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Aus der Klinik für Plastische Chirurgie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. Mailänder

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______________Angiogenetische Effekte von VEGF165 nach adenoviralem Gentransfer im

ischämischen Lappenmodell der Ratte

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von

Alexandra Di Mauro, geb. Maichle

aus Hechingen

Lübeck 2008

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1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Hans-Günther Machens

2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Björn Mayer

Tag der mündlichen Prüfung: 06.05.2009

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 06.05.2009

gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach-Dekan der medizinischen Fakultät-

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung1.1 morphologische und molekulare Grundlagen der Angiogenese1.2 Strategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion

2. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit

3. Material und Methoden3.1 Material3.1.1 Vektoren3.1.3 Tiere3.1.4 ELISA3.1.5 Mikroangiographie3.1.6 real time PCR3.1.7 FACS-Analyse3.2 Methoden3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten3.2.2 Kryoasservation3.2.3 Kultivierung der Zellen3.2.4 adenovirale Transfektion3.2.5 Versuchstier und operatives Vorgehen3.2.5.1 Gruppeneinteilungen und Behandlung des Gewebes in Setting II und III3.2.5.2 operatives Vorgehen und Behandlung in Setting I3.2.6 LacZ-Färbung3.2.7 Auswertung in vitro3.2.7.1 ELISA 3.2.7.2 Transduktionsraten3.2.8.1 Auswertung in vivo3.2.8.2 Mikroangiographie3.3 Statistik

4. Ergebnisse4.1 X-gal Färbung4. 2 Transfektionsrate 4.3 Produktion von VEGF1654.3.1 Proteinexpression in vitro4.4 Effekte der modifizierten Fibroblasten4.4.1 Nachweis von VEGF165 mittels rtPCR4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von VEGF1654.4.3 Immunhistochemischer Nachweis von Kapillaren4.4.4 Mikroangiographie4.5 Effekte der modifizierten Fibroblasten in einem etablierten Lappenmodell der Ratte 4.5.1 Planimetrie4.5.2 Mikroangiographie

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4.5.3 Immunhistochemie

5. Diskussion 5.1 Therapiestrategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion5.2 Angiogeneseinduktion in unserem Modell5.3 Ausblick

6. Zusammenfassung

7. Literatur

8. Anhang

9. Danksagung

10. Lebenslauf

Liste der Abkürzungen:

ELISA= Enzyme-linked Immunosorbent Assay

rtPCR= real time Polymerase Chain Reaction

FACS= Fluorescent Activated Cell Sorter

LacZ= Gen fr die β-Galactosidase

x-gal= 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid: Substrat der β-Galaktosidase

GFP= Green Fluorescent Protein

VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor

bFGF= basic Fibroblast Growth Factor

PDGF= Platelet Derived Growth Factor

NMFB= Non Modified Fibroblasts

DMEM= Dulbeccos Mod Eagle Medium

FBS= Fetal Bovine Serum

PBS= Phosphate Buffered Saline

DMSO= Dimethyl- Sulfoxid

LZ= Langzeit

mRNA= messenger Ribonucleic Acid

MOI= Multiplicity of Infection

PFU= Plaque Forming Unit

cDNA= complementary Deoxyribonucleic Acid

POT= postoperativer Tag

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1. Einleitung

Die Plastische Chirurgie beschftigt sich hauptschlich mit dem mglichst gleichwertigen

Ersatz fehlender Teile des Krpers durch lebendes Gewebe (54, 76). Eine Conditio sine qua

non ist dabei die Sicherstellung einer adquaten Ernhrung im zu transplantierenden oder

transponierenden Gewebe durch Perfusion oder Diffusion (5, 55, 73). Sobald im Gewebe eine

ischmische Situation auftritt, wird eine Signalkaskade von molekularen Mechanismen in

Gang gesetzt, die das Ziel hat, die entstandene Ischmie mglichst schnell wieder zu

beseitigen. Zustzlich zu den zentral gesteuerten kardiovaskulren Reaktionen kommt es im

betroffenen Gewebe dabei primr zu einer Vasodilatation, um dem gesteigerten

Sauerstoffbedarf des Gewebes gerecht zu werden, sowie zur ffnung zustzlicher

arteriovenser Shuntverbindungen (‚choke vessels’). Reichen diese Gegenregulierungs-

manahmen im Gewebe nicht aus und ist die ischmische Schdigung nicht zu ausgeprgt, so

werden energieabhngige gewebestrukturelle Vernderungen in Gang gesetzt, die einem

chronisch gesteigerten Sauerstoffbedarf gerechter werden knnen: es kommt zur Ausbildung

neuer Blutgefe (83, 84).

1.1 Morphologische und molekulare Grundlagen

Ein Grundprinzip allen Lebens ist die Aufrechterhaltung eines intra- und extrazellulren

Steady-State-Zustandes sowie eines physiologischen Fliegleichgewichtes. Jegliche

Unterbrechung und Strung in der Erhaltung dieses Gleichgewichtes gefhrdet und zerstrt

schlielich das Leben des davon abhngigen Zell- und Gewebeverbundes. In allen hher

entwickelten Organismen spielt der Blutflu eine zentrale Rolle zur Sicherung der

Zellfunktion (10). Die Versorgung mit Sauerstoff und energiereichen Substraten sowie der

Abtransport von Metaboliten mu den sich stndig verndernden Bedingungen angepat

werden. Physiologische Vernderungen der Gewebedurchblutung, gleich, ob es sich um eine

Erhhung oder Verminderung handelt, mssen den vernderten energetischen Anforderungen

der Zelle quivalent sein und drfen auf keinen Fall unterbrochen werden. Geschieht dies

dennoch, fhrt eine solche Vernderung ber kurz oder lang zum Zelluntergang. Eine

Mglichkeit des Organismus, dem erhhten Energiebedarf der Zellen gerecht zu werden,

besteht neben der ffnung zuvor noch von der Durchblutung ausgeschalteter Gefe in der

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Ausbildung neuer mikrozirkulatorischer Bahnen. Dieser letztere Prozess wird dann in Gang

gesetzt, wenn keine abrupte Unterbrechung des Steady-States erfolgt, sondern der vermehrte

Energiebedarf langsam genug einsetzt, so da dem Organismus noch Zeit zur Ausbildung

neuer Kapillaren verbleibt (14, 36). Dieser Regulierungsvorgang der Neubildung von

Blutgefen erfolgt, wie jede andere Zellteilung im Organismus auch, vom ersten Moment

des embryonalen Lebens an und wird immer wieder neu in Gang gesetzt bis zum Tode des

Gesamtorganismus.

Morphologie

Angiogenese stellt einen biologischen Vorgang dar, bei dem neue Kapillaren gebildet werden

durch Aktivierung, Migration und Proliferation von Endothelzellen aus vorbestehenden

Endothel-Perizytenverbnden. Aussprossungen der aktivierten Endothelzellen dringen dabei

in das Bindegewebsstroma ein durch eine partielle Desintegration der Basalmembran im

Muttergef als ersten Schritt. Die Migration der Endothelzelle wird normalerweise

richtungsbestimmt durch angiogenetische Stimuli und untersttzt durch eine Proliferation der

benachbarten Endothelzellen. In diesem Zusammenhang spricht man von der Entwicklung

sogenannter ‚buds’ und ‚sprouts’. Nach Ausbildung eines Lumens und Fusion zweier

benachbarter aussprossender Endothelzellen beginnt der Blutflu durch die neu gebildete

Kapillare. Die folgende Abbildung 1 a fasst diesen komplizierten Vorgang anschaulich

zusammen. In vivo lassen sich solche Prozesse nur in Momentaufnahmen abbilden

(Abbildung 1 b).

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Abbildung 1a und 1b

Abbildung 1a: Schematische Darstellung der wesentlichen Schritte in der Entwicklung

kapillrer Aussprossungen, wie sie von Rhodin und Fujita (67) beschrieben wurden.

Dargestellt sind sich in Sprossen entwickelnde Kapillaren des Rattenmesenteriums nach

Analyse von Intravitalvideoaufnahmen und elektronenmikroskopischen Bildern. In der

arteriovensen Kapillarschlinge durchdringen kleine endotheliale Fortstze [1] als erstes die

Basalmembran (gepunktet), entwickeln darin zellulre Protrusionen [2] und entwickeln sich

weiter in endotheliale Auslufer mit kleinen Verzweigungen [3]. Im weiteren Verlauf

wachsen diese Auslufer in die Lnge [4]. Fibroblasten setzen sich auf diesen Auslufern fest

und transformieren zu Perizyten. Eine Extravasion von Plasma und Blutbestandteilen in den

interstitiellen Raum wird verhindert durch Perizyten, die zeitweise wie ein Schirm (‘umbrella’

- Zelle) solche Leckagen abdichten. Abbildung 1b: Wand eines kleines Blutgefes in der

frhen Angiogenesephase . Die Pfeile zeigen auf die Stelle, an der die Endothelzelle mit

kurzen Fortstzen nach auen vortritt, um dort von einer perivaskulren Zelle (Perizyt) wie

von einem Schirm (‚umbrella’) umfasst zu werden (aus Machens HG: Habilitationsschrift

1996).

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Einen weiteren Angiogenesemechanismus, aus bereits vorbestehenden Blutgefen neue

bilden zu knnen, stellt die Lngsteilung bestehender Endothelschluche (‚Intussusception’)

und das axiale endotheliale Lngenwachstum (‚Pruning’) dar (37).Von Vaskulogenese spricht

man in diesem Zusammenhang, wenn die Gefbildung durch endotheliale Vorluferzellen,

andere Stammzellen oder im prnatalen Entwicklungsstadium geschieht. Der Begriff

Angiogenese hingegen bezieht sich auf die Entstehung von Blutgefen aus echten, bereits

vorbestehenden Endothelzellen. Die auf diese Weise neu geformten Blutgefe knnen

entweder fortbestehen als reife Kapillaren oder sich weiterentwickeln zu greren vensen

oder arteriellen Gefen, wobei besonders komplexe Mechanismen im Bindegewebe eine

Rolle spielen unter Einbeziehung von Perizyten und glatten Gefmuskelzellen. Die

Weiterentwicklung solcher, in ihrem Aufbau durch kontraktile Elemente verstrkten Gefe

wird Arteriogenese genannt (8).

Grundstzlich mssen diese Vorgnge unterschieden werden von dem Wiederanschlu

vaskulrer Strukturen an bereits vorbestehende Blutgefe. Dieser Vorgang spielt im Rahmen

von Heilungsvorgngen ebenfalls eine sehr wichtige Rolle, aber entspricht keiner echten

Angiogenese im Sinne einer Neubildung von Blutgefen (9).

Molekularbiologie

Die molekularen Grundlagen der Angiogenese sind uerst komplex und weiterhin

Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Wenigstens drei verschiedene

Regulationsmechanismen spielen dabei eine Rolle: 1. Proteine, die autokrin oder von

benachbarten Zellen in parakriner Form sezerniert oder aus der Extrazellulren Matrix und

lysierten Zellen freigesetzt werden (87); 2. Direkte Zell-Zell Interaktionen oder solche

zwischen Zellen und Extrazellulrer Matrix auf der Ebene der Zelloberflchen,

Adhsionsmoleklen, Zytoskelettproteinen und Integrinen und 3. Proteolytische Enzyme,

welche entweder eine Modifikation dieser regulatorischen Substanzen,

Zelloberflchenmolekle und der Extrazellulren Matrix bewirken oder direkt mit der

endothelialen Funktion interferieren.

