Untersu hungen zur Rolle derimp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellenbei der Hepatitis-B-Virusinfektion humaner HepatozytenDissertation zur Erlangung des Doktorgradesder Naturwissens haften (Dr. rer. nat.)der Naturwissens haftli hen Fakultät III- Biologie und Vorklinis he Medizin -der Universität Regensburg

dur hgeführt amInstitut für Medizinis he Mikrobiologie und Hygienevorgelegt vonElena Simone Röhrlaus Wörth a. d. DonauJanuar 2009

IIDie vorliegende Dissertation wurde zwis hen Februar 2005 und Oktober 2008 am Institut fürMedizinis he Mikrobiologie und Hygiene der Universität Regensburg in der Arbeitsgruppevon Herrn Prof. Dr. Wolfgang Jilg dur hgeführt.

Promotionsgesu h eingerei ht am 07. Januar 2009.Tag der mündli hen Prüfung: 03. April 2009.Diese Arbeit wurde angeleitet von Herrn Prof. Dr. Wolfgang Jilg.Prüfungsvorsitz: Prof. Dr. Reinhard WirthPrüfungsauss huss: Prof. Dr. Ralph WitzgallProf. Dr. Wolfgang JilgProf. Dr. Herbert Ts ho hner

Erklärung IIIErklärungHiermit erkläre i h, die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfsmittelangefertigt zu haben.

Wörth, den 07. Januar 2009Elena Röhrl

Danksagung IVDanksagungMein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Jilg für die Mögli hkeit, in seiner Arbeitsgruppemeine Promotionsarbeit anfertigen zu dürfen. Darüber hinaus mö hte i h mi h au h ganzherzli h für die Betreuung und die angenehme Atmosphäre, in der diese Arbeit angefertigtwerden konnte, bedanken.Herrn Prof. Dr. Hans Wolf danke i h für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes am Institutfür Medizinis he Mikrobiologie und Hygiene am Klinikum der Universität Regensburg.Des Weiteren bedanke i h mi h bei Herrn Prof. Dr. Ralph Witzgall für die Übernahme desErstguta htens.Sehr herzli h mö hte i h mi h bei Frau Dr. Tanja Bauer für ihre Unterstützung und positiveMotivation im Rahmen dieser Arbeit bedanken. Auÿerdem danke i h meinen ehemaligenKollegen, Dr. Sven S himanski und Dr. Jürgen Wenzel, für ihre Diskussions- und Hilfsbe-reits haft.S hlieÿli h danke i h au h den MitarbeiterInnen der diagnostis hen Routineabteilung desInstituts für die immer währende freundli he Arbeitsatmosphäre.

Inhaltsverzei hnis VInhaltsverzei hnisErklärung IIIDanksagung IVInhaltsverzei hnis VAbkürzungsverzei hnis VIITabellenverzei hnis XIAbbildungsverzei hnis XIIZusammenfassung XIII1 Einleitung 11.1 Hepatitis-B � von der Entde kung des auslösenden Virus zum Impfsto� . . . 11.2 Das Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.3 Molekularbiologie des Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.4 Die Hepatitis-B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.5 Immunpathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.6 Infektionsmodelle des Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191.7 Ziel der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 Material und Methoden 222.1 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.1.1 Primäre humane Hepatozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.1.2 Hepatom-Zell-Linien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.1.3 Beein�ussung der HBV-Infektion dur h antiviral wirkende Zytokine . 252.1.4 Periphere Blut-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.1.5 Kokultur von peripheren Blut-Lymphozyten mit HBV-in�zierten He-patozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.2 Etablierung von real-time RT-PCR-Systemen zum Na hweis der Hepatitis-B-Virus-RNA und der RNA des Haupthistokompatibilitätskomplexes . . . . . . 272.2.1 Na hweis der Hepatitis-B-Virus-RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.2.2 Na hweis des Haupthistokompatibilitätskomplexes . . . . . . . . . . . 28

Inhaltsverzei hnis VI2.2.3 Herstellung der RNA-Ei hreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.3 Na hweissysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.3.1 Na hweis der HLA-RNA und Hepatitis-B-Virus-RNA . . . . . . . . . 332.3.2 Na hweis der Hepatitis-B-Virus-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.3.3 Quanti�zierung von Hepatitis-B-Virus-Antigen . . . . . . . . . . . . . 362.3.4 Elispot-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372.4 Computer-Programme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 Ergebnisse 393.1 Hepatitis-B-Virus-Infektionsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.1.1 Primäre humane Hepatozyten als Modell für die Infektion . . . . . . 393.1.2 Untersu hung der HBV-Infektion primärer humaner Hepatozyten . . 403.1.3 Untersu hung der HBV-Infektion humaner Hepatom-Zell-Linien . . . 553.2 Ein�uss der TH-Typ1-Zytokine TNF-α und IFN-γ auf die HBV-Infektion . . 583.3 Kokultur HBV-in�zierter humaner Hepatozyten mit HBV-spezi�s hen peri-pheren Blut-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 703.3.1 Etablierung des Kokultur-Modells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 703.3.2 Wirkung HBV-spezi�s her Immunzellen auf die akute HBV-Infektionprimärer humaner Hepatozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 763.3.3 Wirkung HBV-spezi�s her und HBV-naiver Immunzellen auf die Vi-rusreplikation in HBV-in�zierten humanen Hepatom-Zellen . . . . . . 833.3.4 Charakterisierung der die Virusreplikation hemmenden E�ektorzellen 873.3.5 Zusammenfassende Darstellung antiviraler E�ekte HBV-spezi�s herund HBV-naiver Immunzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 924 Diskussion 934.1 Humane Infektionsmodelle für das Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . 944.2 Ein�uss der TH-Typ1-Zytokine auf die Kultur und Virusreplikation der He-patozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1014.3 E�ekte HBV-spezi�s her und HBV-naiver Immunzellen auf die Virusreplika-tion HBV-in�zierter humaner Hepatozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103Sequenzen XIVLiteraturverzei hnis XXIIPublikationen XXXVII

Abkürzungsverzei hnis VIIAbkürzungsverzei hnisAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Antigenanti-HB . . . . . . . . . . . . . . . . . Antikörper gegen das Hepatitis-B-Virus-Core-Antigenanti-HBe . . . . . . . . . . . . . . . . . Antikörper gegen das Hepatitis-B-Virus-e-Antigenanti-HBs . . . . . . . . . . . . . . . . . Antikörper gegen das Hepatitis-B-Virus-Ober�ä henantigenbp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . pair of bases, Basenpaare°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Grad in CelsiusCD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cluster of Di�erentiation DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . ovalently losed ir ular DNA, kovalent ges hlossene zirku-läre DNACTL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ytotoxi T-Lympho ytes, zytotoxis he T-LymphozytenDEPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diethylpyro arbonatDHBV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Du k hepatitis B virus, Hepatitis-B-Virus der EnteDMEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dulbe os Modi�ed EAGLE MediumDMSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DimethylsulfoxidDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . desoxyribonu lei a id, DesoxyribonukleinsäuredNTP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . desoxynu leotidtriphosphat, DesoxynukleotidtriphosphatdsDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . double stranded DNA, doppelsträngige DNAet al. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . und andereEtOH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ethanolg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Grammge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gravity, Erdbes hleunigungh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stunde(n)HB Ag . . . . . . . . . . . . . . . . . . hepatitis B ore antigen, Hepatitis-B-Virus-Kapsid-AntigenHBeAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . hepatitis B e antigen, Hepatitis-B-Virus-e-Antigen

Abkürzungsverzei hnis VIIIHBsAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . hepatitis B surfa e antigen, Hepatitis-B-Virus-Ober�ä hen-antigenHBV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hepatitis-B-VirusHBVS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . HBV-spezi�s hHBVN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . HBV-naivHLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Humanes Leukozyten-AntigenIgG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Immunglobulin GIgM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Immunglobulin MIFN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . InterferonIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . InterleukinIU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . international unit, Internationale Einheitkb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . kilo-BasenkD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . kilo-DaltonlHBsAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . large hepatitis B surfa e antigen, groÿes Hepatitis-B-Virus-Ober�ä henantigenµ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mikrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . milliM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Molarmax. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . maximum, maximalmHBsAg . . . . . . . . . . . . . . . . middle hepatitis B surfa e antigen, mittleres Hepatitis-B-Virus-Ober�ä henantigenMHC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . major histo ompatibility omplexMHL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . major hydrophili loopmin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Minutenml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . MillilitermRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . messenger RNA, Boten-RNAMW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Molekulargewi htn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . nanong . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NanogrammNKZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Natürli he Killer-ZellenNKTZ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Natürli he Killer-T-Zellennm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nanometer

Abkürzungsverzei hnis IXPBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . periphere Blut-LymphozytenPBS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . phosphate bu�ered saline, Phosphat-gepu�erte Ko hsalzlö-sungPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . polymerase hain rea tion, PolymerasekettenreaktionPEG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PolyethylenglykolPHH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . primäre humane HepatozytenpgRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . pregenomi RNA, prägenomis he RNAPol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PolymeraseRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ribonu lei a id, RibonukleinsäureRNase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ribonu lease, RibonukleaseRT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . RaumtemperaturRT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . Reverse Transkriptase-PCRsHBsAg . . . . . . . . . . . . . . . . . small hepatitis B surfa e antigen, kleines Hepatitis-B-Virus-Ober�ä henantigenssDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . single stranded DNA, Einzelstrang-DNATaq-Polymerase . . . . . . . . . . Thermostabile DNA-Polymerase (Thermus aquati us)TH-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . T-HelferzellenTLR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toll-like re eptor, Toll-like RezeptorTNF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . TumornekrosefaktorU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . units, Enzymeinheitv/v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . volume per volume, Volumeneinheit pro VolumeneinheitWHV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Wood hu k Hepatitis Virus, Hepatitis-Virus des Waldmur-meltiersw/v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . weight per volume, Gewi htseinheit pro Volumeneinheit

Tabellenverzei hnis XTabellenverzei hnis1.1 Virale Proteine des Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.2 Funktionale Klassen der E�ektor-T-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . 142.1 Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der 3,5-kb C-HBV RNA sowieder 2,4-kb S-HBV RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.2 Oligonukleotide für die Ampli�kation der zu klonierenden viralen Sequenzab-s hnitte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.3 Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der MHC-II-Expression . . . . 292.4 Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der MHC-I-Expression . . . . 302.5 Oligonukleotide für die Ampli�kation der zu klonierenden Sequenzabs hnitte 302.6 Annealing-Temperaturen für die konventionelle PCR . . . . . . . . . . . . . 312.7 TaqMan-Reaktionskomponenten für die Quanti�zierung der Hepatitis-B-Virus-RNAs und der MHC-RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.8 Temperaturs hema der TaqMan-PCR für die Quanti�zierung der Hepatitis-B-Virus-RNAs und der MHC-RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.9 Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der Hepatitis-B-Virus-DNA . . 352.10 TaqMan-Reaktionskomponenten für die Quanti�zierung der Hepatitis-B-Virus-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.11 Temperaturs hema der TaqMan-PCR für die Quanti�zierung der Hepatitis-B-Virus-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.1 Reduktion der viralen DNA-Synthese und Antigen-Produktion in HepG2.215-Zellen dur h TNF-α und IFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.2 Reduktion der viralen Transkription in HepG2.215-Zellen dur h TNF-α undIFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.3 Reduktion der viralen DNA-Synthese und der Antigen-Produktion in HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten dur h TNF-α und IFN-γ . . . . . 633.4 Reduktion der viralen Transkription in HBV-in�zierten primären humanenHepatozyten dur h TNF-α und IFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.5 Reduktion der Antigen-Produktion und der viralen DNA-Synthese in HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten dur h HBV-spezi�s he PBL einesgeimpften Spenders und HBV-naive PBL eines ungeimpften Spenders . . . . 783.6 Reduktion der Antigen-Produktion, der viralen DNA-Synthese und der viralenTranskription in HepG2.215-Zellen dur h HBV-spezi�s he und -naive PBL . 85

Abbildungsverzei hnis XIAbbildungsverzei hnis1.1 Struktur der Hepatitis-B-Virus Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.2 Elektronenmikroskopis he Darstellung der Hepatitis-B-Virus Partikel . . . . 51.3 Genomorganisation des Hepatitis-B-Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.4 Replikationszyklus des Hepatitis-B-Virus (na h NTHU, 2008) . . . . . . . . . 83.1 Morphologis he Veränderungen und Di�erenzierung primärer humaner Hepa-tozyten na h Isolierung und Aussaat im Zeitverlauf . . . . . . . . . . . . . . 393.2 Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationen an viralerDNA, HBeAg und HBsAg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.3 Kinetik der viralen HBeAg-Konzentration im Zellkulturüberstand na h Infek-tion der PHH in Abhängigkeit vom Infektionszeitpunkt . . . . . . . . . . . . 433.4 Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationen an vira-ler DNA, HBeAg und HBsAg in drei Parallelansätzen einer HBV-in�ziertenHepatozytenkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.5 Maximale HBeAg-Konzentration 18 vers hiedener Hepatozytenkulturen na hInfektion mit dem glei hen HBV-haltigen Serum . . . . . . . . . . . . . . . . 463.6 RNA-Ei hreihen zum quantitativen Na hweis HBV-spezi�s her RNAs . . . . 483.7 Konzentration der Hepatitis-B-Virus RNA na h in vitro Infektion der PHHmit unters hiedli hen Inokula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493.8 Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationen von HBe-Ag, HBsAg und DNA na h in vitro Infektion primärer humaner Hepatozytenmit unters hiedli hen Inokula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503.9 RNA-Ei hreihen zum Na hweis der Expression von MHC-I und MHC-II . . 523.10 Expression von MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II dur h PHH . . . . . . . . 533.11 Expression von HLA-A und HLA-DRα dur h unter Standard-Bedingungenkultivierte und HBV-in�zierte PHH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543.12 Im Kulturüberstand der Hepatom-Zell-Linien na hweisbare Konzentrationenvon HBeAg, HBsAg und viraler DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.13 Konzentration der Hepatitis-B-Virus RNA in den Hepatom-Linien HepG2.215und HepG2.4A5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573.14 Virusreplikation in humanen Hepatom-Zellen na h Zugabe von TNF-α undIFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

Abbildungsverzei hnis XII3.15 Synthese viraler RNA in humanen Hepatom-Zellen na h Zugabe von TNF-αund IFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.16 Kinetik von HBeAg, HBsAg und viraler DNA unter Ein�uss von TNF-α undIFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 643.17 Konzentration der Hepatitis-B-Virus RNA unter Ein�uss von TNF-α undIFN-γ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.18 Expression von HLA-Klasse-II dur h PHH unter Ein�uss von IFN-γ . . . . . 683.19 Morphologis he Veränderungen der PHH na h direktem Zell-Zell-Kontakt mitheterologen peripheren Blut-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 703.20 Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationen von HBe-Ag, HBsAg und DNA na h HBV-Infektion und Kultivierung der Hepatozytenim Standardmodell und im Kokulturmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.21 Kinetik der im Zellsieb na hweisbaren Konzentrationen von HBeAg, HBsAgund DNA na h HBV-Infektion und Kultivierung der Hepatozyten mit demZelleinsatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.22 Zytokinpro�l HBV-spezi�s her Immunzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.23 Trans-Well -System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 753.24 Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationen von HBe-Ag, HBsAg und viraler DNA na h Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.25 Reduktion der HBeAg-Produktion in HBV-in�zierten Hepatozyten dur h HBV-spezi�s he und HBV-naive PBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 793.26 Korrelation der PBL-vermittelten Reduktion der HBeAg-Produktion mit derZahl IFN-γ-sezernierender Zellen vers hiedener Spender . . . . . . . . . . . . 793.27 HBeAg-Kinetik na h Infektion und Zugabe HBV-spezi�s her und HBV-naiverPBL zu bestehender Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 803.28 HBeAg-Kinetik während und na h Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 813.29 Virale Aktivität in HepG2.215-Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 843.30 Reduktion der HBeAg-Produktion in HepG2.215-Zellen in Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL vers hiedener Spender . . . . . . . . . . 853.31 Zytokinpro�l und Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen der PBL na h Ko-kultivierung mit HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen . . . . . . . . . . . . 883.32 Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen der PBL na h Kokultivierung mitHBV-exprimierenden Hepatom-Zellen und HBsAg-exprimierenden Hepatom-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

Zusammenfassung XIIIZusammenfassungDie erfolgrei hste Prophylaxe gegen eine Hepatitis-B-Virusinfektion ist die aktive Immuni-sierung, die die Induktion einer adaptiven Immunantwort zur Folge hat. Die aktive Immu-nisierung erfolgt mit einem rekombinanten Impfsto�, der als immunogene Determinante dasHepatitis-B-Virus-Ober�ä henantigen (HBsAg) enthält und die Bildung von anti-HBs indu-ziert. Die humorale Immunität und die erfolgrei he Wirksamkeit von anti-HBs zum S hutzvor einer Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus wurde bereits eingehend untersu ht. Dabei istdie Aktivierung HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen essenziell für die Stimulation spezi�s herB-Lymphozyten und der dadur h initiierten Produktion von anti-HBs. Die vorliegende Ar-beit befasst si h mit der zellulären Immunität, die dur h aktive Immunisierung gegen dasHepatitis-B-Virus induziert wird, und untersu ht die Rolle der HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen bei der Hepatitis-B-Virusinfektion.Die funktionelle Charakterisierung der Rolle imp�nduzierter HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen bei der Hepatitis-B-Virusinfektion erfolgte anhand humaner Infektionsmodelle fürdas Hepatitis-B-Virus. Die Untersu hungen wurden mit HBV-in�zierten primären huma-nen Hepatozyten, die als Modell für die akute Primärinfektion gelten, und mit humanenHepatom-Zellen, die einen hronis hen Infektionsstatus repräsentieren, dur hgeführt.HBV-spezi�s he periphere Blut-Lymphozyten von HBV-geimpften Spendern bewirkten inKokultur mit HBV-in�zierten Hepatozyten eine signi�kante Reduktion der viralen Tran-skription, der Virusreplikation und der Antigen-Produktion. Der antivirale E�ekt der pe-ripheren Blut-Lymphozyten einzelner Spender stand in Abhängigkeit ihrer spezi�s hen T-Zellreaktivität und war reversibel. Die negative Beein�ussung der Infektion dur h die peri-pheren Blut-Lymphozyten erfolgte hö hstwahrs heinli h über Sekretion antiviral wirkenderZytokine. Die gewonnenen Daten weisen imp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zelleneine eindeutige, antivirale E�ektorfunktion bei der Hepatitis-B-Virusinfektion humaner He-patozyten zu. Da überras henderweise au h HBV-naive periphere Blut-Lymphozyten unge-impfter Spender eine negative Beein�ussung der Virusreplikation bewirkten und die HBV-Infektion reversibel inhibierten, s heint au h die angeborene Immunität bei der Kontrolleder Hepatitis-B-Virusinfektion eine Rolle zu spielen.

1 Einleitung 11 Einleitung1.1 Hepatitis-B � von der Entde kung des auslösendenVirus zum Impfsto�Im Rahmen einer Impfkampagne gegen Po kenviren im Jahre 1883, bei der S hi�swerftar-beiter in Bremen mit einer aus humaner Lymphe bereiteten Vakzine immunisiert wurden,erlangte die Gelbsu hterkrankung, die s hon seit dem Altertum bekannt ist, zum ersten Maldie Aufmerksamkeit der gesamten Bevölkerung. Wie von A. Luerman 1885 bes hrieben, ent-wi kelten 15 % der insgesamt 1.289 geimpften Personen Wo hen na h der Immunisierungeine Gelbsu ht (Luerman, 1885). Die Gelbsu ht galt seitdem als infektiöse Krankheit.In den Vierziger Jahren stellte der britis he Arzt F. O. Ma Callum gehäuftes Auftreteneiner Hepatitis bei Soldaten fest, die einen Gelb�eber-Impfsto� verabrei ht bekamen, derebenfalls mens hli hes Serum enthielt (Ma Callum et al., 1951). Zudem waren au h Fäl-le bekannt, wona h eine Hepatitis na h Behandlung mit unsterilisierten, wiederverwendetenmedizinis hen Instrumenten auftrat.Ma Callum begann, ein Virus im mens hli hen Blut alsVerursa her einer Hepatitis zu vermuten. Mit der Bezei hnung �Hepatitis-B� bzw. �Serum-hepatitis� grenzte er daraufhin die Form der Lebererkrankung ein, die hauptsä hli h dur hKontakt mit kontaminiertem Blut übertragen wird. Für die Form der Krankheit, die vorallem na h Verzehr von kontaminierter Nahrung und kontaminiertem Wasser auftrat, prägteer den Begri� �Hepatitis-A� (Ma Callum, 1953).Im Jahre 1965 entde kte B. Blumberg ein Antigen im Serum eines australis hen Ureinwohners� das sog. Australia-Antigen �, wel hes mit dem Serum eines amerikanis hen Hämophilie-Patienten reagierte (Blumberg et al., 1965). 1966 fanden B. Blumberg, W. T. London undA. Sutni k im Serum eines 12-jährigen Jungen mit Down-Syndrom das parallele Auftretendes Australia-Antigens und einer Hepatitis-B (Blumberg et al., 1967).Na h intensiver Fors hung bestätigten mehrere Arbeitsgruppen einen Zusammenhang zwi-s hen dem Australia-Antigen und der Serumhepatitis (Ragazzini und Vieru i, 1970; Prin e,1968a; Prin e, 1968b; Oko hi und Murakami, 1993).D. S. Dane und Kollegen stellten 1970 die direkte Verbindung zwis hen dem Australia-Antigen und der Hepatitis her, als sie in elektronenmikroskopis hen Befunden virusähnli hePartikel im Serum von Australia-Antigen-positiven Individuen entde kten. Diese Partikelfanden sie au h in Leberzellen von Patienten mit Hepatitis (Dane et al., 1970).

1 Einleitung 2In der Folge wurde klar, dass si h das Australia-Antigen hauptsä hli h auf der Ober�ä he vonPartikeln fand, die hinsi htli h ihrer Gröÿe sehr unregelmäÿig waren und eine viel geringereDi hte aufwiesen als bereits bekannte Viren ähnli her Gröÿe. Au h weil sie keine geneti-s he Information enthielten, kam die Fors hung zu der S hlussfolgerung, dass das Australia-Antigen nur ein Teil des Virus ist, wel hes Hepatitis-B auslöst. Der Begri� Australia-Antigenwurde zunä hst abgewandelt in �Hepato-assoziiertes Antigen� und s hlieÿli h wurde die Be-zei hnung �Hepatitis B Surfa e Antigen� (HBsAg, Hepatitis-B-Ober�ä henantigen) übernom-men. Das vollständige und infektiöse Virus � bes hrieben als 42 nm groÿes Partikel mit Hülleund ikosaedris hem Nukleokapsid � wurde na h seinem Entde ker �Dane-Partikel� benannt.Die Entde kungen von S. Krugman im Jahre 1971, dass hitzeinaktiviertes Hepatitis-B-kontaminiertes Blut na h Injektion zu keiner Lebererkrankung führte (Krugman et al., 1971),sowie des Auftretens von Antikörpern na h einer Hepatitis-B-Primärinfektion (Lander et al.,1971) resultierten in der Idee, dass HBsAg eine s hützende Immunantwort auslösen könnte(Krugman, 1975). Na h vielen Jahren umfangrei her Fors hung entwi kelte das Unterneh-men Mer k einen Hepatitis-Impfsto�, der aus von humanem Blut isolierten HBsAg herge-stellt wurde. Na h Bes hreibung eines von mehr als 90 %igen S hutzes gegen Hepatitis-Bund fehlender unerwüns hter Nebenwirkungen dur h W. Szmuness und Kollegen (Szmunesset al., 1980), wurde der aus humanem Serum gewonnene Impfsto� im Jahre 1981 zugelassen.Um dem �ä hende kenden Bedarf groÿer Mengen des HBsAg-Impfsto�es gere ht zu wer-den, wurden Anstrengungen unternommen, einen Hepatitis-B-Impfsto� aus rekombinantemHBsAg zu entwi keln. Na h Klonierung und Sequenzierung der viralen DNA gelang es W.Rutter und B. Hall, reine HBsAg-Partikel in genetis h manipulierten Hefezellen herzustellen(Valenzuela et al., 1982; M Aleer et al., 1984). Dieser Impfsto� stellte eine si here Alterna-tive zur Vakzinierung mit attenuierten Viren dar und konnte in glei h bleibender Qualitätsowie Immunogenität produziert werden. Die Vakzine zum S hutz vor Hepatitis-B wurde alsweltweit erster rekombinanter Impfsto� zugelassen und eingesetzt.

1 Einleitung 31.2 Das Hepatitis-B-VirusDas hepatotrope Hepatitis-B-Virus (HBV) gehört weltweit zu den häu�gsten viralen Infekti-onserregern und ist verantwortli h für eine akute oder hronis he Leberentzündung. Jährli hsterben etwa 0,6 bis 1 Million Mens hen an den Folgen einer HBV-Infektion und rund 40 %der Weltbevölkerung weisen entspre hende Antikörper als Merkmal einer bereits stattgefun-denen oder no h bestehenden Infektion auf (Perz et al., 2006).Das HBV gehört zu der Familie der Hepadnaviridae, deren Mitglieder neben einem ausge-prägten Hepatotropismus und hoher Speziesspezi�tät sowie fehlender Zytopathogenität au hdie Fähigkeit aufweisen, persistierende Infektionen mit ausgeprägter Virämie zu erzeugen.Entspre hend der Systematik ihrer Wirtsorganismen lassen si h Hepadnaviridae in die beidenGenera der Orthohepadnaviren und der Avihepadnaviren unterteilen. Die tieris hen Virendieser Familie � vor allem das wood hu k hepatitis virus (WHV) (Waldmurmeltier-Virus;Summers et al., 1978) und das du k hepatitis B virus (DHBV) (Enten-Virus; Mason et al.,1980) � dienen in der Hepatitisfors hung häu�g als Modellsysteme.Eine Einteilung des HBV in vers hiedene Untergruppen kann über serologis he Subtypenoder Genotypen vorgenommen werden. Die vers hiedenen serologis hen Subtypen des HBVunters heiden si h in der Antigenität ihrer Ober�ä henglykoproteine (HBsAg). Ausgehendvon der a-Determinante, die alle Isolate besitzen, wurden die allelis h auftretenden und si hgegenseitig auss hlieÿenden Subtypen d, y und r, w identi�ziert. Die serologis he Einteilungwird allmähli h verdrängt dur h die Einteilung des HBV in die Genotypen A bis F, diedur h DNA-Sequenzunters hiede von 10 - 15 % und eine harakteristis he geographis heVerbreitung gekennzei hnet sind (Norder et al., 2004; E hevarria und Avellon, 2006).Die Übertragung des HBV erfolgt perinatal, perkutan dur h Blut-zu-Blut-Kontakt oderdur h Sexualkontakte. Chronis h HBV-in�zierte Personen stellen das Reservoir für die Virendar, wobei besonders symptomarm oder symptomlos hronis h In�zierte eine Infektionsquellebilden (Robert Ko h-Institut, 2006). Ein wi htiger Übertragungsweg ist die Infektion Neu-geborener dur h in�zierte Mütter, wobei die mit dem Virus in�zierten Frauen die Infektionin der Regel dur h perinatale Übertragung an das Kind weitergeben können. Als epidemio-logis he Dur hseu hungsmarker gelten Antikörper gegen das virale Nukleokapsid-Antigen(anti-HB ), da sie na h Kontakt mit dem Virus lebenslang erhalten bleiben und somit Mar-ker einer stattgefundenen HBV-Infektion sind. Trotz der weltweiten Verbreitung gibt es groÿeUnters hiede in der Prävalenz, je na h geographis her Lage, ethnis her Zugehörigkeit undpersönli hem Risikoverhalten. In der Bundesrepublik Deuts hland beträgt dem Robert Ko h-Institut zufolge die Prävalenz von aktiven HBsAg-positiven HBV-Infektionen 0,4 bis 0,8 %,während si h die Prävalenz von anti-HB auf a. 7 % beläuft (Robert Ko h-Institut, 2006).LautWalter et al. erfolgen hierzulande 30 bis 40 % der Infektionen bei Angehörigen entspre- hender Risikogruppen, was die � na h wie vor bestehende � Notwendigkeit der Aufklärungund entspre hender Impfkampagnen verdeutli ht (Walter et al., 2005).

1 Einleitung 41.3 Molekularbiologie des Hepatitis-B-VirusDas Hepatitis-B-Virus ist ein humanes DNA-Virus, das si h au h aufgrund seiner moleku-larbiologis hen Eigens haften von anderen Viren unters heidet.Morphologie der viralen und subviralen PartikelInfektiöse Viruspartikel, die au h als �Dane-Partikel� bezei hnet werden, besitzen eine dur h-s hnittli he Gröÿe von 42 nm (Abb. 1.1). In Seren hronis her Virusträger können Virusmen-gen von bis zu 1010 und mehr Virionen/ml vorkommen. Ihre äuÿere Hülle ist a. 7 nm di kund zellulären Ursprungs. Sie leitet si h von der Membran des endoplasmatis hen Retikulumsder Wirtszelle ab (Hollinger, 1996). In diese lipidhaltige Hülle sind die drei vers hiedenenFormen des Hepatitis-B-Ober�ä henantigens (groÿes, mittleres und kleines HBsAg) einge-lagert. Die äuÿere Hülle umgibt das 36 nm messende ikosaedris he Nukleokapsid, das sog.Core-Partikel (Crowther et al., 1994). Das Nukleokapsid-Antigen (Core-Antigen, HB Ag)fungiert dabei als strukturgebendes Protein des Kapsids, wel hes das virale Genom und dievirale DNA-Polymerase ums hlieÿt.Neben den Virionen können im Serum von akut oder hronis h in�zierten Personen sog.subvirale Partikel na hgewiesen werden. Die ni htinfektiösen subviralen Partikel bestehenaus leeren Virushüllen und enthalten die im Übers huss synthetisierten Hüllproteine (Bruss,2007; Chai et al., 2008). Aufgrund ihrer Morphologie und der Zusammensetzung ihrer Hüllewerden sie aufgeteilt in sphäris he und �lamentöse Partikel. Die sphäris hen Partikel besitzeneinen Dur hmesser von etwa 17 - 25 nm und werden daher als �22 nm-Partikel� bezei hnet.Sie können im Serum hronis her Virusträger Konzentrationen von mehr als 1013 Partikel/mlerrei hen, während die �lamentösen Partikel seltener auftreten (bis zu 1011 Partikel/ml).

Abb. 1.1: S hematis he Struktur der Hepatitis-B-Virus Partikel (entnommenaus Modrow et al., 2003)

1 Einleitung 5Das parallele Auftreten von Virionen, sphäris hen und �lamentösen Partikel zeigt die fol-gende elektronenmikroskopis he Aufnahme von Serum eines Virusträgers.Abb. 1.2: Elektronenmikroskopis he Darstellung der Hepatitis-B-Virus Parti-kel (entnommen aus Ganem und Prin e, 2004)GenomorganisationDas Hepatitis-B-Virus besitzt ein zirkuläres, partiell doppelsträngiges DNA-Genom, wel- hes je na h Genotyp 3.181 bis 3.221 bp groÿ ist (Abb. 1.3). Der Minus-Strang weist eineLänge von a. 3.200 Nukleotiden auf, während der Plus-Strang mit einer Länge von 1.000- 2.500 Nukleotiden unvollständig ist (Hruska und Robinson, 1977; Landers et al., 1977).Der Minus-Strang bindet am 5'-Ende das terminale Protein (TP) der viralen Polymerasekovalent, während am 3'-Ende des Plus-Strangs die DNA-Polymerase/Reverse Transkripta-se ni htkovalent assoziiert vorliegt. Die Zirkularisierung der zwei DNA-Stränge erfolgt dur hÜberlappen einer komplementären 226 bp-langen Sequenz zwis hen den 5'-Enden der beidenStränge über die dire t repeats DR1 und DR2.

Abb. 1.3: S hematis he Genomorganisation des Hepatitis-B-Virus (entnom-men aus Modrow et al., 2003)

1 Einleitung 6Die virale Nukleinsäure enthält vier o�ene, si h teilweise überlappende Leserahmen, diein vers hiedenen Leserastern abgelesen werden. Die PräCore/Core-Region kodiert für dasPräkapsid- und das Kapsidprotein, die PräS/S-Region kodiert die drei Ober�ä henproteine,die P-Region die virale Polymerase (P-Protein) und die X-Region das HBx-Protein (Tiollaiset al., 1985).Der kodierende Berei h für die Ober�ä henantigene enthält die kodierende Region für daskleine HBsAg, dem am 5'-Ende die PräS1- und PräS2-Region vorangestellt sind. In Ab-hängigkeit vom Start der Translation können dadur h die drei vers hiedenen Formen desOber�ä henantigens synthetisiert werden.In ähnli her Weise liegt im 5'-Berei h der Core-Region der sog. PräCore-Berei h, der bei derSynthese des Hepatitis-e-Antigens abgelesen wird (Kramvis und Kew, 1999).Die Genexpression wird reguliert von vier Promotoren und zwei Enhan ern, die unabhän-gig voneinander gesteuert werden können. Der Core-Promotor ist verantwortli h für dieTranskription der prägenomis hen RNA. Der X-Promotor reguliert die Transkription einer700 bp-langen mRNA für das HBx-Protein. Die Synthese des lHBsAg wird kontrolliert dur hden PräS1-Promotor, wohingegen das mHBsAg und das sHBsAg von einem gemeinsamenPräS2/S-Promotor reguliert werden.Da die virale DNA-Polymerase aufgrund fehlender oder ungenügend wirksamer Exonuklease-Aktivität nur eine unzurei hende Korrekturlesefunktion ausüben kann und die genetis heInformation äuÿerst konzentriert vorliegt, treten häu�g Mutationen im Genom auf. Dabeiführen bereits einzelne Nukleotid-Austaus he zu pleiotropen E�ekten, so dass si h die meis-ten Mutationen als signi�kante Na hteile während der Virusreplikation erweisen und fürdas Virus letal sind. Bestimmte Mutationen können si h jedo h unter entpre hendem Se-lektionsdru k dur hsetzen und dadur h z. B. zu einer Resistenz gegenüber antiviralen Sub-stanzen oder zu einem Auftreten von sog. Immune-es ape-Varianten führen (Protzer undS haller, 2000). Treten Mutationen bei den Genen für die Ober�ä henproteine auf, kön-nen mehrere Leserahmen beein�usst werden. Nukleotid-Austaus he in der S-Region wirkensi h mögli herweise aufgrund der Rolle des sog. major hydrophili loop (MHL) als Ziel so-wohl neutralisierender als au h diagnostis her Antikörper in der Immunantwort als au hletztli h bei der Detektion des HBsAg in diagnostis hen Systemen na hteilig aus (Hollinger,2007). Zusätzli h zu Immune-es ape-Varianten führen entspre hende Mutationen au h zuDiagnosis-es ape-Varianten.

1 Einleitung 7Virale ProteineDie virale Nukleinsäure kodiert für die in Tabelle 1.1 gelisteten Proteine.Leserahmen Bezei hnung MWOber�ä henproteine kleinesAntigen S-Region sHBsAg 24 kD27 kD glykosyliertmittleresAntigen PräS2-S-Region mHBsAg 33 kD36 kD glykosyliertgroÿesAntigen PräS1/PräS2-S-Region lHBsAg 39 kD42 kD glykosyliertNukleokapsidproteine Core-Antigen C-Region HB Ag 22 kDHepB-earlyAntigen PräC-C-Region HBeAg 16 kDHepatitis-B-X-Protein X-Region HBxAg 17 kDHepatitis-B-Polymerase P-Region Polymerase 90 kDTab. 1.1: Virale Proteine des Hepatitis-B-VirusDie Ober�ä henantigene (HBsAg) werden im rauen endoplasmatis hen Retikulum gebildet,während posttranslationale Modi�kationen im Golgi-Apparat erfolgen (Hollinger, 1996). Dersog. major hydrophili loop (MHL) be�ndet si h auf der äuÿeren Ober�ä he der viralenHüllmembran. Die in diesem Berei h liegende a-Determinante stellt als Bindungsstelle fürspezi�s he Antikörper das wi htigste immunogene Epitop der Ober�ä henantigene dar.Das virale Kapsid-Protein (HB Ag) entsteht dur h Translation des Core-Leserahmens undbildet die Strukturkomponenten des viralen Nukleokapsids (Crowther et al., 1994).Das HBe-Protein (Hepatitis B early protein) entsteht dur h Translation der PräCore- undCore-Region und ans hlieÿender Prozessierung des Vorläuferproteins. N-terminale Modi�-kation dieses Vorläuferproteins führt zum Auftreten eines Zwis henproteins, wel hes na hSpaltung in der C-terminalen Region das HBe-Protein bildet (Kramvis und Kew, 1999). DerGroÿteil des produzierten HBe-Proteins wird sezerniert. Bereits 1972 wurde dieses lösli heProtein entde kt und gilt seitdem als serologis her Marker für die virale Genexpression undReplikation (Ou, 1997).Die Translation des o�enen Leserahmens der viralen Polymerase liefert ein multifunktionellesProtein mit vier vers hiedenen Domänen (Ganem, 1996). Das terminale Protein ist für dasPriming bei der DNA-Synthese verantwortli h. Die Reverse Transkriptase zeigt RNA- undDNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Eine Ribonuklease (RNase H) spaltet währendder reversen Transkription die RNA. Diese Ribonuklease-Aktivität ist zusätzli h beteiligt ander Verpa kung der viralen RNA, am optimierten Priming des kodierenden Stranges und ander Elongation der viralen Minus-Strang-DNA (Nassal, 2008).Beim HBx-Protein handelt es si h um ein ni htstrukturelles, akzessoris hes Protein desHepatitis-B-Virus mit vielfältigen, regulatoris hen Funktionen (Tang et al., 2006). Es dient

1 Einleitung 8als Transaktivator für die virale und zelluläre Genexpression und hat darüber hinaus on-kogenes Potential (Su und S hneider, 1997; Diao et al., 2001; Murakami, 2001; Lee et al.,2002).ReplikationszyklusDer Replikationszyklus der Hepadnaviridae (Abb. 1.4) ist harakterisiert dur h die Synthesedes 3,2-kb groÿen, partiell doppelsträngigen und zirkulären DNA-Genoms.

Abb. 1.4: Replikationszyklus des Hepatitis-B-Virus (na h NTHU, 2008)Na h der spezi�s hen Bindung des Virus an die Hepatozyten erfolgt die Aufnahme des Viri-ons in die Zelle, wobei der zelluläre Rezeptor für das Virus im humanen System no h ni htidenti�ziert wurde (Lu und Blo k, 2004).Na h Internalisierung der Virionen wird im Zytoplasma das Nukleokapsid freigesetzt undzum Nukleus transportiert. Über Kernporenkomplexe gelangt das virale Genom in das Kern-innere.Im Nukleus wird die partiell doppelsträngige genomis he DNA dur h zelluläre Enzyme kom-plettiert. Dur h Entfernung des RNA-Oligonukleotides und des terminalen Proteins, Abspal-tung des Überhanges am Minus-Strang, Vervollständigung des Plus-Stranges und kovalenteLigation der beiden Stränge entsteht die DNA ( ovalently losed ir ular DNA). Die - DNA wird in Nukleosomen konzentriert und bildet sog. virale Mini hromosomen, die alsMatrize für die ans hlieÿende Transkription der viralen mRNAs dienen (Nassal, 2008).Ausgehend von den Mini hromosomen werden dur h die zelluläre DNA-abhängige RNA-Polymerase II genomis he und subgenomis he Transkripte synthetisiert. Dabei treten viermRNA-Klassen auf, die unters hiedli he Startpunkte, aber jeweils das glei he 3'-Ende (Po-lyadenylierungssequenz) besitzen (Kann und Gerli h, 1998). Die als prägenomis he RNAbezei hnete 3,5-kb lange mRNA weist eine Überlänge auf. Das Abs hreiben dieser mRNAvon der DNA führt zur Synthese des HB Ag und der viralen Polymerase. Eine 3,1-kb lan-ge mRNA dient als Matrize für das HBe-Antigen. Für die Bildung der Ober�ä henantigene

1 Einleitung 9stehen die 2,4-kb und die 2,1-kb mRNA zur Verfügung. Eine kurze mRNA von 0,7-kb-Längedient der Synthese des HBxAg. Na h Modi�kation der 5'-Enden dur h Cap-Strukturen undPolyadenylierung der 3'-Enden dur h zelluläre Enzyme werden die viralen mRNAs ins Zy-toplasma exportiert und translatiert.Im Zytosol lagern si h die synthetisierten HB -Dimere zum Viruskapsid zusammen. We h-selwirkungen zwis hen der DNA-Polymerase und den HB -Proteinen sowie zwis hen derPolymerase und der prägenomis hen RNA führen zur Kapsidbildung mit Aufnahme desRNA-Polymerase-Komplexes (Bartens hlager et al., 1990; Lott et al., 2000). Die Polymera-se erkennt und bindet nun spezi�s h das ε-Verpa kungssignal, eine RNA-Sekundärstrukturam 5'-Ende der prägenomis hen RNA (Junker-Niepmann et al., 1990). Mit der Inkorpora-tion der viralen prägenomis hen RNA beginnt die reverse Transkription und Reifung derneugebildeten Viruspartikel (Polla k und Ganem, 1994).Die weiteren S hritte der Virusreplikation �nden innerhalb der Core-Partikel im Zytoplasmastatt. Als Primer für die sog. Erststrangsynthese dient die N-terminale Domäne der viralenPolymerase � das terminale Protein. Dur h reverse Transkription wird das RNA-Prägenomin einzelsträngige DNA übers hrieben, währenddessen die RNase H-Aktivität der Polyme-rase den RNA-Anteil des entstehenden Duplexmoleküls degradiert. Der neu synthetisierteMinus-DNA-Strang dient während der sog. Zweitstrangsynthese als Matrize für die Synthesedes Plus-Strangs. Die Synthese des Plus-Strangs kommt na h ungefähr zwei Dritteln zumErliegen, so dass der Plus-Strang 50 bis 70 % der Länge des Minus-Strangs errei ht unddie reife genomis he DNA in ihrer harakteristis hen, partiell doppelsträngigen, zirkulären,aber ni htkovalent ges hlossenen Form entsteht (Ganem, 1996). Die umhüllten Virionen undsubviralen Partikel werden sezerniert.Die Regulation der viralen DNA zum Zwe ke der Etablierung einer Persistenz ist ein zen-traler Aspekt der Hepatitis-B-Virusreplikation (Caruntu und Molagi , 2005). Über Neuin-fektion der Hepatozyten mit dem Virus oder dur h Wiedereintritt neu synthetisierter viralerDNA in den Nukleus kann die Aufre hterhaltung der viralen Replikation gesteuert werden.

1 Einleitung 101.4 Die Hepatitis-BDie �Hepatitis-B� ist eine dur h das Hepatitis-B-Virus hervorgerufene akute oder hronis heLeberentzündung. Eine Primärinfektion kann si h in einer akuten Erkrankung äuÿern, ver-läuft jedo h in der Mehrheit der Fälle inapparent.Symptomatik der Hepatitis-BDie Übertragung von Hepatitis-B-Viren ges hieht dur h Blut oder blutkontaminierte Körper-�üssigkeiten, wobei kleinste Mengen für eine Infektion genügen können. Na h der Inokulationgelangt das Virus über den Blutweg in die Leber. Die Inkubationszeit der Hepatitis-B beträgtse hs Wo hen bis se hs Monate. Im Prodromalstadium treten Appetitlosigkeit, Muskel- undGelenkbes hwerden, Fieber, Übelkeit, Erbre hen und ein allgemeines Krankheitsgefühl auf.Das akute Stadium ist harakterisiert dur h Ikterus, dunklen Urin, entfärbten Stuhl undtastbare Leber- und Milzvergröÿerung. Es zeigen si h starke paren hymale Leberverände-rungen und Entzündungsreaktionen, wobei die antivirale Immunantwort das pathogeneti-s he Ges hehen bestimmt. Das Virus selbst weist eine sehr geringe Zytopathogenität auf.Die starken Gewebes hädigungen entstehen � ausgehend von vers hiedenen Immunzellen �dur h Zytolyse in�zierter Hepatozyten (Vierling, 2007).Verlaufsformen der Hepatitis-BBei an Hepatitis-B-Erkrankten können vers hiedene Krankheitsverläufe auftreten. Bei a.1 % kommt es zu einer fulminanten Hepatitis, die unbehandelt im Leberversagen endetund oft tödli h verlaufen kann. Ein selbstlimitierender Verlauf mit Elimination des Virus,Ausheilung der Erkrankung und Erwerb einer lebenslang s hützenden Immunität tritt in a.90 % aller Hepatitis-B-Fälle bei Erwa hsenen auf. Bei 5 bis 10 % der Patienten älter als12 Jahre und in über 95 % bei perinatal erworbener HBV-Infektion entwi kelt si h jedo heine hronis he Hepatitis (Rehermann und Nas imbeni, 2005).Die hronis he Hepatitis rei ht von der Hepatitis des s heinbar gesunden Virusträgers ohneklinis he Symptome bis hin zur hronis h-aggressiven Hepatitis mit starker Virusvermeh-rung und erhebli hen entzündli hen Veränderungen der Leber. Als Folge einer hronis henHepatitis-B kann dur h die S hädigung des Lebergewebes eine Fibrose entstehen, die na hmehrjährigem Verlauf zur Leberzirrhose forts hreiten und bis zum Leberversagen führenkann. Neben der Zirrhose, die per se onkogen ist, ist au h das Virus selbst onkogen undkann die Entwi klung eines hepatozellulären Karzinoms bewirken (Bre hot, 2004; Szabo etal., 2004).

1 Einleitung 11Diagnostik der Hepatitis-BDie Diagnostik der Hepatitis-B-Virusinfektion beruht auf dem serologis hen Na hweis viralerAntigene und spezi�s her Antikörper sowie der viralen DNA. Das zeitli he Muster der sero-logis hen Marker ist dabei die Grundlage für die Beurteilung des Infektionsstatus (Servossund Friedman, 2004; Hatzakis et al., 2006; Hollinger, 2007; Valsamakis, 2007).Der Na hweis von HBV-DNA im Serum wird als Marker einer signi�kanten Virämie ange-sehen. Bereits in der Frühphase der Infektion ist der direkte Virusna hweis mittels PCRoder Hybridisierungsassays mögli h und erlaubt eine Beurteilung der Virus-Aktivität undInfektiosität.HBsAg kennzei hnet eine HBV-Infektion und kann bereits in der Frühphase der Infektionserologis h na hgewiesen werden. HBsAg zeigt das Vorhandensein von Virus in der Leberund potentielle Infektiosität an.HBeAg gilt als Replikationsmarker, wobei die Höhe des HBeAg-Titers in gewisser Korrelationzur Infektiosität steht.Der Na hweis spezi�s her Antikörper gegen die viralen Antigene erlaubt ebenfalls eine denInfektionsstatus der Hepatitis-B kennzei hnende Beurteilung. Antikörper gegen das viraleOber�ä henprotein � anti-HBs � treten erst na h völligem Vers hwinden von HBsAg aufund harakterisieren eine abgelaufene Infektion. Das na h Serokonversion von HBeAg ent-stehende anti-HBe steht für eine meist niedrige Virus-Aktivität und damit geringe Infek-tiosität. Anti-HB -IgM bzw. anti-HB -IgG (Antikörper gegen das virale Kapsid-Antigen)bleiben na h Kontakt mit HBV lebenslang erhalten und sind Marker einer stattgefundenenInfektion. Da es in allen Infektionsverläufen auftritt, dient anti-HB als epidemiologis herDur hseu hungsmarker.Therapie der Hepatitis-BDie primären Ziele einer antiviralen Therapie sind eine Senkung der Viruslast und Vermin-derung der intrahepatis hen entzündli hen Aktivität. Als therapeutis he potentielle Lang-zeite�ekte werden damit die Verhinderung von Zirrhose und hepatozellulärem Karzinomangestrebt. Eine erfolgrei he Therapie bewirkt eine dauerhafte Reduktion der Viruslast, dau-erhafte Serokonversion zu anti-HBe sowie Verlust des HBsAg (Balsano und Alisi, 2008).Die akute Hepatitis-B heilt bei Erwa hsenen in über 90 % der Fälle spontan aus, so dass in derRegel nur die klinis hen Symptome behandelt werden, da eine Verbesserung der Ausheilungdur h eine antivirale Therapie kaum na hweisbar zu sein s heint (Cornberg et al., 2007).Zur Behandlung der hronis hen Hepatitis-B gibt es gegenwärtig zwei vers hiedene Behand-lungsoptionen. Zum einen werden immunmodulierende Substanzen wie z. B. Interferon-αin der Therapie verwendet, zum anderen die Virusreplikation hemmende Nukleosid- undNukleotidanaloga. Die immunmodulatoris he antivirale Wirkung von rekombinantem IFN-α

1 Einleitung 12wird dur h eine unspezi�s he Stimulation der zellulären Immunantwort (z. B. Erhöhung derExpression des Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I oder Aktivierung zytotoxis herT-Lymphozyten) vermittelt. Nukleosidanaloga wie z. B. Lamivudin, Telbivudin oder Ente- avir bzw. Nukleotidanaloga wie Adefovir oder Tenofovir hemmen die Virusreplikation aufdirektemWege. Die Analoga wirken über Kompetition mit Nukleosiden bzw. Nukleotiden umden Einbau in den wa hsenden DNA-Strang. Die folgende Hemmung der DNA-Polymerasemit ans hlieÿendem Kettenabbru h resultiert in einer Verminderung der viralen Replikation.Da das Absetzen der Therapie mit Nukleosidanaloga in einem Wiederanstieg der Virämieresultiert, muss die antivirale Therapie über einen längeren Zeitraum, u. U. lebenslang,dur hgeführt werden. Jedo h führte die Entwi klung und der Einsatz spezi�s her antiviralerDauertherapien zum Auftreten vers hiedener resistenter HBV-Varianten, was ein virologi-s hes Ni htanspre hen auf die Behandlung zur Folge haben kann (Balsano und Alisi, 2008;Ferir et al., 2008).Immunprophylaxe der Hepatitis-BDur h die aktive und passive Immunisierung ist eine gezielte Prophylaxe der Hepatitis-Bmögli h. Im Jahre 1992 empfahl die Weltgesundheitsorganisation WHO allen Ländern diegenerelle Impfung gegen Hepatitis-B (Hollinger et al., 2007). Da der Mens h der einzig epide-miologis h relevante Wirt des Hepatitis-B-Virus ist, könnte dur h die weltweite Umsetzungdieser Empfehlung die Hepatitis-B langfristig ausgerottet werden.Aktive ImmunprophylaxeDie wi htigste und erfolgrei hste präventive Maÿnahme gegen eine Hepatitis-B-Virusinfektionist die aktive Impfung, wel he die Induzierung einer adaptiven Immunantwort zur Folge hat.Für die aktive Immunisierung wird ein gente hnis h hergestellter Totimpfsto� verwendet,der mit Hilfe des Hefesystems Sa haromy es erevisiae gewonnen wird. Dieses Kultursys-tem ermögli ht die Expression intakter 22 nm-Partikel, die nur ni ht glykosyliertes HBsAgenthalten (Waters et al., 1987). Die 22 nm-Partikel bilden die immunogene Komponente fürdie aktive Immunisierung und induzieren die Bildung neutralisierender Antikörper, die gegendie a-Determinante im sHBsAg geri htet sind (anti-HBs) (Zu kerman, 2000; In hauspe undMi hel, 2007). Die Grundimmunisierung gegen HBV besteht aus drei Impfungen und ist inden Routineimpfplan für Säuglinge und Kleinkinder integriert (Cornberg et al., 2007).Die Aktivierung HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen ist essenziell für die Stimulation spezi-�s her B-Lymphozyten und die dadur h initiierte Produktion von anti-HBs. Szmuness etal. zufolge entwi keln über 95 % der Geimpften eine humorale Immunität mit s hützendemanti-HBs-Titer (Szmuness et al., 1980). Zudem treten HBsAg-spezi�s he T-Helferzellen unddie T-zellabhängige Synthese neutralisierender Antikörper bereits innerhalb von zwei Wo- hen na h der Immunisierung auf (Bo her et al., 1996; Bo her et al., 1999). Na h Kontakt

1 Einleitung 13mit HBsAg setzen die imp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen die Zytokine IL-2,IFN-γ und TNF-α frei (Bo her et al., 1999; Bauer et al., 2002). Die Immunisierung dur hdie HBV-Vakzine führt bei den Imp�ingen zu einer unters hiedli hen Reaktivität, die si hserologis h anhand des Antikörper-Titers bestimmen lässt. Vers hiedene Studien konntenallerdings zeigen, dass a. 80 % der Geimpften, die auf die Impfung ni ht anspre hen � trotzfehlender bzw. s hwa her humoraler Immunität � eine zelluläre Immunität aufbauen können,deren Bedeutung no h ungeklärt ist (Jarrosson et al., 2004; Bauer und Jilg, 2006).Passive ImmunprophylaxeEine passive Immunisierung mit Hepatitis-B-spezi�s hem Immunglobulin dient vor allemder postexpositionellen Prophylaxe. Spezi�s he Immunglobulin-Präparate werden aus Serenvon Patienten mit einer abgelaufenen HBV-Infektion und zum Teil aus Seren von geimpftenPersonen gewonnen. Deshalb enthalten sie neben anti-HBs au h anti-HB . Der hohe Titer anAntikörper gegen HBsAg dieser Hyperimmunglobulinpräparate vermittelt über Komplexie-rung freier Virionen einen sofortigen S hutz na h Kontakt mit dem Virus. Da der Antikörper-vermittelte S hutz nur bis zum Abfall des Titers anhält, erfolgt die passive Immunisierungmeist in Kombination mit dem Totimpfsto� als aktiv-passive Immunisierung (Zu kerman,2007). Die aktiv-passive Impfung ist besonders wi htig für Neugeborene HBV-in�zierter Müt-ter. Die passive Immunisierung dient � neben der postexpositionellen Indikation � au h zumS hutz vor Reinfektion mit dem Virus na h einer Lebertransplantation sowie der Prophylaxeimmunsupprimierter Patienten und Personen, die dur h eine aktive Impfung keinen eigenenImpfs hutz aufbauen können.Aktiv-passive Postexpositionsprophylaxe bei Neugeborenen HBV-in�zierter MütterBesonders gefährli h ist die Infektion Neugeborener dur h HBsAg-positive Mütter, da hierein hohes Risiko zur Entwi klung einer hronis hen Hepatitis besteht (Rehermann und Nas- imbeni, 2005). Zur Verhinderung der Infektion bei Neugeborenen von Hepatitis-B-in�ziertenMüttern sollte die passive Immunisierung innerhalb von zwölf Stunden postnatal erfolgen.Zusätzli h sollte die Grundimmunisierung mit Hepatitis-B-Impfsto� begonnen werden. DieÜbersi htsarbeit von Lee et al. bes hreibt die E�zienz der aktiv-passiven Postexpositions-prophylaxe, die in 85 bis 95 % aller Fälle einen S hutz bei perinataler Übertragung undspäterer Infektion im Kleinkindalter bewirkt (Lee et al., 2006).

1 Einleitung 141.5 ImmunpathogeneseDie angeborene und erworbene Immunität im Überbli kDie angeborene oder natürli he Immunität, die für die frühen Phasen einer Abwehrreaktionverantwortli h ist, setzt si h zusammen aus phagozytotis hen Zellen (Neutrophile, Monozy-ten und Makrophagen) und aus Zellen, die in�ammatoris he Mediatoren freisetzen (Baso-phile, Mastzellen und Eosinophile) sowie aus Natürli hen Killer-Zellen. Toll-like-Rezeptoren(TLR), die sowohl intrazellulär (TLR7, TLR8 und TLR9) als au h auf der Ober�ä he(TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 und TLR11) v. a. von Makrophagen auftreten, stelleneinen konservierten Abwehrme hanismus dar und haben in der angeborenen Immunität ei-ne besondere Bedeutung. Über Erkennung und Bindung pathogen-assoziierter molekularerMuster (pathogen-asso iated mole ular patterns; PAMPs) setzen sie Signalkaskaden in Gang,die über Aktivierung vers hiedener immunologis h aktiver Zellpopulationen eine erste, zeit-li h ras h auftretende Immunreaktion induzieren. Die adaptive oder erworbene Immunitäthingegen wird dur h antigenspezi�s he B- und T-Lymphozyten vermittelt, die dur h Infek-tion oder Impfung induziert werden. Eine e�ektive Elimination von Pathogenen resultiertin der Regel aus der Kombination von angeborener und erworbener Immunität (Delves undRoitt, 2000a; Delves und Roitt, 2000b).Neben der B-Lymphozyten-vermittelten humoralen Immunität spielt die T-Lymphozyten-vermittelte zelluläre Immunität eine ents heidende Rolle bei der adaptiven Immunantwort.Es gibt zwei wi htige Untergruppen von T-Zellen mit unters hiedli hen E�ektorfunktionen,die die Zellober�ä henproteine CD4 oder CD8 tragen:Phänotyp Subpopulation E�ektorfunktionen vermittelt dur hCD3+/ CD4+ T-Helferzellen TH-Typ1 IL-2, IFN-γ, TNF-α Makrophagen-AktivierungCD3+/ CD4+ T-Helferzellen TH-Typ2 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 B-Zell-AktivierungCD3+/ CD8+ zytotoxis he T-Zellen CTL IL-2, IFN-γ, Perforine Lyse virusin�zierter ZellenTab. 1.2: Funktionale Klassen der E�ektor-T-LymphozytenVor allem TNF-α und IFN-γ haben ents heidende Bedeutung an der Regulation immunologi-s her Prozesse und Antworten (Herbein und O'Brien, 2000; Randall und Goodbourn, 2008).Dabei kann die primär antivirale Wirkung der von T-Lymphozyten sezernierten Zytokineoftmals au h � wie bei der Hepatitis-B � für pathogenetis he E�ekte und Zells hädigungenverantwortli h sein (Guidotti und Chisari, 1999; Guidotti und Chisari, 2000).T-Lymphozyten erkennen die dur h HLA-Moleküle präsentierten Fremdantigene über ihrenT-Zell-Rezeptor. Über die T-Zell-Ober�ä henproteine CD4 bzw. CD8 erfolgt während derAntigenerkennung eine spezi�s he Bindung an de�nierte Berei he der HLA-Moleküle, wobeiCD8+T-Zellen an HLA-Klasse-I-Moleküle und CD4+T-Zellen an HLA-Klasse-II-Moleküle

1 Einleitung 15binden. In Kombination mit dem sog. CD3+-Komplex, der na h Bindung des HLA-Peptid-Komplexes für die Signalübertragung zuständig ist, fungieren die CD4- bzw. CD8-Proteineals wi htige Korezeptoren.Die Leber als immunologis h aktives OrganDie Leber gilt als zentrales Organ des gesamten Sto�we hsels und ist Zielgewebe des hepato-tropen Hepatitis-B-Virus. Die Blutzufuhr � und damit der Transport des Virus � in die Lebererfolgt zum einen über die hepatis he Arterie, zum anderen wird nährsto�rei hes Blut vomDarm über die Pfortader in die Leber transportiert. Das Blut strömt dur h die Sinusoide� das Kapillarnetz der Leber � und verlässt die Leber über die Lebervene.Lebergewebe besteht zu a. 65 % aus Hepatozyten, der Rest sind ni htparen hymale, haupt-sä hli h sinusoidale Zellen. Die Sinusoide enthalten neben den Endothelzellen (lebersinu-soidale Endothelzellen, LSEZ) vor allem leberresidente Makrophagen (Kup�er-Zellen) undIto-Zellen (Fett-spei hernde Zellen) (Knolle und Gerken, 2000). Zudem �ndet man im Le-bergewebe residente dendritis he Zellen und Lymphozyten. Die LSEZ bilden zusammen mitden phagozytierenden Kup�er-Zellen einen wi htigen Teil des angeborenen Immunsystems(Enomoto et al., 2004; Naito et al., 2004).Die Kup�er-Zellen, die hepatis hen dendritis hen Zellen und die LSEZ exprimieren als le-berspezi�s he Antigen-präsentierende Zellen HLA-Klasse-I- und Klasse-II-Moleküle auf ih-rer Ober�ä he und können Fremdantigene � sezernierte Antigene oder DNA-Partikel HBV-in�zierter Hepatozyten � aufnehmen, prozessieren und den CD4+T-Zellen bzw. CD8+T-Zellen präsentieren (Knolle und Limmer, 2003).Immunpathogenese der Hepatitis-BZahlrei he Untersu hungen zur Pathogenese der Hepatitis-B im humanen System und imTiermodell erbra hten eindeutige Hinweise, dass das Virus selbst ni ht zytopathogen ist unddie Hepatitis dur h zelluläre virusspezi�s he und angeborene, unspezi�s he Immunreaktioneninitiiert wird. Neben der virusspezi�s hen, T-Zell-vermittelten Lyse in�zierter Hepatozytenspielen au h in�ammatoris he Zytokine, die von antigenspezi�s hen und unspezi�s hen mo-nonukleären Zellen sezerniert werden, eine wi htige Rolle, da sie direkt und ni htzytolytis heine Inhibition der Virusreplikation und der viralen Genexpression induzieren (Guidotti undChisari, 2001). Für die e�ektive Kontrolle der Infektion mit dem Ziel der Viruseliminationsind sowohl zelluläre als au h humorale Immunme hanismen nötig (Wieland und Chisari,2005; Rehermann, 2007). Dabei ents heidet die Di�erenzierung der CD4+T-Zellen in diein�ammatoris hen TH-Typ1- oder die TH-Typ2-E�ektorzellen, ob eine zelluläre und anti-genspezi�s he Immunantwort oder eine humorale Immunantwort vorherrs hend sein wird.Patienten mit einer akuten, selbstlimitierenden Infektion zeigen vorwiegend ein TH-Typ1-spezi�s hes Zytokinmuster, während hronis h In�zierte ein variables Muster einzelner TH-

1 Einleitung 16Typ1- und TH-Typ2-Klone in Kombination vers hiedener Zytokine aufweisen (Inoue et al.,1989; Barnaba et al., 1994; Kakumu et al., 1994).In vers hiedenen Modellsystemen wurde eine Zytokin-vermittelte antivirale Wirkung auf dieHepatitis-B-Virusreplikation gezeigt. Allen voran stehen IFN-γ und TNF-α (Guidotti et al.,2002). IFN-γ und IL-2 wirken au h indirekt über Aktivierung von Lebermakrophagen zur Se-kretion von TNF-α, wel hes konsekutiv die Expression von viralen Proteinen hemmt (Guilhotet al., 1993; Guidotti et al., 1994). Au h IL-12, wel hes von Antigen-präsentierenden Zellenproduziert wird, wirkt über Induktion der IFN-γ-Sekretion dur h T-Zellen und Natürli henKillerzellen stark inhibitoris h (Cavanaugh et al., 1997).Humorale Immunantwort na h Hepatitis-B-VirusinfektionBislang wurden in den Hüllproteinen, im Nukleokapsidprotein und im HBeAg immunogeneBerei he identi�ziert, die zur Induktion spezi�s her Antikörper-produzierender B-Zellen undzur Bildung von anti-HBs, anti-HB sowie anti-HBe führen.Die neutralisierenden Antikörper, die gegen die viralen Ober�ä henproteine geri htet sind,spielen eine ents heidende Rolle bei der Elimination des Virus. Anti-HBs komplexiert dur hBindung des HBsAg freie Viruspartikel und vermittelt zuglei h den S hutz vor einer Rein-fektion. Im Gegensatz dazu üben Antikörper gegen das Nukleokapsid (anti-HB ) sowie gegenHBeAg (anti-HBe) keine neutralisierende Funktion aus. Sie sind sowohl bei akut In�ziertenals au h bei hronis h In�zierten in hohen Titern na hweisbar (Huang et al., 2006).HLA-Klasse-II-restringierte CD4+T-Zellantworten na h Hepatitis-B-VirusinfektionHBV-spezi�s he HLA-Klasse-II-restringierte CD4+T-Zellantworten beoba htet man haupt-sä hli h bei Patienten mit akuter, selbstlimitierender Infektion. Diese starke, multispezi�s heund polyklonale Antwort ri htet si h primär gegen die Kapsidantigene HB Ag und HBeAgund führt zu einer Aktivierung HB Ag-spezi�s her zytotoxis her T-Zellen, wel he die viraleGenexpression und Replikation in der Leber ni htzytolytis h unterdrü ken können (Ferrariet al., 1990).Entgegen der hohen Immunogenität der Nukleokapsid-Antigene induzieren die viralen Ober-�ä henproteine (HBsAg) während der Infektion eine s heinbar s hwä her ausgeprägte Ex-pansion spezi�s her CD4+T-Zellen. Dass es si h bei HBsAg allerdings ni ht um ein generells hwa hes Immunogen handelt, zeigt die starke humorale Immunantwort und die HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellantwort bei immunisierten Personen (Celis et al., 1988; Jin et al.,1988).Als dominierende T-Helferzell-Immunreaktion in Zusammenhang mit der Eliminierung desVirus gilt die nukleokapsidspezi�s he CD4+T-Zellantwort. Weitere immunogene Epitope beider viralen Polymerase (identi�ziert von Mizukoshi et al., 2004) oder dem HBx-Antigen sind

1 Einleitung 17no h unzurei hend erfors ht, könnten aber in der Entwi klung neuer Vakzinierungsstrategienvon Bedeutung sein.Eine hronis he Hepatitis-B-Virusinfektion weist eine deutli h s hwä her ausgeprägte zellu-läre Immunantwort auf, die ni ht ausrei ht, die Infektion e�zient zu kontrollieren und dasVirus zu eliminieren.HLA-Klasse-I-restringierte zelluläre Immunantwort na h Hepatitis-B-VirusinfektionHLA-Klasse-I-restringierte CD8+T-Zellantworten bei Infektion mit dem Hepatitis-B-Virusri hten si h gegen vers hiedene Epitope des Nukleokapsids (Bertoletti et al., 1991; Penna etal., 1991), der Hüllproteine (Nayersina et al., 1993), der Polymerase (Nayersina et al., 1993)und des HBx-Antigens (Hwang et al., 2002). Die virusspezi�s he CD8+T-Zellantwort ist beider akuten, selbstlimitierenden Infektion bedeutend stärker ausgeprägt als bei hronis hemInfektionsverlauf (Vierling, 2007). Es wurde vielfa h gezeigt, dass für die Reduktion derViruslast im in�zierten Gewebe hauptsä hli h die zytotoxis hen CD8+T-Zellen ( ytotoxi T-lympho ytes, CTL) verantwortli h sind. Die antivirale Wirkung erfolgt dur h diese Zel-len sowohl auf zytolytis hem als au h ni htzytolytis hem Weg (Guidotti und Chisari, 2001;Bertoletti und Gehring, 2006).Die ni htzytolytis he antivirale Wirkung aktivierter CD8+T-Zellen resultiert aus Sekretionder Zytokine IFN-γ oder TNF-α, die eine e�ziente Inhibition der viralen Genexpressionund Replikation vermitteln. Zytolytis h wirken aktivierte CD8+T-Zellen über Induktion derApoptose in�zierter Zellen. Eine CTL-induzierte Apoptose betri�t insgesamt jedo h nur5 % aller Hepatozyten. Erst dur h das konsekutive Einwandern weiterer Entzündungszellenkommt es zu einer nekroin�ammatoris hen Reaktion des Gewebes. Na h Walewska-Ziele kaet al. bestehen die in�ltrierenden und in�ammatoris h-wirkenden Zellen zu 20 bis 25 %aus CD8+T-Zellen und zu 50 bis 60 % aus CD4+T-Zellen (Walewska-Ziele ka et al., 2008).Hinzu kommt die von aktivierten Kup�er-Zellen ausgelöste antigenunspezi�s he Zerstörungvon Hepatozyten dur h Sekretion von IFN-γ oder TNF-α.Die Bedeutung imp�nduzierter HBsAg-spezi�s her CD4+T-ZellenErste Hinweise auf eine mögli herweise bedeutende Rolle der HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen für den Verlauf der HBV-Infektion wurden dur h Untersu hungen an HBV-transgenenMäusen erbra ht. Na h Injektion HBsAg-spezi�s her TH1-Zell-Klone wurde in den entspre- henden Mäusen die Virusreplikation signi�kant reduziert. Verantwortli h für diese antivi-ralen E�ekte waren IFN-γ und TNF-α, die na h Antigenerkennung dur h die TH1-Zellenfreigesetzt wurden (Fran o et al., 1997). Mit Hilfe von T-Zell-Klonen HBV-geimpfter Per-sonen konnte gezeigt werden, dass HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen sowohl exogene alsau h endogene virale Hüll-Polypeptide erkennen. Die endogenen Hüllantigene werden den

1 Einleitung 18CD4+T-Zellen dur h HLA-Klasse-II-Moleküle auf der Ober�ä he von Leberzellen präsen-tiert (van den Oord et al., 1986; Penna et al., 1992). In transgenen HBsAg-exprimierendenMäusen wurde eine Reduktion der HBsAg-Produktion sowie der RNA-Expression dur h so-wohl CD8+T-Lymphozyten als au h CD4+T-Zellen beoba htet. Dabei war die Kinetik derAntigen-Reduktion dur h beide T-Zellpopulationen ähnli h und ebenso e�ektiv in der Elimi-nierung der viralen RNA. Daher bes hreiben Man ini et al. die TH1-Antwort als adäquateund starke Antwort des Immunsystems zur Kontrolle der viralen Expression bis hin zurVirus-Elimination (Man ini et al., 1998). Au h im S himpansen-Modell wurden Hinweisefür die Bedeutung der spezi�s hen CD4+T-Zellen gewonnen. Obwohl in einer späteren Pha-se der Infektion die Viruslast trotz zunehmender CD4+T-Zellen unverändert blieb, wurde inAbwesenheit der CD4+T-Zellen (Depletion der Zellen) eine länger andauernde Leberentzün-dung festgestellt. CD4+T-Zellen spielen demzufolge eine ents heidende Rolle in der frühenImmunantwort und sind somit essenziell für die Kontrolle des Virus (Thimme et al., 2003).Regulatoris he T-ZellenEs stellte si h heraus, dass regulatoris he T-Zellen (TReg-Zellen) eine bedeutende Rolle inder Suppression virusspezi�s her Immunantworten spielen. Natürli he TReg-Zellen mit demPhänotyp CD4+CD25+ tragen einen Anteil von ungefähr 5 bis 10 % der CD4+T-Zellen(Sakagu hi, 2005). Na h Manigold und Ra anelli unterdrü ken TReg-Zellen die Aktivierung,Proliferation, Di�erenzierung und E�ektorfunktionen vers hiedener Zelltypen, wie z. B. T-Lymphozyten, B-Zellen oder Natürli her Killer-Zellen. Die Kontrolle der Immunantwort er-folgt über Sekretion antiin�ammatoris her Zytokine, direkte Lyse der Zielzellen oder Zell-Zell-Kontakt-abhängige Me hanismen (Manigold und Ra anelli, 2007).Es wurde gezeigt, dass Patienten mit einer hronis hen HBV-Infektion signi�kant mehr TReg-Zellen im Blut als au h akkumuliert in der Leber vorweisen als Patienten mit akuter Infektion(Xu et al., 2006; Yang et al., 2007). Daneben initiierten CD4+CD25+TReg-Zellen eine erhöhtesuppressive Aktivität gegen HBV-spezi�s he T-Zellantworten. Diese Erkenntnisse führen zuder Vermutung, dass spezi�s he TReg-Zellen HBV-spezi�s he T-Zellen unterdrü ken und soents heidend an der Entstehung einer hronis hen Infektion beteiligt sind (Xu et al., 2006).Die Rolle der angeborenen Immunität bei der Hepatitis-B-VirusinfektionAls erste Barriere gegen Pathogene sollen die E�ektorme hanismen der angeborenen Im-munität die erworbene Immunität komplettieren und die E�ektivität der Pathogenabwehroptimieren. Im HBV-transgenen Mausmodell konnte gezeigt werden, dass über Toll-like-Rezeptoren ausgelöste Signalkaskaden oder die Aktivierung von Natürli hen Killer-Zellen so-wie Natürli hen Killer-T-Zellen zur Zytokinproduktion letztli h zu einer Inhibition der Virus-replikation führen (Kimura et al., 2002a; Kimura et al., 2002b; Isogawa et al., 2005). Cooperet al. zeigten, dass die HB Ag-induzierte Zytokinproduktion ursä hli h TLR2-vermittelt ist

1 Einleitung 19(Cooper et al., 2005). Obwohl die von unters hiedli hen Zellpopulationen der angeborenenImmunität sezernierten Zytokine IFN-γ und TNF-α eine Reduktion der viralen Replikationbewirken können, ist bisher ni ht eindeutig geklärt, wel he Rolle die angeborenen Immunme- hanismen in der Pathogenese bzw. Viruseliminierung während der Frühphase der Infektionspielen.1.6 Infektionsmodelle des Hepatitis-B-VirusWegen der globalen Bedeutung, die dur h das Hepatitis-B-Virus verursa hte Infektionen tra-gen, ist die Erfors hung dieses Virus anhand vers hiedener Tier- und Zellkultur-Modellsyste-me von immenser Wi htigkeit (Guha et al., 2004). Auf natürli hem Weg ist das Hepatitis-B-Virus nur für Mens hen und höhere Primaten infektiös (De Meyer et al., 1997). DieseSpeziesspezi�tät limitiert dabei die potenziellen Modellsysteme für eine direkte Untersu- hung des Virus. Neben der Speziesspezi�tät und dem Hepatotropismus stellt das Viruszudem Anforderungen an den Di�erenzierungsgrad seiner Zielzellen (S hulze-Bergkamen etal., 2003). Somit müssen für entspre hende in vitro Infektionsversu he primäre Leberzel-len verwendet werden, da die zur Verfügung stehenden humanen Hepatom-Zell-Linien auf-grund ihres geringen Di�erenzierungsgrades ni ht mehr in�zierbar sind. Na h Transfektionvon replikationskompetenten Plasmidkonstrukten können jedo h au h in den Hepatom-Zell-Linien (z. B. HepG2.4A5, HepG2.215) infektiöse Na hkommenviren gebildet werden, so dassmit diesem Modellsystem die späteren S hritte im Replikationszyklus des HBV weitgehendaufgeklärt werden konnten (Sun und Nassal, 2006). Da für die späteren S hritte keine strengeSpeziesspezi�tät besteht, konnten HBV-transgene Mausmodelle etabliert werden, bei denendie Versu hstiere entweder einzelne Virusproteine oder ein gesamtes Virusgenom als Fremd-gen enthalten (Chisari, 1996; Dandri et al., 2006). Dur h die Übertragung virusspezi�s herImmunzellen von HLA-identis hen Mäusen auf die transgenen Tiere konnten wi htige Er-kenntnisse zur Immunpathogenese der Hepatitis-B gewonnen werden.Einige der tierpathogenen Hepadnaviren sind zu wi htigen Modellen der HBV-Infektion ge-worden und geben Aufs hluss über die Biologie des Virus. Es existieren etablierte Modellefür die Hepatitis-Viren der Waldmurmeltiere (wood hu k hepatitis virus, WHV), der En-ten (du k hepatitis B virus, DHBV) und der Erdhörn hen (ground squirrel hepatitis virus,GSHV).Das WHV-Modell der Waldmurmeltiere stellt ein gutes System für die Untersu hung derviralen Karzinogenese dar, da diese Tiere bei einer hronis hen Infektion eine hohe Pro-gressionsrate zur Entwi klung eines Leberzelltumors aufweisen. Na hteile bei diesem Modellergeben si h aus der Gröÿe der Tiere und der Tatsa he, dass Waldmurmeltiere Winters hlafhalten (Menne und Cote, 2007).Das DHBV-Modell der Enten ist ein wi htiges Modell für die Untersu hung der einzelnenReplikationss hritte der Hepadnaviren und lieferte wi htige Beiträge zur Molekularbiologie

1 Einleitung 20dieser Virenfamilie. Aufgrund einer nur geringen Verwandts haft zwis hen dem DHBV unddem HBV können Ergebnisse aus dem DHBV-Modell nur mit gewissen Eins hränkungen aufdas humane Virus übertragen werden (S hultz et al., 2004; Funk et al., 2007).Bereits kurz na h der Entde kung und Identi�zierung des Hepatitis-B-Virus dienten S him-pansen als Modell für in vivo Studien. Na hdem ihre Empfängli hkeit für experimentelleHBV-Infektionen erkannt war, wurde die Hepatitis-B-Infektion über drei Jahrzehnte an die-sem in vivo Modell studiert (Mu hmore, 2001; Prin e und Brotman, 2001). Aus ethis henGründen sind diese Tiere jedo h nur begrenzt für experimentelle Untersu hungen verfügbar.Ein neueres in vitro Modell für das Hepatitis-B-Virus stellen primäre Hepatozyten der Spezi-es Tupaia belangeri dar (Cao et al., 2003). Tupaias sind asiatis he Spitzhörn hen, die inner-halb der Ordnung der S andentia zur Familie der Tupaiidae gehören und in den tropis henWäldern Südost-Asiens heimis h sind. Experimentelle in vivo Infektionen dieser Tiere führenauss hlieÿli h zu einer akuten, selbstlimitierenden Infektion und ni ht zu einer Chroni�zie-rung. Daher sind sie ni ht verglei hbar mit dem Verlauf einer natürli hen HBV-Infektion.Ergebnisse aus in vitro Infektionen von primären Tupaia-Hepatozyten deuten jedo h daraufhin, dass die Interaktionen der Viruspartikel mit den Zielzellen bei Tupaia-Hepatozyten undhumanen Hepatozyten sehr ähnli h sind. Somit s heint das in vitro Modell der primärenTupaia-Hepatozyten für die Untersu hung der ersten S hritte der Virusreplikation gut ge-eignet zu sein (Walter et al., 1996).Primäre humane Hepatozyten hingegen stellen ohne Zweifel das optimale in vitro Modellfür die Hepatitis-B-Virusinfektion dar, weil sie dem in vivo Verhältnis von Virus und Wirtbezügli h Speziesspezi�tät und Gewebetropismus am nä hsten kommen.Die S ha�ung entspre hender ethis h-re htli her Rahmenbedingungen für die Nutzung vonmens hli hem Material für wissens haftli he Zwe ke ermögli ht eine verbesserte Verfügbar-keit von primären humanen Hepatozyten. Für die Isolation humaner Hepatozyten stehenGewebestü ke von Operationspräparaten zur Verfügung, die bei Eingri�en zur Tumorentfer-nung in der Leber anfallen und na h feingewebli her Untersu hung ni ht mehr für diagno-stis he Zwe ke benötigt werden. Dur h die Entwi klung zells honender Isolationsmethodenwird die Vitalität der Hepatozyten na h dem Lösen aus dem Gewebeverband bewahrt. DieEtablierung von Bedingungen zur Erhaltung der Vitalität und der zellspezi�s hen Morpho-logie ermögli hen zudem eine Langzeit-Kultivierung (Ryan et al., 1993; Alpini et al., 1994).Im Zentrum für Leberzellfors hung (ZLF) am Klinikum der Universität Regensburg werdenunter standardisierten Bedingungen primäre humane Hepatozyten aus ni ht mehr benötig-tem mens hli hem Gewebe isoliert, konserviert und kultiviert. In enger Kooperation mit demZLF konnten von Böhm et al. am Institut für Medizinis he Mikrobiologie und Hygiene einstandardisiertes in vitro Infektionsmodell für das Hepatitis-B-Virus etabliert werden (Boehmet al., 2005).

1 Einleitung 211.7 Ziel der ArbeitDiese Arbeit hatte zum Ziel, die dur h aktive Immunisierung induzierten HBsAg-spezi�s henCD4+T-Zellen und deren Interaktion mit HBV-in�zierten humanen Hepatozyten funktionellzu harakterisieren. Dur h experimentelle Untersu hungen anhand der Infektionsmodelle derprimären humanen Hepatozyten und der Hepatom-Zell-Linien sollte die Wirkung von imp�n-duzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen auf die HBV-Infektion humaner Hepatozytenuntersu ht werden.Hierfür sollte zunä hst am humanen in vitro HBV-Infektionsmodell die Virusreplikationauf Protein- und RNA-Ebene untersu ht werden. Für den Na hweis der viralen Transkrip-tion sollte ein quantitatives E ht-Zeit RT-PCR-System etabliert werden, um damit die 3,5-kb RNA (prägenomis he RNA) sowie die 2,4-kb RNA (RNA für die Ober�ä henantigene) zudetektieren. Anhand der Na hweissysteme der Infektion auf Translations- und Transkripti-onsebene sollte die Wirkung der TH-Typ1-Zytokine IFN-γ und TNF-α auf die HBV-Infektionhumaner Hepatozyten untersu ht werden.Voraussetzung für die funktionellen Interaktionen der CD4+T-Zellen mit den Hepatozyten istdie Expression von MHC-Klasse-II in Lebergewebe. Deshalb sollte die Expression von MHC-Klasse-II sowie MHC-Klasse-I anhand etablierter quantitativer E ht-Zeit RT-PCR-Systemeuntersu ht werden.Na h Etablierung eines Kokulturmodells für Immunzellen und Hepatozyten sollte eine Beein-�ussung der Hepatitis-B-Virusreplikation dur h virusspezi�s he Immunzellen untersu ht undnäher harakterisiert werden. Parallel dazu sollten diese Versu he mit dem KontrollkollektivHBV-naiver Immunzellen ungeimpfter Spender dur hgeführt werden. Des Weiteren solltefestgestellt werden, dur h wel he lösli hen Faktoren � Zytokine � seitens der Immunzelleneine Beein�ussung der Virusreplikation vermittelt werden könnte.Zusammenfassend lassen si h die Ziele dieser Arbeit wie folgt formulieren:� Charakterisierung der Virusreplikation im humanen HBV-Infektionsmodell auf Protein-und RNA-Ebene� Untersu hung der antiviralen Wirkung der rekombinanten TH-Typ1-Zytokine IFN-γund TNF-α auf die HBV-Infektion� Überprüfung der MHC-Expression im humanen Hepatozyten-Kulturmodell als Grund-lage für die Interaktion von CD4+T-Zellen mit Hepatozyten� Etablierung eines Kokulturmodells für HBV-in�zierte Hepatozyten und Immunzellen� Untersu hung der E�ekte imp�nduzierter HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen auf dieHBV-Infektion humaner Hepatozyten� Identi�zierung der dur h die Kokultur bei den Immunzellen induzierten Zytokine

2 Material und Methoden 222 Material und Methoden2.1 ZellkulturAllgemeine BedingungenDie Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Zellen erfolgte unter Wasserdampf-Atmos-phäre bei 37°C und 5 % CO2 (Bruts hrank Heraeus Institutes; Langenselbold). Das FötaleKälberserum (FCS; PANTMBiote h; Aidenba h), das allen Kulturmedien zugesetzt wurde,wurde vor Gebrau h zur Zerstörung der Komplementfaktoren 30 Minuten bei 56°C hitzein-aktiviert.Bestimmung von Konzentration und Vitalität der ZellenDie Bestimmung der Konzentration und der Vitalität der in Kultur gehaltenen Zellen erfolgtemit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer, die die Quanti�zierung der Zellen dur h ein in dieZählkammer integriertes Raster ermögli ht. Dazu wurden 10 µl der Zellsuspension, fallsnötig 1 : 10 verdünnt, auf die Zählkammer aufgebra ht, wobei die unter dem Li htmikroskopermittelte Zellzahl aus 16 Kleinquadraten dur h Multiplikation mit dem Faktor 104 undeventuellem Verdünnungsfaktor die Anzahl von Zellen pro ml Gesamtkultur wiedergibt.Zur Bestimmung der Lebendzellzahl wurden 100 µl der Zellsuspension mit der glei hen Mengeeiner 0,5 %igen Trypanblau-Lösung (Sigma Aldri h; Taufkir hen) vermis ht. Diese Lebend-Tot-Färbung lässt tote, dur h Eindringen des Farbsto�es in die Zellmembran blau gefärbteZellen, von lebenden, transparenten Zellen unters heiden und so die Vitalität der Gesamt-kultur erre hnen.2.1.1 Primäre humane HepatozytenDie für diese Arbeit verwendeten primären humanen Hepatozyten stammten von Patienten,bei denen aufgrund eines sekundären Lebertumors eine Indikation zur Leberteilresektiongegeben war. Die Betreuung der Patienten und die operative Entfernung des Lebertumorserfolgte in der Klinik und Poliklinik für Chirurgie. Dur h die Stiftung Human Tissue andCell Resear h (HTCR) wurden die re htli h und ethis hen Rahmenbedingungen für die Ver-wendung des humanen Gewebes ges ha�en und die Aufklärung der Patienten zur Leber-zellspende dur hgeführt. Na h operativer Entfernung des Gewebes und histopathologis her

2 Material und Methoden 23Beguta htung im Institut für Pathologie wurde das ni ht benötigte gesunde Lebergewebezur weiteren Präparation der Leberzellen dem Zentrum für Leberzellfors hung (ZLF) über-geben und dem Institut für Medizinis he Mikrobiologie und Hygiene für die geplanten invitro Infektionsversu he zur Verfügung gestellt.Isolierung von primären humanen HepatozytenDie Isolierung und Reinigung primärer humaner Hepatozyten (PHH) wurde na h einer mo-di�zierten Zwei-S hritt-Kollagenase-Perfusionste hnik (Alpini et al., 1994) von Mitarbeiterndes ZLF dur hgeführt.Die gewogenen, tumorfreien und ni ht zirrhotis hen Leberresektate wurden mit Lo hson-den geeigneter Gröÿe kanüliert und mit Krebs-Ringer-Pu�er (154 mM NaCl; 5,6 mM KCl;25 mM NaHCO3; 20 mM HEPES; 5 mM Glukose; 1 mM EDTA; pH 7,4) zur Entfernungvon Blutresten gespült. Diese 10-minütige Perfusion wurde mit auf 37°C erwärmter, über po-röse Silikons hläu he arbogenierter Spüllösung dur hgeführt. Zum proteolytis hen Abbauder extrazellulären Matrix und zur Lösung der Hepatozyten aus dem Gewebeverband erfolg-te eine 10-minütige Kollagenase-Behandlung (0,05 % (w/v) Kollagenase und 5 mM CaCl).Na h Ö�nung der Kapsel mit einem Skalpell wurde das Gewebe in Was hpu�er (120 mMNaCl; 6,2 mM KCl; 0,9 mM CaCl2; 10 mM HEPES; 0,2 % (v/v) Rinderserumalbumin) ge-s hüttelt. Zur Vereinzelung der Zellen wurde diese Zellsuspension na heinander dur h zweiNylon-Netze mit 210 µm und 70 µm Porenweite �ltriert. Na h vorsi htiger Sedimentationder Hepatozyten wurden die Zellen dreimal mit Was hpu�er gewas hen und zur Anrei he-rung der vitalen Zellen dreimal im Auss hwingrotor zentrifugiert (20 × ge; 5 min; 4°C). Diekurzzeitige Lagerung der isolierten primären humanen Hepatozyten bis zur Inkulturnahmeerfolgte auf Eis.Inkulturnahme primärer humaner HepatozytenDas Aussäen der Hepatozyten erfolgte in Kulturmedium DMEM (Sigma Aldri h; Taufkir- hen) mit 10 % FCS, 1 % (v/v) Peni illin/Streptomy in (Sigma Aldri h; Taufkir hen), 1,4 %(v/v) Insulin (Insuman Rapid 40 IU/ml; Aventis Pharma; Bad Soden a. Ts.) und 0,8 % (v/v)Glukagon (Glu aGenr 1 IU/ml; Novo Nordisk A/S Bagsvaerd; Norwegen) auf Kollagen-bes hi hteten 6-well -Platten (Bio oat Collagen I Cellware; Be ton Di kinson; Heidelberg)in einer Konzentration von 1,6 × 106 Zellen pro well. Für eine glei hmäÿige Absetzung derHepatozyten und zur Vermeidung der Zusammenlagerung der Zellen in der Mitte der well,wurden die Hepatozyten na h Aussaat dreimal im Abstand von je 20 Minuten vorsi htigaufges hüttelt.

