Botanisches Institut der Universitat Heidelberg

Untersuchungen zum Regenerationsmechanismus bei Funaria hygrometrica SIBTH.

III. Auslosung durch Inhibitoren und Unterdriickung der apikalen Dominanz

Studies on the Mechanism of Regeneration in Funaria hygrometrica SIBTH.

III. Induction by Inhibitors and Suppression of Apical Dominance

BERND KNOOP

Mit 7 Abbildungen

Eingegangen am 7. Oktober 1975 . Angenommen am 8. Oktober 1975

Summary

The maintenance of cell differentiation in the caulonema of the moss Funaria hygro­metrica is a phenomenon of apical dominance. Only filaments with tip cells, growing at a minimum velocity remain unchanged. If this growth rate is not achieved, intercalarous cell divisions occur, representing an early step of regeneration.

One way of initiation in intact plants is the application of inhibitors of protein synthesis. They stop growth and make the tip cells send a signal to the basic cells (missing regulator?).

Although it can be shown that protein synthesis is inhibited in basic cells too, they respond with intercalarous cell division.

Short time treatment with FdUrd gives similar results. The classic method by killing tip cells must include also the side branches, to induce

divisions at rates corresponding to those obtained by chemical decapitation. These results are discussed also in view of earlier findings.

Key words: Regeneration, Apical dominance, Protein synthesis.

Einleitung

Auf der Suche nach dem AuslOsungsmechanismus der Caulonemaregeneration bei dem Laubmoos Funaria hygrometrica konnte gezeigt werden, dag die Verbindung der nahezu chlorophyllfreien randlichen Eiden zum Gesamtprotonema eine wesent­liche Rolle spielt. Das Abtrennen der Eiden lost ebenso Regeneration aus wie eine kurzfristige Plasmolyse der Zellen (vgl. ISABURO-NAGAI, 1914; STANGE, 1957). Augerdem flihren Eingriffe in die Photosynthese der unverletzten Protonemen zur

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Regenerationsmechanismus bei F una ria 351

Riickdifferenzierung. Offensichtlich spielt die Versorgung der selbst kaum assimilie­renden Caulonemen yom griinen Zentralprotonema aus eine entscheidende Rolle (KNOOP, 1973). Entweder werden direkt im Chloronema gebildete Morphoregulato­ren zur Peripherie hin transportiert (Bopp und KNOOP, 1974), oder es liegen kompli­ziertere Zusammenhange vor. So ist es durchaus denkbar, daB zunachst nur Sub­stanzen erzeugt und transportiert werden, die das Spitzenwachstum der Caulonemen ermoglichen, von wo aus dann in Analogie zur Apikaldominanz bei hoheren Pflan­zen die eigentlichen morphogenetisch wirksamen Substanzen gebildet und basal warts geleitet werden. Ein regulierender EinfluB der Spitzenzellen auf die Ausbildung von Seitenverzweigungen am nachfolgenden Zellfaden konnte bereits mehrfach ge~~igt werden (FEDYK und DEMKIV, 1975; vgl. LARPENT-GOURGAUD und LARPENT, 1974). Wenn diese Vorstellung zutrifft, ware eine enge Beziehung zwischen Spitzenwachs­tum und Differenzierungszustand der nachfolgenden Zellen zu erwarten. Das soll im folgenden untersucht werden.

Nachdem friiher gezeigt wurde, daB an isolierten Caulonemen die Regeneration auch bei gehemmter Proteinsynthese abhlauft (KNOOP, 1975), wird jetzt an intakten Protonemen untersucht, wie weit umgekehrt eine solche Hemmung in den Spitzen­zellen zu einer Auslosung der Regeneration fiihrt.

