Das her-2/neu-Protoonkogen aufChromosom 17q21 kodiert für ein Re-zeptorprotein mit einem Molekularge-wicht von 185.000 mit intrinsischer Ty-rosinkinaseaktivität aus der EGF-Re-zeptor-Familie [22]. Unter physiologi-schen Zuständen wird das Protein inEpithelien von Mamma, Ovar, Endome-trium, Lunge, Gastrointestinaltrakt undNiere sowie im Gehirn exprimiert [15].Als Rezeptor für den epidermalen Wachs-tumsfaktor (EGF) und TGF-a wird demHER-2/NEU eine wichtige Rolle bei derÜbermittlung von Signalen zur Prolife-ration und Differenzierung zugeordnet[12]. Aber auch ohne passenden Ligan-den kann dieser Signalweg über die Aus-bildung von Homodimeren des trans-membranösen Rezeptoranteils aktiviertwerden [6].
In Mamma- und Ovarialkarzino-men konnte bei einer Überexpressiondes her-2/neu-Onkogens ein negativerEinfluss auf die Überlebensrate und dasrezidivfreie Intervall nachgewiesen wer-den [20].Untersuchungen an Kopf-Hals-Karzinomen konnten ebenfalls in unter-schiedlicher Frequenz eine Überexpres-sion zeigen, in einigen Studien wurdezudem ein Einfluss auf die Prognosenachgewiesen (Tabelle 1) [2, 3, 4, 8, 10, 27,28].
Was den genauen Zusammenhangzwischen dem her-2/neu-Status und derPrognose einiger Tumoren angeht, sokamen Untersuchungen an nichtklein-zelligen Lungenkarzinomen zu dem Er-gebnis, dass eine Überexpression vonher-2/neu mit einem höheren Tumorsta-dium und Lymphknotenbefall assoziiertist [11]. Des Weiteren wurde von mehre-ren Arbeitsgruppen eine verringerte An-sprechrate auf bestimmte Chemothera-peutika bei her-2/neu-Überexpressionfür die schlechtere Prognose bei Mam-
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M. Scheer1 · W. Prange2 · K. Petmecky2 · P. Schirmacher2 · J. E. Zöller1 · A. C. Kübler1
1Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie, Universität zu Köln2Institut für Pathologie, Universität zu Köln
Diese Arbeit wurde durch die Universität im Rahmen des Köln Fortune Programmsunterstützt (5/1998)
Dr. M. ScheerKlinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie,Universität zu Köln,Joseph-Stelzmann-Straße 9, 50935 Köln Tel.: 0221-4785791, Fax: 0221-4787360,E-mail: [email protected]
Zusammenfassung
Einleitung: Das her-2/neu-Protoonkogen ko-diert für eine Rezeptortyrosinkinase mit Ho-mologie zum epidermalen Wachstumsfaktor(EGFR). Bislang konnte für dieses Onkogenbei Mamma- und Ovarialkarzinomen eineprognostische und prädiktive Wertigkeitnachgewiesen werden. Ziel dieser Untersu-chung war es, den Einfluss einer her-2/neu-Überexpression auf das tumorfreie sowie aufdas Gesamtüberleben von Patienten mit ora-len Plattenepithelkarzinomen zu analysie-ren.Material und Methode: Für die immunhis-tochemische Untersuchung wurden derpolyklonale Antikörper A0485 (Dako) ver-wendet, und entsprechend der Intensitätund dem Anteil der gefärbten Tumorzellenwurde ein Score zwischen 0 und 3+ verge-ben. Als Überexpression wurden ein Scorevon 2+ und 3+ gewertet. Die FISH-Analysewurde mit 2 direkt markierten Sonden (LSIher-2/neu Spektrum orange und CEP17Spektrum grün,Vysis) durchgeführt. Lag dasSignalverhältnis von her-2/neu zu Chromo-som 17 >2, wurde von einer Amplifikationausgegangen.Ergebnisse: In 11 von insgesamt 97 Biopsien(11,3%) konnte eine Überexpression (Score2+ und 3+) nachgewiesen werden. Bei 42 mit FISH untersuchten Biopsien war in 14 Fällen eine Amplifikation nachweisbar.Bei 28 Biopsien lag das Verhältnis von her-2/neu- zu Chromosom-17-Signalen unterhalbvon 2. In 36 von 42 Fällen (86%) war eineÜbereinstimmung zwischen Immunhisto-chemie und FISH zu verzeichnen.Weder imVergleich mit den pathohistologischen Da-ten noch mit dem tumorfreien oder Gesamt-
überleben konnte eine Korrelation mit demher-2/neu-Status nachgewiesen werden.Diskussion: Es lässt sich eine Überexpressiondes her-2/neu-Protoonkogens in einem Teilder oralen Plattenepithelkarzinome nach-weisen. Die prognostische Wertigkeit im Hin-blick auf das tumorfreie oder Gesamtüberle-ben ist jedoch fraglich. Inwieweit der her-2/neu-Status eine prädiktive Relevanz bei deradjuvanten Therapie besitzt, müssen weitereStudien klären.