2 Material und Methoden 24Kultivierung primärer humaner HepatozytenZum Entfernen von versto�we hseltem und verbrau htem Kulturmedium und zur Aufre ht-erhaltung der Sto�we hselvorgänge der Hepatozyten wurde tägli h ein Medienwe hsel dur h-geführt. Je na h Vitalitätszustand der Zellen (beurteilt mittels Mikroskopie) wurde an Tag 2beziehungsweise Tag 3 na h der Inkulturnahme auf Kulturmedium mit Zusatz von 1 % (v/v)DMSO (Sigma Aldri h; Taufkir hen) umgestellt.In vitro Infektionen mit Hepatitis-B-Virus-haltigen SerenFür die in vitro Infektionsversu he wurden vers hiedene Serumproben hronis her Hepatitis-B-Virus-Träger aus der virologis hen Diagnostikabteilung des Instituts für Medizinis he Mi-krobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums Regensburg bezogen. Die Viruslast derverwendeten Serumproben, die über Ampli�zierung der viralen DNA mittels TaqMan-PCRbestimmt wurde, betrug 1 × 109 Virus-Kopien/ml. Die einzelnen Serumproben wurden na hder Blutentnahme aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.Die Infektion der primären humanen Hepatozyten mit Hepatitis-B-Virus erfolgte an Tag 6 bis8 na h Aussaat. Pro Infektionsansatz (well) wurde in 1 ml Inokulum eine Virus-Konzentrationvon 1 × 107 Kopien/ml eingesetzt. Dafür wurde das entspre hende Volumen des HBV-haltigen Serums zum Kulturmedium gegeben. Dem Inokulum wurden zusätzli h 5 % (w/v)PEG 6'000 (Fluka Chemie AG; Bu hs; S hweiz) zugesetzt, das aufgrund seiner fusogenenWirkung auf die Zellmembran die spezi�s he Anlagerung und Aufnahme des Virus erlei htert(Gripon et al., 1993).In allen Versu hsreihen wurde eine Negativ-Kontrolle mitgeführt, für die vor Infektionsbeginndie Zellen eines well mit EtOH abgetötet wurden. Hiefür wurden die Zellen drei Minutenmit 1 ml 50 % EtOH inkubiert. Na h Absaugen des EtOH wurden die Zellen dreimal mitKulturmedium für je mindestens 15 Minuten gewas hen.Für die Infektion wurden die Hepatozyten 14 Stunden mit dem viralen Inokulum inkubiert.Na h Abnahme der Infektionsüberstände wurden die Zellen in den folgenden zehn Stundenfünfmal � im Abstand von zwei Stunden � mit Kulturmedium gewas hen, um passiv gebun-dene und mit dem Inokulum im Übers huss zugeführte virale DNA und Antigene (HBsAg,HBeAg) zu entfernen. Je na h Fragestellung im jeweiligen Versu h wurden ab Tag 1 bisTag 14 na h Infektion die Zellüberstände im regelmäÿigen 24-Stunden-We hsel abgenommenund dur h neues Kulturmedium ersetzt. Die gesammelten Kulturüberstände wurden bis zuihrer quantitativen Vermessung von viraler DNA, HBsAg und HBeAg (vgl. Kapitel 2.3 aufSeite 33) bei -20°C eingefroren.Eine Interpretation des Infektionsverlaufs erfolgte dur h die tägli h im Zellkulturüberstandgemessenen Konzentrationen an viraler DNA und viraler Antigene, HBsAg und HBeAg.

2 Material und Methoden 252.1.2 Hepatom-Zell-LinienIm Rahmen dieser Arbeit wurden HepG2.215-Zellen und HepG2.4A5-Zellen kultiviert, diestabil mit dem Hepatitis-B-Virus trans�ziert sind und konstitutiv HBV-DNA, HBsAg undHBeAg produzieren und in den Zellkultur-Überstand abgeben (Sells et al., 1987; Weiss etal., 1996). Aufgrund dieser konstitutiven Virusexpression repräsentieren HepG2.215- undHepG2.4A5-Zellen einen hronis hen Hepatitis-B-Infektionsstatus. Zudem wurden die LinienHepG3 und PLK/PRF verwendet, die auss hlieÿli h HBsAg exprimieren und sezernieren(Hofs hneider et al., 1979; Daemer et al., 1980).Kultivierung der Hepatom-LinienDie adhärenten Hepatom-Zell-Linien wurden als Monolayer in Polystyren-Zellkultur�as henunters hiedli her Gröÿe (Be ton Di kinson; Heidelberg) in DMEM -Medium (Invitrogen;Karlsruhe) mit Zusatz von 10 % FCS, 100 U/ml Peni illin (Sigma Aldri h; Taufkir hen)und 100 µg Streptomy in (Sigma Aldri h; Taufkir hen) kultiviert. Kon�uente Zellen wur-den zunä hst mit PBS gespült und na h 3- bis 5-minütiger Inkubation mit Trypsin-EDTA(PANTMBiote h; Aidenba h) abgelöst. Die abtrypsinierten Zellen wurden in Kulturmediumaufgenommen und im Verhältnis 1 : 3 auf neue Kultur�as hen verteilt.Konservierung und Rekultivierung der Hepatom-LinienFür die Langzeitlagerung wurden die Zellen zunä hst gewas hen, abtrypsiniert, in Kultur-medium aufgenommen und dann dur h Zentrifugation (300 × ge; 8 min; RT) geerntet. DieZellmenge von 1 × 107 Zellen wurde in 1 ml bereits vorgekühltem Einfrier-Medium (DMEMmit 10 % FCS und 20 % DMSO) aufgenommen und in ein Kryogefäÿ abgefüllt. Na h ei-ner 24-stündigen Zwis henlagerung bei -80°C wurden die Zellen in den �üssigen Sti ksto�überführt. Zur Rekultivierung wurden die Zellen auf 37°C erwärmt, in ausrei hend Mediumverdünnt, pelletiert (300 × ge; 8 min; RT) und no hmals mit Medium gewas hen, bevor siein Kulturgefäÿe überführt wurden.2.1.3 Beein�ussung der HBV-Infektion dur h antiviral wirkendeZytokineUm eine Beein�ussung der HBV-Infektion der Hepatom-Zellen und der in vitro in�ziertenPHH dur h antiviral wirkende Zytokine zu untersu hen, wurde dem Kulturmedium rekombi-nantes TNF-α und IFN-γ (beides von Immunotools; Friesothye) zugesetzt. Für die Bestim-mung eines dosisabhängigen antiviralen E�ektes wurden die Zytokine in unters hiedli henKonzentrationen (1 ng/ml; 10 ng/ml; 20 ng/ml) eingesetzt.

2 Material und Methoden 262.1.4 Periphere Blut-LymphozytenSpender peripherer Blut-LymphozytenDie zur Dur hführung dieser Arbeit benötigten peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) stamm-ten von freiwilligen, gesunden Personen im Alter von 22 bis 60 Jahren. Das Spender-Kollektivbeinhaltet Personen mit vollständiger Grundimmunisierung gegen Hepatitis-B sowie unge-impfte Kontrollprobanden. Alle Geimpften wiesen einen anti-HBs Titer von > 100 IU/mlauf. Zur funktionellen Charakterisierung HBV-spezi�s her PBL wurden die Immunzellen inKokulturversu hen mit HBV-in�zierten humanen Hepatozyten eingesetzt.Isolierung und Kultivierung von peripheren Blut-LymphozytenDie Gewinnung von PBL erfolgte aus heparinisiertem Vollblut mittels Di htegradienten-zentrifugation. Hierfür wurde in speziellen Leu osep-Röhr hen (Be ton Di kinson; Heidel-berg) 15 ml Fi oll (PANTMBiote h; Aidenba h) vorgelegt und mit Blut, das 2 : 1 mit PBS(684 mM NaCl, 13 mM KCl, 20 mM Na2HPO4×12 H2O, 7,3 mM KH2PO4; Mer k; Darm-stadt) verdünnt wurde, übers hi htet. Die Auftrennung der Subzellfraktionen erfolgte beider ans hlieÿenden 15-minütigen Zentrifugation bei 1.000 × ge (Auss hwingrotor; RT) inPhasen aus Plasma, Lymphozyten, Fi oll und Erythrozyten. Die Lymphozytensuspensionwurde abgezogen, zweimal mit je 30 ml PBS gewas hen und sedimentiert (300 × ge; 8 min;RT). Na h Aufnahme des Zell-Pellets in RPMI -Medium (RPMI 1640; PANTMBiote h; Ai-denba h) mit Zusatz von 10 % FCS, 100 U/ml Peni illin und 100 µg Streptomy in wurdedie Zellzahl ermittelt und die Zellen in die entspre henden Versu he eingesetzt.2.1.5 Kokultur von peripheren Blut-Lymphozyten mitHBV-in�zierten HepatozytenUm eine Wirkung imp�nduzierter HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen auf die Hepatitis-B-Virusinfektion humaner Hepatozyten zu untersu hen, wurden PBL mit primären in vitroin�zierten Hepatozyten und mit den konstitutiv HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen ko-kultiviert. Zur Vermeidung der Alloreaktivität der heterologen Immunzellen gegen die He-patozyten, wurden in Kokulturversu hen die PBL von den Hepatozyten dur h ein Zellsiebgetrennt. Die Membran der verwendeten Zellsiebe (Be ton Di kinson; Heidelberg) wies Po-rendur hmesser von 0,4 µm auf und war für lösli he Faktoren permeabel. Na h Etablierungdes Kokultur-Modells wurden die Versu he wie folgt dur hgeführt:Um den Ein�uss der HBV-spezi�s hen PBL auf die Virusreplikation der Primärinfektionzu untersu hen, wurden 24 Stunden na h in vitro Infektion der primären Hepatozyten5 × 106 PBL in einem Zellsieb auf die Hepatozytenkultur eines well transferiert und dieZellüberstände der Kokultur im Verlauf von 14 Tagen gewonnen. Um die Wirkung der PBL

2 Material und Methoden 27auf die Virusreplikation der Hepatom-Zellen zu untersu hen, wurden 1 × 106 Hepatozytenpro well in 6-well -Platten ausgesät. Na h Bildung eines kon�uenten Zellrasens wurden diePBL in den Zellsieben auf die Hepatom-Kultur transferiert und für 48 Stunden kokultiviert.2.2 Etablierung von real-time RT-PCR-Systemen zumNa hweis der Hepatitis-B-Virus-RNA und der RNAdes HaupthistokompatibilitätskomplexesDer Na hweis spezi�s her RNA wurde quantitativ mittels E ht-Zeit (real-time) ReverserTranskriptase-PCR dur hgeführt. Hierfür wurden spezi�s he RT-PCR-Systeme entwi keltund etabliert, mit wel hen anhand entspre hender Ei hreihen, die auf einer Verdünnungsrei-he in vitro transkribierter RNA basieren, die RNA quanti�ziert werden konnte. Die quan-titative Bestimmung der RNA erfolgte am ABI PRISM 7000 Sequen e Dete tion System(Perkin Elmer; Applied Biosystems; Foster City; USA) mittels TaqMan-PCR. Alle Oligo-nukleotide wurden von der Firma Metabion (Planegg-Martinsried) bezogen und in einerEndkonzentration von 100 µM in 10 mM Tris (pH 8,5; Invitrogen; Karlsruhe) gelöst.Te hnologie der TaqMan-PCRDie Te hnologie der TaqMan-PCR beruht auf dem Einsatz einer �uorogenen Sonde, dieam 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbsto� FAM (6-Carboxy-�uores in) und am 3'-Ende mitdem Quen her TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin) markiert ist. Beide Farbsto�ebesitzen ein unters hiedli hes Emissionsmaximum. Die �uorogene Sonde bindet unmittelbarhinter dem 5'-Primer an den glei hen Strang wie dieser. Solange die Sonde intakt ist, wird beiAnregung mittels Laser die absorbierte Energie von FAM direkt auf TAMRA übertragen, sodass nur dessen Fluoreszenz detektiert wird. Dur h Synthese eines Ampli�kationsproduktesspaltet die 5'-3' Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase die Sonde und trennt die beidenFarbsto�e damit voneinander. In diesem Falle wird die Fluoreszenz von FAM messbar, wobeider Anstieg dieses Signals direkt proportional zur Menge des entstehenden PCR-Produktesist.2.2.1 Na hweis der Hepatitis-B-Virus-RNANeben der Beurteilung der HBV-Infektion anhand der aus dem Zellkulturüberstand gewon-nenen viralen Produkte (HBsAg, HBeAg, virale DNA) wurde der de�nierte Beginn der Vi-rusreplikation dur h Messung der viralen Transkripte festgestellt. Zum Na hweis der HBV-spezi�s hen RNAs wurde jeweils ein System für die 3,5-kb RNA (C-HBV; dient als RNA fürdie Translation des HB Ag sowie der Polymerase) sowie für die 2,4-kb RNA (S-HBV; RNAfür die vers hiedenen Formen des HBsAg) entwi kelt.

2 Material und Methoden 28Die für die Quanti�zierung der viralen RNAs verwendeten Oligonukleotide sind der Tabel-le 2.1 zu entnehmen.Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)C-HBV Primer Reverse GTT TCC GGA AGT GTT GAT AAG ATA GGC-HBV Primer Forward TGG TCT CTT TCG GAG TGT GGA TC-HBV Sonde FAM - CGC ACT CCT CCA GCC TAT AGA CCA CCA A - TAMRAS-HBV Primer Reverse ATA TGA TAA AAC GCC GCA GAC ACS-HBV Primer Forward CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA CS-HBV Sonde FAM - TCC TCC AAT TTG TCC TGG TTA TCG CT - TAMRATab. 2.1: Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der 3,5-kb C-HBVRNA sowie der 2,4-kb S-HBV RNAMit Hilfe des Programmes Primer ExpressTM, Version 2.0, (ABI Prism r; Applied Bio-systems; Foster City; USA) wurden äuÿere Primer (ex Reverse bzw. ex Forward) für dieAmpli�kation der zu klonierenden Sequenzabs hnitte generiert (Tabelle 2.2).Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)C-HBV ex Reverse TGA AGT TTC CCA CCT TAT GAG TCC AAGC-HBV ex Forward TGG GTG GGT AAT AAT TTG GAA GAT CCAS-HBV ex Reverse TCG TGC AGG TTT TGC ATG GTS-HBV ex Forward ACA AGA ATC CTC ACA ATA CCG CAGTab. 2.2: Oligonukleotide für die Ampli�kation der zu klonierenden viralenSequenzabs hnitte2.2.2 Na hweis des HaupthistokompatibilitätskomplexesImmunologis he Voraussetzung und Grundlage für eine funktionelle Interaktion HBV-spezi-�s her PBL mit virusin�zierten Hepatozyten stellt die Expression der Gene des Haupthi-stokompatibilitätskomplexes (Major Histo ompatibility Complex; MHC) dar. HLA-Klasse-I-Moleküle werden konstitutiv exprimiert, während HLA-Klasse-II-Moleküle generell vonZellen des Immunsystems gebildet werden. Zur Überprüfung der HLA-Expression dur h He-patozyten wurden quantitative und spezi�s he Na hweissysteme entwi kelt.Für den Na hweis von MHC-Klasse-II wurden neben dem Lokus CD40 die bereits in derLiteratur bes hriebenen Lo i von HLA-DRα und des Ko-Transaktivators CIITA gewählt(Magner et al., 2000; Tab. 2.3).

2 Material und Methoden 29Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)CD40 Primer Reverse CAA TCT GCT TGA CCC CAA AGCD40 Primer Forward GAG GCC TGT GAG AGC TGT GTCD40 Sonde FAM - TGC ACC GCT CAT GCT CGC C - TAMRAHLA-DRα Primer Reverse ATG AAG ATG GTC CCA ATA ATG ATGHLA-DRα Primer Forward CTC TTC TCA AGC ACT GGG AGT TTHLA-DRα Sonde FAM - TGC TCC AAG CCC TCT CCC AGA GAC - TAMRACIITA Primer Reverse TGG GAG TCC TGG AAG ACA TAC TGCIITA Primer Forward AGC AGG CTG TTG TGT GAC ATGCIITA Sonde Fam - AGG GAG GCT TAT GCC AAT ATC GCG G - TAMRATab. 2.3: Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der MHC-II-ExpressionDer Na hweis von MHC-Klasse-I sollte anhand der Lo i HLA-A, HLA-B, HLA-C und ÿ2M(beta2-Mikroglobulin) erfolgen. Aufgrund des polygenen und polymorphen Charakters desHLA-Komplexes wurden zunä hst alle Einträge kaukasis her Gensequenzen der NCBI -Daten-bank (National Center for Biote hnology Information; http://www.n bi.nlm.nih.gov) fürdiese Lo i mit Hilfe der HUSAR-Anwenderplattform (Heidelberg Unix Sequen e Analysis Re-sour es; http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de) gegeneinander vergli hen. Dadur h konn-ten konservierte Berei he lokalisiert werden. Für das Design der PCR-Systeme innerhalb derkonservierten Berei he wurde das Programm Primer ExpressTM, Version 2.0, (ABI Prism r;Applied Biosystems; Foster City; USA) verwendet. Primer und Sonden wurden damit hin-si htli h S hmelzpunkt und GC-Gehalt optimal aufeinander abgestimmt. Die Oligonukleoti-de für die spezi�s he Quanti�zierung von MHC-Klasse-I sind in der Tabelle 2.4 bes hrieben.

2 Material und Methoden 30Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)HLA-A Primer Reverse TGG GAA GAC AGC TCC CAT CTHLA-A Primer Forward TGC CAT GTG CAG CAT GAGHLA-A Sonde FAM - TCT GCC CAA GCC CCT CAC CC - TAMRAHLA-B Primer Reverse TAC ATG CTC TGG AGG GTG TGAHLA-B Primer Forward GAA CCT GCG CGG CTA CTHLA-B Sonde FAM - CAA CCA GAG CGA GGC CGG G - TAMRAHLA-C Primer Reverse CCA CAG CTG CCC ACT TCTHLA-C Primer Forward ACY CAG GAC ACC GAG CTTHLA-C Sonde FAM - TGG AGA CCA GGC CAG CAG GAG A - TAMRAÿ2M Primer Reverse TTA CAT GTC TCG ATC CCA CTT AAC Tÿ2M Primer Forward GAG TAT GCC TGC CGT GTG Aÿ2M Sonde FAM - CCA TGT GAC TTT GTC ACA GCC CAA GA - TAMRATab. 2.4: Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der MHC-I-ExpressionZur Ampli�kation der zu klonierenden Sequenzabs hnitte von MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II wurden die in Tabelle 2.5 gelisteten Primer (ex Reverse bzw. ex Forward) verwen-det. Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)CD40 ex Reverse CGA TCC TGG GGA CCA CAG ACD40 ex Forward ATG CCT TCC TTG CGC TGAHLA-A ex Reverse AGC GAC CAC AGC TCC AGT GHLA-A ex Forward AGA CCA GGC CTG CAG GGHLA-B ex Reverse GTC CTC GTT CAG GGC GAT GHLA-B ex Forward CGT GGA TAG AGC AGG AGG GGHLA-C ex Reverse ATG GGG ATG GTG GGC TGHLA-C ex Forward ACC ATG AGG CCA CCC TGÿ2M ex Reverse CAA AGT AGA ATT ATA AAG AAG ATC ATG TCC ATÿ2M ex Forward GAC TTA CTG AAG AAT GGA GAG AGA ATT GATab. 2.5: Oligonukleotide für die Ampli�kation der zu klonierenden Sequenz-abs hnitte

2 Material und Methoden 312.2.3 Herstellung der RNA-Ei hreihenZur Quanti�zierung der RNA wurden serielle Verdünnungen in vitro transkribierter RNAverwendet. Dazu wurden die entspre henden Sequenzabs hnitte aus revers transkribierter DNA aus Epstein-Barr-Virus-in�zierten Raji-Zellen (MHC-Klasse-I bzw. MHC-Klasse-II)bzw. pHBV991 (virale Transkripte) mittels konventioneller PCR ampli�ziert (vgl. PrimerTab. 2.2, 2.3, und 2.5). Alle Reagenzien für die Reverse Transkription und die si h ans hlie-ÿende konventionelle PCR wurden von Applied Biosystems (Foster City; USA) bezogen.Die Reverse Transkription erfolgte für 30 Minuten bei 42°C in einem Reaktionsgemis h aus7 mM MgCl2, 10 × PCR-Pu�er (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3), je 4 mM dNTPs,1,0 U/µl RNase Inhibitor, 1,0 U/µl Reverser Transkiptase und 270 nM Primer Reverse.Abs hlieÿend folgte ein 10-minütiger Hitzes hritt bei 94°C. Die ans hlieÿende konventionellePCR zur Ampli�kation der zu klonierenden Sequenzabs hnitte erfolgte in einem Reaktions-gemis h aus 7 mM MgCl2, 10 × PCR-Pu�er, je 4 mM dNTPs, je 270 nM Primer Reversebzw. Forward und 1,5 U/µl AmpliTaqr DNA Polymerase. Die Annealing-Temperatur fürdie konventionelle PCR wurde für jedes System in Vorversu hen optimiert (Tab. 2.6).System Annealing-TemperaturC-HBV 63°CS-HBV 56°CHLA-A 57°CHLA-B 61°CHLA-C 55°Cÿ2M 57°CCD40 55°CHLA-DRα 58°CCIITA 60°CTab. 2.6: Annealing-Temperaturen für die konventionelle PCRIm Temperaturpro�l der dur hgeführten konventionellen PCR folgten einem initialen Dena-turierungss hritt (5 Minuten bei 95°C) 40 Zyklen mit jeweils 30 Sekunden bei 95°C, 30 Se-kunden bei der entspre henden Annealing-Temperatur und 30 Sekunden bei 72°C. Eine 10-minütige Inkubation bei 72°C s hloss die Ampli�kation ab.Die Ampli�kate wurden auf einem 1 %-Agarose-Gel (LE-Agarose; Biozym; Hessis h Olden-dorf) aufgetrennt und gemäÿ dem QIAqui k gel-extra tion Kit (Qiagen; Hilden) aus derGelmatrix aufgereinigt. Da die Ampli�kation mit der verwendeten Taq-Polymerase zu ei-nem einzelnen Adenosin-Überhang am 3�-Ende der Ampli�kate führt, konnten diese direktmit dem p rII-TOPO-Vektor ligiert werden, der über einen 5�-Thymidin-Überhang verfügt.Die Ligation und ans hlieÿende Transformation in hemis h kompetente E. oli erfolgte ge-mäÿ den Angaben des Herstellers (TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter von Invitrogen;

2 Material und Methoden 32Karlsruhe). Die transformierten Bakterien wurden auf mit 1,6 mg X-Gal (Ro he; Mann-heim) bes hi hteten LBAmp-Platten ausgebra ht und über Na ht bei 37°C inkubiert. Dabeiwurde mittels der vom Vektor vermittelten Ampi illin-Resistenz und über die Blaufärbungvon Kolonien, die den intakten Vektor ohne das gewüns hte Insert enthalten, auf Kolonienselektioniert, die den Vektor mit integriertem Insert aufgenommen hatten und si h als weiÿeKolonien identi�zieren lieÿen. Mit einigen weiÿen Kolonien wurden mehrere 5 ml LBAmp-Kulturen angeimpft und na h Inkubation über Na ht Plasmid-DNA (QIAprep Spin Mini-prep Kit von Qiagen; Hilden) isoliert. Mittels PCR wurde die Vollständigkeit des Insertsüberprüft und ans hlieÿend 100 ml LBAmp-Kulturen beimpft. Aus diesen Kulturen konntemit dem QIA�lter Plasmid Midi Kit (Qiagen; Hilden) eine gröÿere Menge an Plasmid-DNAgewonnen werden, deren Konzentration anhand der Absorption bei 260 nm photometris hquanti�ziert wurde. Eine Sequenzierung des Inserts sowie der angrenzenden Berei he desVektors, die von der Firma GENEART (Regensburg) dur hgeführt wurde, gab Aufs hlussüber die Orientierung des Inserts im Vektor.Ca. 50 µg der DNA wurden mittels Restriktionsverdau innerhalb der Vektorsequenz hinterdem Insert linearisiert (C-HBV, S-HBV, HLA-A, HLA-C, ÿ2M, HLA-DR-α: BamHI; HLA-B,CD40, CIITA: E oRV; Ro he; Mannheim), über ein Agarose-Gel aufgetrennt und aus derGelmatrix aufgereinigt. Die in vitro Transkription wurde mit dem RiboMax large s ale RNAprodu tion system SP6 bzw. T7 (Promega; Mannheim) gemäÿ den Angaben des Herstel-lers dur hgeführt. Grundlage hierfür ist das Vorhandensein je eines Promotors für die SP6-und die T7-Polymerase im verwendeten Vektor, so dass je na h Orientierung des Insertsim Vektor die RNA transkribiert werden kann. Vor der photometris hen Konzentrationsbe-stimmung der RNA anhand der Absorption bei 260 nm musste die Vektor-DNA entferntwerden. Hierfür wurde die RNA-Präparation einem RNAse-freien DNA-Verdau unterzogen,ans hlieÿend über RNeasy-Säul hen aufgereinigt und mittels TaqMan-PCR die Reinheit derRNA überprüft.Da die Länge der einzelnen Transkripte (Insert mit Vektoranteil (bp): C-HBV 514, S-HBV444, HLA-A 352, HLA-B 358, HLA-C 399, ÿ2M 489, CD40 521, HLA-DRα 270, CIITA 212)bekannt ist, konnte aus der Konzentration der präparierten RNA über folgende Formeln au hdie Anzahl der Transkripte bere hnet werden.pmol of ssRNA = µg (of ssRNA)× 106pg

1µg×

1pmol

340pg×

1

Nb

=µg (of ssRNA)× 2941

Nbmolml ×NA = Kopien pro ml NA = 6, 022 × 1023 Kopien pro molssRNA = einzelsträngige RNA; NA= Avogadro-KonstanteDie Transkripte wurden in RNAse-freiem Wasser mit 10 µg/ml transferRNA (tRNA; SigmaAldri h; Taufkir hen) seriell von 109 - 100 Transkripte / 1,5 µl / Ansatz verdünnt.

2 Material und Methoden 332.3 Na hweissysteme2.3.1 Na hweis der HLA-RNA und Hepatitis-B-Virus-RNAIsolierung der RNADie zelluläre und virale RNA wurde aus den Hepatom-Zell-Linien und in vitro HBV-in�zier-ten primären humanen Hepatozyten präpariert. Na h einem Was hs hritt und Abtrypsi-nierung der adhärenten Hepatom-Zellen konnte die entspre hende Zellmenge für die RNA-Isolierung eingesetzt werden. Die primären Hepatozyten, die auf einer Kollagenmatrix adhä-rierten, wurden na h einem Was hs hritt direkt in der Kulturs hale lysiert. Die Präparationder RNA erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kit (Qiagen; Hilden).Die Lyse der Zellen erfolgte dur h den Lysepu�er RLT mit 1 % β-Mer aptoethanol (SigmaAldri h; Taufkir hen), gefolgt von der Homogenisierung des Zelllysats mittels QiaShredder -Säul hen bei einer zweiminütigen Zentrifugation bei 20.000 × ge und Raumtemperatur (RT).Zu dem homogenisierten Lysat wurden 350 µl 70 %iger Ethanol gegeben und die Mis hungwurde auf eine RNeasy Mini-Säule überführt. Bei der si h ans hlieÿenden Zentrifugation(8.000 × ge; 1 min; RT) erfolgte eine quantitative Adsorption der RNA an die Sili a-Gel-Membran in den Säul hen. Mit jeweils 80 µl DNAse-Lösung des RNAse-free DNAse Set(Qiagen; Hilden) wurde in einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur kontaminie-rende DNA auf der Säule abgebaut. Na h zweimaligem Was hen der gebundenen RNA mitje 500 µl des Pu�ers RPE und Zentrifugation (8.000 × ge; 1 min; RT) wurde die RNA mit60 µl RNAse-freiem Wasser eluiert und bei -80°C gelagert.Quanti�zierung der RNAFür die Quanti�zierung der 3,5-kb C-HBV RNA sowie der 2,4-kb S-HBV RNA wurden die inTabelle 2.1 aufgeführten Oligonukleotide verwendet. Die Quanti�zierung von MHC-Klasse-Ierfolgte mit den in Tabelle 2.4 gelisteten Oligonukleotiden und für die Quanti�zierung vonMHC-Klasse-II wurden die in Tabelle 2.3 bes hriebenen Oligonukleotide eingesetzt.Vor der spezi�s hen Quanti�zierung dieser RNAs wurde zur vollständigen Beseitigung vonkontaminierender DNA in den RNA-Präparationen zunä hst ein zweiter Verdau der DNAdur hgeführt. Dieser erfolgte im glei hen Reaktionsansatz wie die Reverse Transkription (vgl.S. 31). Hierfür wurde isolierte RNA mit den oben bes hriebenen Reaktionskomponenten,jedo h ohne Reverse Transkriptase, mit 1,0 U DNAse (Ro he; Mannheim) gemis ht und30 Minuten bei 37°C inkubiert. Eine folgende Hitzedenaturation für 5 Minuten bei 94°Celiminierte die Aktivität der DNAse. Na h Abs hluss der DNAse-Behandlung wurden demReaktionsgemis h 1,0 U RNAse-Inhibitor und 1,0 U Reverse Transkriptase zugegeben. DieReverse Transkription wurde wie auf Seite 31 bes hrieben dur hgeführt. Unmittelbar na hdem Ums hreiben der RNA in DNA wurde diese zur Quanti�zierung in die TaqMan-PCReingesetzt.

2 Material und Methoden 34Bei der experimentellen Optimierung der einzelnen Komponenten der PCR-Systeme zeigtesi h hinsi htli h der Konzentrationen von MgCl2, Primer und Sonden, dass alle Systemeparallel standardisiert werden konnten. Für die Quanti�zierung der RNA wurde folgenderReaktionsansatz (TaqMan-Pu�er, MgCl2, dNTPs und Polymerase von Applied Biosystems;Foster City; USA) in einem Gesamtvolumen von 40 µl gemis ht (Tab. 2.7):Reagens KonzentrationH2O 0,1 % DEPC (Carl Roth; Karlsruhe)1 x TaqMan Pu�erMgCl2 7 mMdNTPs je 4 mMPrimer Reverse 300 nMPrimer Forward 300 nMSonde 200 nMAmpliTaqrGoldTM Polymerase 1,0 UTab. 2.7: TaqMan-Reaktionskomponenten für die Quanti�zierung derHepatitis-B-Virus-RNAs und der MHC-RNAsZu diesem Ansatz wurden 10 µl DNA pipettiert. Na h kurzem Abzentrifugieren der Re-aktionsansätze wurde die TaqMan-PCR gestartet, wobei für eine optimale Aktivierung derTaq-Polymerase eine Hot Start-PCR gewählt wurde. Die DNA wurde mit dem in Tabelle2.8 bes hriebenen zweistu�gem Programm ampli�ziert.Stufe 1 1 Zyklus S hritt 1: Denaturierung 95°C 10 minStufe 2 45 Zyklen S hritt 1: Denaturierung 95°C 15 se S hritt 2: Primer Annealing und Primer Extension 60°C 1 minTab. 2.8: Temperaturs hema der TaqMan-PCR für die Quanti�zierung derHepatitis-B-Virus-RNAs und der MHC-RNAsDie Auswertung der RNA-Konzentration in unbekannten Proben erfolgte dur h Verglei hmit der seriellen Verdünnung in vitro transkribierter RNA.2.3.2 Na hweis der Hepatitis-B-Virus-DNAIsolierung der viralen DNADer quantitative Na hweis der viralen DNA in Kopien/ml wurde aus den verwendeten Se-ren, den Zellüberständen der Hepatom-Zell-Linien und na h in vitro Infektion der primärenhumanen Hepatozyten vorgenommen. Die Isolierung der viralen Nukleinsäure erfolgte stan-dardgemäÿ mit Hilfe des QIAamp Blood and Tissue Kit (Qiagen; Hilden).

2 Material und Methoden 35Die Präparation der viralen DNA wurde aus 200 µl einer 1 : 10-Verdünnung der zu testen-den Proben in PBS dur hgeführt. Zur Freisetzung der Nukleinsäure aus den Viruspartikelnwurde das Material in Anwesenheit von 200 µl Lysepu�er AL und 25 µl Protease bei 56°C10 Minuten inkubiert. Die folgende Zugabe von 200 µl 96 %igem EtOH bewirkte bei dersi h ans hlieÿenden Zentrifugation (6.000×ge; 1 min; RT) eine quantitative Adsorption derviralen DNA an eine Sili a-Gel-Membran in den sog. spin olumns. Die gebundene DNAwurde zweimal mit je 500 µl des ethanolhaltigen Was hpu�ers AW1 bzw. AW2 gewas hen.Die abs hlieÿende Elution der viralen DNA erfolgte mit 100 µl des Elutionspu�ers AE dur hZentrifugation (6.000×ge; 1 min; RT).Quanti�zierung der viralen DNADie quantitative Bestimmung der viralen DNA erfolgte ebenfalls am ABI PRISM 7000 Se-quen e Dete tion System (Perkin Elmer; Applied Biosystems; Foster City; USA) mittelsTaqMan-PCR.Die für die Ampli�kation der Hepatitis-B-Virus-DNA verwendeten und von Weinberger etal., 2000, bes hriebenen Oligonukleotide sind in Tabelle 2.9 gelistet.Oligonukleotid Sequenz (5� - 3�)HBV Primer Reverse ATA TGA TAA AAC GCC GCA GAC ACHBV Primer Forward CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA CHBV Sonde FAM - TCC TCC AAT TTG TCC TGG TTA TCG CT - TAMRATab. 2.9: Oligonukleotide für den spezi�s hen Na hweis der Hepatitis-B-Virus-DNADie Komponenten für die Ampli�kation der viralen DNA, die in Tabelle 2.10 aufgeführt sind,wurden zu einem Gesamtvolumen von 50 µl zusammenpipettiert.ReaktionskomponentenH2O 0,1 % DEPC (Carl Roth; Karlsruhe)2 x TaqMan PCR Universal Mastermix:dNTPsTaq-PolymeraseMgCl2 (5 mM)(Applied Biosystems; Foster City; USA)Primer Reverse 300 nMPrimer Forward 300 nMSonde 200 nMvirale DNA-MatrizeTab. 2.10: TaqMan-Reaktionskomponenten für die Quanti�zierung derHepatitis-B-Virus-DNA

2 Material und Methoden 36Na h kurzem Abzentrifugieren der Reaktionsansätze wurde das zweistu�ge Programm fürdie Ampli�kation gestartet (Tabelle 2.11).Stufe 1 1 Zyklus S hritt 1: Denaturierung 95°C 10 minStufe 2 45 Zyklen S hritt 1: Denaturierung 95°C 15 se S hritt 2: Primer Annealing und Primer Extension 60°C 1 minTab. 2.11: Temperaturs hema der TaqMan-PCR für die Quanti�zierung derHepatitis-B-Virus-DNADie Auswertung der Quantität der viralen DNA erfolgte dur h Verglei h mit einer a htstu-�gen Verdünnungsreihe des Plasmids pHBV991 (100 - 107 Kopien/Ansatz) in 10 mM Tris(Metabion; Planegg-Martinsried) und 0,01 mg tRNA/ml (Sigma Aldri h; Taufkir hen).2.3.3 Quanti�zierung von Hepatitis-B-Virus-AntigenKonzentrationsbestimmung des HBsAgDer Na hweis von HBsAg wurde aus den Zellkulturüberständen der HBV-in�zierten Hepa-tozyten unter Verwendung des AXM HBsAg (V2) von Abbott Laboratories (Wiesbaden)vorgenommen.Zur Bestimmung von HBsAg wurden monoklonale anti-HBs bes hi htete Mikropartikel ver-wendet. 200 µl der zu testenden Probe wurden in einer Inkubationskammer mit Primäranti-körper-bes hi hteten Mikropartikeln und Biotin-markiertem Sekundär-Antikörper vermis ht.Dur h Bindung von vorhandenem HBsAg an die mit anti-HBs-bes hi hteten Mikropartikelsowie an das Biotin-markierte anti-HBs bilden si h Antigen-Antikörper-Komplexe. Ein Teildieser Komplexe adsorbiert an eine Glas�bermatrix, an die die Mikropartikel irreversibel bin-den. Der nun zupipettierte anti-Biotin-alkalis he Phosphatase-konjugierte Antikörper bindetan die Komplexe. Na h Zugabe von 4-Methylumbelliferyl-Phosphat, dem Substrat der al-kalis hen Phosphatase, wird die Bildung des �uoreszierenden Produkts optis h detektiert.Der Na hweis von HBsAg erfolgt dur h den Verglei h der Bildungsrate des �uoreszierendenReaktionsprodukts mit dem aus der Reaktionsges hwindigkeit des Kalibrators ermitteltenGrenzwert. Ist der Probenwert gröÿer oder glei h dem Grenzwert, gilt die Probe als reaktivfür HBsAg.Die photometris hen Werte der HBsAg-Quanti�zierung werden als �Signal to Noise�-Ratio(S/N) angegeben, der Grenzwert beträgt 2 S/N.Konzentrationsbestimmung des HBeAgDer Na hweis von HBeAg wurde ebenfalls aus den Zellkulturüberständen der HBV-in�ziertenHepatozyten vorgenommen. Hierfür wurde AXM HBe (2.0) von Abbott Laboratories (Wies-

2 Material und Methoden 37baden) verwendet.Diese Messung läuft analog der Messung des HBsAg und verwendet das Prinzip der direktenBindung des vorhandenen HBeAg in der Probe an die mit anti-HBe (Maus, monoklonal)bes hi hteten Mikropartikel. Der Na hweis des gebundenen HBeAg erfolgt dur h das anti-HBe-Alkalis he Phosphatase-Konjugat. Die Probe gilt als reaktiv für HBeAg, wenn der Wertdes �uoreszierenden Produkts in der Probe gröÿer oder glei h dem zuvor automatis h ermit-telten Grenzwert ist.Die photometris hen Werte der HBeAg-Quanti�zierung werden als �Signal to Cut-o� �-Ratio(S/CO) angegeben, der Grenzwert beträgt 1 S/CO.2.3.4 Elispot-AssayStimulation mit spezi�s hen Antigenen induziert bei T-Lymphozyten die Sekretion bestimm-ter Zytokine. Mit dem enzym-linked-immunospot-assay (Elispot) können spezi�s h Zytokin-sezernierende Zellen auf Einzelzell-Niveau detektiert werden. Dadur h kann die Zahl spezi-�s her T-Zellen quanti�ziert werden.Die in dieser Arbeit dur hgeführten Elispots hatten zum Ziel, die reaktiven T-Zellantwortenvon HBV-spezi�s hen PBL und HBV-naiven Kontroll-PBL auf HBsAg als TH-Typ1- oderTH-Typ2-Antworten zu harakterisieren. Zunä hst wurde die reaktive Antwort der Immun-zellen geimpfter und ungeimpfter Spender auf rekombinantes HBsAg, der immunogenenDeterminante des Impfsto�-Antigens, harakterisiert. Zudem wurden mittels Elispot Im-munzellen getestet, die in Kokultur mit HBV-in�zierten Hepatozyten gehalten und dur hdie in der Kultur gebildeten viralen Produkte stimuliert wurden. Na h Beendigung der Ko-kultur wurden die PBL direkt in den Elispot-Assay eingesetzt und das Zytokin-Pro�l sowiedie Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen bestimmt.Zunä hst wurden die 96-well -Nitrozellulose-Mikrotiter-Platten (MAHAN45 von Millipore;S hwalba h) mit monoklonalen Primär-Antikörper-Lösungen (Anti-human IL-2, Anti-humanIL-4, Anti-human IL-10, Anti-human IL-5, Anti-human IFN-γ und Anti-human TNF-α; al-le von MABTECH AB; Na ka Strand; S hweden) in einer Konzentration von 5 µg/ml inPBS bes hi htet und über Na ht bei 4°C inkubiert. Na h Entfernen der Antikörper-Lösungwurden zur Absättigung bzw. Blo kierung unspezi�s her Bindungsstellen die Platten zweiStunden bei Raumtemperatur mit je 200 µl RPMI mit 10 % FCS inkubiert. Na h fünfma-ligem Was hen der Platten mit PBS (200 µl/well) wurden 2 × 105 PBL in einem Volumenvon 150 µl/well ausgegeben und 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Währenddieser 24-stündigen Inkubation bindet gebildetes und sezerniertes Zytokin an den entspre- henden Antikörper. Na h 24 Stunden wurde die Zellsuspensionen dur h viermaliges Spülenmit Was hpu�er (PBS mit 0,05 % Tween; Mer k; Darmstadt; 200 µl/well) und abs hlie-ÿendem dreimaligen Was hen mit PBS (200 µl/well) entfernt. Dana h folgte die Zugabeder entspre henden biotinylierten Sekundär-Antikörper-Lösungen (Anti-human IL-2 Biotin,

2 Material und Methoden 38Anti-human IL-4 Biotin, Anti-human IL-10 Biotin-12G8, Anti-human IL-5 Biotin-5A10,Anti-human IFN-γ Biotin-7-B6-1 und Anti-human TNF-α Biotin-II; 1 µg/ml in PBS; al-le von MABTECH AB; Na ka Strand; S hweden) und eine Inkubation über Na ht bei4°C. Zur Entfernung ungebundener Sekundär-Antikörper erfolgten na h dieser Phase dreiWas hs hritte mit PBS (200 µl/well). Nun wurden die Platten zwei Stunden bei Raumtem-peratur mit 200 µl/well eines Streptavidin-Alkalis he-Phosphatase-Konjugats (MABTECHAB; Na ka Strand; S hweden; 1 µg/ml in PBS) inkubiert. Dur h abs hlieÿende Zugabe desEnzymsubstrates NBT/BCIP-Lösung (Ro he; Mannheim; 1 : 50 in Färbepu�er (0,1 M Tris;0,05 M MgCl2; 0,1 M NaCl) verdünnt) erfolgte die Detektion der Zytokin-Spots. Na h einigenMinuten wurde die kolorimetris he Reaktion dur h Abspülen der Platten mit Leitungswas-ser gestoppt und die Platten bei Raumtemperatur getro knet. Die quantitative Auswertungder Zytokin-Spots erfolgte an einem Bioreader 2000 (BioSys; Karben). Als Grenzwert wurdeder zweifa he Hintergrund der Negativ-Kontrolle (Stimulation der Immunzellen mit DMEM-Medium) bestimmt.2.4 Computer-ProgrammeDiese Dissertation wurde mit LYX Version 1.5.5-Win-32 verfasst. Die Statistik wurde mitSPSS für Windows anhand des Mann-Whitney-Tests dur hgeführt. Die Literaturre her heerfolgte mit Hilfe der Medline Datenbank. Zur Verwaltung der Literatur diente BibliographixRelease 7. Abbildungen und Diagramme wurden mit SigmaPlot 8.0, CorelDRAW 12 undMi rosoft Ex el 2003 erstellt.

