Trenn- und Analysenmethoden organischer...

Trennmethoden organischer Arzneistoffe

N. Haider, Universität Wien www.pharmxplorer.at 1

Trenn- und Analysenmethoden organischer Arzneistoffe

Abschnitt B - Trennmethoden

N. Haider

SS 2005

Inhaltsübersicht

• Chromatographische Methoden

∗ Funktionsprinzip, theoretische Grundlagen

∗ Dünnschichtchromatographie (DC, TLC)

∗ Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

∗ Säulenchromatographie (SC, CC)

∗ Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)

∗ Gaschromatographie (GC)

∗ Auswertung von Chromatogrammen (qualitativ, quantitativ)



Das Prinzip chromatographischer Methoden

Definition: Chromatographische Methoden sind physikalisch-chemische Trennmethoden, die alle im Prinzip darauf beruhen, dass Substanzen zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich an dieser vorbeibewegenden (mobilen) Phase verteilt werden.

Beispiel zur Veranschaulichung: Dünnschichtchromatographie

Start

· ·

Fließmittelfront

Substanz Fall A Fall B Fall C

Fall A, B: keine Chromatographie; Fall C: Chromatographie

Trennung von Substanzgemischen



Wichtige Begriffe

Chromatographisches Arbeiten erfordert folgende Schritte:

• Aufbringen der Probe

• Entwickeln des Chromatogramms (mobile Phase wandert)

• Nachweis der getrennten Substanzen (Detektion)

Jedes chromatographische System besteht aus:

• der mobilen Phase

• der stationären Phase

• dem zu trennenden Substanzgemisch

Charakteristika chromatographischer Verfahren

Vorteile gegenüber klassischen Methoden zur Stofftrennung (Fällen, Kristallisieren, Destillieren, Sublimieren, Extrahieren):

• höhere Trennschärfe

• größere Empfindlichkeit

• geringerer Zeitaufwand

• manchmal einfachere Durchführbarkeit (DC, klass. SC)

Verhalten von Substanzen in einem gegebenen chromatograph. System → spezifische Substanzeigenschaft; geeignet zur Charakterisierung und Identifizierung von Substanzen (bzw. Identitätsprüfung)



Charakterisierung des Wanderungsverhaltens (DC)

a

Glasplatte

Sorbensschicht

Fließmittelfront

RF = c

RX = RSt =ab

c

b

a

. . .

St Pr St

3 mm

20 mm

5 mm

• RF-Wert

• RX-Wert (RSt-Wert)

Messpunkte:

• Startpunkt

• Fleckenmittelpunkt bzw.

• Fließmittelfront

Grundlagen chromatographischer Trennungen

Trennprinzipien (Trennmechanismen):

• Adsorption

• Verteilung

• Molekularsiebwirkung (Ausschluss)

• Ionenaustausch

• Bioaffinität

manchmal keine 100%ige Abgrenzung möglich




AdsorptionDefinition: Anreicherung eines gelösten Stoffes oder eines gasförmigen Stoffes ( = ADSORBAT) an der Oberfläche eines Feststoffes ( = ADSORBENS = SORBENS);

• Oberflächenreaktion

• reversibler Prozess → Desorption (Konkurrenz mit anderenSubstanzen, v.a. mit Lösungsmittel!)

Bindung erfolgt bei der physikalischen Adsorption durch:

• Dipol-Dipol-Wechselwirkungen

• H-Brückenbindungen

• Charge-Transfer-Wechselwirkungen

Grundlagen chromatographischer Trennungen: Adsorption

ständiger Wechsel von Adsorptions- und Desorptionsprozessen,

Beschreibung durch Adsorptionsisothermen

Cs

Cm

ideale Adsorptionsisotherme (linearer Verlauf)

Cs, Cm: Substanzkonzentration in der stationären bzw. mobilen Phase



ideale Adsorptionsisothermen

flacher Verlauf: rasche Wanderungsteiler Verlauf: langsame Wanderung

Zur Trennung zweier Substanzen ist ein ausreichender Steigungsunterschied der beiden Adsorptionsisothermen erforderlich.

reale Adsorptionsisothermen: Langmuir-Isotherme

Krümmung der Isotherme infolge beschränkter Adsorptionskapazität derstationären Phase; aktivste Stellen an der Oberfläche zuerst besetzt.

Resultat: TailingAbhilfe: in niedrigerem Konzentrationsbereich arbeiten




Verteilung• System besteht aus 2 nicht miteinander mischbaren Phasen: 2 Flüssigkeiten

oder 1 Flüssigkeit + 1 Gas; in beiden Phasen (zumindest teilweise) löslicher Analyt

• Trägermaterial für flüssige stationäre Phase erforderlich

• es gilt das Nernst´sche Verteilungsgesetz

K = C in Phase 1

C in Phase 2a

a

Ca .................. Konzentration der Substanz aK ................... Verteilungskoeffizient = Gleichgewichtskonstante

des Verteilungsgleichgewichtes

K abhängig von: Art der beiden PhasenTemperaturDruck

K unabhängig (im Idealfall) von Konzentrationsbereich

ideale / reale Nernst-Verteilung

Abweichungen vom linearen Verlauf infolge von Aggregatbildung, Sättigungseffekten bei höheren Konzentrationen

Resultat: TailingAbhilfe: in niedrigerem Konzentrationsbereich arbeiten

Ca

Ca in Phase 2

ideale Nernst-Verteilung

in Phase 1

reale Nernst-Verteilung



Verteilung

• Substanzen sind verteilungschromatographisch trennbar, wenn sich ihreVerteilungskoeffizienten hinreichend voneinander unterscheiden

• Maßzahl für Trennbarkeit: Trennfaktor β

• „Normale“ Verteilungschromatographie: polare stationäre Phase (z.B. H2O), apolare mobile Phase (organ. LM)

• Umkehrphasen-Verteilungschromatographie (reversed phase): apolarestationäre Phase (z.B. Paraffinöl, Silikonöl), polare mobile Phase (H2O-hältiges LM-Gemisch; z.B. H2O/Methanol, H2O/Acetonitril, etc.)

Ka ..... Verteilungskoeffizientfür Substanz a

Kb ..... Verteilungskoeffizientfür Substanz b

β = K

Ka

b

Wanderungsverhalten verschieden polarer Substanzen

• Adsorptionschromatographie: apolare Substanzen wandern immer schneller als polarew Substanzen

• Verteilungschromatographie: Umkehrung des Wanderungsverhaltens möglich

o o o oStart

FM-Front

Verteilungs-DC Adsorptions-DC

"normal" mit Phasen-umkehr

aktives Sorbens,apolares Fließmittel

wenig aktives Sorbens,polares Fließmittel

A

P

P

A

A

P

A

P




IonenaustauschIonenaustauscher: unlösliche Festsubstanzen mit Polyelektrolyt-Charakter, die aus Elektrolytlösungen Anionen bzw. Kationen aufnehmen können und dafür äquivalente Mengen gleichsinnig geladener Ionen in die Lösung abgeben. Je nachdem, ob Anionen oder Kationen abgegeben werden →Anionen- bzw. Kationenaustauscher.

• Häufig verwendet: Co-Polymerisate aus Styrol und Divinylbenzol mit ionischen funktionellen Gruppen an den Phenylresten.

