Molekularbiologisches Problem
Unsere zweite Aufgabe
Phosphate transporter
Molekularbiologisches Problem
Unsere nächste Aufgabe
Phosphate transporter
= RESTRIKTIONSENZYM
Molekularbiologie Einleitung
Welche Methoden lernen wir in diesem Molekularbiologiekurs?
• VL I: DNA Struktur, Fähigkeiten, Isolierung• VL II: DNA Schneiden: Restriktionsenzymen• VL III: DNA Ligation: Klonierung in Vektoren• VL IV: Herstellung von DNA Bibliotheken und Screening• VL V: Teil 1: Bioinformatische Tools
Teil 2: SequenzierungsmethodenTeil 3: Genomesequenzierung
• VL VI: Teil 1: RNA Struktur, Expression analyse: Northern blot, RT-PCRTeil 2: Expression analyse: Real time, cDNA Bibliothek, Microarrays
• VL VII: Teil 1: Rekombinante Proteine• VL VII: Teil 2: Western blot, Affinity chromatography• VL VIII: Mutagenese, Transformation
KIT – University of the State of Baden-Wuerttemberg and National Research Center of the Helmholtz Association
Prof. Dr. Natalia Requena, Molecular Phytopathology, Botanical Institute
www.kit.edu
Molekularbiologie Vorlesung II
DNA Schneiden: Restriktionsenzymen
how could I break this down into pieces?
1970 – Der Beginn einer Revolution: Entdeckung einesRestrictionsenzyms im Bakterium Haemophilus influenzae
Die Entdeckung der Restriktionsenzyme
1978 erhielten • der Mikrobiologe und Genetiker Werner Arber, • der Mikrobiologe und Biochemiker Daniel Nathans, • und der Biochemiker Hamilton Othanel Smith für die Entdeckung der Restriktionsenzyme und deren Anwendung in der Molekulargenetik den Nobelpreis für Physiologie der Medizin.
“The tale of the king and his servants”“When I come to the laboratory of my father, I usually see some plates lying on the tables. These plates contain colonies of bacteria. These colonies remind me of a city with many inhabitants. In each bacterium there is a king. He is very long, but skinny. The king has many servants. These are thick and short, almost like balls. My father calls the king DNA, and the servants enzymes. The king is like a book, in which everything is noted on the work to be done by the servants. For us human beings these instructions of the king are a mystery.
My father has discovered a servant who serves as a pair of scissors. If a foreign king invades a bacterium, this servant can cut him in small fragments, but he does not do any harm to his own king.
Clever people use the servant with the scissors to find out the secrets of the kings. To do so, they collect many servants with scissors and put them onto a king, so that the king is cut into pieces. With the resulting little pieces it is much easier to investigate the secrets. For this reason my father received the Nobel Prize for the discovery of the servant with the scissors".
Silvia Arber (10 years old)
Der Weg der Entdeckung
1952 beobachteten Salvador Luria und Mary Human, sowie Bertani und Weigleein eigenartiges Wachstumsverhalten
von Bakteriophagen."host controlled restriction of
bacteriophages"
Anfang der 60er gelang es Werner Arber und seinen Mitarbeitern, nach zu weisen, dass wirtsspezifischeModifikationen auf der Phagen-DNA zu finden sind und dass die Restriktion der Phagen-DNA mit deren Abbauverknüpft ist. https://slideplayer.com/slide/13126642/
Der Weg der Entdeckung
• 1965 sagte Arber voraus, dass „site-specific restrictionenzymes“ existieren würden und dass die Modifikationen durch wirtsspezifische DNA-Methylasen hervorgerufen werden könnten.
• Auch wenn die Existenz dieser Enzyme als gesichert galt, dauerte es bis 1968, bis Linn und Arber ein Enzym mit solchen Eigenschaften in E. coli B fanden (Typ I)
• Zur selben Zeit, berichteten Meselson und Yuan von einem Restriktionsenzym, dass sie bei ihren Experimenten in
E. coli K fanden.• Durch eine „sucrose gradient centrifugation“ zeigten sie, dass
ihr Enzym unbehandelte DNA in große Teile zerschnitt, währenddesen modifizierte DNA unverändert blieb.
Der Weg der Entdeckung
• Später zeigten sie noch, dass das Restriktionsenzym aus Haemophilus site-specific ist, und, dass das Enzym fremde DNA an einer sechsstelligen in sich symmetrischen Basenpaarsequenz schneidet.