Material und Methode

Ausgangsmaterial waren Protonemen aus Einzelsporkulturen mit durchweg sehr einheit­licher Entwicklung. Die friiher benutzte Methode der vegetativen Vermehrung iiber Ex­plant ate wurde nicht verwendet, wei I im Laufe von 2 Jahren zunehmend atypisch wachsende Pflanzen beobachtet wurden. Die Abweichungen gegeniiber dem Ausgangsmaterial bestanden in der Abnahme der Zahl gleichartig wachsender Caulonemen/Protonema und in einer Vor­verlegung der Knospenbildung. Beide Eigenschaften sind aus versuchstechnischen Griinden unerwiinscht. Da die au~eren Kulturbedingungen konstant blieben, kann iiber die Ursache dieser Veranderungen keine nahere Aussage gemacht werden. Die Einzelsporkulturen wurden eben falls unter Standardbedingungen gezogen (KNOOP, 1973). Die Scintillationsmessungen und Autoradiographien wurden in einem kombinierten Verfahren durchgefiihrt, das bereits beschrieben ist (KNOOP, 1975).

Zum gezielten Abtoten einzelner Zellen wurde ein Mikromanipulator nach DE FONBRUNE benutzt. Als Werkzeuge dienten feinst ausgezogene Glasnadeln.

Bei den dargestellten Kurven handelt es sich urn Ergebnisse aus jeweils 3-4 unabhangigen Versuchen. Pro Kurvenpunkt und Versuch ist das Wachstum von 20-25 Caulonemen am intakten Protonema gemittelt. Die Teilungsrate bezieht sich auf dieselben Zellfaden und gibt an, wieviel Prozent der vorderen 10 Zellen eines Fadens eine intercalare Teilung auf­weisen. Fiir diesen Wert kommen also pro Punkt ca. 200-250 Zellen zur Auswertung. Mehrfachteilungen einer Zelle wurden nicht beriicksichtigt.

Die verwendeten Chemikalien stammen von Merck (Darmstadt) sowie Serva (Heidelberg). 3 H-Leucin wurde von Amersham/Buchler (Braunschweig) bezogen.

Ergebnisse

Versuche von Bopp und BOHRS (1965) zeigten, daB FdUrd bei isolierten Caulone­men die intercalaren Zellteilungen vollig hemmt. Gleichzeitig stagniert das Wachstum

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der Spitzenzellen. Auch an ganzen Protonemen laBt sich das Wachs tum mit FdUrd blockieren, ohne daB intercalare Teilungen auftreten. Wenn die Regulation der Caulonemadifferenzierung aber auf der Dominanz der wachsenden Spitzenzellen beruht, sollte unter diesen Bedingungen eine Induktion der Ruckdifferenzierung er­wartet werden, auch wenn sie sich unter Dauer-FdUrd nicht als Teilung ausdrucken kann. Da man in Versuchen mit FdUrd an ganzen Proton em en stets eine deutliche Vermehrung und VergroBerung der Chloroplasten beobachtet, wie sie fur den nor­mal en Regenerationsablauf typisch ist, scheint ein erster Hinweis fur eine Induktion gegeben.

Ein Pulsversuch mit FdUrd zeigt dies noch klarer. Intakte Protonemen werden 1, 3 und 5 Std. mit FdUrd (10-4 M) behandelt, anschlieBend auf Knop-Agar ohne Hemmstoff zuruckgesetzt. Registriert werden das Spitzenwachstum und das Auftre­ten intercalarer Teilungen.

Der Caulonemazuwachs nimmt entsprechend der Pulsdauer abo Dabei treten zwi­schen 24 und 48 Std. nach Versuchsbeginn intercalare Teilungen auf, und zwar am starksten in den Versuchsgruppen, deren Wachstum am meisten gehemmt ist. Eine Wachstumshemmung mit FdUrd lOst also tatsachlich Regeneration aus.

o 1 3 5 Std. FdUrd (10-') M

Fig. 1: Caulonema growth (-. -) and inter­calarous cell divisions (- x -) in unwounded protonemas 24 (- - -) and 48 hrs. (--) after beginning of a FdUrd-pulse with 1, 3 and 5 hrs. Posttreatment: Knop-Agar.

Durch gleichzeitige Gabe von 10-3 M Thymidin kann man die FdUrd-bedingte Wachstumshemmung vollig aufheben. Unter diesen Bedingungen treten auch in der weiteren Entwicklung keine intercalaren Teilungen auf (nicht dargestellt). Diese Er­gebnisse bestatigen die Beobachtung, daB eine enge Kopplung von Wachstumshem­mung und Auslosung der intercalaren Teilungenvorliegt.

