Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie

Blockpraktikum Molekularbiologische ArbeitstechnikenWS 2004/2005

Bianca Löhr

Übersicht

Einführung Probleme und Lösungsmöglichkeiten Möglichkeiten der Überexpression Expressionssysteme in E.coli Affinitätschromatographie

Einführung

In der Molekularbiologie werden oft größere Mengen an nativem Protein benötigt Analyse der Funktion, Struktur etc.

Überexpression bedeutet erhöhte Expressions- bzw. Transkriptionsrate eines Gens

Auch verwendet für: vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins über die natürliche Konzentration hinaus

Einführung

Homologe Genexpression

Expression im endogenen Wirt Heterologe Genexpression

Expression in fremden Wirtssystemen

Einführung

Natürlich auftretende Überexpression als Antwort auf unterschiedliche Milieubedingungen

Nahrung, Temperatur etc. Immer induzierbare Expressionssysteme Künstliche Überexpression Nutzung von regulierbaren Promotoren aber auch

von konstitutiven Systemen Es existieren viele Expressionssysteme für z.B.

Bakterien, Pilze, Hefen, Höhere Pflanzen und Tiere

Probleme und Lösungsmöglichkeiten

Bei der Überexpression können Probleme auftreten die durch das jeweilige Protein bedingt sind

Proteine wirken teilweise toxisch Proteine werden abgebaut Proteolyse Es treten niedrige Expressionsraten, Lyse und

Absterben der Zellen auf Verminderung dieser Auswirkungen durch: Niedrige Kultivierungstemperaturen, kurze

Induktionszeiten Einsatz proteasedefizienter Wirtsstämme Veränderungen des N-Terminus

Probleme und Lösungsmöglichkeiten

Codonverteilung: Die Codonverteilung in unterschiedlichen

Organismen ist verschieden Die Bevorzugung best. Triplettkombinationen führt zu

unterschiedlichen Konzentrationen der zugehörigen tRNAs

Die Translation eines fremden Gens mit anderen Codons ist erschwert

Anpassung der Codons an die des Wirtes durch Mutagenese

Co-Überexpression bestimmter tRNAs

Probleme und Lösungsmöglichkeiten

Posttranslationale Modifizierung eykaryontischer Proteine

Glycosilierung, Phosphorylierung, etc. Modifizierung ist im Wirtssystem verändert oder fehlt

Nutzung von möglichst nah verwandten Expressionssystemen

Probleme und Lösungsmöglichkeiten

Bildung von Disulfidbrücken Bei Prokaryonten extracellulär bzw. im Periplasma Bei Eukaryonten im ER, nicht im reduzierenden

Cytoplasma Eukaryontische Gene aggregieren bei cytosolischer

Expression Transport in ein oxidierendes Zellkompartiment muss

gewährleistet sein

Probleme und Lösungsmöglichkeiten

Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies bei Überexpression von hydrophoben Proteinen

Proteine liegen nicht mehr in nativer Form vor Verminderung durch:

Limitierte Induktion, niedrige Temperatur, Gabe von nicht-metabolisierbaren Glucose-Homologon, Fusionsprotein, Überexpression von Hitzeschock-Proteinen

Möglichkeiten der Überexpression

Überexpression als Inclusion-Body-Protein Nur bei guter Renaturierung des Proteins Vorteile: hohe Konzentrationen möglich (bis 50% des

Gesamtzellproteins) und einfache Aufreinigung

Möglichkeiten der Überexpression

Überexpression als Fusionsprotein Fusion mit Proteinen bzw. Proteindomänen Fusion mit kurzen, endständigen Peptiden: tags Vorteile: Verringerung von Toxizität, Proteolyse,

Aggregation, Effiziente Aufreinigung mit Affinitätschromatographie

Möglichkeiten der Überexpression

Häufig verwendete Fusionspartner-Proteine und Tags

Möglichkeiten der Überexpression

Reinigungsschema für GST-Fusion

Möglichkeiten der Überexpression

Spaltung der Fusionspartner Chemisch: Hydrolyse der Peptidbindung Enzymatisch: z.B. durch den Xa-Faktor

Expressionssysteme in E.coli

Eine hohe konstitutive Expression beeinträchtigt meist den Zellmetabolismus

Daher Anwendung von induzierbaren Expressionssystemen

Promotor-Operator-System Induktion durch Metabolitzugabe, Entfernen best.

Kohlenstoffquellen, Temperaturveränderungen

Expressionssysteme in E.coli

Häufig genutzte Promotoren in E.coli

Affinitätschromatographie

Prinzip: Spezifische und reversible Adsorption eines Moleküls

an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner

Selektive Adsorption aus einer komplexen Mischung

Affinitätschromatographie

Schema Affinitätschromatographie

Affinitätschromatographie

Durchführung: Adsorption der Probe: Bindungskonstante des

Proteins von 10-5 bis 10-7 M Waschen: Entfernung unspezifisch gebundener

Komponenten durch erhöhte Ionenstärke Desorption: spezifisch oder unspezifisch Regeneration der Matrix: richtet sich nach der

Verunreinigung der Ausgangsprobe

Affinitätschromatographie

Schema Matrix

Affinitätschromatographie

IMAC = immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie

Basiert nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen

Affinitätschromatographie

Prinzip: Metall-chelatierte Gruppe ( bei uns NTA) ist am

Säulenmaterial immobilisiert Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion (bei uns

Nickel) bindet an das NTA Interaktion mit den Histidinresten des His-tags Desorption durch Gradientenelution mittels Imidiazol

kompetetive Verdrängung

Affinitätschromatographie

Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe