Universität Hohenheim
Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
Reinigung und Charakterisierung
der Subtilase LeSBT3 von Tomate
Diplomarbeit vorgelegt von:
Leszek Gabler
Studiengang Biologie
Fakultät Naturwissenschaften
Stuttgart-Hohenheim, im September 2004
INHALT
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................1 1.1 Proteasen...............................................................................................................1 1.2 Subtilasen .............................................................................................................2 1.3 Pflanzliche Subtilasen ..........................................................................................5 1.4 Zielsetzung ...........................................................................................................9 2. Material und Methoden ...................................................................................10 2.1 Material...............................................................................................................10 2.1.1 Chemikalien........................................................................................................10 2.1.2 Chromatographie-Säulen ....................................................................................12 2.1.3 Verbrauchsmaterial.............................................................................................12 2.1.4 Geräte .................................................................................................................12 2.1.5 Antikörper...........................................................................................................13 2.1.6 Zellkulturen ........................................................................................................13 2.1.7 Medien, Lösungen und Puffer ............................................................................13 2.2 Methoden............................................................................................................19 2.2.1 Anzucht pflanzlicher Zellkulturen......................................................................19 2.2.2 Zellkulturernte ....................................................................................................19 2.2.3 Ammoniumsulfat-Präzipitation ..........................................................................19 2.2.4 Dialyse................................................................................................................20 2.2.5 Ionenaustauschchromatographie ........................................................................20 2.2.6 Aufkonzentrieren und Umpuffern geringvolumiger Proteinlösungen................21 2.2.7 Aktivitätstest.......................................................................................................21 2.2.8 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford .......................................22 2.2.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).......................................22 2.2.10 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen ................................................23 2.2.11 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen ......23 2.2.12 Immunologischer Nachweis der Proteine...........................................................23 3. Resultate ............................................................................................................25 3.1 Vorversuche zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease........................................25 3.1.1 Überexpression von LeSBT3 in transgenen Tomatenzellkulturen.....................25 3.1.2 Bestimmung der Sättigungsstufen für die Ammoniumsulfat-Präzipitation .......25 3.1.3 Zeitlicher Verlauf der Expression von LeSBT3 .................................................28 3.1.4 Anionenaustauschchromatographie des SBT3-Dialysates .................................30 3.1.5 Kationenaustauschchromatographie des SBT3-Dialysates ................................32 3.2 Aufreinigung der LeSBT3-Protease ...................................................................35 3.2.1 Anionenaustauschchromatographie....................................................................35 3.2.2 Analyse des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes .......................................35 3.2.2.1 Aktivitätstest.......................................................................................................35 3.2.2.2 SDS-PAGE-Analyse und Western-Blot .............................................................37 3.2.3 Kationenaustauschchromatographie...................................................................37 3.2.4 Analyse des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes ......................................39 3.2.4.1 Aktivitätstest.......................................................................................................39
I
INHALT
3.2.4.2 SDS-PAGE-Analyse und Western-Blot .............................................................40 3.2.5 Zusammenfassung zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease ..............................41 3.3 Biochemische Charakterisierung der LeSBT3-Protease.....................................43 3.3.1 Bestimmung des Aufbewahrungsoptimums.......................................................43 3.3.2 Bestimmung des pH-Optimums der Enzymaktivität..........................................44 3.3.3 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration......................45 3.3.4 Untersuchung zur autokatalytischen Prozessierung von LeSBT3......................46 4. Diskussion..........................................................................................................49 4.1 Vorversuche zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease........................................50 4.2 Aufreinigung und Sequenzanalyse der LeSBT3-Protease..................................52 4.3 Biochemische Charakterisierung der LeSBT3-Protease.....................................52 4.3.1 Bestimmung des Aufbewahrungsoptimums.......................................................53 4.3.2 Bestimmung des pH-Optimums der Aktivität ....................................................53 4.3.3 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration......................54 4.3.4 Untersuchung zur autokatalytischen Prozessierung ...........................................54 4.3.5 Ausblick..............................................................................................................55 5. Zusammenfassung ............................................................................................57 6. Anhang...............................................................................................................58 6.1 Primärstruktur von LeSBT3 ...............................................................................58 7. Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................59 8. Literaturverzeichnis .........................................................................................61
II
KAPITEL 1 EINLEITUNG
1. Einleitung 1.1 Proteasen In den Pflanzen dürfte es keinen Prozess geben, der nicht direkt oder indirekt von
ökologischer Bedeutung wäre. Jeder dieser Prozesse hat seinen biochemischen
Hintergrund. Einer dieser biochemischen Prozesse ist die Proteolyse. Trotz großer Vielfalt
an proteolytischen Enzymen, bleibt das Prinzip der proteolytischen Spaltung immer gleich.
Es basiert auf der hydrolytischen Spaltung einer Peptidbindung. Die Enzyme, die an dieser
Spaltung beteiligt sind, werden deshalb als Peptidasen oder Peptidhydrolasen bezeichnet,
häufig auch als Proteasen oder Proteinasen, wenn sie intakte Proteine angreifen können.
Die Spezifität einer Peptidase ist überwiegend durch die Aminosäuren definiert, welche die
zu spaltende Peptidbindung flankieren.
Es existieren für Proteasen zwei Einteilungsprinzipien: eines nach dem
Katalysemechanismus in Serin-, Aspartat-, Cystein-, Threonin- und Metalloproteasen, und
eines nach dem Angriffsort: in Endopeptidasen und Exopeptidasen. Die ersten spalten
Peptidbindungen innerhalb eines Proteins, die letzteren am N-terminalen
(Aminopeptidasen) oder C-terminalen Ende (Carboxypeptidasen) (Barrett et al., 1998).