Aus anderen Versuchsreihen ist bekannt, daB isolierte Caulonemen auch intercalare Teilungen machen, wenn sie mit Proteinsynthese-Inhibitoren behandelt werden. Das eroffnet die Moglichkeit, durch Behandlung ganzer Protonemen den Zusammenhang von Wachs tum und Teilungsinduktion zu prufen.

Intakte Protonemen werden mit ihrer Cellophanunterlage auf Konzentrations­reihen verschiedener Hemmstoffe der Proteinsynthese umgesetzt.

ErwartungsgemaB nimmt unter dem EinfluB der Inhibitoren der Zuwachs der Caulonemen in Abhangigkeit von ihrer Konzentration abo Gleichzeitig treten jedoch

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versdrkt intercalare Teilungen auf, und zwar zum grofhen Teil im Zeitraum zwi­schen 24 und 48 Std. nach Behandlungsbeginn (Abb. 2 a-d). Gegeniiber isolierten Caulonemen, deren Teilungsmaximum zwischen 12 und 24 Std. liegt, tritt also eine Verzogerung auf. Wie die Kurven zeigen, nimmt der Zuwachs in den zweiten 24 Std. gegeniiber den ersten bei allen Hemmstoffkonzentrationen deutlich abo Zeitlich deckt sich also die maximale Wachstumshemmung mit dem Teilungsoptimum.

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a 0.1 0.3 0.5 0.7 a 2 3 Cycloheximid (mg/i) %Alhanol

Fig. 2: Caulonema growth (-. -) and intercalarous cell divisions (- x -) in intact protonemas 24 (- - -) and 48 hrs. (--) after continuous application of different concentrations of several inhibitors of protein synthesis.

Der folgende Versuch soll klaren, wie stark die Proteinsynthese unter dem Ein­Hug der fur die Teilungsinduktion wirksamsten 1nhibitorkonzentrationen gehemmt ist. Dazu werden Protonemen fur 24 Std. mit den verschiedenen Hemmstoffen vor­behandelt und anschliegend auf gleiche Substrate umgesetzt, die zusatzlieh 10,uC/ml 3 H-Leucin enthalten. Die 1nkubationszeit betragt 6 Std. Die Kontrollen werden ohne Hemmstoffbehandlung umgesetzt. Von jedem Protonema werden 10 Caulonemen isoliert, auf Deekglasern fixiert und gewassert. Die im Seintillationszahler bestimmte Gesamtaktivitat ist ein relatives Mag fur eingebautes 3 H-Leuein.

Die Proteinsynthese ist zu Beginn der Periode, in der naeh Applikation der 1n­hibitoren die meisten Teilungen auftreten, unter deren EinHug erheblieh niedriger als in den Kontrollen. Das liegt sieher zum Teil an der Hemmung des Wachstums in den Spitz en, wo normalerweise am starksten markiert wird. Die Hemmung erstreekt

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sich aber auch auf die Ubrigen Fadenzellen, wie durch Vergleich von Autoradio­graphien jeweils der 3. Zelle der Kontrollen mit denen behandelter Caulonemen ge­zeigt werden kann (Abb. 4). Auffallend ist ubrigens die unterschiedliche Hemmung in Plasma und Plastiden bei Tetracyclin und Cycloheximid.

Es laufen jedoch noch immer Restsynthesen in den verschiedenen Zellkomparti­menten ab, deren Rolle fur die Einleitung der Regeneration schwer zu beurteilen

25 ~

20

£ lJ 15

~ 10

5

Ko

- ......--

n TC CAP CYCL ArH

KO TC

Fig. 3: Incorporation of 3H-Ieucine into caulonemas of intact plants. Pretreatment of the whole protonema with inhibitors: 15 hrs., followed by an additional application of 3H-Ieucine (10,uCi / ml): 6 hrs. Concentra­tions: Tetracyclin 50 mgll, Chloramphenicol 150 mg/ I, Cycloheximide 0,5 mgll, Ethanol 2 %.

CYCL ATH

Fig. 4: Autoradiography of the third filament cell after treatment with inhibitors and 3H-Ieucine incorporation. Experimental conditions see Fig. 3.