Proteine spielen bei der Angiogeneseinduktion eine Schlsselrolle. Diese Substanzen sind

sehr verschieden in ihrem Ursprung, Molekulargewicht, chemischer Zusammensetzung und

biologischer Wirksamkeit. Die meisten Faktoren mit hherem Molekulargewicht gehren

dabei in eine der drei folgenden Substanzklassen, welche die Angiogenese in vivo regulieren:

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1. Wachstumsfaktoren und Zytokine (42, 60); 2. Bestandteile der Zelloberflächen und der

Extrazellulären Matrix und 3. Proteasen. Um therapeutisch und klinisch für angiogenetische

Zwecke Anwendung finden zu können, sollten diese Substanzen dabei folgende

Eigenschaften besitzen: 1. Fähigkeit zur Induktion und Stimulation einer kontrollierten

Angiogenese in adultem Gewebe; 2. klar begrenzte Zelleffekte durch die Angiogenese mit

vernachlässigbaren lokalen und systemischen Nebenwirkungen; 3. effektive Dosen bereits im

Nano - und Picomolarbereich mit Dosis-Wirkungsrelation; 4. chemisch definierte Substanzen,

die problemlos zu handhaben sind und 5. breites klinisches Anwendungsfeld. Diese Kriterien

werden von der Gruppe der Wachstumsfaktoren und Zytokinen erfüllt, welche sich zudem

durch die Techniken der Biotechnologie und Molekularbiologie rekombinant in vitro

herstellen und von extern appliziert lassen (Protein-basierte Therapie). Ein weiterer Vorteil

dieser Substanzen liegt darin, daß sie parakrin von genetisch modifizierten Zellen sezerniert

werden können. In den letzten 18 Jahren wurden mehr als 30 angiogenetische Faktoren

isoliert, von denen der am häufigsten verwendeten Wachstumsfaktor mit angiogenetischer

Potenz Vascular Endothelial Growth Factor/Vascular Permeability Factor (VEGF/VPF)

darstellt. VEGF, früher auch VPF genannt, ist ein homodimeres Glykoprotein (40-45 kD),

welches in hoher Affinität selektiv an die Tyrosinkinase-Rezeptoren von Endothelzellen

bindet und sowohl parakrin von Makrophagen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen und

anderen Zellen als auch autokrin von Endothelzellen selbst synthetisiert wird. Inzwischen sind

5 verschiedene Subtypen (121, 145, 165, 189 und 206) bekannt, die sich durch

unterschiedliche Eigenschaften, an Heparin zu binden, unterscheiden (88) und von denen die

bekannteste und am häufigsten therapeutisch eingesetzte Isoform das VEGF165 darstellt (18).

VEGF wirkt in vivo und in vitro über die endothelialen Rezeptoren (31) mitogen auf diese

Zellen und entfaltet dadurch seine direkte angiogenetische Wirkung (26). In verschiedenen

Endothelzelltypen exprimiert VEGF zudem auch noch Plasminogenaktivatoren und -

inhibitoren sowie Kollagenase, was die direkte angiogenetische und exklusiv

endothelzelltypische Wirkung (91) von VEGF weiter verständlich macht. Darüber hinaus hat

VEGF165 auch auf andere Zellen wie Schwann-Zellen und Epithelzellen positive Effekte (48,

69, 75).

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1.2 Strategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion

Das klinische Wissen um die essentielle Bedeutung einer ausreichenden Gewebeperfusion fr

die Wundheilung hat schon frh innerhalb der chirurgischen Forschung zu Bestrebungen

gefhrt, Mittel und Wege zur Induktion einer therapeutischen Angiogenese in vivo zu finden

(53). Diese Forschung hat innerhalb der letzten Dekade zustzlichen Auftrieb erhalten durch

die Entwicklungen der Regenerativen Medizin, der die Plastische Chirurgie vor allem durch

das Tissue Engineering (6, 34, 81) in besonderer Weise fachlich verbunden ist. Die

therapeutische Einflussnahme auf die Bildung neuer funktioneller Blutgefe innerhalb der

plastisch-chirurgischen Forschung wird derzeit auf vier verschiedenen Wegen umgesetzt: (I)

die ein- oder mehrfache Applikation angiogenetischer Wachstumsfaktoren in das gewnschte

Zielgebiet (57), (II) die Transfektion von Zellen in vitro/vivo zur Modulation ihrer

Genexpression (20, 47), (III) die Applikation von ex-vivo prparierten Carriern zur

gesteuerten Freisetzung von angiogenetischen Proteinen und (IV) (25, 43) die Transplantation

von angiogenetisch potenten Zellen oder adulten Stammzellen des Knochenmarkes sowie des

peripheren Blutes (12, 80) (Abbildung 2).

Vasculogenese Angiogenese Arteriogenese

rekombinanteProteine (I)

andereEndothelzellen

lokaleEndothelzellen

bioaktiveCarrier (III)

Gentherapie (II)

EndothelialeVorluferzellen/

Stammzellen (IV)

zell – basierte Therapie (IV)

glatte Gefmuskelzellen

Abbildung 2: Techniken der Angiogeneseinduktion in vivo.

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2. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit

In dieser Arbeit soll der Frage nachgegangen werden, ob es mglich ist, eine therapeutische

Angiogeneseinduktion in vivo durch Zellen zu induzieren, die nach genetischer Modifikation

zu einer temporren Expression von VEGF165 fhig sind. Bezugnehmend auf die Abbildung

2 wrde dies eine Kombination gentherapeutischer Techniken (II) mit einer zellbasierten

Therapie (IV) bedeuten. Ein solches Verfahren wurde von Herrn Professor Machens

entwickelt und steht erstmalig im Rahmen dieser Doktorarbeit zur Verfgung. Solche

modifizierten Zellen mssen mehrere Bedingungen erfllen:

1. sie mssen immunologisch kompatibel mit dem Zielgewebe sein

2. sie mssen eine zeitlich begrenzte Proteinexpression gewhrleisten, um das

Expressionssystem in vivo kontrollierbar zu machen

3. sie drfen ihre Wirkung nur im therapeutisch zu behandelnden Geweben entfalten und

nicht in ortsfremde Gewebestrukturen einwandern (‚trafficking’)

4. sie sollten eine therapeutischen angiogenetische Wirkung entfalten knnen

Um diese Anforderungen berprfen zu knnen, ist es erforderlich, die lokale in vivo

Wirkung solcher modifizierter Zellen im Langzeitversuch zu untersuchen sowie ein

geeignetes Tiermodell zu verwenden, welches die berprfung eines therapeutischen

angiogenetischen Effektes ermglicht.

Fragestellung und Zielsetzung dieser tierexperimentellen Arbeit sind daher aufgeteilt in

folgende Punkte:

1. Ist es mglich, krpereigene Zellen zu entnehmen, ex vivo zu kultivieren und einem

isogenen Wirtsorganismus immunologisch kompatibel wieder zuzufhren?

2. Kann in vitro eine genetische Modifikation der Zellen vorgenommen und somit die

Produktion eines therapeutisch wirksamen Proteins (VEGF165) angeregt werden?

3. Welche lokalen Gewebereaktionen werden durch die in vivo Implantation solcher

genetisch modifizierter Zellen ausgelst?

4. Gelingt es durch VEGF165, das transient im Krper durch diese Zellen produziert wird,

die Nekrosewahrscheinlichkeit eines definierten ischmischen Gewebeareals durch

therapeutische Angiogeneseinduktion herabzusetzen?

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3. Material und Methoden

Zur Beantwortung der genannten Fragestellungen wird der Versuchsablauf wie folgt geplant:

1. Die zu modifizierenden Zellen sollen in vivo möglichst keine Immunreaktion

hervorrufen. Aus diesem Grund werden ausschließlich isogene Fibroblasten

verwendet. Diese sollen zunächst in vivo gezüchtet werden.

2. Die gewonnenen Fibroblasten sollen genetisch modifiziert werden, um VEGF165 zu

produzieren. Dazu erfolgt ihre Kultivierung und Transduktion in vitro.

3. Modifizierte Fibroblasten werden in isogenes Rattengewebe appliziert, um lokale

Langzeiteffekte untersuchen zu können.

4. Zum Nachweis eines klinischen Effektes wird eine Ischämie im Tiermodell generiert

und die modifizierten Fibroblasten werden appliziert. Dazu werden verschiedene

Gruppen gebildet.

Zielort der Untersuchungen ist chirurgisch induziertes ischämisches Gewebe, das ohne

therapeutische Intervention mindestens zu 50 % nekrotisieren würde. Um

standardisierte statistische Aussagen machen zu können, wird in allen Versuchstieren

der gleiche Gewebedefekt provoziert. Verwendet wird hierzu der von McFarlane 1965

beschriebene myofasziokutane Hautlappen mit einer definierten Größe von 8 x 2 cm.

(59). Anhand dieses Vorgehens wird ein Areal generiert, das zuverlässige

Abgrenzungen vitaler und avitaler Gewebeanteile erlaubt.

5. Die eingetretenen Effekte werden dokumentiert und klinisch, histologisch,

immunhistochemisch, proteoanalytisch sowie mikroangiographisch ausgewertet.

3.1 Materialien

3.1.1 Vektoren

Der verwendete und im Labor von Herrn Dr. Lindenmaier (GBF Braunschweig) hergestellte

Vektor ist bicistrionisch (Abbildung 3, s. Anhang), d.h. er codiert für VEGF165 und GFP

(green fluorescent protein), welches zur FACS-Analyse (FACS= fluorescent activated cell

sorter) benötigt wird. Zusätzlich wird ein so genannter Leervektor benutzt, der nur für GFP

codiert (Abbildung 4, s. Anhang). Ein weiterer, von T. Wickham (Fa. Genentech/USA)

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entwickelter Vektor wurde verwendet, um das lac-Z Gen als zustzlichen Zellmarker mit

maximaler Effizienz in den Zielzellen zu exprimieren (86).

3.1.2 Zellkultur

DMEM: Dulbeccos mod eagle medium with 0,11 /GL Na PYR, with Pyridoxine (Fa. Gibco)-

FBS (fetal bovine serum) (Fa. HtClone/USA)

Penicillin/ Streptomycin 100 IU-100 μl/ml (Fa. Bhringer)

Fungizone (Amphotericin B, 250 UG/ml) (Fa. Gibco)

L- Ascorbinsure (Fa. Sigma)

Ascorbinsurelsung: Ascorbinsure+ aqua dest. 1:10, filtersterilisiert

Vollmedium: DMEM+ 5% FBS+ 1% Pen./ Strep.+ 1% Ascorbinsurelsung+ 0,2%

Fungizone

PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlsung) (Fa. Gibco)

DMSO (Dimethyl- Sulfoxid) (Fa. Sigma-Aldrich/ England)

Trypsin 1-300 (Fa. ICN Biochemicals)

Trypsinlsung: Trypsin+ PBS 1:10, filtersterilisiert

Zellkulturflaschen 150 cm (Fa. TPP, Trasadingen/ Schweiz)

Qualifreeze Cryo- Einfriergert mit einer Abkhlrate von 1C/ min (Fa. Qualilab/ Bender&

Hobein)

Sterile Pipetten 2, 5, 10, 25 ml

Eppendorf- Pipetten 10, 100, 1000 μl

Falcons 15, 50 ml

Gefriercups 1,5 ml

Filter, Kompressen, Skalpell

3.1.3 Tiere

isogene weibliche Ratten (Sprague-Dawley Stamm, 220 g) der Firma Charles River,

Sandhofer Weg 7, 97633 Sulzfeld

alle Tierversuche erfolgen streng nach den hierfr vorgesehenen Protokollarien des

Universittsklinikum Schleswig – Holstein

die Tierversuche wurden genehmigt vom Ministerium fr Umwelt, Natur und Forsten des

Landes Schleswig-Holstein (Tierversuchsnummer: 27/g/02)

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CO2- Gas

Ketamin (Ketanest 25 mg/ ml) (Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA)

Xylazin 2% (Rompun 20 mg/ ml) (Fa. Bayer Vital GmbH, Leverkusen)

Operationsinstrumentarium

Nahtmaterial (Seralon blau 50cm, 5/0, scharfe Nadel, DSS-15)

Silastikfolie ( Fa. PharmElast, SF Medical Hudson MA/USA)

Spritzen 2, 5, 10 ml

Insulinspritzen 1ml

Kanülen gelb (0,9 x 40 mm), grün (0,8 x40 mm), braun (0,45 x 12mm)

Isotone Kochsalzlösung (NaCl)

3.1.4 ELISA

Es wurden ELISAs bei einer MOI von 10, 30 und 100 durchgeführt. Medium wurde an den

Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17, 21 und 24 entnommen und analysiert. Für alle Versuche

wurden Quantikine human VEGF165 (Fa. R&D Systems) mit den dazugehörigen Materialien

entsprechend der Anleitung des Herstellers verwendet.

