42. Seminar über Versuchstiere und Tierversuche, Berlin, 10‐11. September 2013
Tiermodelle zur Etablierung und Optimierung von Knorpelersatztherapien bei Knorpelschaden
G d l S h l T il
Charité‐Universitätsmedizin Berlin, CBF,
Gundula Schulze‐Tanzil
, ,Klinik für Orthopädische, Unfall‐ und Wiederherstellungschirurgie
heute
● Gelenkknorpel und Knorpelschadenp p
● Aktuelle Therapiemethoden
● Unmet medical need
● Tiermodelle
Campus Benjamin Franklin Klinik für Orthopädische, Unfall‐ und Wiederherstellungschirurgie
K l fb
Gelenkknorpel
KnorpelaufbauextrazelluläreKnorpelmatrix
(ECM)knorpe
l
Chondrozyten
(ECM)
Gelen
kkhe
n
Chondrozyten
Knoch
rot: Proteoglykane
Knorpelmarker: Kollagen Typ II
Cho
Kollagen Typ IIAggrekan
ndron
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Knorpel
G l kk l K l tGelenkknorpelzonen, Knorpelarten
III
Tidemark
II
III
Tidemark
IV
Gelenkknorpelblau: Proteoglykane Knochen
(K i h )(Kaninchen)
Perichondrium
Nasenseptumknorpel Ohrknorpel
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subchondraler Übergang
Kapillarschlingenreichen in kalzifizierten Knorpel
GelenkknorpelGelenkknorpel
Tidemark
kalzifizierter Knorpel
subchondralerZementlinie
Hargrave‐Thomas EJet al., 2013, J Anat: in press
subchondraler Knochen
Spongiosa
Madry H et al., 2010, Knee Surg Traumatol Arthrosc 18: 419‐433Knee Surg Traumatol Arthrosc 18: 419‐433
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Knorpeldefekte
rtial
hickne
ss
pa
full th
Knorpel
Therapie
h d l
Knochen
Totalendoprotheseße
Knorpelzell‐Trans‐
Therapie
chondral
OCT,Mikrofrakturierung
p
Defektgröß
…
Transplantationen
18 Jahre 50 (55) Jahre
Mikrofrakturierung …
D
Alter
osteochondral
18 Jahre 50 (55) Jahre
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Mensch: meist chondrale Defekte
KnorpelzelltransplantationenACT: Autologe Chondrozyten Transplantation
Kollagenmembran
ACT: Autologe Chondrozyten Transplantation
Kollagenmembran
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Veränderung von Chondrozyten in vitro
kultivierte Chondrozyten:1. Tag 5. Tag
Kollagen Typ II
Dedifferenzierung
DreidimensionaleKultur
gMonolayerkultur:Fibroblasten‐ähnliche MorphologieProliferation ↑, Kollagen Typ II, Aggrekan…↓
Redifferenzierung
Kollagen Typ I ↑
Beispiele klinisch eingesetzter Chondrozytentransplantate
Novocard 3D
Novocard 3D
Chondrosphere
Novocard 3D
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HE HE
Knorpelersatz: Beispiele Zell/Biomaterial‐basierte VerfahrenVerfahren
Technik Produkt (Hersteller)1. Generation: Zellsuspension mit Periostlappen„ACT“ ACT-Biotissue (BioTissue), Carticel (Genzyme), ChondroCelect (TiGenix)
Chondrotransplant (Co.don)
2 Generation: Zellsuspension mit Kollagenmembran2. Generation: Zellsuspension mit Kollagenmembran
ARTHROcell 3D (CellGenix/Geistlich/Ormed), Chondro – Gide (GeistlichBiomaterials)
3. Generation: Zell-Matrix-Konstrukt „MACT“Hyaluronsäure-Vlies Hyalograft C (Anika Therapeutics)
K ll b A th M t i (O th ) MACI (M t i i d d t l h d tKollagenmembran ArthroMatrix (Orthogen), MACI (Matrix induced autologous chondrocyteimplantation (Verigen)
Kollagenmatrix NOVOCART® (TETEC)
Polymerflies BioSeed-C (BioTissue)
4. Generation: 3D-KnorpelzellkonstruktACT-3D“ Chondrosphere (Co don) NOVOCART®inject (TETEC)„ACT-3D Chondrosphere (Co.don), NOVOCART®inject (TETEC)
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Knorpelersatz: Vorläuferzell‐basierte Verfahren
● Implantation von autologen Vorläuferzellen in Knorpeldefekt: Chondrogenese
Steinwachs et al., 2011: KlinischeB h dl
● Implantation von autologen Vorläuferzellen in Knorpeldefekt: Chondrogenese
Behandlung von Gelenkknorpelschädenmithilfe von autologen VorläuferzellenB ndesges ndheitsbl 54Bundesgesundheitsbl 54,797
Aspiration von Knochenmarkblut
Beladung einerKollagenmembran
Einnähen der Membranin den Defekt
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Unmet medical need
● schnelles, einzeitiges, arthroskopisches Verfahren entwickeln
● Entnahmemorbidität reduzieren (alternative Zellquellen?)