• starke IAT: bei jedem pH-Wert in ionischer Form

• starke Kationenaustauscher: z.B. R-SO3- Na+

• starke Anionenaustauscher: z.B. R-N(R‘)3+ Cl-

• schwache IAT: nur in bestimmtem pH-Bereich ionisch

• schwache Kationenaustauscher: z.B. R-COO- Na+

• schwache Anionenaustauscher: z.B. R-NH3+ Cl-

Ionenaustauschchromatographie

Trennung infolge unterschiedlichstarker Wechselwirkungskräftezwischen verschiedenen ionischen Analyten und den Festionen des IAT

stationäre Phase: ionische Stellen desAustauscherharzes

mobile Phase: Elektrolytlösung




Molekülsiebwirkung, Ausschluss-Chrom.verwendet in Gel-Chromatographie (Gel-Permeation), Gel-Filtration

Trenneffekt durch sterischen Ausschluss (Molekülgröße bzw. Molekular-gewicht), nur für Verbindungen ab einer best. Mindestgröße geeignet

kleinere Moleküle diffundieren weiter in die Poren hinein

→ längerer Aufenthalt in der stationären Phase

→ langsamere Wanderung

mobile Phase: geeignetes LM (meist wässrige Pufferlösungen)stationäre Phase: das selbe LM, und zwar dessen Anteil innerhalb der Poren


Bioaffinitäts-ChromatographieAn der Oberfläche eines inerten, polymeren Trägers sind Substanzen chemisch gebunden, die zu bestimmten Biomolekülen eine besonders hohe Affinität besitzen und diese daher hervorragend retinieren können.

z.B.:

Antikörper ↔ Antigen

Enzym ↔ Substrat, Inhibitor

Rezeptor ↔ Arzneistoff, Hormon



Einteilung chromatographischer Verfahren

• nach dem Trennprinzip

• nach der Ausführungstechnik:

• säulenchromatographische Verfahren

• flat-bed-Verfahren

• nach dem Phasenaufbau:stationäre Phase fest (S) oder flüssig (L), mobile Phase flüssig (L) oder gasförmig (G)→ Bezeichnungen wie LSC, LLC, GSC, GLC

• danach, wo die Substanzen nachgewiesen werden:

• innerhalb der Trennstrecke → inneres Chromatogramm

• nach Verlassen der Trennstrecke → äußeres Chrom.

Theorie des chromatographischen Prozesses

Mehrere Theorien zur Beschreibung der relevanten Vorgänge:

• kinetische Theorie

• Theorie der Böden (Trennstufen-Modell)

• dynamische Theorie

• molekularstatistische Theorie (random-walk-Modell)

Ziel: besseres Verständnis, Möglichkeit der Vorhersage



kinetische Theorie

Verhalten einzelner Moleküle verschiedenen Typs wird betrachtet;Boots-Modell (verschiedene Typen von Booten auf einem Fluss)

Beispiel: 3 Substanzen (I, a, b)I Inertsubstanz (ohne Retention), wandert gleich schnell wie mobile Phasea mit einer bestimmten Retentionb mit Retention größer als a (wandert langsamer als a)

am Säulenkopf aufgegeben, dann LM-Gemisch zugeführt (wandert infolge Schwerkraft durch die Säule), Subst. I, a und be werden mittransportiert und verlassen nacheinander die Säule am unteren Ende;

Zeit vom Beginn der Entwicklung gemessen, Subst.-Konzentration am Ende der Trennstrecke laufend gemessen → Darstellung als zeitabhängiges Konzentrationsprofil: Elutionskurve

kinetische Theorie

Substanz-Zone: „Peak“ (annähernd Gauß´sche Glockenkurve)



Theorie der Böden (Trennstufen-Modell)

Verteilungsgleichgewicht (Substanz ↔ mobile/stationäre Phase) stellt sich nicht unendlich schnell ein. Trennstrecke wird in gedachte Abschnitte zerlegt, die gerade lang genug sind, damit Gleichgewichtseinstellung erfolgen kann:Länge so eines Abschnittes: Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens(Begriff aus der Destillation) bzw. height equivalen to a theoretical plate(HETP) bzw. Trennstufenhöhe (H)

Ursachen für „nicht ideale“ Chromatographie:• Viskosität der mobilen Phase• Diffusionseffekte:

• Longitudinale Diffusion: durch unterschiedlich lange Aufenthaltszeitengleichartiger Substanzmoleküle in der stationären Phase

• Streudiffusion = Eddy-Diffusion: durch unterschiedlich lange Aufenthalts-zeiten glaichartiger Substanzmoleküle in der mobilen Phase

Je kleiner die Trennstufenhöhe, umso mehr Trennstufen pro Trennstreckenlänge→ umso besser die Trennleistung des Systems

Kenngrößen eines chromatographischen Peaks

Basisbreite:• Ermittlung der Wendepunkte• Anlegen der Wendetangenten• Abstand der Schnittpunkte der

Wendetangenten mit der Basislinie

Halbwertsbreite:• keine Wendetangenten erforderlich• Schnittpunkt einer horizontalen

Linie auf halber Peakhöhe mit denbeiden Peakflanken

• bei unsymmetrischen oder überlappenden Peaks leichter zuermitteln als Basisbreite

Halbwertsbreite ist nichtdie halbe Basisbreite!!!



Ermittlung der Trennstufenzahl und -höhe

H ....... Höhe eines theoretischen BodensL ....... Länge der chromatographischen Trennstrecke in mmZ ....... TrennstufenzahlB ....... Basisbreite eines Peaks

bei symmetrischen Peaks bei verzerrten Peaks

H = LZ

Z = 16 · (tBR )2

Z = 5.54 · (

tB

R

1/2

)2

(Peaks mit Tailing, überlappende Peaks)

Ermittlung der Symmetrie eines Peaks

der Symmetriefaktor



dynamische Theorie

• Erweiterung der Theorie der Böden• Zusammenhang zwischen der theoretischen Trennstufenhöhe H

und dynamischen Erscheinungen (Diffusions-, Strömungseffekte und Nichtgleichgewichtseinstellung): van Deemter-Gleichung

dynamische Theorie

• van Deemter-Gleichung stellt Trennstufenhöhe H der linearen Strömungsgeschwindigkeit u gegenüber

• H umso kleiner (→ mehr Trennstufen!), wenn A, B, Cmöglichst klein sind

A: berücksichtigt Eddy-Diffusion, ist klein bei:gleichmäßiger Packungeinheitlichem Teilchendurchmesser der stationären Phasekleiner Teilchengröße der stat. Phase

B: berücksichtigt longitudinale Diffusion, ist klein bei weiten und unverzweigten Poren in der stationären Phase

C: berücksichtigt Geschwindigkeit der Gleichgewichts-einstellung, ist klein bei niedriger Viskosität der mobilen Phase



chromatographische Trennmethoden

Dünnschichtchromatographie (DC)Thin-Layer Chromatography (TLC)

• geringer apparativer Aufwand (billig)• geringer Zeitaufwand• hohe Trennleistung• niedrige Nachweisgrenzen• hohe Selektivität des Nachweises

charakteristische Merkmale:

Trennstrecke besteht aus dünner Schicht stationärer Phase, die sich auf einer geeigneten inerten Unterlage (Glas, Alu-, Plastikfolie) befindet. Die Trennung erfolgt näherungsweise in zweiter Dimension (Unterschied zu SC).→ flat-bed-Methode.