5'AAGCTT3'3'TTCGAA5'
5'---A AGCTT---3'3'---TTCGA A---5'
Der Weg der Entdeckung
HindIII
• 1969 hat Nathans zusammen mit ein paar Kollegen Restriktionsenzyme zur Untersuchung des SV40 Tumor Virus Genoms verwendet.
• Durch diese Forschungen demonstrierte er, dass man mit den Restriktionsenzymen sehr wichtige und wertvolle „Instrumente“ für DNA-Analysen gefunden hatte.
Der Weg der Entdeckung
• Außerdem führte er die Gelelektrophorese zur Analyse von DNA-Fragmenten ein.
• Nachdem dann auch noch Ethidium Bromid, ein Fluoreszenz Farbstoff für DNA, von Sharp der Wissenschaft offen gelegt wurde, dauerte es nicht lang bis Laboratorien aus der ganzen Welt neue Restriktionsenzyme nachwiesen.
Der Weg der Entdeckung
Hamilton Othanel Smith:
„The observations leading to the discovery of restictionenzymes span a period of nearly two decades and constitute a prime example of how basic research on an apparentlyinsignificant bacteriological phenomenon has had unexpectedlyfar-reaching implications.“
Der Weg der Entdeckung
Restriktionsenzyme
• Bakterielle Enzyme• Erkennen spezifisch 4-8 Basenpaarsequenzen der DNA und
schneiden an dieser Stelle• Auch Restriktionsendonucleasen genannt, da sie die DNA
innerhalb des Moleküls schneiden und nicht außerhalb, wie DNA-Exonukleasen
• Spezifische Basensequenzen kommen oft als Palindrom vor:
EcoRI 5‘ – GAATTC – 3‘3‘ – CTTAAG – 5‘
ATAGGTCCTCAGGTAGGCCTCAGGTAGGCGGTAGGC ATAGGTCCTCAGGTAGGCCTCAGGTAGGCGGTAGGC
• Nucleasen= Nucleinsäuren hydrolysierende Enzyme• Restriktionsendonucleasen= Enzyme, die die Hydrolyse des
Phosphodiesterrückgrats der DNA katalysieren
RE
Restriktionsenzyme
Warum werden diese Enzyme„Restriktionsenzyme“ genannt?
• They „restrict“ the entrance of foreign DNA by cleaving it atall restriction sites.
• Restringere (lat.), restrict (engl.) = Einschränken
• Bsp.: Bakteriophagen DNA oder DNA, die durch eine Transformation aufgenommen wurde.
• Restriktionsenzyme schneiden Fremd-DNA an den spezifischen Basenpaarsequenzen,
• Aber wie wird die eigene DNA geschützt, die ebenfalls die spezifischen Basenpaarsequenzen enthält?
• → „Modifizierende Enzyme“
Modifizierende Enzyme (Methylasen)
• Schützen die DNA durch Modifikation in der Nähe der Restriktionsschnittstellen
→ Methylierung an bestimmten Basen→ Restriktionsenzyme spalten diese DNA nicht mehr
Für jede Restriktionsendonuclease erzeugt die Wirtszelle eine entsprechende Methylase für den eigenen Schutz.
Restriktionsendonucleasen und Methylasen bilden zusammen das
Restriktions-Modifikations-System
→ Wirts-DNA wird geschützt,Fremd-DNA wird abgebaut
NamensgebungDer Name eines Restriktionsenzyms leitet sich von dem ersten Buchstaben der Gattung und den ersten beiden Buchstaben der Spezies ab, aus der das Enzym isoliert wurde. Dieser Teil des Namens wird kursiv geschrieben. Dazu kommt eine Zahl und/oder ein Buchstabe, die nicht kursiv sind• EcoRI - Escherichia coli• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens• HindIII - Haemophilus influenzae• PstI - Providencia stuartii• Sau3AI - Staphylococcus aureus• AvaI - Anabaena variabilis
RestriktionsenzymeDie DNA eines Organismus hat eine spezifische Sequenz: Restiktionsanalyse der DNA ergibt ein spezifisches und reproduzierbares Fragmentmuster: Restriktionsfragmente oderRestriktionsmuster: Restriktionskarte
5’- GAATTC -3’3’- CTTAAG -5’
GAATTCCTTAAG
10 kbEcoRI
4 kb3.5 kb2.5 kb
• Restriktionsenzyme schneiden nur spezifische Basenpaarsequenzen
• Verschiedene Restriktionsenzyme verschieden lange Fragmentmuster eines Basenabschnitts
Was passiert wenn 2 Enzyme schneiden?