● Dedifferenzierung in der Kultur vermeiden
● ideales Biomaterial: biokompatibel, biomechanisch stabil, langsam resorbierbareinfaches Handling, chondrokonduktiv…
● Kryokonservierung
viele dieser Aspekte müssen im Tiermodell erarbeitet werden
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TiermodellForschungsansätze zur GelenkknorpelrekonstruktionTiermodell
in vitro
Schulze‐Tanzil, 2009Ann Anat 191,325‐38.
)
Was ist besonders an menschlichem Knorpel?cke (m
m)
Haustiere: Körpergewicht korreliert i. W. mit Knorpeldicke (Maus, Ratte, Katze, Kaninchen, Hund, Schaf, Rind)
Knorpe
ldi
Mensch: größte Knorpeldicke, geringste Zelldichte!Stockwell RA 1971,
J Anat 109, 411K
Körpergewicht (kg)
Spezies Gewicht (kg) Knorpeldicke (mm) Zelldichte (x 103/mm3)
FemurkondylenSpezies Gewicht (kg) Knorpeldicke (mm) Zelldichte (x 103/mm3)
Mensch ca. 72 2,26 14,1
Rind ca. 600 1,68 19,8
Knorpeldicke:Schwein: 1,5‐2 mmPf d 2 2
Schaf ca. 50 0,84 52,9
Hund ca. 24 0,67 44,4
Kaninchen ca 3 2 0 21 188
Pferd: 2,2 mmAhern BJ et al., 2009, Osteoarthritis
Cartilage 17, 705
Kaninchen ca. 3,2 0,21 188
Katze ca. 2,3 0,33 108
Ratte ca. 0,3 0,07 265 Stockwell RA 1971, J A t 109 411
Maus ca. 0,025 0,06 334J Anat 109, 411
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Was ist besonders an menschlichem Knorpel?Mensch
Schwein Kaninchen Ratte
Speziesunterschiede im Gelenkknorpel (Knie)!Kn
orpe
l‐oglykane
blau
: KProteo
Proteoglykanverteilung: unterschiedlich0
Proliferation + Dedifferenzierung: Mensch < Schwein < Schaf, Pferd Passage‐0
ssage 1
Schulze‐Tanzil G et al., 2009 Histochem Cell Biol 131,219‐29.
Pa
PferdSchafSchweinMenschWas ist besonders an menschlichem Knorpel?
rot: Kollagenassage‐0
rot: Kollagen Typ IIgrün: Aktinblau: Zellkerne
Pae‐1
Passage
sage‐0
rot: KnorpelProteoglykaneblau: Zellkerne
Pass blau: Zellkerne
Passage‐1
Schulze‐Tanzil G et al., 2009 Histochem Cell Biol 131,219‐29.
P
Polyglykolsäure (PGA) Scaffolds in vivo (nude mice)PGA Kultur
6 Wochen 12 Wochen1 Woche
3 Wochen
Ø 6 mm
6 Wochen 12 Wochen1 Wochekulär
in vitro
artik
ärten
subkutane Implantation aurikulä
hond
rozyt
Nacktmaus für 1, 6, 12 Wochen
osep
talCh
g
artikuläreaurikulärenasoseptale
ina
so
veränd
erun
g p
Zell‐frei
resorbiert
% Größe
nv1 Woche 12 Wochen6 Wochen
Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57‐69.
6 Wochen 12 Wochen1 WochePGA in vivo (nude mice), Proteoglykane
rtikulär PGA
arär
100 µm100 µm
kane
ten
aurikulä
roteoglyk
hond
rozyt
septal
norpel Pr
Ch
nasos
blau
: K
Zell‐frei
resorbiertFibrin
Z
Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57‐69.
Kollagen Typ II6 Wochen 12 Wochen6 Wochen
Ca++ Nachweistikulär
positive KontrolleGelenkknorpel ti
kulär
100 µm100 µmart
r
Gelenkknorpel100 µm100 µm
art
ären
aurikulä
aurikulä
ondrozyte
septal
septal
Ch
nasos
nasos
Zell‐frei
resorbiertZell‐frei
Z
Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57‐69.
Z
PGA in vivo (nude mice), Histologie
PGAPGA
*
PGA‐Scaffolds18
**
**** ***
articuläreauriculärenasoseptale
artikuläreaurikuläre
12
14
16
er Score
Zell‐freiChondrozyten
4
6
8
10
tologische
0
2
4
1 6 12
hist
in vivo Zeit (Wochen)
Lohan A et al., 2011 Histochem Cell Biol 136,57‐69.