3 Ergebnisse 393 Ergebnisse3.1 Hepatitis-B-Virus-Infektionsmodell3.1.1 Primäre humane Hepatozyten als Modell für die InfektionDie primären humanen Hepatozyten (PHH) wurden aus Leberteilresektaten unters hiedli- her Patienten gewonnen. Die Vitalität der dur h die Zwei-S hritt-Kollagenase-Perfusions-te hnik isolierten und gereinigten Zellen betrug dabei zwis hen 76 und 86 %. Unmittel-bar na h der Isolierung wurden die PHH in einer Konzentration von 1,6 Mio/well in mitKollagen-I bes hi hteten 6-well -Kulturplatten ausgesät und bei 37°C und 5 % CO 2 kulti-viert. Abbildung 3.1 zeigt die morphologis hen Veränderungen und die Di�erenzierung derHepatozyten beginnend als no h abgerundete Zellen na h der Isolierung und im weiterenVerlauf der in vitro Kultur.

Abb. 3.1: Morphologis he Veränderungen primärer humaner Hepatozytenna h Isolierung und Aussaat im Zeitverlauf

3 Ergebnisse 403.1.2 Untersu hung der HBV-Infektion primärer humanerHepatozytenDie Infektion der primären humanen Hepatozyten mit Hepatitis-B-Virus (HBV) erfolgtena h Ausdi�erenzierung der Zellen (Tag 6 bis 8 na h Aussaat). Dafür wurden die Hepa-tozyten initial mit virushaltigem, infektiösem Serum hronis her Hepatitis-B-Virus-Trägerinkubiert, wobei eine Viruskonzentration von 1 × 107 virale DNA-Kopien pro Infektionsan-satz eingesetzt wurde. Zur Beurteilung der E�zienz der HBV-Infektion wurde die in vitroSynthese der viralen Produkte (HBeAg, HBsAg und virale DNA) dur h Quanti�zierung ausdem Zellkulturüberstand in einem Zeitrahmen von 14 Tagen verfolgt.Quanti�zierung viraler Antigene und viraler DNA na h in vitro InfektionUm eine Neusynthese der viralen Produkte im Infektionsverlauf zu bestimmen, musstenzunä hst die mit dem Inokulum eingebra hten Antigene und die DNA an Tag 1 na h Infektiondur h fünf Was hs hritte entfernt werden. Abbildung 3.2 zeigt den Verlauf einer in vitroHBV-Infektion von PHH. Für die Negativ-Kontrolle wurden die Zellen eines Ansatzes vorInfektionsbeginn mit 70 % EtOH abgetötet.Die virale DNA-Konzentration (Abb. 3.2; A) �el na h Abnahme des viralen Inokulums (anTag 1 na h Infektion) dur h die initialen Was hs hritte sowohl bei der Positiv- als au h beider Negativ-Kontrolle bis zum Tag 8 na h Infektion deutli h ab. Bei der Positiv-Kontrollewar ab Tag 8 eine de novo Replikation mit einem Anstieg der DNA-Konzentrationen bis zu4,5 × 105 Kopien/ml an Tag 14 zu verzei hnen. Bei der Negativ-Kontrolle hingegen war eineweitere Abnahme der DNA-Konzentration und keine Neusynthese der DNA messbar.Abbildung 3.2 Teil B) zeigt die im Zellkulturüberstand messbare Konzentration an HBeAg.Die HBeAg-Konzentration nahm in beiden Ansätzen zunä hst ab. In der Positiv-Kontrollewar ab Tag 3 na h Infektion eine Neuproduktion des HBeAg mit einem starken Anstiegder Antigen-Konzentration zu verzei hnen, die Werte bis zu 163 S/CO an Tag 13 errei hte.Bei der Negativ-Kontrolle erfolgte na h den initialen Was hs hritten keine Zunahme derHBeAg-Konzentration im Kulturüberstand.Abbildung 3.2 Teil C) zeigt den Verlauf der HBsAg-Konzentrationen, die im Kulturüberstandna hweisbar waren. Einer � was hbedingten � Abnahme der Konzentration bis Tag 5 von2,6×103 S/N auf 46 S/N folgte bei der Positiv-Kontrolle ein Anstieg der HBsAg-Produktionbis zu einer Konzentration von 123 S/N an Tag 14. Bei der Negativ-Kontrolle war eine weitereAbnahme der HBsAg-Konzentration und keine Neusynthese des HBsAg zu verzei hnen.

3 Ergebnisse 41

Abb. 3.2: Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationenan viraler DNA (A), HBeAg (B) und HBsAg (C) na h in vitro In-fektion der primären humanen Hepatozyten mit Hepatitis-B-Virus

3 Ergebnisse 42Die Beurteilung der in vitro Infektionen der vorliegenden Arbeit erfolgte anhand der HBeAg-Expression. Da aktive HBeAg-Expression mit der Synthese der viralen DNA einhergeht, kanndie HBeAg-Produktion als Korrelat zur Virusreplikation angesehen werden. HBeAg liegt imSerum in viel geringerer Konzentration vor als HBsAg oder die virale DNA. Dadur h lässtsi h das mit dem Inokulum zugeführte HBeAg ras h ausverdünnen. Zudem wird HBeAg imVerlauf der Infektion als frühes Antigen gebildet und die Konzentration steigt bei erfolgrei- her Infektion sehr s hnell � etwa ab dem dritten Tag na h Infektion � an. Die Verwendungvon HBeAg als frühem Infektionsmarker ermögli ht, eine Beein�ussung der Infektion übereinen gröÿeren Zeitraum zu verfolgen (Tag 3 bis 14). Anhand der de novo Replikation derDNA lassen si h Beein�ussungen der Infektion hingegen erst ab Tag 8 verfolgen. Die mitdem Inokulum eingebra hten hohen Konzentrationen an viraler DNA und HBsAg lassensi h dur h die Was hs hritte langsamer und s hle hter ausverdünnen. Dadur h wird ein frü-her Beginn der Virusreplikation und der Synthese des HBsAg unter Umständen überde ktund ist zunä hst ni ht identi�zierbar. So ist ein Anstieg der viralen Replikation und derHBsAg-Synthese erst zu einem späteren Zeitpunkt messbar.

3 Ergebnisse 43Zeitpunkt der InfektionJe na h Ausgangsmaterial zeigten primäre humane Hepatozyten etwa ab dem dritten Tagna h Aussaat Hepatozyten-spezi�s he Morphologie. Da die Lebensspanne kultivierter Hepa-tozyten begrenzt ist und diese Zellen in Kultur ni ht proliferieren, ergibt si h nur ein kurzesZeitfenster für eine in vitro Infektion. Um den optimalen Zeitpunkt für die Infektion derZellen festzulegen, wurden die Hepatozyten an vier vers hiedenen Zeitpunkten na h Aussaat(Tag 2, 4, 6 und 8) in�ziert. In der Abbildung 3.3 ist die Kinetik der HBeAg-Produktion inAbhängigkeit vom Infektionszeitpunkt dargestellt.

Abb. 3.3: Kinetik der viralen HBeAg-Konzentration im Zellkulturüberstandna h Hepatitis-B-Virus-Infektion der primären humanen Hepatozy-ten an Tag 2, 4, 6 und 8 na h AussaatIn den zu vers hiedenen Zeitpunkten in�zierten Hepatozytenkulturen wurden deutli h un-ters hiedli he HBeAg-Kinetiken gemessen. Die maximale HBeAg-Konzentration dieser Ver-su hsreihe wurde in Hepatozyten errei ht, die an Tag 6 na h Aussaat in�ziert wurden(HBeAgmax [S/CO℄: Infektion an Tag 2: 16; Infektion an Tag 4: 23; Infektion an Tag 6: 46und Infektion an Tag 8: 27). Ausgehend von diesem Ergebnis, das si h in einem Wiederho-lungsversu h bestätigen lieÿ, wurden alle im Rahmen dieser Arbeit dur hgeführten in vitroInfektionen zwis hen dem se hsten und a hten Tag na h Inkulturnahme gestartet.

3 Ergebnisse 44Intraexperimentelle ReproduzierbarkeitUm die S hwankungsbreite der Infektionsergebnisse innerhalb einer Versu hsreihe zu testen,wurden drei vers hiedene Kulturs halen einer Hepatozytenpräparation mit Hepatitis-B-Virusin�ziert. Abbildung 3.4 zeigt die Replikation der DNA und die Produktion der viralen An-tigene in den drei Parallelansätzen.Die in den drei Parallelinfektionen quanti�zierten Konzentrationen der viralen DNA (A)zeigten im Verlauf der Infektion untereinander geringfügige S hwankungen, während dieMessung der HBeAg-Produktion (B) und der HBsAg-Produktion (C) der Infektionen 1,2 und 3 nahezu identis he Ergebnisse lieferte. Das Ergebnis dieser Versu hsreihen zeigt,dass innerhalb einer Hepatozytenpräparation eine Experimentreihe mit unters hiedli henFragestellungen reproduzierbar dur hgeführt und mit HBeAg als viralem Marker zuverlässigausgewertet werden kann.

3 Ergebnisse 45

Abb. 3.4: Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationenan viraler DNA (A), HBeAg (B) und HBsAg (C) in drei Parallel-ansätzen einer HBV-in�zierten Hepatozytenkultur

3 Ergebnisse 46Interexperimentelle ReproduzierbarkeitIm Laufe dieser Arbeit kristallisierten si h � trotz intraexperimenteller Reproduzierbarkeit �S hwankungen der E�zienz der Infektion in vers hiedenen Zellpräparationen heraus. Abbil-dung 3.5 gibt einen Überbli k über die maximale Infektionse�zienz von 18 vers hiedenenHepatozytenkulturen, die mit dem glei hen virushaltigen Serum in�ziert wurden. Die Infekti-onse�zienz wurde anhand der maximalen HBeAg-Konzentration na h beginnender Antigen-Neuproduktion beurteilt.

Abb. 3.5: Maximale HBeAg-Konzentration in 18 vers hiedenen Hepatozyten-kulturen na h Infektion mit dem glei hen HBV-haltigen SerumIn den Kulturen 2, 15 und 17 konnte keine Produktion von HBeAg gemessen werden (Na h-weisgrenze bei 1 S/CO). In drei der in�zierten Hepatozytenkulturen hingegen konnten HBeAg-Konzentrationen von mehr als 100 S/CO gemessen werden (HBeAgmax [S/CO℄: Kultur 4: 105;Kultur 10: 163; Kultur 14: 170). Dur h das virushaltige Serum konnte o�enbar ni ht in jederder verwendeten Zellpräparationen eine e�ziente Infektion initiiert werden.Für diese unters hiedli hen Ergebnisse der in vitro Infektionen ist zum einen die generel-le Variabilität von humanem primären Zellmaterial verantwortli h. Trotz hoher Vitalität,identis her Zellzahl bei der Inkulturnahme und kon�uenter Zell-Monolayer zu Beginn derInfektion dedi�erenzieren Zellen mit zunehmender Kulturdauer. Des Weiteren ist es denkbar,dass für eine e�ziente Infektion eine entspre hende � z. B. Rezeptor-bedingte � Kompatibi-lität zwis hen Virus und Wirtszelle ents heidend ist.

3 Ergebnisse 47Na hweis der Hepatitis-B-Virus RNADie Messung der in vitro produzierten viralen Antigene und der DNA aus dem Zellkultur-überstand ermögli ht eine Charakterisierung des Infektionsverlaufs, die über einen längerenZeitraum aus einem Infektionsansatz dur hgeführt werden kann. Die Messung der viralenRNA als Marker der Transkription hingegen erlaubt einen de�nierten Na hweis der Infek-tion, wodur h der Beginn der Virusreplikation festgestellt werden kann. Zudem ermögli htder parallele Na hweis der Transkription und der Proteinexpression Aussagen über den An-gri�spunkt und Wirkme hanismus antiviraler Strategien.Etablierung der quantitativen RT-PCR-SystemeUm die HBV-Infektion der Hepatozyten auf RNA-Ebene zu harakterisieren, wurden Na h-weissysteme für die 3,5-kb RNA (C-HBV) und die 2,4-kb RNA (S-HBV) entwi kelt. Die3,5-kb RNA umspannt die gesamte Sequenz des Genoms und dient als mRNA für die Trans-lation des HB Ag und der Polymerase, zusätzli h dient sie als prägenomis he RNA für denersten S hritt der Virusreplikation. Von der 2,4-kb RNA werden je na h Transkriptionsstartdie groÿe, die mittlere oder die kleine Form des HBsAg gebildet.Na h Klonierung der gewüns hten Sequenzabs hnitte und in vitro Transkription wurden dieTranskripte von 109 bis 100 Kopien/Ansatz seriell verdünnt und zur Erstellung einer Ei hge-raden für die Quanti�zierung der viralen RNAs mittels quantitativer Reverser TranskriptaseTaqMan-PCR (qRT-PCR) verwendet. Abbildung 3.6 zeigt die zwei RNA-Ei hgeraden C-HBV und S-HBV in den Verdünnungsstufen 109 bis 100 Kopien/Ansatz.

3 Ergebnisse 48

Abb. 3.6: RNA-Ei hreihen zum quantitativen Na hweis der 3,5-kb C-HBVRNA sowie der 2,4-kb S-HBV RNA; dargestellt sind Dreifa h-Werteje VerdünnungsstufeQuanti�zierung viraler RNAFür die quantitative Bestimmung der HBV-spezi�s hen RNAs im Verlauf einer Infektionwurden Parallelinfektionen einer Hepatozytenkultur angesetzt. Für jeden Messpunkt wurdendie Hepatozyten einer Kulturs hale gewas hen, lysiert und aus der präparierten RNA wurdemittels qRT-PCR die Konzentrationen der S-HBV RNA sowie der C-HBV RNA bestimmt.Im Folgenden sind anhand zweier in vitro Infektionen einer Hepatozytenpräparation mitzwei viralen Inokula (Serum 1 bzw. Serum 2) die Produktion der viralen RNA (Abb. 3.7)sowie zugehörige HBeAg- und DNA-Ergebnisse (Abb. 3.8) dargestellt. Für einen Messpunktwurde die virale RNA aus 1,6 × 106 Zellen eingesetzt. Bei der quantitativen Bestimmung derRNA im Verlauf der Infektion ist zu bea hten, dass mit jedem Messpunkt die virale Tran-skription eines unters hiedli hen Infektionsansatzes erfasst wird. Die zuvor gezeigte geringe

3 Ergebnisse 49intraexperimentelle Variabilität erlaubt jedo h die Bestimmung des zeitli hen Verlaufs derRNA-Produktion.

Abb. 3.7: Konzentration der S-HBV RNA sowie der C-HBV RNA im Verlaufvon 16 Tagen na h in vitro Infektion primärer humaner Hepatozy-ten eines Spenders mit unters hiedli hen Inokula; (A) Serum 1 und(B) Serum 2In beiden Versu hsreihen konnte bereits 24 Stunden na h Beginn der Infektion HBV-spezi�-s he RNA mit einem kontinuierli hen Anstieg der viralen Transkription na hgewiesen wer-den. Na h Infektion mit Serum 1 (Abb. 3.7; A) errei hte die Transkription maximale RNA-Konzentrationen von 2,0 × 107 S-HBV Kopien/1,6 × 106 Zellen und 6,0 × 105 Kopien(C-HBV). Na h Infektion mit Serum 2 (Abb. 3.7; B) konnten maximale RNA-Mengen von a. 4,6 × 107 (S-HBV) und 4,5 × 106 (C-HBV) gemessen werden.Hier ist anzumerken, dass mit den gewählten Oligonukleotiden für den Na hweis der S-HBV RNA au h die C-HBV RNA erfasst wird. Daher ergibt si h die e�ektive Konzentration

3 Ergebnisse 50der S-HBV RNA aus der Di�erenz beider RNAs. Aus dieser Di�erenz � gemessen an dermaximalen RNA-Konzentration na h Infektion an Tag 16 � resultiert eine Konzentration derS-HBV RNA von 1,9 × 107 Kopien (Serum 1) bzw. 4,2 × 107 (Serum 2). Vergli hen mitder maximalen Konzentration der C-HBV RNA zeigt si h, dass die S-HBV RNA in deutli hhöherer Konzentration gebildet wird.Der Verglei h der RNA-Synthese mit aus dem Zellkulturüberstand gemessenen Antigenenund der DNA (Abb. 3.8) zeigte, dass die virale RNA in beiden Infektionen bereits 48 Stundenproduziert wurde, ehe ein Anstieg des HBeAg (ab Tag 3 na h Infektion) detektierbar war.Ein Anstieg der HBsAg-Produktion wurde ab Tag 5 (Serum 1; A) bzw. Tag 6 (Serum 2; B)festgestellt. Eine Zunahme der DNA-Konzentrationen konnte ab Tag 8 (Serum 1; A) bzw.Tag 6 (Serum 2; B) gemessen werden.

Abb. 3.8: Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentrationenvon HBeAg, HBsAg und DNA im Verlauf von 16 Tagen na h invitro Infektion primärer humaner Hepatozyten eines Spenders mitunters hiedli hen Inokula; (A) Serum 1 und (B) Serum 2

3 Ergebnisse 51Na hweis der MHC-GenexpressionImmunologis he Voraussetzung und Grundlage für eine funktionelle Interaktion HBV-spezi�-s her Immunzellen mit virusin�zierten Hepatozyten ist die Expression der Gene des Haupt-histokompatibilitätskomplexes (Major Histo ompatibility Complex; MHC). HLA-Klasse-I-Moleküle werden konstitutiv von allen kernhaltigen Zellen exprimiert, während HLA-Klasse-II-Moleküle nur von Zellen der Immunabwehr (z. B. Monozyten, Makrophagen, B-Zellen)gebildet werden. Demna h sollten Hepatozyten keine HLA-Klasse-II-Moleküle exprimieren.Allerdings gibt es in der Literatur Hinweise für eine HLA-Klasse-II-Expression dur h Hepato-zyten. Um eine Expression der HLA-Klasse-II-Moleküle dur h primäre Hepatozyten festzu-stellen und zu überprüfen, ob dur h Zellen dieser Kultur eine Antigenpräsentation gegenüberCD4+T-Zellen erfolgen kann, wurde ein Na hweissystem für MHC-Klasse-II mittels quan-titativer Reverser Transkriptase PCR (qRT-PCR) entwi kelt. Für Kontrolluntersu hungenwurden zusätzli h Systeme zum Na hweis von MHC-Klasse-I etabliert.

3 Ergebnisse 52Etablierung der qRT-PCR-Systeme MHC-Klasse-I und Klasse-IIFür den Na hweis von MHC-Klasse-II wurden die Lo i HLA-DRα, CD40 und der Klasse-II-Transaktivator CIITA gewählt. Zum Na hweis von MHC-Klasse-I wurden die Lo i HLA-A,HLA-B, HLA-C und beta2-Mikroglobulin (ÿ2M) gewählt. Na h Klonierung der entspre hen-den Sequenzabs hnitte und ans hlieÿender in vitro Transkription wurden die Transkripte von109 bis 100 Kopien/Ansatz seriell verdünnt. Abbildung 3.9 zeigt exemplaris h die Ei hgeradender Systeme HLA-A und HLA-DRα in den Verdünnungsstufen 109 bis 100 Kopien/Ansatz.Anhand der erstellten RNA-Standardreihen wurde die HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Expression dur h primäre humane Hepatozyten mittels TaqMan-PCR quanti�ziert.

Abb. 3.9: RNA-Ei hreihen zum Na hweis der Expression von MHC-Klasse-I (HLA-A) und MHC-Klasse-II (HLA-DRα); dargestellt sindVierfa h-Werte je Verdünnungsstufe

3 Ergebnisse 53Quanti�zierung der Expression von MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-IIUm die Expression von MHC-Klasse-I und Klasse-II in primären Hepatozytenkulturen zuuntersu hen, wurde die RNA aus 1,6 × 106 Zellen gewonnen und zur Quanti�zierung vonHLA-A, HLA-B, HLA-C, ÿ2M sowie HLA-DRα, CD40 und CIITA in die qRT-PCR eingesetzt(Abb. 3.10).

Abb. 3.10: Expression von MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II dur h kulti-vierte primäre humane Hepatozyten; dargestellt sind Mittelwerteaus je drei HepatozytenpräparationenDie gemittelten Konzentrationen der Transkripte [RNA-Kopien/1,6 × 106 Zellen℄ von MHC-Klasse-I betrugen für HLA-A 3,1 × 107, für HLA-B 3,7 × 106, für HLA-C 2,2 × 107 und fürÿ2M 6,1 × 107. Die MHC-Klasse-II-Transkripte lagen für HLA-DRα in einer Konzentrationvon 7,4 × 105 Kopien vor, für CD40 wurden 2,3 × 104 Kopien und für CIITA 6,1 × 103Kopien gemessen.Zunä hst s hien der quantitative Na hweis der MHC-Klasse-II-Expression dur h humane He-patozyten das in der Literatur bes hriebene Auftreten von MHC-Klasse-II in Lebergewebezu bestätigen. Der Literatur zu Folge enthalten aber isolierte Kulturen 10 bis 20 % ni htpa-ren hymatöse Zellen, die für eine e�ziente Di�erenzierung und Kultivierung der primärenHepatozyten nötig sind. Dabei handelt es si h hauptsä hli h um lebersinusoidale Endothel-zellen und Kup�er-Zellen, die MHC-Klasse-II exprimieren. Der Na hweis von MHC-Klasse-IIzeigt, dass, wenn in Lebergewebe die MHC-Klasse-II exprimierenden Zellen HBsAg aufneh-men, eine Antigenpräsentation für CD4+T-Lymphozyten erfolgen kann.

3 Ergebnisse 54Um die Kinetik der Expression von MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II im Kulturverlauf undglei hzeitig den E�ekt der Virusinfektion darauf zu untersu hen, wurden 12 Hepatozyten-Kulturs halen unter Standard-Bedingungen kultiviert und parallel wurden 12 Kulturs halenmit HBV in�ziert. An 12 Zeitpunkten wurde die Gesamt-RNA jeweils einer ni ht in�ziertenund einer in�zierten Kultur gewonnen. Die Abbildung 3.11 zeigt am Beispiel der Expressionvon HLA-A und HLA-DRα die Kinetik der MHC-Transkripte im 16-tägigen Kulturverlauf.

Abb. 3.11: Expression von HLA-A und HLA-DRα dur h unter Standard-Bedingungen kultivierte und HBV-in�zierte primäre humane He-patozyten im Verlauf von 16 TagenDie Expression von HLA-A und HLA-DRα im Verlauf einer 16-tägigen Kulturphase na hVersu hsbeginn zeigte an den einzelnen Messwerten ledigli h geringfügige S hwankungen,die sowohl in der unin�zierten, als au h in der in�zierten Hepatozytenkultur auftraten. DieMHC-Transkription nahm weder kontinuierli h zu no h ab, au h in der Expression der (hierni ht gezeigten) überprüften Systeme HLA-B, HLA-C, ÿ2M, CD40 und CIITA konnte kein

3 Ergebnisse 55spezi�s her Trend festgestellt werden.Anders als zum Teil in der Literatur bes hrieben, bewirkte eine HBV-Infektion der Hepato-zyten keinen messbaren E�ekt auf die MHC-Transkription. Hierbei ist anzumerken, dass indiesem in vitro Infektionsmodell nur ein geringer Prozentsatz ( ir a 10 %) der Hepatozytenmit Hepatitis-B-Virus in�ziert ist, wie mittels Färbung der ore-Partikel festgestellt wurde(Taus h, 2005).3.1.3 Untersu hung der HBV-Infektion humanerHepatom-Zell-LinienParallel zu dem in vitro HBV-Infektionsmodell der primären humanen Hepatozyten wurdenau h humane Hepatom-Zell-Linien eingesetzt. Die Linien HepG2.215 und HepG2.4A5 pro-duzieren konstitutiv HBV-DNA, HBsAg und HBeAg und repräsentieren somit den Statuseiner hronis hen HBV-Infektion. Die Zell-Linien HepG3 und PLK/PRF exprimieren undsezernieren auss hlieÿli h HBsAg.Die HBV-in�zierten Hepatom-Zell-Linien dienten als weiteres Modellsystem für die Unter-su hung antiviraler Eigens haften HBsAg-spezi�s her CD4+T-Lymphozyten.Quanti�zierung viraler Antigene und viraler DNADie Abbildung 3.12 zeigt die in vitro Produktion von HBeAg und HBsAg sowie die Re-plikation der viralen DNA der Zell-Linien HepG2.215, HepG2.4A5, HepG3 und PLK/PRF(gemessen aus dem Überstand kon�uenter Kulturen mit a. 1,6 × 105 Zellen/ m2).

3 Ergebnisse 56

Abb. 3.12: Im Kulturüberstand der Hepatom-Zell-Linien HepG2.215,HepG2.4A5, HepG3 und PLK/PRF na hweisbare Konzen-trationen von HBsAg und HBeAg (A) sowie viraler DNA(B)Die Linien HepG2.215 und HepG2.4A5 produzierten neben HBsAg au h HBeAg sowie vi-rale DNA. Dabei übersteigt die Virus- und Antigen-Produktion der HepG2.215-Zellen dieder HepG2.4A5-Zellen um ein Vielfa hes. Die HepG3-Zellen und die PLK/PRF-Zellen ex-primierten auss hlieÿli h HBsAg.

3 Ergebnisse 57Quanti�zierung viraler RNAZur Quanti�zierung der 3,5-kb RNA (C-HBV) und der 2,4-kb RNA (S-HBV) in den Hepatom-Linien HepG2.215 und HepG2.4A5 wurde die RNA aus 1,6 × 106 Zellen isoliert und in dieqRT-PCR eingesetzt (Abb. 3.13).

Abb. 3.13: Konzentration der 2,4-kb S-HBV RNA sowie der 3,5-kb C-HBVRNA in den Hepatom-Zell-Linien HepG2.215 und HepG2.4A5In beiden Hepatom-Zell-Linien wurde die S-HBV RNA in deutli h höherer Konzentrati-on gemessen als die C-HBV RNA. In HepG2.215-Zellen wurden 2,1 × 109 S-HBV RNA-Kopien/1,6 × 106 Zellen gemessen, während in HepG2.4A5-Zellen 1,1 × 108 S-HBV Kopiengemessen wurden. Die C-HBV RNA wurde bei HepG2.215-Zellen in einer Konzentration von1,0 × 108 Kopien und bei HepG2.4A5-Zellen in einer Konzentration von 2,5 × 104 Kopiengemessen.Aus der Di�erenz beider RNAs zeigt si h, dass au h in den Hepatom-Zellen die Konzentra-tion der S-HBV RNA tatsä hli h überwiegt. Somit ergibt si h für die in HepG2.215-Zellenna hgewiesene S-HBV RNA eine e�ektive Konzentration von 2,0 × 109 Kopien, während dieS-HBV RNA Konzentration der HepG2.4A5-Zellen 1,0 × 108 Kopien beträgt.Im Verglei h zu HepG2.215-Zellen weisen HepG2.4A5-Zellen sowohl eine geringere Tran-skriptionsrate, als au h eine s hwä here Synthese der viralen Antigene und s hwä here Vi-rusreplikation auf. Für einen Verglei h der Virusreplikation der Hepatom-Zellen mit derPrimärinfektion der Hepatozyten ist anzumerken, dass bei den Hepatom-Zellen jede Zellemit Virus in�ziert ist. Zudem kann im Gegensatz zu den in�zierten primären Hepatozytenin den Hepatomzellen mehr HBeAg als HBsAg gebildet werden.

3 Ergebnisse 583.2 Ein�uss der TH-Typ1-Zytokine TNF-α und IFN-γauf die HBV-InfektionEine Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus hat im Zuge der Immunantwort die Bildung derin�ammatoris hen Zytokine IFN-γ und TNF-α dur h die Immunzellen zur Folge. Diese Zyto-kine werden von CD4+T-Helferzellen-Typ1 sezerniert und als TH-Typ1-Zytokine bezei hnet.Au h die dur h Impfung induzierten CD4+T-Zellen sezernieren na h Kontakt mit HBsAg TH-Typ1-Zytokine. In vers hiedenen ni ht-humanen Modellsystemen wie dem HBV-transgenenMausmodell oder dem Enten-HBV-Modell konnte dur h exogene Zugabe von rekombinan-tem IFN-γ und bzw. oder TNF-α ein hemmender Ein�uss auf die Virusreplikation beob-a htet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der E�ekt dieser TH-Typ1-Zytokine aufdie Hepatitis-B-Virusinfektion humaner Hepatom-Zellen und auf die akute Infektion pri-märer Hepatozyten untersu ht. Die Beein�ussung der Virusreplikation wurde sowohl aufTranslations- als au h auf Transkriptionsebene überprüft.Ein�uss von TNF-α und IFN-γ auf die HBV-Replikation humanerHepatom-ZellenMit Hilfe der konstitutiv HBV-exprimierenden Zell-Linie HepG2.215 wurde zunä hst derdosisabhängige E�ekt von IFN-γ und TNF-α auf die Virusreplikation untersu ht. Hierfürwurden die Hepatom-Zellen 48 Stunden mit Medium kultiviert, dem rekombinantes IFN-γoder TNF-α in den Konzentrationen 1 ng/ml, 10 ng/ml und 20 ng/ml zugesetzt war.In den Hepatom-Zellen wurde na h Kultur mit zytokinhaltigem Medium eine im Verglei hzur Kontrollkultur reduzierte Konzentration der Virus-DNA sowie der Antigene HBeAg undHBsAg gemessen. Das Ausmaÿ der Inhibition nahm mit steigender Zytokin-Konzentrationzu, dabei wurde dur h IFN-γ eine stärkere Reduktion der viralen Aktivität vermittelt alsdur h TNF-α (Abb. 3.14).

3 Ergebnisse 59

Abb. 3.14: Produktion von HBV-DNA (A), HBeAg (B) und HBsAg (C) inHepG2.215-Zellen na h Zugabe von rekombinantem TNF-α undIFN-γ in unters hiedli hen Konzentrationen

3 Ergebnisse 60Die Synthese der viralen DNA (Abb. 3.14; A) wies unter Zytokin-Zugabe deutli he Konzen-trationsunters hiede und eine Inhibition der Virusreplikation im Verglei h zur Kontrollkulturauf (HBV-DNA [Kopien/ml℄: Kontrolle ohne Zytokin-Zugabe: 4,0 × 106; 1 ng/ml TNF-α:3,6× 106; 10 ng/ml TNF-α: 2,4× 106; 20 ng/ml TNF-α: 2,2× 106; 1 ng/ml IFN-γ: 2,6× 106;10 ng/ml IFN-γ: 2,2 × 106; 20 ng/ml IFN-γ: 1,5 × 106).Die Produktion von HBeAg (Abb. 3.14; B) wurde dur h die Zytokine im Verglei h zurKontrollkultur ebenfalls deutli h reduziert (HBeAg [S/CO℄: Kontrolle ohne Zytokin-Zugabe:117; 1 ng/ml TNF-α: 99; 10 ng/ml TNF-α: 91; 20 ng/ml TNF-α: 88; 1 ng/ml IFN-γ: 96;10 ng/ml IFN-γ: 78; 20 ng/ml IFN-γ: 68).Au h die Expression des HBsAg (Abb. 3.14; C) zeigte in Kulturen mit Zytokin-Zugabe ver-minderte Antigen-Konzentrationen im Verglei h zur Kontrollkultur (HBsAg [S/N℄: Kontrolleohne Zytokin-Zugabe: 81; 1 ng/ml TNF-α: 77; 10 ng/ml TNF-α: 75; 20 ng/ml TNF-α: 73;1 ng/ml IFN-γ: 77; 10 ng/ml IFN-γ: 54; 20 ng/ml IFN-γ: 52).Die deutli he TNF-α- bzw. IFN-γ-vermittelte Reduktion der DNA-Synthese und der Antigen-Produktion s heint sowohl dosisabhängig als au h zytokinabhängig zu sein (Tab. 3.1).Reduktiondur h TNF-α 1 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/mlHBV-DNA 10 % 40 % 45 %HBeAg 15 % 22 % 25 %HBsAg 5 % 7 % 10 %Reduktiondur h IFN-γ 1 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/mlHBV-DNA 35 % 45 % 63 %HBeAg 18 % 33 % 42 %HBsAg 5 % 33 % 36 %Tab. 3.1: Reduktion der viralen DNA-Synthese und Antigen-Produktion inHepG2.215-Zellen dur h TNF-α und IFN-γ

3 Ergebnisse 61Aus der Abbildung 3.15 ist ersi htli h, dass TNF-α und IFN-γ au h eine Beein�ussung derviralen Transkription bewirkten.

Abb. 3.15: Synthese der 3,5-kb C-HBV RNA (A) sowie der 2,4-kb S-HBVRNA (B) in HepG2.215-Zellen na h Zugabe von rekombinantemTNF-α und IFN-γ in unters hiedli hen KonzentrationenIn der Kultur ohne Zytokin-Zugabe wurde eine Konzentration der C-HBV RNA (Abb. 3.15;A) von 1,2 × 108 Kopien/1,6 × 106 Zellen gemessen. TNF-α verminderte die C-HBV RNA-Synthese auf 1,0× 108 Kopien (1 ng/ml), 8,0× 107 Kopien (10 ng/ml) bzw. 4,1× 107 Kopien(20 ng/ml). IFN-γ reduzierte die C-HBV RNA-Synthese auf 9,0 × 107 Kopien (1 ng/ml),6,0 × 107 Kopien (10 ng/ml) bzw. 3,8 × 107 Kopien (20 ng/ml).Die S-HBV RNA (Abb. 3.15; B) konnte in der Kultur ohne Zytokin-Zugabe in 2,2 × 109Kopien quanti�ziert werden. TNF-α inhibierte die S-HBV RNA Synthese auf 2,0 × 109Kopien (1 ng/ml), 1,3 × 109 Kopien (10 ng/ml) bzw. 9,0 × 108 Kopien (20 ng/ml). IFN-γ

3 Ergebnisse 62verminderte die Synthese der S-HBV RNA auf 1,8 × 109 Kopien (1 ng/ml), 1,2 × 109 Kopien(10 ng/ml) bzw. 8,1 × 108 Kopien (20 ng/ml).Der zytokinabhängige E�ekt auf die RNA-Synthese s heint ebenfalls in Abhängigkeit dereinwirkenden Konzentration zu stehen (Tab. 3.2).Reduktiondur h TNF-α 1 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/mlC-HBV RNA 17 % 33 % 66 %S-HBV RNA 9 % 41 % 59 %Reduktiondur h IFN-γ 1 ng/ml 10 ng/ml 20 ng/mlC-HBV RNA 25 % 50 % 68 %S-HBV RNA 18 % 46 % 63 %Tab. 3.2: Reduktion der viralen Transkription in HepG2.215-Zellen dur hTNF-α und IFN-γFür die Untersu hung der antiviralen Wirkung der Zytokine in der bzw. auf die Frühphaseeiner Infektion und um zusätzli h einen längeren Verlauf dieser zytokinabhängigen Beein�us-sung der Infektion verfolgen zu können, wurden weitere Versu hsreihen an in vitro in�ziertenprimären humanen Hepatozyten dur hgeführt.

3 Ergebnisse 63Ein�uss von TNF-α und IFN-γ auf die HBV-Replikation in in vitroin�zierten primären humanen HepatozytenAufbauend auf den Versu hen mit der Hepatom-Linie HepG2.215 wurde na h einer Infekti-on der PHH ab Tag 1 tägli h 10 ng/ml rekombinantes TNF-α und in einem Parallelansatz10 ng/ml rekombinantes IFN-γ zum Kulturmedium gegeben. Eine Beein�ussung der Infek-tion dur h die Zytokine wurde auf Protein- und RNA-Ebene überprüft.Aus Abbildung 3.16 A) ist ersi htli h, dass bereits 24 Stunden na h Zugabe der ZytokineTNF-α und IFN-γ eine Reduktion der HBeAg-Expression messbar war. Im Gegensatz zuder an Tag 2 beginnenden Produktion von HBeAg in der Standardinfektion (Infektion oh-ne Zytokin-Zugabe) setzte in den mit Zytokinen kultivierten Ansätzen die Neusynthese desHBeAg zunä hst verzögert an Tag 4 ein. Im weiteren Verlauf der Infektion war die HBeAg-Expression im Verglei h zur Standardinfektion deutli h reduziert (HBeAgmax [S/CO℄: Infek-tion ohne Zytokin-Zugabe: 45; mit TNF-α: 28; mit IFN-γ: 17).Au h der Beginn der HBsAg-Expression sowie der DNA-Neusynthese (Abb. 3.16; B/C) warim Verglei h zur beginnenden HBsAg-Produktion und Virusreplikation der Standardinfek-tion 48 Stunden später messbar. Im Verglei h zur Standardinfektion wurden in den mitTNF-α und IFN-γ kultivierten Infektionsansätzen deutli h verminderte Maximalkonzentra-tionen der HBs-Antigene (HBsAgmax [S/N℄: Infektion ohne Zytokin-Zugabe: 51; mit TNF-α:28; mit IFN-γ: 12) und der Virus-DNA (HBV-DNAmax [Kopien/ml℄: Infektion ohne Zytokin-Zugabe: 2,6 × 105; mit TNF-α: 1,1 × 105; mit IFN-γ: 1,0 × 105) errei ht.Dur h TNF-α und IFN-γ wurde somit au h die Primärinfektion inhibitoris h beein�usst.Es erfolgte eine deutli he Reduktion der viralen DNA-Synthese und der Antigen-Produktion(Tab. 3.3). Reduktion dur h TNF-α Reduktion dur h IFN-γHBV-DNA 58 % 62 %HBeAg 38 % 62 %HBsAg 45 % 77 %Tab. 3.3: Reduktion der viralen DNA-Synthese und der Antigen-Produktionin HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten dur h TNF-αund IFN-γ

3 Ergebnisse 64

Abb. 3.16: Kinetik von HBeAg (A), HBsAg (B) und viraler DNA (C) in invitro HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten unter Ein-�uss von rekombinantem TNF-α und IFN-γ

3 Ergebnisse 65Au h auf RNA-Ebene zeigte si h bereits 24 Stunden na h erstmaliger Zugabe der Zytokineeine Suppression der Virusaktivität (Abb. 3.17).

Abb. 3.17: Konzentration der C-HBV RNA (A) und S-HBV RNA (B) in invitro HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten unter Ein-�uss von rekombinantem TNF-α und IFN-γAn Tag 12 lag in der Kultur ohne Zytokin-Zugabe eine C-HBV RNA-Konzentration von9,8 × 105 Kopien/1,6 × 106 Zellen vor, während TNF-α zu einer C-HBV Konzentration von8,0 × 104 Kopien und IFN-γ zu 2,1 × 104 Kopien führte. Die S-HBV RNA konnte in derKontrollkultur in einer Konzentration von 1,6 × 107 Kopien gemessen werden, während na hKultur mit TNF-α 1,4 × 106 Kopien und na h Kultur mit IFN-γ 4,9 × 105 Kopien gemessenwurden.

3 Ergebnisse 66Wie auf Proteinebene übte IFN-γ au h auf Transkriptionsebene eine stärkere inhibitoris heWirkung aus als TNF-α (Tab. 3.4).Reduktion dur h TNF-α Reduktion dur h IFN-γC-HBV-RNA 92 % 98 %S-HBV-RNA 91 % 97 %Tab. 3.4: Reduktion der viralen Transkription in HBV-in�zierten primärenhumanen Hepatozyten dur h TNF-α und IFN-γAnalog zu den Vorversu hen mit den konstitutiv HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen zeigtesi h hier dur h die Zytokine TNF-α und IFN-γ ein inhibitoris her E�ekt auf die Virusre-plikation in der Frühphase der Infektion. Somit konnte gezeigt werden, dass der antiviraleE�ekt die Synthese viraler Produkte sowohl in der Frühphase einer Infektion als au h in eineretablierten Infektion unterdrü ken kann, wobei IFN-γ stärker inhibierend wirkt als TNF-α.

3 Ergebnisse 67Ein�uss von Interferon-γ auf die MHC-Klasse-II-ExpressionEs ist bekannt, dass IFN-α oder IFN-β zu einer Steigerung der Transkription von MHC-Klasse-I führt, während IFN-γ über Induktion des Klasse-II-Kotransaktivators (CIITA) dieExpression von MHC-Klasse-II steuert. Da au h CD4+T-Zellen IFN-γ sezernieren, könn-te dies dur h gesteigerte MHC-Klasse-II-Expression zu einer erhöhten Antigenpräsentationführen.Daher wurde getestet, ob IFN-γ au h in den primären Hepatozytenkulturen eine Steige-rung der MHC-Klasse-II-Expression bewirkt. Hierfür wurden PHH für einen Zeitraum vonvier Tagen unter Zugabe unters hiedli her IFN-γ-Konzentrationen (1 ng/ml, 10 ng/ml und20 ng/ml) kultiviert. Aus Abbildung 3.18 Teil A) ist ersi htli h, dass, dur h 10 ng/ml IFN-γ� ausgehend von 5,4 × 102 CIITA-RNA Kopien/1,6 × 106 Zellen � bis Tag 4 eine 9,4-fa herhöhte CIITA-Expression auf 5,1 × 103 Kopien erfolgte. Die Expression von HLA-DRα(Abb. 3.18; B) wurde dur h 10 ng/ml IFN-γ von 3,2 × 105 Kopien/1,6 × 106 Zellen bisTag 4 auf 1,0 × 107 Kopien 31,2-fa h erhöht.