M. Scheer · W. Prange · K. Petmecky · P. Schirmacher · J. E. Zöller · A. C. Kübler
Evaluation of her-2/neuamplification/overexpression in OSCC with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry
Abstract
Introduction: The human epidermal growthfactor receptor (her-2/neu) protooncogeneencodes a membrane tyrosine kinase withhomology to the epidermal growth factorreceptor (EGFR). Amplification and proteinoverexpression have been identified in vari-ous solid tumors and a significant associa-tion with poor clinical outcome was report-ed.This investigation was performed to as-sess the frequency of her-2/neu overexpres-sion and to compare these results with clini-cal outcome in OSCC.Material and methods: Archival biopsyspecimens from 97 untreated OSCCs wereevaluated using a polyclonal antibody A0485(Dako). Only membrane staining intensityand pattern were evaluated according to theguidelines of the clinical trial assay recom-mendations (0–3+) for breast carcinoma.Score 0 and 1+ were interpreted as negativefor HER-2/NEU protein overexpression and2+ and 3+ as positive. FISH analysis with di-rectly labeled probes for her-2/neu and chro-mosome 17 was performed on the samespecimens.The ratio between her-2/neu andchromosome 17 signals was calculated afterselection of 20–40 non-overlapping tumorcells.The tumor was considered amplified ifthe ratio was above 2.Results: In 11 out of 97 biopsies (11.3%)membranous overexpression (score 2+ and3+) of her-2/neu was shown by immunohis-tochemistry. FISH analysis in 42 cases re-vealed amplification in 14 cases. Concor-dance between immunohistochemistry andFISH was found in 86%. Clinical-pathologicaldata as well as survival revealed no correla-tion with her-2/neu status.Discussion: In spite of missing correlationbetween survival and her-2/neu overexpres-sion in our study, the predictive value of theher-2/neu protooncogene in adjuvant thera-py in OSCC needs further investigation.
Keywords
Oral cancer · Overexpression · Amplification ·Prognosis
Zur Analyse des her-2/neu-Statussind die Immunhistochemie und dieFluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH) als Methoden akzeptiert. BeideVerfahren ermöglichen die Untersu-chung geringer Mengen von formalinfi-xiertem, paraffineingebettetem Materi-al bei erhaltener Zellmorphologie.
Insbesondere als Testverfahren voreiner geplanten Therapie mit Trastu-zumab (Hercerptin®), einem monoklo-nalen Antikörper, der gegen das HER-2/NEU-Protein gerichtet ist, hat die Im-munhistochemie als einfaches Verfahrenzur Beurteilung des her-2/neu-Status ei-ne große Bedeutung erlangt. Aufgrundder Variabilität der Resultate, bedingtdurch unterschiedliche Antikörper undTechniken zur Gewebefixierung, wurdevon der FDA ein semiquantitatives im-munhistochemisches Testkit vor Her-ceptintherapie bei Mammakarzinomenzugelassen (Hercep-Test®) [5]. Als auf-wändigeres und kostenintensiveres Ver-fahren wird die Fluoreszenz-in-situ-Hy-bridisierung (FISH) für die Bestimmungdes her-2/neu-Status in der klinischenRoutine überwiegend bei fraglich über-exprimierten Fällen (2+) eingesetzt. DerVorteil dieser Methode gegenüber derImmunhistochemie ist die einfachereQuantifizierung der Signale. Bezüglichder Übereinstimmung zwischen diesenbeiden Verfahren wurden bei Mamma-karzinomen Werte um 90% erzielt [18].
Bei Kopf-Hals-Tumoren wurden bis-lang die her-2/neu-Überexpression und-Genamplifikation noch nicht systema-tisch miteinander verglichen.