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ist. Die bisher genannten Hemmstoffe setzen zwar die Syntheserate herab, es ent­stehen aber noch funktionsfahige Proteine. Ein anderer Weg, die Rolle solcher Rest­synthesen zu untersuchen, besteht in der Applikation von Aminosaureanaloga, die zur Bildung fraudulenter Proteine fuhren. Augerdem ergibt sich hierbei die M6g­lichkeit, die Wirkungsspezifitiit durch gleichzeitige Gabe der richtigen Metaboliten nachzuweisen.

Abb. 5 zeigt die Ergebnisse von Versuchen mit Athionin, das anstelle von Methio­nin eingebaut wird.

r--

2

Ko

r--

-

r I A /0-5 j,; 10-5

ME 10-5

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ii /0-5 ME 10-4

~ 30 ;

~

20 ~ S

10

Fig. 5: Effect of continuous treatment with ethionine (A) on the growth and induction of cell divisions in caulonema filaments of unwounded protonema, 48 hrs. after application. Reversion with methionine (Me).

10-5 M Athionin hemmt das Wachstum intakter Proton em en v6l1ig, gleichzeitig werden wieder intercalare Teilungen ausge!6st. Verschiedene Methionin-Konzentra­tionen revertieren beide Effekte je nach Konzentration teilweise oder ganz. Das Analogon wird dabei nicht nur in der Spitzenzelle wirksam, sondern auch in den ubrigen Fadenzellen. Das zeigt die sonst bei der Regeneration ablaufende ChI oro­plastenentwicklung, die unter Athionin vollkommen gehemmt ist. Kombiniert man Cycloheximid und Athionin, beide in Konzentrationen, die allein schon wirksam werden, so sollte erwartet werden, dag die von Cycloheximid zugelassenen Rest­synthesen durch das Aminosaureanalogon fraudulent werden.

Trotzdem wird die intercalare Teilungsrate nicht herabgesetzt (Abb. 5), sondern zeigt in zwei der drei durchgefuhrten Experimente sogar leicht h6here Werte als Athionin fur sich allein, immer aber deutlich mehr Teilungen als nur auf Cyclo­heximid.

Die gleichzeitige Aufhebung der Athioninwirkung mit Methionin fuhrt wieder zu den niederen Werten, wie sie fur Cycloheximid allein typisch sind (vgl. Abb. 2 c). Diese Ergebnisse mach en es wenig wahrscheinlich, dag in den Restsynthesen ein Pro­tein entsteht, welches ursachlich an der AuslOsung der Ruckdifferenzierung beteiligt ist.

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40

-

-10

Ko c A

r-

n Fig. 6: Enhancement of intercalarous cell divisions by combined treatment of whole plants with cyclo­heximide (C: 0,5 mg/I) and ethionine (K: 10-5 M). Enhancement reversed by methionine (ME: 10-4 M).

Die Ergebnisse mit FdUrd und Kthionin zeigen, da~ sich die Chloroplastenent­wicklung und das Teilungsgeschehen entkoppeln lassen. Bisher wurde aber noch keine Bedingung gefunden, unter cler eine Regeneration auch bei fortdauerndem Wachstum stattfindet. Hier scheint ein sehr enger Zusammenhang zu bestehen, wie er auch flir die Apikaldominanz der Moospfhinzchen oder von hoheren Pflanzen gilt. Offenbar ist nur die wachsende Spitz en zelle in der Lage, die Rlickdifferenzierung der nachfolgenden Zellen zu verhindern.

Mit Hilfe der klassischen Methode durch gezieltes Abtoten der wachsenden Zellen soll diese Korrelation gezeigt werden: Totet man an einem sonst intakten Protonema die Spitzenzellen der Hauptfaden, so bleibt der Induktionserfolg minimal (Abb. 7). In den meisten Fallen wird die Spitze durch den nachsten gebildeten Seitenfaden ersetzt, ohne da~ intercalare Zellteilungen beobachtet werden. Das entspricht im wei­testen Sinn dem Auswachsen vorhandener Anlagen bei hoheren Pflanzen und wurde schon mehrfach beschrieben (FEDYK und DEMKIV, 1975; LARPENT-GOURGAUD und LARPENT, 1974).

