Zbl. Vet. Med. B, 22, 403-410 (1975) @ 1975 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0044-4294/ASTM-Coden: ZVRBAZ Aus dem Znstitut f i r Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus Liebig-Universitat GieBen Direktor: Prof. Dr. Th. Schliesser Serologischer und kultureller Nachweis von Brucella canis bei Beagle-Hunden einer Versuchstierhaltung Von A. WEBER und TH. SCHLIESSER Mit 2 Tabellen (Eingegangen am 9. Januar 1971) Die Moglichkeit, dai3 Hunde sich mit Brucellen infizieren konnen, ist schon seit langem bekannt. Infektionen mit Brucella abortus, Br. melitensis oder Br. suis treten sporadisch auf und konnen in den meisten Fallen auf einen Kontakt mit infizierten landwirtschaftlichen Nutztieren zuruckgefuhrt werden (PANNWITZ et al., 1971). In der amerikanischen Literatur wurden in den letzten Jahren wiederholt Falle von Brucella canis-Infektionen in Hunde- bestanden beschrieben (u. a. CARMICHAEL, 1968; CARMICHAEL et al., 1968 u. 1970; MOORE et al., 1968 u. 1969; MOORE,1969; PICKERILL, 1970). Diese Erkrankungen, die haufig einen seuchenhaften Verlauf zeigten, wurden zwar vor allem in Beagle-Haltungen beobachtet, konnten aber auch bei anderen Hunderassen (z. B. Foxhound, Pointer, Schfferhund, Weimaraner) nachge- wiesen werden (MOORE, 1969). Obwohl nach MOORE et al. (1970) Brucella canis-Infektionen auch in australischen und europaischen Hundehaltungen vorkommen sollen, liegen in der Literatur kaum Mitteilungen daruber vor. Nur in jungster Zeit berichten aus Japan YAMAUCHI et al. (1974) sowie UEDA et al. (1974) uber den Nachweis von Brucella canis in Beagle-Hundehaltungen. In der Bundesrepublik Deutschland konnte vor kurzem von KRUEDENER (1974) Brucella canis als Ursache fur gehauft aufgetretene Abortusfalle in einer Beagle-Hundezucht ermitteln. Aus einem anderen Beagle-Bestand einer groaen Versuchstierhaltung in der Bundesrepublik erhielten wir Unter- suchungsmaterial zur Klarung des Verdachtes einer Brucella canis-Infektion. Ober die serologischen und kulturellen Ergebnisse dieser Untersuchungen wird im folgenden berichtet. Eigene Untersuchungen Tiermaterial 40 Beagle-Hunde (20 weibliche und 20 mannliche Tiere), die von einer pharmazeutischen Firma fur toxikologische Untersuchungen eingestellt worden 28.
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Zbl. Vet. Med. B, 22, 403-410 (1975) @ 1975 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0044-4294/ASTM-Coden: ZVRBAZ
Aus dem Znstitut f i r Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus Liebig-Universitat GieBen
Direktor: Prof. Dr. Th . Schliesser
Serologischer und kultureller Nachweis von Brucella canis bei Beagle-Hunden einer Versuchstierhaltung
Von
A. WEBER und TH. SCHLIESSER
Mit 2 Tabellen
(Eingegangen am 9. Januar 1971)
Die Moglichkeit, dai3 Hunde sich mit Brucellen infizieren konnen, ist schon seit langem bekannt. Infektionen mit Brucella abortus, Br. melitensis oder Br. suis treten sporadisch auf und konnen in den meisten Fallen auf einen Kontakt mit infizierten landwirtschaftlichen Nutztieren zuruckgefuhrt werden (PANNWITZ et al., 1971). In der amerikanischen Literatur wurden in den letzten Jahren wiederholt Falle von Brucella canis-Infektionen in Hunde- bestanden beschrieben (u. a. CARMICHAEL, 1968; CARMICHAEL et al., 1968 u. 1970; MOORE et al., 1968 u. 1969; MOORE, 1969; PICKERILL, 1970). Diese Erkrankungen, die haufig einen seuchenhaften Verlauf zeigten, wurden zwar vor allem in Beagle-Haltungen beobachtet, konnten aber auch bei anderen Hunderassen (z. B. Foxhound, Pointer, Schfferhund, Weimaraner) nachge- wiesen werden (MOORE, 1969). Obwohl nach MOORE et al. (1970) Brucella canis-Infektionen auch in australischen und europaischen Hundehaltungen vorkommen sollen, liegen in der Literatur kaum Mitteilungen daruber vor. Nur in jungster Zeit berichten aus Japan YAMAUCHI et al. (1974) sowie UEDA et al. (1974) uber den Nachweis von Brucella canis in Beagle-Hundehaltungen.