Dünnschichtchromatographie

Bezüglich Trennmechanismen: am häufigsten Adsorption, Verteilung (ev. auch Ionen-austausch)

Anwendungsmöglichkeiten: analytisch, mikropräparativ (100 mg Maßstab)

für Trennung größerer Stoff-mengen nur wenig geeignet (dafür ist SC besser)




Sorbentien in der DC

• Kieselgel1,2)

• Aluminiumoxid2)

basisch (pH ≈ 9.0)neutral (pH ≈ 7.5)sauer (pH ≈ 4.0)

• Kieselgur• Polyamid (Nylon, Perlon)• Cellulose• Acetylierte Cellulose• Dextrangele• Stärke

1) G: mit CaSO4 (≈ 13%)H: ohne Bindemittel

2) F: mit FluoreszenzindikatorP: für präparative ChromatographieR: besonders gereinigt (z.B. für quant. in situ Auswertung)Zahlenangaben: mittlerer Porendurchmesser in Å (z.B. Typ 60 ..... 60 Å)


Adsorptionskraft des Sorbensmaterials → Aktivität

hängt ab von:

• Teilchengröße (kleine Teilchen → große spezifischeOberfläche (z.B. Kieselgel 60: 500 m2/g); in DC ca. 0.5-25 µm

• Zahl und Durchmesser der Kanäle (Poren), die bei derHerstellung entstehen

• Wassergehalt des Sorbens

Herstellung der Schichten: heute prakt. nur mehr industriell




Auftragen der Substanzenetwa 5 - 20 µg Substanz in einem LM, das die Substanz gut löst: z.B. Aceton, Methanol, Ethanol, Dichlormethan0.1 - 5%ige Lösungen, 2 - 20 µl mit Mikropipetten, MikroliterspritzenBelastbarkeit: 10-5 g/g Sorbens

Entwicklung des Chromatogramms erst nach völligem Abdunsten des zumAuftragen verwendeten LM

• punktförmiges Auftragen: v.a. in analytischer DC

• strichförmiges (bandförmiges) Auftragen: v.a. in präparativer DC

Fleckenform und -größe beeinflussen Ergebnis der Trennung


Thermomikro-Auftrageverfahren nach Stahl (TAS)spezielles Verfahren zum Auftragen leicht flüchtiger Substanzen aus komplexer Matrix (z.B. pflanzl. Material)




Fließmittel-Auswahl

• Nacharbeiten vorgegebener Arbeitsvorschriften: LM mit definierterReinheit und def. Wassergehalt verwenden (p.A.-Qualität)

• eigene Methodenentwicklung

• Struktur der Probenmoleküle bekannt → Abschätzung der Polarität→ Abschätzung der erforderlichen ElutionskraftReihung der Lösungsmittel nach steigender Elutionskraft in Verbindungmit einem bestimmten Sorbens, bezogen auf n-Pentan als Nullpunkt→ eluotrope Reihe

• unbekannte Eigenschaften der Analysensubstanz → Auswahl desFließmittels durch „Versuch und Irrtum“; experimentell rasch durchzu-führen mittels Mikrozirkulartechnik


Elutionskraft ε0 verschiedener Lösungsmittel

Lösungsmittel Al2O3 SiO2 MgO Florisil DK δ

Pentan 0.00 0.00 0.00 0.00 1.84 5.91 Hexan 0.01 0.03 --- --- 1.88 7.27 Cyclohexan 0.04 0.03 0.06 --- 2.02 8.19 Tetrachlormethan 0.18 0.11 0.16 0.04 2.24 8.55 Diisopropylether 0.28 0.21 --- --- 3.88 7.06 Benzol 0.32 0.25 0.22 0.17 2.28 9.16 Diethylether 0.38 0.38 0.21 0.30 4.33 7.53 Chloroform 0.40 0.26 0.26 0.19 4.8 9.16 Dichlormethan 0.42 0.32 0.26 0.23 8.93 9.88 Aceton 0.56 0.47 0.50 --- 21.4 9.62 1,4-Dioxan 0.56 0.49 --- --- 2.21 10.13 Essigsäureethylester 0.58 0.38 --- --- 6.11 8.91 Acetonitril 0.65 0.50 --- --- 37.5 12.11 Pyridin 0.71 > 0.7 12.4 10.62 Ethanol 0.88 25.8 Methanol 0.95 0.73 33.6 14.50 Wasser sehr groß 80.4




Fließmittel-Auswahl mittels dem Stahl‘schen Dreieck:


Fließmittel-Auswahl mittels Mikrozirkulartechnik

Startfleck

FM zu apolar

FM zu polar

optimales FM

mehrere Versuche neben-einander auf einer einzigen DC-Platte möglich(geringer Platzbedarf)




Fließmittel-Auswahl

• Gemische von Lösungsmitteln mit sehr großem Polaritätsunterschiedvermeiden → Möglichkeit der Ausbildung einer β-Front (teilweiseEntmischung des Fließmittels auf der DC-Platte)


Entwicklung des Chromatogrammshäufigste und einfachste Form: aufsteigende Entwicklung; 2 Möglichkeiten:• ohne Kammersättigung (Problem der nicht konstanten FM-Zusammensetzung)• mit Kammersättigung (gibt besser reproduzierbare RF-Werte)




Entwicklung des Chromatogramms

• Laufstrecken meist 5-15 cm

• Trennstufenzahl meist zwischen 500 und 3000

• Laufzeit meist 10-30 minbei aufsteigender DC unter Kammersättigung verhalten sich dieLaufzeiten wie die Quadrate der Laufstrecken

neben normalen Kammern auch Horizontal-Entwicklungskammern,Sandwich-Kammern (S-Kammern), Doppeltrog-Kammern


Sandwich-Kammer Doppeltrog-Kammer



weitere DC-Entwicklungstechniken

Mehrfach-Entwicklung

bei ungenügender Trennung, vor allem bei präp. DC;Trocknen, neuerliche Entwicklung mit gleichem FM

→ Trennstufenzahl ist dadurch zu vergrößern.

Berechnung, dass bei der DC die Auflösung am besten bei einem RF von ca. 0.3 ist. (kleiner → zu geringe Trennstufenzahl; größer → Auflösungs-verschlechterung durch Fleckenverbreiterung)

Berechnung des RF-Wertes nach Mehrfach-Entwicklung:

nRF = 1-(1-RF)n n ... Anzahl derEntwicklungen


Stufentechniknach Entwicklung mit FM 1 → Trocknen → Entwickeln mit FM 2; vor allem, wenn präp. Trennung von mehreren polaren und mehrerenunpolaren Verbindungen erfolgen soll: stark polares FM bis zur halbenPlattenhöhe → dann schwach polares FM bis oben.

Keilstreifentechnikvor allem bei knapp beieinander liegenden RF-Werten.Nach der Verjüngung tritt zusätzlich zur Strömung in Laufrichtung eine dazu senkrechte auf, welche die Substanz-Zonen quer zur Laufrichtung und damit auseinander zieht.