3 Ergebnisse 68

Abb. 3.18: Expression von CIITA (A) sowie HLA-DRα (B) dur h primärehumane Hepatozyten im Verlauf von 4 Tagen na h Zugabe vonrekombinantem IFN-γ in unters hiedli hen Konzentrationen

3 Ergebnisse 69Zusammenfassung:Antivirale Wirkung der TH-Typ1-Zytokine auf die Virusreplikation HBV-in�zierterhumaner HepatozytenDie rekombinanten TH-Typ1-Zytokine TNF-α und IFN-γ führten in HBV-in�zierten huma-nen Hepatozyten zu einer Inhibition der viralen Aktivität.� Der supprimierende E�ekt auf die Infektion zeigte si h auf RNA- und Proteinebenesowie in der Replikation der viralen DNA.� Die HBeAg-Produktion der humanen Hepatom-Zellen wurde dur h TNF-α um bis zu25 % und dur h IFN-γ um 42 % reduziert.� Die HBeAg-Produktion der primären humanen Hepatozyten wurde dur h TNF-α um38 % und dur h IFN-γ um 62 % reduziert.� Der Zytokin-vermittelte antivirale E�ekt war bereits innerhalb von 24 Stunden mess-bar.� Der antivirale E�ekt war sowohl zytokin- als au h dosisabhängig.Zudem bewirkte IFN-γ in humanen Hepatozyten eine erhöhte MHC-Klasse-II-Expression.

3 Ergebnisse 703.3 Kokultur HBV-in�zierter humaner Hepatozyten mitHBV-spezi�s hen peripheren Blut-Lymphozyten3.3.1 Etablierung des Kokultur-ModellsUm eine Beein�ussung der Hepatitis-B-Virusinfektion dur h HBV-spezi�s he Immunzellenim eigentli h funktionellen Kontext untersu hen zu können, sollten dur h Kokultivierungin�zierter Zielzelle (Hepatozyten) und reaktiver E�ektorzelle (Immunzellen, periphere Blut-Lymphozyten, PBL) in vivo Bedingungen simuliert werden.Alloreaktivität von Immunzellen und Hepatozyten unters hiedli herHLA-RestriktionUm eine Alloreaktivität von Immunzellen mit Hepatozyten zu überprüfen, wurden isolierteheterologe PBL mit direktem Kontakt zu PHH in eine Kulturs hale gegeben. Wie in derAbbildung 3.19 ersi htli h, waren bereits na h 12-stündigem Zell-Zell-Kontakt morphologi-s he Veränderungen der Hepatozyten erkennbar. Innerhalb von 24 Stunden na h Zugabeder PBL traten ausgedehnte zytotoxis he E�ekte auf, die s hlieÿli h zum Absterben derHepatozytenkultur führten.

Abb. 3.19: Morphologis he Veränderungen primärer humaner Hepatozytenna h direktem Zell-Zell-Kontakt mit heterologen peripheren Blut-Lymphozyten

3 Ergebnisse 71Für die Untersu hungen der Interaktionen der Immunzellen mit virusin�zierten Hepatozy-ten wurde deshalb ein Kulturmodell entwi kelt, das eine Kokultivierung heterologer Lym-phozyten mit Hepatozyten erlaubt. Dabei wurde dur h Unterbinden eines direkten Zell-Zell-Kontaktes die Alloreaktivität der HLA-unters hiedli hen Zellen verhindert.Trans-well-SystemZur Vermeidung direkter Zell-Zell-Kontakte wurden für die Dur hführung der Kokultur vonHepatozyten mit PBL spezielle Zellsiebe verwendet. Die Membran dieser Siebe besitzt Porenmit einem Dur hmesser von 0,4 µm und sollte daher auss hlieÿli h für lösli he Faktoren, z.B.Zytokine oder virale Partikel und Antigene permeabel sein. Der Einsatz der Zellsiebe auf dieHepatozytenkultur erforderte zunä hst eine Abwandlung bzw. Anpassung der Kulturbedin-gungen des Standard-Infektionsmodells.Dur h das Einsetzen des Zellsiebes war es nötig, das Kulturvolumen auf 3 ml zu erhöhen.Deshalb wurde getestet, ob der Aufsatz des Zellsiebes und die Erhöhung des Kulturvolumenseine negative Beein�ussung der Infektion (z. B. Auswirkungen eines eventuell verändertenSauersto�partialdru ks auf die Vitalität der Zellen und damit Änderung der HBeAg-Kinetik)zur Folge haben. Im Verglei h zu einer Standardinfektion (1 ml Kulturvolumen) wurde eineInfektion mit Siebeinsatz und 3 ml Kulturvolumen (Kokulturmodell) dur hgeführt. Im Ko-kulturmodell wurde an Tag 2 (24 Stunden na h Infektion) das Zellsieb eingesetzt und dieVolumina auf je 1,5 ml im Hepatozyten-well sowie im Zellsieb angepasst. Die Abbildung 3.20zeigt den Verlauf der Synthese von HBeAg, HBsAg und viraler DNA in den beiden unter-s hiedli hen Infektionsmodellen.Da die im Kokulturmodell produzierten Antigene und die DNA im Verglei h zum Standard-modell im Überstand 1 : 3 verdünnt vorlagen, war die maximal gemessene Konzentration derAntigene und der viralen DNA im Kokulturmodell erniedrigt. Jedo h war in allen Ansätzen� sowohl im Standardmodell als au h im Kokulturmodell � eine Zunahme der messbarenAntigen- und DNA-Konzentrationen zu verzei hnen. Das erhöhte Kulturvolumen und derEinsatz des Zellsiebes hatten somit keine negative Beein�ussung der Antigen-Produktionund der Virusreplikation zur Folge.

3 Ergebnisse 72

Abb. 3.20: Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentratio-nen von HBeAg (A), HBsAg (B) und DNA (C) na h in vitro HBV-Infektion und Kultivierung der primären humanen Hepatozytenim Standardmodell (1 ml Kulturvolumen) und im Kokulturmo-dell mit Siebeinsatz (3 ml Kulturvolumen)

3 Ergebnisse 73Zur Testung der Permeabilität der Siebmembran für die in vitro synthetisierten viralen Pro-dukte wurden Hepatozyten in�ziert und mit eingesetztem Zellsieb kultiviert. Antigen- undDNA-Konzentrationen wurden tägli h im Zelleinsatz bestimmt. Die Abbildung 3.21 zeigt denVerlauf der im Zellsieb na hweisbaren Konzentrationen der HBeAg- und HBsAg-Produktionsowie der Synthese von viraler DNA. Im Zellsieb konnte sowohl eine kontinuierli he Konzen-trationszunahme der Antigene als au h der Viruspartikel gemessen werden.

Abb. 3.21: Kinetik der im Zellsieb na hweisbaren Konzentrationen von HBe-Ag, HBsAg sowie viraler DNA na h in vitro HBV-Infektionund Kultivierung der primären humanen Hepatozyten mit demZelleinsatzDieses Ergebnis bestätigte das zu erwartende Di�usionsglei hgewi ht zwis hen Hepatozy-tens hale und Zelleinsatz. Die von Hepatozyten produzierten lösli hen Antigene und dieViruspartikel passieren die Siebmembran; damit kann davon ausgegangen werden, dass imGegenzug die von Immunzellen sezernierten lösli hen Produkte (Zytokine) dur h die Mem-bran di�undieren.

3 Ergebnisse 74Modellsystem zur Kokultivierung HBV-spezi�s her Immunzellen mitHBV-in�zierten humanen HepatozytenMittels des Kokulturmodells wurden nun die Interaktionen HBV-spezi�s her Immunzellen(PBL) mit HBV-in�zierten Hepatozyten untersu ht. Die HBV-spezi�s hen PBL wurden vonSpendern gewonnen, die gegen Hepatitis-B-Virus geimpft worden waren. Der für die Vakzi-nierung verwendete Impfsto� enthält als immunogene Determinante das HBsAg. Die Reak-tivität der Zellen gegen HBsAg (Impfsto�-Antigen) wurde im Elispot getestet. Das Zytokin-pro�l zeigt mit der Sekretion von IL-2, IFN-γ und TNF-α eine eindeutige TH-Typ1-Antwort(Abb. 3.22).

Abb. 3.22: Zytokinpro�l HBV-spezi�s her Immunzellen HBV-geimpfter Per-sonen; gemessen mittels ElispotAls Kontrollen wurden HBV-naive PBL von ungeimpften Spendern eingesetzt, die im Elispotkeine Reaktivität auf das Impfsto�-Antigen zeigten.

3 Ergebnisse 75Zur Untersu hung der Rolle der imp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Lymphozytenbei der HBV-Infektion wurden in�zierte Hepatozyten mit PBL, die bei Geimpften die spe-zi�s hen CD4+T-Zellen beinhalten, kokultiviert. Die Abbildung 3.23 zeigt s hematis h dasKokultursystem, mit dem die im Folgenden bes hriebenen Versu he dur hgeführt wurden.Die grundlegende Idee war, dass die von HBV-in�zierten Hepatozyten sezernierten viralenProdukte eine Stimulation der HBV-spezi�s hen Immunzellen bewirken, die als reaktive Ant-wort die Bildung antiviral wirkender Zytokine zur Folge haben könnte bzw. sollte. Aufgrunddes si h einstellenden Di�usionsglei hgewi hts zwis hen Hepatozyten-well und Zellsieb soll-ten trotz fehlendem Zell-Zell-Kontakt Interaktionen zwis hen Ziel- und E�ektorzellen statt-�nden können, die über lösli he Faktoren vermittelt werden.

Abb. 3.23: Trans-Well -System zur Dur hführung der Kokulturversu he vonHBV-spezi�s hen Immunzellen mit HBV-in�zierten humanenHepatozytenZur Beurteilung der Infektionse�zienz der PHH/PBL-Kokulturen wurde die Kinetik derHBeAg-Produktion bestimmt.

3 Ergebnisse 763.3.2 Wirkung HBV-spezi�s her Immunzellen auf die akuteHBV-Infektion primärer humaner HepatozytenWirkung HBV-spezi�s her PBL auf die Initiation der Hepatitis-B-VirusinfektionZunä hst wurde die Wirkung von HBV-spezi�s hen PBL geimpfter Spender auf die Initia-tion einer in vitro HBV-Infektion der PHH untersu ht. Parallel dazu wurden als KontrollenKokulturen mit HBV-naiven PBL ungeimpfter Spender dur hgeführt. Der Beginn der Ko-kulturen erfolgte 24 Stunden na h der Infektion dur h Zugabe von 5 × 106 isolierter PBL zuHBV-in�zierten Hepatozyten. Abbildung 3.24 zeigt die HBeAg- und HBsAg-Synthese unddie Replikation der viralen DNA in PHH/PBL-Kokulturen mit HBV-spezi�s hen (HBVS)und HBV-naiven (HBVN) PBL.

3 Ergebnisse 77

Abb. 3.24: Kinetik der im Zellkulturüberstand na hweisbaren Konzentratio-nen von HBeAg (A), HBsAg (B) und viraler DNA (C) na h invitro HBV-Infektion der primären humanen Hepatozyten und Ko-kultur mit HBV-spezi�s hen PBL eines geimpften Spenders undHBV-naiven PBL eines ungeimpften Spenders

3 Ergebnisse 78Die Kontrollinfektion (PHH ohne PBL) zeigte ab Tag 4 na h Infektion einen kontinuierli- hen Anstieg der HBeAg-Produktion (Abb. 3.24; A), die ein Maximum an Tag 14 (HBe-Ag [S/CO℄: 7,3) errei hte. Im Gegensatz dazu konnte in der PHH/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur keine e�ektive Antigen-Neuproduktion gemessen werden (< 1 S/CO; Na hweisgren-ze: 1 S/CO). Überras henderweise wurde im Verglei h zur Kontrollinfektion au h in derPHH/HBV-naiven-PBL-Kultur eine deutli h verminderte HBeAg-Konzentration (1,8 S/CO)gemessen.Die Messung der HBsAg-Expression (Abb. 3.24; B) zeigte in der Kontrollinfektion ab Tag 9einen lei hten Anstieg. An Kulturende war die HBsAg-Konzentration (HBsAg [S/N℄) sowohlin der PHH/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur (5,7 S/N) als au h der PHH/HBV-naiven-PBL-Kultur (6,4 S/N) im Verglei h zur Kontrollinfektion (22,1 S/N) deutli h reduziert.Die Konzentrationsbestimmung der HBV-DNA (Abb. 3.24; C) zeigte in der Kontrollinfek-tion ebenfalls ab Tag 9 einen lei hten Anstieg der Virusreplikation mit einer Maximalkon-zentration von 4,9 × 104 Kopien/ml. An Tag 14 wiesen sowohl die PHH/HBV-spezi�s he-PBL-Kultur (2,1 × 104 Kopien/ml) als au h die PHH/HBV-naive-PBL-Kultur (2,5 × 104Kopien/ml) eine verminderte DNA-Synthese auf.In Kokultur der HBV-in�zierten Hepatozyten mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven Im-munzellen war ein antiviraler E�ekt zu verzei hnen, der zu einer deutli hen Reduktionder HBeAg-Produktion, der HBsAg-Expression sowie der Synthese der viralen DNA führte(Tab. 3.5). Reduktion dur hHBV-spezi�s he PBL Reduktion dur hHBV-naive PBLHBeAg 100 % 75 %HBsAg 74 % 71 %HBV-DNA 57 % 49 %Tab. 3.5: Reduktion der Antigen-Produktion und der viralen DNA-Synthesein HBV-in�zierten primären humanen Hepatozyten dur h HBV-spezi�s he PBL eines geimpften Spenders und HBV-naive PBL einesungeimpften SpendersDie dur h HBV-spezi�s he PBL vermittelte antivirale Wirkung auf die HBeAg-Produktionwurde in einem Kollektiv von 17 geimpften Spendern überprüft. HBV-spezi�s he PBL sup-primierten die HBeAg-Produktion Zellspender-abhängig bis zur Vollständigkeit (um 78 bis100 %) (Abb. 3.25). Die E�ekte HBV-naiver PBL auf die HBV-Infektion wurden in einemKollektiv von 12 ungeimpften Spendern getestet. Dabei wurde eine Reduktion der HBeAg-Produktion von 27 bis 82 % errei ht.

3 Ergebnisse 79

Abb. 3.25: Reduktion der HBeAg-Produktion in in vitro HBV-in�zierten pri-mären humanen Hepatozyten dur h HBV-spezi�s he PBL (n=17;Median 90 Prozent) und dur h HBV-naive PBL (n=12; Median58,5 Prozent) vers hiedener SpenderDie HBV-spezi�s hen PBL führten zu einer signi�kant (p < 0,05) stärkeren Suppression derHBeAg-Produktion vergli hen mit HBV-naiven PBL. Dabei zeigte si h ein direkter Zusam-menhang zwis hen der Reduktion der HBeAg-Produktion und der Zahl reaktiver (IFN-γ-sezernierender) T-Zellen (gemessen im Elispot) (Abb. 3.26).

Abb. 3.26: Korrelation der Zahl IFN-γ-sezernierender Zellen vers hiede-ner HBV-geimpfter Spender mit der Reduktion der HBeAg-Produktion in in vitro HBV-in�zierten primären humanenHepatozyten

3 Ergebnisse 80Wirkung HBV-spezi�s her und HBV-naiver PBL auf die bestehendeHepatitis-B-VirusinfektionNa hfolgend wurde untersu ht, ob der PBL-vermittelte antivirale E�ekt au h bereits be-stehende Infektionen beein�ussen kann. Hierfür erfolgte die Zugabe der PBL an Tag 4 na hBeginn der Infektion. Die Abbildung 3.27 zeigt anhand eines repräsentativen Beispiels die Ki-netik der bereits aktiven HBeAg-Produktion na h Zugabe von HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL an Tag 4 ( ).

Abb. 3.27: Kinetik der HBeAg-Produktion na h in vitro HBV-Infektion derprimären humanen Hepatozyten und Zugabe HBV-spezi�s herund HBV-naiver PBL an Tag 4 na h Beginn der InfektionIn allen Kulturen war zunä hst ab Tag 3 na h Infektion ein Anstieg der HBeAg-Produktionzu verzei hnen. An Tag 4 war in allen Ansätzen eine verglei hbare HBeAg-Konzentrationzu messen (HBeAg [S/CO℄: 3,0; 2,9; 2,9). Die Zugabe HBV-spezi�s her und HBV-naiverPBL jedo h bewirkte eine starke Inhibition der Antigen-Produktion in den Kokulturan-sätzen, während die HBeAg-Produktion in der Kontrollinfektion ohne PBL bis Tag 14 ei-ne Konzentration von 7,4 S/CO errei hte. Die HBeAg-Konzentration in der PHH/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur sank auf < 1,0 S/CO. Au h in Kultur mit HBV-naiven PBL wurdedie HBeAg-Produktion deutli h reduziert (1,8 S/CO). HBV-spezi�s he PBL reduzierten dieHBeAg-Produktion vollständig, während HBV-naive PBL eine Inhibition der Infektion um76 % bewirkten.Die Versu he zur Zeitabhängigkeit der antiviralen Wirkung von PBL auf die Primärinfektionder Hepatozyten ergaben, dass neben der Initiation einer Infektion au h eine bereits etablierteHBV-Infektion dur h HBV-spezi�s he und HBV-naive PBL dauerhaft beein�usst werdenkann.

3 Ergebnisse 81Die dur h HBV-spezi�s he und HBV-naive PBL vermittelte antivirale Wirkung istreversibelDa gezeigt werden konnte, dass dur h Zugabe von HBV-spezi�s hen sowie HBV-naiven PBLeine bereits bestehende Virusinfektion der Hepatozyten beein�usst werden kann, wurde un-tersu ht, ob es si h dabei um einen reversiblen E�ekt handelt. Hierfür wurden na h 14-tägigerKokultur die PBL entfernt und die HBeAg-Konzentration im Überstand der in�zierten He-patozyten eine weitere Wo he verfolgt.An einem repräsentativen Beispiel ist in Abbildung 3.28 der Verlauf der HBeAg-Produktionwährend und na h der Kokultur mit HBV-spezi�s hen bzw. HBV-naiven PBL ( ) dargestellt.

Abb. 3.28: HBeAg-Kinetik na h in vitro HBV-Infektion der primären huma-nen Hepatozyten und Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL (bis Tag 14) und na h Entfernen der PBL (ab Tag14)Bis Tag 14 errei hte die HBeAg-Produktion in der Kultur ohne PBL eine Konzentrationvon 7,3 S/CO, während in der PHH/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur 1,0 S/CO und in derPHH/HBV-naiven-PBL-Kultur 2,1 S/CO gemessen wurden. Na h Entfernen der PBL anTag 14 stieg sowohl in der PHH/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur als au h in der PHH/HBV-naiven-PBL-Kultur die HBeAg-Konzentration bereits na h 48 Stunden an. Im weiteren Ver-lauf folgte eine Zunahme der HBeAg-Produktion, die si h an Antigen-Konzentrationen derKontrollkultur annäherte (HBeAg an Tag 23: PHH ohne PBL: 12,2 S/CO; PHH mit HBV-spezi�s hen PBL: 7,2 S/CO; PHH mit HBV-naiven PBL: 8,9 S/CO).Die Messung der HBeAg-Kinetik als Marker für die Virusreplikation zeigt somit, dass derantivirale E�ekt von HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL auf die in vitro Primärinfektionder Hepatozyten reversibel ist.

3 Ergebnisse 82Zusammenfassung:Beein�ussung der Virusreplikation HBV-in�zierter primärer humaner Hepatozytendur h HBV-spezi�s he und HBV-naive Immunzellen� Dur h HBV-spezi�s he PBL erfolgte eine signi�kante Reduktion der HBeAg-Produktion(78 bis 100 %).� Die Reduktion der HBeAg-Produktion korrelierte mit der Zahl IFN-γ-sezernierenderZellen der jeweiligen PBL-Spender.� Der supprimierende E�ekt der HBV-spezi�s hen PBL war reversibel.Obwohl HBV-naive PBL im Elispot na h Stimulation mit rekombinantem HBsAg (Impfsto�-Antigen) � im Gegensatz zu HBV-spezi�s hen PBL � keine Reaktivität zeigen, vermittelnsie im Kulturmodell der primären humanen Hepatozyten eine inhibitoris he Wirkung auf dieHBV-Infektion (27 bis 82 %). Au h die inhibitoris he Wirkung der HBV-naiven PBL warreversibel.Allerdings reduzierten HBV-naive PBL die HBeAg-Produktion signi�kant weniger als HBV-spezi�s he PBL (Median 58,5 % versus 90,0 %).Der inhibierende E�ekt der HBV-naiven PBL dürfte Ausdru k der angeborenen Immunitätsein. Die Kokulturversu he wurden mit der Gesamtheit der PBL-Zellpopulation dur hge-führt, die au h Komponenten und Zellen der angeborenen Immunität wie Monozyten, Ma-krophagen, Dendriten oder Natürli he Killer-Zellen beinhaltet. Zudem sezernieren die in�-zierten Hepatozyten neben HBsAg au h HBeAg sowie virale DNA. Anders als im klassis henElispot erfolgt daher in diesem Modell eine Stimulation der Immunzellen ni ht auss hlieÿli hdur h HBsAg.Aufbauend auf diesen grundlegenden Erkenntnissen über die antiviraleWirkung HBV-spezi�-s her und -naiver Immunzellen auf die Hepatitis-B-Virusinfektion wurden weitere Versu hs-reihen zur näheren Charakterisierung dieser E�ekte mit den humanen Hepatom-Zell-Liniendur hgeführt.

3 Ergebnisse 833.3.3 Wirkung HBV-spezi�s her und HBV-naiver Immunzellen aufdie Virusreplikation in HBV-in�zierten humanenHepatom-ZellenWeitere Untersu hungen der bes hriebenen antiviralen E�ekte der HBV-spezi�s hen undHBV-naiven PBL auf die Hepatitis-B-Virusinfektion wurden an humanen Hepatom-Zell-Linien dur hgeführt. Die humanen Zell-Linien HepG2.215 und HepG2.4A5 exprimieren kon-stitutiv HBsAg, HBeAg sowie virale DNA und dienen als Modell einer hronis hen HBV-Infektion. Aus der hohen Proliferationsrate dieser Zell-Linien ergibt si h allerdings die ex-perimentelle S hwierigkeit, dass die Untersu hung der antiviralen E�ekte nur über einen kur-zen Zeitraum (bis zu 48 Stunden) dur hgeführt werden kann. Aus den Kokultur-Experimentenmit den primären Hepatozyten ist jedo h bekannt, dass der antivirale E�ekt der PBL bereitsin der Frühphase einer Infektion die HBeAg-Produktion signi�kant beein�ussen kann unddieser inhibitoris he E�ekt in Langzeitversu hen dauerhaft anhielt. Des Weiteren war dieserinhibitoris he E�ekt auf die HBeAg-Produktion bereits innerhalb von 24 Stunden na h Be-ginn der Kokultur messbar. Somit sollten si h PBL-vermittelte E�ekte au h innerhalb vonZell-Passagen der Hepatom-Linien äuÿern, die � je na h Kulturgröÿe � meist na h 48 bis72 Stunden dur hgeführt werden.Wirkung HBV-spezi�s her und HBV-naiver Immunzellen auf die viraleTranskription und TranslationZunä hst sollte geklärt werden, in wie weit der dur h PBL vermittelte antivirale E�ektau h die Antigen-Produktion und Virusreplikation in den HBV-in�zierten Hepatom-Zellenbeein�usst. Hierfür wurden HepG2.215-Zellen in 6-well -Platten ausgesät, HBV-spezi�s hebzw. HBV-naive PBL in Zellsieben auf die Kulturen transferiert und 48 Stunden kokultiviert.Abbildung 3.29 zeigt die innerhalb von 48 Stunden produzierte Gesamtkonzentration derviralen Antigene HBeAg und HBsAg und der DNA sowie der HBV-RNAs in der HepG2.215/PBL-Kokultur.

3 Ergebnisse 84

Abb. 3.29: Produktion von HBeAg, HBsAg und viraler DNA (A) inHepG2.215-Zellen sowie zugehörige HBV-RNA-Konzentrationen(B) in Kokultur mit HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBLIm Gegensatz zur HBeAg-Konzentration (Abb. 3.29; A) der HepG2.215-Kultur ohne PBL(98 S/CO) wurde dur h HBV-spezi�s he PBL die HBeAg-Produktion auf 55 S/CO unddur h HBV-naive PBL auf 59 S/CO reduziert. Die HBsAg-Konzentration wurde von 52 S/Nin der Kontrollkultur auf 22 S/N (dur h HBV-spezi�s he PBL) bzw. 26 S/N (dur h HBV-naive PBL) vermindert. Die DNA-Synthese in den Kokulturen war im Verglei h zur Kon-trollkultur (4,1 × 106 Kopien/ml) dur h HBV-spezi�s he PBL auf 2,9 × 106 Kopien/ml unddur h HBV-naive PBL auf 3,3 × 106 Kopien/ml vermindert.Au h auf Transkriptionsebene wurde eine inhibitoris he Wirkung der PBL festgestellt (Abb.3.29; B). Ausgehend von 8,6 × 108 C-HBV RNA-Kopien/1,6 × 106 Zellen wurden in derHepG2.215/HBV-spezi�s hen-PBL-Kultur 5,3 × 108 C-HBV Kopien und in der HepG2.215/HBV-naiven-PBL-Kultur 6,5 × 108 C-HBV Kopien quanti�ziert. Für die S-HBV RNA wur-den in der Kontrollkultur 2,3 × 109 Kopien gemessen. In Kultur mit HBV-spezi�s hen PBLlagen 1,5 × 109 S-HBV Kopien vor und in Kultur mit HBV-naiven PBL wurden 1,7 × 109

3 Ergebnisse 85S-HBV Kopien gemessen.Analog zu den Ergebnissen der Kokulturversu he mit in vitro in�zierten primären Hepatozy-ten wurde au h imModell mit den humanen Hepatom-Zellen ein PBL-vermittelter antiviralerE�ekt erzielt (Tab. 3.6). Reduktion dur hHBV-spezi�s he PBL Reduktion dur hHBV-naive PBLHBeAg 44 % 40 %HBsAg 58 % 50 %HBV-DNA 30 % 20 %C-HBV-RNA 38 % 25 %S-HBV-RNA 35 % 26 %Tab. 3.6: Reduktion der Antigen-Produktion, der viralen DNA-Syntheseund der viralen Transkription in HepG2.215-Zellen dur h HBV-spezi�s he und -naive PBLIn Wiederholungsversu hen mit Immunzellen vers hiedener Spender zeigte si h, dass derinhibitoris he E�ekt der HBV-spezi�s hen und HBV-naiven PBL auf die Virusreplikationder Hepatom-Zellen s hwä her ausgeprägt ist als auf die der primären Hepatozyten. DesWeiteren war der Unters hied der Antigen-Reduktion dur h HBV-spezi�s he und HBV-naivePBL geringer als imModell der primären Hepatozyten. Denno h reduzierten HBV-spezi�s hePBL die Infektion der HepG2.215-Zellen deutli h stärker als HBV-naive PBL (Abb. 3.30).

Abb. 3.30: Reduktion der HBeAg-Produktion in HepG2.215-Zellen dur hHBV-spezi�s he (n=4; Median 60 Prozent) und HBV-naive PBL(n=4; Median 41 Prozent) vers hiedener Spender

3 Ergebnisse 86Zusammenfassung:Beein�ussung der Virusreplikation HBV-in�zierter humaner Hepatom-Zellen dur hHBV-spezi�s he und HBV-naive Immunzellen� Dur h sowohl HBV-spezi�s he als au h HBV-naive PBL erfolgte eine signi�kante Re-duktion der HBeAg-Produktion.� HBV-spezi�s he PBL reduzierten die HBeAg-Produktion der Hepatom-Zellen um 45bis 71 % (Median 60%).� HBV-naive PBL bewirkten eine Inhibition der HBeAg-Produktion um 38 bis 64 %(Median 41 %).� Der PBL-vermittelte antivirale E�ekt war au h auf Transkriptionsebene messbar.Somit konnte gezeigt werden, dass HBV-spezi�s he PBL � ebenso wie HBV-naive PBL �inhibitoris h sowohl auf die akute HBV-Infektion der primären Hepatozyten als au h auf die hronis he Infektion der Hepatom-Zellen wirken. Die infektionssupprimierende Wirkung derspezi�s hen PBL, die u. a. au h imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen beinhalten,war deutli h stärker als die der naiven Immunzellen.

3 Ergebnisse 873.3.4 Charakterisierung der die Virusreplikation hemmendenE�ektorzellenDie Immunzellen zeigten in Kokulturversu hen antivirale Wirkung und führten zu einere�ektiven Suppression der viralen Aktivität. Aufgrund des fehlenden Zell-Zell-Kontakteszwis hen Ziel- (Hepatozyten) und E�ektorzellen (PBL) konnten für diesen supprimierendenE�ekt nur lösli he Faktoren (Zytokine) verantwortli h sein. HBV-spezi�s he Immunzellensezernieren na h in vitro Stimulation mit rekombinantem HBsAg (Impfsto�-Antigen) die TH-Typ1-Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α (s. Abb. 3.22). Die HBV-naiven PBL ungeimpfterSpender zeigten na h in vitro Stimulation mit rekombinantem HBsAg � wie erwartet � keineReaktivität. Im Elispot wurden jedo h auss hlieÿli h imp�nduzierte, HBsAg-spezi�s he T-Zell-Antworten untersu ht. Im Gegensatz dazu erfolgte die Stimulation der PBL in denKokulturen au h dur h andere virale Antigene sowie dur h die neu gebildeten infektiösenVirionen.Da sowohl die Kokultur mit PBL HBV-geimpfter als au h HBV-naiver Spender eine Inhi-bition der viralen Aktivität zur Folge hatte, lag die Vermutung nahe, dass die antiviraleZytokinantwort ni ht auss hlieÿli h HBsAg-vermittelt ist. Es ist denkbar, dass Komponen-ten bzw. Zellen der angeborenen Immunität für die antivirale Wirkung der HBV-naiven PBLverantwortli h sind.Zunä hst wurde untersu ht, wel he Zytokine na h Stimulation der PBL in der Kokulturdur h Zellen HBV-geimpfter bzw. HBV-naiver Spender sezerniert werden.Zytokinpro�l der antiviral wirkenden E�ektorzellenDer quantitative Na hweis Zytokin-sezernierender Zellen erfolgte im Elispot dur h Detektionder Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10, IL-2, sowie IFN-γ und TNF-α. Hierfür wurden PBL vondrei HBV-geimpften bzw. HBV-ungeimpften Spendern 24 Stunden mit HepG2.215-Zellenbzw. HepG2.4A5-Zellen kokultiviert und die Zytokinproduktion ans hlieÿend im Elispot be-stimmt. Aus Abbildung 3.31 geht hervor, dass die Kokultur von virusin�zierten Hepatozytenund PBL sowohl bei HBV-geimpften als au h bei HBV-ungeimpften Spendern die Auss hüt-tung der Zytokine IL-10, IL-2, IFN-γ und TNF-α induziert.

3 Ergebnisse 88

Abb. 3.31: Zytokinpro�l und Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen derHBV-spezi�s hen PBL dreier geimpfter und der HBV-naiven PBLdreier ungeimpfter Spender na h Kokultivierung mit HepG2.215-Zellen (A) und HepG2.4A5-Zellen (B)Neben den TH-Typ1-Zytokinen IFN-γ und TNF-α, für die in dieser Arbeit eine hemmen-de Wirkung auf die Antigenexpression und die Virusreplikation HBV-in�zierter humanerHepatozyten gezeigt wurde (s. Abs hnitt 3.2), produzierten die PBL au h IL-10 und IL-2.Die PBL HBV-geimpfter Spender zeigten na h Kokultur mit virusproduzierenden Hepatozy-ten das glei he Zytokinmuster wie na h Stimulation mit rekombinantem HBsAg. Zusätzli hsezernierten sie IL-10. Obwohl das Impfsto�-Antigen (HBsAg) im klassis hen Elispot keineReaktivität HBV-naiver PBL auslöste, sezernierten diese na h Kokultur mit den viruspro-duzierenden Zellen IL-10, IL-2, IFN-γ und TNF-α.

3 Ergebnisse 89Selektive Stimulation der E�ektorzellen dur h virale ProdukteMithilfe der unters hiedli hen humanen Hepatom-Zell-Linien konnte im weiteren Verlaufselektiv untersu ht werden, wel he viralen Faktoren in diesem Kultursystem für die Stimula-tion der Immunzellen verantwortli h sind und wel he Reaktivität das in vitro synthetisierteHBsAg bei den Immunzellen auslöst. Zur antigenspezi�s hen Stimulation der Immunzellendienten in diesen Versu hsreihen die auss hlieÿli h HBsAg-exprimierenden Linien HepG3 undPLK/PRF. Die HBsAg-Produktion der HepG3-Zellen ist mit der der HepG2.215-Zellen ver-glei hbar, während die HBsAg-Produktion der PLK/PRF-Zellen ähnli he Konzentrationenliefert wie die der HepG2.4A5-Zellen. Zur Klärung der Frage, wel he Reaktivität der Immun-zellen das in der Kultur gebildete HBsAg auslöst, wurden PBL eines geimpften und eines un-geimpften Spenders mit HepG3-Zellen im Verglei h zu HepG2.215-Zellen kokultiviert. Eben-so wurden die PBL dieser Spender mit PLK/PRF-Zellen im Verglei h zu HepG2.4A5-Zellenkultiviert. Na h 24-stündiger Kokultivierung mit den Hepatom-Zellen im Trans-well -Systemwurden die PBL direkt im Elispot getestet.Die Abbildung 3.32 zeigt die Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen und das Zytokinmusterder PBL eines geimpften bzw. eines ungeimpften Spenders na h der Kokultur. Zellen beiderSpender sezernierten na h Stimulation in der Kokultur die Zytokine IL-10, IL-2, IFN-γ undTNF-α. Jedo h gab es deutli he Unters hiede hinsi htli h der Zahl reaktiver Zellen.Sowohl die PBL des geimpften als au h des ungeimpften Spenders zeigten na h Kokul-tivierung mit den HepG2.215-Zellen bzw. HepG2.4A5-Zellen eine signi�kant stärkere Zy-tokinsekretion als na h Kokultivierung mit HepG3-Zellen bzw. PLK/PRF-Zellen. Darausresultierend wurden dur h Stimulation mit HBsAg als einzig viralem Faktor weniger Zellenzur Zytokinproduktion angeregt als dur h Stimulation mit den im Überstand enthaltenenlösli hen (HBsAg, HBeAg) und partikulären viralen Produkten.

3 Ergebnisse 90

Abb. 3.32: Zahl der Zytokin-sezernierenden Zellen HBV-spezi�s her PBL ei-nes geimpften und HBV-naiver PBL eines ungeimpften Spen-ders na h Kokultivierung mit HepG2.215-Zellen und auss hlieÿli hHBsAg-exprimierenden HepG3-Zellen (A) bzw. HepG2.4A5-Zellenund PLK/PRF-Zellen (B)Der Abbildung ist zu entnehmen, dass die Stimulation mit der Gesamtheit der viralen Pro-dukte (HBeAg, HBsAg und Virionen) mehr Zellen zur Zytokinsekretion induzierte als dieStimulation mit HBsAg. Somit liefert dieses Ergebnis Hinweise, dass die Reaktion der Im-munzellen in diesem Kulturmodell ni ht auss hlieÿli h dur h HBsAg ausgelöst wird.Zudem löste au h das in Kultur gebildete HBsAg eine reaktive Antwort der HBV-naivenPBL aus, die na h Stimulation mit dem Impfsto�-Antigen (HBsAg) im klassis hen Elispotkeine Reaktivität zeigen.

3 Ergebnisse 91Zusammenfassung:Kokulturbedingte Induktion der E�ektorzellen zur Zytokinsekretion� Na h Kokultur mit den virusin�zierten HepG2.215- und HepG2.4A5-Zellen sezernier-ten sowohl HBV-spezi�s he als au h HBV-naive PBL die TH-Typ1-Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α sowie IL-10.� Dieses Zytokinpro�l zeigten die Immunzellen au h na h Kokultur mit den auss hlieÿli hHBsAg-exprimierenden HepG3- und PLK/PRF-Zellen.� Die Kokultur mit HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen induzierte jedo h deutli hmehr Zytokin-sezernierende Zellen als die Kokultur mit den auss hlieÿli h HBsAg-exprimierenden Hepatom-Zellen.Eine e�ektive Zytokinsekretion und Reaktivität der Immunzellen erfolgte in diesem Kultur-modell somit na h Stimulation mit der Gesamtheit der lösli hen viralen Antigene sowie derViruspartikel.

3 Ergebnisse 923.3.5 Zusammenfassende Darstellung antiviraler E�ekteHBV-spezi�s her und HBV-naiver ImmunzellenAnhand zweier unters hiedli her humaner Modellsysteme wurden die E�ekte der imp�n-duzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen auf die Hepatitis-B-Virusinfektion untersu ht.Dur h vers hiedene Kokulturexperimente, bei denen die Hepatozyten und die Immunzellendur h ein Zellsieb voneinander getrennt waren, wurden folgende Ergebnisse gewonnen:� Sowohl dur h HBV-spezi�s he als au h dur h HBV-naive PBL erfolgte eine signi�kanteReduktion der viralen Transkription, der Antigen-Produktion sowie der DNA-Synthese.� Allerdings reduzierten HBV-naive PBL die Virusreplikation statistis h signi�kant we-niger als HBV-spezi�s he PBL.� Dabei war die Inhibition der Virusreplikation dur h die Immunzellen reversibel.� Sowohl die Primärinfektion der Hepatozyten als au h die Infektion und konstitutiveVirusexpression der Hepatom-Zellen wurde dur h die Immunzellen negativ beein�usst.� Die Stimulation der HBV-spezi�s hen und HBV-naiven Immunzellen dur h die in Kul-tur gebildeten viralen Produkte induzierte die Sekretion von IL-10, IL-2, IFN-γ undTNF-α.� Aufgrund des fehlenden Zell-Zell-Kontaktes zwis hen Hepatozyten und E�ektorzellenwurde die Inhibition der Hepatitis-B-Virusinfektion dur h die HBV-spezi�s hen undHBV-naiven Immunzellen somit hö hstwahrs heinli h über die Sekretion antiviral wir-kender Zytokine vermittelt.Der antivirale E�ekt HBV-spezi�s her PBL auf die Hepatitis-B-Virusinfektion wurde of-fenbar in Kombination sowohl der adaptiven Immunantwort dur h imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen als au h dur h Komponenten bzw. Zellen der angeborenen Immu-nität induziert. Die antivirale Wirkung HBV-naiver PBL auf die Hepatitis-B-Virusinfektions heint Ausdru k der angeborenen Immunität zu sein, die letztli h ebenfalls dur h die TH-Typ1-Zytokine die Inhibition der HBV-Infektion bewirkt haben könnte.

4 Diskussion 934 DiskussionIn der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der imp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen bei der Hepatitis-B-Virus-Infektion untersu ht. Die anhand humaner Infektionsmo-delle gewonnenen Daten zeigen, dass imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen dieVirusreplikation, die Antigen-Produktion und die virale Transkription HBV-in�zierter Zel-len signi�kant und reversibel reduzieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass au h dieImmunzellen ungeimpfter Spender ähnli h inhibitoris h auf die Virusreplikation, die Antigen-Produktion und die virale Transkription wirkten.In der folgenden Diskussion werden zunä hst die verwendeten Kulturmodelle und die HBV-Infektion der primären humanen Hepatozyten sowie der Hepatom-Zellen erörtert. Im An-s hluss folgt eine Darstellung der Untersu hung der MHC-Expression dur h die Hepatozy-tenkulturen, die als Voraussetzung für Interaktionen von CD4+T-Zellen und virusin�ziertenHepatozyten zu sehen ist. Dem folgend werden die Versu he und Ergebnisse zur antiviralenWirkung der TH-Typ1-Zytokine IFN-γ und TNF-α auf die Virusreplikation erörtert. Einlei-tend zur Diskussion der Interaktionen von CD4+T-Zellen mit virusin�zierten Hepatozytenwerden zunä hst die T-Zellreaktivität der PBL-Spender sowie die Etablierung des Kokultur-modells dargestellt. Abs hlieÿend folgt die Darstellung und Interpretation der vers hiedenenExperimente sowie der gewonnenen Daten zur Untersu hung der Rolle der imp�nduziertenHBsAg-spezi�s hen CD4+T-Zellen bei der Hepatitis-B-Virus-Infektion.