In der Bundesrepublik Deutschland konnte vor kurzem von KRUEDENER (1974) Brucella canis als Ursache fur gehauft aufgetretene Abortusfalle in einer Beagle-Hundezucht ermitteln. Aus einem anderen Beagle-Bestand einer groaen Versuchstierhaltung in der Bundesrepublik erhielten wir Unter- suchungsmaterial zur Klarung des Verdachtes einer Brucella canis-Infektion. Ober die serologischen und kulturellen Ergebnisse dieser Untersuchungen wird im folgenden berichtet.
Eigene Untersuchungen Tiermaterial
40 Beagle-Hunde (20 weibliche und 20 mannliche Tiere), die von einer pharmazeutischen Firma fur toxikologische Untersuchungen eingestellt worden
28.
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waren. Das Alter der Tiere betrug zum Zeitpunkt der Einstellung 4-6 Monate.
Serologische Untersuchungen Von allen Hunden gelangte mindestens 1 Serumpaar zur serologischen
Untersuchung. Die 1. serologische Untersuchung erfolgte etwa 3 Wochen nach Einstellung der Tiere, die 2. serologische Untersuchung 11 Wochen spater. Von 36 Hunden konnte nach weiteren 9 Wochen, am Tage der Totung der Tiere, eine 3. Blutprobe entnommen werden. Die Seren wurden mittels Rohrchen- Langsamagglutination auf das Vorhandensein von Antikorpern gegen Brucella canis untersucht. Das BY. canis-Antigen stellten wir anlehnend an die Angaben von MOORE et al. (1968) selbst her'. Als Suchtest wurden zuerst nur die Serum-Verdiinnungen 1 : 50 und 1 : 100 angesetzt. Bei positivem Ausfall der Reaktion wurde die Langsamagglutination mit den betreff enden Seren dann bis zu einer Verdunnung von 1 : 3200 durchgefuhrt. Alle Rohrchen enthielten je 0,5 ml Serum-NaC1-Verdiinnung und je 0,5 ml Antigen. Der Ausfall der Reaktion wurde nach 18-24stundiger Inkubation bei 37 OC abgelesen. Als Agglutinationstiter wurde die letzte Serumverdunnungsstufe bewertet, bei der noch eine deutliche Agglutination mit etwa 50 O/oiger Klarung der uberstehen- den Flussigkeit zu beobachten war.
Kulturelle Untersuchungen Zum kulturellen Nachweis von Brucella canis standen Organproben
(Leber, Milz, Niere, Darmbeinlymphknoten und Uterus oder Hoden) von insgesamt 21 der serologisch untersuchten Beagle-Hunde zur Verfugung. Sie wurden nach Abschlui3 der Versuche unmittelbar nach Totung und Sektion der Tiere entnommen. Das betreffende Material wurde auf je 1 Platte 7 O/o Ham- melblutagar, Tryptose-Blutagar und Gassneragar angelegt und 48-72 Stun- den bei 37 O C aerob bebrutet. Die nach dieser Zeit auf den Blutplatten ge- wachsenen Kolonien wurden anlehnend an den von OETJEN et al. (1973) vor- geschlagenen Untersuchungsgang diff erenziert.