Insbesondere die semiquantitativeAnalyse der her-2/neu-Überexpressionmittels eines standardisierten immun-histochemischen Nachweises (Hercep-Test®) wurde bislang bei Mundhöhlen-karzinomen noch nicht durchgeführt.
Ziel der Untersuchung war es, ne-ben der Häufigkeit einer her-2/neu-Überexpression, den möglichen Zu-sammenhang von Überexpression undAmplifikation in primären Plattenepi-thelkarzinomen der Mundhöhle zu be-stimmen, sowie mögliche Korrelationenmit bekannten klinischen Prognosepa-rametern zu identifizieren.
Material und Methode
Tumorgewebe
Im Rahmen dieser Untersuchung wurdein Formalin fixiertes und in Paraffin ein-gebettetes Material untersucht, das zwi-schen 1995 und 2002 als Probebiopsieentnommen worden war. Dabei wurdennur primäre Plattenepithelkarzinomeder Mundhöhle und des Oropharynxeingeschlossen.Bei Patienten,die mittelseiner kombinierten präoperativen Ra-diochemotherapie behandelt wordenwaren und sich danach einer kurativenintendierten Resektion unterzogen,wur-de der Anteil an vitalen Tumorzellen imResektat an den Hämatoxylin-Eosin-ge-färbten Schnitten geschätzt. Ein Anteilvon <5% vitalen Zellen wurde als nega-tiv gewertet.
Klinische Daten
Klinische und Follow-up-Daten der ein-geschlossenen Patienten wurden ausden Krankenunterlagen entnommen.Die Einteilung der Tumoren wurde ge-mäß den Richtlinien der UICC undAJCC vorgenommen [21]. Bei allen Pa-tienten wurde im Rahmen einer Probe-biopsie Gewebe zur histopathologischenAufarbeitung entnommen und von 2 er-fahrenen Histopathologen untersucht.
Immunhistochemische Färbungen (IHC)
Die immunhistochemische Untersu-chung der HER-2/NEU-Protein-Expres-sion wurde mittels Hercep-Test® (Dako,Hamburg) gemäß der Angaben des Her-stellers durchgeführt.Für die Färbungenwurden 4 mm dicke Schnitte auf silani-sierte Objektträger aufgebracht undmittels Xylol 2-mal 5 min lang entparaf-finiert sowie in einer absteigenden Al-koholreihe rehydriert.Anschließend wur-den die Schnitte einer Behandlung mit95°C warmer 0,01-molarer Zitratlösung(pH 6,0) für 40 min im Wasserbadunterzogen. Nach Abkühlung erfolgtedie Inkubation mit einer Lösung beste-hend aus 3% H2O2 und 15 mmol/l Natri-umazid für 5 min zur Blockade der endo-genen Peroxidase. Nachfolgend wurdeder polyklonale HER-2/NEU-Antikör-per A0485 (Verdünnung 1:1000, Dako)für 30 min aufgebracht. Im Anschluss da-ran wurden die Objektträger mit 100 ml
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des HRP-konjugierten Sekundäranti-körpers für weitere 30 min überschich-tet. Zwischen den einzelnen Inkuba-tionsschritten wurden die Objektträgermit TRIS-Puffer gespült.Als Chromogenwurden 100 ml Diaminobenzidinlösung(DAB) für 10 min aufgetragen, bevor ei-ne Gegenfärbung mit Hämatoxylindurchgeführt und die Präparate einge-deckt wurden.
Interpretation der Färbungen
Für die Beurteilung der her-2/neu-Ex-pression wurde gemäß den Empfehlun-gen zur Interpretation des Hercep-Testsfür Mammakarzinome nur die membra-näre Anfärbung berücksichtigt.
Die Einteilung in die entsprechen-den Scores wurde durch zwei erfahrenePathologen (W.P., P.S.) ohne Kenntnisdes klinischen Verlaufs vorgenommen.Dabei wurden mehrere repräsentativeGesichtsfelder bei 20- bis 40-facher Ver-größerung nach den in Tabelle 2 darge-stellten Kriterien ausgewertet.
Nur Präparate, in denen eine schwa-che bis starke komplette membranäreAnfärbung erkennbar war (Score 2+und 3+), wurden als überexprimiert ge-wertet (Abb. 1).
