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ó Das therapeutische Vorgehen in derOnkologie hat sich in den letzten Jahrenstark gewandelt. Eine zunehmende Zahlgenetischer Biomarker wurde beschrieben,die von prognostischer oder prädiktiverBedeutung sind und direkte Relevanz für dieBehandlung haben. Unterschieden werdenhierbei somatische, das heißt tumorspezifi-sche Mutationen, von Keimbahnverände-rungen, die in allen Körperzellen vorkom-men und über Generationen vererbt werdenkönnen. Der Fokus dieses Artikels liegt aufden somatischen Tumormutationen. Bekann-teste Beispiele für diesen Typus vonDNA-Varianten sind KRAS-Mutationen beikolorektalen Karzinomen [1, 2] oder BRAF-Mutationen bei Melanomen [3], die zur prätherapeutischen Stratifizierung bei derTherapieplanung bereits seit Längerem imRahmen der molekularpathologischen Dia-gnostik analysiert werden. Der technologi-sche Fortschritt im Bereich der Sequenzie-rung, namentlich Next Generation Sequen-cing (NGS) [4], ermöglicht nun seit einigenJahren die parallele Analyse einer Vielzahlvon Genen. Ganze Tumorgenome könneninnerhalb weniger Tage analysiert werden[5]. Die Interpretation der gefundenen Varianten ist jedoch komplex und hängt auchvon der zugrunde liegenden Art der Tu -morerkrankung ab. So konnte z. B. gezeigtwerden, dass Patienten mit BRAF-mutier-tem kolorektalem Karzinom im Gegen-satz zu Melanompatienten nicht immer voneiner BRAF-gezielten Therapie profitieren[6]. Fundierte Kenntnisse über somatische Mutationen und die zugehörigen Signalkas-kaden im Kontext der Pathologie sind not-wendig, um eine mögliche therapeutischeRationale von genetischen Daten abzuleiten.Um mit diesen neuen Methoden eine mög-lichst schnelle Umsetzung von wissen-schaftlichen Ergebnissen zu erreichen, wur-den in Tübingen Rahmenbedingungengeschaffen, die es erlauben, komplexe gene-tische Datensätze schnell in die Klinik zubringen.

Translationale Onkologie

Somatische Tumormutationen eröffnen neue Therapieoptionen

CHRISTOPHER SCHROEDER1,2, PETER BAUER1,2, FALKO FEND3, OLAF RIESS1,2

1INSTITUT FÜR MEDIZINISCHE GENETIK UND ANGEWANDTE GENOMIK,

UNIVERSITÄTSKLINIKUM TÜBINGEN, 2GENES AND THERAPY GMBH, TÜBINGEN,3INSTITUT FÜR PATHOLOGIE UND NEUROPATHOLOGIE, UNIVERSITÄTSKLINIKUM

TÜBINGEN

Prognostic or predictive somatic genetic biomarkers influence therapeuticdecisions in oncology. With the availability of next-generation sequencing(NGS) technologies, large numbers of somatic and germ line mutationscan be analysed in parallel both, from formalin-fixed, paraffin-embeddedtissue (FFPE) and fresh frozen tissue at high quality. In this study we evalu-ated the feasibility, turn-around time and diagnostic usefulness of high-throughput NGS analyses in the clinical setting and offered two differentdiagnostic sequencing panels to 52 selected patients.

10.1007/s12268-014-0417-2© Springer-Verlag 2014

˚ Abb. 1: A, Übersicht über den Probenfluss. Nach Selektion eines Patienten in der Klinik wirdeine Tumorprobe, sofern nicht bereits verfügbar, und eine Referenzblutprobe gewonnen. Am Insti-tut für Pathologie wird die Tumorprobe analysiert und DNA aus einem Bereich mit einem mög-lichst hohen Tumoranteil (> 80 %) isoliert. Die Sequenzierung erfolgt am Institut für MedizinischeGenetik und die anschließende Interpretation der Varianten wird im Rahmen eines interdisziplinä-ren Tumorboards durchgeführt. Die angestrebte Dauer der Analyse bis zu einem medizinischenAbschlussbericht beträgt zwei Wochen. B, Übersicht über die in dieser Studie verwendeten Pro-ben. Insgesamt wurde Tumorgewebe von 52 Proben sequenziert. AML: akute lymphatische Leukämie, CC: Kolonkarzinom, CCC: cholangiozelluläres Karzinom, HCC: hepatozelluläres Karzi-nom, LC: Lungenkarzinom, NET: neuroendokriner Tumor, OC: Ovarialkarzinom, PC: Pankreaskarzi-nom, RCC: Nierenzellkarzinom, S: Sarkom, UM: uveales Melanom, benign: kein Tumornachweis,CUP: cancer of unknown primary.

