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Enzymatische ReaktionenU. Albrecht BC1
1. Chemische Kinetik
2. Enzymatische Kinetik
3. Inhibition
4. pH Effekte
5. Bisubstrat Reaktionen
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Kinetik ist das Studium der Raten bei welchen Chemische Reaktionen ablaufen.
U. Albrecht BC1
1. Chemische Kinetik
A. Elementarreaktionen
A -> P
Kann über Zwischenprodukte ablaufen
A -> I1 -> I2 -> P
A = Ausgansmoleküle, I = Intermediate, P= Produkte
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U. Albrecht BC1
Geschwindigkeitsgleichungen
Konstante Temperatur -> Geschwindigkeit einer Reaktion abhängigvon Konzentration
aA + bB + …….+ zZ -> P
Geschwindigkeitsgleichung:
v = k [A]a [B]b ……. [Z]z
k = GeschwindigkeitskonstanteOrdnung der Reaktion = a + b + ……+ z
A -> P Reaktion erster Ordnung2A -> P Reaktionen zweiter Ordnung
A+B -> P
Reaktionen dritter Ordnung selten, da Wahrscheinlichkeit, dass 3Moleküle zusammentreffen gering ist.
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U. Albrecht BC1B. Reaktionsgeschwindigkeiten
1. Ordnung A -> P
[A] und [P] als Funktion der Zeit:
d [A] d [P]v = dt = dt = k [A]
2. Ordnung 2A -> P
d [A] d [P]v = dt = dt = k [A]2
A + B -> P
d [A] d [B]v = dt = dt = k [A] [B]
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U. Albrecht BC1
Geschwindigkeitsgleichungen erster Ordnung
d [A]v = dt = k [A]
d [A][A] = - k dt
[A]0S[A]d ln [A] = - k 0S t
dt
ln [A] = ln [A]0 - k t
[A] = [A]0 e - k t
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Plot of ln[A] versus time for a first-order reaction.
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U. Albrecht BC1
ln [A] = ln [A]0 - k t
Halbwertszeit:
t 1/2
[A]0/2ln [A]0 = -k t 1/2
t 1/2 = ln2 / k
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Comparison of the progress curves for first- and second-order reactions that have the same value of t1/2.
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U. Albrecht BC1
d [A][A]0S[A]
[A]2 = k 0S tdt
1 1[A] = [A]0 + k t
-> lineare graph. Darstellung
Geschwindigkeitsgleichung für Reaktanten zweiter Ordnung
t 1/2 = 1 / k [A]0-> abh. von Ausgangskonz.
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Potential energy of the colinear H + H2 system as a function of its internuclear distances, RAB and RBC. (a) A perspective drawing.
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U. Albrecht BC1C. Theorie des Übergangszustandes
a = Reaktanden, b = Reaktanden dissoziert, c = Sattelpunkt, d = ProdukteRote linie = Reaktionsverlauf
Reaktion: A + B-C -> A-B + C
z.B. H + H2 -> H2 + H
Übergangszustand
Bei verschiedenartigen MolekülenTäler a und d auf verschiedenen Ebenen.
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Transition state diagrams. (a) For the H + H2 reaction. This is a section taken along the a—c—d line of previous figure.
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U. Albrecht BC1
Übergangszustandsdiagramm
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U. Albrecht BC1
Thermodynamik des Übergangszustandes
A + B <----> X* ----> P + QK* k‘
X* = aktivierter Komplex
d [P]dt = k [A] [B] = k‘ [X*]
k = Geschwindigkeitskonst. der Gesamtreaktionk ‘= Geschwindigkeitskonst. Zerfall von X*
X* im schnellen Gleichgewicht mit A und B[X*]
K* = [A][B]
K* = Gleichgewichtskonstante -> Thermodynamik anwendbar
-RT ln K* = ∆G* ∆G*= Differenz der freien Enthalpieaktivierter Komplex zu Reaktanten
d [P]dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B]
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Transition state diagrams. (b) For a spontaneous reaction, that is, one in which the free energy decreases.