Trennt man von diesen Caulonemen zusatzlich noch diese Seitenverzweigungen ab, treten intercalare Teilungen auf mit Werten, wie sie auch bei der Induktion durch Isolieren oder chemischer Wachstumshemmung erreicht werden (Abb. 7). Ent­weder sind die Seitenfaden in der Lage, sehr schnell die Funktion der Spitzenzelle zu libernehmen, oder der Einflu~ der Hauptspitzen reicht nur wenige Zellen weit

~ 30

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:s 10

n Ko SP sp,

SV

Fig. 7: Initiation of intercalarous divisions after mechanical killing of the main tip cell only (SP), and additional removing of the side branches (SP + SV). Controls unwounded. Time: 24 hrs.

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und wird auch wahrend des normalen Wachstums schon durch die Seitenaste er­ganzt. Diese Frage bleibt noch zu klaren.

Diskussion

Die Regeneration der Funaria-Caulonemen wird durch die Spitzenzellen kontrol­liert. Bei einer Wachstumsstorung der Hauptspitzen iibernimmt zunachst ein junger Seitenfaden deren Funktion. Wird auch dieser Vorgang verhindert, kommt es zu der qualitativ neuen Reaktion der intercalaren Zellteilung. Die Auslosung dieser Tei­lungen durch Inhibitoren entspricht einer chemischen Dekapitierung, die aile wach­senden Spitzenzellen erfafh. Mit dieser Methode ist es moglich, einen quantitativen Zusammenhang von Wachstum und Riickdifferenzierung zu finden. Offenbar muG eine bestimmte Wachstumsgeschwindigkeit unterschritten werden, damit intercalare Teilungen stattfinden, deren Zahl dann mit zunehmender Hemmung steigt. Hier zeigt sich sehr klar der graduelle Charakter der Apikaldominanz (vgl. PHILLIPS, 1975). In Anwendung dieser Ergebnisse auf die Ontogenese heigt das, dag der von Bopp und BRANDES (1964) gepragte Begriff der «kritischen Groge» eines Moos­protonemas, bei der sich Caulonemen zu differenzieren beginnen, in erster Linie als Ausdruck fiir das Erreichen einer bestimmten Wachstumsgeschwindigkeit angesehen werden kann.

Unter dem Gesichtspunkt der «Apikaldominanz» werden aile bisher gefundenen Auslosungsmechanismen verstiindlich. Entweder handelt es sich dabei urn einen Man­gel an wachstumswichtigen Substanzen (Eingriff in die Photosynthese; Transport­unterbrechung durch Isolieren), oder urn direkte Hemmung von Synthesen in den Spitzenzellen (Dekapitierung, Inhibitoren). Die Plasmolyse als AuslOser (vgl. STANGE, 1957) ist weniger klar einzuordnen, wei I sich hier verschiedene Effekte iiberlagern. Reigen die Plasmodesmen, kommt es zu einem Korrelationsverlust. Doch auch ohne diese Isolierung der Zellen voneinander stort die Plasmolyse eine ganze Reihe von Stoffwechselprozessen (vgl. HSIAO, 1973). Bei Avena zum Beispiel wird die Protein­synthese bis zu 80 Ofo gehemmt (DHINDSA und CLELAND, 1975). Dag eine solche Hem­mung bei Funaria Teilungen induziert, wurde gezeigt.

Bei allen bisherigen Experimenten konnte keine Entkopplung von Wachstum und Caulonemadifferenzierung gefunden werden. Demgegeniiber besteht offenbar zwi­schen der Teilungsinduktion und der Chloroplastenentwicklung kein obligater Zu­sammenhang. Beide Prozesse konnen fiir sich allein ablaufen (s. Athionin und FdUrd).

Das auslOsende Signal fiir die Teilungen besteht moglicherweise in dem Fehlen eines Morphoregulators, des sen Synthese in den wachsenden Spitzenzellen eng mit der Proteinsynthese verkniipft ist. Dag auch FdUrd die Regeneration auslOst, steht dazu nicht im Widerspruch, denn eine generelle Wachstumshemmung der Spitzen­zellen erstreckt sich mit Sicherheit auch auf die RNA und Proteinsynthese (KADOURI et aI., 1973).

