man eindeutig an den Spuren 8 und 9 erkennen. Die Spur 9 ist die Positivkontrolle, die

das Insert scheinbar gar nicht trägt. Dies lässt sich auch später anhand den Minipräps aufzeigen

(2.10.3.).

Die Spur 8 entspricht der Selbstligation, die hier eindeutig das Insert trägt (Vergleich mit Standart

XIV).

Meine PCR (Spur 3 bzw. 4)der Selbstligation sowie Positivkontrolle hat nicht funktioniert.

Mögliche Gründe sind:

1) Die PCR hat nicht funktioniert.

2) Es wurde eine blaue Bakterienkultur gepickt.

Dafür spricht, dass andere Praktikanten andere vermeintlich weiße Kolonien von mir

gepickt haben, deren PCR funktioniert hat.

Trotzdem kann man auch bei 104bp keine Bande erkennen. Dies kann man sich

vielleicht bei der Betrachtung des Gels erklären, da hier vielleicht die 104bp-große

Bande schon aus dem Gel gelaufen ist.

2.8 Versuchsteil 4.2.19., 4.2.20., 4.2.21 (DNA-Minipräps, Konzentration d. Plasmid)

2.8.1 Einleitung

Um zu überprüfen, ob die Klonierung funktioniert hat, wird eine weiße Kolonie über Nacht

vermehrt (4.2.19.). Am nächsten Tag erfolgt dann die DNA-Minipräparation, bei der der vermehrte

Plasmid präpariert wird. Dies erfolgt durch eine alkalische Lyse der Bakterienzelle (4.2.20.).


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In dem Versuchsteil 4.2.21. wird dann die Optische Dichte des Plasmids zur

Konzentrationsbestimmung gemessen, um eine Aussage über die Reinheit des Plasmids zu machen.

Dabei wird einmal bei 260nm (DNA) und bei 280nm (Proteine) gemessen und der Quotient

gebildet. Dieser sollte ca. 1,7 betragen.

2.8.2 Durchführung Die Durchführung erfolgt laut Skript Seiten 98 und 99.

Änderung bei 4.2.20.: Das Pellet wird im vorletzten Schritt in 100µl Wasser aufgenommen und es

werden nur 20µl für die Konzentrationsbestimmung eingesetzt.

2.8.3 Auswertung Gemessene Extinktion:

Positivkontrolle Ligationsansatz DNA bei 260nm 0,484 0,325 Proteine bei 280nm 0,278 0,173

Beispiel der Berechnung der Konzentration:

1,0 OD = 50µg/ml

0,1 OD = 5µg/ml

Wir haben aber nur 20µl, deswegen:

5µg = 20µl

xµg = 1µl x = 5/20 c = 0,25 µg/µl für 1 OD ist c = 2,5µg/µl.

Es werden nur die Konzentrationen der Positivkontrolle und des Ligationsansatzes der DNA

bestimmt.

Positivkontrolle: Ligationsansatz:

c = 0,484 * 2,5µg/µl =1,21 µg/µl c = 0,325 * 2,5 µg/µl = 0,8125µg/µl

Es sollen im Versuchsteil 4.2.22. jedoch 2µg DNA eingesetzt werden, deswegen:


2µg = xµl 2µg = xµl

1,21µg = 1µl 0,8125µg = 1µl

x = 1,7µl x = 2,5µl

Berechnung des OD-Quotienten:

OD-Quotient = 0,484 / 0,278 = 1,74 für die Positivkontrolle

OD-Quotient = 0,325 / 0,173 = 1,87 für den Ligationsansatz


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2.9 Versuchsteil 4.2.22. (Analytisches Gel Minipräp)

2.9.1 Einleitung Die oben berechnete Menge DNA wird auf dem Gel aufgetragen und somit erneut geprüft, ob das

Insert einkloniert wurde.

2.9.2 Durchführung Die Proben für das Gel wurden folgendermaßen angesetzt:


1,7µl DNA 2,5µl DNA

8,3µl Wasser 7,5µl Wasser

2µl AP (6-fach) 2µl AP (6-fach)

12µl Endvolumen 12µl Endvolumen

2.9.3 Auswertung

Abb. 6: PCR Minipräp (keine bp

angegeben, da kein Standart

aufgetragen wurde)

Auch hier ist bei dem Ligationsansatz und der Positivkontrolle (Spur 3 bzw. 4) keine Bande zu

erkennen. Erklärung siehe 2.8.3.. Ein weiterer Grund könnte sein, dass sich die Zellen nach das

Plasmid nach der Aufreinigung nicht richtig gelöst hat. Ein Beweis bleibt aus.

Auf Spur 8 ist die Kontrolle aufgetragen. Betrachtet man Spur 5 (eigene Ligation) und Spur 6

(Positivkontrolle) so stellt man fest, dass die eigene Ligation das Insert beinhaltet. Die

Positivkontrolle dagegen ist negativ. Diese Aussage passt zu der Aussage, die unter 2.8. getroffen

wurde.

Die dicken Banden entsprechen der supercoild (s.c.) Form des Plasmids, die durch ihre

Komprimierung am weitesten wandert. Die darüberliegenden Banden sind nicked circled (n.c.)

Form. Die lineare Form kann man hier nicht erkennen. Die Banden, die sich auf der Höhe der

Geltaschen befinden, können der genomischen DNA entsprechen.