3.1.5 Mikroangiographie

Venenverweilkatheter (Insyte- W 0,9 x 25 mm) (Fa. Vialon)

Gelatine (Fa. Merck, Darmstadt)

Bariumsulfat

Grüne Tinte (Fa. Lamy)

Perfusorspritzen 50ml

Prostavasin

Materialien, die bereits unter 2.1.1- 2.1.3 aufgeführt sind

3.1.6 real time PCR

Die Bestimmung der mRNA für VEGF165 im Zielgewebe wurde im Institut für Physiologie

durch Herrn Dr. Hellwig-Bürgel und Laborassistenten vorgenommen.

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3.1.7 FACS – Analyse

Zur Messung der Transfektionsrate von GFP-und bicistronisch GFP/VEGF165 transfizierten

Zellen wurde in der GBF/Braunschweig eine FACS – Analyse der modifizierten Zellen

durchgefhrt.

3.2 Methoden

3.2.1 Implantation von Silastik und Gewinnung der Fibroblasten

Zuerst wurden 10 weibliche Sprague Darley Ratten 225g mit CO2 begast und anschlieend

eine intraperitoneale Narkose mit 0,05ml Rompun und 0,325ml Ketanest gesetzt. Nachdem

die Tiere ausreichend narkotisiert waren, wurde auf dem Rcken kranial ein 2cm langer

Schnitt gemacht und von da aus die Subkutis von der Muskelfaszie gelst, um eine kleine

Hhle zu schaffen fr die anschlieende Einlage von einem 5cm langen und 1cm breiten

Stck Silastik. Danach wurde der Schnitt zugenht und die Tiere zurck in die Kfige gesetzt.

Eine Woche spter wurden die Tiere wieder wie oben narkotisiert und anschlieend das

Fibroblastenkonglomerat, das sich als Folge der Fremdkrperreaktion um das Silastik gebildet

hatte, entnommen und in ein mit 20 ml DMEM geflltes 50ml Falcon gelegt. Danach wurden

die Tiere euthanasiert. Dann wurde das Konglomerat in einem Labor der gentechnischen

Sicherheitsstufe 1 unter sterilen Bedingungen von der Silastikmembran abgelst. Das Material

wurde ausgiebig gewaschen in insgesamt 10 x 50ml Falcons mit 20ml PBS, wobei es 10mal

60 Sekunden lang krftig geschttelt wurde. Nach dem Waschen wurde das Material in einer

Petrischale mit zwei Skalpellen klein geschnitten. Danach wurde das Material in eine sterile

25ml Monovette gegeben und 60 min bei 37C mit 10ml einer Collagenaselsung (2mg

Collagenase/ ml PBS) und 5ml DMEM ohne Zustze enzymatisch behandelt, um die

Fibroblasten aus dem Kollagenverband zu lsen. Anschlieend wurde der berstand mit den

Zellen durch sterile Gaze gefiltert und mit dem brigen Gewebe noch einmal gleichsinnig

verfahren. Danach wurde die so gewonnene Suspension 4 min lang bei 1200 U/ min

zentrifugiert, sodass sich die Fibroblasten am Gefboden als Pellet abgesetzt haben. Nach

Suspension in 10 ml DMEM wurden 20 l abpipettiert, um die Zellzahl in einer

Zellzhlkammer zu bestimmen. Anschliessend wurden die Fibroblasten kryoasserviert oder

weiter kultiviert.

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3.2.2 Kryoasservation

Die Zellen wurden zu je 5 Mio. / Cup verteilt und in je 1ml DMSO/FBS- Lösung (10%

DMSO, 90% FBS) gelöst. Danach wurden die Cups in ein Cryo- Einfriergerät gestellt und bei

-80 °C über 24 Stunden langsam eingefroren. Danach wurden die Cups wieder

herausgenommen und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben, um die Zellen bei -196 °C

weiter zu asservieren.

Aus diesem Bestand konnten immer wieder Zellen entnommen werden, um sie zu kultivieren.

Für alle Versuche wurden nur Zellen aus der 4. Passage verwendet.

Dazu wurde die gebrauchte Anzahl an Cups dem Stickstoffbehälter entnommen und im

Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Dann wurden die Zellsuspensionen in DMEM aufgenommen

und aus den Cups abpipettiert und in je ein 15 ml Falcon gegeben, das jeweils schon mit 5 ml

Vollmedium gefüllt war, und 4 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der

Überstand abgesaugt und das Zellpellet wieder in 5 ml Vollmedium aufgelöst, sodass das

DMSO hinterher entfernt war und die Fibroblasten zur Zellkultivierung weiter verwendet

werden konnten.

3.2.3 Kultivierung der Zellen

Vollmedium wurde bei 37 °C im Wasserbad erwärmt und anschließend je 20 ml in eine

Zellkulturflasche gefüllt. Dann wurde eine Suspension aus 5 Mio. Zellen und 5ml Medium

(siehe oben) dazugegeben und die Zellkulturflaschen wieder in den Brutschrank gestellt. Alle

drei Tage wurde Medium gewechselt, da sich die Fibroblasten ca. alle 16- 18 Stunden teilen

und deshalb entsprechend Energie brauchen. Nachdem die Zellen konfluent waren ( Abb. 5

und 6) , wurden die entsprechenden Flaschen mit 10 ml PBS gewaschen und anschließend

wurde je 4 ml Trypsinlösung für 4min zugegeben, sodass nach sanftem Schwenken und

Beklopfen sich die Zellen ablösten. Danach wurde je 5 ml DMEM dazupipettiert, um die

Trypsinaktivität zu stoppen. Dann wurde die Suspension abpipettiert und in ein 15 ml Falcon

überführt, das 4 min bei 1200 U/min zentrifugiert wurde. Hinterher wurde der Überstand

abgesaugt und das verbleibende Pellet in 9ml Vollmedium resuspendiert. Neue

Zellkulturflaschen wurden mit 22 ml Vollmedium bestückt und die Suspension wurde auf

drei Flaschen gleichmäßig verteilt. Die Zellen wurden so nochmals über 2-3 Zellpassagen

kultiviert, bis man die gewünschte Anzahl an Fibroblasten hatte.

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Abbildung 5: präkonfluente Zellen Abbildung 6: konfluente ZellenPhasenkontrastmikroskopie: 50fache Vergrösserung

3.2.4 Adenovirale Transfektion

Wesentlicher experimenteller Bestandteil dieser Arbeit war die Transfektion der aus dem

Nativgewebe gewonnenen Fibroblasten mit einem vektortragenden Adenovirus. Nur Zellen

mit der neuen rekombinanten Kerninformation waren später dazu in der Lage, VEGF165 in das

Gewebe freizusetzen und die gewünschten klinischen Effekte hervorzubringen. Das hier zur

Anwendung kommende Verfahren des zellbasierten Gentransfers wurde von Herrn Professor

Machens entwickelt und genießt internationalen Patentschutz (PTC/EP 03/01766).

Sämtliche Arbeiten erfolgten unter streng sterilen Kautelen in einem Labor der

Sicherheitsstufe 2 mit einem Unterdruckluftsystem zum Absaugen der Luft an jedem

Arbeitsplatz.

Nachdem die Zellen über drei Zellpassagen kultiviert waren, wurde in einer Phase, in der die

Zellen gerade konfluent waren, das Medium abpipettiert und 4ml einer Suspension aus PBS,

2% FCS und Adenovirus dazugegeben. Danach wurden die Flaschen für eine Stunde unter

Abschirmung von UV- Licht auf die Schwenkbank gestellt. Hinterher wurde je 21 ml

Vollmedium dazupipettiert und die Flaschen wurden wieder über Nacht in den Brutschrank

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gestellt. Am nächsten Tag wurde das Medium abpipettiert, die Zellen trypsinisiert und

zentrifugiert und das Pellet in 1ml Vollmedium wieder resuspendiert. Die Menge an

Adenovirus wurde anhand der Zellzahl (Bsp.: 5 Mio. in einer Zellkulturflasche, 200 000 in

einem well einer 12- well Platte), dem Virustiter (Bsp.: 5x 1010 Pfu/ ml) und der

gewünschten MOI (multiplicity of infection; Bsp.: bei der MOI 100 braucht man für eine

Flasche 5x 106x 100 = 5x 108 Viren, aus der Viruslösung muss also 0,1 ml entnommen

werden) ermittelt. Die Zellzahl eines gerade konfluent gewordenen Fibroblastenrasens einer

Zellkulturflasche wurde ausgezählt, um die benötigte Virenmenge zu ermitteln.

3.2.5 Versuchstiere und operatives Vorgehen

3.2.5.1 Gruppeneinteilungen

Um die Wahrscheinlichkeit einer immunologischen Reaktion auf die modifizierten

Fibroblasten in vivo möglichst gering zu halten, wurden ausschließlich isogene Ratten des

Stammes Sprague Dawley verwendet. Alle Tiere wurden unter gleichen Bedingungen in

einem Stall der biologischen Sicherheitsstufe 1 gehalten. Nahrung und Wasser waren für alle

Tiere vor und nach der Operation frei zugänglich. Nach der Operation wurden die Tiere in

Einzelkäfigen gehalten, um Kannibalismusschäden untereinander zu vermeiden.

Die Tiere wurden in verschiedene experimentelle Gruppen unterteilt. (s. Tabelle 1) Jede

Gruppe der Ischämieversuche bestand aus 30 Tieren (ausser Gruppe 0, diese bestand aus 10

Tieren). Die Einteilung der Gruppen beinhaltete eine Untergliederung in 3 Settings. Tieren in

Setting I wurden die applizierten Substanzen bzw. Zellen während der Lappenoperation

verabreicht (Zeitpunkt 0), die Auswertung der Tiere erfolgte 7 Tage später. Tieren im Setting

II und III wurden die Substanzen bzw. Zellen zum Zeitpunkt 7 Tage (Setting II) und 14 Tage

(Setting III) vor der Lappenoperation verabreicht. Die Auswertung erfolgte ebenfalls 7 Tage

nach der Lappenoperation. Aus diesen Zeitmodi wird ersichtlich, dass der längste

stattfindende Kontakt eines Tieres mit den transplantierten Zellen 21 Tage betrug (Tiere in

Setting III). Die Zellen bzw. das Medium wurden an zwei verschiedene Transplantationsorte

implantiert: 5 Mio. Zellen, aufgelöst in 1ml DMEM bzw. 1ml DMEM in 20 parallelen

Implantationsorten im Lappen =A (Gruppen VEGF165 A, GFP A, NMFB A, DMEM A) und 2

x 5 Mio. Zellen in 2ml DMEM bzw. 2ml DMEM in 20 parallelen Implantationsstellen im

Lappen und 20 Implantationsstellen um das Zielgebiet herum =B (Gruppen VEGF165 B, GFP

B, NMFB B, DMEM B) (Abb. 7 und 8). Zusätzlich wurde eine Gruppe in Setting I gar nicht

19

behandelt (Gruppe 0), um eine eventuelle Beeinflussung des Ergebnisses durch das Medium

auszuschließen. Außerdem wurden Langzeitgruppen (VEGF165-LZ, GFP-LZ, NMFB-LZ) mit

jeweils 28 Tieren gebildet, denen je 5 Mio. Fibroblasten subkutan in das 2x 8cm große Areal

auf dem Rücken implantiert wurden. Am postoperativen Tag 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 17 wurden

jeweils zwei Tiere für die Auswertung der Mikroangiographie und zwei Tiere für die

Auswertung der Immunhistochemie und der rt PCR sakrifiziert und das Zielgewebe

analysiert. Eine weitere Gruppe von 5 Tieren wurde gebildet, um lokale

Fremdkörperreaktionen an den Implantationsorten von transplantierten Fibroblasten 7 Tage

nach Zelltransplantation zu untersuchen und um die durch X-gal blau gefärbte Galaktosidase

in mit lac-Z transfizierten Zellen an anderen Gewebelokalisationen aufspüren zu können

(trafficking). Nur in dieser Gruppe wurden die zu transplantierenden Zellen mit einem

adenoviralen Vektor, der für lac-Z kodiert, transfiziert (s.u.)