Was passiert wenn 2 Enzyme schneiden?
Auftrennen der einzelnen Restriktionsfragmente mit Hilfe der Gel Elektrophorese
BasenpaarsequenzänderungRestriktionsenzym schneidet nicht mehr verändertes Bild der Gel Elektrophorese
Restriktionskarte eines linearen DNA Moleküls
3 Schnittstellen = 4 Fragmente
Restriktionskarte eines zirkulären DNA Moleküls
3 Schnittstellen = 3 Fragmente
DNA Enden nach einem Restriktionsverdau
Blunt endsSticky ends
Sticky bzw. cohesive ends(Klebrige Enden)
Manche Restriktionsenzyme schneiden DNA-Doppelstränge im „Zick-Zack“ durch und erzeugen
Einzelstrangüberhänge:
DNA Enden nach einem Restriktionsverdau
5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’
5’-G-OH P -AATTC-3’3’-CTTAA- P HO-G-5’
Cohesive or Sticky Ends (Klebrige Enden)EcoRI
DNA Enden nach einem Restriktionsverdau
Blunt ends(Glatte bzw. stumpfe Enden)
Manche Restriktionsenzyme schneiden DNA-Doppelstränge vertikal durch:
DNA Enden nach einem Restriktionsverdau
Blunt ends (Glatte Enden)
EcoRV
5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’
5’-GAT-OH P -ATC-3’3’-CTA- P HO-TAG-5’
DNA Enden nach einem Restriktionsverdau
Sticky bzw. cohesive ends
Blunt-ending cohesive ends
5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’
5’-G-OH P -AATTC-3’3’-CTTAA- P HO-G-5’
EcoRI
5’-G-OH
3’-CTTAA- P
Filling (polymerase) 5’-G
3’-CTTAA- P
5’-G-OH
3’-C- PCutting (exonuclease)
AATT-OH
Blunt-ending cohesive ends
Filling: DNA polymerase
DNA-Polymerasen füllen DNA-Stränge auf, indem sie Nukleotide an das überhängende 3´ Ende anhängenà Filling
Die Polymerisation findet immer vom 5´ zum 3´ Ende statt!
DNA Polymerasen
DNA-Polymerasen können zusätzlich Exonukleaseaktivität in eine oder beide Richtungen haben
Exzision von Nukleotiden
Polymerase mit Exonukleaseaktivität
• Korrekturlesen: 3´-5´ Exonuklease-
aktivität, Erkennung von fehlerhaft eingebauten Nukleotiden und deren Entfernung (proof-reading)
• Strang-Austausch: 5´-3´ Exonuklease-
aktivität, Abbau eines DNA-Strangs bei gleicher Bildung eines neuen Strangs
+ nucleotides+ Mg
5’-GAATT-OH
3’-CTTAA- P
5’-G-OH
3’-C- P
-nucleotides+Mg
5’-G-OH
3’-CTTAA- P
EcoRI site
Blunt-ending cohesive ends
E. coli DNA polymerase I
(EXO 5'-3')
(POL 5'-3')
+ nucleotides+ Mg
5’-G-OH
3’-C- P
- nucleotides+ Mg
5’-GGTAC-OH
3’-C - P
5’-GGTAC-OH
3’-C - P
KpnI site(EXO 3'-5')
Blunt-ending cohesive endsE. coli DNA polymerase I
Blunt-ending cohesive ends
• Klenow-fragment:Teilfragment der DNA-Polymerase I von E.coli àkeine 5´-3´Exonukleaseaktivität
• T4 DNA-Polymerase: ebenfalls keine 5´-3´ Exonukleaseaktivität, aber starke 3´-5´ Exonukleaseaktivität
DNA polymerase IKlenow fragment
109 KDa5’-3’ polymerase activity3’-5’ exonuclease activity5’-3’ exonuclease activity
68 KDa5’-3’ polymerase activity3’-5’ exonuclease activity
Blunt-ending cohesive ends
Klassen von Restriktionsendonucleasen
Typ ISpezifische Erkennung, schneiden Einzelstränge weit entfernt von
der Erkennungssequenz. Benötigen Mg2+, ATP, S-Adenosylmethionine
Typ IISpezifische Erkennung, schneiden Doppelstrang DNA in der Näheoder innerhalb der Erkennungssequenz, benötigen üblicher Weise
Mg2+
Typ IIISchneiden beide Stränge außerhalb der Erkennungssequenz.