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An der Regulation sind wahrscheinlich «Auxine" beteiligt, wie die Zunahme und zeitliche Vorverlegung der Caulonemadifferenzierung in Fliissigkeitskulturen von Funaria zeigt (JOHRI, 1973; SCHAFERS, 1974). Insgesamt gesehen besitzen die Zell­Faden also ein Regulationssystem, das der Apikaldominanz bei hoheren Pflanzen cntspricht und flir die Aufrechterhaltung eines bestimmten Differenzierungszustandes verantwortlich ist. Flir nahere Untersuchungen hierzu bieten die Mooscaulonemen den grog en Vorteil, dag die frlihe Rlickdifferenzierung ohne Zellwachstum sichtbar wird und unempfindlich gegen eine Hemmung der Proteinsynthese ist. Damit ent­fallen eine ganze Reihe von Schwierigkeiten, wie sie bei Versuchen mit hoheren Pflanzen auftreten (vgl. PHILLIPS, 1975).

Frau M.-T. BAUER danke ich fiir die gewissenhafte Assistenz, der Deutschen Forschungs­gemeinschaft fiir die finanzielle Unterstiitzung.

Literatur

Bopp, M., und H. L. BOHRS: Die Regeneration der Caulonemen von Funaria hygrometrica. Planta 67, 357-374 (1965).

Bopp, M., und H. BRANDES: Versuche zur Analyse der Protonemaentwicklung der Laubmoose. II. Uber den Zusammenhang zwischen Protonemadifferenzierung und Kinetinwirkung bei der Bildung von Moosknospen. Planta 62,116-136 (1964).

Bopp, M., et B. KNOOP: Regulation de la differenciation chez Ie proton em a des Mousses. Sci. bot. Fr., ColI. Bryol., im Druck.

DHINDSA, R. S., and R. E. CLELAND: Water stress and protein synthesis. I. Differential inhibition of protein synthesis. Plant Physiol. 55, 778-781 (1975).

FEDYK, J D., and O. T. DEMKIV: Morphological study of the moss gametophytes. XII. In­ternational Botanical Congress, Abstracts Part I, 89 (July 1975).

HSIAO, T. c.: Plant responses to water stress. Ann. Rev. Plant Physiol. 24, 519-570 (1973). ISABURO-NAGAI: Physiologische Untersuchungen iiber Farnprothallien. Flora 6, 281-330

(1914). JOHRI, M. M., and S. DESAI: Auxin regulation of caulonema formation in moss protonema.

Nature New BioI. 245, 223-224 (1973). KADOURI, A., D. ATSMON, and C. TABBAK: Does 5-fluorodeoxyuridine inhibit growth by

indirectly inhibiting RNA synthesis? Plant & Cell Physiol. 14, 719-725 (1973). KNOOP, B.: Untersuchungen zum Regenerationsmechanismus bei Funaria hygrometrica SIBTH.

I. Die Auslosung der Caulonemaregeneration. Z. Pflanzenphysiol. 70, 22-33 (1973). - Untersuchungen zum Regenerationsmechanismus bei Funaria hygrometrica SIBTH. II. Zur

Bedeutung der RNA- und Proteinsynthese bei der Regeneration isolierter Caulonemen. Z. Pflanzenphysiol., im Druck.

LARPENT-GOURGAUD, M., et J-P. LARPENT: Mecanismes de la ramification des systemes filamenteux ches les vegetaux inferieurs. Vortrag in Heidelberg (September 1974).

PHILLIPS, 1. D. J: Apical dominance. Ann. Rev. Plant Physiol. 26, 341-367 (1975). SCHAFERS, M.: Untersuchungen zur Differenzierung von Moosprotonemen in Fliissigkeits­

kultur. Staatsexamensarbeit Heidelberg (1974). STANGE, L.: Untersuchungen iiber Umstimmungs- und Differenzierungsvorgange in regenerie­

renden Zellen des Lebermooses Riella. Z. Bot. 45, 197-244 (1957).

Dr. BERND KNOOP, Botanisches Institut der Universitat Heidelberg, D-6900 Heidelberg, Hofmeisterweg 4, West Germany.

Z. PJlanzenphysiol. Bd. 77. S. 350-358. 1976.