Ergebnisse Mit Hilfe der Langsamagglutination konnten in der serologischen Ver-
folgsuntersuchung, die sich iiber einen Zeitraum von 5l/z Monaten erstreckte, bei insgesamt 21 von 40 Hunden (11 weiblichen und 10 mannlichen) ein- oder mehrmals Antikorper gegen Brucella canis ermittelt werden. In der 1. sero- logischen Untersuchung wiesen 12 Tiere einen nachweisbaren Titer gegen BY. canis auf. In der 2. Untersuchung wurden weitere 6 Hunde als serologisch positiv ermittelt und in der 3. Untersuchung kamen nochmals 3 positive Tiere hinzu (Tab. 1).
In der kulturellen Untersuchung der Organproben von 21 sezierten Hunden konnte bei 14 Tieren Brucella canis nachgewiesen werden. Bei 7 Hun- den liei3en sich Brucellen nicht anzuchten. Nachweisquote, Organverteilung und Beziehung zum Antikorpertiter sind aus Tabelle 2 ersichtlich (Tab. 2).
In 13 Fallen wurde BY. canis aus der Milz und in 12 aus dem Darmbein- lymphknoten isoliert. Bei 6 Tieren gelang die Anziichtung aus der Leber, in je 2 Fallen aus der Niere und dem Hoden und in einem Falle aus dem Uterus.
Herrn ORVR Dr. R. VON KRUEDENER, Ba erische Staatliche Veterinaruntersuchungsanstalt, Niirnberg, danken wir fur die freundliche 6berlassung einer Brucellu-cunis-Kultur, fur die Herstellung der ersten Antigenpraparationen.
Serologischer und kultureller Nachweis von Brucella canis bei Beagle-Hunden 405
Tabelle 1 Agglutinierende Antikorper gegen Brucella canis bei Beagle-Hunden wahrend eines Zeitraumes
Zei chenerklarung : Titer in reziproken Werten angegeben @ = nicht untersucht - = Serumverdunnung 1 : 50 und 1 : 100 negativ
127. 3. 74)
400 100 800
1600 800 50
- 400
1MX) 800 400
3200 800
1600 1600
800
1600 1600 400
-
3. Untcrsuchunq
(29. 5. 7 4 )
100 0 d
1600 1 0 - -
200 200 -
- 800
1600 8M)
400 3200 800
800 200 -
200 800
200 3200 400 -
Kulturell konnten somit bei allen 14 serologisch positiven Tieren Brucellen isoliert werden. Dagegen fie1 bei den 7 serologisch negativen Hunden die kul- turelle Untersuchung auf Brucella canis ubereinstimmend negativ aus. Die insgesamt 36 Isolate zeigten bei ihrer Diff erenzierung einheitliches kulturelles und biochemisches Verhalten: Keine Beweglichkeit in Hitchens-Stichagar, kein
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Leber
Tabelle 2 Kultureller Nachweis yon Brucella canis in Organproben von 21 sezierten Beagle-Hunden
Zeichenerklarung : + = Nachweis von Br. canis - = kein Nachweis von Br. canis negativ = Serumverdiinnung 1 : 50 und 1 : 100 negativ
Wachstum auf MacConkey- und Gassner-Agar ; Methylrot-, Voges-Proskauer- und Indolreaktion negativ; Nitrat wird zu Nitrit reduziert, Harnstoff inner- halb von 15 Minuten gespalten; Oxydase- und Katalase-Reaktion positiv; Citrat wird nicht verwertet, Schwefelwasserstoff nicht gebildet; Dextrose, Laktose, Mannit und Adonit werden nicht angegriff en; Agglutination mit spezifischem Br. canis-Antiserum.
Besprechung der Ergebnisse Das auffallendste klinische Merkmal einer Brucella canis-Infektion ist das
Verwerfen der Hundinnen im letzten Trachtigkeitsdrittel (MOORE, 1969; CARMICHAEL, 1968). Infizierte Hundinnen zeigen dabei weder vor noch nach dem Abort auffallende klinische Krankheitssymptome; nur gelegentlich soll ein leichter und langanhaltender Vaginalausflufl zu beobachten sein (MOORE, 1969). Bei Ruden auflert sich die Infektion durch Vergroi3erung der Hoden und der regionaren Lymphknoten (MOORE et al., 1969). Die Ansteckung der Hunde erfolgt in den meisten Fallen beim Deckakt, aber auch Urin infizierter Tiere soll als mogliche Infektionsquelle in Frage kommen (CARMICHAEL et al., 1970; MOORE, 1969).