A B

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RahmenbedingungenIm Rahmen dieser Machbarkeitsstudie wurdeein Konzept für eine rasche Analyse mittelsmoderner genetischer Hochdurchsatzmetho-den und der Interpretation von Tumorvari-anten entwickelt (Abb. 1). Hierzu wurde eininterdisziplinäres, onkogenetisches Tumor-board, bestehend aus Onkologen, Pathologenund Genetikern, gegründet, das sich in regel-mäßigen Abständen zu Falldiskussionen trifft.Ausgewählten Patienten, das heißt Patienten,bei denen eine Standardtherapie nicht ver-fügbar ist bzw. keine therapeutische Antworterreicht werden kann, wurde zusätzlich eineNGS-Tumorsequenzierung von therapierele-vanten Genen angeboten. Diese Sequenzie-rung beinhaltete initial ein kommerziell ver-fügbares Gen-Panel für Mutations-hot spotsin 48 Genen (http:// support. illumina. com/sequencing/sequencing_kits/truseq_amplicon _cancer_panel.ilmn) und wurde im Ver-lauf auf ein Panel mit 182 Genen erweitert(www.genesandtherapy.de/?q=Tumordia gnos

tik), welches die komplette codierendeSequenz dieser Gene abdeckt. Analysiert wur-den bisher insgesamt 52 unterschiedlicheTumorproben, sowohl FFPE als auch nativesGewebe. 47 Analysen wurden mit dem 48-Gen-Panel und elf Analysen mit dem 182-Gen-Panel durchgeführt. Sechs Proben, in denenkeine relevanten Veränderungen mit dem 48-Gen-Panel gefunden wurden, wurdenanschließend mit dem 182-Gen-Panel sequen-ziert. Zusätzlich zur Tumorprobe wurde eineReferenzprobe (in der Regel Blut) analysiert,um Keimbahnveränderungen von somati-schen Mutationen trennen zu können. DieDauer der Analyse bis zur Erstellung einesmedizinischen Berichts beträgt rund zweiWochen.

Somatische MutationenDie Detektion somatischer, also tumorspezi-fischer Mutationen in Tumorgewebe ist kom-plex, da es sich in der Regel um kombinierteMosaike handelt. Zum einen ist Tumorgewe-