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Für die FISH-Analyse wurden 4 mm di-cke Schnitte auf Poly-L-Lysin-beschich-teten Objektträgern (SuperFrost Plus®)aufgezogen und anschließend für 30–
60 min bei 60°C und für 2-mal 10 minin Xylol entparaffiniert. Nach Rehydrie-rung in absteigender Alkoholreihe (100%,80% und 70%) für je 5 min wurden diePräparate für 20 min mit 0,2 N HCl be-handelt und anschließend für 3 min mit2-mal SSC (pH 7,0) gespült. Zum chemi-schen Verdau wurden die Objektträgereiner 30-minütigen Behandlung mit Na-triumisothiozyanat im 80°C-Wasserbadunterzogen. Der enzymatische Verdauwurde für 35–50 min im Wasserbad bei37°C in einer Proteaselösung (1500 U/ml) bei pH 2 durchgeführt. Anschlie-ßend erfolgte eine Behandlung für 2-mal5 min mit 2-mal SSC, bevor 10 ml Hybri-disierungslösung, bestehend aus denfluoreszenzmarkierten DNA-Sonden fürdie her-2/neu-Region (LSI® her-2/neu,Spektrum orange) und das Chromosom17 (CEP 17®,Spektrum grün) aufgetragenwurden. Die Objektträger wurden miteinem Deckglas und Fixogum (Mara-bou) eingedeckt. Die Denaturierungund anschließende Hybridisierung wur-
den in einem programmierbaren Ther-mocycler (Hybrite®,Vysis) für 5 min bei72°C bzw. für 24 h bei 37°C vorgenom-men. Am darauffolgenden Tag wurdendas Fixogum und das Deckglas entferntund die Objektträger erst bei Raumtem-peratur und danach für 2 min im 72°C-Wasserbad mit 2-mal SSC/0,3% NP-40(Vysis) gewaschen. Nach Trocknungwurden die Präparate mit 10 ml DAPI(Vysis) eingedeckt und bis zur Auswer-tung bei –20°C dunkel gelagert.
Auswertung der FISH-Präparate
Zur mikroskopischen Auswertung wurdeein Leitz Aristoplan Mikroskop mit 100 WHBO-Licht, CCD-Kamera (Sensys®, Photo-metrics) und einem automatischen Filter-wechsler mit Filtereinsätzen für DAPI,Spektrum grün und Spektrum orangeeingesetzt. Über einen angeschlossenenPower Macintosh G3® (Apple) mit derSoftware IPLab Spektrum (Vysis) wur-den die Befunde dokumentiert.
Tabelle 1her-2/neu Amplifikation und -Überexpression in Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region
Quelle Anzahl Methoden Überexprimierte Amplifizierte Einfluss auf Prognose(n) Fälle [%] Fälle [%]
Craven et al. [3], 1992 93 IHC 38 (41) Kein Einfluss auf Tumorprogression oder ÜberlebenField et al. [4], 1992 75 IHC 45a (60) Keine Korrelation zwischen Expression, klinischen Parametern oder
ÜberlebenKrecicki et al. [10], 1999 154 IHC 81 (53) Keine Korrelation mit ÜberlebenXia et al. [28], 1999 111 IHC 18 (16) Überexpression korreliert mit Lymphknotenmetastasen und
verkürztem GesamtüberlebenWerkmeister et al. [27], 2000 110 PCR 27 (25) Verkürztes tumorfreies ÜberlebenCharoenrat et al. [2], 2002 54 RT-PCR 25 (46) Korrelation mit Invasion, Lymphknotenbeteiligung und kürzerem
Überleben (univariat)Khan et al. [8], 2002 67 IHC 12 (17) 4 (25) Kein Einfluss auf tumorfreies Überleben oder Gesamtüberleben
16 FISH
aNur zytoplasmatische, keine membranäre Anfärbung
Tabelle 2Auswertungskriterien für Hercep-Score
Färbemuster her-2/neu- ScoreÜberexpression
Keine oder nur geringe membranäre Anfärbung in weniger als 10% Negativ 0der Tumorzellen Inkomplette membranäre Färbung in mehr als 10% der Tumorzellen Negativ 1+Schwache bis mäßige komplette membranäre Anfärbung in mehr als Positiv 2+10% der Tumorzellen Starke, komplette membranäre Färbung in mehr als 10% der Zellen Positiv 3+