Peptidasen sind wahrscheinlich die am weitesten verbreitete Enzymklasse. Sie kommen in
allen Organismen und allen Organellen vor. Selbst Viren verfügen in der Regel mindestens
über eine eigene Peptidase.
Die biochemischen Funktionen der proteolytischen Enzyme, sowie die damit verbundene
Steuerung biologischer Vorgänge, sind sehr vielseitig. Sie reichen von einer spezifischen
Prozessierung von Präproteinen, bis zu einem unspezifischen Abbau der bestehenden
Proteine. Speziell bei Pflanzen schließen sie die Steuerung zahlreicher Entwicklungs-
prozesse wie Embryogenese, Photomorphogenese, Keimung der Samen, Seneszenz der
Blätter (Ryan und Walker-Simmons, 1981), die hormonelle Signalübertragung bei
Auxinen, Cytokininen, Gibberellinen, Abscisinsäure und Jasmonat (Vierstra, 2003) und
viele andere ein.
Die durch die immense Variabilität der Struktur, Spezifität und biologischen Funktion
gekennzeichneten Serinproteasen sind eine der am besten untersuchten Klassen von
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
Proteasen. Sie sind charakterisiert durch einen reaktiven Serinrest, der in den meisten
Fällen mit einem Histidin- und Aspartatrest die Architektur der katalytischen Maschinerie
im aktiven Zentrum des Enzyms bildet (Dodson und Wlodawer, 1998). Allen
Serinproteasen ist deren hohe hydrolytische Aktivität gegenüber der Peptid- und
Esterbindungen der jeweiligen Enzym-spezifischen Substrate gemeinsam. Der allen
Serinproteasen ähnliche Katalysenmechanismus und die räumliche 3-D-Struktur der in die
katalytische Triade einbezogenen Aminosäurereste führt zu einer Unterteilung der
einzelnen Vertreter der Klasse der Serinproteasen im Chymotripsin, Subtilase-, und
Carboxypeptidase-Klans (Rawlings und Barret, 1994). Die Ähnlichkeit im Katalyse-
mechanismus und der räumlichen Anordnung der Aminosäurereste in der katalytischen
Triade dieser Enzyme (Abb. 1) ist vermutlich das Resultat einer konvergenten Evolution
der einzelnen Klans der Serinprotease und ist weniger auf eine gemeinsame
phylogenetische Verwandschaft zurückzuführen (Siezen et al., 1991; Rawlings und Barret,
1994).
1.2 Subtilasen Die Subtilasen (Subtilisin-ähnliche Proteasen) bilden die zweitgrößte Serinproteasefamilie,
die bis jetzt identifiziert wurde. Über 200 Subtilasen sind momentan bekannt und bei mehr
als 170 davon ist ihre komplette Aminosäurefolge aufgeklärt (Siezen und Lenissen, 1997).
Die erste Subtilase, die in einem eukaryontischen Organismus identifiziert wurde, war die
Kex2p-Protease der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Julius et al., 1984). Die Kex2p-
Protease weist eine Spezifität für basische Aminosäuren in den Positionen P1 und P2 auf.
Ein solches dibasisches Motiv ist auch in vielen tierischen Proproteinen und Prohormonen
am Übergang zwischen der Prodomäne und dem aktiven Peptid vorhanden. Aufgrund von
Sequenzähnlichkeiten mit Kex2 gelang die Identifizierung des tierischen fur-Gens, das für
die erste bekannte Proproteinkonvertase – Furin kodiert (Fuller et al., 1989). Die erste
pflanzliche Subtilase Cucumisin wurde aus der Melonenfrucht Cucumis melo isoliert,
enzymatisch charakterisiert und anschließend kloniert (Kaneda und Tominaga, 1975;
Yamagata et al., 1989; Yamagata et al., 1994).
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
Abb. 1: Darstellung der sekundären und tertiären Struktur des Subtilisins (PDB code 2SNI) mit der für die Serinproteasen typischen „katalytischen Triade“ im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997) Die Subtilasen wurden anhand von Vergleich der Seqenzen in den katalytischen Domänen
in sechs Familien unterteilt (Abb. 2 A und B) (Siezen und Lennissen, 1997). Die Subtilisin-
Familie umfasst hauptsächlich Enzyme von Mikroorganismen und Hefe, besonders viele
hochalkalische und intrazelluläre Proteasen von Bacillus. Der Lantibiotische Peptidasen-
Familie gehören nur prokaryontische Subtilasenvertreter an, z.B. Endopeptidasen der
grampositiven Bakterien. Die Proteinase-K-Familie beinhaltet sekretorische
Endopeptidasen aus Pilzen, Hefen und gramnegativen Bakterien. Bei der Kexin-Familie
handelt es sich um Subtilasen nur aus den eukaryontischen Organismen. Hierzu gehören
die meisten Proproteinkonvertasen mit einer hohen Spezifität für dibasische Spaltung
(Lys-Arg). Die Pyrolysin-Familie kennzeichnet eine große Heterogenität in Bezug auf die
Herkunft sowie Substratspezifität. Sie beinhaltet sowohl Subtilasen der Prokaryonten als
auch der Eukaryonten.
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
A
B Abb. 2: Subtilasen.
Abb. 2A: Ein Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie basierend auf dem Sequenzvergleich der katalytischen Domänen; ein genereller Vergleich (Siezen und Leunissen, 1997). Abb. 2 B: Detailliertes Dendrogramm der individuellen Familien. Die Abzweigungslänge ist umgekehrt proportional zum Grad der Sequenzähnlichkeit. Dieses Dendrogramm wurde konstruiert nach der Neighborjoining Methode (Saitou und Nei, 1993).
