Aus dem Institut fr Humangenetik
(Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Klaus Zerres)
SMA-Studie:
Der CNTF-Genotyp als potentieller Einflussfaktor auf den klinischen
Verlauf der infantilen spinalen Muskelatrophie
Von der Medizinischen Fakultt
der Rheinisch-Westflischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Julia Hansmeier
aus Salzkotten
Berichter: Frau Professorin Dr. med. Sabine Rudnik-Schneborn
Herr Professor Dr. med. Martin Georg Husler
Tag der mndlichen Prfung: 18.08.2014
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfgbar.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkrzungsverzeichnis..................................................................................................... III
Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................... V
Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... VI
1 Einleitung ................................................................................................................. 1
1.1 Klinik der infantilen spinalen Muskelatrophie ............................................................. 1
1.2 Genetik der infantilen spinalen Muskelatrophie ........................................................... 3
1.3 Einflussfaktoren auf den klinischen Verlauf der SMA ................................................. 4
1.4 CNTF ciliary neurotrophic growth factor .................................................................. 7
1.5 Fragestellung dieser Studie ........................................................................................... 9
2 Material und Methoden ........................................................................................... 10
2.1 Patientenkollektiv und klinische Daten ...................................................................... 10
2.2 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .................................... 10
2.3 CNTF-Mutationsanalyse mittels HAE III-Restriktionsverdau ................................... 13
2.3.1 PCR .................................................................................................................13
2.3.2 HAE III-Restriktionsverdau ............................................................................15
2.4 CNTF-Mutationsanalyse mittels Sequenzierung nach Sanger ................................... 16
2.5 CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequencing ...................................................... 19
2.5.1 Pyro-Primersynthese .......................................................................................21
2.5.2 PCR und Pyrosequencing ...............................................................................21
2.6 Statistik ....................................................................................................................... 23
3 Ergebnisse .............................................................................................................. 24
3.1 Kenngren fr das Gesamtkollektiv ......................................................................... 24
3.2 Fallberichte der vier Patienten mit CNTF-Genotyp homozygot mutiert .................... 25
3.2.1 Fallbericht 1: Patient 1057 ..............................................................................29
3.2.2 Fallbericht 2: Patient 1132 ..............................................................................29
3.2.3 Fallbericht 3: Patientin 254 .............................................................................30
3.2.4 Fallbericht 4: Patient 249 ................................................................................30
3.3 CNTF-Genotyp-Verteilung im Gesamtkollektiv ........................................................ 31
3.4 Analyse des CNTF-Allels auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts ....... 32
Inhaltsverzeichnis
II
3.5 Analyse klinischer Parameter ..................................................................................... 33
3.6 Kaplan-Meier-Analyse fr Krankheitsbeginn und berleben .................................... 40
4 Diskussion .............................................................................................................. 45
4.1 Infantile autosomal-rezessive spinale Muskelatrophie: Pathogenese in vivo
und im Tiermodell ....................................................................................................... 45
4.1.1 SMN-Proteinmangel als Ursache der SMA ....................................................45
4.1.2 SMA-Mausmodelle.........................................................................................47
4.2 Funktion des CNTF im Tiermodell ............................................................................ 49
4.3 Ergebnisse klinischer Studien unter Bercksichtigung des CNTF ............................. 52
4.3.1 Ergebnisse aus vorangegangenen Studien zu verschiedenen neurologischen
Erkrankungen ..................................................................................................52
4.3.2 CNTF-Genotyp-Frequenz im Bezug zum Hardy-Weinberg-
Gleichgewicht .................................................................................................54
4.3.3 CNTF in Bezug auf die klinischen Parameter dieses SMA- Kollektivs .........57
5 Zusammenfassung................................................................................................... 61
6 Anhang ................................................................................................................... 64
6.1 Ergnzung zu Tabelle 8 .............................................................................................. 64
6.2 Ergnzung zu Tabelle 9 .............................................................................................. 65
6.3 Ergnzung zu Tabelle 10 ............................................................................................ 65
6.4 Ergnzung zu Tabelle 11 ............................................................................................ 67
6.5 Ergnzung zu Tabelle 13 ............................................................................................ 69
6.6 Ergnzung zu Tabelle 15 ............................................................................................ 71
7 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 72
8 Danksagung ............................................................................................................ 79
9 Erklrung zur Datenaufbewahrung .......................................................................... 80
10 Eidesstattliche Erklrung ber den Eigenanteil ........................................................ 81
Abkrzungsverzeichnis
III
Abkrzungsverzeichnis
ALS Amyotrophe Lateralsklerose AMP Adenosinmonophosphat APS Adenosin-5-Phosphosulphat Aqua dest. Aqua destillata ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar BTFp44 Basal Transcription Factor Subunit p44 bzw. beziehungsweise ca. circa CLC Kardiotrophin-like Zytokin CNTF Ciliary Neurotrophic Factor CNTF-R Ciliary Neurotrophic Factor Rezeptor alpha CPAP Continuous Positive Airway Pressure CT-1 Kardiotrophin-1 d.h. das heit dATP Desoxyadenosintriphosphat dATPS Desoxyadenosine-alpha-thio-triphosphat DdeI Restriktionsenzym aus Desulfovibrio desulfuricans ddNTPs Didesoxyribonukleosidtriphosphate DNA Desoxyribonukleinsure dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate EMG Elektromyographie et al. lateinisch: et alii, fr: und andere F-ALS Familire Amyotrophe Lateralsklerose FDR False Discovery Rate F-Primer Forward-Primer gp130 Glykoprotein 130 GTF2H2 General Transcription Factor IIH Polypeptide 2 H0 Nullhypothese H1 Alternativhypothese H4F5 = SERF1A/B
Small EDRK-rich Factor 1A/B
HAE III aus Haemophilus aegyptius isoliertes Restriktionsenzym Hinfl Restriktionsenzym aus dem Bakterium Haemophilus influenzae hnRNP heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein Particle HPLC High Performance Liquid Chromatography IL-6, IL-11 Interleukin-6 / -11 kDa kilo-Dalton LIF / LIFR Leukemia Inhibitory Factor / LIF-Rezeptor l Mikroliter M Molare Masse MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification mRNA Messenger-Ribonukleinsure MS Multiple Sklerose NAIP Neuronales Apoptose Inhibitor Protein NaOH Natriumhydroxid
Abkrzungsverzeichnis
IV
NEB New England Biolabs ng Nanogramm NGF nerve growth factor NNT-1 Novel Neurotrophin-1 NP Neuropoietin OSM Onkostatin M PCR Polymerase Chain Reaction pH potentia Hydrogenii pmn progressive motor neuropathy PPi Pyrophosphat pr-mRNA Prkursor-Messenger-Ribonukleinsure rpm revolutions per minute R-Primer Reverse-Primer s. siehe SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SD Standardabweichung sec Sekunde SF-3 B-Zell stimulierender Faktor 3 SMA Spinale Muskelatrophie SMARD Spinal Muscular Atrophy With Respiratory Distress SMN1 = telSMN Telomerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN2 = cSMN Zentromerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN-Protein Survival-Motor-Neuron-Protein SNP Single Nucleotide Polymorphismus snRNP small nuclear Ribonucleoprotein Particle ssDNA Einzelstrang-DNA Ta