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Unter Übersichtsvergrößerung wur-den mit Hilfe des DAPI-Filters Tumor-zellareale identifiziert.Bei 630-facher bis1000-facher Vergrößerung (Öl) wurdendie Fluoreszenzsignale von 20–40 Tu-morzellen in 3 verschiedenen Schnittre-gionen ausgezählt. Dabei wurden nurZellkerne ausgewertet, die keine Über-lappungen mit anderen zeigten, voll-ständig waren und klare Kerngrenzenerkennen ließen.Aus den gezählten Sig-nalen für her-2/neu und das Chromo-som 17 wurde ein Quotient errechnet.Ein Quotient von her-2/neu- zu Chro-mosom-17-Signalen von >2 wurde alsAmplifikation gewertet
Statistische Auswertung
Die Zielkriterien zur Prognose des Patien-tenkollektivs waren tumorfreies Überle-ben und Gesamtüberleben. Die Überle-benskurven wurden nach der Kaplan-Meier-Methode erstellt. Dabei wurde derLog-rank-Test zur Unterscheidung zwi-schen den verschiedenen Gruppen be-
nutzt. Für eine bivariate Analyse zwischenden klinisch-pathologischen Parameternund der her-2/neu-Überexpression bzw.-Amplifikation wurde der Korrelations-koeffizient nach Spearmen-Rho berech-net.Alle angegeben p-Werte beziehen sichauf eine zweiseitige Irrtumswahrschein-lichkeit von 0,05. Die statistischen Berech-nungen wurden mit dem Statistikpro-gramm SPSS,Version 10.0.7, durchgeführt.
Ergebnisse
Patienten
In die Untersuchung wurde formalinfi-xiertes Biopsiematerial von 97 Patienteneingeschlossen, die zwischen März 1995und Oktober 2001 wegen eines Platten-epithelkarzinoms der Mundhöhle behan-delt wurden und von denen ausreichendGewebe zur Verfügung stand. Die Häu-figkeitsverteilung der klinisch-patholo-gischen Parameter der 97 Patienten undderen Einfluss auf das Gesamtüberlebensind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Es wurden überwiegend Biopsienvon fortgeschritteneren Tumoren desUICC-Stadiums III/IV gegenüber I/IIanalysiert (65% vs. 35%). Bei 38 Patien-ten (39,2%) lagen Lymphknotenmetas-tasen vor. Die pathohistologische Unter-suchung der Biopsien in Hinblick aufden Differenzierungsgrad ergab über-wiegend mäßig und schlecht differen-zierte Tumoren [GII 75 Biopsien (77,3%),GIII 19 Biopsien (19,6%)].
Tumoren mit einer Tumorgröße T2–T4 wurden kombiniert mittels ei-ner neoadjuvanten Radiochemothera-pie, bestehend aus Carboplatin 70 mg/m2 Körperoberfläche in der ersten Be-handlungswoche und 39,6 Gy Radiatio(1,8 Gy Einzeldosis) über 4 Wochen be-handelt. 2–3 Wochen nach Ende derTherapie wurde eine kurativ intendier-te Tumorresektion mit Lymphkno-tenentfernung den präoperativ mit-tels Tuschetätowierung festgelegten Grenzen (1 cm Abstand der Tätowierungzum palpablen Tumorrand) durchge-führt.
Abb. 1 � her-2/neu-Überexpression in OSCC, Bewertungssystem der immunhistochemischen Färbungen
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Bei 4 Patienten wurde aufgrund derInoperabilität des Tumors eine Radio-chemotherapie, bestehend aus wöchent-lichen Gaben von Carboplatin und Pa-clitaxel kombiniert mit einer 7-wöchi-gen Strahlentherapie (Gesamtdosis etwa72 Gy), vorgenommen.
Im Beobachtungszeitraum tratenbei 31 Patienten (32%) lokoregionäre Re-zidive auf, bei 5 (5,2%) Patienten wurdenZweittumoren diagnostiziert. Die mitt-lere tumorfreie Überlebenszeit betrug11,5±2,0 Monate. Insgesamt verstarbenim Beobachtungszeitraum 29 Patienten(29,9%) an den Folgen ihrer Tumorer-krankung.
Die univariate Analyse der klini-schen und pathohistologischen Datender Patienten im Hinblick auf einen Ein-fluss auf das Gesamtüberleben ergabsignifikante Werte bei dem Halslymph-knotenbefall (N+ vs. N–, p=0,04) undUICC-Stadium (Stadien I/II vs. III/IV,p=0,03) (Tabelle 3).