Am unteren Rand des Gels kann man die RNA-Bande erkennen.


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2.10 Versuchsteil 4.2.23. (Restriktion der weißen Kolonie)

2.10.1 Einleitung Die Restriktion der weißen Kolonie dient der Orientierungsbestimmung. Ab diesem Versuchsteil

habe ich die Selbstligation von Karoline eingesetzt.

2.10.2 Durchführung Durchführung siehe Skript Seite 100.

Pipettierschema des Restriktionsansatzes:

8,5µl DNA des Klons

5µl 10-fach Puffer PvuII

35,5µl Wasser

1µl PvuII-Enzym

50µl Endvolumen

Danach Auftragung auf Gel mit 2µl AP (6-fach) mit 10 µl verdauter DNA.

2.10.3 Auswertung

Abb. 7: Restriktion der weißen Kolonie

Auf Spur 5 befindet sich meine Bande. Sie ist ca. 2,6kb groß. Dies entspricht dem geschnittenen

Plasmid. Das herausgeschnitten Insert (plus einige Basen des Plasmids bis zur Schnittstelle PvuII)

ist auf dem Gel nicht mehr zu sehen. Es ist aus dem Gel herausgelaufen.

Somit ist die Bestimmung der Orientierung anhand dieses Gels nicht möglich.

Meine Bande


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Abb. 8: Skizze des pUC 19 mit Insert und der möglichen

Schnittstellen des PvuII-Restriktionsenzyms

Wenn PvuII auf dem Plasmid schneidet, entsteht die bei

der Abb. 7 aufgezeigte Bande.

Über die Größe der kleinen Stücke könnte man die

Orientierung herausfinden

2.11 Versuchsteil 4.2.24. (Orientierungsbestimmung durch PCR)

2.11.1 Einleitung Durch die PCR mit unterschiedlichen Primern auf dem Plasmid und dem Insert kann hiermit eine

Orientierungsbestimmung gemacht werden.

2.11.2 Durchführung Die Durchführung erfolgt wie im Skript auf Seite 101 beschrieben.

Pipettierschemata:

PCR 1 PCR 2 PCR 3 (nochmalige Kontrolle meiner Pos.-Kontrolle)

1µl DNA 1µl DNA 5µl DNA

1µl KB3-Primer 1µl KB3-Primer 1µl Universal-Primer

1µl Reverse-Primer 1µl Forward-Primer 1µl Reverse-Primer

9,5µl Wasser 9,5µl Wasser 5,5µl Wasser

12,5µl Hot Start Mix 12,5µl Hot Start Mix 12,5µl Wasser

25µl Endvolumen 25µl Endvolumen 25µl Endvolumen

2.11.3 Auswertung

Abb. 9: PCR des Minipräps

Auf der Spur 7 befindet sich der Standart XIV. Die Banden auf den Spuren 2, 6, 9, 11 und 12 sind

alle gleich weit gelaufen. Es handelt sich hier der Größe nach um unser Plasmid (ca. 1000bp).

Insert


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Bei den Spuren 2, 3 und 4 handelt es sich um meine Proben. Auf Spur 4 wurde noch einmal die

Positivkontrolle der vorherigen Versuchsteile aufgetragen. Auch dieses Mal ist keine Bande zu

erkennen. Erklärung siehe 2.8.3..

Auf Spur 2 handelt es sich um die PCR 1 (siehe Durchführung), bei Spur 3 um die PCR 2.

Das Ergebnis ist somit eindeutig. Das Insert wurde „richtigrum“ eingebaut! Die Zeichnungen

werden dies erklären.

Abb. 10: Orientierungseinschätzung durch Primerzugabe Das Ablesen der DNA-Stränge erfolgt immer vom 5´-Ende zum 3´-Ende.

Bei der PCR sind 2 Primer notwendig. Der eine ist zum Ablesen des Sense-Stranges, der andere

zum Ablesen des Antisense-Stranges verantwortlich.

Gibt man zu der PCR Reverse-Primer (PRR) und KB3-Primer hinzu (PCR1), funktioniert die DNA

(siehe Abbildung B, schwarze Pfeile), wenn das Insert „richtigrum“ eingebaut wurde. Falls es

„falschrum“ eingebaut wurde, funktioniert die PCR mit diesen 2 Primern nicht (Abbildung C, roter

Pfeil)!

Dreht man diese Tatsache um, so erklärt sich der Fall für die Anwendung des Forward-Primers

(FPP).

Somit wurde hier in Sense-Richtung einkloniert.


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Abb. 11: Plasmid-Orientierungsschema

3 Diskussion Zusammenfassend kann man nun feststellen, dass der Versuch funktioniert hat und somit zu einem

akzeptablen Ergebnis geführt hat.

Wenn ich nun den eigenen Versuchsansatz betrachte, kann man mit dem Ergebnis wohl nur halb

zufrieden sein.

Haben die Aufreinigung des Plasmids sowie des Inserts perfekt funktioniert, ist der

Transformationsschritt absolut missglückt.

Allerdings muss man auch bedenken, dass jeder nur eine einzige Probe angesetzt hat, was in einem

natürlichen Laborumfeld nicht üblich ist.

Nimmt man alle FI-Praktikanten zusammen, ist wohl eine normale prozentuale Erfolgschance am

Ende herausgekommen.

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