Gruppeneinteilung

Setting Iwährend Lappen-OP

Setting II7 Tage vor OP

Setting III14 Tage vor OP

Langzeit

NaCl

(1ml)

Gruppe 0

= 10 Tiere

DMEM

(1ml)

Gruppe

DMEM A SI

= 10 Tiere

Gruppe

DMEM A SII

= 10 Tiere

Gruppe

DMEM A SIII

= 8 Tiere +

Gruppe DMEM

LZ

= 28 Tiere

DMEM

(2ml)

Gruppe

DMEM B SI

= 10 Tiere

Gruppe

DMEM B SII

= 8 Tiere +

Gruppe

DMEM B SIII

= 10 Tiere

NMFB

(5x106 Zellen)

Gruppe

NMFB A SI

= 10 Tiere

Gruppe

NMFB A SII

= 10 Tiere

Gruppe

NMFB A SIII

= 10 Tiere

Gruppe NMFB

LZ

= 28 Tiere

NMFB

(2 x 5x106 Zellen)

Gruppe

NMFB B SI

= 10 Tiere

Gruppe

NMFB B SII

= 10 Tiere

Gruppe

NMFB B SIII

= 10 Tiere

GFP

(5x106 Zellen)

Gruppe

GFP A SI

= 10 Tiere

Gruppe

GFP A SII

= 10 Tiere

Gruppe

GFP A SIII

= 10 Tiere

Gruppe GFP

LZ

= 28 Tiere

20

GFP

(2 x 5x106 Zellen)

Gruppe

GFP B SI

= 10 Tiere

Gruppe

GFP B SII

= 10 Tiere

Gruppe

GFP B SIII

= 10 Tiere

VEGF165

(5x106 Zellen)

Gruppe

VEGF165A SI

= 10 Tiere

Gruppe

VEGF165A SII

= 10 Tiere

Gruppe

VEGF165A SIII

= 10 Tiere

Gruppe

VEGF165LZ

= 26 Tiere *

VEGF165

(2 x 5x106 Zellen)

Gruppe

VEGF165B SII

= 10 Tiere

Gruppe

VEGF165B SII

= 9 Tiere +

Gruppe

VEGF165B SIII

= 10 Tiere

---

lac-Z

(5x106 Zellen)

Gruppe lac-Z

LZ

= 5 Tiere

Tabelle 1: Darstellung der Versuchstiergruppen. Die Gruppen LZ wurden als zustzliche Gruppe angesehen.

Hier wurden keine Lappenoperationen vorgenommen. Diese Gruppen dienten der Untersuchung eventueller

Langzeiteffekte im Gewebe. Die Gruppe lac-Z LZ diente der Beantwortung der Frage nach dem mglichen

‚trafficking’ der Zellen nach genetischer Modifikation in andere Organe.

* 2 Tiere waren vor Auswertung verstorben.

+ durch Autokannibalismus nach der Lappen-OP konnten Tiere nicht ausgewertet werden.

8cm

2cm Implantationsstellen in Gruppen A Implantationsstellen in Gruppen B

und Langzeitgruppen

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Implantationsorte in den Gruppen A, LZ, lac-Z LZ sowie in der Gruppe B.

21

Abbildung 8 : Darstellung der Implantationstechnik in den Tieren der Settings II und III sowie in den Tieren

der Gruppen LZ sowie lac-Z LZ.

3.2.5.2 Operatives Vorgehen und Behandlung in Setting I

Die Sprague Dawley Ratten wurden wie oben beschrieben narkotisiert und der Rücken rasiert.

Dann wurde ein 2x 8 cm großes Areal auf dem Rücken eingezeichnet (Abb. 9) und mit dem

Skalpell kranial ein kleiner Hautschnitt gesetzt. Von da aus wurde mit der Schere in einer

epifaszialen Schicht das Gewebe abpräpariert und seitlich durchtrennt, sodass daraus ein

randomisierter Lappen mit einer 2cm großen kaudalen Basis entstand (Abb. 10). Dieser

Lappen enthielt kutanes, subkutanes und myogenes Gewebe durch den Einschluß des für

Ratten typischen Panniculus Carnosus. Nach Behandlung des Gewebes (Abb. 11) wurde der

Lappen replaziert und mit einer fortlaufenden Naht mit versenkten Knoten wieder eingenäht

(Abb. 12). Eine Woche später wurden die Tiere sakrifiziert und das Zielgewebe ausgewertet.

Abbildung 9 Abbildung 10

22

Abbildung 11 Abbildung 12

3.2.6 LacZ- Färbung

Zuerst wurden die Fixationslösung und die Färbelösung hergestellt. Die Fixationslösung

bestand aus 1% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS. Bsp. 10ml Fixationslösung:

270µl Formaldehyd, 80µl Glutaraldehyd, 965µl PBS. Für 1ml Färbelösung wurden 25µl

Ferrozyanat (Fe2+, entspricht 5mM), 25µl Ferrizyanat (Fe3+, entspricht 5mM), 2µl MgCl2

(entspricht 2mM) und 950µl PBS verwendet.

Sieben Tage nach Implantation der lac-Z modifizierten Zellen wurden die Implantationsorte

(Abb. 6) mitsamt den 8 x 2 cm umfassenden myokutanen Geweben entnommen, einmal mit

PBS gewaschen und 5 Minuten lang in die Fixationslösung gelegt, danach nochmals dreimal

mit PBS gewaschen und mit Färbelösung vollständig bedeckt. Nach zwei Stunden bei

Raumtemperatur wurde dem Gewebe die Färbelösung wieder entfernt und durch PBS ersetzt

(Abb. 13). Das Gewebe wurde dann mit Hilfe einer Lupenkamera fotografiert (Abb. 14) und

anschließend in Paraffin eingebettet, HE gefärbt und für die Histologie geschnitten.

Abbildung 13 Abbildung 1

23

3.2.7 Auswertung in vitro

Die in vitro Befundung umfasst die Auswertung einer ELISA-Antigen-Bestimmung und einer

Fluoreszenzmikroskopie. Ziel ist es, durch die in vitro-Analyse zunchst einen quantitativen

Nachweis einer VEGF165-Produktion durch ELISA bei verschiedenen MOIs zu fhren und die

erhaltene Transfektionsrate bei einer dann festgelegten MOI zu messen.

3.2.7.1 ELISA

Ein wichtiger Schritt vor der Arbeit im Tierexperiment war die Beantwortung der Frage nach

der Dauer und der Menge der Expression therapeutischen Proteins durch die modifizierten

Zellen. Dies gelang im in vitro ELISA. Gemessen wurde in zwei verschiedenen ELISA-

Anstzen, wovon jeder jeweils 96 Wells beinhaltete, sodass die Messungen von

verschiedenen MOI zur gleichen Zeit erfolgen konnte, um dadurch einen systematischen

Fehler so klein wie mglich zu halten. Der experimentelle Aufbau dazu war folgender:

Eine 12-well-Platte wurde beschickt mit 2x105 Fibroblasten pro well. Um sicherzustellen,

dass sich nur noch vitale Zellen auf der Platte befanden, wurde diese fr 24 Stunden unter

oben genannten Standardbedingungen kultiviert und anschlieend ein Mediumwechsel

durchgefhrt. Dabei wurden avitale Zellen und sonstiger Zelldetritus entfernt. Da alle wells

voneinander isoliert waren, war es mglich, Transfektionen mit unterschiedlicher MOI auf

derselben Platte durchzufhren und so fr den Versuchsablauf die bestmglichen

Vergleichsbedingungen zu erreichen. Die ersten drei wells wurden nicht transfiziert, sie

dienten als Kontrollgruppe. Drei wells wurden transfiziert mit einer MOI 10, drei mit einer

MOI 30 und drei weitere mit einer MOI 100. Jedes well wurde mit 2 ml Vollmedium befllt

und anschlieend kultiviert. Jeden Tag zur selben Zeit wurde ein erneuter Mediumwechsel

durchgefhrt. Das dabei gewonnene Medium wurde gut resuspendiert und an den Tagen 1, 3,

5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24, 28, 35, 42, 49 und 56 in Proben zu jeweils einem Milliliter pro

Ansatz asserviert. Die Aufbewahrung der Proben erfolgte nach Schockgefrierung (-196 C)

bei einer Temperatur von –80 C.

Zur Auswertung der Proben wurde ein ELISA-Kit (s. Kap. 2.2) verwendet. Fr jeden zu

untersuchenden Tag wurde von jeder MOI-Probe der asservierte Ansatz im Wasserbad schnell

aufgetaut, 100 l des Inhaltes entnommen und der Rest in flssigem Stickstoff wieder

schockgefroren. Streng nach den Angaben des Herstellers wurde der VEGF165-Gehalt jeder

Probe nach guter Resuspendierung im ELISA gemessen.

24

3.2.7.2 Transfektionsrate

Fr die Beurteilung der Effektivitt des Modifikationsverfahrens und die mgliche

Korrelation zwischen der Konzentration therapeutischen Proteins und der Zahl transfizierter

Zellen war es wichtig, die Transfektionsrate in der Zellkultur zu bestimmen. Teil des Genoms

der verwendeten Adenoviren war das Gen fr GFP. In der GBF/ Braunschweig wurde eine

Analyse der fluoreszierenden Zellen unter Leitung von Dr. Lindemann durchgefhrt.

3.2.8.1 Auswertung in vivo

Die in vivo-Befundung erfolgte durch computerassistierte klinisch-planimetrische Messung

der Vernderung von Flchenverhltnissen, Histologie entnommener Biopsate (HE und

PECAM fr Kapillardichte), rt-PCR zum m-RNS Nachweis von produziertem VEGF165 und

eine mikroangiographische Darstellung des Gefbettes (>20 mikrometer).

Fr die Auswertung wurden alle Tiere mit einer berdosis des Narkotikums euthanasiert. Der

Lappen wurde standardisiert fotografiert. Die Rnder der Nekrosezone und des vitalen

Lappenteiles wurden nach Auflegen einer Klarsichtfolie abgezeichnet, um ihre

Grenverhltnisse bestimmen zu knnen (Abb. 15) Im letzten Schritt wurden Gewebeproben

des Lappenareals gewonnen. Dazu musste der Lappen erneut gehoben werden. Der initiale

Schnitt wurde 0,5 cm kaudal des Stieles gefhrt. Er reichte bis etwa 0,5 cm auerhalb der

Lappengrenzen hinaus. Diese Prparation auerhalb der Lappengrenzen ermglichte eine

sptere histologische Darstellung der Regionen, die sich distal der nekrotischen Areale

befanden. Der Lappen wurde bis zu seinem apikalen Ende vom Untergrund gelst und in

Lngsrichtung halbiert. Die beiden Teile wurden asserviert (eine Hlfte in flssigem

Stickstoff bei –196C, die andere in Formalinlsung) (Abb. 16).