4 Diskussion 944.1 Humane Infektionsmodelle für das Hepatitis-B-VirusPrimäre humane HepatozytenDiese Arbeit befasste si h mit der Beein�ussung der Hepatitis-B-Virus-Infektion humanerHepatozyten dur h imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen. Primäre humane He-patozyten stellen aufgrund der Speziesspezi�tät und des Hepatotropismus des HBV ein ad-äquates Modellsystem zur Untersu hung der HBV-Infektion dar. Denn obwohl z. B. das du khepatitis B virus (DHBV) oder das wood hu k hepatitis virus (WHV) wi htige Erkenntnissezum Replikationszyklus des HBV lieferten, weisen die tieris hen Vertreter der Hepadnaviridaeeinige signi�kante Unters hiede zum humanpathogenen HBV auf. So beri hteten Sprengel etal., dass das Genom der Avihepadnaviren kein HBx-Protein kodiert, während Di et al. grund-legende Unters hiede in der viralen Transkription zwis hen dem WHV und dem humanenVirus beoba hteten (Sprengel et al., 1985; Di et al., 1997).Die Aussaat der isolierten Hepatozyten erfolgte auf einer Kollagen-I-Matrix, da Kollagen so-wohl eine glei hmäÿige Adhärenz als au h die Di�erenzierung der Zellen fördert. Da primäreHepatozyten in vitro ni ht proliferieren, ist bei Kulturbeginn zudem die Konzentration derausgesäten Zellen von ents heidender Bedeutung. Wie von S hulze-Bergkamen et al. gezeigtwurde, führte die Aussaat sowohl einer zu niedrigen als au h zu hohen Hepatozytenkon-zentration na h der Adhärenz zu einer ras hen Ablösung der Zellen. Für eine funktionelleKultur ist der Zell-Zell-Kontakt der Hepatozyten ents heidend (S hulze-Bergkamen et al.,2003). Um eine kon�uente Kultur zu erhalten, wurden die Hepatozyten in dieser Arbeit ineiner Konzentration von 1,6 × 105 Zellen pro m2 ausgegeben. Die Zellen einer kon�uentenHepatozytenkultur weisen � mikroskopis h betra htet � einen höheren Di�erenzierungsgradsowie eine verminderte Dedi�erenzierung im Laufe der Kultur auf. Ebenfalls ents heidendfür eine funktionelle Hepatozytenkultivierung und Di�erenzierung der Zellen ist das Vorhan-densein ni htparen hymaler Zellen. Wie von Bhatia et al. bes hrieben, bewahren isolierteund kultivierte Hepatozyten in Anwesenheit ni htparen hymatöser Zellen ihre stereotypi-s he polyklonale Morphologie, strukturstarke Zell-Zell-Grenzen sowie leberspezi�s he Funk-tionen für bis zu fünf Wo hen (Bhatia et al., 1999). Im Vorfeld dieser Arbeit wurde anhanddur h�usszytometris her Tests bestimmt, dass in den hier zur Verfügung stehenden Hepa-tozytenkulturen ein Anteil an ni htparen hymalen Zellen von bis zu 15 % vorliegt. Damitübereinstimmend fanden au h S hulze-Bergkamen et al. in isolierten Hepatozytenpräparatio-nen bis zu 15 % ni htparen hymatöse Zellen (S hulze-Bergkamen et al., 2003). Au h wennmit zusätzli hen Gradienten-Zentrifugationen ein höherer Reinheitsgrad der Hepatozytenvon bis zu 99 % errei ht werden kann (S hroeder et al., 1994), entspri ht das Vorhandenseinni htparen hymaler Zellen dem physiologis hen Gewebeverband und fördert über mögli henzellulären Austaus h au h intrazellulären Metabolismus.Na h Bildung eines kon�uenten Hepatozytenrasens sind die Kulturbedingungen für den Er-halt der funktionellen und morphologis hen Stabilität der Zellen ents heidend. Neben Wa hs-

4 Diskussion 95tumsfaktoren wie Insulin und Glukagon ist das Agens Dimethylsulfoxid für eine Langzeitkul-tivierung der Hepatozyten von Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Hepatozytenab dem zweiten Tag na h Inkulturnahme mit 1 % Dimethylsulfoxid im Medium kultiviert,da Dimethylsulfoxid neben einer Induktion und Erhaltung der Di�erenzierung der primärenZellen au h die E�zienz einer in vitro Infektion mit Hepatitis-B-Virus fördert (Gripon etal., 1988).Die ges hilderten Bedingungen erlaubten die Aufre hterhaltung der morphologis hen undfunktionellen Integrität der Hepatozyten. In Abhängigkeit des Spendermaterials konnte da-her eine erfolgrei he Kultivierung der humanen Hepatozyten für die Dauer von bis zu vierWo hen errei ht werden.Die in vitro HBV-Infektion primärer humaner HepatozytenDie in vitro Infektion der primären humanen Hepatozyten erfolgt dur h Inkubation der Le-berzellen mit einer von hronis hen Hepatitis-B-Virus-Trägern gewonnenen Serumprobe, inder eine ausrei hend hohe Menge an infektiösen Viruspartikeln enthalten ist. Um dabei dieE�zienz der in vitro Infektionen zu steigern, wurde dem viralen Inokulum 5 % Polyethy-lenglykol zugegeben, das aufgrund seiner fusogenen Eigens haften sowohl die Adsorption alsau h die Penetration der Viruspartikel erhöht (Gripon et al., 1993). Die Infektionse�zienzund aktive Virusreplikation wurden mittels etablierter quantitativer Messsysteme für dieviralen Proteine HBsAg und HBeAg sowie für die virale DNA na hgewiesen.Eine erfolgrei he in vitro Infektion der Hepatozyten mit dem Hepatitis-B-Virus ist gekenn-zei hnet dur h eine de novo Synthese und Freisetzung von Virionen und der viralen Antigenein den Zellkulturüberstand. Dabei zeigt die Kinetik der Syntheserate der drei viralen Produk-te einen unters hiedli hen Verlauf. HBeAg ist im Serum in signi�kant geringerer Konzentra-tion enthalten als HBsAg und virale DNA. Daher wird das mit dem Inokulum eingebra hteHBeAg dur h die initialen Was hs hritte ras her entfernt als HBsAg oder die Virus-DNA.Entgegen dem HBeAg, dessen Neuproduktion ungefähr ab dem dritten Tag na h Infektionder Hepatozyten na hweisbar wird, ist eine Neusynthese der viralen DNA sowie des HBsAgzeitli h verzögert messbar. Wie u. a. au h von Rijntjes et al. bes hrieben, lassen si h dievirale DNA und HBsAg, das im viralen Inokulum zusätzli h in Form der subviralen Partikelim Übers huss vorliegt, trotz mehrfa her intensiver Was hs hritte na h Abnahme des Inoku-lums ni ht vollständig entfernen (Rijntjes et al., 1988). Es ist denkbar, dass ein Teil der imInokulum enthaltenen Virionen und Hüllproteine an die Wände der Kulturs hale adsorbiertoder � jedo h ohne zu penetrieren � au h an die Hepatozyten, um si h ans hlieÿend na hund na h zu lösen und dadur h tägli h mit dem Überstand abgenommen zu werden. Wiein der Literatur bes hrieben, treten Maximalkonzentrationen der viralen Antigene ungefährab dem neunten Tag na h Infektion auf, wona h si h eine glei h bleibende Syntheserate derviralen Produkte einstellt (Galle et al., 1994). In der vorliegenden Arbeit wird die HBeAg-Produktion als Marker für die Virusreplikation verwendet. HBeAg wird als frühes Antigen

4 Diskussion 96gebildet und erlaubt somit, eine Beein�ussung der Infektion über einen längeren Zeitraumzu verfolgen.Neben der Untersu hung der Hepatitis-B-Virusinfektion auf Proteinebene sollte in dieserArbeit der Infektionsverlauf au h auf Transkriptionsebene verfolgt werden. Um die SyntheseHBV-spezi�s her RNAs zu analysieren, wurden real-time PCR-Systeme für den Na hweis der3,5-kb RNA sowie der 2,4-kb RNA etabliert. Die Synthese der 3,5-kb langen prägenomis henRNA ist ein ents heidendes Ereignis während des viralen Replikationszyklus, da dieses RNA-Transkript für die virale Polymerase und das Kapsidprotein sowie für das HBeAg kodiert. Die2,4-kb RNA dient als Matrize für die Translation der groÿen Hüllproteine, die Bestandteil vonVirionen und subviralen Partikeln sind (Moolla et al., 2002). Anhand erstellter Ei hreihenwurden die innerhalb von 24 Stunden im Verlauf der Infektion gebildeten Transkripte der3,5-kb RNA sowie der 2,4-kb RNA quantitativ bestimmt. Reproduzierbar wurde bereits24 Stunden na h Infektionsbeginn die Synthese sowohl der 3,5-kb RNA als au h der 2,4-kbRNA na hgewiesen. Gripon et al. hingegen konnten mittels Northern-Blot unmittelbar na hder Infektion zunä hst eine nur geringe RNA-Synthese mit alleinigem Na hweis der 2,4-kbRNA detektieren, gefolgt von einem starken Anstieg der Synthese der 2,4-kb und der 3,5-kbRNA bis Tag 5 na h Infektion (Gripon et al., 1988). In allen hier dur hgeführten Messungenwurde für die 2,4-kb S-HBV RNA eine deutli h höhere Konzentration verzei hnet als fürdie C-HBV RNA. Theoretis h erklärbar wäre die Dominanz der 2,4-kb RNA aufgrund der� in vivo � im Übers huss gebildeten Hüllproteine. Die virale Transkription konnte in dervorliegenden Arbeit 48 Stunden vor einem Anstieg der HBeAg-Produktion na hgewiesenwerden. Somit erlaubt der sensitive und quantitative Na hweis der viralen RNA-Syntheseeinen Einbli k in die Initiations- und Frühphase der Infektion.In Versu hen zur Standardisierung der in vitro Infektion für diese Arbeit wurde ein de�nier-ter Zeitrahmen für den Beginn der Infektion festgelegt. Obwohl je na h Ausgangsmaterial dieVitalität und morphologis he Di�erenzierung humaner Hepatozyten variiert, wurde u. a. vonMiyazaki et al. festgestellt, dass erst ab dem dritten Tag na h der Isolierung der Zellen eineaktive Synthese und Sekretion leberspezi�s her Proteine (wie Albumin) erfolgt (Miyazakiet al., 1981). Na h Katsura et al. steigt die Albuminsynthese bis etwa zum vierzehnten Tagna h der Isolierung an und nimmt in der Folge wieder stark ab (Katsura et al., 2002). Da inden Infektionsversu hen ein mindestens 14-tägiger Verlauf untersu ht werden sollte, war einfrüher Start der Infektionsexperimente � vor Einsetzen der zellulären Dedi�erenzierungspro-zesse � notwendig. Anders als von Rijntjes et al. bes hrieben, führten in der vorliegendenArbeit in vitro Infektionen an vers hiedenen Zeitpunkten na h der Aussaat der Hepatozy-ten zu unters hiedli hem Erfolg der jeweiligen Infektion (Rijntjes et al., 1988). Die hö hsteInfektionse�zienz lieÿ si h mit beginnender Infektion an Tag se hs na h Inkulturnahme derZellen errei hen, während ein zu früh gewählter Zeitpunkt in einer deutli h s hwä herenHBeAg-Produktion resultierte. Somit s heint unter den gewählten Infektionsbedingungeneine erfolgrei he in vitro Infektion der humanen Hepatozyten nur na h Di�erenzierung derZellen und Aufnahme der leberspezi�s hen Funktionen mögli h zu sein.

4 Diskussion 97In Versu hsreihen mit humanem Zellmaterial, das natürli herweise vielen S hwankungen un-terworfen ist, kann die biologis he Variabilität die Ergebnisse beein�ussen. Jedo h sollte dieDur hführung von Experimenten innerhalb einer Zellpräparation verglei hbare Ergebnisseliefern. Die Überprüfung der intraexperimentellen Variabilität der Virusreplikation und derAntigen-Synthese mehrerer Parallelansätze zeigte, dass sowohl die virale DNA, als au h dieviralen Proteine HBsAg und HBeAg im Verlauf der Infektion annähernd identis he Konzen-trationen aufwiesen. Diese Versu hsreihen bestätigen, dass innerhalb einer ZellpräparationInfektionsversu he mit unters hiedli hen Fragestellungen dur hgeführt werden können. Daim Rahmen dieser Arbeit we hselnde Hepatozytenpräparationen vers hiedener Spender zurVerfügung standen, konnte au h die interexperimentelle Reproduzierbarkeit untersu ht wer-den. Deren Analyse bestätigte die Beoba htungen von Gripon et al., die in Infektionsexpe-rimenten mit Hepatozyten von 39 vers hiedenen Zellspendern deutli he Unters hiede in derInfektionse�zienz fanden (Gripon et al., 1988). In der vorliegenden Arbeit konnte am Beispielvon 18 Hepatozytenpräparationen vers hiedener Leberzellspender gezeigt werden, dass trotzidentis her Versu hsbedingungen die in vitro Infektion � mit derselben HBV-haltigen Serum-probe sowie identis her Konzentration an viraler DNA � zu extremen Unters hieden in derHBeAg-Produktion führte. Diese unters hiedli he Infektiösität der Viruspartikel derselbenSerumprobe, die von einer sehr starken HBeAg-Produktion bis hin zu keiner na hweisbarenHBeAg-Produktion führte, kann vers hiedene Ursa hen haben. Generell bestimmen sowohlvirale Determinanten als au h die Kulturbedingungen und wirtsspezi�s he Faktoren die In-fektion. Das infektiöse Serum enthält neben den viralen Antigenen und Virionen no h eineVielzahl weiterer Faktoren, die theoretis h mit Plasmamembrankomponenten der Hepato-zyten einiger Spender interagieren und so die Anlagerung der Viruspartikel stören könnten(Gripon et al., 1988). Daneben liegen in HBV-haltigem Serum hohe Konzentrationen dersubviralen Partikel vor, die ebenfalls um die Rezeptorbindestellen für die Viruspartikel kon-kurrieren (Ko k et al., 2001). Trotz Verwendung von Polyethylenglykol, das erwiesenermaÿendie Adsorption und Penetration des Virus fördert, s heint die Viruspenetration in die Ziel-zellen unters hiedli h e�ektiv zu sein. Auf Seite des Wirts s heint die Empfängli hkeit derHepatozyten vers hiedener Individuen für die in vitro HBV-Infektion unters hiedli h zu sein.Dies kann genetis h bedingt sein und in Assoziation mit den Polymorphismen der Haupthi-stokompatibilitätskomplexe stehen, die in vivo den Verlauf einer HBV-Infektion ents hei-dend beein�ussen (Thursz, 2001). Bekanntli h ist jedo h die Qualität humanen MaterialsS hwankungen unterworfen. Die Variabilität bedingt si h dur h Alter, Ges hle ht und ge-netis he Unters hiede der Leberzellspender, Grunderkrankung und Vortherapie sowie prä-und intraoperative S hädigung der Leberzellen. Au h die Vitalität sowie die morphologi-s he und funktionelle Di�erenzierung der Zellen können die Infektion na hteilig beein�ussen.Na h Mitry et al. stehen Zellausbeute, Vitalität sowie Qualität der isolierten Zellen in Ab-hängigkeit der Zells hädigungen, die während dem Isolationsprozess eintreten können. DieZells hädigungen sind bedingt dur h die Dauer der Is hämie, Zusammensetzung der Per-fusionsreagenzien sowie dur h die Kollagenasebehandlung zum Gewebeverdau (Mitry et al.,

4 Diskussion 982002). Au h morphologis h ni ht erkennbare E�ekte des Isolationsprozesses könnten na htei-lige Wirkungen auf die intrazelluläre, funktionelle Aktivität der Hepatozyten haben (Elaut etal., 2006). Zudem wäre au h eine S hädigung der hepatozellulären Ober�ä henproteine bzw.unzurei hende Regeneration der zellulären Bindestellen für die Viruspartikel na h dem Isola-tionsprozess mögli h. Der Verglei h der Infektionsergebnisse von Hepatozytenpräparationenunters hiedli her Spender erfolgte anhand der jeweils maximal gemessenen Konzentrationder HBeAg-Produktion.Die Charakterisierung der Hepatitis-B-Virusreplikation zeigt, dass das humane in vitro In-fektionsmodell unter Wahl entspre hender und optimierter Versu hsbedingungen für eine zu-verlässige und reproduzierbare Untersu hung der HBV-Infektion geeignet ist. Dieses Modell-system erlaubt entspre hend der Speziesspezi�tät des Hepatitis-B-Virus und der Verwendungnativer Virionen für die in vitro Infektion Untersu hungen nahe den in vivo Verhältnissenvon Virus und Wirt.Die Virusreplikation HBV-in�zierter humaner Hepatom-ZellenNeben der Primärinfektion humaner Hepatozyten diente in der vorliegenden Arbeit au hdie Infektion humaner Hepatom-Zell-Linien als Modell zur Untersu hung der Rolle imp�n-duzierter HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen bei der HBV-Infektion. Vers hiedene konstitu-tiv virusexprimierende Zell-Linien wurden dur h Transfektion von Hepatitis-B-Virus-DNAin humane Hepatozyten entwi kelt. In dieser Arbeit wurde die von Sells et al. etablierteund konstitutiv virusexprimierende Linie HepG2.215 sowie die von Weiss et al. etablierteHepatom-Linie HepG2.4A5 verwendet (Sells et al., 1987; Weiss et al., 1996).Die Analyse der viralen Aktivität der HBV-in�zierten Hepatozyten erfolgte anhand der imRahmen dieser Arbeit etablierten RNA-Na hweissysteme sowie der Messung der Antigeneund der viralen DNA. Die Bestimmung der 3,5-kb sowie der 2,4-kb viralen RNA zeigte hoheKonzentrationen der beiden RNA-Spezies. Wie in den in vitro in�zierten primären humanenHepatozyten wurde im Verglei h zur C-HBV RNA die 2,4-kb S-HBV RNA in deutli h höhererKonzentration gebildet. Sowohl die HepG2.215-Zellen als au h die HepG2.4A5-Zellen produ-zieren neben viraler DNA au h HBsAg und HBeAg. Dabei zeigte si h, dass in HepG2.215-Zellen die HBeAg-Produktion die HBsAg-Produktion übersteigen kann. Diese Beoba htungsteht in Übereinstimmung mit der Literatur (Sells et al., 1988; Liu et al., 2004) und na h Gle-be et al. s heinen für diese variable E�zienz der Antigen-Produktion die Kulturbedingungenents heidend zu sein (Glebe et al., 2001). Generell ist die Syntheserate der viralen Proteinesowie der DNA der HepG2.4A5-Zellen um ein Vielfa hes geringer als bei HepG2.215-Zellen.Dies beruht na h Weiss et al. auf der Tatsa he, dass in HepG2.4A5-Zellen das virale Genomin einzelner Ausführung sowie unter Kontrolle eines HBV-eigenen Promotors vorliegt, wäh-rend HepG2.215-Zellen ein dimeres HBV-Genom unter Kontrolle heterologer Promotorenbesitzen (Weiss et al., 1996).

4 Diskussion 99Der Verglei h der Infektion und der Virusreplikation der HepG2.215-Zellen mit der in vi-tro Infektion der primären Hepatozyten zeigt, dass die virale Transkription, die Antigen-Expression und die DNA-Synthese in beiden Infektionsmodellen ähnli he Konzentrationender viralen Produkte liefert. Na h in vitro Infektion primärer Hepatozyten sind jedo h nur a. 10 % der Zellen in�ziert (Taus h, 2005). Im Gegensatz dazu sollte in der Hepatom-Kultur jede Zelle mit dem Virus in�ziert sein. Aufgrund dieser Tatsa he würde man in denHepatom-Zellen eine höhere virale Aktivität als in in vitro in�zierten primären Hepatozy-ten erwarten. Die primären Hepatozyten stammen von gesundem Lebergewebe und sind alsnaive Zellen anzusehen, während die Hepatom-Zellen aus einer Tumor-Linie entwi kelt wur-den. Tumorbedingte Veränderungen des Zellsto�we hsels und eine starke Dedi�erenzierungder Hepatom-Zellen könnten si h na hteilig auf die virale Aktivität auswirken. So sind dieseZellen z. B. mit nativem Virus ni ht mehr in�zierbar (Sells et al., 1988).Inwieweit die von heterologen Promotoren regulierte Virusreplikation der HepG2.215-Zellenrepräsentativ für den viralen Lebenszyklus bei einer natürli hen in vivo Infektion ist, wirdin der Literatur kontrovers diskutiert (Sells et al., 1988; Weiss et al., 1996). Denno h wirddie Zell-Linie HepG2.215 neben der HepG2.4A5-Linie zur Untersu hung von z. B. antiviral-wirkenden Substanzen verwendet. In der vorliegenden Arbeit dienten beide Hepatom-Linienaufgrund ihrer konstitutiven Virusexpression als Modellsystem zur Untersu hung der Virus-replikation einer hronis hen Infektion.Expression der Haupthistokompatibilitätskomplexe dur h primäreHepatozytenkulturenIn der vorliegenden Arbeit sollten die E�ekte HBsAg-spezi�s her CD4+T-Zellen auf dieHBV-Infektion humaner Hepatozyten untersu ht werden. Voraussetzung einer funktionel-len Interaktion der CD4+T-Zellen mit in�zierten Hepatozyten ist jedo h die Aktivierungder T-Lymphozyten über Antigenpräsentation. Fran o et al. zeigten an einem murinenin vitro Modell, dass hepatis he ni htparen hymatöse Zellen für die AntigenpräsentationHBV-spezi�s her TH1-Lymphozyten verantwortli h sind (Fran o et al., 1997). Weitere Da-ten führten jedo h zu der Hypothese, dass Hepatozyten selbst als spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen fungieren und in der Folge CD8+- bzw. CD4+T-Zellen aktivieren kön-nen (Herkel et al., 2003). Zudem wurden in mehreren Untersu hungen in�ltrierende CD4+T-Lymphozyten in der Leber na hgewiesen (Bertoletti et al., 1997; Walewska-Ziele ka et al.,2008).Um festzustellen, ob in primären Hepatozytenkulturen eine Antigenpräsentation für CD4+-und CD8+T-Lymphozyten erfolgen kann, sollte in der vorliegenden Arbeit die MHC-Expres-sion untersu ht werden. Hierfür wurden real-time RT-PCR-Systeme für den Na hweis vonHLA-DRα, CD40 und CIITA sowie HLA-A, HLA-B, HLA-C und ÿ2M erstellt. Die Überprü-fung der MHC-Expression dur h die primären Hepatozyten zeigte, dass MHC-Klasse-I undMHC-Klasse-II sowohl in ni ht in�zierten als au h in HBV-in�zierten Kulturen exprimiert

4 Diskussion 100werden. Dies bestätigt Daten aus der Literatur, wona h eine MHC-Expression in adulten undfötalen Hepatozyten na hgewiesen wurde (Lobo-Yeo et al., 1990; Chiu et al., 1997; Chenet al., 2005a). Jedo h war in der vorliegenden Arbeit davon auszugehen, dass die MHC-Expression primär dur h die in der Kultur vorhandenen ni htparen hymalen Zellen erfolgte.Na h Daar et al. wird MHC-Klasse-I in Lebergewebe dur h Gallengangsepithelzellen, vas-kuläre Endothelzellen und die sinusoidalen Endothelzellen sowie Kup�er-Zellen exprimiert(Daar et al., 1984a). MHC-Klasse-II hingegen wird in der Leber primär dur h Kup�er-Zellenexprimiert (Daar et al., 1984b). Tatsä hli h ergaben dur h�usszytometris he Tests einenAnteil von bis zu 15 % ni htparen hymaler Zellen in den primären Hepatozytenkulturen.Analysen zeigten, dass si h darunter 1 bis 3 % Kup�er-Zellen und 2 bis 12 % lebersinusoida-le Endothelzellen be�nden (S hulze-Bergkamen et al., 2003). Konsens herrs ht jedo h überdie MHC-Expression dur h HBV-in�zierte Hepatozyten. Von vers hiedenen Arbeitsgruppenwurden HLA-Klasse-I- sowie -Klasse-II-Moleküle auf der Ober�ä he von Hepatozyten hro-nis her Virusträger detektiert (Barbatis et al., 1981; van den Oord et al., 1986; Fran o et al.,1988; Chiu et al., 1997). Allerdings führte die in vitro Infektion der primären Hepatozytenmit dem Hepatitis-B-Virus � anders als zum Teil in der Literatur bes hrieben � in den Zell-kulturen zu keiner Änderung der MHC-Expression. Andere Arbeiten hingegen beoba hteteneine dur h HBV signi�kant reduzierte MHC-Klasse-I-Expression bei HepG2.215-Zellen undprimären Hepatozyten eines HBV-transgenen Mausmodells (Chen et al., 2006). Dass diein vitro Infektion der primären humanen Hepatozyten keine signi�kanten Änderungen derMHC-Expression zur Folge hatte, könnte dadur h bedingt sein, dass nur a. 10 % der Zellenin diesem Modell tatsä hli h in�ziert sind.Die Expression von HLA-Klasse-I und HLA-Klasse-II in den Hepatozytenkulturen zeigt,dass eine HLA-restringierte Antigenpräsentation dur h in vitro in�zierte primäre Hepa-tozyten erfolgen kann. Zudem konnte in den primären humanen Hepatozytenkulturen ei-ne IFN-γ-induzierte Erhöhung der Expression von CIITA und HLA-DRα bewirkt werden.Die Steigerung der HLA-Klasse-II s heint dabei in Abhängigkeit der einwirkenden IFN-γ-Konzentration zu stehen. Promotorstudien zeigten, dass die Expression von CIITA dur hIFN-γ kontrolliert und reguliert wird. Zudem ist ein funktionelles CIITA-Gen für die In-duktion der Klasse-II-Expression notwendig (Steimle et al., 1994). Dies ist bedeutend, wennman bedenkt, dass imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Zellen in vivo und in vitrona h Antigen-Erkennung mit Sekretion der TH-Typ1-Zytokine reagieren (Bo her et al., 1999;Bauer et al., 2002; Ren et al., 2003). Wie z. B. von Fran o et al. gezeigt, induziert in vitroproduziertes IFN-γ tatsä hli h die Expression von sowohl HLA-Klasse-I- als au h -Klasse-II-Molekülen (Fran o et al., 1988). Das sezernierte IFN-γ kann somit über die Erhöhung vonHLA-Klasse-II zu gesteigerter Antigenpräsentation führen, was wiederum in e�ektiver undoptimierter Aktivierung der CD4+T-Zellen und antiviraler Abwehr resultieren kann.

4 Diskussion 1014.2 Ein�uss der TH-Typ1-Zytokine auf die Kultur undVirusreplikation der HepatozytenDie zelluläre Immunität na h der HBV-Impfung wird dur h TH-Typ1-Zellen vermittelt, diedie Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-α sezernieren (Bauer et al., 2002). In vers hiedenen invitro Modellsystemen wurde die Wirkung von Zytokinen auf die HBV-Infektion untersu ht.Es wurden antivirale E�ekte von IFN-γ, TNF-α und IL-2 in HBV-transgenen Mäusen undim DHBV-System bes hrieben (Gilles et al., 1992; Guilhot et al., 1993; Lavine und Ga-nem, 1993; S hultz und Chisari, 1999). Na h Wieland et al. aktiviert IFN-γ � ebenso wiedie Typ-I-Interferone IFN-α/β � hepatozelluläre Me hanismen, die die Formation und Rei-fung replikationskompetenter Viruskapside verhindern und letztli h die virale Replikationinhibieren (Wieland et al., 2005). TNF-α inhibiert die virale Replikation ebenfalls über De-stabilisierung viraler Nukleokapside, wobei die antivirale Wirkung von der Aktivierung desTranskriptionsfaktors NF-κB abhängig ist (Biermer et al., 2003).Um im humanen System einen direkten E�ekt der TH-Typ1-Zytokine auf die Virusreplika-tion zu untersu hen, wurden HBV-in�zierte Hepatozyten mit rekombinantem TNF-α undIFN-γ kultiviert. TNF-α und IFN-γ bewirkten innerhalb von 24 Stunden na h erstmaligerZugabe eine deutli he und na hhaltige Verminderung der viralen Genexpression sowie eineReduktion der viralen DNA und der Proteine. Dur h IFN-γ und TNF-α wurde sowohl dieVirusreplikation der in vitro in�zierten primären Hepatozyten als au h die Virusreplikationder HBV-in�zierten Hepatom-Zellen negativ beein�usst. Der infektionsinhibierende E�ektder Zytokine äuÿerte si h in der Reduktion der Antigene HBeAg und HBsAg sowie derviralen DNA-Synthese. Dabei zeigte si h eine konzentrationsabhängige Wirkung der Zyto-kine. Mit steigender Zytokinkonzentration erhöhte si h die Reduktion der Virusreplikation.Ähnli h zu diesen Ergebnissen bes hreiben Parvez et al. für das Modell der trans�ziertenHepG2-Zellen eine signi�kante Reduktion der HBsAg-Produktion na h IFN-γ-Behandlung.Für die Reduktion der viralen DNA-Synthese wurde jedo h eine höhere IFN-γ-Konzentrationbenötigt (Parvez et al., 2006). Suri et al. zeigten anhand von 15 HepatozytenpräparationenHBV-in�zierter Spender mit unters hiedli her Viruslast, dass rekombinantes IFN-γ die Re-plikation der viralen DNA reduzierte. Jedo h konnte in den Hepatozytenkulturen mit derhö hsten Viruslast kein E�ekt auf die Virusreplikation festgestellt werden (Suri et al., 2001).Im DHBV-Modell wurde neben der Konzentrationsabhängigkeit au h eine zeitli he Abhän-gigkeit für die E�zienz der IFN-γ-vermittelten Inhibition der Infektion bes hrieben. Einemaximale Reduktion der viralen DNA wurde errei ht, wenn IFN-γ bereits vor der oderparallel zur Infektion zum Kulturmedium gegeben wurde (S hultz und Chisari, 1999). Inder vorliegenden Arbeit bewirkten TNF-α und IFN-γ eine deutli h stärkere Reduktion derHBeAg-Produktion bei der Primärinfektion der Hepatozyten als in den in�zierten Hepatom-Zellen. Zu den primären Hepatozyten wurden die Zytokine bereits zu Beginn der Infektionzugegeben, während in den Hepatom-Zellen eine konstitutive Virusexpression vorliegt. DieTNF-α- und IFN-γ-vermittelte Reduktion der viralen Transkription war in den primären

4 Diskussion 102Hepatozyten bereits 24 Stunden na h erstmaliger Zytokingabe messbar. Ähnli h diesem Er-gebnis detektierten Suri et al. bereits 18 Stunden na h Zytokingabe eine IFN-γ-vermittelteReduktion der viralen RNA in in�zierten primären humanen Hepatozyten (Suri et al., 2001).Au h im Modell der HBV-transgenen Mäuse erfolgte bereits 16 Stunden na h Injektion vonrekombinantem murinem TNF-α eine signi�kante Reduktion der viralen RNA (Gilles et al.,1992). In der vorliegenden Arbeit wurden die Einzele�ekte von TNF-α und IFN-γ auf dieHBV-Infektion untersu ht. Ein synergistis her E�ekt beider Zytokine könnte jedo h zu ei-ner stärkeren Reduktion der Transkription und der Virusreplikation führen. Pasquetto et al.bestätigen einen synergistis hen E�ekt der Zytokine TNF-α und IFN-γ und bes hreiben an-hand einer immortalisierten Maus-Linie, dass, obwohl die Synthese der viralen DNA e�zientdur h IFN-γ inhibiert wird, eine e�ektive Hemmung der Transkription nur in Kombinationder beiden Zytokine errei ht wurde (Pasquetto et al., 2002).Zusammenfassend führten die Experimente zur antiviralen Wirkung von TNF-α und IFN-γ auf die HBV-Infektion humaner Hepatozyten zu Ergebnissen, die mit � anhand andererModellsysteme gewonnenen � Daten aus der Literatur übereinstimmen.

4 Diskussion 1034.3 E�ekte HBV-spezi�s her und HBV-naiverImmunzellen auf die VirusreplikationHBV-in�zierter humaner HepatozytenBereits frühe Arbeiten mit Untersu hungen an HBV-in�zierten Patienten und vers hiede-nen Modellsystemen zeigten, dass HBsAg-spezi�s he CD4+T-Lymphozyten HBV-spezi�s heHüllproteine erkennen und an der Elimination virusin�zierter Zellen beteiligt sind (Ferrariet al., 1990; Penna et al., 1992). Na h Transfer HBsAg-spezi�s her CD4+T-Lymphozytenin HBV-transgene Mäuse sezernierten die Lymphozyten na h Antigenerkennung die TH1-Zytokine IFN-γ und TNF-α, die letztli h die Suppression der viralen Replikation vermittel-ten (Fran o et al., 1997).In der vorliegenden Arbeit wurden die E�ekte untersu ht, die imp�nduzierte HBV-spezi�s heImmunzellen auf die Hepatitis-B-Virusreplikation humaner Hepatozyten ausüben. Daherwurde zunä hst die Immunantwort harakterisiert, die spezi�s he Immunzellen na h in vi-tro Stimulation mit rekombinantem HBsAg zeigen. Wie von Bauer et al. bes hrieben, wurdedafür die HBsAg-spezi�s he T-Zellantwort peripherer Blut-Lymphozyten (PBL) ex vivo mit-tels Elispot bestimmt (Bauer et al., 2002; Bauer und Jilg, 2006). Bei allen hier überprüftenSpendern, die eine aktive HBV-Immunisierung erhielten, konnte eine Reaktivität gegen dasImpfsto�-Antigen (rekombinantes HBsAg) gemessen werden. Die PBL sezernierten IFN-γ,IL-2 und TNF-α. Aufgrund des Zytokinpro�ls � Sekretion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α �wurde die zelluläre Immunantwort der geimpften Spender als TH-Typ1-Antwort harakteri-siert. Bei den überprüften Spendern konnten z. T. unters hiedli he Frequenzen der TH-Typ1-Zytokine detektiert werden. Der Literatur zufolge steht die Zahl der Zytokin-sezernierendenZellen jedo h meist ni ht in Korrelation zum imp�nduzierten Antikörper-Titer (Vingerhoetset al., 1994; Bo her et al., 1999). Bei den HBV-naiven PBL der ungeimpften Kontrollproban-den war keine Reaktivität auf das Impfsto�-Antigen zu verzei hnen. Vers hiedene weitereArbeitsgruppen konnten in ähnli hen Untersu hungen ebenso keinerlei Reaktivität HBV-naiver Immunzellen feststellen (Vingerhoets et al., 1994; Larsen et al., 2000). Demgegenübersteht eine aktuelle Studie, in der mittels Elispot bei zehn von insgesamt zwölf ungeimpf-ten PBL-Spendern na h Stimulation mit rekombinantem HBsAg die Sekretion von IFN-γdetektiert wurde (Weihrau h et al., 2008). Na h Weihrau h et al. könnte dafür eine Kreuz-reaktivität verantwortli h sein, bei der Antigen-präsentierende Zellen Proteine präsentieren,die Teilen des HBsAg strukturell ähnli h sind.Die Untersu hungen der E�ekte imp�nduzierter HBsAg-spezi�s her Immunzellen auf dieHBV-Infektion humaner Hepatozyten wurden mit E�ektor- und Zielzellen unters hiedli herHLA-Restriktion dur hgeführt. In Kulturen HLA-unters hiedli her Lymphozyten mit direk-tem Zell-Zell-Kontakt zu Hepatozyten traten alloreaktive, zytotoxis he E�ekte auf. Aufgrundder Alloreaktivität der HLA-inkompatiblen Zellen wurde ein Kulturmodell entwi kelt, dasdur h Trennung der beiden Zellpopulationen zytotoxis he E�ekte verhindert. Die Trennung

4 Diskussion 104erfolgte dur h ein Zellsieb, das auf die Hepatozytenkultur aufgesetzt wurde. Der Einsatzdes Zellsiebes ma hte es jedo h nötig, das Volumen des Mediums in der Kultur zu ver-dreifa hen. Es wäre denkbar gewesen, dass si h das erhöhte Volumen über Änderung desSauersto�partialdru ks auf die Infektion der Zellen auswirkt. Aufgrund der Ergebnisse ausden Untersu hungen konnte jedo h ausges hlossen werden, dass der Einsatz des Zellsiebesund die Erhöhung des Kulturvolumens die Kinetik und Dynamik der HBV-Infektion derprimären Hepatozyten na hteilig beein�ussten. Um trotz der Trennung der beiden Zellpo-pulationen Interaktionen über einen Austaus h von lösli hen Faktoren zwis hen den Zellenzu ermögli hen, sollte die Membran der Zellsiebe für sezernierte Produkte der in�ziertenHepatozyten sowie der Immunzellen permeabel sein. Die Versu he zur Überprüfung der Per-meabilität bestätigten, dass die in vitro synthetisierten viralen Produkte HBsAg, HBeAg unddie virale DNA die Membran passieren. Aufgrund der Di�usion der viralen Produkte dur hdie Siebmembran konnte davon ausgegangen werden, dass Antigen-präsentierende Zellender PBL-Suspension die viralen Produkte aufnehmen, prozessieren und den T-Lymphozytenpräsentieren. Die Aktivierung der T-Lymphozyten sollte die Sekretion antiviral wirkenderZytokine induzieren, die ebenfalls dur h die Siebmembran di�undieren und so Ein�uss aufdie HBV-Infektion der Hepatozyten ausüben können.In dieser Arbeit wurde der Verlauf der HBV-Infektion humaner Hepatozyten untersu ht,die mit humanen Immunzellen (PBL) kokultiviert wurden. Die Ergebnisse aus diesen Versu- hen zeigen erstmals die E�ekte in vivo imp�nduzierter HBV-spezi�s her PBL auf in�ziertehumane Hepatozyten. Die PBL beinhalten dabei die imp�nduzierten HBsAg-spezi�s henCD4+T-Zellen. Daher ist anzunehmen, dass reaktive Antworten auf die Stimulation mit vi-ralen Produkten ursä hli h CD4+T-Zell-vermittelt sind. Aufgrund der Trennung der Immun-zellen von den Hepatozyten dur h ein Zellsieb wurden die beoba hteten E�ekte auss hlieÿli hdur h lösli he Faktoren vermittelt.Die gewonnenen Daten aus den Kokulturexperimenten der vorliegenden Arbeit zeigen, dassdur h HBV-spezi�s he PBL die Antigen-Produktion in in�zierten primären humanen He-patozyten sowie den konstitutiv HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen signi�kant und z. T.vollständig reduziert wurde. Au h die Synthese der viralen DNA und die virale Transkrip-tion wurden von den PBL negativ beein�usst. Die unters hiedli he, im Elispot gemesseneT-Zell-Reaktivität einzelner PBL-Spender äuÿerte si h in den Versu hen in unters hiedli hstarker Inhibition der Antigen-Produktion (78 % bis 100 %). Dabei war eine enge Korrelationzwis hen der Reduktion der Antigen-Produktion mit der Zahl IFN-γ-sezernierender Zellenzu beoba hten.Den Zusammenhang zwis hen der IFN-γ-Produktion und der Reduktion der Virusreplikationbeoba hteten au h Suri et al. in Kokulturen virusin�zierter Hepatozyten mit PBL hroni-s her Virusträger (Suri et al., 2001). Eine weitere Arbeit beri htet von der Verminderungder viralen Replikation HBV-in�zierter Patienten, die ebenfalls in Zusammenhang mit ei-ner zunehmenden IFN-γ-Produktion dur h HBsAg-spezi�s he CD4+T-Lymphozyten steht(Ren et al., 2003). Au h für das Wood hu k -Hepatitis-Modell wurde die Korrelation der

4 Diskussion 105antiviralen Wirkung und der Konzentration von IFN-γ bes hrieben. Na h Guo et al. sinddie IFN-γ-Konzentrationen in der Leber bei e�ektiver viraler Elimination signi�kant höherals in hronis h in�zierten Tieren (Guo et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit bewirk-ten HBV-spezi�s he PBL in Kokultur mit den HBV-in�zierten humanen Hepatozyten eineeindeutige Inhibition der viralen Antigen-Produktion, der DNA-Replikation und der RNA-Transkription. Die Stärke der antiviralen Wirkung der HBV-spezi�s hen PBL zeigte si h inden Versu hen zur Zeitabhängigkeit in den primären Hepatozyten. Obwohl an Tag vier na hVersu hsbeginn eine aktive Virusreplikation vorliegt, konnte die virale Aktivität der Infektion� gemessen an der HBeAg-Produktion � dur h Einwirken der PBL reduziert und au h voll-ständig inhibiert werden. Au h die konstitutive Virusreplikation der Hepatom-Zellen wurdedur h die PBL signi�kant reduziert. Eine ents heidende Erkenntnis dieser Versu hsreihenergibt si h aus der Beoba htung, dass die antiviralen E�ekte unmittelbar (24 bis 48 Stun-den) na h Beginn der Kokulturen messbar und zudem reversibel waren. Dur h Entfernen derPBL na h 14-tägiger Kokultivierung mit den in�zierten Hepatozyten wurde der antiviraleE�ekt aufgehoben und es erfolgte innerhalb von 48 Stunden eine Neuproduktion von HBeAg.Diese s hnelle Wirkung antiviraler E�ekte konnte in dieser Arbeit au h dur h rekombinantesIFN-γ bzw. TNF-α gezeigt werden.Überras henderweise traten die bes hriebenen E�ekte der HBV-spezi�s hen PBL au h in Ko-kulturen mit HBV-naiven PBL auf. Die PBL ungeimpfter Spender inhibierten ebenfalls dieAntigen-Produktion in in vitro in�zierten primären humanen Hepatozyten sowie in konsti-tutiv HBV-exprimierenden Hepatom-Zellen. Jedo h war die Reduktion der Virusreplikationim Verglei h zu HBV-spezi�s hen PBL deutli h geringer. HBV-spezi�s he PBL bewirkten inprimären Hepatozyten eine Inhibition der Antigen-Produktion um 90 %, während HBV-naivePBL eine Reduktion um 58,5 % bewirkten. In Abhängigkeit des HBV-naiven PBL-Spendersvariierte dabei die Suppression der viralen Aktivität von 27 % bis 82 %. Die Virusreplikationder humanen Hepatom-Zellen wurde dur h die HBV-naiven PBL um 41 % reduziert. Wiedie E�ekte der HBV-spezi�s hen PBL war die antivirale Wirkung der HBV-naiven PBLinnerhalb von 24 bis 48 Stunden na h Beginn der Kokultur messbar. Ebenso wurde dur hEntfernen der PBL der antivirale E�ekt aufgehoben, was eine starke Neuproduktion vonHBeAg bewirkte. Primär lag die Vermutung nahe, dass die E�ekte der HBV-naiven PBLvon Komponenten und Zellen der angeborenen Immunität vermittelt wurden. Die Kokul-turversu he wurden mit PBL dur hgeführt, die neben T-Lymphozyten au h Makrophagen,Monozyten, Dendriten, Natürli he Killer-Zellen sowie B-Lymphozyten enthalten. Es könntenalso neben CD4+- und CD8+T-Zellen vers hiedene weitere Zellen an der antiviralen Reaktionder PBL auf die HBV-Infektion beteiligt sein.Die antivirale Wirkung der PBL hatte auf die Virusreplikation der Primärinfektion einenstärkeren Ein�uss als auf die Virusreplikation der Hepatom-Zellen. Dur h HBV-spezi�s hePBL erfolgte in primären Hepatozyten eine Reduktion der HBeAg-Produktion um 90 %,während in den Hepatom-Zellen eine Inhibition um 60 % erfolgte. HBV-naive PBL redu-zierten die HBeAg-Produktion der in�zierten primären Hepatozyten um 58,5 % und die der

4 Diskussion 106Hepatom-Zellen um 41 %. Gründe hierfür könnten sein, dass aufgrund der hohen Proliferati-onsrate der Hepatom-Zellen diese nur 48 Stunden mit den Immunzellen kokultiviert werdenkonnten, während die primären Hepatozyten 14 Tage mit den PBL kokultiviert wurden.Des Weiteren ist die Konzentration der gebildeten viralen Produkte der Virusreplikation derPrimärinfektion mit der der HepG2.215-Zellen verglei hbar, obwohl im Gegensatz zu denHepatom-Zellen nur a. 10 % der primären Zellen in�ziert sind. Die dadur h o�enbar höherevirale Aktivität könnte eine stärkere Stimulation und Reaktivität der PBL bewirkt haben.Denn obwohl in beiden Kulturmodellen die in�zierten Hepatozyten mit 5 × 106 PBL kokul-tiviert wurden, wurde die Virusreplikation der Primärinfektion stärker beein�usst als die derHepatom-Zellen.Sowohl HBV-spezi�s he als au h HBV-naive PBL konnten trotz fehlendem Zell-Zell-Kontaktund der räumli hen Distanz zu den HBV-in�zierten Zielzellen die Virusreplikation deutli hinhibieren. In der Annahme, dass tatsä hli h Zytokine als Mediatoren dieser antiviralen Wir-kung fungieren, wurde mittels Elispot die dur h die Kokultur induzierte Reaktivität der PBLgetestet. Dabei stellten si h au h die Fragen, dur h wel he Faktoren die PBL HBV-naiverSpender zu einer derart starken Reaktion angeregt werden und ob bzw. wel he Zytokinedie Inhibition der viralen Aktivität bewirken könnten. Es war bekannt, dass rekombinantesHBsAg im Elispot keine Reaktivität HBV-naiver Zellen induziert. Im Gegensatz dazu könntedie Stimulation der PBL in der Kokultur neben partikulärem HBsAg au h dur h sezernier-tes HBeAg sowie virale DNA und Viruspartikel erfolgt sein. Um die lösli hen Faktoren zuidenti�zieren, wurden HBV-spezi�s he und HBV-naive PBL, die zunä hst mit in�ziertenHepatozyten kokultiviert wurden, im Elispot untersu ht. Die Zellen geimpfter und unge-impfter Spender sezernierten na h Antigen-Stimulation � wie vermutet � IFN-γ und TNF-α,sowie IL-2 und IL-10. In Anlehnung an Valitutti et al. zeigt dieses Ergebnis die individuel-le, spenderabhängige Sensitivität der Immunzellen (Valitutti et al., 1996). Zudem spiegeltdieses Ergebnis au h die angeborene sowie die erworbene Reaktivität der Immunzellen na hStimulation mit viralen Antigenen und der Viruspartikel wider. Auÿer von T-Lymphozytenwerden diese Zytokine no h von einer Reihe weiterer Zellen produziert. IFN-γ wird zusätzli hvon Makrophagen gebildet, ebenso TNF-α, das zudem no h von Natürli hen Killer-Zellensezerniert wird, während IL-10 ein Produkt von T-Zellen, Monozyten und B-Zellen ist. UmHinweise zu gewinnen, wel he Reaktivität HBsAg-spezi�s he CD4+T-Lymphozyten und diePBL HBV-naiver Spender na h Stimulation dur h das in Kultur sezernierte HBsAg zeigen,wurden PBL mit HBsAg-exprimierenden sowie HBV-exprimierenden Zellen kokultiviert unddann im Elispot getestet. Trotz verglei hbarer HBsAg-Konzentrationen in beiden Kulturenwurden dur h die viralen Produkte der HBV-exprimierenden Hepatozyten deutli h mehrZellen zur Zytokin-Sekretion angeregt als dur h HBsAg. Neben HBsAg sind o�enbar dievirale DNA, HB Ag und HBeAg an der Induktion einer reaktiven Immunantwort beteiligt.Dieses Ergebnis könnte ein weiterer Hinweis für die vermutete Beteiligung der angeborenennatürli hen Immunität in diesem Kulturmodell sein.Mili h et al. beoba hteten in transgenenMäusen, dass HB Ag primär TH1-Zellen induziert, während HBeAg TH0- und TH1-Zellen