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U. Albrecht BC1
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U. Albrecht BC1
A + B <----> X* ----> P + QK* k‘
Aktivierungsschwelle
k‘ = χ ν ν = Schwingfrequenz der Bindungχ = Transmissionskoeffizient ->
Wahrscheinlichkeit mit der KomplexX* zerfällt.bei H+H2 ist er 0.5, sonst meist 1
Plank‘sches Gesetz ν = ε / h ε = Durchsnittl. Energie d. Schwingung diezum Zerfall von X* führt
h = Planck Konstante
ε = kB T kB = Boltzmann-Konstante -> kB T verfüg-bare thermische Energie
χ kB Tk‘ = h
d [P]dt = k‘ e -∆G*/RT [A] [B]
d [P]dt = k [A] [B]
χ kB Tk = k‘ e -∆G*/RT = h e -∆G*/RT
Meistens = 1
k
Aktivierungsenthalpie
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Transition state diagram for the two-step overall reaction A → I → P.
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U. Albrecht BC1Mehrstufige Reaktionen haben einen GeschwindigkeitsbestimmendenSchritt
Bildung von P bestimmt durch die langsamste Reaktion
A ---> I ----> Pk1 k2
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The effect of a catalyst on the transition state diagram of a reaction.
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U. Albrecht BC1Katalyse führt zur Absenkung der Aktivierungsenergie
Reaktionsgeschwindigkeit wird um e ∆∆G*cat/RT erhöht
Beschleunigung um Faktor 10 ∆∆G*cat= 5.7 kJ/molIst weniger als Hälfte von H2Bindung
1Mio fach ∆∆G*cat= 34 kJ/molEntspricht nur einem Teil derEnergie der meisten kovalenten Bindungen
Katalysator beschleunigt hin-und Rückreaktion gleich stark-> Gleichgewichtskonstante istunverändert.
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U. Albrecht BC1
2. Enzymkinetik
Enzyme = hochspezifische Katalysatorennicht passive Katalysatoren sondern komplexe molekulare Maschinen
Kinetische Messungen -> Aufklären von Katalysemechanismen von Enzymen
A. Michaelis-Menten Gleichung
Fructofuranosidase: Saccharose + Wasser -> Glucose + Fructose
wenn genügend hohe Konz. Saccharose -> Geschwindigkeit unabhängig von Sacc. Konz.
E + S <---> ES ----> P + Ek2k1
k-1
ES = Enzym-Substrat Komplex
Wenn S genug hoch -> 2. Reaktionschritt geschwindigkeitsbestimmend
d [P]v = dt = k2 [ES]
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E + S <---> ES ----> P + Ek2k1
k-1
d [ES]dt = k1 [E][S] - k-1 [ES] - k2 [ES]
Diese Gleichung lässt sich nicht ohne Vereinfachung integrieren
1. Annahme: Es gibt ein präexistierendes Gleichgewicht zwischen Enzymund Substrat.
-> k-1 >> k2
k-1 [E][S]Ks = k1 = [ES]
Diese Annahme ist nicht immer korrekt. ES wird als Michelis-Menten Komplexbezeichent.
U. Albrecht BC1
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k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] k1 ([E]T - [ES]) [S] = (k-1 + k2 )[ES] [ES] (k-1 + k2 + k1 [S])= k1 [E]T[S] Division durch k1 aufgelöst nach [ES]
[E]T[S][ES] = KM + [S]
KM= (k-1 + k2 )/ k1 Michaelis-MentenKonstante
Progress curves for the components of a simple Michaelis–Menten reaction.