Die Tiere der Langzeitgruppe wurden am jeweiligen Auswertungstag 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,

17, 21, 24, 28, 35, 42, 49 und 56 nach Gewebebehandlung euthanasiert. Das Zielgewebe

wurde an seinen angezeichneten Grenzen gehoben (bei diesen Tieren ist keine Nekrosezone

vorhanden) und quer halbiert. Der apikale Teil wurde in sich wiederum in Lngsrichtung

halbiert. Ein Teil wurde kryokonserviert (Schockgefrierung bei –196C), der andere in

Formalinlsung asserviert fr eine sptere CD 31 Frbung zum Nachweis von Endothelzellen

und zur leichteren Quantifizierung von Kapillaren. Der basale Teil, an dem sich der

Lappenstiel befand, wurde nicht als Ganzes asserviert. Mit einer Prparierschere wurde hier

vorsichtig die unterste Gewebsschicht gelst. Etwa 0,5 cm Zellmaterial sollten so gewonnen

und schockgefroren werden.

25

Abbildung 15Abzeichnen der Nekrosezone und der Lappengrenze zur planimetrischen Ausmessung des vitalen Lappenanteils

in %

in flüssigen

Stickstoff in Formalin

(rtPCR) (Immunhistochemie)

Abbildung 16Schematische Darstellung der Auswertung der Ischämiegruppen

26

3.2.8.2 Mikroangiographie

Zur Herstellung des Kontrastmittels, welches sowohl röntgendicht als auch niedrig viskös sein

musste, um selbst kleinste Blutgefäße zu erreichen, wurde eine Mischung aus 40g

Gelatinepulver und 200 ml Wasser (flüssige Gelatine) bei 100°C erhitzt und warm gehalten.

Dann wurde das betreffende Versuchstier anästhesiert und bei Rückenlage fixiert. Nach

Freipräparation der linken Carotis wurde diese mit einer 22er Braunüle kanüliert. Hierein

wurden 40 µg Prostavasin, aufgelöst in 0,5 ml NaCl 0,9%/ 100g Ratte injiziert und 30 sec.

abgewartet. Nach Entnahme von 1,5ml Blut/ 100g Ratte wurde eine Mischung aus flüssiger

Gelatine, Bariumsulfat und Tinte (brillantgrün) in einem Mischungsverhältnis von 1: 2: 0,05

und in einer Menge von 10ml/ 100g Ratte bei noch vitaler Herzfunktion appliziert (Abb. 17

und 18).

Abbildung 17 Abbildung 18

Eine Grünfärbung aller 4 Extremitäten sowie der Ohren und der Augen wurde als Zeichen

dafür gewertet, dass die Mischung die peripheren Gefäße erreicht hat (Abb. 19 - 22).

Abbildungen 19 – 22: (von links nach rechts)

27

Danach wurde das Tier ber 24 Stunden bei 4C gelagert. Am nchsten Tag wurde das

betreffende Versuchstier nachrasiert und das Zielgewebe entnommen (Abb. 19 und 20). In der

Radiologie erfolgte dann die rntgenologische Darstellung der Gefe mittels der digitalen

Mammographie (24 kV bei 9mAs konventionell) (Abb. 23 und 24).

Abbildung 23 Abbildung 24

Die so gewonnenen digitalen Bilder wurden quantitativ ausgewertet durch Auszhlung der

Gefabgnge/cm.

3.2 Statistik

Alle Ergebnisse sind als Mittelwert Standardabweichung dargestellt. Die Signifikanz des

Unterschieds der Varianzen zweier Gruppen wurde mit dem F-Test ermittelt. Paarweise

Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Students t-Test durchgefhrt. Die

Varianzanalyse mehrerer Gruppen erfolgte durch den ANOVA Test. Das Signifikanzniveau

wurde auf α = 0,05 festgelegt. Eine Signifikanz lag vor, wenn p≤ 0,05.

4. Ergebnisse

4.1 X-gal- Färbung

Die Gegenfrbung der vom lac-Z Gen exprimierten und intrazellulr verbleibenden -

Galaktosidase durch X-gal ergab, dass die Zellen 10 Tage nach Implantation noch an

derselben Stelle zu finden waren, es hatte also keine Migration stattgefunden. Die

Blaufrbung bewies, dass die Zellen noch vital waren aufgrund der kurzen Halbwertszeit von

28

-Galaktosidase. Histologisch konnte man keine Anhufung von polymorphonukleren Zellen

erkennen, was darauf schlieen lsst, dass keine Immunreaktion gegen die implantierten

Zellen stattgefunden hat (Abb. 25 und 26). Die Untersuchung von Leber, Lunge und Gehirn

ergab keinen Nachweis LacZ positiver Zellen.

Abbildung 25: HE-Frbung , Abbildung 26: HE-Frbung,Vergrsserung 100x Vergrsserung 200x

4.2 Transfektionsrate

Andere Vorarbeiten hatten bereits ergeben, dass eine optimale Transfektionsrate bei einer

MOI von 100 zu erzielen war. Bei dieser MOI fanden sich die relativ hchsten

Transfektionsraten bei gleichzeitig niedrigster Mortalitt transfizierter Zellen. Die FACS –

Analyse der nicht transfizierten und trotzdem fluoreszierenden Zellen lag bei 0,4%. Bei den

allein mit GFP transfizierten Zellen lag die Transfektionsrate bei 95,3 % und bei dem

bicistrionischen Vektor, der VEGF165 zusammen mit GFP codiert, war die Transfektionsrate

88,0 % (Abb. 27).

29

Nicht transfizierte Zellen VEGF165 transfizierte Zellen GFP transfizierte Zellen

MOI 100 MOI 100

egfp egfpegfpegfp egfpegfp

Abbildung 27Ergebnisse der FACS-Analyse

4.3 Produktion von VEGF165

4.3.1 Proteinexpression in vitro

Kontrolltransfektionen mit einer niedrigeren MOI von 10 erbrachten zwar eine wesentliche

Steigerung der Proteinexpression gegenüber nicht transfizierten Fibroblasten (Abb. 28 und

29), jedoch war die Expression insgesamt nur mit Hilfe eines hochsensitiven ELISA im

niedrigen picogramm-Bereich zu messen. Allerdings lag die Proteinexpression der nicht

transfizierten Fibroblasten schon fast unterhalb der Nachweisgrenze.

VEGF165 MOI10, I

0

5

10

15

20

25

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165 11 18 19 6,3 6,8 12 2,2 6,3 0 1,1

1 3 5 7 9 11 13 17 21 24

VEGF165 MOI10, II

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165 7,4 3,9 5,1 0,5 3,3 5,1 1,6 2,2 0,5 0

1 3 5 7 9 11 13 17 21 24

30

Abbildung 28

nmFB

0

0,05

0,1

0,15

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 3 5 7 9 1 1 1 2 2

Abbildung 29

Weitere Transfektionsversuche mit einer MOI von 30 zeigten, dass die Proteinexpression

deutlich gegenüber den Werten bei einer MOI von 10 zu steigern war (Abb. 30).

VEGF165 MOI 30, I

0

50

100

150

200

250

300

350

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165 72 317 183 59 41 25 16 25 15 10

1 3 5 7 9 11 13 17 21 24

VEGF165 MOI30, II

0

50

100

150

200

250

300

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165 155 251 118 59 37 24 82 30 35 12

1 3 5 7 9 11 13 17 21 24

Abbildung 30

Bei einer MOI von 100 zeigte sich eine weitere Steigerung der Proteinexpression (Abb. 31).

Deutlich war hier wie auch schon bei den Versuchen mit einer MOI von 30, dass ein

Expressionsmaximum am 3. Tag nach Transfektion zu erreichen war. In den folgenden 10

Tagen fiel die Proteinexpression auf einen Basislevel und war danach nur im sehr niedrigen

Bereich messbar gewesen. Andere Versuche hatten ergeben, dass eine weitere Steigerung der

MOI zu keiner wesentlichen Verbesserung der Transfektionsrate wie der Proteinexpression

führte. Deshalb wurden alle folgenden Experimente mit genetisch modifizierten Fibroblasten

bei einer MOI von 100 durchgeführt.

31

VEGF165 MOI100, I

0

200

400

600

800

1000

Tage

pg/m

l

VEGF165

VEGF165 336 890 781 364 261 189 152 0 130 49,4

1 3 5 7 9 11 13 17 21 24

Abbildung 31Proteinexpression bei einer MOI von 100: An Tag 3 konnten fast 1000 pg VEGF165 gemessen werden.

4.4 Effekte der modifizierten Fibroblasten in vivo

4.4.1 Nachweis von VEGF165 mittels rtPCR

Aus dem Zielgewebe wurden Gewebeproben an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 24,

28, 35, 42, 49 und 56 nach Gewebebehandlung entnommen. Es fand sich nur während des 1.,

3. und 5. Tages eine signifikante Zunahme der mRNS im Zielgewebe (Abb. 32). Die

maximale Produktion von VEGF165 der VEGF156-LZ Gruppe fand dabei am 3. Tag nach

Zellapplikation statt. Die mRNS Produktion der Kontrollgruppen (GFP und nmFB) ging im

gesamten Zeitraum nicht über den Basislevel hinaus.

Abbildung 32Ergebnisse der real time pcr: mRNS Produktion der VEGF165-LZ Gruppe im Vergleich zu nicht modifizierten

Zellen. Es wurden jeweils 2 Tiere ausgewertet.

VEGF

0

100

200

300

400

1 3 5

%

Tage post operationem

32

4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von VEGF165

In einem eigens entwickelten Verfahren (Dr. Söllner) gelang die spezifische Färbung von

VEGF165 im Zielgewebe (gestrichelte Linie in Abb. 33). Dabei konnten auch Zellen

beobachtet werden, die eine besonders intensive Färbung angenommen hatten und als

modifizierte Fibroblasten mit maximaler VEGF165 Produktion identifiziert wurden (Inset in

Abb. 33).

Abbildung 33: Färbung VEGF165 positiver Zellen im Zielgewebe: Vergrösserung 100x und 400x

4.4.3 Immunhistochemischer Nachweis von Kapillaren

Wir konnten eine deutliche Zunahme der Anzahl von Kapillaren pro Gesichtsfeld nur

innerhalb der ersten 7 Tage nach Zellapplikation feststellen. Eine signifikante Steigerung der

Kapillarzahl fand sich dabei interessanterweise nur am Tag 1 nach Zellapplikation (Abb. 34;

Tab. 2 s. Anhang).

33

Immunhistochemie Langzeitgruppen

0

20

40

60

80

100

120

140

1 3 5 7 9 11 14Tage post operationem

Kap

illar

en/G

esic

htsf

eld

VEGF165GFPnmFB

Abbildung 34: Graphische Darstellung der Ergebnisse der Immunhistochemie der Langzeitgruppen: Die anfangs verzeichnete höhere Kapillardichte der therapeutischen Gruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen

nahm im Verlauf ab. Jede Gruppe bestand aus jeweils 18 Tieren, von denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen

Tagen post operationem ausgewertet wurden. Aus jedem Tier wurden 4 Gwebeproben entnommen.

*P < 0,05

4.4.4 Mikroangiographie

Mikroangiographisch fanden wir nur innerhalb der ersten 5 Tage nach Zellapplikation in der

therapeutischen Gruppe eine signifikante Zunahme der Blutgefäßanzahl pro cm² Zielgewebe.

Ab dem 7. Tag nach Zellapplikation war bereits eine Normalisierung der Gefäßanzahl

festzustellen (Abb. 35, Tab. 3 s. Anhang).

*

34

LZ-Mikroangiographie

05

101520253035404550

1 3 5 7 11 17Tage post operationem

Blut

gefä

ße/c

m²

VEGF165GFPnmFB

Abbildung 35: Graphische Darstellung der Ergebnisse der Mikroangiographie der Langzeitversuche: Nach einer Woche nahm die Dichte des Gefnetzes in der therapeutischen Gruppe wieder ab.

Jede Gruppe bestand aus 18 Tieren, von denen jeweils 2 Tiere an den einzelnen Tagen post operationem

ausgewertet wurden.

4.5 Effekte der modifizierten Fibroblasten in einem etablierten Lappenmodell der

Ratte

4.5.1 Planimetrie

Die Ausmessung der vitalen Lappenanteile, gemessen an der Gesamtlappenflche, ergab fr

fast alle Gruppen vergleichbare Werte ohne signifikante Unterschiede, verglichen mit Gruppe

0, die keinerlei Behandlung nach Lappenbildung erhalten hatte. Einzig in der Gruppe

VEGF165 B im Setting II war eine signifikante Vergrerung vitaler Lappenanteile

gegenber den Kontrollgruppen zu beobachten (P < 0,05) (Abb. 36und Abb. 37, Tab. 4 s.

Anhang). In dieser Gruppe waren die VEGF165 – exprimierenden Fibroblasten 7 Tage vor

Lappenhebung in das Zielgewebe, das 2 x 8 cm messende Lappengebiet, sowie in den

umgebenden Rand, welcher nach Lappenhebung den spteren Wundrand darstellen wrde,

injiziert worden.

35

Ergebnisse Planimetrie

*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Setting I Setting II Setting III

vita

les

Lapp

enge

web

e(%

) VEGF165 AVEGF165 BGFP AGFP BnmFB AnmFB BDMEM ADMEM BGruppe 0

Abbildung 37: Graphische Darstellung der Planimetrie: Nur Gruppe VEGF B des Settings II zeigt einen signifikant höheren Anteil an vitalem Lappengewebe im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Jede Gruppe eines

Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Planimetrie standen alle Tiere zur Verfügung.

*P < 0,01

Abbildung 37: Beispiele aus den Gruppen DMEM B, NMFB B, GFP B und VEGF165 B im Setting II (von links nach rechts)

36

4.5.2 Mikroangiographie

Mikroangiographisch konnte der Verdacht bestätigt werden, dass nur in der Gruppe

VEGF165B eine signifikante Zunahme der neu gebildeten Blutgefäße zu verzeichnen war.

Dieses Ergebnis war gegenüber allen anderen Gruppen signifikant (Abb. 38, Tab. 5 s.

Anhang).

Mikroangiographie

*

0102030405060708090

SettingI Setting II Setting III

Blu

tgef

äße/

cm² VEGF A

VEGF BGFP AGFP BNMFB ANMFB BDMEM ADMEM BGruppe 0

Abbildung 38: Graphische Darstellung der Mikronagiographie der Ischämiegruppen: Hier bestätigte sich das Ergebnis der Planimetrie. Jede Gruppe eines Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der

Mikroangiographie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe zur Verfügung.

* P < 0,01 versus Kontrollen; MW ± SD

37

4.5.3 Immunhistochemie

Wie zu erwarten, fand sich ebenfalls nur in der Gruppe VEGF165 B eine signifikante

Zunahme der Anzahl von Kapillaren pro Gesichtsfeld (Abb. 39, Tab. 6 s Anhang).

Immunhistochemie Ischämiegruppen

*

0102030405060708090

100

Setting I Setting II Setting III

Kap

illar

en/G

esic

htsf

eld

VEGF165 A

VEGF165 B

GFP A

GFP B

nmFB A

nmFB B

DMEM A

DMEM B

Gruppe 0

Abbildung 39: Graphische Darstellung der Immunhistochemie der Ischämiegruppen. Jede Gruppe eines Settings bestand aus 10 Tieren. Für die Auswertung der Immunhistochemie standen jeweils 5 Tiere jeder Gruppe

zur Verfügung. Aus jedem Tier wurden 4 Gwebeproben entnommen.

* P < 0,01 versus Kontrollen; MW ± SD

38

5. Diskussion

Die Komplexitt der hier erbrachten Ergebnisse lsst es notwendig erscheinen, einige Aspekte

nher zu erlutern. Im Folgenden soll daher in Anlehnung an die Abb. 2 zunchst auf die

derzeit verwendeten Therapiestrategien zur Angiogeneseinduktion eingegangen werden. Im

Anschlu daran sollen die Ergebnisse hinsichtlich des verwendeten Lappenmodelles und der

hier gefundenen therapeutischen Effekte durch VEGF165 diskutiert werden.

5.1 Therapiestrategien zur therapeutischen Angiogeneseinduktion

Protein-basierte Therapieansätze (I)

In den 1980er und 90er Jahren wurde mit den wachsenden Erkenntnissen ber die

molekularen Mechanismen der Angiogeneseinduktion und nach der erfolgreichen

Erstanwendung von ‚Angiotropin’ zur Verbesserung der berlebensrate ischmisch

gefhrdeter Lappengewebe (30) schnell der Ruf laut nach der klinischen Umsetzung protein-

basierter Studien. Weiterfhrende tierexperimentellen Studien, welche hauptschlich mit

VEGF165 und bFGF als angiogenetische Signalproteine in vivo durchgefhrt wurden, ergaben

jedoch durchaus widersprchliche Ergebnisse (24). Dies mag zum Teil an den

unterschiedlichen Tiermodellen, Applikationsmodi und Wirkstoffkombinationen in den

jeweiligen Studien gelegen haben (51) (Tab. 7, s Anhang). Unter anderem auch wegen der

relativ kurzen Halbwertzeit applizierter therapeutischer Proteine in vivo besteht inzwischen

Einigkeit darber, dass eine echte Angiogeneseinduktion durch die proteinbasierte Therapie

zumindest mittels VEGF165 allein primr nicht stattfindet und stattdessen eine Stimulierung

vasodilatatorischer, NOS-gesteuerter Prozesse im Vordergrund steht (3, 33). Hierbei ist es

auch in Abhngigkeit vom verwendeten tierexperimentellen Modell von entscheidender

Bedeutung, ob das Zielgewebe ber eine bereits ausreichende vaskulre Kapazitt verfgt

(z.B: 3 x 9 cm dorsaler Mc Farlane flap mit sakralen Stielgefen der Ratte) oder ob das

Zielgewebe primr hypovaskularisiert ist (z.B. 2 x 8 cm randomisierter dorsaler Mc Farlane

flap ohne sakrale Stielgefe der Ratte). Bisher stellen experimentelle Studien zur protein-

basierten Therapie ischmischer Gewebe oder zur verbesserten Wundheilung mit mehr als 75

% Literaturanteil (PubMed) die grte Gruppe innerhalb der Techniken zur therapeutischen

Angiogeneseinduktion fr die Plastische Chirurgie dar. Die meisten Publikationen zu diesem

Thema aus den Jahren 2003 und 2004 hatten dabei noch die Applikation von VEGF165

beschrieben.

39

Gentransfer (II)

Zahlreiche Technologien haben inzwischen Anwendung gefunden für den therapeutischen

Gentransfer. Hierzu gehören physikochemische Methoden des Gentransfers wie DNS-

Liposomenkomplexe und DNS-ummantelte Mikroprojektile sowie viral gesteuerte Techniken

mittels rekombinanten Retroviren und Adenoviren. Alle diese Techniken haben das gleiche

Ziel: die Einführung und Expression eines therapeutischen Genes in eine Zielzelle oder ein

Zielgewebe. Hierbei müssen grundsätzlich zwei verschiedene Verfahren unterschieden

werden, nämlich die Transfektion (transiente Veränderung des genetischen Materials in einer

Zelle) und die Transduktion (permanente Veränderung des genetischen Materials in einer

Zelle). Der Hauptunterschied liegt in der Frage, ob die genetische Modifikation der Zellen

temporär (z.B. Plasmid-DNS, adenovirale Vektoren) oder permanent (z.B. retrovirale

Vektoren) erfolgen soll. Bei ersterem werden die übertragenen Gene weder in das Genom der

Zielzellen integriert noch haben sie die erforderlichen genetischen Bausteine, die ihnen eine

Replikation zum Zeitpunkt der Zellmitose gestatten würde. Die Gene haben nur für eine

bestimmte Zeit Bestand, in der sie exprimiert werden können, was durchaus einen

signifikanten und therapeutisch relevanten Zeitraum bedeuten kann. Bei der permanenten

genetischen Modifikation wird das entsprechende Gen in das Genom der Zielzellen stabil

integriert oder das Gen enthält zusätzliche genetische Informationen, die eine Replikation der

Gene bei der Zellmitose erlauben. Solche Gene haben Fortbestand und werden bis zum

Untergang der Zielzelle exprimiert werden. Darüber hinaus werden die entsprechenden Gene

im Rahmen der Zellteilung ebenfalls repliziert und an die jeweils nächste Generation von

Tochterzellen weitergegeben. Ein wesentlicher Unterschied besteht auch hinsichtlich des

Applikationsortes: wird die genetische Veränderung der Zellen in vivo durchgeführt, so

spricht man von direktem Gentransfer. Wenn die Zellmodifikation dagegen ex vivo erfolgt, so

werden nur die relevanten Zielzellen außerhalb des Organismus selektiv modifiziert und

anschließend an ihren Zielort im Gewebe verbracht. Man spricht dann von zell-basiertem

Gentransfer (Abb. 40) (22). Für die therapeutische Angiogeneseinduktion hat sich gezeigt,

dass eine Kontrollierbarkeit der Genexpression in vivo von besonderer Bedeutung ist, um eine

überschießende Bildung neuer funktionsloser Blutgefäße zu vermeiden.

40

Abbildung 40: zell-basierte Gentherapie: Ex vivo Transfektion von Zellen, die danach in das Zielgebiet implantiert werden

Direkter Gentransfer in vivo

Mit den zunchst sehr optimistischen Erwartungen in die Gentherapie Anfang der 1990er

Jahre nahm diese Technologie auch bald Einzug in die Angiogeneseforschung. Zunchst

waren es vor allem Studien aus dem kardiovaskulren Bereich, die schon bald in Phase I

Studien mndeten. Fr die direkte Transfektion des ischmisch gefhrdeten Gewebes werden

zurzeit vor allem Plasmide und Adenoviren erfolgreich verwendet (21, 28). Doch obwohl die

Genexpression in vivo erfahrungsgem nur temporr ber maximal 7-14 Tage erfolgt,

wurden auch fr adenovirale Vektoren (78) und fr DNS-Plasmide (70) pathologische

Gefbildungen in vivo gefunden. Eine klinische Durchsetzbarkeit solcher direkten

Transfektionsverfahren in vivo wird sich nur erreichen lassen, wenn eine Mglichkeit besteht,

die transgene Expressionskinetik in vitro zu messen, bevor der Vektor in vivo gelangt (77).

Hinzu kommt, dass fr diese Therapieformen, bei denen adenovirale Vektoren die effektivere

Transfektionsrate haben, aber dabei die weitaus hchste antigene Belastung im

Wirtsorganismus darstellen, bisher keine Lsung fr die bestehenden Probleme der

ungerichteten Transfektion aller erreichbaren Zellen im Zielgebiet, besonders bei

amphotrophen Vektoren und der daraus resultierenden Unkalkulierbarkeit von Qualitt und

Quantitt der Proteinexpression, dargestellt werden knnen. Damit stehen einer klinischen

Umsetzbarkeit dieser Therapieform weiterhin erhebliche Bedenken gegenber.

Bioaktive Carrier( III)

Zellfreie biodegradierbare Trger, welche als ‚slow-release-systems’ angiogenetische

Signalproteine ber einen lngeren Zeitraum von 1-2 Wochen freisetzen knnen, werden oft

41

als ‚Medizinprodukte’ eingestuft und haben dadurch das Interesse der Industrie auf sich

gezogen. Anders als bei (II) oder (IV) werden dabei zumeist keine autologen Zellen

verwendet, welche immer eine Individualrezeptur darstellen und eine den pharmazeutischen

Markt interessierende interindividuelle Gabe dadurch ausschlieen (49). Solche Carrier lassen

sich im wesentlichen in 2 Gruppen unterteilen: Polymerfestkrper aus Polyester oder

Polyanhydrite, bei denen inkorporierte Signalproteine weniger durch Diffusion in die

Umgebung sondern mehr durch Hydrolyse des Festkrpers selbst freigesetzt werden und

Hydrogele, die als dreidimensionale Polymernetzwerke H2O aufnehmen knnen und eine

kontinuierliche Diffusion von inkorporierten Signalstoffen aus dem Polymerverbund erlauben

(92). Grundstzlich mssen bei diesen Verfahren natrlich die carrierspezifischen lokalen

inflammatorischen und damit auch angiogenetischen Effekte nach Implantation in vivo

bercksichtigt werden. Innerhalb der Plastischen Chirurgie haben Rinsch et al. alternativ

genetisch modifizierte allogene Myoblasten in polymeren Strukturen mikroencapsuliert und

fr bFGF sogar unter Ischmiebedingungen therapeutische angiogenetische Effekte im 3 x 8

cm McFarlane Lappen der Ratte nachweisen knnen (68). Unabhngig davon werden auch

adulte differenzierte Zellen zur Induktion einer Angiogenese eingesetzt, weil sie selbst, wenn

auch in deutlich geringerem Ausma als genetisch modifizierte Zellen, angiogenetische

Signalproteine sezernieren (16).