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
1993 wurde von Rawlings ein neues Klassifikationssystem (MEROPS) eingeführt, das
strukturelle Aspekte sowie evolutionäre Verwandtschaftsbeziehungen auf Basis der
Aminosäuresequenz berücksichtigt (http://merops.sanger.ac.uk/). Die Subtilasen werden
nach der MEROPS-Klassifikation in zwei Subfamilien, in die S8A und S8B gruppiert. Bis
heute sind neun Subtilasen in Säugetieren bekannt, von denen sieben der S8B Subfamilie
angehören (Seidah et al., 1999; Seidah und Chretien, 1999). Vor kurzem wurden zwei
Säugetiersubtilasen innerhalb der S8A Subfamilie charakterisiert, die Site-1-Protease (S1P)
und das Subtilisin-Kexin-Isozym-1 (SkI-1), die zu der Gruppe der Pyrolysine gehören und
sich an der Prozessierung des Sterol-regulatory-element-Bindeproteins (SREBP) beteiligen
(Sakai, 1998; Seidah, 1999a; Seidah, 1999b).
1.3 Pflanzliche Subtilasen Alle bis jetzt identifizierten Subtilasen der höheren Pflanzen werden der S8A Subfamilie
zugeordnet. Es wurden bis jetzt viele Versuche unternommen, um die Funktionen der
einzelnen pflanzlichen Subtilasen aufzuklären. Anhand der Arabidopsis sdd1 Mutante
(stomatal density and distribution 1) wurde gezeigt, dass die SDD1-Subtilase eine
wesentliche Funktion in der Steuerung der stomatären Dichte und Verteilung erfüllt. Das
SDD1 kodierende Gen wurde durch positionelle Klonierung isoliert und charakterisiert
(Berger und Altmann, 2000). Die anschließenden Expressionsstudien ergaben, dass SDD1
stark in den stomatären Vorläuferzellen exprimiert wird. Das SDD1-Protein wird
vermutlich in den Apoplast der Zellen sekretiert, wo es an der Prozessierung der für die
Kontrolle der Stomatadichte verantwortlichen Proteine beteiligt sein könnte (von Groll et
al., 2002). Die ALE1-Protease (abnormal leaf shape 1) ist erforderlich bei der
Differenzierung der Epidermis während der Embryonalentwicklung von Arabidopsis
thaliana. Man vermutet, dass ALE1 eine Rolle bei der Erzeugung der Peptidsignale spielt,
die für die Differenzierung der Epidermis erforderlich sein könnten (Tanaka et al., 2001).
Die Phänotypen der sdd1- und ale1-Mutanten zeigen somit, dass mindestens einige
Subtilasen im hohem Grade spezifische Funktionen in der Entwicklung der Pflanze
übernehmen.
Weitere Hinweise, dass Subtilasen spezifische Aufgaben in den physiologischen Abläufen
der Pflanzen übernehmen könnten, liefern mehrere Studien. So wird z.B. das für eine
Subtilase kodierende ag12-Gen aus Alnus glutinosa in Wurzelknöllchen im Rahmen der
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
Symbiose mit Actinomyzeten exprimiert, was auf eine eventuelle Interaktion mit dem
Stickstoff-fixierenden Symbionten hinweisen kann (Ribeiro et al., 1995). Bei der
Pollenentwicklung von Lilium longiflorum, in der Microsporogenese der Antheren wird
LIM9, eine extrazelluläre Protease spezifisch exprimiert. Ihre Expression konnte zuerst im
Tapetum und während der späteren Phase der Microsporogenese in Antheren
nachgewiesen werden, was auf eine Funktion bei der Pollenentwicklung hindeuten würde
(Taylor et al., 1997). Viele von den identifizierten pflanzlichen Subtilasen weisen eine
breite Substratspezifität auf. Dies könnte ein Hinweis auf eine degradative Funktion in den
pflanzlichen Prozessen wie Blattseneszenz sein. Dazu gehören solche pflanzlichen
Subtilasen, wie das Macluralisin aus Maclura pomifera (Rudenskaya et al., 1995),
Taraxalisin aus Taraxacum officinale (Rudenskaya et al., 1998), Plantagolisin aus
Plantago major (Bogacheva et al., 2001).
Die Identifizierung von SBP50, einem Protein, das spezifisch mit Systemin in der Tomate
Lycopersicon esculentum interagiert, brachte einen weiteren Hinweis auf die Existenz von
Subtilisinen in den Pflanzen (Schaller und Ryan, 1994). Systemin ist ein Peptidhormon,
das eine zentrale Rolle in der Vermittlung der Wundreaktionen spielt (Pearce et al., 1991)
und ein für die Subtilasen der Kexin-Familie charakteristisches dibasisches Spaltmotiv
Lys9-Arg10 aufweist. In letzter Zeit sind in der Tomate noch weitere Subtilisin-ähnliche
Proteasen identifiziert worden (Tornero et al., 1996 und 1997; Jorda et al., 1999).
Die Subtilasenfamilie in der Tomate besteht aus mindestens 15 Mitgliedern, die aufgrund
der Sequenzhomologie in fünf Subfamilien unterteilt werden: P69, tmp, LeSBT1, LeSBT2
und LeSBT3/4 (Abb. 3; Meichtry et al., 1999). Es besteht dabei eine 79 – 98% Sequenz-
übereinstimmung innerhalb einer Subfamilie und eine 34 – 54% Sequenzüberein-
stimmung zwischen den Subfamilien.