Weiterhin zeigte sich bei der iso-lierten Betrachtung der neoadjuvant be-handelten Patienten (n=83), in deren Re-sektat keine vitalen Tumorzellen mehrnachgewiesen werden konnten, eine signifikant längere Überlebenszeit (p=0,04) (Abb. 2).
Immunhistologie
Die Auswertung der immunhistochemi-schen Färbungen (Tabelle 4) ergab einemembranäre Anfärbung (Score 1+, 2+und 3+) in 32 der untersuchten Biopsien(32,9%). Im Sinn einer Überexpressionwurden jedoch nur die Biopsien gewertet,bei denen eine komplette membranäreAnfärbung in mehr als 10% der Tumor-zellen zu erkennen war. Dies war in 11 von97 Biopsien (11,3%) der Fall. In 65 Biop-sien (67%) konnte keine membranäre Ex-pression nachgewiesen werden.
Die statistische Analyse im Hinblickauf eine Korrelation von klinisch-pa-thologischen Variablen und einer her-2/
neu-Überexpression ergab keine signi-fikante Assoziation mit Geschlecht,Alter, Grading, T-Stadium, N-Stadium,Lymphknotenkapseldurchbruch,Lymph-angiosis carcinomatosa oder vitalen Tu-morzellen im Resektat nach Radioche-motherapie (Tabelle 5).
Bezogen auf das tumorfreie und dasGesamtüberleben war kein Einfluss ei-ner her-2/neu-Überexpression im Log-rank-Test nachweisbar (p=0,35 bzw. p=0,97).
FISH-Ergebnisse
In 42 Biopsien wurde eine FISH-Analy-se (Abb. 3) auf Amplifikation des her-2/neu-Protoonkogens durchgeführt (Ta-belle 4).
Die Auswertung erbrachte eine Am-plifikation mit einem Signalverhältniszwischen her-2/neu- zu Chromosom-17-Signalen >2 in 14 Fällen (33%). In 28Biopsien (67%) lag keine Amplifikationvor.
Im Vergleich der immunhistoche-mischen Ergebnisse mit den Daten ausder FISH-Analyse (Tabelle 6) zeigte sichin allen 8 überexprimierten Fällen aucheine Amplifikation. In 6 Fällen ohneher-2/neu-Überexpression konnte je-doch ebenfalls eine Amplifikation nach-gewiesen werden. Von diesen 6 Fällenzeigten 5 Biopsien einen Score 0. Ledig-lich 1 Fall ließ ein Score 1+ erkennen.Zusammengenommen war in 36 Fällen(86%) sowohl mit den immunhistoche-misch als auch den mit FISH untersuch-ten Biopsien eine Übereinstimmung derbeiden Techniken zu verzeichnen.
Im Hinblick auf die klinisch-patho-logischen Parameter ergab sich keine
Tabelle 3Klinischen Daten und univariateAnalyse bezüglich eines Einflussesauf das Gesamtüberleben
aDer Unterschied der Überlebenszeit wurde fürPatienten unter 56 Jahren vs. über 56 JahrenberechnetbDie T-Stadien 1 und 2 wurden den Stadien 3und 4 gegenübergestelltcZur Berechnung wurden N1 und N2 zu N+ zu-sammengefasstdDie UICC-Stadien I/II wurden mit den StadienIII/IV verglichen*Statistisch signifikanter Wert
Abb. 2 � Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für alle neoadjuvant behandelten Pa-
tienten (n=83) mit und ohne vitale Tumor-zellen im Resektat
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signifikante Korrelation mit den FISH-Resultaten (Tabelle 5).
Auch ließ sich im Log-rank-Testkein Einfluss auf das tumorfreie oderGesamtüberleben nachweisen (p=0,24bzw. 0,26).