ZirkulartechnikIn der Plattenmitte wird FM mit einem Docht auf die Schicht gebracht, welche nach unten liegt; kreisförmige Ausbreitung in alle Richtungen.

F(lin)F(circ) RR =





zweidimensionale EntwicklungArt der Ausführung:• mit zwei verschiedenen FM zur besseren Trennung schwer trennbarer

Gemische (z.B. Arzneistoff in biolog. Proben)• mit gleichem FM:

falls während der Analyse keine Veränderung der Substanzen eintritt → Punkte nach der 2. Entwicklung auf einer Diagonalentritt Reaktion auf aktiver Oberfläche während der Chromatographie (oder beim Zwischentrocknen) ein → Punkte liegen nicht auf Diagonale

TRT-Technik (Trennung - Reaktion - Trennung)damit kann die chemische Reaktionsfähigkeit von Substanzen untersucht werden. Mögliche Reaktionstypen:• Oxidation• Hydrolyse• Photochemische Reaktionen• Halogenierungen (z.B. mittels Br2-Dampf)




Detektion der Substanzen

• Eigenfarbe

• Fluoreszenza) bei Tageslichtb) durch Anregung mit UV366 (UV-Lampe)

• Fluoreszenzminderung: erfordert Fluoreszenzindikator(Anregungsstrahlung: UV254)

• chemische Farbreaktionen (→ Sprühreagentien), z.B.:I2 (Lsg. od Dämpfe) braune Flecken bei basischen N-VerbindungenKMnO4 weiße Flecken auf rosa Grund bei reduzierenden Verb.Dragendorff orange-gelbe Flecken bei AlkaloidenFeCl3 zart-violette Flecken bei Phenolen (int. grün bei 1,2-Diphenolen)Ninhydrin blauviolette Flecken bei Aminosäurenetc. etc.


a

Glasplatte

Sorbensschicht

Fließmittelfront

RF = c

RX = RSt =ab

c

b

a

. . .

St Pr St

3 mm

20 mm

5 mm

Charakterisierung desMigrationsverhaltens

• RF-Wert

• RX-Wert (RSt-Wert)

RF-Wert immer zwischen 0 und 1

RX-Wert auch > 1 möglich

hRF-Wert = RF-Wert x 100




Abhängigkeit des RF-Wertes

RF-Wert wäre eigentlich substanzspezifische Kenngröße, wären alle Einfluss-faktoren vollständig kontrollierbar; dies ist aber nicht der Fall, daher gewisserSchwankungsbereich. Experimentelle Faktoren, die den RF-Wert beeinflussenkönnen:

• durchschnittliche Korngröße• Aktivierungsgrad• Luftfeuchtigkeit• Schichtdicke• Art der Schichtherstellung• Sättigungsgrad der Kammeratmosphäre• Entwicklungstechnik• Länge der Laufstrecke• Substanzmenge u. a.


Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie /High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)

Schichtdicke 0.19 mmFleckdurchmesser 0.3 - 0.5 mmTeilchen 5 µm (eng klassiert)Trennstufenzahl ca. 3 x DCTrennstrecke 1 - 3 cmEntwicklungszeit 2 - 3 minNachweisgrenze 0.5 - 5 ng (DC: 5 - 50 ng)



Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie

Auftragen der Substanzen

in Lösung mit geeigneten Mikroliterspritzen; spezielle Auftrage-vorrichtung (z.B. „Linomat“)


Entwicklung

meist horizontal in Flachkammern, sodass praktisch kein Gasraum → daher hervorragende Reproduzierbarkeit. Phasenfluss ist konstant; Zufuhr des FM mittels Kapillareffekt (hydrostatisch mit FM versorgt).




Detektion

meist mittels Densitometer = DC-Scanner (bzw. HPTLC-Scanner)→ rel. genaue quantitative Auswertung möglich: Platte wird von Lichtstrahl abgetastet, Intensität des durchtretenden oder diffus reflektierten Lichtes wird gemessen und als Kurve aufgezeichnet


Säulenchromatographie (SC)Column Chromatography (CC)

Durchführung in vertikal montierter Glasröhre (=„Säule“; Länge einige cm bis m), Verhältnis Länge/Durchmesser ca. 40 : 1



Säulenchromatographie


Sorbentien: alle schon bei der DC angeführten Materialien; Teilchendurchmesser meist ca. 100 µm; Sorbens-Aktivität kann hier vergleichsweise einfach festgelegt werden.

Aktivitätsstufen nach Brockmann:

Wassergehalt (%)

Stufe Al2O3 Kieselgel

I*)

IIIIIIVV

0361015

010121520

*) nach Erhitzen auf 150°C




Problem der gleichmäßigen Dampfraumsättigung (s. DC) entfällt bei SC; Gleichmäßigkeit der Säulenfüllung wichtig für Trenn-ergebnis → Einschlämmen des Füllmaterials; Fließmittel wandert infolge der Schwerkraft, ev. geringer Über-druck (bis ca. 5 bar, MPLC = "medium pressure liquid chromatography"), falls Strömungsgeschwindigkeit bei Verkleinerung der Teilchengröße zu stark abnimmt.

In der Adsorptions-SC gelten die bekannten Elutionsreihen.Übliche Druchflussrate 1-10 ml/min.Auffangen von Eluatfraktionen (automatisierbar).Man erhält ein äußeres Chromatogramm


Entwicklungstechniken

• Elutionstechnik: am meisten verwendetSubstanzgemisch in konzentrierter Lsg. aufgetragen, mit FM so lange entwickelt, bis alle Substanzen nacheinander die Säule verlassen haben

• isokratische Elution: FM-Zusammensetzung konstant

• Gradienten-Elution: Elutionskraft wird stetig erhöht




Gradientenelution:

• Verkürzung der Analysenzeit• Verringerung des LM-Verbrauchs• Verbesserung des Trennergebnisses durch Zurückdrängen von „tailing“• Verbesserung der Peakform (schmäler, dafür höher), wichtig bei Peaks

mit großer Retentionszeit

• innere Gradienten: Polaritäts-, pH-, Konzentrations-, Ionenstärke-Gradienten

• äußere Gradienten: Temperatur, Durchflussrate


weitere Entwicklungstechniken

• Frontaltechnik:Verdünnte Lösung des zu trennenden Gemisches im Fließmittel wird kontinuierlich auf die Säule aufgegeben. Substanz mit geringster Retention erscheint als erste im Eluat rein, weitere Fraktionen sind dann Mischfraktionen.Anwendungsbeispiele:Entfernung von Peroxiden aus LM (Ether)Entfernung von Stabilisator-EtOH aus ChloroformEntwässern von LM

• Verdrängungstechnik:mobile Phase enthält „Displacer“, um stark retinierte Substanzen von der stat. Phasezu verdrängen; Anwendung v.a. in der Ionenaustauschchromatographie




Detektion

• diskontinuierlichZeit- oder Volumengesteuerte Fraktionskollektoren; Untersuchungder einzelnen Fraktionen mittels Farbreaktionen, DC, GC,...