Stammzellen und endotheliale Vorläuferzellen (IV)

Grundstzlich wird zwischen zwei Kategorien von Stammzellen unterschieden: totipotente

embryonale Stammzellen (ESZ) aus Blastozysten stammend sowie pluri- und multipotente

adulte Stammzellen (ASZ) aus differenzierten Geweben unterschiedlichen Ursprunges. Das

grte regenerative Potential besitzen die ESZ, da sie nicht nur zu Derivaten des Ekto-, Meso

– und Endoderms als Organe differenzieren, sondern einen kompletten Organismus bilden

knnen. Die Therapie mit ESZ wird besonders in Deutschland weiterhin kontrovers diskutiert

und soll hier vorerst nicht dargestellt werden. Die frhe Begeisterung fr das enorme

regenerative Potential dieser Zellen in vitro wich allerdings bald der Erkenntnis, dass diese

neuen Gewebeverbnde in vivo auch eine Vaskularisierung erfahren mssen, da sie ansonsten

einer progredienten Ischmie und sukzessivem Zelluntergang anheim fallen. Interessant und

neu ist die Erkenntnis, dass auch differenzierte Zellen unter bestimmten Bedingungen ex vivo

dedifferenziert werden knnen, um sich mesodermal neu zu entwickeln (65). Tatschlich sind

verschiedenene Typen von Stammzellen imstande, de novo Blutgefe im Organismus zu

bilden. Dieser Vorgang wurde vor der Entdeckung endothelialer Vorluferzellen (1) im

adulten Organismus nicht fr mglich gehalten und wird inzwischen als postnatale

42

Vaskulogenese bezeichnet. Der klinische und experimentelle Einsatz einer therapeutischen

Vaskulogenese erweitert natrlich die medizinischen Mglichkeiten, welche experimentell

bislang aber vor allem im kardiovaskulren Bereich genutzt wurden.

Zell-basierter Gentransfer (Kombination aus II und IV)

Als Carrier der Proteinexpression dienen hier vitale Zellen, die im Tierexperiment isogen

oder auch autolog gewonnen werden knnen. Diese Zellen werden ex vivo transfiziert. Damit

erhalten sie die gewnschte genetische Information (oder eine Kombination mehrerer Gene)

und knnen auerdem in vitro auf ihre Funktionalitt getestet werden. Dadurch lsst sich eine

genauere Quantifizierung der zu erwartenden Proteinexpression in vivo erreichen. Die

transfizierten Zellen werden genau in das gewnschte Zielgebiet transplantiert, sodass ein

vektorgebundener (oft viraler) antigener Kontakt im Empfngerorganismus weitgehend

entfllt und allenfalls noch die Strukturvektorproteine an der Zielzellenoberflche prsentiert

werden knnen. In anderen Fachbereichen (z.B. Kardiologie und Kardiochirurgie) haben

zell-basierte Therapien bereits eine gewisse klinische Anwendung in Phase 1 und 2 Studien

erfahren (44). Dabei wurden dem Zielgebiet entsprechend vor allem Myoblasten und

Kardiomyozyten verwendet (4, 46). In anderen Studien wurden NIH3T3 – Zellen (29),

autologe glatte Gefmuskelzellen (23) oder mikrovaskulre Endothelzellen (19) erfolgreich

zur Angiogeneseinduktion in vivo genutzt. Die besondere Rolle der dosierten

Proteinfreisetzung zeigten Arbeiten mit retroviral transfizierten Myoblasten, welche

kontinuierlich VEGF164 freisetzten: 70 - 100 ng VEGF164/106 Zellen/Tag stellten demnach im

Mausmodell eine ‚Signalgrenze’ zur Induktion von Hmangiomen dar. Hingegen wurden im

gleichen Modell bei einer kontinuierliche Freisetzung von weniger als 70 ng VEGF164/106

Zellen/Tag stabile arteriogenetische Blutgefstrukturen gebildet (63). Auch fr den

gesamten Bereich des Tissue Engineering und innerhalb der sich aktuell entwickelnden

Regenerativen Medizin wird dieser Therapieform zunehmende Beachtung geschenkt. So

konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Zeitpunkt und Applikationsort von VEGF165

exprimierenden isogenen Fibroblasten eine entscheidende Bedeutung fr das klinische

Outcome nach Induktion einer Ischmie im randomisierten Lappengewebe der Ratte haben.

So konnten wir zeigen, dass eine temporre VEGF165 – Expression im Zielgewebe nur

innerhalb einer Woche vor Ischmiebeginn eine therapeutisch relevante Angiogenese zu

induzieren vermag. Dabei ist es entscheidend, nicht nur das ischmische Zielgewebe sondern

auch dessen Umgebung in die Angiogeneseinduktion mit einzubeziehen. Hingegen sind die

angiogenetischen Effekte bei einer Genexpresession 2 Wochen vor Ischmiebeginn im

Zielgewebe und dessen Umgebung zum therapeutisch relevanten Zeitpunkt bei einer

43

Monoexpression von VEGF165 allein nicht mehr therapeutisch effektiv. Diese

therapeutischen Erfolge sind ebenfalls nicht erzielbar, wenn die modifizierten Zellen erst

zum Zeitpunkt des Ischmiebeginnes in vivo appliziert werden, was durch den

Wirkungsmechanismus der exprimierten Proteine verstndlich wird. Da nur ortsstndige

Endothelzellen zur Angiogenese angeregt werden, welche unter Ischmiebedingungen

bereits eine lokale Stimulation durch freigesetzte Signalproteine erfahren, wird eine

zustzliche Expression von Angiogenesefaktoren keine nennenswerten therapeutischen

Effekte generieren knnen. Neue Studien haben deshalb zum Ziel, neben den Signalprotein-

exprimierenden Zellen auch endotheliale Progenitorzellen oder periphere Stammzellen zu

transplantieren, die selbst eine de novo Gefbildung im Sinne einer Vasculogenese

induzieren oder eine Arteriogenese im Zielgebiet untersttzen knnen (32).

5.2 Angiogeneseinduktion im hier dargestellten Modell

In unserem Modell bedienten wir uns des zell-basierten Gentransfers. Der Vorteil dieses

Verfahrens liegt vor allem darin, dass es die Gentherapie, im Gegensatz zur direkten

Transfektion des Gewebes, kontrollierbar macht, da hier eine definierte Anzahl von Genen,

auf eine definierte Anzahl von Zellen gebracht wurde. Die Anzahl der dadurch transfizierten

Zellen wurde bestimmt und die daraus resultierende Proteinfreisetzung konnte noch in vitro

mittels ELISA gemessen werden. Dann wurde eine genau definierte Anzahl dieser Zellen in

ein vorher festgelegtes Gebiet implantiert. Hierfr wurden Fibroblasten isogener Ratten

entnommen und diese adenoviral mit dem gewnschten Gen (VEGF165 oder GFP) transfiziert.

Als Ischmiemodell diente uns der McFarlane Lappen. Dieser –von McFarlane 1965 (59)

etablierte- musculokutane Lappen bezeichnet ein Gebiet von 2x8 cm Gre auf dem Rcken

der Ratte mit einer randomisierten Blutversorgung, die von der Lappenbasis stammt. Die

Zellen wurden dabei in den Panniclus carnosus injiziert. Aufgrund der Gre und des

Aufbaus des Lappenmodells war die zu erwartende Nekrose bei unbehandeltem Gebiet immer

um 50%, wenn man davon ausgeht, dass bei randomisierten Lappen bei einem

Grenverhltnis von 1:2 gerade noch eine ausreichende Durchblutung gewhrleistet ist und

dieses Modell ein Grenverhltnis von 1:4 beinhaltete. Es konnte somit also nicht nur

histologisch und mikroangiographisch die Anzahl der Blutgefsse im behandelten Gewebe

ermittelt, sondern direkt auch die therapeutische Konsequenz im klinischen Verlauf

gemessen werden.

44

Unsere Arbeit zeigte nun, dass nur die Behandlung des Zielgebiets eine Woche vor

Ischmiebeginn und nur unter Einbeziehung des umgebenden Gewebes eine signifikant

hhere berlebensrate des Ischmiegebietes erzielen konnte.

In Setting I unserer Versuchsreihe, als nmlich die Zellen bei Ischmiebeginn implantiert

wurden, zeigte sich, dass die Gruppen mit dem therapeutischen Gen keine signifikant bessere

berlebensrate im Vergleich zu den Kontrollgruppen vorweisen konnten. Auch in Bezug auf

die Anzahl der Gefe und der Kapillardichte fand sich in den Gruppen VEGF A und VEGF

B dieses Settings keine signifikante Verbesserung zu den Kontrollgruppen, obwohl in diesen

Gruppen bei Ischmiebeginn die hchste VEGF165-Sekretion, wie im ELISA und der rt-PCR

nachgewiesen, stattfindet. Ein therapeutischer Effekt wie in anderen Studien, bei denen eine

einmalige sytemische Gabe nach Ischmiebeginn oder sogar die topische Gabe von VEGF

(35) oder die Transfektion des Zielgebiets mit cDNA oder Adenovirus bei Ischmiebeginn

(62, 82, 90) zu einem signifikant besseren berlebens des Zielgebiets gefhrt hatte, konnte

hier nicht gesehen werden. Es besttigten sich hier unsere frheren Beobachtungen, dass eine

lokale Gabe rekombinanter Proteine bei Ischmiebeginn keinen therapeutischen Effekt hat

(51). Dies liee sich dadurch erklren, dass bei Ischmie die Zellen eines Gewebes ber den

HIF-1 (Hypoxie induzierter Faktor) Weg schon die maximale Konzentration an verschiedenen

Wachstumsfaktoren sezernierten, was aber bei der Gre dieses Ischmiegebietes nicht

ausreichte. Eine Mehrdurchblutung ischmischen Gewebes konnte in dieser Phase nur durch

Vasodilatation erreicht werden und nicht durch Angiogenese, die mehrere Tage bentigt. Die

Zeit war zu knapp fr ein therapeutisches Gefwachstum. Die in den Langzeitergebnissen

gefundene signifikant hhere Anzahl an Blutgefssen in der VEGF165-LZ Gruppe am Tag 1

nach Zellapplikation ist hchstwahrscheinlich der Vasodilatation schon bestehender Gefe

zuzuschreiben. Dies ist mglicherweise auch ein Teil des Effekts der Prkonditionierung

eines zu transplantierenden Lappens durch Dehnung des Gewebes (15, 40) oder

vorhergehender kurzzeitiger Ischmien („delay phenomen“) (36, 61). Jedoch selbst ca. 1000

pg/ml VEGF165/ 200000 Zellen/Tag, das bekanntlich ja ein starker Vasodilatator ist, da es

nach Bindung an den VEGFR2-Rezeptor die Bildung von NO und Prostacyclin veranlasst,

reichten in diesem Modell nicht aus, um einen berlebensvorteil des Zielgewebes der

therapeutischen Ischmiegruppen zu bewirken. Erschwerend kam noch hinzu, dass die

transplantierten Fibroblasten distal der Lappenbasis selbst vom Sauerstoff- und

Nhrstoffmangel betroffen waren und daher zugrunde gingen, sodass die VEGF165 -

Produktion in diesem Gebiet vermutlich schnell zum Erliegen kam und somit kein Anschluss

an die Gefe des Lappenrandes erfolgen konnte.