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
Abb. 3: Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie in Tomate.
Dargestellt ist die phylogenetische Beziehung der Tomaten Subtilasen, basierend auf dem Vergleich von Aminosäurensequenzen, die von der genomischen DNA und cDNA abgeleitet wurden (Meichtry et al., 1999). Das Expressionsmuster der Proteasen P69A und P69D verändert sich stark während der
Entwicklung der Pflanze. Dies lässt eine Beteiligung bei den Entwicklungsprozessen
vermuten (Jorda et al., 1999). Die weiteren Proteasen der Subfamilie P69 (P69B und
P69C) werden nach einem Pathogenbefall exprimiert, was auf eine potentielle Rolle dieser
Proteasen in der Pathogenabwehr der Tomate hinweist (Jorda et al., 1999). Diese
Vermutung konnte durch eine Reihe weiterer Versuche untermauert werden, denn es
wurde eine verstärkte Expression der P69B und P69C Proteasen auch nach der Behandlung
mit Salicylsäure beobachtet (Jorda et al., 1999). Außerdem wurde für die Proteasen p69E
und P69F eine spezifische Expression in Wurzeln und in Hydathoden festgestellt, was auf
einen möglichen Einsatz bei den Abwehrreaktionen der Pflanze deutet (Jorda et al., 2000).
Die Tomatensubtilase tmp ist der extrazellulären Protease LIM9 aus Lilium longiflorum
sehr ähnlich und ist potenziell bei der Pollenentwicklung beteiligt (Riggs and Horsch,
1995; Taylor et al., 1997).
Die Gewebespezifische Expression der LeSBT – Subtilasen wurde mittels Northern Blot
(Abb. 4) analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass LeSBT3 in allen untersuchten Geweben
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
detektierbar war, während LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT4A eine Gewebespezifität zeigten.
Auffällig ist bei der Expression der LeSBT – Unterfamilie, dass die Subtilasen LeSBT1
und LeSBT2 in keinem pflanzlichen Gewebe gemeinsam exprimiert werden (Abb. 4). Die
Subtilase LeSBT3 ist in allen untersuchten Gewebe detektierbar (Meichtry et al., 1999). Abb. 4: Gewebespezifische Expression der LeSBT-Subtilasen.
Dargestellt ist ein Northern Blot der Expression von Subtilasen LeSBT1-3, LeSBT4A, p69 und tmp in unterschiedlichen Organen der Tomate (Meichtry et al., 1999). Ein weiterer Ansatz zur funktionellen Charakterisierung der Subtilasen, ist die Analyse von
Promoter-Reportergenfusionen (A. Stintzi und A. Schaller, nicht veröffentlich). Bei der
Analyse der GUS-Expression zeigte sich, das viele der Subtilasen nur in ganz bestimmten
Entwicklungsstadien oder Zelltypen exprimiert werden. Es wurde beobachtet, das die
SBT1-Protease in den Abszissionszonen der Blütenorgane exprimiert wird. Dieser Befund
könnte ein Hinweis auf die Funktion der LeSBT1-Protease in der Abszission sein.
Einen weiteren Schritt in Richtung Funktionsaufklärung der LeSBT-Unterfamilie brachte
die Arbeit zur heterologen Expression und biochemischen Charakterisierung der LeSBT1
Subtilase (Janzik et al., 2000). Die LeSBT1 Subtilase wurde im Insektenzell/Baculovirus-
Expressionssystem heterolog exprimiert, gereinigt und biochemisch charakterisiert. Dabei
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KAPITEL 1 EINLEITUNG
zeigte sich, dass drei N-terminale Prozessierungsschritte zur vollständigen Reifung der
LeSBT1 Subtilase notwendig sind. Zuerst kommt es zur Abspaltung eines Signalpeptids
beim Eintritt in den sekretorischen Weg, gefolgt von Prozessierung einer Prodomäne und
anschließender streng pH-abhängiger Abspaltung der autoinhibitorischen Domäne. Das
pH-Optimum für diese Subtilase lag im sauren Bereich zwischen pH 4.0 und pH 5.0, was
mit der vermuteten Lokalisation dieses Proteins im Apoplasten der Pflanze übereinstimmt.
1.4 Zielsetzung In der Tomate (Lycopersicon esculentum) sind bisher 15 Subtilisin-ähnliche Serinproteasen
identifiziert worden. Für die meisten dieser Subtilasen liegen auf der DNA und RNA-
Ebene ausreichende Informationen vor, allerdings ist ihre Funktion in dem pflanzlichen
System noch weitgehend ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Protokoll für die
Aufreinigung der in der Suspensionskultur des Lycopersicon peruvianum exprimierten
LeSBT3-Subtilase ausgearbeitet und etabliert werden. Ein weiteres Ziel der vorliegenden
Arbeit war die Durchführung erster biochemischer Analysen zur Charakterisierung dieser
Protease. Es sollten zum einen Untersuchungen zur autokatalytischen Prozessierung der
gereinigten und aktiven LeSBT3 Subtilase vorgenommen werden. Zum anderen sollten die
optimalen Aufbewahrungsbedingungen für diese Protease bestimmt werden. Außerdem
sollte die Aktivität des Enzyms in Abhängigkeit vom pH-Wert und von der
Substratkonzentration untersucht werden.