• kontinuierlicha) UV/Vis-Durchflussphotometer 10-9 g/ml

(mit konstanter oder mit variabler Wellenlänge)b) Fluorimeter 10-10 g/mlc) Polarograph 10-11 g/mld) Differentialrefraktometer 10-7 g/ml

mehr zu Detektoren: s. HPLC


Anwendungen

• präparative Trennungen, auch im industriellen Maßstab

• zur chrom. Racemattrennung (chirale Sorbentien)

• zur Gel-Chromatographie bzw. Gel-Filtration

• zur Ionenaustausch-Chromatographie

• zur Lösungsmittelreinigung




Hochleistungs-FlüssigchromatographieHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Weiterentwicklung der klassischen SC; mit abnehmender Teilchengröße steigt erforderlicher Druck exponentiell an; Schwerkraft reicht nicht mehr aus, FM muss mittels geeigneter Einrichtungen unter Druck gesetzt werden (Pumpen): 20-200 bar.

Feinkörnigeres Material der stationären Phase (ca. 5 µm) → wesentliche Steigerung der Trennstufenzahl pro Säule gegenüber klass. SC erzielbar

ca. 50000-100000 Trennstufen/m

typische Säulenlänge 12.5 cm → ca. 10000 Trennstufen / Säule

Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)

GeräteaufbauSystem für Gradientenelution (schematisch)




GeräteaufbauSystem für Gradientenelution


GeräteaufbauPumpen: möglichst gleichmäßige Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase; häufigster Pumpen-Typ: Kurzhub-Kolbenpumpe → Kolben (meist aus künstl. Saphir) über Nockenwelle angetrieben; hohe Anforderungen an Dichtungen (bes. bei Verwendung aggressiver Medien: Puffer, Salzlösungen); Einlass- u. Auslassventil (Kugeln); Förderleistung meist 0-10 ml/min

Pulsationen: müssen gedämpft werden (wichtig bei best. Detektoren) → Pulsationsdämpfer oder Doppelkolbenpumpen (Gegentakt)Gradientenerzeugung:a) Niederdruck-Gradient: nur 1

HPLC-Pumpe notwendigb) Hochdruck-Gradient: 2 Pumpen

notwendig; besser reproduzierbar




GeräteaufbauProbenaufgabe: druckloses Einbringen der Probe in eine "Probenschleife" (Volumen 1 µl - 2000 µl, exakt reproduzierbar!), mittels Mehrweghahn-Vorrichtung (Probenventil) in Trennsäule gespült


GeräteaufbauProbenaufgabe mittels automat. Probenwechsler (Autosampler): Magazin mit einer größeren Anzahl an vorbereiteten Probenfläschchen beladen; Roboterarm mit Nadel, sticht durch Gummiseptum in das gewünschte Fläschchen, saugt Probelösung auf und injiziert automatisch über ein Probenventil; Gerät muss entsprechend programmiert werden; ermöglicht unbeaufsichtigte Serienanalysen (z.B. bei Qualitätskontrolle in pharm. Industrie, in diagnostischen Labors, bei Behörden etc.)




SäulenMaterial: meist Edelstahl, innen poliert, ev. glasbeschichtet; Endverschraubung mit Stahlfritte; Stahlkapillare mit Klemmring-Anschluss (z.B. "Swagelok").

Andere Variante: auswechselbare Kartuschen-Säulen aus gehärtetem Spezialglas (kostengünstiger als Edelstahlsäulen) + Kartuschenhalterung aus Stahl (einmalige Anschaffung).


SäulenInnendurchmesser: meist ca. 4 mm; präp. HPLC: auch 20 mm und mehrLänge: 5-50 cm; meist 12.5 oder 25 cm (Vorsäulen 2-5 cm)Säulenfüllen: Slurry-Verfahren → entgaste Aufschlämmung des Füll-Materials in geeignetem LM unter hohem Druck eingepresst




SäulenMontage: in entsprechender Halterung; vorteilhaft: thermostatisierbarer Säulenofen (Trennungen besser reproduzierbar, bes. bei Verteilungschromatographie)


Detektorenprakt. nur kontinuierliche Detektion selektive - unselektive Detektoren; unterschiedliche Empfindlichkeiten

• UV/Vis-Durchflussphotometera) mit konstanter Wellenlängeb) mit variabler Wellenlängec) Diodenarray-Detektor

• Fluorimeter

• Differentialrefraktometer

• Polarograph

• Leitfähigkeitsdetektor

• Massenspektrometer




UV/Vis-Detektorselektiv, nur UV/Vis-absorbierende Substanzen erfassbar; trotzdem relativ universell einsetzbar (Detektoren mit variabler Wellenlänge); Nachweisgrenze ca. 10-9 g/mlmeist 2-Strahl-Prinzip: Lichtquelle, 2 Strahlen durch Blenden/Linsen-Kombination, Küvetten aus Quarzglas, Photodiode, elektr. Verstärkung; statt (austauschbarem) Filter: Monochromator (stufenlose Selektion der Wellenlänge möglich); Bereich: 200-400 nm (mit Deuteriumlampe), 350-800 nm (mit Wolframlampe)

Fließmittel darf beigewählter Wellenlänge nicht absorbieren;

Gradientenelution möglich


Diodenarray-DetektorWeiterwentwicklung des UV/Vis-Detektors: viele Wellenlängen gleichzeitig erfasst; zusätzliche Information über substanzspezifische Eigenschaft (UV-Spektrum); graphische Darstellung in 3-dimensionaler Matrix; Array = Reihe (hier: Reihe von Photodioden; jede Diode misst Licht einer bestimmte Wellenlänge nach Auffächerung des polychromatischen Lichtstrahls mittels Beugungsgitter)




Diodenarray-Detektorauch Aussage über Peakreinheit (= Einheitlichkeit) möglich → Vergleich des UV-Spektrums an ansteigender Peakflanke mit UV-Spektrum an abfallender Peakflanke → müssen bei einem einheitlichenSubstanzpeak übereinstimmen (X-Achse: Chromatogramm, Y-Achse: UV-Spektrum)


Fluoreszenz-Detektor (Fluorimeter)

noch selektiver als UV/Vis

Prinzip: best. Substanzen durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt (Eigenstrahlung bei höherer Wellenlänge); Messung der Intensität des emittierten Lichtes erfolgt rechtwinkelig zur Richtung der UV-Anregungsstrahlung

Nachweisgrenze ca. 10-10 g/ml; ev. Derivatisierung mit fluoreszenzfähigen Reagentien → auch Verbindungen erfassbar, die von Haus aus nicht fluoreszieren




Brechungsindex-Detektor (Differential-Refraktometer)unselektiv, dafür universell verwendbar; rel. unempfindlich;Lichtquelle, Blende/Linse, Referenz- und Messzelle mit schräggestellter Trennwand (Winkel beeinflusst Empfindlichkeit), Spiegel, opt. Nullpunkt, Photodiode;Referenzzelle: mit reinem Eluenten gefüllt; genaue Thermostatisierung erforderlich (Brechungsindex ist temperaturabhängig!), kein Gradientenbetrieb möglich; Anwendung: z.B. für Zucker; Nachweisgrenze ca. 10-7 g/ml


Elektrochemischer Detektor (Polarograph)Oxidierbarkeit oder Reduzierbarkeit von Substanzen genutzt; mobile Phase muss gewisse Leitfähigkeit besitzen (ev. Zusatz geeigneter Elektrolyte)Messung des Stromflusses; sehr empfindlich (leider auch auf Pulsationen); selektivNachweisgrenze ca. 10-11 g/ml