Benötigen Mg2+ und ATPTyp IV
Erkennen modifizierte, normalerweise methylierte DNA z.B. McrBCund Mrr Systeme aus E. coli
Verschiedene Restiktionsenzymtypen
Typ II
Typ II Classical: Hind III, Not I, EcoRI etccleave DNA within their recognition sequences. Most recognize
DNA sequences that are symmetric, because they bind to DNA as homodimers.
Type IIS are those like FokI and AlwI that cleave outside of their recognition sequence to one side. They are thought to bind to
DNA as monomers for the most part, but to cleave DNA cooperatively
Type IIG restriction enzymes, large enzymes
Verschiedene Restiktionsenzymtypen
Restriktionsmuster
Die Länge der Erkennungssequenz ist variabel. Einige Enzyme erkennen 4 bp (höhere Schneidefrequenz in einem Genom,
kleinere Fragmente). Andere erkennen 8 bp (geringereSchneidefrequenz, größere Fragmente)
Selten schneidende Enzyme werdenRARE CUTTERS
genannt.
4 cutter1 Schnittstelle alle 256 Basen (44)
8 cutter1 alle 65,500 Basen (48)
HincII schneidet 4 verschiedene Sequenzen.
5'-G T C GA C-3' 5'-G T T G A C-3' 5'-G T C A A C-3' 5'-G T T A A C-3’3'-C A G C T G-5' 3'-C A A C T G-5' 3'-C A G T T G-5' 3'-C A A T T G-5’
Die Konsensus Sequenz von HincII lautet:
5'-G T Y R A C-3’
RestriktionsmusterEinige Enzyme erlauben eine gewisse Variabilität und erkennen
mehr als eine Sequenz
C AT G
Restriktionsmuster
EIN SELTENES und variabel schneidendes Enzym, das häufig in der Molekularbiologie verwendet wird, ist SfiI
(aus Streptomyces fimbriatus)
5'-GGCCNNNNNGGCC-3’
Es werden zwei Erkennungssequenzen benötigt. Die beiden Sequenzen können sich auf dem gleichen oder auf
verschiedenen DNA Molekülen befinden.
Star activity
Die Restriktionsenzyme schneiden in anderen Sequenzen
• Jedes Enzym hat besondere Anforderungen
• Die Spezifität kann verloren gehen bei zum Beispiel:- falsch eingestellten Puffern- zu hoher Konzentration an Enzymen- verlängerter Inkubationszeit
Jedes Enzym hat besondere Anforderungen
How do we really do it?
How do we really do it?
H2OBufferDNAEnzyme
4 kb
3 kb2 kb
1 kb
0.5 kb
2. Molecular biology problem
You got a lineal DNA fragment of 7 Kb. You did a restriction analysis with EcoRI andHindIII and got this pattern. Can you deduce from it a possible restriction map?
M E H E+H
EcoRI: 1, 2 and 4 kb bandsHindIII: 1.5, 2.5 und 3 kb bandsE+H: 3, 1.5, 2x 1, 0.5 kb bands
Check yourself:Erstellen Sie einer Restriktionskarte
auf einer zirkulären DNA
1. Sie haben ein genomisches DNA-Fragment von 10 kb in einen Vektor kloniert. Bei der Restriktionsanalyse mit EcoRI und XhoI erhalten Sie das unten angegebene Muster. Zeichnen Sie die Restriktionsschnittstellen und die entsprechenden Abstände in eine zirkuläre Plasmidkarte ein. (3 Punkte)
Klausurfrage 2018-2019
XhoI EcoRI Eco+Xho
8
2
2x 4
2
2x1
2x 2
4
Molekularbiologisches ProblemàUnsere nächste Aufgabe
Phosphate transporter
https://pixels.com/featured/1-yeast-saccharomyces-cerevisiae-power-and-syred.html
https://antisensescienceblog.wordpress.com/2013/12/04/a-cornerstone-of-molecular-biology-the-pcr-reaction/