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Acetonitril Roth Acrylamid-Rotiphorese Roth 6-Aminohexansäure Merck 3-Aminophtalhydrazid Fluka Ammoniumsulfat Roth N-Benzyladenin Fluka Bradford Reagenz (Protein Assay) BioRad Brilliant Blau R Roth Bromphenolblau Fluka Calciumchlorid Fluka p-Cumarsäure Roth DMSO Roth EDTA Roth Essigsäure Roth Ethanol Roth Fluorogenes Systemin Jerini Formaldehyd Roth Fotofixierer Kodak Fotoentwickler Kodak Glycerin Roth Glycin Fluka 10
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Kaliumdihydrogenphosphat Roth Kanamycin Duchefa Magermilchpulver Regilait β-Mercaptoethanol Merck Methanol Roth MSMO Sigma Naphtylessigsäure Roth Natriumacetat Fluka Natriumcarbonat Fluka Natriumchlorid Roth Natriumdihydrogenphosphat-dihydrat Fluka di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat Fluka Natriumhydroxid Roth Natriumlaurylsulfat (SDS) Roth Proteinmarker BioRad Rinderserum-Albumin (BSA) BioLabs Saccharose Merck Salzsäure Roth Silbernitrat Merck TEMED Roth Tris Roth Bis-Tris Roth Tween 80 Roth Wasserstoffperoxid Fluka
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.2 Chromatographie-Säulen Resource Q, 6 ml Amersham Biosciences (Anionenaustausch-Chromatographie) Resource S, 6 ml Amersham Biosciences (Kationenaustausch-Chromatographie)
2.1.3 Verbrauchsmaterial Blotting-Papier Amersham Biosciences Konzentratoren Vivaspin 20 ml Vivascience Dialyseschläuche Serva Membranfilter Sartorius Mikrotiterplatten Nuck Nitrocellulose-Transfermembran Schleicher & Schuell Küvetten Sarstedt
2.1.4 Geräte Blotting-Apparatur LKB-Bromma/Pharmacia Äkta Purifier Amersham Biosciences Chromatographie-System mit Zubehör Elektrophorese-Kammer BioRad für Proteingele Fluoreszenzphotometer Varian Schüttler Multitron HT Infors UV/Vis Spectrophotometer Beckman Ultraschallbad RK 255H Sonorex Kühlzentrifuge 5415R Eppendorf Kühlzentrifuge RC-3B Sorvall
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Kühlzentrifuge RC 5B Plus Sorvall Rotor H6000A Sorvall Rotor HS-4 Sorvall
2.1.5 Antikörper anti-LeSBT3 polyklonal, aus Kaninchen; wurde von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt anti-Kaninchen IgG/
Peroxidase-Konjugat Calbiochem
2.1.6 Zellkulturen Wt Lp2-Zellkultur Suspensionskultur aus Tomate (Lycopersicon peruvianum) SBT3-Zellkultur transgene Tomaten – Suspensionskultur, in der unter Kontrolle des 35S Promotors LeSBT3 überexprimiert wird, wurde von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt
2.1.7 Medien, Lösungen und Puffer Tomaten-Suspensionskultur Nover-Medium 4,4 g Murashige und Skoog-Medium 30 g Saccharose 0,17 g KH2PO4 500 µl Naphtylessigsäure (10 mg/ml in 0,1 NaOH) 50 µl N-Benzyladenin (40 mg/ml in 2 N KOH) 1 ml Vitamin-Stammlösung pH 5.5 mit KOH einstellen ddH2O ad 1 Liter, autoklavieren, gegebe- nenfalls Zugabe von 75 µg/ml Kanamycin 13
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Vitamine-Stammlösung 500 mg Vitamin B1-HCl 250 mg Nicotinsäure 25 mg p-Aminobenzoesäure 125 mg Pyridoxin-HCl 1250 mg Cholinchlorid 250 mg Calcium D(+)-Panthothenat 2,5 mg Folsäure (0,1 mg/ml in 0,1 N NaOH) 2,5 ml Biotin (0,1 mg/ml in 0,1 N NaOH) 2,5 ml Cyanocobalamin (0,1 mg/ml) pH 6.2 mit KOH einstellen ddH2O ad 250 ml, autoklavieren
Dialyse Dialysepuffer (Anion) 25 mM Tris/HCl, pH 9.0 5 mM EDTA Dialysepuffer (Kation) 25 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0 5 mM EDTA
Säulenchromatographie Bindungspuffer (AAnion) 25 mM Tris/HCl, pH 9.0 5 mM EDTA
Elutionspuffer (BAnion) 25 mM Tris/HCl, pH 9.0 5 mM EDTA 1 M NaCl
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Bindungspuffer (AKation) 25 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0 5 mM EDTA
Elutionspuffer (BKation) 25 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0 5 mM EDTA 1 M NaCl
SDS-PAGE 4 x Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl, pH 8.8 0,4 % (w/v) SDS 4 x Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl, pH 6.8 0,4 % (w/v) SDS
Trenngel: (8,5 % w/v, zwei 1,5 mm Gele) 3,97 ml 30 % (w/v) Acrylamidstammlösung 9,83 ml ddH2O 4,6 ml 4 x Trenngelpuffer 200 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat 20 µl TEMED
Sammelgel: (4,5 % w/v, zwei 1,5 mm Gele) 1,3 ml 30 % (w/v) Acrylamidstammlösung 6,1 ml ddH2O 2,5 ml 4 x Sammelgelpuffer 100 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat 10 µl TEMED