4 Diskussion 107induziert. Da HB Ag und HBeAg Kreuzreaktivität bei der Antigenpräsentation zeigen, kön-nen si h T-Helferzellen in Abhängigkeit des Immunogens in vers hiedene E�ektorzellgruppenentwi keln (Mili h et al., 1997). Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lässt si h jedo h au hs hlieÿen, dass au h HBsAg bei HBV-naiven PBL ungeimpfter Spender eine Stimulationbewirkt. Das in Kultur produzierte HBsAg löste � anders als das rekombinante HBsAg desImpfsto�es � bei naiven PBL die Sekretion antiviral wirkender Zytokine aus. Partikulä-res HBsAg wird aus einzelnen, in Lipidmembranen eingelagerten Proteinen gebildet. Daherkönnten Unters hiede in der Struktur der in vitro gebildeten HBsAg-Partikel und der ni htglykosylierten Impfsto�-Antigene zur Erkennung dur h vers hiedene Antigen-präsentierendeZellen und spezialisierter Antigen-Bindung führen (Ren et al., 2003), wodur h si h die Sti-mulation der HBV-naiven PBL erklären lieÿe.Die gewonnenen Daten zeigen, dass HBV-spezi�s he und HBV-naive PBL die HBV-Infektionin diesem humanen Modell o�enbar über Sekretion von TH-Typ1-Zytokinen kontrollierenkönnen. Die ersten Demonstrationen der Zytokin-vermittelten Inhibition der viralen Repli-kation wurden in HBV-transgenen Mäusen erbra ht (Guidotti et al., 1994; Chisari, 1996;Guidotti et al., 1996; M Clary et al., 2000). Wie in der vorliegenden Arbeit waren für dieantiviralen E�ekte hauptsä hli h die Zytokine IFN-γ und TNF-α verantwortli h. In dentransgenen Mäusen führten die Zytokine dazu, dass innerhalb von 24 Stunden virale Nu-kleokapside und die replizierende DNA in der Leber eliminiert und die Transkription derviralen RNA supprimiert wurde (Guidotti et al., 1996). Au h im S himpansen-Modell wur-de die E�ektivität der ni htzytopathogenen Inhibition der viralen DNA-Synthese währendder akuten Infektion dur h T-Lymphozyten gezeigt. Na h Guidotti et al. waren ungefähr90 % der viralen DNA der Leber eliminiert, bevor in den in�zierten Tieren entzündli heLeberveränderungen auftraten (Guidotti und Chisari, 1999).Da die PBL geimpfter Spender, die imp�nduzierte HBsAg-spezi�s he CD4+T-Lymphozytenenthalten, eine � im Verglei h zu den HBV-naiven PBL ungeimpfter Spender � statistis h si-gni�kant stärkere Suppression der Virusreplikation bewirkten, ist die antivirale Wirkung derHBV-spezi�s hen PBL tatsä hli h HBsAg-vermittelt. Es zeigte si h jedo h au h, dass derantivirale E�ekt auf die Infektion synergistis h aus der angeborenen sowie der spezi�s hen,imp�nduzierten Immunität resultiert. Für eine additive Wirkung spri ht die signi�kant stär-kere inhibitoris he Wirkung der PBL geimpfter Spender im Verglei h zu den HBV-naivenPBL. Daher s heinen CD4+T-Lymphozyten eine direkte antivirale Antwort auf die HBV-Infektion humaner Hepatozyten na h Stimulation dur h in vitro produzierte virale Partikelzu vermitteln. Dies bestätigen Daten aus der Literatur, wona h sowohl für das transgeneMausmodell als au h für das S himpansenmodell eine direkte, TH-Typ1-Zytokin-abhängigeantivirale Rolle der CD4+T-Lymphozyten gezeigt wurde (Fran o et al., 1997; Guidotti etal., 1999; Guidotti und Chisari, 2001).Tatsä hli h gibt es aber in der Literatur au h Hinweise für eine Inhibition der HBV-Replikati-on dur h Zellen und Mediatoren der angeborenen Immunität. An der antiviralenWirkung derHBV-naiven PBL könnten Toll-like Rezeptoren (TLR) ursä hli h beteiligt sein. TLR sind

4 Diskussion 108integrale Membranproteine, die Rezeptoren für die Erkennung spezi�s her Muster (patternre ognition re eptors; PRRs) bilden. Über Erkennung pathogen-assoziierter konservierter Be-rei he (pathogen asso iated mole ular patterns, PAMPs) aktivieren sie Zellen der angebore-nen Immunität und repräsentieren eine direkte Verknüpfung der angeborenen mit der adap-tiven Immunität (Kawai und Akira, 2007). TLR binden vers hiedene antigene Komponentenwie Lipopeptide, doppelsträngige RNA, Lipopolysa haride oder einzelsträngige RNA. Eineents heidende Rolle spielen TLR bei der Erkennung bakterieller oder Pilz-Pathogene, wäh-rend die Bedeutung der TLR in der antiviralen Abwehr weniger bekannt ist. Zunä hst gingman davon aus, dass doppelsträngige RNA � ein replikatives Intermediat vieler Viren � daseinzig virale stimulierende Signal zur Aktivierung der angeborenen Immunität sei. Doppel-strängige RNA induziert über einen Transkriptionsfaktor (IFR 3, Interferon-regulierenderFaktor 3) aktiv die Synthese vers hiedener antiviral wirkender Faktoren. Mittlerweile wurdeklar demonstriert, dass TLR Hüllproteine vers hiedener Viren erkennen und dadur h eineinfektionsinhibierende Signalkaskade in Gang setzen. Es wurde gezeigt, dass das Fusions-Protein des Pneumovirus RSV (Respiratory syn ytial virus) und das Hämagglutinin desMasernvirus dur h Interaktion mit vers hiedenen TLR monozytäre Zellen aktiviert (Hay-nes et al., 2001; Bieba k et al., 2002). In TLR4-de�zienten Mäusen zeigte das Virus einehöhere Replikationsrate und längere Persistenz als in Wildtyp-Mäusen (Kurt-Jones et al.,2000). Ein murines Retrovirus (mammary tumour virus; MMTV) aktiviert dur h Interak-tion mit TLR4 Dendriten und B-Zellen (Burzyn et al., 2004). Das humane Cytomegalie-Virus (CMV) löst na h Interaktion des Virions mit TLR2 bei mononukleären Zellen dieSekretion in�ammatoris her Zytokine aus (Compton et al., 2003). Au h in der Erfors hungder Hepatitis-B-Virusinfektion mehren si h die Hinweise für die bedeutende Beteiligung derTLRs an der antiviralen Abwehr. Isogawa et al. beri hten von der Inhibition der HBV-Replikation in transgenen Mäusen dur h Injektion spezi�s her Liganden für TLR3, TLR4,TLR5, TLR7 und TLR9. Innerhalb von 24 Stunden wurde der inhibitoris he E�ekt dur hTyp-I-Interferone ni ht zytopathogen vermittelt (Isogawa et al., 2005). Riordan et al. be-s hreiben in einem Kollektiv hronis her Virusträger Interaktionen des Virus mit TLR2. InHBeAg-positiven Patienten �ndet si h eine stark reduzierte Expression von TLR2 sowie ver-minderte TNF-α-Konzentration. Demna h könnte eine reduzierte TLR2 -Expression an derEntstehung einer persistierenden Infektion beteiligt sein (Riordan et al., 2006). Eine wei-tere Arbeit aus dem Mausmodell beri htet, dass intrahepatis he ni htparen hymale Zellendur h TLR3 und TLR4 aktiviert werden können. In der Folge kommt es dur h die unter-s hiedli hen Zelltypen zu einer Freisetzung vers hiedener Mediatoren, die letztli h in derInhibition der viralen Replikation resultieren (Wu et al., 2007). Eine bedeutende Funktion inder Abwehr des Hepatitis-B-Virus wird Natürli hen Killer-Zellen (NKZ) zugespro hen. NKZrepräsentieren eine lymphoide Zellpopulation, die unabhängig von der HLA-Restriktion eineerste Barriere und zelluläre Antwort auf eine Virusinfektion stellen (Chen et al., 2005b).NKZ produzieren eine Reihe in�ammatoris her Zytokine mit direkter antiviraler Aktivitätwie z. B. IFN-γ oder TNF-α und können dur h Zell-Zell-Kontakt direkt zytolytis h wir-

4 Diskussion 109ken (Guidotti und Chisari, 2001). Des Weiteren können NKZ dur h aktivierte Lymphozytenselbst aktiviert werden, wie z. B. dur h Natürli he Killer-T-Zellen (NKTZ). NKTZ gelten alsspezialisierte Zellen der Immunabwehr, die sowohl T-Zell-Marker als au h Marker der NKZtragen. Eine Arbeit aus einem HBV-transgenen Mausmodell beri htet, dass die virale Repli-kation direkt dur h NKTZ via Sekretion von IFN-γ und IFN-α/β und dur h Rekrutierungvon NKZ inhibiert wurde (Kakimi et al., 2000). Eine Beteiligung der NKZ an der antivira-len Wirkung wurde au h im S himpansen-Modell demonstriert (Guidotti et al., 1999). DerLiteratur na h könnte die Aktivierung der NKTZ dur h vers hiedene Elemente erfolgen, wiez. B. dur h virale Glykolipide und Phospholipide oder HBV-induzierte Zytokine (Bendela et al., 1997; Biron et al., 1999; Kakimi et al., 2000). Aus dem Mausmodell ist bekannt,dass HBV-exprimierende Hepatozyten eine direkte in vivo Aktivierung der NKTZ währendder akuten Infektion bewirken (Baron et al., 2002). Des Weiteren ist die von aktiviertenAntigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und Dendritis hen Zellen ausgehende In-hibition der HBV-Replikation in HBV-transgenen Mäusen hauptsä hli h IFN-γ-vermittelt(Kimura et al., 2002a).Es wäre dur haus denkbar, dass die in dieser Arbeit beoba htete antivirale Wirkung derHBV-naiven PBL und die e�ektive Inhibition der Virusreplikation eine erste starke Reak-tion oben genannter Me hanismen darstellt. Antiviral und immunmodulatoris h wirkendeZytokine werden von vers hiedenen Zellen wie CD4+T-Zellen, CD8+T-Zellen, NKZ, NKTZ,Dendritis hen Zellen, Monozyten und Makrophagen produziert (Vierling, 2007). Auÿer denTH-Typ1-Zytokinen besitzen eine Reihe weiterer sezernierter Faktoren antivirales Potential.Allen voran die Typ-1-Interferone IFN-α/β (Wieland et al., 2000; Anderson et al., 2005).IFN-α wird erfolgrei h in der Therapie der hronis hen Hepatitis-B eingesetzt. In Kombina-tionstherapien mit z. B. Ribavirin wird eine signi�kante Reduktion der Virämie bei glei h-zeitiger Proliferation von CD4+T-Zellen sowie konzentrierter TH-Typ1-Zytokine beoba htet(Hultgren et al., 1998; Ri o et al., 2001). Des Weiteren wurden au h IL-12 oder IL-18 in derLiteratur als mögli he Inhibitoren der Hepatitis-B-Virusreplikation bes hrieben (Cavanaughet al., 1997; Kimura et al., 2002b). In vivo könnte die Beteiligung der Zellen der angeborenenImmunität mitverantwortli h dafür sein, dass die akute HBV-Infektion in bis zu 95 % der im-munkompetenten Erwa hsenen einen selbst-limitierenden Verlauf zeigt. Na h Vakzinierungbenötigt die adaptive Immunantwort ungefähr sieben bis zehn Tage, bevor sie aktiv dasantivirale Ges hehen bestimmen kann (Ganem und S hneider, 2001). Somit s heinen wäh-rend der Aktivierungsphase der imp�nduzierten HBsAg-spezi�s hen CD4+T-Lymphozytenzunä hst o�enbar Zellen und Komponenten der angeborenen Immunität einen ersten S hutzzu vermitteln (Rehermann, 2007).Die gewonnenen Erkenntnisse der antiviralen Wirkung imp�nduzierter, HBsAg-spezi�s herCD4+T-Zellen und der HBV-naiven Immunzellen werfen jedo h weitere Fragen auf. Auf denDaten der vorliegenden Arbeit aufbauend, sollten daher weitere Projekte die Identi�zierungder für die inhibitoris he Wirkung auf die HBV-Infektion verantwortli hen Zellen und derantiviral wirkenden Mediatoren verfolgen. Wie in der Literatur angeda ht, könnte zudem die

4 Diskussion 110therapeutis he Aktivierung von TLR, NKTZ oder weiterer Zellen der angeborenen Immuni-tät potentiell die HBV-Replikation während der natürli hen Infektion kontrollieren (Baronet al., 2002; Chen et al., 2005b). Darüber hinaus könnten die gewonnenen Daten jedo hau h Bedeutung für die zelluläre Immunität der Imp�inge haben, die auf die aktive Immu-nisierung ni ht anspre hen. Ca. 80 % dieser Personengruppe können trotz fehlender bzw.s hwa her humoraler Immunität eine zelluläre Immunität aufbauen, deren Bedeutung no hni ht eindeutig geklärt ist (Jarrosson et al., 2004; Bauer und Jilg, 2006).Zusammenfassend zeigten die Untersu hungen zur Interaktion imp�nduzierter HBsAg-spezi-�s her CD4+T-Zellen mit HBV-in�zierten humanen Hepatozyten, dass HBsAg-spezi�s heCD4+T-Zellen eine eindeutige antivirale E�ektorfunktion ausüben. Die HBV-spezi�s henPBL bewirkten eine signi�kante Reduktion und z. T. vollständige Suppression der Virusre-plikation. Zudem sezernierten die HBV-spezi�s hen PBL TH-Typ1-Zytokine, die für die an-tivirale Wirkung verantwortli h sein könnten. Entgegen der Erwartung erfolgte au h dur hHBV-naive PBL eine Reduktion der HBV-Infektion sowie die Sekretion von TH-Typ1-Zytoki-nen. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Immunzellen dur h die in Kultur gebildetenviralen Produkte stimuliert wurden und dadur h die Sekretion antiviral-wirkender Zytoki-ne induziert wurde. Sowohl die HBV-spezi�s hen als au h die HBV-naiven Immunzellenkonnten o�enbar über die Sekretion der Zytokine die HBV-Infektion kontrollieren und in-hibieren. An dieser Stelle ist no hmals hervorzuheben, dass die antivirale Wirkung trotzfehlendem Zell-Zell-Kontakt au h über die räumli he Entfernung zu einer signi�kanten Be-ein�ussung der Virusreplikation führte. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die anhand der hierverwendeten humanen Infektionsmodelle gewonnenen Ergebnisse mit Daten diverser ande-rer Modelle aus der Literatur übereinstimmen. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten weisender imp�nduzierten, HBsAg-spezi�s hen zellulären Immunität bzw. den HBsAg-spezi�s henCD4+T-Zellen eine ents heidende antivirale Bedeutung bei der Hepatitis-B-Virusinfektionzu.

Sequenzen XIVSequenzenHLA-ANM_002116; eingesehen 2006atgg gt a tgg g g aa t t tg ta t t ggggg t gg tga aga tggg ggg t a t atgagg tattt tt a at gtgt gg gg g ggggag g tt at g gtggg ta gtgga g a a g agtt gtg ggtt ga ag ga g g gag a gaggatggag g ggg g gtggataga g aggagggg ggagtatt ggga agga ga a ggaat gtgaagg agt a aga tga gagtg ga tgggga tg g gg ta ta aa agag gagg ggtt t a a at ag ataatgtatg g tg ga gt ggggt gga ggg g tt t g gggta gg agga g ta ga g g aaggatta at g tg aa gagga tg g t ttg ga g gg g ga atgg gg t agat a aag g aag tgggagg gg atgagg ggag agttg agag ta tggatgg a gtg gtggag tgg t g a gata tgga gaa gggaag gaga g tg ag g a gga aaga a atatga a a at t tga atgagg a tgaggtg tggg tg gg tt ta tg ggagat a a tga tgg ag ggg atggggagga aga ag ga a ggag t gtggaga agg tg a ggggatggaa tt agaa gtggg gg t gtggtggtg tt tggaga ggag agagata a tg atgtg ag a tgagggt tg aag t a tgag atgggag tg t tt ag a at at gtggg at attg tg g tggtt t ttggag t gtgat a tg gag tgtggt g tg gtg atgtggagga ggaagag t agatagaaaa ggagggagtt a a t agg tg aag agtga agtg aggg t tga tgtgt t a ag ttgta aagtgtgaga ag tg tt gtgtggga tgagagg aag agttgtt t g tt t ttgtga ttg aagaa tg a tttgttt tg aaagg a tg atgtg t tgtgtt g tgtagg ata atgtgaggag gtggggaga a a atgt a atga t tt a g t ga tgtg t t aa t at ttt tgtt agag aggtgggg tgaggtgt t at t tgt t aa tt at ggtg a tga g tgtaa tt tt tt tattaaaattagaa ttag tataaattta ttt t aaa tt ttg at gagaggttga tgagttaatt aaaggagaagatt taaaa tttgagaga aaaataaatg gaa a atga gaa tt a aaaaaaaaaa aaaaaaaa

Sequenzen XVHLA-BNM_005514; eingesehen 2006atg tggt a tgg g g aa gt t tg tg t t gg gg t gg tga gaga tggg gg t a t atgagg tattt ta a t gtgt gg gg g ggggag g tt at t agtggg ta gtgga g a a agtt gtgaggtt ga ag ga g g gagt gagagaggag g ggg g gtggataga g aggagggg ggagtatt ggga ggaa a a agat ta aagg agg a aga tga gagag ag tg gga a tg g gg ta ta aa agag gagg gggt t a a t ag ag atgta g g tg ga gt gggg gga ggg g t t g ggg a tga agta g ta ga g g aaggatta at g tg aa gagga tg g t tg ga g g g ga a gg gg t agat a ag g aag tgggagg gg gtgagg ggag ag gg agag ta tggaggg gagtg gtggag tgg t g a gata tgga gaa gggaag ga aag tgg ag g g tga aaaga a a gtga a a at t tga atgagg a tgaggtg tggg tg ggttt ta tg ggagat a a tga tgg ag ggg atgg gagga aaa t ag ga a tgag ttgtggaga aga ag a ggagatagaa tt agaa gtggg ag t gtggtggtg tt tggaga agag agagata a atg atgta ag a tgagggg tg gaag t a tgag atgggag g t tt agt a gt at gtggg attgttg tg g tgg tgt tag agtt gtggt at g gag tgtggt g tg tgtg atgtgtagga ggaagagtt aggtggaaaa ggagggag t a t t agg tg gtg ag ga agtg aggg t tga tgtgt t t a ag ttgaa aag tgaga ag tgt tt gtgaggga tgagatg agg attt tt a g t tt tgtga tt a agag t tg g at t ttt tg aaagg a tgaatgt gt tg gt tgttag at aatgtgagga ggtggagaga ag a ttgtgt a tgtga t gtt atg tga tgtgt tt t a gt at ttt ttgtt aga gaggtgggg tggatgt t at t tgt t aa ttta gtg a tgag tg aa tt tta tt t a tgaaaataagaat tgaa tataaatttg tttt t aaa tatttg tat gagaggttga tggattaatt aaataagt aatt tggaa tttgaaagag aaataaaga tgagaa tt agaaaa aaaaaaaaaa aaa

Sequenzen XVIHLA-CNM_002117; eingesehen 2006gg gagatg gggt atgg g gag t t tg tg t t gg gagg tgg tga gaga tggg t g t a t atgaggtat tt ga a g gtgt g g gg g ggagag g tt at t agtggg ta gtgga ga a g agtt gt g ggtt ga ag ga g g gagt gagaggggag g ggg g gt gggtggag a ggagggg g gagtattggg a gggaga a agaagta aag g agg a agg tga gagtgag tg ggaa tg g gg ta ta aa ag ag gagga gggt t a a t agagg atgt tgg t g ga tggg g ga ggg g t t g gggtatga agt g ta ga gg a aggatta at g tgaa gagga tg g t tgga g g gga a g gg t agat a a g g aagttg gagg gg gtg gg gga g ag tgaga g ta tggaggg a gtg gtggagtgg t g agat a tggagaa gggaaggag a g tg ag g g agaa aaaga a a gtga a a t t tga at gagg a tgaggtg tg gg tggg tt ta tg ggagat a a tga tgg ag gggatg gggagga a ga agga a gag ttgtggaga ag g ag agga gatggaa t t agaagtg gg ag tgtg gtggtg tt tgga aagag agagata a gtg ata tg ag a ga gggg tg aa gag t a tgag tg ggag at tt ag a at at atggg at gttg tgg tgg tgt t ggttgt ta g tgt ttggag tgtggt a g tatg atgtgtagga ggaagag t aggtggaaaa ggagggag t g t t agg tg gtg ag aa agtg aggg t tga tgagt t t at a ttgta aag tgaga ag tg tgtgtggga tg agatg agga ttt tt a a t t ttt gtga tt aa gag t tgg at t ttt tg aaagg a tgaatgtg t tg gtt tgttag ata atgtgaggag gtggagaga ag a gtgt a gtga tg t a a t ga tgtgtt t ga t at ttt tgtt agagaggtgggg t ggatgt t at t tgt t aaatt atg gtg a tgag tg aa tt tta tt taatgaagtta agaa tgaa tataaatttg tgtt t aaa tatttg tat gaag gttga tggattaattaaataagt a att tagaa gttgagagag aaataaaga tgagaa tt aaaaaa aaaaaaaaaa

Sequenzen XVIIÿ2-MikroglobulinNM_004048; eingesehen 2006aatataagtg gagg gt g g tgg ggg att tgaag tga ag at t ggg gag atgt t g t gtgg tt ag tgtg t g g ta t t t ttt tgg tggagg t at ag gta t aaagatt aggttta t a gt at ag agagaa tggaaagt a aattt tga attg tatgt gt tgggttt at at g a attgaagt tga tta tg aagaatggag agagaattga aaaagtggag att aga ttgt ttt ag aagga tgg t ttt tat t ttgta ta a tgaatt a a tg aaaaagatgagtatg tg gtgtgaa atgtga ttt gt a ag aagatagtta agtgggat g aga atgtaag ag at at ggaggtttga agatg g a tttggattgg atgaatt a aatt tg tt g ttg tttttaatattgat atg ttata a tta a tt tatg a aaa atgtagggtt ataataatgt taa atgga atgat tt t ttataatt t a tttgagtg tgt t at gtttgatgta t tgag agg ttg t a aggtag t ta ggaggg tgg aa ttagag gtggggag a gagaatt t ttat aa a t aa at ttggt agattt gaa t tt a at t ttg a t aaag tt gttaagatag ttaag gtg ataagttaa tt aattta ata t tg ttagaatttg ggggaaaatt tagaaatata attga agga ttattggaaatttgttataa tgaatgaaa attttgt at ataagatt a tattta tt ttata attt gataaagtaagg atggttg tggttaat t ggtttatttt tgtt a aa gttaaataaa t ataaaa t tgatgtgttat t tta

Sequenzen XVIIICD40NM_001250; eingesehen 2006g aagg tg ggg agggga gt ag agag g t g t g gg g agt ggt tg g tggt t a t g tatg gtt gt tg t tg agtg gt t tgg gg tg ttg tga g tgt at agaa a a tg atg agaga aaaa agta taataaa a gt agtg tg tt tttgtg ag agga agaaa tggt gagtga tg a agagtt a tgaaa gga atg tt t tg ggtgaaa g gaatt taga a tgg aa agagaga a a tg a ag a aaa ta tg ga aa tagg g tt gggt ag agaagg g a t aga aa aga a at tg a t gtgaagaagg tgg a tgt a gagtgagg tgtgagag tgtgt tg a g t at g t g gg tttggggt aag agattg ta aggggttt tgata at tg gag tg agt gg tt tt t aatgtgt at tg ttt gaaaaatgt a ttgga aag tgtga ga aaaga tggttgtg aa agg agg a aaa aag a tgatgttgt tgtggt aggat gg tgagag tggtggtgat at at tt gggat tgtttg at t ttggtg tggt ttta t aaaaaggt gg aagaag aa aata agg a aag aggaa agg agat aattt t ga gat tt tgg t aa a tg tg t agtg aggaga ttta atggatg aa ggt a aggagg atgg aaaga gagt g at t agtg agg agaga agtgagg tg a a aggag tgtgg a g tggg aaa a gg agttgg agagag t ggtg tg tg tg tgtgg gtgagggtga gggg tgg a tga tggg atag t g tt tg t g a tg agtttgaga aggaga tg g a tggatg agaaa agt t a ttgaa gaa t t a tt a tggag at agt t aa ttgtattaa aga agagg agaagtttgg tggtggtggt gttggggtatggtttagtaa tat a ag a tt gat ag agttt ggtg aga gagg at at ggtgg tt tg g ag gaag atat a a agatg attg ag attgtttgtg atagtgaa a a tggaag tg ttaa tgt at ag ag gaga tgg t aaataaaatt agaatatatt tata aa ag aat t aaaaa a tgttga gtaaggaaaa aaagg atg tg tgaatga tgggtatgga a tttttaaa aaagta atg ttttatgta tgtatattg tatggatat atgtataaat a aatatg a t atatattg atataa aagggtt tggaa gggta a ag aaaa a a g t gaagag tggtga gt tggggtgggg aagaagggt tggggg

Sequenzen XIXHLA-DRαXM_042473; eingesehen 2005att ttgt t gtt tg t a t gag t ta tga t aa agag g aagaa gaaaatgg ataagtggag t tgtg t aggattttt at atag tg tg tgatgag g t aggaa t atggg tat aaagaaga a atgtgat at agg g agtt tat t gaat tga aat agg g agtttatgtttga tttgat ggtgatgaga tttt atgt ggatatgg a aagaaggaga ggt tgg g g ttgaagaatttgga gat ttg ag tt tgagg t aa ggtg attgg aa atag tgtgga aaa g aa tggaaat atga aaag g t aa tata t gat a aa tgta t a gaggtaa tg tg t a aaa ag tgtg gaa tgagag ag aa gt t at tgt tt ataga a agtt a a agtggt aatgt a gt gg tt gaaa tggaaaa t gt a a ag gagtgt aga ga agt tt tg agggaaga a t ttt g aag tt a tat t tt t g t aa t gagga gttt a ga tg agggtggag a tgggg ttgg atgag t t t t aag a tgggagtttg atg t aag t t agaga ta ag agaa gtggt gtgtg tg gg tga tg tgggt tggt ggg at att attggga at tt at at aagggattg g aaaag a atg ag aga a g aggggg t tgtaag g a atggaggtgatggtgt tt ttagaga gaagat a t gaagaaa tt tg tttaat gg ttta aa ag tgg aatatta aat ttga t ag tgaaag agt at tt ag atttt ag tatag a aagtgtggatatg t tt gattg t gta t t aa at tag tgg tt t gt tattg tttt tgtat tatttt t tattt t at attttat tat a atg aatg t t ggaataaaa ata aggagt tgt t tg tatggaatg atgggg at t ttgtg ta ttattgt ttaaggttt t aaa tgtgattttt tg aa a aataa a tattttga tgat ttggg tggaa

Sequenzen XXCIITAAY084055; eingesehen 2005 tggttagtg atgagg tgt gtg tt tga g tggg at gaagg at ttggggaag tgaggg a gaggagggg tg aga t gggag tg tg tgg tg ggatt ta a aatg gtt g tgg t a g tg t gggt ta tgt agag aagg ag t a agtgtg a atgga gttgggg tagaaggtg g ta tgga g tt ttaa ag gatg tg a tgtg t ta a tt tatga agatgga t gg tggagaa gaagagattg ag t ta t agaa ga a aga a a t aa tg ga agtt ag agg tgttgt gtga atgga aggtggtgaa gaga aggg agg ttatg aatat g ggaa tgga agtatgt tt agga t ag tggagg g tgag aa gga atttt aag a atagga agatga agtgat ggt gagagtatgg agatg ag agaagttggg agaaaagt agaaaaga tt agag gag tt gg aga tgaa g a tggaag ag tgag a tgt ggtga tgg agt t tag tggga agt gag ga tg t a tg tg tg a tg tg g tgtt aa aggag ag t gg ag atg g tgg agaaaa ga agatt atg ttt t agtt t gttgag tg tgaat t tgaggga at agttt gt a a t t a t t g atggg t tgg aaa t t tgagg tggaa aggg gt t agta tatt at ta atggtgag gtg agg ag aagt a t agtggatt a tgt a gg t aa a t t aga gg agg t a ag tt g t at ag a tga tg ag atg tgaa tg tga t gagtgg tggga tg ggg a g at atgt tgg taattt tt atttttg gtagaga ag ggttttg gtgtt

Sequenzen XXIHBV pHBV991 (adw2)X_51970; eingesehen 2007tt a tg tt a aag t tg aaga agagt aggggt tgt atttt tg tggtgg t agtt aggaa agtaaa tg t gaat attg t t a at t gt aat t g g agga gggga tgtga gaa atggag aa at a at aggatt t agga tg gtgtta agg ggggttttt ttgttg a aagaat t a aata g agagt ta ga t gtggt gga tt t t aatttt tagggggat a gtgtgt t tgg aaaat t g gat aa t aa t a t a a a t tgt t aatttg t tggttat g tggatgt gt tg gg g ttttat ata tt t tt a t tg tg tatg t at tt ttattgg tt tt tgga ttat aaggt atgttg g tttgt t t aatt taggat aa aa aa agta ggg a atg aaa a tg a ga t tg t a agg aa t t atgttt t atgttg tg ta aaaa t a ggatggaa attg a tg tatt at at gt tt ggg ttt g aaaata ta tgggagtggg t agt g ttt t ttgg t agttta tagtg att tgtt agtggtt gtaggg ttt a tgtttgg tt t ag tatat ggatgatgtg gtattggggg aagt tgta ag at gt gagtt ttt ata g tgt ta aatttt ttttgt t tgggtata a tttaaa taa aaaa aa aaagatgggg ttatt ta aa tt atgg gttatgtaat tggaagttgg a aggat atattgta aa aaaat aaa a tgttttag aaaa tt t gttaa agg tattgattg gaaagtatgt aaagaattg tgggt tttt ggg tttg t g t tttta a aatgtgg atat tg ttaatg ttgtatg atg tata aag t aaa agg tt t a ttt t g aa tta aagg ttt taagtaaa agta atgaa ttta g ttg t gg a a gg tggt tgtg aag tatttg tga tg aa a tgg tggg g ttgg at agg at ag g atg g g gaa tttgt gg t t tg gat ata tg ggaa t tag g t tgttttg t g ag ggt tggag gaaa t at ggaa tga aatt tgt gt t t g ggaaat ata t gtt t atgg ta tagg tgtg tg aa tg gat tt g ggga gt t ttgttta gt gt gg g tgaat g gga ga t t gggg g ttggga t t t gt tt t gt tg gtt ag ga a gggg g a t t ttta g ggt t gt tgtg t t t at tg ggt gtgt g a tt g t t a t tg a gttg atg gaga a gtgaa g a t agat tg aaggt t ta ataagag ga t ttgga t ag aa tgt aa ga ga ttgag g ta tt a aaga tgtgt gtttaagga tgggaggag tgggggagga gattaggttaaaggt tttg tattaggagg tgtagg at aaattggt t g g a ag a atg aa ttttt a t tg taat at t ttgta atgt a tgtt aag t aag tgt g ttgggtg g tttgggg atgga attg a ttataa agaatttgga g ta tgtgg agtta t t gtttttg t t tga tt ttt tt gt agagat t taga a g t gg t t gtat gggaa g ttagagt t tgag attg t a t a ata g a t agg a ag att t tg tgggggg aattgatga t tag ta tgggtgggta ataatttgga agat ag a t agggat tagtagt aa ttatgttaat a taa atgggattaaagat agg aa t ttgtggttt atat t ttg tta tttt ggaagagaaa tgta ttgaatatttggt t ttt ggag tgtggatt g a t t a g tataga a aaatg tat ttat aa a tt ggaaa ta tgttgttaga ga ggga gagg aggt tagaaga agaa t t g t g ag a g agat t aat g g gt g agaag at t aat t gggaat t aatgttagtatt ttgga t ataaggtg ggaaa tt a tggg ttta tt t ta a g a tat t ttaat tgaatgg aaa t tt ttt taaaatt a ttta aagag ga attatta ataggtgt a a aatttgtggg t t a tgtaaatga aaagagaaga ttgaaattaa ttatg tg tagatt tat ta a a taaatattt g ttaga aaaggaatta aa ttatta t agat ag gtagttaat atta tt aaa aga at tattta ata t tttggaa gg gggtatt tatataaga gagaaa a a gtag g at attttg g ggt a ata tt ttgggaa aagag ta ag atgggag gttggt at aaaa t g aaagg atgg gga gaat t tt tgtt aa t tgg gatt ttt gat at ag ttgga tgtatt ggag aa t aaa aat agatt ggga tt aa at aag ga a tgg ag ag aa aggtagga gtgggag at t ggg agg gtt a t a a gg g gtgttttggg gtggag t agg t agg g atgttga agtgt a a aatt t t tg t g aat gg agt aggaagg ag ta t at t t a t taa gaga agt a t t agg atg agtgga a

Literaturverzei hnis XXIILiteraturverzei hnisAlpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. (1994). Re ent advan es in theisolation of liver ells. Hepatology, 20(2): 494-514.Anderson, A. L., Banks, K. E., Pontoglio, M., Yaniv, M., M La hlan, A. (2005). Al-pha/beta interferon di�erentially modulates the learan e of ytoplasmi en apsidated repli ationintermediates and nu lear ovalently losed ir ular hepatitis B virus (HBV) DNA from the liversof hepato yte nu lear fa tor 1alpha-null HBV transgeni . J Virol, 79(17): 11045-52.Balsano, C., Alisi, A. (2008). Viral hepatitis B: established and emerging therapies. Curr MedChem, 15(9): 930-9.Barbatis, C., Woods, J., Morton, J. A., Fleming, K. A., M Mi hael, A., M Gee, J. O.(1981). Immunohisto hemi al analysis of HLA (A, B, C) antigens in liver disease using a mono lonalantibody. Gut, 22(12): 985-91.Barnaba, V., Fran o, A., Paroli, M., Benvenuto, R., De Petrillo, G., Burgio, V.L., Santilio, I., Balsano, C., Bonavita, M. S., Cappelli, G. (1994). Sele tive expansion of ytotoxi T lympho ytes with a CD4+CD56+ surfa e phenotype and a T helper type 1 pro�le of ytokine se retion in the liver of patients hroni ally infe ted with Hepatitis B virus. J Immunol,152(6): 3074-87.Baron, J. L., Gardiner, L., Nishimura, S., Shinkai, K., Lo ksley, R., Ganem, D.(2002).A tivation of a non lassi al NKT ell subset in a transgeni mouse model of hepatitis B virusinfe tion. Immunity, 16(4): 583-94.Bartens hlager, R., Junker-Niepmann, M., S haller, H. (1990). The P gene produ t ofhepatitis B virus is required as a stru tural omponent for genomi RNA en apsidation. J Virol,64(11): 5324-32.Bauer, T., Jilg, W. (2006). Hepatitis B surfa e antigen-spe i� T and B ell memory in indivi-duals who had lost prote tive antibodies after hepatitis B va ination. Va ine, 24(5): 572-7.Bauer, T., Weinberger, K., Jilg, W. (2002). Variants of two major T ell epitopes within thehepatitis B surfa e antigen are not re ognized by spe i� T helper ells of va inated individuals.Hepatology, 35(2): 455-65.Bendela , A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. (1997). Mouse CD1-spe i� NK1 T ells: development, spe i� ity, and fun tion. Annu Rev Immunol, 15: 535-62.Bertoletti, A., D'Elios, M. M., Boni, C., De Carli, M., Zignego, A. L., Durazzo, M.,Missale, G., Penna, A., Fia adori, F., Del Prete, G., Ferrari, C. (1997). Di�erent

Literaturverzei hnis XXIII ytokine pro�les of intraphepati T ells in hroni hepatitis B and hepatitis C virus infe tions.Gastroenterology, 112(1): 193-9.Bertoletti, A., Ferrari, C., Fia adori, F., Penna, A., Margolskee, R., S hli ht, H.J., Fowler, P., Guilhot, S., Chisari, F. V. (1991). HLA lass I-restri ted human ytotoxi T ells re ognize endogenously synthesized hepatitis B virus nu leo apsid antigen. Pro Natl A ad S iU S A, 88(23): 10445-9.Bertoletti, A., Gehring, A. J. (2006). The immune response during hepatitis B virus infe tion.J Gen Virol, 87(Pt 6): 1439-49.Bhatia, S. N., Balis, U. J., Yarmush, M. L., Toner, M. (1999). E�e t of ell- ell intera tionsin preservation of ellular phenotype: o ultivation of hepato ytes and nonparen hymal ells. FASEBJ, 13(14): 1883-900.Bieba k, K., Lien, E., Klagge, I. M., Avota, E., S hneider-S haulies, J., Duprex, W.P., Wagner, H., Kirs hning, C. J., Ter Meulen, V., S hneider-S haulies, S. (2002).Hemagglutinin protein of wild-type measles virus a tivates toll-like re eptor 2 signaling. J Virol,76(17): 8729-36.Biermer, M., Puro, R., S hneider, R. J. (2003). Tumor ne rosis fa tor alpha inhibition ofhepatitis B virus repli ation involves disruption of apsid Integrity through a tivation of NF-kappaB.J Virol, 77(7): 4033-42.Biron, C. A., Nguyen, K. B., Pien, G. C., Cousens, L. P., Salazar-Mather, T. P. (1999).Natural killer ells in antiviral defense: fun tion and regulation by innate ytokines. Annu RevImmunol, 17: 189-220.Blumberg, B. S., Alter, H. J., Visni h, S. (1965). A 'new' antigen in leukemia sera. TheJournal of the Ameri an Medi al Asso iation, 191: 541-6.Blumberg, B. S., Gerstley, B. J., Hungerford, D. A., London, W. T., Sutni k, A.I. (1967). A serum antigen (Australia antigen) in Down's syndrome, leukemia, and hepatitis. AnnIntern Med, 66(5): 924-31.Bo her, W. O., Herzog-Hauff, S., Herr, W., Heermann, K., Gerken, G., Meyer ZumBus henfelde, K. H., Lohr, H. F. (1996). Regulation of the neutralizing anti-hepatitis B surfa e(HBs) antibody response in vitro in HBs va ine re ipients and patients with a ute or hroni hepatitis B virus (HBV) infe tion. Clin Exp Immunol, 105(1): 52-8.Bo her, W. O., Herzog-Hauff, S., S hlaak, J., Meyer zum Bus henfeld, K. H., Lohr,H. F. (1999). Kineti s of hepatitis B surfa e antigen-spe i� immune responses in a ute and hroni hepatitis B or after HBs va ination: stimulation of the in vitro antibody response by interferongamma. Hepatology, 29(1): 238-44.Boehm, S., Thasler, W. E., Weiss, T., Jilg, W. (2005). Primary human hepato ytes as anin vitro model for Hepatitis B virus infe tion. In: M. Roggendorf (Ed.), Monographs in Virology -Models of viral hepatitis, vol. 25: 119-134, Basel: Karger.Bre hot, C. (2004). Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepato ellular ar inoma: old andnew paradigms. Gastroenterology, 127(5 Suppl 1): S56-61.

Literaturverzei hnis XXIVBruss, V. (2007). Hepatitis B virus morphogenesis. World J Gastroenterol, 13(1): 65-73.Burzyn, D., Rassa, J. C., Kim, D., Nepomnas hy, I., Ross, S. R., Piazzon, I. (2004). Toll-like re eptor 4-dependent a tivation of dendriti ells by a retrovirus. J Virol, 78(2): 576-84.Cao, J., Yang, E., Su, J., Li, Y., Chow, P. (2003). The tree shrews: adjun ts and alternativesto primates as models for biomedi al resear h. J Med Primatol, 32(3): 123-30.Caruntu, F. A., Molagi , V. (2005). C DNA persisten e during natural evolution of hroni VHB infe tion. Rom J Gastroenterol, 14(4): 373-7.Cavanaugh, V. J., Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (1997). Interleukin-12 inhibits hepatitis Bvirus repli ation in transgeni mi e. J Virol, 71(4): 3236-43.Celis, E., Ou, D., Otvos, L. J. (1988). Re ognition of hepatitis B surfa e antigen by humanT lympho ytes. Proliferative and ytotoxi responses to a major antigeni determinant de�ned bysyntheti peptides. J Immunol, 140(6): 1808-15.Chai, N., Chang, H. E., Ni olas, E., Han, Z., Jarnik, M., Taylor, J. (2008). Properties ofsubviral parti les of hepatitis B virus. J Virol, 82(16): 7812-7.Chen, M., Taba zewski, P., Trus ott, S. M., Van Kaer, L., Stroynowski, I. (2005a).Hepato ytes express abundant surfa e lass I MHC and e� iently use transporter asso iated withantigen pro essing, tapasin, and low mole ular weight polypeptide proteasome subunit omponentsof antigen pro essing and presentation pathway. J Immunol, 175(2): 1047-55.Chen, Y., Cheng, M., Tian, Z. (2006). Hepatitis B virus down-regulates expressions of MHC lass I mole ules on hepatoplastoma ell line. Cell Mol Immunol, 3(5): 373-8.Chen, Y., Wei, H., Gao, B., Hu, Z., Zheng, S., Tian, Z. (2005b). A tivation and fun tionof hepati NK ells in hepatitis B infe tion: an underinvestigated innate immune response. J ViralHepat, 12(1): 38-45.Chisari, F. V. (1996). Hepatitis B virus transgeni mi e: models of viral immunobiology andpathogenesis. Curr Top Mi robiol Immunol, 206: 149-73.Chiu, J. H., Lui, W. Y., Chang, H. M., Loong, C. C., Wu, L. H., Kao, H. L., Wu,C. W. (1997). Class I and lass II major histo ompatibility omplex antigens expression on humanhepato ytes and hepatoma ells: an approa h with high sensitivity and spe i� ity. Cytometry, 30(6):317-23.Compton, T., Kurt-Jones, E. A., Boehme, K. W., Belko, J., Latz, E., Golenbo k, D.T., Finberg, R. W. (2003). Human ytomegalovirus a tivates in�ammatory ytokine responsesvia CD14 and Toll-like re eptor 2. J Virol, 77(8): 4588-96.Cooper, A., Tal, G., Lider, O., Shaul, Y. (2005). Cytokine indu tion by the hepatitis B virus apsid in ma rophages is fa ilitated by membrane heparan sulfate and involves TLR2. J Immunol,175(5): 3165-76.Cornberg, M., Protzer, U., Dollinger, M. M., Petersen, J., Wedemeyer, H., Berg,T., Jilg, W., Erhardt, A., Wirth, S., S hirma her, P., Fleig, W. E., Manns, M. P.