Diskussion
Die Ergebnisse der vorliegenden Unter-suchung zeigen, dass eine her-2/neu-Überexpression mittels Hercep-Test inoralen Plattenepithelkarzinomen nur in11% der untersuchten Biopsien nach-weisbar war. Somit ist dieses Protoonko-gen in einem kleinen Anteil oraler Plat-tenepithelkarzinome überexprimiert.Daten aus anderen Untersuchungen anKopf-Hals-Karzinomen zeigten Überex-pressionsraten von 16–53% [3, 8, 10, 28].Als Ursache kommen überwiegend me-thodische Ursachen bei der Gewebevor-bereitung, Färbung und Auswertung inFrage. Da bei der Mehrzahl der Studienformalinfixiertes Archivmaterial unter-sucht wurde, muss vor Anwendung desPrimärantikörpers eine Demaskierungdes Epitops (HER-2/NEU) erfolgen.Ver-gleichende Untersuchungen von Press etal. [17] konnten bei Biopsien von Mam-makarzinomen unterschiedliche Sensi-tivitätsraten in Abhängigkeit von derverwendeten Technik zum „antigen re-trieval“ nachweisen.Auch zeigte Frisch-material deutlich höhere Positivitätsra-ten bei der her-2/neu-Überexpressionals formalinfixiertes Gewebe vom glei-chen Tumor [17]. Neben der Gewebevor-behandlung scheinen auch die Sensiti-vität und Spezifität verschiedener kom-merziell erhältlicher HER-2/NEU-Anti-körper der Grund für die variierendenÜberexpressionsraten bei Mammakar-
zinomen zu sein [13, 17]. Im Gegensatzzu den anderen Untersuchungen anKopf-Hals-Tumoren wurde erstmals derpolyklonale Antikörper A0485 (Dako)eingesetzt, sodass kein direkter Ver-gleich möglich ist. Auch ist die Bewer-tung immunhistochemischer Schnittesubjektiven Einflüssen unterworfen, diedurch die Heterogenität im Tumor zu-sätzlich die Einordnung erschweren [3].Im Gegensatz zu anderen Arbeitsgrup-pen, die eine zytoplasmatische Färbungals positiv werteten [1, 4], wurde in dervorliegenden Studie nur eine komplettemembranäre Färbung in mehr als 10%der Tumorzellen als Überexpression an-gesehen, da Untersuchungen an Mam-makarzinomen nur bei diesem Expres-sionsmuster eine Korrelation mit derGenamplifikation des her-2/neu-Onko-gens nachweisen konnten [23]. Zur Er-gänzung der Immunhistochemie wirdseit einiger Zeit auch die Durchführungder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH) favorisiert [18]. Bei Kopf-Hals-Karzinomen wurde bislang erst in einer
Studie ergänzend zur Immunhistochmiedie FISH-Analyse durchgeführt. In derUntersuchung von Khan et al. [8] wurdemittels FISH-Untersuchung in 4 von 19Fällen eine Amplifikation nachgewiesen.In der vorliegenden Studie wurde dieFISH-Untersuchung bei 42 Patienten an-gewandt, von denen 14 eine Amplifika-tion aufwiesen. Bezüglich der Überein-stimmung zwischen Immunhistochemieund FISH zeigte sich in dieser Studie,dass in 8 Fällen eine Amplifikation inder FISH nachzuweisen war, ohne dasseine Überexpression in der Immunhis-tochemie dargestellt werden konnte.AlsGrund kommen prinzipiell 2 Erklärun-gen in Frage:
1. Eine Vermehrung der Genkopien muss nichtzwingend mit einer Überexpression an derZelloberfläche einhergehen, da posttransla-tionale und posttranskriptionale Vorgängein der Zelle zu einer Veränderung des Pro-teinprodukts führen können.
2. Neben längeren Fixierungszeiten in unge-puffertem Formalin, die eine Quervernet-zung des HER-2/NEU-Rezeptors zur Folgehaben, können auch erhöhte Temperaturenbei der Paraffineinbettung zu einem Verlustder HER-2/NEU-Antigenität führen [13].
Umfangreiche Untersuchungen anMammakarzinomen zeigten Überein-stimmungsraten zwischen Immunhisto-chemie und FISH um 90% [26].
Im Hinblick auf eine prognostischeRelevanz bei Mundhöhlenkarzinomenkonnte weder beim Vergleich mit denklinisch-pathologischen Daten noch mitdem Überleben eine Korrelation zumher-2/neu-Status gefunden werden. Die-se Beobachtung deckt sich auch mit denErgebnissen anderer Arbeitsgruppen [3,
Tabelle 4Ergebnisse der Immunhistochemie (IHC) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)
Ratio her-2/neu- zu Chromosom-17-Signalen (n=42)<2 (Bereich: 1–1,9) 28 66,7>2 (Bereich: 2,1–4,6) 14 33,3 Amplifikation
Tabelle 5Korrelation (Spearman-Rho) der klinisch-pathologischen Parameter mit den Ergebnissen der IHC und FISH für her-2/neu-Überexpression bzw. -Amplifikation
4, 8, 10]. Dennoch bleibt zu berücksich-tigen, dass alle Studien an Plattenepi-thelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichsrecht kleine Fallzahlen im Vergleich zuden Untersuchungen beim Mammakar-zinom aufwiesen [8].Auch erscheint vordem Hintergrund der methodischenProbleme bei der Interpretation im-munhistochemischer Färbungen die er-gänzende Durchführung der FISH beiallen fraglich überexprimierten bzw.schwach positiven Fällen geboten, umauf molekularer Ebene eine Amplifika-tion ausschließen bzw. nachweisen zukönnen.