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
3 x SDS-Probenpuffer 150 mM Tris/HCl, pH 6.8 6 % (w/v) SDS 30 % (w/v) Glycerin 0,04 % (w/v) Bromphenolblau 7,5 % (v/v) β-Mercaptoethanol
10 x SDS-Laufpuffer 0,25 M Tris 1,9 M Glycin 1 % SDS
Western-Blot Anodenpuffer 1 0,3 M Tris/HCl pH 10.4 20 % (v/v) Methanol
Anodenpuffer 2 25 mM Tris/HCl pH 10.4 20 % (v/v) Methanol
Kathodenpuffer 40 mM 6-Aminohexansäure 20 % (v/v) Methanol
Immunologischer Nachweis der Proteine 2 x TBS-Puffer 40 mM TrisHCl, pH 7.4 270 mM NaCl
Waschlösung 1 x TBS 0,1 % (v/v) Tween 20 ddH2O ad 500 ml
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Blockierlösung 1 x TBS-Lösung 0,1 % (v/v) Tween 20 6 % (w/v) Magermilchpulver
ECL-Lösung - Lösung A 5 ml 1 M Tris/HCl pH 8.5 45 ml ddH2O 110 µl 90 mM p-Cumarsäure (in DMSO) 250 µl 250 mM Luminol (in DMSO)
- Lösung B 100 µl 30 % H2O2 900 µl ddH2O
- vor Gebrauch 1 ml Lösung A + 3 µl Lösung B frisch mischen
Silberfärbung Fixierung 50 % (v/v) Methanol 12 % (v/v) Essigsäure 0,05 % (v/v) Formaldehyd (37 %)
Waschlösung 50 % (v/v) Methanol
Vorbehandlungslösung 1 ml Natriumthiosulfat-Stammlösung (200 mg/10 ml ddH2O ) ddH2O ad 100 ml
Entwicklungslösung 6 g Natriumcarbonat 50 µl Formaldehyd (37 %) 20 µl Natriumthiosulfat-Stammlösung (200 mg/10 ml ddH2O ) 17
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Stopplösung 50 % (v/v) Methanol 12 % (v/v) Essigsäure ddH2O ad 100 ml
Coomassiefärbung Gelfärbelösung 2,5 g Coomassie Brilliant Blue R 250 900 ml Methanol 100 ml Essigsäure
Gelfixierlösung 600 ml ddH2O 300 ml Methanol 100 ml Essigsäure
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KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
2.2 Methoden 2.2.1 Anzucht pflanzlicher Zellkulturen Die Tomaten-Suspensionskulturen wurden im sterilen Nover-Medium in Glas-
Erlenmeyerkolben mit Schaumstoffstopfen in einem Schüttler bei einer konstanten
Temperatur von 25 °C und bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 100 upm angezogen.
Die Zellerhaltungskulturen wurden einmal wöchentlich umgesetzt, dabei wurden 5 ml der
SBT3-Erhaltungskultur, sowie 4 ml Wt Lp2-Erhaltungskultur mittels einer Sterilpipette in
50 ml frischem Nover-Medium resuspendiert. Zu der transgenen Erhaltungskultur wurden
jeweils 50 µg/ml Kanamycin als Selektionsdruck zugesetzt. Um die für die Ernte
bestimmte Hauptkultur zu erhalten, wurden 20 ml der SBT3-Erhaltungskultur unter
Zugabe von 75 µg/ml Kanamycin, sowie 16 ml Wt Lp2-Erhaltungskultur in 200 ml
frischem Nover-Medium resuspendiert. Die Hauptkultur wurde in einem Gesamtvolumen
von ca. 2 Liter angeimpft und 8 Tage wachsen gelassen.
2.2.2 Zellkulturernte Die Trennung von Zellen und Zelltrümmern von den im Kulturüberstand vorhandenen
löslichen Proteinen erfolgte durch eine Filtration (Filterpapier) mittels Wasserstrahlpumpe.
Das Volumen des gewonnenen Überstands (Filtrat) wurde nach der Filtration bestimmt
und auf 4° C abgekühlt.
2.2.3 Ammoniumsulfat-Präzipitation Die am häufigsten verwendete Methode Proteine zu fällen ist, sie durch Zugabe von
Ammoniumsulfat auszusalzen. Proteine bilden mit ihren exponierten und polaren Gruppen
Wasserstoffbrücken mit den Wassermolekülen. Wird eine hohe Konzentration an stark
geladenen Ionen wie Ammoniumionen (NH4+) und Sulfationen (SO42-) der Proteinlösung
zugefügt, so hydratisieren die Salzionen und entziehen den Proteinen die Hydrathülle. Dies
führt zur Aggregation der Proteine durch hydrophobe Wechselwirkung. Ammoniumsulfat
wird portionsweise zu der Proteinlösung zugegeben, wodurch eine fraktionierte Fällung
und Anreicherung des Zielproteins erzielt wird.
Das Ammoniumsulfat wurde zuerst in einem Mörser zerkleinert, um dessen Löslichkeit zu
verbessern. Die dem Überstand zugegebene Menge an Ammoniumsulfat richtete sich nach
19
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
den Volumen des gewonnenen Überstands und dem Sättigungsgrad der Lösung. Das
abgewogene Ammoniumsulfat wurde dem Überstand unter ständigem Rühren bei 4 °C
über einen Zeitraum von 30 min portionsweise zugefügt. Nach einem weiteren
vierstündigen Rühren bei 4 °C folgte eine 20 minutige Zentrifugation des Überstandes bei
10800 x g und 4 °C. Das Präzipitat des entsprechenden Fällungsschrittes wurde für die
Dialyse und weitere Reinigungsschritte bei 4°C aufbewahrt.