45

Es konnte jedoch noch ein anderer Effekt dargestellt werden: VEGF165 fhrt in der Akutphase

nicht nur zu einer Vasodilatation, sondern auch bekanntermaen zu einer Fensterung des

Endothels. Dieses „capillary leak“, wie schon in anderen Arbeiten beschrieben (13), war in

den Mikroangiographiebildern dieses Settings sehr gut zu sehen. ( Abb. 41).

Abb. 41: Mikroangiographiebild eines Tieres der Gruppe VEGF B Setting II. Zu sehen ist der Austritt von Kontrastmittel durch das „capillary leak“ (durch rote Pfeile markiert).

Anders sah es in Setting II aus. Hier hatte das Gewebe genug Zeit fr eine Prformierung der

Gefe. Die Gruppe VEGF B dieses Settings hatte im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine

signifikant (P< 0,01) bessere berlebensrate des Zielgebietes. Die Ergebnisse der

Mikroangiographie und Immunhistochemie besttigten dies. Auch da lie sich eine signifikant

hhere Anzahl an kleinen Gefen und Kapillaren ausmachen. Allerdings war dies fr die

Gruppe VEGF A aus Setting II, bei der die transfizierten Zellen nur in das Zielgebiet

transplantiert wurden, nicht der Fall. In der Ischmiesituation zeigte sich, dass die

Blutversorgung des Zielgebietes nicht nur von der Basis abhngig war, sondern vor allem

auch die Bildung von Kollateralen zum umgebenden Gewebe eine entscheidende Rolle

spielte. Diese wurden zwar bei der OP durchtrennt, fanden aber zum Teil wieder Anschluss,

nachdem die Wundrnder wieder adaptiert wurden (Abb. 42).

46

Abbildung 42: Mikroangiographiebild eines Tieres der Gruppe VEGF B Setting II. Man sieht deutlich, dass ein Großteil der Gefäßversorgung vom Wundrand her kommt (durch rote Pfeile markiert).

In Setting III war dieser Effekt wieder verschwunden, die therapeutischen Gruppen zeigten

keinen signifikanten Unterschied zu den Kontrollgruppen in allen Untersuchungen. Dies ließe

sich dadurch erklären, dass die Gefäße, die unter dem Einfluss von VEGF165 gebildet wurden,

nur aus Endothelzellen bestanden. Diese Gefäße besitzen weder eine Basalmembran, noch

Perizyten oder glatte Muskelzellen, was zu einer enormen Instabilität führt. Fällt der

VEGF165-Spiegel ab, bildet sich dieses Gefäßnetz wieder zurück. Dieser Effekt konnte in den

Langzeitversuchen bestätigt werden. Unsere Beobachtung, dass es bei der VEGF B Gruppe

des II. Settings gelang, eine therapeutisch effektive Angiogenese in Gang zu setzen, liesse

sich dadurch erklären, daß eine Woche nach Beginn der zellulären VEGF-Produktion die

Ischämie einsetzte, welche die zusätzliche zelluläre Bildung von Wachstumsfaktoren wie z.B.

bFGF (Basalmembran) und PDGF (glatte Muskelzellen) über den HIF 1-Weg ermöglichte,

was wiederume zu einer weiteren Stabilisierung der Gefäße beitragen konnte (60).

Die Langzeitversuche korrelierten mit den Ergebnissen der ELISAs und teilweise mit denen

der Ischämieversuche. In der ersten Woche post transplantationem ließen sich histologisch

und mikroangiographisch viele Gefäße nachweisen.Wie schon erwähnt, war der Effekt an Tag

1 der therapeutsichen Gruppe der Vasodilatation zuzuschreiben. Dies war jedoch in der

Ischämiesituation nicht ausreichend. Je mehr Zeit verstrichen war, desto mehr glich sich die

Gefäßanzahl der therapeutischen Gruppe die der Kontrollgruppen an. In diesem Modell war

während der beobachteten 28 Tage kein negativer Effekt unserer Gentherapie zu erkennen. Es

gab keine Immunreaktion auf eventuelle Viruspartikel und der Effekt war transient: die

Blutgefässe bildeten sich wieder zurück. Es konnte während der ganzen Zeit kein Wachstum

Nekrosezone

47

eines Hämangioms oder eines anderen Tumors gesehen werden. Mit einem erhöhten Risiko

für einen Tumor geht vor allem die Behandlung mit retroviralen Vektoren einher, da sich das

Gen des Retrovirus in das Wirtsgenom integriert und somit eine stetige Proteinproduktion

erfolgt und durch die Integration des Gens evtl. Mutationen ausgelöst werden können.

Beim Menschen lässt sich, anders als bei Nagetieren, nicht ausschließen, dass eine

Immunreaktion gegen eingeschleuste Viruspartikel auftritt. Außerdem muß noch die

theoretische Gefahr eines wild-type breakthrough (Spontanmutation in ein

replikationsfähiges Virus) erwähnt werden. Dieser Effekt wurde in unseren

Langzeitversuchen allerdings nicht gesehen. Trotzdem sollte man in Erwägung ziehen, die

Transfektion nicht-viral durchzuführen. Dazu könnte man z.B. die Elektroporation

verwenden. Allerdings ist diese Methode noch nicht ausgereift. Die Transfektionsraten sind

bis jetzt noch um Einiges geringer als bei Verwendung eines viralen Vektors.

Eine Verbesserung der Ergebnisse kann möglicherweise durch den Einsatz anderer Zellen

und/ oder durch eine Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren erzielt werden (7, 45).

Als zu transfizierende Zellen hatten wir Fibroblasten ausgewählt, weil diese sich einfach

kultivieren und transfizieren lassen. In unserem Modell konnten wir keinen Einfluß dieser

Zellen auf das Outcome des Lappens feststellen (38, 39). In zukünftigen Experimenten

könnten solche Zellen durch Endothelzellen (41) oder endotheliale Progenitorzellen (2, 11)

oder multipotenten Stammzellen ersetzt werden. Adulte Stammzellen können z.B. aus dem

Fettgewebe gewonnen werden (93). Dies hätte theoretisch den Vorteil, dass durch die

autokrine Wirkung von VEGF165 auf diese Zellen im Falle der endothelialen Progenitorzellen

und der Stammzellen eine Vasculogenese ausgelöst werden kann. Somit könnte

möglicherweise ein noch dichteres Gefäßnetz aufgebaut werden. Hier würde die Neubildung

von Gefäßen nicht nur allein durch die Aussprossung von schon vorhandenen Gefäßen

bewerkstelligt werden. Man wäre also nicht mehr von einem schon vorbestehenden guten

Gefäßnetz eines Gewebes abhängig. Im tierischen und menschlichen Organismus stellt sich

dieses Problem der A- oder Hypovaskularität nur bei pathologischen Zuständen wie chronisch

ischämisch geschädigten Geweben (27, 64, 71) und daraus resultierenden Problemwunden

(Beispiel: diabetisches Fußsyndrom) (66). Wenn man sich aber mit der Entwicklung

bioartifizieller Gewebe beschäftigt, ist der wichtigste limitierende Faktor bei der Herstellung

dreidimensionaler Gewebe die mangelnde Nährstoffversorgung der zentral und damit am

weitesten von der schon bestehenden Blutversorgung entfernt gelegenen Zellen bei

Implantation des Konstruktes in einen Organismus (58, 85). Um also später wirklich

48

komplexe bioartifizielle Gewebe transplantieren zu können, muss man schon in vitro für ein

ausreichendes Gefäßnetz sorgen (17, 79). Dies lässt sich nur durch Vaskulogenese erreichen.

In unserem Modell ist die Angiogenese nur transient durch die geringe Stabilität der VEGF-

induzierten Gefäße, da die gebildeten Gefäße primär nur aus Endothelzellen ohne

Basalmembran, Perizyten und glatten Muskelzellen bestehen. Man benötigt zur Stabilisierung

solcher fragiler Blutgefäße noch andere Wachstumsfaktoren, die arteriogenetisch wirksam

sind wie z.B. bFGF und PDGF und synergistisch mit VEGF165 eingesetzt werden müssten

(74, 76). Das optimale Timing für den Wirkungsbeginn solcher Wachstumsfaktoren muss

noch erforscht werden. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten liefern dazu für das Modell des

Mcfarlane Lappens im Tiermodell erste Hinweise. Das von VEGF165 verursachte Kapillarleck

ist primär wichtig, um es Endothelzellen besser zu ermöglichen, in das Gewebe

einzuwandern. In diesem Stadium wäre es eher hinderlich, diese Fenster wieder mit einer

Basalmembran zu verschließen. Um verschiedene Wachstumsfaktoren zu unterschiedlichen

Zeitpunkten und synergistisch wirken zu lassen, gibt es theoretisch zwei Möglichkeiten:

entweder, man appliziert die Protein exprimierenden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten

oder man reguliert die Aktivität eingeschleuster Gene mit Hilfe eines vorgeschalteten

Promotors, mit dem man das Gen an- und abschalten kann. Letzteres ist z. B. bei Tetrazyklin-

abhängigen Promotoren der Fall, die das zu regulierende Gen nur in Anwesenheit von

Tetrazyklin aktivieren (58).

5.3 Ausblick

Gentherapie wird in der Zukunft eine immer wichtigere Rolle in der Behandlung

ischämischen Gewebes spielen. In der Plastischen Chirurgie ist dies vor allem bei

rekonstruktiven Eingriffen mit freien muskulocutanen Lappen von Bedeutung. Um die

Wirksamkeit einer Gentherapie allerdings reproduzierbar und damit für die spätere Therapie

wie bei einem Medikament anwendbar zu machen, hat z.B. Ylä-Hertualla (89) gefordert, zu

den ADME (= absorption, distribution, metabolism, excretion) Kriterien eines Medikaments

für gentherapeutische Produkte zusätzliche Parameter aufzustellen: STED:

Spreading throughout and reaching appropriate cells in the target tissue (eine durchgehende

Ausbreitung des Vectors und das Erreichen der geeigneten Zellen im Zielgewebe)

Transduction efficiency (Transductions-, Transfektionseffizienz)

Expression strength in the transduced cells (Stärke der Genexpression in transduzierten/

-fizierten Zellen)

49

Duration of expression ( Dauer der Genepression).

Diese Kriterien werden von unserem Modell erfüllt, da

die transfizierten Zellen genau in das Zielgebiet gebracht werden

der von uns benutzte Vektor eine hohe Transfektionseffizienz besitzt (nämlich 88%)

und dass die daraus resultierende Proteinproduktion sowohl in vitro als auch in vivo

transient ist

die Proteinproduktion vor Implantation der Zellen gemessen werden kann

eine klinisch signifikante Wirksamkeit in diesem Modell nur bei Behandlung des

Zielgebiets eine Woche vor Ischämie und nur unter Einbeziehung des umgebenden

Gewebes erzielt werden kann

auch in den Langzeitversuchen die Gefäßbildung nur transient ist und ein negativer

Effekt nicht gesehen werden konnte

Für die Monotherapie mit VEGF165 konnten wir das optimale Timing und das optimale Gebiet

für die Behandlung mit VEGF165 für dieses Modell aufzeigen. Eine Verbesserung der

Durchblutungssituation konnte in diesem Modell nur bei Vorbehandlung des Zielgebiets

erreicht werden, was eine Anwendung dieses Modells nur bei elektiven Eingriffen und nicht

in akuter Ischämiesituation möglich macht. In wieweit jedoch diese Ergebnisse auf größere

Tiere und Menschen übertragbar sind, muss noch gezeigt werden.

6. Zusammenfassung

Ziel dieser tierexperimentellen methodologischen Ar