Es ist bemerkenswert, dai3 bei keinem der von uns serologisch oder kul- turell als mit Brucella canis infiziert festgestellten Hunde klinische Krank- heitssymptome beobachtet worden waren, trotzdem bei insgesamt 52,5 O/o der Tiere ein- oder mehrmals Antikorper nachgewiesen wurden. Die Ergebnisse der zu verschiedenen Zeitpunkten vorgenommenen serologischen Untersuchungen
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lassen vermuten, dai3 sich die klinisch unerkannte Infektion im Bestand lang- sam weiter ausbreitete. Zu den in der 1. Untersuchung positiv reagierenden 12 Hunden (3O0/o) kamen nach 11 Wochen 6 weitere Tiere und 9 Wochen danach nochmals 3 Tiere dam. Wahrscheinlich haben sich unter den zuerst als infiziert fesigestellten Hunden latente Ausscheider von BY. canis befunden. Die Inkubationszeit betragt i. d. R. 6-21 Tage und nach dieser Zeit ist erfah- rungsgemai3 mit dem Auftreten von nachweisbaren Antikorpertitern zu rech- nen (CARMICHAEL et al., 1968; LEWIS et al., 1973; MYERS et al., 1974). Die untersuchten Hunde wurden zwar einzeln in Boxen gehalten, hatten aber taglich gemeinsamen Auslauf. Hierbei erfolgte vermutlich die Ansteckung der Tiere untereinander.
Nach bisherigen Erfahrungen sol1 die Serumlangsamagglutination ein zuverlassiges Auffinden von rnit BY. canis infizierten Hunden (MOORE et al., 1970; PICKERILL, 1970) erlauben. Dies wird durch unsere kulturellen Befunde an Organproben getoteter Hunde eindeutig bestatigt. Bei infizierten und nicht infizierten Tieren stimmten die Ergebnisse der serologischen und bakteriologi- schen Untersuchungen in auffallender Weise uberein (siehe Tab. 2).
Die Ergebnisse lassen aber auch erkennen, dai3 in einem verseuchten Be- stand nicht nur Tiere mit hohen (1 : 400 und hoher), sondern auch mit niedri- gen Serumtitern (1 : 100 - 1 : 200) als infiziert anzusehen sind. Gerade bei solchen Hunden fallt die Blutkultur (Citratblut), die zur Sicherung der serolo- gischen Diagnose am lebenden Tier benutzt werden kann, infolge des abakte- riamischen Stadiums haufig negativ aus (CARMICHAEL et al., 1968; MOORE et al., 1970). Der Erregernachweis im Blut gelingt nach bisheriger Erfahrung einigermafien regelmai3ig nur bei Tieren mit Antikorpertitern von 1 : 400 und hoher. Nach einem bakteriamischen Stadium manifestiert sich die Infektion aber hauptsachlich in den lymphatischen Organen (MOORE et al., 1969; CAR- MICHAEL et al., 1970). Nach unseren Befunden sind dies vor allem Milz und Lymphknoten. Aus ihnen konnten wir mit Abstand am haufigsten und regel- mai3igsten Brucellen isolieren, wahrend aus Leber, Niere, Hoden und Uterus die kulturelle Anzuchtung erheblich seltener und nur bei Tieren mit hohen Antikorpertitern gelang. In Ubereinstimmung mit LEWIS et al. (1973) halten wir daher Lymphknoten und Milz getoteter Tiere fur das geeignetste Unter- suchungsmaterial zum bakteriologischen Nachweis von Brucella canis.