In einigen Untersuchungen wurdehingegen eine Korrelation zwischenher-2/neu-Überexpression bzw.Amplifi-kation und dem verkürztem tumor-freien sowie dem Gesamtüberleben ge-funden [2, 27, 28]. In diesem Zusam-menhang scheint aber auch dem EGFReine besondere Bedeutung bei der ora-len Kanzerogenese zuzukommen, dahäufig eine Koamplifikation der beidenHomologe aus der Familie der epider-malen Wachstumsfaktoren vorliegt [2].Nach den Ergebnissen von Charoenratet al. [2] konnte eine Korrelation zwi-schen egfr- und her-2/neu—Amplifika-tion und der Invasivität sowie demLymphknotenbefall gefunden werden,jedoch waren nur erhöhte egfr-Level mitverkürztem Überleben assoziiert. EinePhase-I-Studie mit dem chimären mono-klonalen Anti-EGFR-Antikörper (Cetu-ximab®) bei Patienten mit fortgeschrit-teneren Kopf-Hals-Karzinomen zeigteeine hohe Rate an Komplettremissionen[19].
In dieser Untersuchung wurden 83der 97 eingeschlossenen Patienten (85,5%)einer kombinierten Behandlung mitpräoperativer Radiochemotherapie un-terzogen. Im Hinblick auf das Gesamt-überleben der neoadjuvant behandeltenPatienten war ein signifikanter Überle-bensvorteil für Patienten mit komplet-ter pathologischer Remission erkenn-bar. Diese Beobachtung wurde bereitsvon einigen Autoren im Rahmen derDÖSAK-Studie publiziert [14]. Inwieweiteine her-2/neu-Überexpression mit demAnsprechverhalten korreliert,kann nichtabschließend beurteilt werden, jedochwar keine Assoziation zwischen einerkompletten pathologischen Remissionund einer her-2/neu-Überexpressionnachweisbar. Auch lässt sich derzeitnoch keine Aussage über den prädikti-
Abb. 3a,b � Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit fluoreszenzmarkier-ten DNA-Sonden (her-2/neu orange, Chromosom 17 grün) ohne (a) und mit Amplifikation (b)
Tabelle 6Ergebnisse der Immunhistologie vs. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Immunhistologie
FISH n=42 Hercep-Score 0/1+ Hercep-Score 2+/3+ (her-2/neu-Überexpression)
28 0
6 8
(HER-2 Amplifikation)
Mund Kiefer GesichtsChir 3 · 2003 145
ven Wert einer her-2/neu-Amplifikationim Hinblick auf das Ansprechverhaltengegenüber Platinderivaten oder Taxanentreffen. Da sowohl die Taxane als auchCisplatin bei der Behandlung oralerPlattenepithelkarzinomen eingesetztwerden, wäre es sinnvoll In-vitro- undIn-vivo-Untersuchungen des her-2/neu-Status unter dem Aspekt der Sensitivitätgegenüber diesen Chemotherapeutikadurchzuführen.
Da keine Korrelation zwischen kli-nischen Daten und dem her-2/neu-Sta-tus nachweisbar war, ist die Rolle desher-2/neu-Onkogens als prognostischerParameter beim Mundhöhlenkarzinomals fraglich zu beurteilen. Gleichwohlsind weitere Untersuchungen mit grö-ßeren Fallzahlen und längeren Nachbe-obachtungszeiten erforderlich. Im Hin-blick auf eine Therapie mit dem huma-nisierten monoklonalen Antikörper ge-gen das her-2/neu-Epitop (Herceptin)sind noch weitere In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen erforderlich.
Danksagung · Für die technische Unterstüt-zung bei der Etablierung der FISH-Experi-mente bedanke ich mich bei Dr. ChristianBarth (Vysis).
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