Leitfähigkeits-Detektorbei leitender mobiler Phase zur Detektion von Ionen: 2 Elektroden, Spannung, Messung des Widerstandes




MS-Detektor (Massenspektrometer)Vorteil: hoher Informationsgehalt → Hochleistungstrennverfahren + Verfahren zur StrukturaufklärungGroßer apparativer Aufwand zur Kopplung der beiden Geräteteile (HPLC + MS) → Fließmittel muss entfernt werden (versch. Spray-Verfahren, z.B. „Electrospray“); Einschränkungen z.B. bei Wahl von Pufferlösungen


Detektor-Output:

• analoges elektr. Signal (Ausnahme: Diodenarray, MS)

• Spannung proportional Signalintensität → Schreiber, „manuelle“ Integration, elektron. Integrator,Datenstation (PC), A/D-Wandlung notwendig

• qualitative Information: Anzahl d. Peaks, Retentionszeiten (Identifizierung von Substanzen)

• quantitative Information: Fläche (ev. Höhe) eines Peaks→ Rückschluss auf Substanzmenge




Trennmechanismen• Adsorption: polare stationäre Phase;

Kieselgel (Si-OH-Gruppen): schwach sauerAluminiumoxid: meist basisch - neutralapolare mobile Phase: z.B. Kohlenwasserstoffe, Ether: definierter Wassergehalt! (z.B. 50% Sättigung)langsame Gleichgewichtseinstellung; Problem: Reproduzierbarkeit

• Verteilung: meist als Reversed-Phase-Chromatographie: RP-Säulena) Flüssig-flüssig-Verteilung: apolare flüssige stationäre Phase (auf inertem porösem Trägermaterial); polare (wässrige) mobile Phase;Gefahr des „Ausblutens“ der stat. Phaseb) chemisch gebundene Phasen (heute üblich): Alkylketten kovalent mit Kieselgel verknüpft, z.B. RP-18

Cl3Si-(CH2)17-CH3- HCl

Si O-SiCl2-(CH2)17-CH3

OH2

Si O-Si(OH)2-(CH2)17-CH3

(CH3)3SiClSi O Si

O-Si(CH3)3

O-Si(CH3)3

(CH2)17-CH3

Si OH +


Trennmechanismen• Gelchromatographie: Trennung nach Molekülgröße

soft-gels: wenig druckbeständig (z.B. Polyacrylamid), nur für SCsemi-rigid-gels: bis ca. 60 bar (vernetztes Polystyrol)rigid-gels: druckstabil (z.B. poröses Glas)

• Ionenaustausch-Chromatographie: Kationen-, Anionenaustausch; mobile Phase: Pufferlösung

• Ionenpaarchromatographie:Ionenpaar: Alternative zu Ionenaustausch und IonensuppressionSysteme für Kationen und Anionen verfügbar; Zusatz eines geeigneten Gegenions, z.B. Alkylsulfonate für Kationen, Tetraalkylammoniumverbindungen für Anionen; gemeinsame Solvathülle; chromatograph. Verhalten wie Neutralstoff; Trennung auf RP-Säulen möglich

• Bioaffinitätschromatographie: für biologische Problemstellungen; stationäre Phase: makromolekulare Verbindung mit „biologisch aktiven“ Gruppen; Wechselwirkungsprinzip: z.B. Antigen -Antikörper; Enzym - Ligand (Inhibitor)




Variationsmöglicgkeiten• stationäre Phase: Trennmechanismus (und damit Selektivität)• mobile Phase: bei Adsorption und Verteilung: Polarität; bei Puffern

(Ionenaustausch): pH, Ionenstärke• Gradientenelution: binär, ternär; auch Flussgradient

(innere/äußere Gradienten)• Temperatur: Säulenofen, Wasserbad

Derivatisierung• vor der Injektion: pre-column

Vorteil: Reaktionsbedingungen frei wählbar; chrom. Eigenschaftender Probe u.U. verbesserbarNachteil: Gefahr von Artefakten, ev. keine quant. Umsetzung

• nach der Elution (kurz vor Detektor): post-columnVorteil: Nebenprodukte irrelevant; zusätzlich 2. Detektor möglich Nachteil: technisch aufwendig, Reaktion muss in mobiler Phase ablaufen können, Reagens selbst darf kein Signal liefern


Anwendungen

• Analytik:universelle Methode, sehr flexibel, gut standardisierbar, auch für sehr geringe Probenkonzentrationen geeignet; quantitative Bestimmungen gut reproduzierbar; durch Kombination mit speziellen Detektoren (Diodenarray, Massenspektrometer) großer Gewinn an Information

• präparative Trennungen:HPLC sehr leistungsfähig, trotzdem weniger verbreitet infolge hoher Investitions- und Betriebskosten (Säulen,Lösungsmittel)




Gaschromatographie (GC)besondere Form der Säulenchromatographie, bei der als mobile Phase ein Gas fungiert; einsetzbar zur Trennung und qual. und quant. Bestimmung von Substanzen, die unzersetzt in die Dampfform übergeführt werden können, bzw. aus denen sich unzersetzt verdampfbare Derivate herstellen lassen. Verflüchtigungstemperatur 50-300°C.

Fest-Gas-Chromatographie (GSC): Adsorptions-Chrom.Flüssig-Gas-Chromatographie (GLC): Verteilungschrom.

Besonderheiten infolge niedriger Viskosität der mobilen Phase:• kurze Analysenzeiten• hohe Trennschärfe• sehr geringe Substanzmengen trennbar• Substanzen im Gaszustand → hohe Diffusionsgeschwindigkeiten,

daher rasche Einstellung der Gleichgewichte zwischen mobiler und stationärer Phase

Gaschromatographie (GC)

Zeit (min)

Trägergas

Säulenofen (thermostatisiert)

Proben- einlaß

Spritze Detektor

Schreiber

Chromatogramm

Regelventil

Säule

Prinzip des Geräteaufbaus

Probe wird mittels Injektionsspritze in den geheizten Probeneinlass eingebracht, dort verdampft sie augenblicklich und wird vom Trägergas durch die Trennsäule transportiert. Die mit dem Trägergas in den Detektor gelangenden getrennten Substanzen werden vom Schreiber/Integrator/PC als Peak erfasst.




Geräte

Die meist sehr lange, aber dünne Trennsäule ist nicht langgestreckt montiert, sondern aus Platzgründen aufgewickelt (s. rechtes Bild).