2.2.4 Dialyse Die Dialyse dient zum Entfernen von Salzen aus Proteinlösungen und zum
Pufferaustausch. Dazu werden Dialyseschläuche aus regenerierter Zellulose mit einer
definierten Porenweite verwendet, die sehr spezielle Trennleistungen ermöglichen. Für die
Dialyse wurde das Sediment der Ammoniumsulfat-Präzipitation in einem 20 ml
Dialysepuffer AAnion resuspendiert. Bei der nachfolgenden Zentrifugation (15 min bei 4 °C
und 2620 x g) wurden die Polysaccharide und Zelltrümmer von den gelösten Proteinen
getrennt. Die gewonnene Proteinlösung wurde mittels einer Pipette in einen
Dialyseschlauch (10-20 kD Ausschlußgrenze) überführt und im AAnion-Dialysepuffer (4l
für 4h bei 4 °C) entsalzt. Nach 4h wurde die Proteinlösung in einen neuen AAnion-
Dialysepuffer für weitere 4h überführt. Danach erfolgte eine Übernacht-Dialyse. Die
entsalzte Proteinlösung wurde anschließend abzentrifugiert und mittels Wasserstrahlpumpe
abfiltriert (Membranfilter Sartorius 0,45 µm). Das gewonnene Dialysat wurde für weitere
Reinigungsschritte bei 4 °C aufbewahrt.
2.2.5 Ionenaustauschchromatographie Bei der Ionenaustauschchromatographie erfolg die Trennung von Proteinen basierend auf
ihrer Ladung. Unter Beachtung des isoelektrischen Punktes wird der pH-Wert so gewählt,
dass das Protein der Wahl an die Matrix der Säule bindet. Die Elution der gebundenen
Proteine erfolgt durch Zugabe von Salzen, wobei in der Regel NaCl verwendet wird.
Durch die Anwesenheit von geladenen Natrium- und Chloridionen werden die
elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit der Matrix unterbunden, so dass
die Proteine von der Matrix gelöst werden. Für die Anionenaustauschchromatographie
wurde die Resource Q, 6 ml Säule eingesetzt.
20
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Die nach der Dialyse gewonnene Proteinlösung wurde in 5 ml Portionen auf die zunächst
mit Puffer AAnion äquilibrierte Anionenaustauschersäule appliziert und anschließend mittels
eines Stufen-Salzgradienten mit dem Puffer BAnion über 20 Säulenvolumen bei
Raumtemperatur eluiert. Die dabei gewählte Flußgeschwindigkeit betrug 2 ml/min. Das
Eluat wurde in 3 ml Fraktionen in Reagenzgläsern aufgefangen und bei 4 °C aufbewahrt.
Bei der nachfolgenden Kationenaustauschchromatographie wurde die Resource S, 6 ml
Säule eingesetzt, und es wurde wie bei der bereits beschriebenen Anionenaustausch-
chromatographie verfahren.
2.2.6 Aufkonzentrieren und Umpuffern geringvolumiger Proteinlösungen Das Aufkonzentrieren und Umpuffern geringvolumiger Proteinlösungen erfolgte unter
Anwendung von Vivaspin-Konzentratoren. Hierzu wurden die Proben in das
Innenröhrchen des Konzentrators, das eine Membrane mit 10 kD Ausschlussgrenze enthält,
gefüllt. Die Lösung wurde so lange bei 2620 x g und 4 °C zentrifugiert, bis das
Endvolumen ca. 500 µl betrug. Zum Umpuffern des Proteinkonzentrats wurden dann 20 ml
des entsprechenden Puffers zugegeben. Die Lösung wurde anschließend erneut
zentrifugiert. Das erhaltene Konzentrat wurde dann entweder für weitere
Aufreinigungsschritte verwendet oder bei –80 °C aufbewahrt.
2.2.7 Aktivitätstest Das Prinzip des Aktivitätstests beruht auf der Hydrolyse von fluoreszenzmarkierten
Peptidsubstraten. Das in diesem Test als Substrat eingesetzte fluorogene Systemin-Peptid
(ABz-SKRDPPKMQTD-Y(NO2)-NH2) weist eine Fluoreszenz-Gruppe (ABz (o-
aminobenzoyl)) und eine Quencher-Gruppe (Y(NO2)) auf. Bei der Anregung der ABz-
Gruppe bei einer Wellenlänge von 320 nm, kommt es zur Emission von Fluoreszenz mit
einem Emissionsmaximum bei 420 nm. Diese Fluoreszenz wird im ungespaltenen Peptid
durch den in Nachbarschaft gebundenen Quencher abgefangen und kann so in einem
Fluoreszenzphotometer nicht detektiert werden. Durch die Aktivität der LeSBT3-Protease
kommt es zur hydrolytischen Spaltung des Peptids, und dadurch zur räumlichen Trennung
zwischen der Fluoreszenz- und der Quenchergruppe. Die emittierte Fluoreszenz wird
folglich nicht mehr abgefangen und kann in einem Fluoreszenzphotometer quantifiziert
werden. Sie ist der Aktivität der getesteten Protease proportional. Die Messung der
21
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Fluoreszenz, bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge
von 420 nm, erfolgte bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten.
Der Aktivitätstest wurde in einem Gesamtvolumen von 200 µl mit 10 µM Substrat, 50 mM
Tris/HCl, pH 8.0 und 20 – 80 µl LeSBT3-Probe in Mikrotiterplatten durchgeführt.
2.2.8 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Der Bio-Rad Protein Assay (Bradford-Reagenz) ist ein einfacher kolorimetrischer Test für
die Messung der Gesamtproteinkonzentration. Er basiert auf der Methode nach Bradford
(1976), bei welcher die Farbänderung von Coomassie Brilliant Blue G-250 bei der
Bindung an Proteine gemessen wird. Dieser Farbstoff bindet dabei hauptsächlich an
basische und aromatische Aminosäuren. Der Test quantifiziert die meisten Proteine und
Polypeptide mit einem MW > 3-5 kD. Bei den durchgeführten Versuchen wurde ein Teil
der zu bestimmenden Proteinlösung mit dem ddH2O/Bradford-Reagenzgemisch (im
Verhältnis 5:1) bei einer Wellenlänge von 595 nm in einem UV/Vi Spektrophotometer
gemessen. Die Proteinkonzentration wurde anschließend anhand einer BSA-Eichgerade
errechnet.