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478
U. Albrecht BC1
2. Annahme: Es existiert ein Fliessgleichgewicht
d [ES]dt = 0
Dies ist gültig im grauen BereichUnd wenn [ S0 ] >> [ E ]T
[ E ]T = [ E ] + [ ES ]
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U. Albrecht BC1
Anfangsgeschwindigkeit
d [P] k2 [E]T[S]vo = dt = k2 [ES] = KM + [S]
t=0
Bei hoher Substratkonzentration -> Enzym vollständig gesättigt -> Maximalgeschwindigkeit vmax, Enzym liegt vollständig in ES komplex vor.
vmax = k2 [E]T
vmax [S]vo = KM + [S]
Michaelis-Menten Gleichung(Grundgliechung der Enzymkinetik)Nota bene: 2 Annahmen !!!!
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Plot of the initial velocity vo of a simple Michaelis–Menten reaction versus the substrate concentration [S].
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U. Albrecht BC1Die Bedeutung der Michaelis-Konstanten KM
Bei einer Substratkonzentration von [S] = KM ist die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte des Maximalwertes. Ein Enzym mit kleinem KM erreicht die Maximale katakytische Wirksamkeit bei niedriger Substratkonzentrtion.
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Values of KM for Some Enzymes and Substrates.
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U. Albrecht BC1
KM hängt von der Art des Enzyms und des Substrates ab. Er ist ausserdem Temperatur und pH Abhängig.
KM =k-1
k1 Ks +k2
k1+ =
k2
k1KS = Gleichgew. Dissozationskonst.
-> steigender KS -> fallendeAffinität des Enzyms zu seinem Substrat, wenn k2 < k-1
klein
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U. Albrecht BC1
B. Analyse kinetischer Daten
Aus vo gegen Substrat Plot vmax nur sehr ungenau zu bestimmen. Auch bei Substratkonzentration von 10 KM nur etwa 91% des wahren vmax Wertes ablesbar.-> Lineweaver-Burk Plot = reziproke Formel
A double reciprocal (Lineweaver–Burk) plot.
1 KM 1 1 vo = vmax [S] + vmax
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U. Albrecht BC1kkat / KM ist ein Mass für die katalytische Wirksamkeit
Katalytische Konstante kkat = Wechselzahl (turnover number)
kkat =vmax
[E]TIn Michaelis-Menten Modell istkkat = k2
Wenn [S] << KM wird wenig ES gebildet --> [E] etwa = [E]T ist. Es wird deshalb
d [P] k2 [E]T[S]vo = dt = k2 [ES] = KM + [S]
t=0
k2 kkat
vo KM [E]T [S] KM [E][S]
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Cross section through the active site of human superoxide dismutase (SOD).
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U. Albrecht BC1
SOD perfektes Enzym -> jede Substratkontakt resultiert in Reaktion
Elektrostatisches Feld lenktSauerstoffradikale in dieBindungsstelle für die Reaktion
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U. Albrecht BC1
3. InhibitionInhibitoren sind der Struktur des Substrates ähnlich und interferieren mit dem EnzymEnzyminhibitoren -> Chemotherapeutika siehe z.B. Methotrexat.
Essentieller Cofaktor für die Synthesevon Thymidylsäure -> nötig für DNASynthese
Methotrexat -> blockieren der DNA Synthese -> häufig teilende Zellen davonbetroffen -> Krebszellen
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U. Albrecht BC1
A. Kompetitive Hemmung
E + S ES ----> P + Ek2k1
k-1
+I
EI + S keine Reaktion
KI
KI =[E][I][EI]
Ein kompetitiver Inhibitor erniedrigt die Konzentration des freien Enzyms
Berücksichtigen von Inhibitor ergibt für die Michaelis Menten Gleuchung:
vmax [S]vo = α KM + [S] α =
[I] KI
1 +
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U. Albrecht BC1
vmax [S]vo = α KM + [S]
Für [S] gegen unendlich bleibt vmax gleich, d.h. der Inhibitor beeinflusst nicht dieWechselzahl.