PGA im osteochondralen Defekt (Kaninchenmodell)3 Wochen
relebende/tote Zellen
n3 Wochenin vitro PGA
artikulär
ndrozyten
läre
50 µm50 µm
loge Cho
nau
riku
autol
Analyse der h d l
in vivo
osteochondralenDefektheilung(6 + 12 Wochen)Implantation in osteochondralenImplantation in osteochondralen
Knorpeldefekt (Patellagleitlager)
Lohan A et al., submitted.
PGA im KaninchenmodellPGA
makroskopische Beurteilung
Chondrozytenartikuläre aurikuläre Zell‐frei Leerdefekt
Chondrozyten6 Wochen
12 Wochen
Woche
n
8
10
12
14Makroscore
6
0
2
4
6
8
ar
au Ze Lertikulär
urikulär
ell‐frei
eerdefekt
Lohan A et al., submitted.
PGA im KaninchenmodellPGA
mikroskopische Beurteilung
20
25
e
*Zeit in vivo
15
20
cher Score
12 Wochen
6 Wochen
5
10
histologisc
0
5h
Chondrozyten
Lohan A et al., submitted.
Schwein als Knorpelmodelljuvenil (3‐5 Monate)
Göttinger Minipig Hybridschwein
5000
Femur Kondylen: Minipig vs. Hybridschwein lat.
***
* 2000
3000
4000
µm
links: medial rechts: lateral
*Hybridschwein Minipig
0
1000
*Sehne: M extensor digitorum longuslinks: medial, rechts: lateral y p gSehne: M. extensor digitorum longus
BlutgefäßeHybridschwein Göttinger Minipig
Minipig lat. vs. med.
lateral
ossifizierende Zellen in der KulturMüller C et al., 2013 Exp Biol Med in press.
Schwein als Knorpelmodelljuvenil
Hybridschwein Göttinger Minipig
Zellverteilung
juvenil
gin Zone I‐III
kultivierte Chondrozyten
kultivierte Chondrozyten
Kollagen Typ II Sox9Aggrekan
*g yp
expression
15
20
25
4
5
6
3
4 *gg
elative Gen
e
0
5
10
15
0
1
2
3
4
1
2
Müller C et al., 2013 Exp Biol Med in press.
re Hybridschwein Göttinger Minipig0
Hybridschwein Göttinger Minipig0
Hybridschwein Göttinger Minipig0
PGA im MinipigmodellPGA
10makroskopischer Score
6
8
in vivo
8 mm chondraler full thickness Defekt
0
2
46 Monate
PGA im Defekt artikulär aurikulärLeerdefekt
artikulär aurikulär Leerdefekt0
fertige Knorpelnaht
Lohan A et al., 2013Ann Anat in press.
PGA im Minipigmodell15
20
25 histologischer Score
gesunder artikulär aurikulär Leerdefekt0
5
10
in vivo 6 Monate
aa
Leerdefekt aurikulärartikulär
ger
Knorpel
HE
* **500 µm500 µm
gering
H
*ößerun
g:öh
er
* *100 µm100 µmVergrö hö
ne
**geringer
orpe
l‐oteo
glyka
*500 µm500 µmKno
pro
Lohan A et al., 2013Ann Anat in press.
PGA im Minipigmodell15
immun‐histologischer Score
5
10
in vivo 6 Monate
aurikulärartikulärLeerdefektgesunderKnorpel
artikulär aurikulär Leerdefekt0
Typ II
***
gen
p I
50 µm50 µm
* *
Kol
lag
Typ *
*
nTyp X
*
*
*Kol
lage
n
Lohan A et al., 2013Ann Anat in press.
K
Zusammenfassung
Mensch: einzigartige Anatomie und ungünstige Knorpelbiologie
osteochondrale/chondrale Defektmodelle
Großtiermodell Schwein: zeigt knorpelbiologische Ähnlichkeiten zumGroßtiermodell Schwein: zeigt knorpelbiologische Ähnlichkeiten zum Menschen, Rasse‐/Linien‐typische Unterschiede
gute Verträglichkeit des Biomaterials PGA, aurikuläre Chondrozyten als Zellquelle denkbar
Acknowledgement
Prof. Dr. med. Wolfgang Ertel
Dr. med. vet. Anke Lohan, Dr. Riccarda MüllerUlrike Marzahn, Dr. Karym El Sayed, Claudia Müller
PD D A d H i h D K h i S öl lPD Dr. Andreas Haisch, Dr. Katharina Stölzel
Carola Meier, Marion Lemke, Benjamin KohlClaudia ConradClaudia Conrad
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!Bayer Innovation GmbH
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Campus Benjamin Franklin Klinik für Unfall‐ und Wiederherstellungschirurgie mit dem Arbeitsbereich Orthopädie