Die Identifizierung und Diff erenzierung von Brucella canis bereitet keine allzu groi3en Schwierigkeiten (OETJEN et al., 1973). In der aeroben Primar- kultur wachsen diese Keime nach 2-3tagiger Bebrutung auf Blut- oder Tryptose-Blut-Agar in kleinen, weiagrauen, mattglanzenden Kolonien, die nach mehrmaliger Subkultivierung schleimige Konsistenz annehmen. Das lang- same Wachstum dieser Species durfte die grogten Schwierigkeiten bei ihrer Isolierung bereiten. Vor allem in Mischkulturen kann BY. canis durch schnelles Wachstum anderer Bakterien uberwuchert und dadurch leicht ubersehen wer- den. Alle als Br. canis diff erenzierten Isolate zeigten ein sehr einheitliches kul- turelles und biochemisches Verhalten, wie dies auch von anderen Autoren schon beschrieben worden ist (u. a. CARMICHAEL et al:, 1968; MOORE et al., 1970; VON KRUEDENER, 1974). Auffallendstes biochemisches Merkmal ist die bereits innerhalb von 15 Minuten deutlich feststellbare Harnstoff spaltung. Dieses Kriterium eignet sich deshalb zusammen mit der Objekttrageragglutination auch zur schnellen Oberprufung verdachtiger Kolonien.
Weitere inzwischen durchgefuhrte serologische und kulturelle Unter- suchungen an einem groi3en Tiermaterial zeigen, dai3 Infektionen mit Brucella canis in Versuchstierhaltungen der Bundesrepublik Deutschland nicht selten sind. Ober diese Ergebnisse wird demnachst berichtet werden. Die Infektionen
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laufen vielfach ohne klinische Krankheitserscheinungen ab, konnen aber u. U. bei der Auswertung toxikologischer Versuche zu Schwierigkeiten fuhren (GLIMARTIN, 1961). Bei mit BY. canis infizierten Tieren sind besonders in Milz, Prostata und Lymphknoten erhebliche pathologisch-histologische Veranderun- gen festzustellen (MOORE et al., 1969; CARMICHAEL et al., 1970). Es ist daher angebracht, vor jeder Einstellung von Hunden, insbesondere Beagle-Hunden, in Versuche bzw. in Versuchstierhaltungen, die Tiere sowohl serologisch als auch kulturell (Citratblutproben) im Abstand von 4 Wochen auf das Vor- handensein von Brucella canis-Infektionen untersuchen zu lassen. Nur auf diese Weise konnen positive Tiere rechtzeitig ermittelt und auch ausgemerzt werden.
Zusammenfassung 40 Beagle-Hunde einer Versuchstierhaltung wurden wahrend eines Zeit-
raumes von 5l/z Monaten mehrmals serologisch (Langsamagglutination) auf das Vorliegen einer Infektion mit Brucella canis untersucht. In Serumproben von insgesamt 12 Tieren konnten agglutinierende Antikorper gegen Brucella canis ermittelt werden. Die gefundenen Titerwerte reihten von 1 : 50 bis 1 : 3200. Die 1. serologische Untersuchung ergab 12 positive Tiere. Bei der 2. und 3. Untersuchung wurden weitere 6 bzw. 3 Tiere festgestellt.
Von 21 getoteten Hunden dieser Gruppe konnten jeweils Leber, Milz, Niere, Darmbeinlymphknoten und Uterus bzw. Hoden kulturell untersucht werden. 14 Tiere, die auch serologisch positiv reagiert hatten, wurden als Trager von BY. canis ermittelt. Am haufigsten liei3en sich die Erreger aus Milz (1 3mal) und Darmbeinlymphknoten (12mal) isolieren. Wahrend der verein- zelte Erregernachweis aus Leber bzw. Hoden nur bei Hunden mit Antikorper- titern von iiber 1 : 400 gelang, konnte Brucella canis aus Milz oder Darm- lymphknoten stets auch bei Hunden mit Serumtitern von 1 : 100 und 1 : 200 angezuchtet werden.
Bei den getoteten 21 Hunden stimmten sowohl die positiven als auch die negativen bakteriologischen Befunde in allen Fallen mit den Ergebnissen der serologischen Verlaufsuntersuchungen uberein.