α KM
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U. Albrecht BC1
vmax unabhängig vonkompetitivem Inhibitor
1 αKM 1 1 vo = vmax [S] + vmax
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U. Albrecht BC1
B. Unkompetitive Hemmung
E + S ES ----> P + Ek2k1
k-1+I
ESI keine Reaktion
K‘I
Bei unkompetitiver Inhibition bindet der Inhibitor and den Enzym-Substrat Komplexaber nicht an das freie Enzym
[ES] [I][ESI]K‘I =
Bindung des nicht kompetitiven Inhibitors (braucht Substrat nicht ähnlich zu sein) ->Konformationsänderung im aktiven Zentrum des Enzyms -> Aktivität reduziert
nicht kompetitiven Inhibitors an freies Enzym -> kein Einfluss auf Substrataffinität ->
vmax [S]vo = KM + α‘ [S]
Michaelis-Menten Gleichung für unkompetitiveHemmung
α‘ = [I] K‘I
1 +
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Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis–Menten enzyme in the presence of uncompetitive inhibitor.
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U. Albrecht BC1
1 KM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax
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U. Albrecht BC1
C. Gemischte Hemmung
E + S ES ----> P + Ek2k1
k-1+I
EI
KI
+I
ESI keine Reaktion
K‘I
Gemischte Inhibitoren binden am Enzym an Stellen die sowohl an der Substratbindung als auch an der Katalyse beteiligt sind.
1 αKM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax
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Lineweaver–Burk plot of a simple Michaelis-Menten enzyme in the presence of a mixed inhibitor.
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U. Albrecht BC1
1 αKM 1 α‘ vo = vmax [S] + vmax
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nc.4. Einfluss des pH-Wertes
U. Albrecht BC1
EH + S ESH P + EH
E - ES -
EH2+ ESH2
+
H+
H+
H+
H+
KE1
KE2
KES1
KES2
k1 k2
k-1
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nc.
Effect of pH on the initial rate of the reaction catalyzed by the enzyme fumarase.
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U. Albrecht BC1
The pH dependence of (a) log V ′max and(b) log (V ′max/K ′M).
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Some bisubstrate reactions. (a) The peptide hydrolysis reaction catalyzed bytrypsin. (b) The alcohol dehydrogenase reaction.
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U. Albrecht BC1
5. Bisubstrat-ReaktionenIn vorherigen Kapiteln Enzyme mit einem Substrat. Transferase- und Redoxreationenbrauchen aber 2 Substrate:
A + B P + QE
P-X + B P + B-XE
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U. Albrecht BC1
Bi-Bi-Reaktionstypen:
2 Substrate(A, B)
2 Produkte(P,Q)
1. Sequentielle oder Kettenreaktion (Einzel-Verdrängungsreaktionen)
Reaktionen, bei denen sich alle Substrate mit dem Enzym verbinden müssen, bevor eine Reaktion ablaufen kann und Produkte freigesetzt werden können.(z. B. NAD+ und NADP+ bedürftige Dehydrogenasen mit Coenzym).
2. Ping-Pong-Reaktionen (Doppel-Verdrängugnsreaktionen)
Eines oder mehrere Produkte werden schon freigesetzt, bevor alle Substrategebunden haben.Die beiden Substrate sind nie gleichzeitig auf der Enzymoberfläche.z. B. Chymotrypsin, Transaminasen und einige Flavoenzyme.
A B P Q
A BP Q
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Double-reciprocal plots for an enzymatic reaction with a Ping Pong Bi Bi mechanism.
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U. Albrecht BC1Unterscheidung von Bisubstratmechanismen
Parallelenschar für verschiedene Substratkonzentrationen deutetAuf Ping-Pong Mechanismus hin.
A and B like uncompetitiveinhibitors
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Double-reciprocal plots of an enzymatic reaction with a Sequential Bi Bi mechanism. (a) Plots of 1/vo versus 1/[A] or 1/[B] at various constant concentrations of B or A.
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U. Albrecht BC1
A and B like competitive inhibitors
Sequentieller Mechanismus