be ein Gemisch aus Tumorzellen und gesun-den Zellen (z. B. Stützgewebe, Gefäße), zumanderen entwickeln sich Tumorzellen klonalund erwerben zusätzliche Mutationen überdie Zeit. Somit enthält Tumorgewebe selbstein Mosaik unterschiedlichster Tumorzellen.Erschwerend kommen häufig copy number-Varianten – Amplifikationen oder Deletionen– von Genabschnitten hinzu. Die Präanaly-tik, das heißt Behandlung, Fixierung undpathologische Analyse des Tumorgewebes,hat daher für die Qualität der Daten eine ent-scheidende Bedeutung. Nach der Sequenzie-rung erfordert die anschließende Charakteri-sierung der Mutationsdaten auf diese Situa-tion spezialisierte Analysepipelines. Aufgrundder Vielzahl von unterschiedlichen Tools, dieverfügbar sind, wurden vom ICGC (Interna-tional Cancer Genome Consortium) erste Emp-fehlungen zur Analyse von NGS-Daten ausTumorgewebe publiziert [7]. Eine möglicheAnalysepipeline, wie sie für unsere Sequen-zierungen zur Anwendung kommt, zeigtAbbildung 2. Zwei unterschiedliche Sets vonSoftware-Programmen wurden zur Auswer-tung verwendet und die bioinformatischenErgebnisse anschließend verglichen. Um einesichere Mutationsdetektion zu gewährleisten,werden Frequenzen mutierter Allele von min-destens fünf Prozent gefordert. Insgesamt istdavon auszugehen, dass es bei einer hohenAllelfrequenz einer somatischen Mutation imTumorgewebe eine höhere Wahrscheinlich-keit gibt, dass es sich um eine therapeutischangehbare, relevante „Treibermutation“ han-delt. Um Mutationen sicher zu identifizieren,streben wir eine durchschnittliche Tiefe von1.000 auswertbaren Sequenzen je Base an –für das 48-Gen-Panel wurden durchschnitt-lich 1,6 × 106 reads und für das 182-Gen-Panel 5,9 × 106 reads generiert. Diese hoheSequenziertiefe wird insbesondere für FFPE-Material benötigt, da die DNA unter der Fixie-rung leidet. Durchschnittlich wurden im 48-Gen-Panel 97,84 Prozent und im 182-Gen-Panel 88 Prozent der Zielregion mit einer 100-fachen Mindesttiefe abgedeckt. Außerdemwurden Mutationen im 48-Gen-Panel in68 Prozent der Proben und im 182-Gen-Panelin 100 Prozent der Proben gefunden. EineÜbersicht über die gefundenen COSMIC-ge -listeten Mutationen finden sich in Abbil-dung 3. Hierunter waren auch potenziell the-rapeutisch relevante somatische Mutationenin KRAS, BRAF, MTOR, KIT und ERBB2. Fürfünf Patienten war im Vorfeld eine Analyseauf KRAS-Mutationen am Institut für Patho-logie und Neuropathologie (Universitätskli-

˚ Abb. 2: Übersicht über den verwendeten NGS-Workflow. Beginnend mit den fastq-Dateien desSequenziergeräts aus einem paired-end-Lauf (Read1, Read2) werden zuerst Sequenzieradapterabgeschnitten, ein Mapping gegen das Referenzgenom vorgenommen, Duplikate entfernt und einlokales Realignment durchgeführt. Ist keine Referenzprobe vorhanden, erfolgt die Variantenanaly-se ausschließlich über A. Die Filterkriterien für die schlussendliche Variantenfilterung basierenauf festen Schwellenwerten (u. a. Allelfrequenz > 5 %, kein häufiger Polymorphismus). Sind sowohlTumor- als auch Normalprobe vorhanden, so erfolgt das Varianten-Calling mittels Tools, die aufVariantendetektion in vergleichenden Proben spezialisiert sind (B). Auch hier erfolgt eine finaleFilterung anhand von Plausibilitätswerten. Im Schaubild sind sowohl die Namen der verwendetenTools als auch die Versionsnummern ablesbar.

A

B

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nikum Tübingen) durchgeführtworden, und die Ergebnisse füralle fünf Fälle stimmen mit denErgebnissen aus der NGS-Ana-lyse überein (drei Patientenwaren Mutationsträger, zweinicht). Alle gefundenen Vari-anten werden nach Abschlussder Analysen im gemeinsamenmolekulargenetischen Tumor-board besprochen. Aufgrundder Ergebnisse bietet sich dieMöglichkeit, dass anhand derdetektierten Mutationen neueTherapiemöglichkeiten eröff-net werden (siehe auch [8]).

KeimbahnmutationenKeimbahnmutationen werdenvon den Eltern ererbt und anNachkommen weitergegeben.Hierunter fallen Mutationen,die sich z. B. auf den Medika-mentenstoffwechsel auswirkenkönnen oder auch Bedeutungfür familiäre Erkrankungenhaben. Insbesondere Letzteresunterstreicht die Notwendig-keit einer interdisziplinärenZusammenarbeit – in unseremPatientenkollektiv konnten wirinsgesamt vier Mutationenidentifizieren, die auf einefamiliäre Prädisposition fürTumor erkrankungen hinwei-sen (Tab. 1). Besonders deut-lich wird diese Problematikanhand eines pädiatrischenPatienten, der an einem kolo-rektalen Karzinom erkranktwar. Hier ergab die Sequenzie-rung die Diagnose einer fami-liären Form von Darmkrebs,dem Lynch-Syndrom. Nebenden somatischen Veränderun-gen werden Keimbahnmuta-

tionen, die das familiäre Risiko für Krebser-krankungen nachgewiesenermaßen erhöhen,auf Wunsch des Patienten zurückberichtet.Dies geht immer mit dem Angebot einerhumangenetischen Beratung einher.