Literaturverzei hnis XXV(2007). Prophylaxe, Diagnostik und Therapie der Hepatitis-B-Virus-(HBV-)Infektion - 'Upgrade'der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011. Z Gastroenterol, 45(6): 525-74.Crowther, R. A., Kiselev, N. A., Bott her, B., Berriman, J. A., Borisova, G. P., Ose,V., Pumpens, P. (1994). Three-dimensional stru ture of hepatitis B virus ore parti les determinedby ele tron ryomi ros opy. Cell, 77(6): 943-50.Daar, A. S., Fuggle, S. V., Fabre, J. W., Ting, A., Morris, P. J. (1984a). The detaileddistribution of HLA-A, B, C antigens in normal human organs. Transplantation, 38(3): 287-92.Daar, A. S., Fuggle, S. V., Fabre, J. W., Ting, A., Morris, P. J. (1984b). The detaileddistribution of MHC Class II antigens in normal human organs. Transplantation, 38(3): 293-8.Daemer, R. J., Feinstone, S. M., Alexander, J. J., Tully, J. G., London, W. T., Wong,D. C., Pur ell, R. H. (1980). PLC/PRF/5 (Alexander) hepatoma ell line: further hara teriza-tion and studies of infe tivity. Infe t Immun, 30(2): 607-11.Dandri, M., Lutgehetmann, M., Volz, T., Petersen, J. (2006). Small animal model systemsfor studying hepatitis B virus repli ation and pathogenesis. Semin Liver Dis, 26(2): 181-91.Dane, D. S., Cameron, C. H., Briggs, M. (1970). Virus-like parti les in serum of patients withAustralia-antigen-asso iated hepatitis. Lan et, 1(7649): 695-8.De Meyer, S., Gong, Z. J., Suwandhi, W., van Pelt, J., Soumillion, A., Yap, S. H.(1997). Organ and spe ies spe i� ity of hepatitis B virus (HBV) infe tion: a review of literaturewith a spe ial referen e to preferential atta hment of HBV to human hepato ytes. J Viral Hepat,4(3): 145-53.Delves, P. J., Roitt, I. M. (2000a). The immune system. First of two parts. N Engl J Med,343(1): 37-49.Delves, P. J., Roitt, I. M. (2000b). The immune system. Se ond of two parts. N Engl J Med,343(2): 108-17.Di, Q., Summers, J., Bur h, J. B., Mason, W. S. (1997). Major di�eren es between WHV andHBV in the regulation of trans ription. Virology, 229(1): 25-35.Diao, J., Gar es, R., Ri hardson, C. D. (2001). X protein of hepatitis B virus modulates y-tokine and growth fa tor related signal transdu tion pathways during the ourse of viral infe tionsand hepato ar inogenesis. Cytokine Growth Fa tor Rev, 12(2-3): 189-205.E hevarria, J. M., Avellon, A. (2006). Hepatitis B virus geneti diversity. J Med Virol, 78Suppl 1: S36-42.Elaut, G., Henkens, T., Papeleu, P., Snykers, S., Vinken, M., Vanhae ke, T., Rogiers,V. (2006). Mole ular me hanisms underlying the dedi�erentiation pro ess of isolated hepato ytesand their ultures. Curr Drug Metab, 7(6): 629-60.Enomoto, K., Nishikawa, Y., Omori, Y., Tokairin, T., Yoshida, M., Ohi, N., Nishimura,T., Yamamoto, Y., Li, Q. (2004). Cell biology and pathology of liver sinusoidal endothelial ells.

Literaturverzei hnis XXVIMed Ele tron Mi ros , 37(4): 208-15.Ferir, G., Kaptein, S., Neyts, J., De Cler q, E. (2008). Antiviral treatment of hroni hepatitis B virus infe tions: the past, the present and the future. Rev Med Virol, 18(1): 19-34.Ferrari, C., Penna, A., Bertoletti, A., Valli, A., Antoni, A. D., Giuberti, T., Cavalli,A., Petit, M. A., Fia adori, F. (1990). Cellular immune response to hepatitis B virus-en odedantigens in a ute and hroni hepatitis B virus infe tion. J Immunol, 145(10): 3442-9.Fran o, A., Barnaba, V., Natali, P., Balsano, C., Mus a, A., Balsano, F. (1988). Ex-pression of lass I and lass II major histo ompatibility omplex antigens on human hepato ytes.Hepatology, 8(3): 449-54.Fran o, A., Guidotti, L. G., Hobbs, M. V., Pasquetto, V., Chisari, F. V. (1997). Pa-thogeneti e�e tor fun tion of CD4-positive T helper 1 ells in hepatitis B virus transgeni mi e. JImmunol, 159(4): 2001-8.Funk, A., Mhamdi, M., Will, H., Sirma, H. (2007). Avian hepatitis B viruses: mole ular and ellular biology, phylogenesis, and host tropism. World J Gastroenterol, 13(1): 91-103.Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., S hranz, P., Zentgraf,H. (1994). In vitro experimental infe tion of primary human hepato ytes with hepatitis B virus.Gastroenterology, 106(3): 664-73.Ganem, D. (1996). Hepadnaviridae and their repli ation. In: Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley,P. M., Chano k, R. M., Melni k, J. L., Monath, T. P., Roizman, B., Strauss, S. E. (Ed.), FieldsVirology: 2703-2737, Philadelphia: Lipin ott-Raven Publishers.Ganem, D., Prin e, A. M. (2004). Hepatitis B virus infe tion - Natural history and lini al onsequen es. N Engl J Med, 350(11): 1118-29.Ganem, D., S hneider, R. J. (2001). The mole ular biology of hepatitis B viruses. In: Knipe,D., Howley, P. (Ed.), Fields Virology: vol.2, New York: 4th ed.Gilles, P. N., Fey, G., Chisari, F. V. (1992). Tumor ne rosis fa tor alpha negatively regulateshepatitis B virus gene expression in transgeni mi e. J Virol, 66(6): 3955-60.Glebe, D., Berting, A., Broehl, S., Naumann, H., S huster, R., Fiedler, N., Tolle,T. K., Nits he, S., Seifer, M., Gerli h, W. H., S haefer, S. (2001). Optimised onditionsfor the produ tion of hepatitis B virus from ell ulture. Intervirology, 44(6): 370-8.Gripon, P., Diot, C., Guguen-Guillouzo, C. (1993). Reprodu ible high level infe tion of ultured adult human hepato ytes by hepatitis B virus: e�e t of polyethylene gly ol on adsorptionand penetration. Virology, 192(2): 534-40.Gripon, P., Diot, C., Theze, N., Fourel, I., Loreal, O., Bre hot, C., Guguen-Guillouzo,C. (1988). Hepatitis B virus infe tion of adult human hepato ytes ultured in the presen e of di-methyl sulfoxide. J Virol, 62(11): 4136-43.Guha, C., Mohan, S., Roy-Chowdhury, N., Roy-Chowdhury, J. (2004). Cell ulture andanimal models of viral hepatitis. Part I: hepatitis B. Lab Anim (NY), 33(7): 37-46.

Literaturverzei hnis XXVIIGuidotti, L. G., Ando, K., Hobbs, M. V., Ishikawa, T., Runkel, L., S hreiber, R. D.,Chisari, F. V. (1994b). Cytotoxi T lympho ytes inhibit hepatitis B virus gene expression by anon ytolyti me hanism in transgeni mi e. Pro Natl A ad S i U S A, 91(9): 3764-8.Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (1999). Cytokine-indu ed viral purging�role in viral pathogenesis.Curr Opin Mi robiol, 2(4): 388-91.Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (2000). Cytokine-mediated ontrol of viral infe tions. Virology,273(2): 221-7.Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (2001). Non ytolyti ontrol of viral infe tions by the innateand adaptive immune response. Annu Rev Immunol, 19: 65-91.Guidotti, L. G., Guilhot, S., Chisari, F. V. (1994a). Interleukin-2 and alpha/beta interferondown-regulate hepatitis B virus gene expression in vivo by tumor ne rosis fa tor-dependent and-independent pathways. J Virol, 68(3): 1265-70.Guidotti, L. G., Ishikawa, T., Hobbs, M. V., Matzke, B., S hreiber, R., Chisari, F. V.(1996). Intra ellular ina tivation of the hepatitis B virus by ytotoxi T lympho ytes. Immunity,4(1): 25-36.Guidotti, L. G., Morris, A., Mendez, H., Ko h, R., Silverman, R. H., Williams, B. R.G., Chisari, F. V. (2002). Interferon-regulated pathways that ontrol hepatitis B virus repli ationin transgeni mi e. J Virol, 76(6): 2617-21.Guidotti, L. G., Ro hford, R., Chung, J., Shapiro, M., Pur ell, R., Chisari, F. V.(1999). Viral learan e without destru tion of infe ted ells during a ute HBV infe tion. S ien e,284(5415): 825-9.Guilhot, S., Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (1993). Interleukin-2 downregulates hepatitisB virus gene expression in transgeni mi e by a posttrans riptional me hanism. J Virol, 67(12):7444-9.Guo, J. T., Zhou, H., Liu, C., Aldri h, C., Saputelli, J., Whitaker, T., Barrasa, M.I., Mason, W. S., Seeger, C. (2000). Apoptosis and regeneration of hepato ytes during re overyfrom transient hepadnavirus infe tions. J Virol, 74(3): 1495-505.Hatzakis, A., Magiorkinis, E., Haida, C. (2006). HBV virologi al assessment. J Hepatol, 44(1Suppl): S71-6.Haynes, L. M., Moore, D. D., Kurt-Jones, E. A., Finberg, R. W., Anderson, L. J.,Tripp, R. A. (2001). Involvement of toll-like re eptor 4 in innate immunity to respiratory syn ytialvirus. J Virol, 75(22): 10730-7.Herbein, G., O'Brien, W. A. (2000). Tumor ne rosis fa tor (TNF)-alpha and TNF re eptors inviral pathogenesis. Pro So Exp Biol Med, 223(3): 241-57.Herkel, J., Jagemann, B., Wiegard, C., Lazaro, J. F. G., Lueth, S., Kanzler, S.,Blessing, M., S hmitt, E., Lohse, A. W. (2003). MHC lass II-expressing hepato ytes fun tionas antigen-presenting ells and a tivate spe i� CD4 T lympho yutes. Hepatology, 37(5): 1079-85.

Literaturverzei hnis XXVIIIHofs hneider, P. H., Zaslavsky, V., Deinhardt, F., Frosner, G. G., Alexander, J. J.(1979). Labeling of hepatitis B virus surfa e antigen (HBsAg) synthesized in a HBsAg-produ inghepatoma ell line. J Med Virol, 4(3): 171-5.Hollinger, F. B. (1996). Hepatitis B virus. In: Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M.,Chano k, R. M., Melni k, J. L., Monath, T. P., Roizman, B., Strauss, S. E. (Ed.), Fields Virology:2790-2806, Philadelphia: Lipin ott-Raven Publishers.Hollinger, F. B., Bell, B., Levy-Bruhl, D., Shouval, D., Wiersma, S., Van Damme, P.(2007). Hepatitis A and B va ination and publi health. J Viral Hepat, 14 Suppl 1: 1-5.Hollinger, F. B. (2007). Hepatitis B virus geneti diversity and its impa t on diagnosti assays.J Viral Hepat, 14 Suppl 1: 11-5.Hruska, J. F., Robinson, W. S. (1977). The proteins of hepatitis B Dane parti le ores. J MedVirol, 1(2): 119-31.Huang, C., Lin, S., Ho, Y., Chen, F., Yang, C. (2006). The immune response indu ed byhepatitis B virus prin ipal antigens. Cell Mol Immunol, 3(2): 97-106.Hultgren, C., Mili h, D. R., Weiland, O., Sallberg, M. (1998). The antiviral ompoundribavirin modulates the T helper (Th) 1/Th2 subset balan e in hepatitis B and C virus-spe i� immune responses. J Gen Virol, 79 ( Pt 10): 2381-91.Hwang, Y. K., Kim, N. K., Park, J. M., Lee, K. y., Han, W. K., Kim, H. I., Cheong, H.S. (2002). HLA-A2 1 restri ted peptides from the HBx antigen indu e spe i� CTL responses invitro and in vivo. Va ine, 20(31-32): 3770-7.In hauspe, G., Mi hel, M. L. (2007). Va ines and immunotherapies against hepatitis B andhepatitis C viruses. J Viral Hepat, 14 Suppl 1: 97-103.Inoue, M., Kakumu, S., Yoshioka, K., Tsutsumi, Y., Wakita, T., Arao, M. (1989). Hepati-tis B ore antigen-spe i� IFN-gamma produ tion of peripheral blood mononu lear ells in patientswith hroni hepatitis B virus infe tion. J Immunol, 142(11): 4006-11.Isogawa, M., Robek, M. D., Furui hi, Y., Chisari, F. V. (2005). Toll-like re eptor signalinginhibits hepatitis B virus repli ation in vivo. J Virol, 79(11): 7269-72.Jarrosson, L., Kolopp-Sarda, M. N., Aguilar, P., Bene, M. C., Lepori, M. L., Vignaud,M. C., Faure, G. C., Kohler, C. (2004). Most humoral non-responders to hepatitis B va inesdevelop HBV-spe i� ellular immune responses. Va ine, 22(27-28): 3789-96.Jin, Y., Shih, W. K., Berkower, I. (1988). Human T ell response to the surfa e antigen ofhepatitis B virus (HBsAg). Endosomal and nonendosomal pro essing pathways are a essible toboth endogenous and exogenous antigen. J Exp Med, 168(1): 293-306.Junker-Niepmann, M., Bartens hlager, R., S haller, H. (1990). A short is-a ting se-quen e is required for hepatitis B virus pregenome en apsidation and su� ient for pa kaging offoreign RNA. EMBO J, 9(10): 3389-96.

Literaturverzei hnis XXIXKakimi, K., Guidotti, L. G., Koezuka, Y., Chisari, F. V. (2000). Natural killer T ella tivation inhibits hepatitis B virus repli ation in vivo. J Exp Med, 192(7): 921-30.Kakumu, S., Ishikawa, T., Wakita, T., Yoshioka, K., Takayanagi, M., Tahara, H., Kusa-kabe, A. (1994). Interferon-gamma produ tion spe i� for hepatitis B virus antigen by intrahepati T lympho ytes in patients with a ute and hroni hepatitis B. Am J Gastroenterol, 89(1): 92-6.Kann, M., Gerli h, W. (1998). Hepadnaviridae: stru ture and mole ular virology. In: Zu kerman,A., Thomas, H. (Ed.), Viral hepatitis: 77-105, London: Chur hill Livingstone.Katsura, N., Ikai, I., Mitaka, T., Shiotani, T., Yamanoku hi, S., Sugimoto, S., Kana-zawa, A., Terajima, H., Mo hizuki, Y., Yamaoka, Y. (2002). Long-term ulture of primaryhuman hepato ytes with preservation of proliferative apa ity and di�erentiated fun tions. J SurgRes, 106(1): 115-23.Kawai, T., Akira, S. (2007). TLR signaling. Semin Immunol, 19(1): 24-32.Kimura, K., Kakimi, K., Wieland, S., Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (2002a). A tivatedintrahepati antigen-presenting ells inhibit hepatitis B virus repli ation in the liver of transgeni mi e. J Immunol, 169(9): 5188-95.Kimura, K., Kakimi, K., Wieland, S., Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (2002b). Interleukin-18 inhibits hepatitis B virus repli ation in the livers of transgeni mi e. J Virol, 76(21): 10702-7.Knolle, P. A., Gerken, G. (2000). Lo al ontrol of the immune response in the liver. ImmunolRev, 174: 21-34.Knolle, P. A., Limmer, A. (2003). Control of immune responses by savenger liver endothelial ells. Swiss Med Wkly, 133(37-38): 501-6.Ko k, J., Nassal, M., Ma Nelly, S., Baumert, T. F., Blum, H. E., von Weizsa ker, F.(2001). E� ient infe tion of primary tupaia hepato ytes with puri�ed human and woolly monkeyhepatitis B virus. J Virol, 75(11): 5084-9.Kramvis, A., Kew, M. C. (1999). The ore promoter of hepatitis B virus. J Viral Hepat, 6(6):415-27.Krugman, S., Giles, J. P., Hammond, J. (1971). Viral hepatitis, type B (MS-2 strain) preventionwith spe i� hepatitis B immune serum globulin. JAMA, 218(11): 1665-70.Krugman, S. (1975). Viral hepatitis type B: prope ts for a tive immunization. Dev Biol Stand,30: 363-7.Kurt-Jones, E. A., Popova, L., Kwinn, L., Haynes, L. M., Jones, L. P., Tripp, R. A.,Walsh, E. E., Freeman, M. W., Golenbo k, D. T., Anderson, L. J., Finberg, R. W.(2000). Pattern re ognition re eptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syn ytialvirus. Nat Immunol, 1(5): 398-401.Lander, J. J., Giles, J. P., Pur ell, R. H., Krugman, S. (1971). Viral hepatitis, type B(MS-2 strain). Dete tion of antibody after primary infe tion. N Engl J Med, 285(6): 303-7.Landers, T. A., Greenberg, H. B., Robinson, W. S. (1977). Stru ture of hepatitis B Daneparti le DNA and nature of the endogenous DNA polymerase rea tion. J Virol, 23(2): 368-76.

Literaturverzei hnis XXXLarsen, C. E., Xu, J., Lee, S., Dubey, D. P., Uko, G., Yunis, E. J., Alper, C. A. (2000).Complex ytokine responses to hepatitis B surfa e antigen and tetanus toxoid in responders, non-responders and subje ts naive to hepatitis B surfa e antigen. Va ine, 18(26): 3021-30.Lavine, J. E., Ganem, D. (1993). Inhibition of du k hepatitis B virus repli ation by interferon-gamma. J Med Virol, 40(1): 59-64.Lee, C., Gong, Y., Brok, J., Boxall, E. H., Gluud, C. (2006). E�e t of hepatitis B immu-nisation in newborn infants of mothers positive for hepatitis B surfa e antigen: systemati reviewand meta-analysis. BMJ, 332(7537): 328-36.Lee, M., Choi, Y., Shin, E., Kang, H., Kim, Y., Jeong, S., Seong, J. K., Yu, D., Cho,H., Park, J. H., Kim, S. J. (2002). Hepatitis B virus X protein indu ed expression of interleukin18 (IL-18): a potential me hanism for liver injury aused by hepatitis B virus (HBV) infe tion. JHepatol, 37(3): 380-6.Liu, M., Yu, M., Zhang, N., Gong, W., Wang, Y., Piao, W., Wang, Q., Wang, G. (2004).Dynami analysis of hepatitis B virus DNA and its antigens in 2.2.15 ells. J Viral Hepat, 11(2):124-9.Lobo-Yeo, A., Senaldi, G., Portmann, B., Mowat, A. P., Mieli-Vergani, G., Vergani,D. (1990). Class I and lass II major histo ompatibility omplex antigen expression on hepato ytes:a study in hildren with liver disease. Hepatology, 12(2): 224-32.Lott, L., Beames, B., Notvall, L., Lanford, R. E. (2000). Intera tion between hepatitis Bvirus ore protein and reverse trans riptase. J Virol, 74(24): 11479-89.Lu, X., Blo k, T. (2004). Study of the early steps of the Hepatitis B Virus life y le. Int J MedS i, 1(1): 21-33.Luerman, A. (1885). Eine i terus epidemi . Berlin Klin Wo hens hr, 22: 20-23.Ma Callum, F. O., M Farlan, A. M., Miles, J. A. R., Pollo k, M. R., Wilson, C.(1951). Infe tive hepatitis; studies in East Anglia during the period 1943-47. Spe Rep Ser Med ResCoun (G B), 273: 1-144.Ma Callum, F. O. (1953). Hepatitis. Br Med Bull, 9(3): 221-5.Magner, W. J., Kazim, A. L., Stewart, C., Romano, M. A., Catalano, G., Grande, C.,Keiser, N., Santaniello, F., Tomasi, T. B. (2000). A tivation of MHC lass I, II, and CD40gene expression by histone dea etylase inhibitors. J Immunol, 165(12): 7017-24.Man ini, M., Had houel, M., Tiollais, P., Mi hel, M. L. (1998). Regulation of hepatitis Bvirus mRNA expression in a hepatitis B surfa e antigen transgeni mouse model by IFN-gamma-se reting T ells after DNA-based immunization. J Immunol, 161(10): 5564-70.Manigold, T., Ra anelli, V. (2007). T- ell regulation by CD4 regulatory T ells during hepatitisB and C virus infe tions: fa ts and ontroversies. Lan et Infe t Dis, 7(12): 804-13.Mason, W. S., Seal, G., Summers, J. (1980). Virus of Pekin du ks with stru tural and biologi alrelatedness to human hepatitis B virus. J Virol, 36(3): 829-36.

Literaturverzei hnis XXXIM Aleer, W. J., Buynak, E. B., Maigetter, R. Z., Wampler, D. E., Miller, W. J.,Hilleman, M. R. (1984). Human hepatitis B va ine from re ombinant yeast. Nature, 307(5947):178-80.M Clary, H., Ko h, R., Chisari, F. V., Guidotti, L. G. (2000). Relative sensitivity ofhepatitis B virus and other hepatotropi viruses to the antiviral e�e ts of ytokines. J Virol, 74(5):2255-64.Menne, S., Cote, P. J. (2007). The wood hu k as an animal model for pathogenesis and therapyof hroni hepatitis B virus infe tion. World J Gastroenterol, 13(1): 104-24.Mili h, D. R., S hodel, F., Hughes, J. L., Jones, J. E., Peterson, D. L. (1997). Thehepatitis B virus ore and e antigens eli it di�erent Th ell subsets: antigen stru ture an a�e t Th ell phenotype. J Virol, 71(3): 2192-201.Mitry, R. R., Hughes, R. D., Dhawan, A. (2002). Progress in human hepato ytes: isolation, ulture ryopreservation. Semin Cell Dev Biol, 13(6): 463-7.Miyazaki, K., Takaki, R., Nakayama, F., Yamau hi, S., Koga, A., Todo, S. (1981). Isola-tion and primary ulture of adult human hepato ytes. Ultrastru tural and fun tional studies. CellTissue Res, 218(1): 13-21.Mizukoshi, E., Sidney, J., Livingston, B., Ghany, M., Hoofnagle, J. H., Sette, A.,Rehermann, B. (2004). Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. J Immunol,173(9): 5863-71.Modrow, S., Falke, D., Truyen, U. (2003). Molekulare Virologie, 2. Au�age, Heidelberg -Berlin: Spektrum Akademis her Verlag GmbH.Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. (2002). Regulatory elements of hepatitis B virus trans- ription. J Viral Hepat, 9(5): 323-31.Mu hmore, E. A. (2001). Chimpanzee models for human disease and immunobiology. ImmunolRev, 183: 86-93.Murakami, S. (2001). Hepatitis B virus X protein: a multifun tional viral regulator. J Gastroen-terol, 36(10): 651-60.Naito, M., Hasegawa, G., Ebe, Y., Yamamoto, T. (2004). Di�erentiation and fun tion ofKup�er ells. Med Ele tron Mi ros , 37(1): 16-28.Nassal, M. (2008). Hepatitis B viruses: reverse trans ription a di�erent way. Virus Res, 134(1-2):235-49.Nayersina, R., Fowler, P., Guilhot, S., Missale, G., Cerny, A., S hli ht, H. J., Vi-tiello, A., Chesnut, R., Person, J. L., Redeker, A. G., Chisari, F. V. (1993). HLA A2restri ted ytotoxi T lympho yte responses to multiple hepatitis B surfa e antigen epitopes duringhepatitis B virus infe tion. J Immunol, 150(10): 4659-71.Norder, H., Courou e, A., Coursaget, P., E hevarria, J. M., Lee, S., Mushahwar, I.K., Robertson, B. H., Lo arnini, S., Magnius, L. O. (2004). Geneti diversity of hepatitis

Literaturverzei hnis XXXIIB virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes. Intervirology,47(6): 289-309.NTHU (National Tsing Hua University) (2004). http://life.nthu.edu.tw/~b831626/HTML1.html (09.10.2008).Oko hi, K., Murakami, S. (1993). Observations on Australia antigen in Japanese. Vox Sang,65(1): 75.Ou, J. H. (1997). Mole ular biology of hepatitis B virus e antigen. J Gastroenterol Hepatol, 12(9-10): S178-87.Parvez, M., Sehgal, D., Sarin, S., Basir, S., Jameel, S. (2006). Inhibition of hepatitis Bvirus DNA repli ative intermediate forms by re ombinant interferon-gamma. World J Gastroenterol,12(19): 3006-14.Pasquetto, V., Wieland, S. F., Upri hard, S. L., Tripodi, M., Chisari, F. V. (2002).Cytokine-sensitive repli ation of hepatitis B virus in immortalized mouse hepato yte ultures. JVirol, 76(11): 5646-53.Penna, A., Chisari, F. V., Bertoletti, A., Missale, G., Fowler, P., Giuberti, T., Fia - adori, F., Ferrari, C. (1991). Cytotoxi T lympho ytes re ognize an HLA-A2-restri ted epitopewithin the hepatitis B virus nu leo apsid antigen. J Exp Med, 174(6): 1565-70.Penna, A., Fowler, P., Bertoletti, A., Guilhot, S., Moss, B., Margolskee, R. F.,Cavalli, A., Valli, A., Fia adori, F., Chisari, F. V. (1992). Hepatitis B virus (HBV)-spe i� ytotoxi T- ell (CTL) response in humans: hara terization of HLA lass II-restri tedCTLs that re ognize endogenously synthesized HBV envelope antigens. J Virol, 66(2): 1193-8.Perz, J. F., Armstrong, G. L., Farrington, L. A., Hutin, Y. J. F., Bell, B. P. (2006).The ontributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infe tions to irrhosis and primary liver an er worldwide. J Hepatol, 45(4): 529-38.Polla k, J. R., Ganem, D. (1994). Site-spe i� RNA binding by a hepatitis B virus reversetrans riptase initiates two distin t rea tions: RNA pa kaging and DNA synthesis. J Virol, 68(9):5579-87.Prin e, A. M., Brotman, B. (2001). Perspe tives on hepatitis B studies with himpanzees. ILARJ, 42(2): 85-8.Prin e, A. M. (1968a). An antigen dete ted in the blood during the in ubation period of serumhepatitis. Pro Natl A ad S i U S A, 60(3): 814-21.Prin e, A. M. (1968b). Relation of Australia and SH antigens. Lan et, 2(7565): 462-3.Protzer, U., S haller, H. (2000). Immune es ape by hepatitis B viruses. Virus Genes, 21(1-2):27-37.Ragazzini, F., Vieru i, A. (1970). Antigene Australia ed epatite virale. Folia Allergol (Roma),17(1): 1-9.

Literaturverzei hnis XXXIIIRandall, R. E., Goodbourn, S. (2008). Interferons and viruses: an interplay between indu tion,signalling, antiviral responses and virus ountermeasures. J Gen Virol, 89(Pt 1): 1-47.Rehermann, B., Nas imbeni, M. (2005). Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virusinfe tion. Nat Rev Immunol, 5(3): 215-29.Rehermann, B. (2007). Chroni infe tions with hepatotropi viruses: me hanisms of impairmentof ellular immune responses. Semin Liver Dis, 27(2): 152-60.Ren, F., Hino, K., Yamagu hi, Y., Funatsuki, K., Hayashi, A., Ishiko, H., Furutani,M., Yamasaki, T., Korenaga, K., Yamashita, S., Konishi, T., Okita, K. (2003). Cytokine-dependent anti-viral role of CD4-positive T ells in therapeuti va ination against hroni hepatitisB viral infe tion. J Med Virol, 71(3): 376-84.Ri o, M. A., Quiroga, J. A., Subira, D., Castanon, S., Esteban, J. M., Pardo, M.,Carreno, V. (2001). Hepatitis B virus-spe i� T- ell proliferation and ytokine se retion in hroni hepatitis B e antibody-positive patients treated with ribavirin and interferon alpha. Hepatology,33(1): 295-300.Rijntjes, P. J., Moshage, H. J., Yap, S. H. (1988). In vitro infe tion of primary ultures of ryopreserved adult human hepato ytes with hepatitis B virus. Virus Res, 10(1): 95-109.Riordan, S. M., Skinner, N., Kurtovi , J., Lo arnini, S., Visvanathan, K. (2006). Redu- ed expression of toll-like re eptor 2 on peripheral mono ytes in patients with hroni hepatitis B.Clin Va ine Immunol, 13(8): 972-4.Robert Ko h-Institut (2006). Zur Situation wi htiger Infektionskrankheiten in Deuts hland:Virushepatitis B, C und D im Jahr 2005. Epidem Bull, 46.Ryan, C. M., Carter, E. A., Jenkins, R. L., Sterling, L. M., Yarmush, M. L., Malt,R. A., Tompkins, R. G. (1993). Isolation and long-term ulture of human hepato ytes. Surgery,113(1): 48-54.Sakagu hi, S. (2005). Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T ells in im-munologi al toleran e to self and non-self. Nat Immunol, 6(4): 345-52.S hroeder, A. J., Blaheta, R. A., S holz, M., En ke, A., Markus, B. H. (1994). Isolationund Separation humaner adulter Hepatozyten aus Leberresektaten: Zellausbeute und Reinheit beiAnwendung vers hiedener Methoden. Zentralbl Chir, 119(2): 127-38.S hultz, U., Chisari, F. V. (1999). Re ombinant du k interferon gamma inhibits du k hepatitisB virus repli ation in primary hepato ytes. J Virol, 73(4): 3162-8.S hultz, U., Grga i , E., Nassal, M. (2004). Du k hepatitis B virus: an invaluable modelsystem for HBV infe tion. Adv Virus Res, 63: 1-70.S hulze-Bergkamen, H., Untergasser, A., Dax, A., Vogel, H., Bu hler, P., Klar,E., Lehnert, T., Friess, H., Bu hler, M. W., Kirs hfink, M., Stremmel, W., Kram-mer, P. H., Muller, M., Protzer, U. (2003). Primary human hepato ytes�a valuable tool forinvestigation of apoptosis and hepatitis B virus infe tion. J Hepatol, 38(6): 736-44.

Literaturverzei hnis XXXIVSells, M. A., Chen, M. L., A s, G. (1987). Produ tion of hepatitis B virus parti les in Hep G2 ells transfe ted with loned hepatitis B virus DNA. Pro Natl A ad S i U S A, 84(4): 1005-9.Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., A s, G. (1988). Repli ative intermediates ofhepatitis B virus in HepG2 ells that produ e infe tious virions. J Virol, 62(8): 2836-44.Servoss, J. C., Friedman, L. S. (2004). Serologi and mole ular diagnosis of hepatitis B virus.Clin Liver Dis, 8(2): 267-81.Sprengel, R., Kuhn, C., Will, H., S haller, H. (1985). Comparative sequen e analysis ofdu k and human hepatitis B virus genomes. J Med Virol, 15(4): 323-33.Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Ma h, B. (1994).Regulation of MHC lass II expression by interferon-gamma mediated by the transa tivator geneCIITA. S ien e, 265(5168): 106-9.Su, F., S hneider, R. J. (1997). Hepatitis B virus HBx protein sensitizes ells to apoptoti killingby tumor ne rosis fa tor alpha. Pro Natl A ad S i U S A, 94(16): 8744-9.Summers, J., Smole , J. M., Snyder, R. (1978). A virus similar to human hepatitis B virusasso iated with hepatitis and hepatoma in wood hu ks. Pro Natl A ad S i U S A, 75(9): 4533-7.Sun, D., Nassal, M. (2006). Stable HepG2- and Huh7-based human hepatoma ell lines for e� ientregulated expression of infe tious hepatitis B virus. J Hepatol, 45(5): 636-45.Suri, D., S hilling, R., Lopes, A. R., Mullerova, I., Colu i, G., Williams, R., Naou-mov, N. V. (2001). Non- ytolyti inhibition of hepatitis B virus repli ation in human hepato ytes.J Hepatol, 35(6): 790-7.Szabo, E., Paska, C., Kaposi Novak, P., S haff, Z., Kiss, A. (2004). Similarities and di�e-ren es in hepatitis B and C virus indu ed hepato ar inogenesis. Pathol On ol Res, 10(1): 5-11.Szmuness, W., Stevens, C. E., Harley, E. J., Zang, E. A., Oleszko, W. R., William, D.C., Sadovsky, R., Morrison, J. M., Kellner, A. (1980). Hepatitis B va ine: demonstrationof e� a y in a ontrolled lini al trial in a high-risk population in the United States. N Engl J Med,303(15): 833-41.Tang, H., Oishi, N., Kaneko, S., Murakami, S. (2006). Mole ular fun tions and biologi alroles of hepatitis B virus x protein. Can er S i, 97(10): 977-83.Taus h, U. (2005). Etablierung eines Modellsystems zur Infektion primärer humaner Hepatozytenmit dem Hepatitis B-Virus. Regensburg.Thimme, R., Wieland, S., Steiger, C., Ghrayeb, J., Reimann, K. A., Pur ell, R. H.,Chisari, F. V. (2003). CD8(+) T ells mediate viral learan e and disease pathogenesis duringa ute hepatitis B virus infe tion. J Virol, 77(1): 68-76.Thursz, M. (2001). Geneti sus eptibility in hroni viral hepatitis. Antiviral Res, 52(2): 113-6.Tiollais, P., Pour el, C., Dejean, A. (1985). The hepatitis B virus. Nature, 317(6037): 489-95.Valenzuela, P., Medina, A., Rutter, W. J., Ammerer, G., Hall, B. D. (1982). Synthesisand assembly of hepatitis B virus surfa e antigen parti les in yeast. Nature, 298(5872): 347-50.

Literaturverzei hnis XXXVValitutti, S., Muller, S., Dessing, M., Lanzave hia, A. (1996). Di�erent responses areeli ited in ytotoxi T lympho ytes by di�erent levels of T ell re eptor o upan y. J Exp Med,183(4): 1917-21.Valsamakis, A. (2007). Mole ular testing in the diagnosis and management of hroni hepatitisB. Clin Mi robiol Rev, 20(3): 426-39, table of ontents.van den Oord, J. J., de Vos, R., Desmet, V. J. (1986). In situ distribution of major histo- ompatibility omplex produ ts and viral antigens in hroni hepatitis B virus infe tion: eviden ethat HB - ontaining hepato ytes may express HLA-DR antigens. Hepatology, 6(5): 981-9.Vierling, J. M. (2007). The immunology of hepatitis B. Clin Liver Dis, 11(4): 727-59, vii-viii.Vingerhoets, J., Vanham, G., Kestens, L., Penne, G., Leroux-Roels, G., Gigase, P.(1994). De� ient T- ell responses in non-responders to hepatitis B va ination: absen e of TH1 y-tokine produ tion. Immunol Lett, 39(2): 163-8.Walewska-Ziele ka, B., Madalinski, K., Jablonska, J., Godzik, P., Ciele ka-Kuszyk,J., Litwinska, B. (2008). Composition of in�ammatory in�ltrate and its orrelation with HBV/HCVantigen expression. World J Gastroenterol, 14(25): 4040-6.Walter, E., Keist, R., Niederost, B., Pult, I., Blum, H. E. (1996). Hepatitis B virusinfe tion of tupaia hepato ytes in vitro and in vivo. Hepatology, 24(1): 1-5.Walter, J., Radun, D., Claus, H., Hamouda, O., Stark, K. (2005). Risikofaktoren derHepatitis B und C in Deuts hland�Ergebnisse der bundesweiten Surveillan e. Gesundheitswesen,67(7): 441-7.Waters, J. A., O'Rourke, S. M., Ri hardson, S. C., Papaevangelou, G., Thomas, H. C.(1987). Qualitative analysis of the humoral immune response to the 'a' determinant of HBs antigenafter ino ulation with plasma-derived or re ombinant va ine. J Med Virol, 21(2): 155-60.Weihrau h, M., von Bergwelt-Baildon, M., Kandi , M., Weskott, M., Klamp, W.,Rosler, J., S hultze, J. (2008). T ell responses to hepatitis B surfa e antigen are dete table innon-va inated individuals. World J Gastroenterol, 14(16): 2529-33.Weinberger, K. M., Wiedenmann, E., Bohm, S., Jilg, W. (2000). Sensitive and a uratequantitation of hepatitis B virus DNA using a kineti �uores en e dete tion system (TaqMan PCR).J Virol Methods, 85(1-2): 75-82.Weiss, L., Kekule, A. S., Jakubowski, U., Burgelt, E., Hofs hneider, P. H. (1996). TheHBV-produ ing ell line HepG2-4A5: a new in vitro system for studying the regulation of HBVrepli ation and for s reening anti-hepatitis B virus drugs. Virology, 216(1): 214-8.Wieland, S. F., Chisari, F. V. (2005). Stealth and unning: hepatitis B and hepatitis C viruses.J Virol, 79(15): 9369-80.Wieland, S. F., Eustaquio, A., Whitten-Bauer, C., Boyd, B., Chisari, F. V. (2005). Inter-feron prevents formation of repli ation- ompetent hepatitis B virus RNA- ontaining nu leo apsids.Pro Natl A ad S i U S A, 102(28): 9913-7.

Literaturverzei hnis XXXVIWieland, S. F., Guidotti, L. G., Chisari, F. V. (2000). Intrahepati indu tion of alpha/betainterferon eliminates viral RNA- ontaining apsids in hepatitis B virus transgeni mi e. J Virol,74(9): 4165-73.Wu, J., Lu, M., Meng, Z., Trippler, M., Broering, R., Sz zeponek, A., Krux, F., Ditt-mer, U., Roggendorf, M., Gerken, G., S hlaak, J. F. (2007). Toll-like re eptor-mediated ontrol of HBV repli ation by nonparen hymal liver ells in mi e. Hepatology, 46(6): 1769-78.Xu, D., Fu, J., Jin, L., Zhang, H., Zhou, C., Zou, Z., Zhao, J., Zhang, B., Shi, M., Ding,X., Tang, Z., Fu, Y., Wang, F. (2006). Cir ulating and liver resident CD4+CD25+ regulatoryT ells a tively in�uen e the antiviral immune response and disease progression in patients withhepatitis B. J Immunol, 177(1): 739-47.Yang, G., Liu, A., Xie, Q., Guo, T. B., Wan, B., Zhou, B., Zhang, J. Z. (2007). Asso iationof CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T ells with hroni a tivity and viral learan e in patients withhepatitis B. Int Immunol, 19(2): 133-40.Zu kerman, A. J. (2000). E�e t of hepatitis B virus mutants on e� a y of va ination. Lan et,355(9213): 1382-4.Zu kerman, J. N. (2007). Review: hepatitis B immune globulin for prevention of hepatitis Binfe tion. J Med Virol, 79(7): 919-21.

Publikationen XXXVIIPublikationenVortragRoehrl E., Bauer T., Boehm S., Weiss T. S., S hlitt H. J., Jilg W.: Impa t of va ine-indu edHBsAg-spe i� CD4+-T- ells on Hepatitis B-virus infe tion, GfV Jahrestagung, Mün hen 2006PosterRoehrl E., Bauer T., Weiss T. S., S hlitt H. J., Jilg W.: HBV-infe ted human hepato ytes as amodel to study antiviral e�e ts of immune e�e tor ells, 13th International Symposium on ViralHepatitis and Liver Disease, Washington 2009Roehrl E., Bauer T., Weiss T. S., S hlitt H. J., Jilg W.: In vitro HBV-infe tion of primary humanhepato ytes: antiviral e�e t of HBsAg-spe i� immune e�e tor ells, GfV Jahrestagung, Heidelberg2008Roehrl E., Messner A., Bauer T., Weiss T., S hlitt H., Jilg W.: Produ tion of viral RNA-trans riptsand viral proteins after hepatitis B virus (HBV) infe tion of primary human hepato ytes, 3rdEuropean Congress of Virology, Nürnberg 2007Roehrl E., Bauer T., Weiss T. S., S hlitt H. J., Jilg W.: Use of an in vitro infe tion model forHBV to study the antiviral e�e t of immune e�e tor ells, International Meeting on the Mole ularBiology of Hepatitis B Viruses, Rom 2007Roehrl E., Bauer T., Boehm S., Weiss T. S., S hlitt H. J., Jilg W.: Impa t of va ine-indu edHBsAg-spe i� CD4+-T- ells on in vitro hepatitis B-virus infe tion of primary human hepato ytes,12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Paris 2006PosterbeiträgeBoehm S., Roehrl E., Taus h U., S hlitt H. J., Weiss T. Jilg W.: The neutralising a tivity ofpoly lonal antibodies against hepatitis B surfa e antigen is signi� antly redu ed by intera tionswith subviral parti les, GfV Jahrestagung, Hannover 2005Boehm S., Taus h U., Roehrl E., Thasler W. E., S hlitt H. J., Weiss T. Jilg W.: In vitro repli ationof a lamivudine-resistant hepatitis B virus isolate with mutations within the ore-promoter region,3rd European Conferen e on Viral Diseases (ConVir), Regensburg 2004

Publikationen XXXVIIIBoehm S., Taus h U., Roehrl E., Thasler W. E., S hlitt H. J., Weiss T. Jilg W.: In vitro repli ationand phenotypi reversion of HBeAg-negative hepatitis B virus variants after infe tion of primaryhuman hepato ytes, GfV Jahrestagung, Tübingen 2004Boehm S., Taus h U., Roehrl E., Thasler W. E., Weiss T. Jilg W.: Primary human hepato yte ultures as a tool for determination of neutralizing a tivity of antibodies against di�erent hepatitisB virus isolates, Jahrestagung der Deuts hen Arbeitsgemeins haft zum Studium der Leber (GASL),Freiburg 2004Boehm S., Taus h U., Roehrl E., Thasler W. E., S hlitt H. J., Weiss T. Jilg W.: High in vitrorepli ative a tivity of lamivudine-resistant hepatitis B virus isolate after infe tion of primary humanhepato ytes, International HBV Meeting, The Mole ular Biology of Hepatitis B Virus, Bergamo2003Taus h U., Bauer T., Boehm S., Roehrl E., Thasler W. E., S hlitt H. J., Weiss T. Jilg W.: Cytokine-mediated non- ytolyti inhibition of in vitro hepatitis B virus infe tion of primary human hepato- ytes, International HBV Meeting, The Mole ular Biology of Hepatitis B Virus, Bergamo 2003