Trägergase:He, Ar, H2, N2 (wichtig!), CO2 (zunehmende Polarität)

H2: niedrigste Viskosität, daher auch bei längeren Säulen optimale Strömungs-geschwindigkeit gewährleistet, jedoch Explosionsgefahr;Durchflussgeschwindigkeit: 30-80 ml/min

Trennsäulen:gepackte Säulen: Edelstahl bzw. Glassäulen, Belastbarkeit bis 10 µl Lösung;

stationäre Phase ist auf Oberfläche eines inerten gekörnten Träger-materials aufgezogen; meist 2-3 mm Durchmesser, Länge: einige m

Kapillarsäulen: stationäre Phase befindet sich als dünner Film an der Innenwandeiner Quarzglaskapillare; meist 0.1-1 mm Durchmesser, Länge: 30-300 mBelastbarkeit 10-1 bis 10-3 µl Lösung (spezielle Injektoren: Split)wesentlich höhere Z erzielbar, wesentlich bessere Trennergebnisse• Dünnfilmkapillare: 2-3 µm dünner Film der stat. Phase• Dünnschichtkapillare: an Innenwand dünne Schicht von

mit stat. Phase belegtem Trägermaterial



Gaschromatographie (GC)Gaschromatographie (GC)

Stationäre Phasen:

für Adsorptions-GC

Adsorbentien:AktivkohleKieselgelAluminiumoxidMolekularsiebePoropak (poröses Polystyrol)Ionenaustauscher

für Verteilungs-GC

Trägermaterialien:KieselgelKieselgurTeflonGlaskugeln

Trennflüssigkeiten:SqualanApiezonfetteSiliconölePolyethylenoxidePolyetherPolyestercyanethylierte Alkohole, Glykole

steigendePolarität


Probenaufgabe:Mit Mikroliterspritze durch ein Silikongummiseptum; muss so erfolgen, dass die Probe augenblicklich verdampft. Gase: 0.1 - 10 ml; Flüssigkeiten:gepackte Säulen: 0.1 - 10 µl, Kapillarsäulen um Faktor 1000 weniger; Feststoffe: nur wenn ausreichende Flüchtigkeit gegeben ist, in LM gelöst, in Injektor wie Flüssigkeit eingebracht;

Für nicht unzersetzt verflüchtigbare Verbindungen → Derivatisierung zu flüchtigen Derivatena) Acetylierung: OH, NH2, NHR, z.B. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid

(mit hochempfindlichem ECD Fluor gut erfassbar)b) Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt

(z.B. mit N,O-bis-Trimethylsilylacetamid)

Trennung: isotherm (bei konstanter Temp.) oder mit programmiertem Temperaturanstieg → Temperaturgradient; Obergrenze, wenn stationäre Phase zu verdampfen beginnt („Säulenbluten“ = "bleeding")



Detektoren für die Gaschromatographie

Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD):Vergleich der Wärmeleitfähigkeit des Trägergases allein und des Trägergases, das Komponenten der Probe enthält → Differential-Detektor. Beruht auf der Änderung des Widerstandes eines Heizdrahtes je nach Ausmaß, in dem ein ihn umgebendes Gas Wärme an die Detektorwand abtransportiert. Signal ist konzentrationsabhängig. Erfasst werden alle (auch C-freie) Verbindungen, welche die WLF des Trägergases verändern → universell


Flammenionisationsdetektor (FID):Eluat wird in eine Wasserstoff-Flamme geleitet und dort verbrannt. Gemessen wird die Zunahme der Ionen in der Flamme dadurch, dass der zwischen 2 Elektroden fließende Strom registriert wird. Angezeigt werden nur kohlenstoffhältige verbrennbareVerbindungen (also nicht Wasser, Edelgase, Stickstoff, CO, CO2, O2, CCl4, NH3)Das Signal ist massenstromabhängig; auch Halogen-, N-, P-selektive FIDs verfügbar.




Elektroneneinfangdetektor,Electron Capture Detector (ECD):Im Detektor befindet sich ein Beta-Strahler (63Ni, 3H). Gasraum ist durch freie Elektronen leitend. Substanzen, die Elektronen einfangen können (vor allem halogenhältige) führen zur Abnahme des gemessenen Elektronenstroms → zeigt Substanzen mit hoher Elektronenaffinität an

Massenspektrometer (MS):hochspezifisch (Kopplung on-line, heute nur mehr mit Kapillar-GC); Trägergas muss vollständig entfernt werden → leichter bei Kapillar-GC realisierbar;Aufzeichnung des Totalionenstroms (total ion current, TIC); zu jedem GC-Peak wird das entsprechende Massenspektrum erhalten (Vergleich mit Spektrenbibliotheken möglich)Bei fixer Einstellung des MS auf ein bestimmtes m/z Verhältnis → massenspezifische Detektion, "single ion monitoring" (SIM)


Anwendungen:

qualitative und quantitative Analyse von Gemischen flüchtiger Verbindungen; auch wenn sehr komplexe Gemische vorliegen (z.B. äther. Öle)

wenig verbreitet: präparative GC

Kopplung: Trennverfahren mit Nachweisverfahrenon-line: direkte Verbindung z.B. GC-MS, auch GC-IR (hier FT-IR)off-line (Transfer erforderlich), z.B. GC-NMR

Normierung des Retentionsverhaltens von Verbindungen möglich (Kovats-Index, McReynolds-Konstante)



weitere chromatographische Trennmethoden

Supercritical Fluid Chromatography (SFC):

Zwischenstellung zwischen HPLC und GCmobile Phase: überkritisches Fluid

Kompression eines Gases → Verflüssigung, aber nur wenn Temperatur unterhalb der sog. kritischen Temperatur liegt. Andernfalls → Gas immer dichter und dichter (Fluid), aber keine Kondensation zu flüssiger Phase.

• geringe Viskosität (ähnl. GC)• hohe Beladbarkeit (ähnl. HPLC)

mobile Phase: meist überkritisches CO2, ev. mit polarem “Modifier”, z.B. MeOH (bis zu 30%); ev. + “Additiva” (geringe Mengen Säure oder Base)

stat. Phase: z.B. stat. Phasen aus HPLC verwendbar


Supercritical Fluid Chromatography (SFC):

Kapillar-SFC: Erwartungen nicht ganz erfüllt → zurück zur SFC in gepackten Säulen

Druck mittels Restriktor bis nach dem Detektor aufrechterhalten(z.B. 30°C, 200 bar)

Detektoren: modifizierte HPLC-Detektoren, ev. auch FID




Gegenstrom-Verteilungschromatographie(Counter-Current Chromatography, CCC):

kommt ohne festes Trägermaterial für die flüssige stationäre Phase aus. Frühe Versionen: Craig-Apparatur, DCCC (Droplet Counter-Current Chromatography), RLCCC (Rotation Locular Counter-Current Chromatography);

neuere Entwicklung: HSCCC (High-Speed Counter-Current Chromatography) → stationäre Phase in spiralförmig aufgewickelten Kunststoff-schläuchen, die in einem Exzenter-System um zwei Achsen gleichzeitig rotieren; mobile Phase langsam durchgepumpt; gute Trennleistung, auch für präparative Trennungen geeignet (z.B. Phytochemie)


Gegenstrom-Verteilungschromatographie(Counter-Current Chromatography, CCC):

DCCC-Anlage HSCCC-Anlage




Auswertung von Chromatogrammen

• Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems

• Qualitative Auswertung eines Chromatogramms

• Quantitative Auswertung eines Chromatogramms

• äußere Chromatogramme (Elutionskurven)

• innere Chromatogramme

• Validierung von Analysenmethoden

Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems

die Auflösung (A)

angestrebt wird optimale Trennung (nicht unbedingt „maximale“ Trennung), nähere Definition über den Begriff der Auflösung:

Auflösung A = Maßzahl dafür, wie weit die Peaks zweier Substanzen (a, b) voneinander getrennt sind;

A ist eine rechnerische Größe, aus einem äußeren Chromatogramm ermittelbar:

A = 2 ·tR(b) - tR(a)

Bb + Ba

tR = Gesamtretentionszeit, B = Basisbreite des jeweiligen Peaks




die Auflösung (A)

Peaks können mit Hilfe der Wendetangenten zu Dreiecken vereinfachtdargestellt werden:

A = 0 : keine Trennung

A < 1 : unvollständige Trennung

A = 1 : Dreiecksformen getrennt, aberinfolge der Glockenform der Peaksnoch teilweise Überlappung

A = 1.5 und darüber: gute Trennung(Basislinien-Trennung)


die Auflösung (A)

Bei unvollständiger Trennung: Basisbreiten d. Peaks schwierig zu ermitteln→ Auflösung kann auch mit Hilfe der Halbwertsbreiten d. Peaks berechnetwerden.