Summary Serological and cultural demonstration of Brucella canis in
Beagles in an experimental kennel 40 Beagle dogs in an experimental establishment were examined sero-
logically on several occasions over a period of 5'/2 months by the slow agglu- tination test to look for Brucella canis infection. Serum tests from a total of 21 dogs showed agglutinating antibodies against Brucella canis. The titres ranged from 1 5 0 to 1:3200. The first serological examination revealed 12 positive animals, the second 6 and the third 3 reactors (21 dogs in all).
From 21 dogs that were destroyed, cultural studies were made of liver, spleen, kidney, mesenteric nodes and uterus or testis. 14 dogs, which had also reacted serologically, were found to be carriers of Brucella canis. The or- ganism was isolated most often (13 times) from the spleen and lymph nodes (12 times). Whereas occasional isolations were made from liver or testis from dogs with titres above 1 :400, the organism was isolated from spleen or mesen- teric lymph nodes in dogs with serum titres as low as 1 :lo0 and 1 :ZOO.
In all 21 dogs the bacteriological findings, positive or negative, cor- responded with the serological findings.
Serologischer und kultureller Nachweis von Brucella canis bei Beagle-Hunden 409
Rbsumb Mise en Cvidence drologique et par des cultures de Brucella canis
chez des beagles d’une animalerie d’expbrimentation 40 beagles d’une animalerie d’expkrimentation ont k tk examinks skro-
logiquement plusieurs fois durant 51/.2 mois sur la prksence d’une infection B Brucella canis. Des anticorps agglutinants contre Brucella canis ont k tk trouvks dans les kchantillons de skrums de 21 animaux. Les titres allaient de 1 : 50 A 1 : 3200. La premibre agglutination donna 12 animaux positifs, la deuxihme 6 nouveaux et la troisihme 3 nouveaux animaux.
Des cultures bactkriologiques du foie, de la rate, des reins, des ganglions de l’iliony de l’udrus et des testicules de 21 chiens sacrifiks ont kt6 faites. 14 animaux, skrologiquement positifs, ktaient porteurs de BY. canis. Les germes furent isolks le plus frkquemment A partir de la rate (13 fois) et des ganglions (12 fois). L‘isolement des germes B partir du foie et des testicules n’a ktk possible que chez des chiens ayant un titre d’anticorps supkrieur B 1 : 400; BY. canis a pu &tre isolke B partir de la rate et des ganglions d’animaux ayant un titre skrologique de 1 : 100 B 1 : 200. Les rksultats bactkriologiques aussi bien positifs que nkgatifs ont correspondu dans tous les cas aux rksultats skrologiques chez les 21 chiens sacrifiks.
Resumen Identificaci6n serol6gica y cultural de Brucella canis en beagles
de una perrera destinada a investigacibn 40 beagles de una explotaci6n de experimentaci6n se examinaron sero-
16gicamente (aglutinacidn lenta) varias veces durante un period0 de 5 meses y medio en cuanto a la presencia de una infecci6n por Brucella canis. En muestras skricas de 21 animales se pudieron apreciar anticuerpos aglutinantes contra BY. canis. Los titulos oscilaban entre 1 :50 y 1 :3200. El examen sero- 16gico primero revel6 12 animales positivos, el segundo 6 y el tercero 3 reaccionantes nuevos.
De 21 perros sacrificados en este grupo, se pudieron examinar cultural- mente cada vez el hfgado, bazo, rifihn, ganglios linfiticos iliacos y h e r o resp. testiculo. 14 animales, que reaccionaron tambikn seroldgicamente de forma positiva, se desenmascararon como portadores de BY. canis. Los agentes etiol6gicos se aislaron con frecuencia maxima en el bazo (13 veces) y ganglios linfiticos iliacos (12 veces). Mientras que solo se logr6 el ais- lamiento de 10s gkrmenes en el higado y testiculo en perros con tl’tulos de anticuerpos supersiores a 1:400, siempre se pudo cultivar tambikn BY. canis a partir de bazo o ganglios mesentkricos en perros con titulos skricos entre 1 :loo y 1 :200.
En todos 10s 21 perros sacrificados se correspondian 10s hallazgos bacteriol6gicos, positivos o negativos, con 10s resultados serol6gicos.
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Anschrift der Verfasser: 63 GieBen, Frankfurter Strade 89.