ZusammenfassungSomatische Tumormutationen sind bereitsheute für die Therapieplanung bei onkologi-schen Patienten relevant und werden inZukunft weiter an Bedeutung gewinnen. Die

APC I1307K 48 Gene 26697 18–30 % Lebenszeitrisiko für ein kolorektales Karzinom

MSH2 Q429X 48 Gene – HNPCC-Syndrom

MET T1010I 48 Gene – unklar, beschrieben bei kolorektalem Karzinom

TP53 G245C 182 Gene 562653 unklar

Tab. 1: Keimbahnmutationen bei einer Patientenkohorte, in der insgesamt vier Keimbahnmutationenidentifiziert wurden, die mit einer familiären Form einer Krebserkrankung in Verbindung stehen bzw.stehen könnten. Bei zwei Patienten wurden Mutationen gefunden, die in klarem Zusammenhang miteinem erhöhten Risiko für Darmkrebs stehen.

Gen Mutation Panel COSMIC-ID Klinische Bedeutung

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Entwicklungen im Bereich der Sequenzie-rung erlauben mittlerweile die parallele Ana-lyse einer Vielzahl von onkogenetischen Bio-markern. NGS ist auch geeignet für den Ein-satz an FFPE-Material, und die Analyse vonTumorgewebe kann in der Detektion poten-ziell therapeutisch relevanter Mutationenresultieren. Jedoch sind die gewonnenenDaten sowie deren Interpretation komplexund erfordern eine sorgfältige Auswahl derGen-Panels und eine intensive interdiszipli-näre Zusammenarbeit von Onkologen, Gene-tikern und Pathologen. Darüber hinaus erfor-dert die Möglichkeit des Nachweises vonKeimbahnmutationen eine Klärung der recht-lichen und ethischen Rahmenbedingungenfür die Analyse von Tumorgewebe. Der Ein-satz dieser neuen Technik im klinischen All-tag erfordert eine stringente Validierungunter diagnostischen Bedingungen und eineklare Aufgabenverteilung zwischen moleku-

larer und „konventioneller“ Pathologie,Humangenetik und Onkologie. Trotz überra-gender Erfolge der Therapieanpassung auf-grund der genetischen Charakterisierungeines Tumors bei Einzelpatienten fehlen großangelegte Studien. Daher wird eine umfas-sende genetische Analyse des Tumorgewe-bes bisher nicht von den Krankenkassenerstattet. Auch muss der Langzeiterfolg derTherapieumstellung noch gezeigt werden.

Das beschriebene Panel wird iterativ ange-passt und soll in naher Zukunft auch Ampli-fikationen und Deletionen detektierbarmachen. ó

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Korrespondenzadresse:Dr. med. Christopher SchroederInstitut für Medizinische Genetik und AngewandteGenomikUniversitätsklinikum TübingenCalwerstraße 7D-72076 TübingenTel.: 07071-29-72296christopher.schroeder@med.uni-tuebingen.de

AUTORChristopher SchroederJahrgang 1982. Medizinstudium an der Universität Tübingen. Studium der Medizini-schen Informatik an der Beuth Univer sity of Applied Sciences, Berlin. 2009–2011 Radioonkologie, Universitätsklinikum Tübingen. Seit 2012 Institut für MedizinischeGenetik und Angewandte Genomik, Universitätsklinikum Tübingen.

˚ Abb. 3: Übersicht über die Sequenzierergebnisse. Der Plot (generiert mit der Software Circos)stellt die Sequenzierergebnisse der bisher durchgeführten Panels kompakt dar. Der äußerste Ring(rot) zeigt die Gene, die entweder im 182-Gen-Panel (äußerer Ring) oder 48-Gen-Panel (innererRing) als mutiert vorliegend gefunden wurden. Sowohl der äußere als auch innere Ring stelleneinen Scatterplot dar. Ein Punkt steht für eine COSMIC-gelistete Mutation. So wurde z. B. das GenCTNNB1 in unserer Kohorte viermal im 48-Gen-Panel und einmal im 182-Gen-Panel mit einerMutation gefunden.