A = 1.18 ·tR(b) - tR(a)

B0.5(b) + B0.5(a)




Qualität einer Trennung

Eine Verbesserung der Trennung zweier Substanzen (= Vergrößerung der Auflösung) kann erzielt werden durch:

Erhöhung der Selektivität mehr Trennstufen(z.B.: andere mobile Phase) (z.B.: kleinere Korngröße d. stat. Phase)


Zusammenhang zwischen der Auflösung (A) und der Zahl der Trennstufen (Z):

A = 41 . Z . .r - 1

r

k´b

k´b + 1

r : relative Retention

k´ : Kapazitätsfaktor



Qualitative Auswertung eines Chromatogramms

• Anzahl der Substanzen in einem Gemisch:Anzehl der Flecken auf innerem Chrom. (DC, HPTLC)Anzahl der Peaks in äußerem Chrom. (HPLC, GC, ...)

• Wanderungsverhalten der einzelnen Substanzen:RF-Wert bzw. RX-Wert bei innerem Chrom.k´-Wert bei äußerem Chrom.

• Kombination mit weiterer Information aus Detektionsmethode:spezifische Nachweisreaktionen auf DC-Plattespektroskopische Information, z.B. aus Diodenarray-Detektor (HPLC), Massenspektrometer (GC, HPLC)

Quantitative Auswertung eines Chromatogramms

äußere Chromatogramme (Elutionskurven)

Fläche unter dem Peak ist proportional der Substanzmenge, die eluiert wurde; Dagegen ist die Peakhöhe ebenso wie die Peakbreite auch abhängig von der Retentionszeit ( → Peakhöhe ist nur inbestimmten Fällen zur Quantifizierung geeignet; besser: Fläche).

Ermittlung der Peakfläche:• elektronische Integration (Integrator, PC)

• Ausschneiden der Peaks (aus Kopie des Chromatogramms) und Wägen → Gewicht ist proportional der Fläche

• Berechnung mit Hilfe der Peakabmessungen:

F = h . B0.5. 1.0632




Standardisierungsmethoden:

Interner Standard: eine weitere Substanz in bekannter Konz. wird dem Analysengemisch zugesetzt; Flächenverhältnis für Analysensubstanz-Peak zu Standardsubstanz-Peak separat ermitteln (in mehreren Konzentrationen) → Eichgerade

Externer Standard: Authentische Analysensubstanz wird in getrennten Analysenläufen in jeweils bekannter Konz. vermessen → Eichgerade; hier: kein zusätzlicher Peak im Chromatogramm, aber höhere Anforderungen an Reproduzierbarkeit der Bestimmung (Probenvorbereitung, Detektor-Empfindlichkeit, Genauigkeit des injizierten Probenvolumens, usw.)


innere Chromatogramme

Fleckengröße (visuell): wichtig für quantitative bzw. semiquant. Auswertung, jedoch kein linearer Zusammenhang mit Substanz-menge:

= prop. log M F : Fleckengröße

M : Substanzmenge

beobachtete Fleckengröße hängt von verschiedenen Faktoren ab

F



Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms

Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße:• Nachweisgrenze der verwendeten Detektionsmethode


Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße:• aufgetragene Substanzmenge




Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße:• Länge der Laufstrecke


• semiquantitative Abschätzungdurch visuellen Vergleich der Fleckengrößen von Analyt undVergleichslösungen (Verdünnungsreihe) mit bekannter Konz.(auf DC-Platte abwechselnd aufgetragen)

• Off-line-QuantifizierungFlecken bzw. Bänder abschaben, mit LM eluieren → Photometer(UV), Polarographie, Titration, etc.

• In-situ-Quantifizierungohne Zerstörung der Trennschicht; Messung von Farbe, Fluoreszenz, Fluoreszenzminderung, UV-Absorption eines Flecks;Chromatogramm wird am Fenster eines Messgerätes (DC-Scanner = Densito-meter) vorbeigeführt und das gemessene Phänomen bezüglich seiner Intensität in Bezug gesetzt zum Ort. Ergebnis wird von Schreiber aufgezeichnet. Man erhält Peaks: im Fleckenmittelpunkt ist Substanzkonzentration am größten, nach außen zu abnehmend.




Messprinzipien bei der in-situ-Quantifizierung(häufig angewandt: Messung der Lichtabsorption im UV/Vis-Bereich)

• Messung in Transmission

Messung im Durchlicht; infolge von Streueffekten gilt hier das Lambert-Beer'sche Gesetz nicht. Es muss mit Eichfunktionen gearbeitet werden; nicht unter 330 nm möglich (mangelnde UV-Durchlässigkeit der Glasplatte).

• Messung in Remission

Licht wird in einem best. Winkel auf Schicht gestrahlt, wird dort diffusreflektiert. Man misst Intensität des reflektierten Lichtes und vergleicht Intensität an leerer Stelle der Schicht und an Stelle mit Substanzfleck; empfindlicher; bis hinunter zu 220 nm möglich


Validierung von chrom. AnalysenverfahrenÜberprüfung und Bewertung der Aussagekraft des jeweiligen Verfahrens anhand einer Reihe von Parametern, die experimentell bestimmt werden.

Parameter: Aussage über:Genauigkeit systematische und zufällige FehlerRichtigkeit systematische FehlerPräzision zufällige FehlerWiederholpräzision laborinterne ReproduzierbarkeitVergleichspräzision Reprod. von Labor zu LaborLinearität Zusammenhang Signal/KonzentrationWiederfindungsrate Ausbeute der ProbenvorbereitungSelektivität Störungen durch BegleitstoffeRobustheit Störanfälligkeit durch veränderte ParameterNachweisgrenze kleinste nachweisbare MengeBestimmungsgrenze kleinste quantifizierbare Menge

Dokumentation, GLP, ISO9000



Trenn- und Analysenmethoden organischer Arzneistoffe

Literatur zum Thema „Trennmethoden“

• J. BöckerChromatographieVogel Buchverlag, Würzburg, 1997

• A. Dominik, D. SteinhilberInstrumentelle AnalytikDeutscher Apotheker Verlag, Stuttgart, 2002

• G. Rücker, M. Neugebauer, G. G. WillemsInstrumentelle Pharmazeutische AnalytikWissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, 2001

Date post:	22-Aug-2019
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Trenn- und Analysenmethoden organischer...

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