2.2.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Auftrennung und Analyse von Proteingemischen erfolgte mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) im diskontinuierlichen Gelsystem nach Laemmli (1970).
Mit ihrer Hilfe können Proteine in Abhängigkeit von Masse und Ladung getrennt und
nachgewiesen werden. Da die getrennten Stoffe aus dem Gel mobilisiert werden können,
sind weitere Untersuchungen wie z.B. spezifische Immunreaktionen mit den Proteinen im
Anschluß an die Elektrophorese möglich. Die aufzutragenden Proteinproben mußten
zunächst denaturiert werden. Dazu wurden sie mit 3 x SDS-Probenpuffer versetzt und 5
min bei 100 °C inkubiert. Danach wurden die Proben auf ein 8,5 % (w/v) SDS-
Polyacrylamidgel geladen und im 1 x SDS-Laufpuffer bei 100 V aufgetrennt. Zur
Abschätzung der Molekularmasse der Proteine wurden 5 µl des Molekulargewichtsmarkers
(Standardprotein BioRad) auf das Gel aufgetragen.
22
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
2.2.10 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen Die Proteinbanden in Gelen können mit dem Farbstoff Coomassie – Blau sichtbar gemacht
werden. Dieser bindet unspezifisch an kationische und hydrophobe Seitenketten des
Proteins. Die Nachweisgrenze beträgt 100 – 50 ng. Nach der Auftrennung wurde das SDS-
Polyacrylamidgel über Nacht in der Gelfärbelösung inkubiert. Danach erfolgte eine
Entfärbung des Gels mittels Gelfixierlösung. Eine weitere Methode um Proteine sichtbar
zu machen, ist die Anwendung von Silberfärbung. Dabei bilden Ag+-Ionen Komplexe mit
Glutamat-, Aspartat- und Cysteinresten. Durch Reduktion entsteht elementares Silber,
welches die Proteine sichtbar macht. Die Nachweisgrenze liegt bei 5 ng. Nach der
Auftrennung wurde das SDS- Polyacrylamidgel über Nacht in der Fixationslösung
inkubiert. Die weiteren Schritte der Silberfärbung wurden dem Protokoll von Blum et al.,
(1987) entnommen.
2.2.11 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen („Western-Blot“) Die bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden für eine
weitere Analyse im Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
Beim elektrophorischen Transfer von Proteinen auf die Membran wurde nach dem
Protokoll des Herstellers (LKB) verfahren.
Der Anode lagen 6 Lagen des zuvor in Anodenpuffer 2 inkubierten (10 min) Bloting-
Papiers an, gefolgt von 3 Lagen des zuvor im Anodenpuffer 1 inkubierten (10 min)
Bloting-Papiers. Darauf wurden die Nitrocellulosemembran, die im Anodenpuffer 1 für 10
min inkubiert wurde und das Proteingel platziert. Der abschließenden Kathode lagen 6
Lagen Bloting-Papier an, das zuvor 10 min im Kathodenpuffer inkubiert wurde. Die bei
dem Blot verwendete Anode und Kathode wurden vor dem Versuch ca. eine Stunde in
ddH2O gewässert. Die elektrophoretische Übertragung erfolgte über 90 min bei 100 mA.
2.2.12 Immunologischer Nachweis der Proteine Zur Immundetektion der Proteine wurde zuerst die Nitrocellulosemembran über Nacht in
der Blockierungslösung inkubiert, um die freien Protein-Bindestellen der Membran
abzusättigen.
23
KAPITEL 2 MATERIAL UND METHODEN
Am darauffolgenden Tag folgte eine 2- bis 3-stündige Inkubation mit dem primären anti-
LeSBT3 Antikörper, der in der Blockierlösung 1:1000 verdünnt wurde. Der anschließende
Waschschritt (2 x 10 min 1 x TBS pH 7.4 / 0,1 % Tween und 1 x 10 min Blockierlösung)
diente der Entfernung der unspezifisch gebundenen Antikörper. Danach wurde die
Membran für 1h mit dem sekundären, Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert. Die
Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Blockierlösung betrug 1:10000.
Anschließend wurde die Membran vier Mal gewaschen und zur Detektion der Proteine mit
der ECL-Lösung für eine Minute bedeckt. Die Membran wurde dann gegen einen
Röntgenfilm exponiert und der Film nach entsprechender Expositionszeit (zwischen 2 und
10 Sekunden) entwickelt.
24
KAPITEL 3 RESULTATE
3. Resultate 3.1 Vorversuche zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease Um eine grundlegende biochemische Charakterisierung der LeSBT3-Protease durchführen
zu können, war es in erster Linie notwendig ein zuverlässiges Protokoll für die Gewinnung
und Aufreinigung der in den pflanzlichen Zellkulturen exprimierten Protease
auszuarbeiten.
3.1.1 Überexpression von LeSBT3 in transgenen Tomatenzellkulturen Vor Beginn dieser Arbeit, wurde eine transgene SBT3-Tomatensuspensionskultur
entwickelt, in der die LeSBT3-Protease unter Kontrolle des 35S-Promotors überexprimiert
wird. Dieses Protein wird dann ins Medium sezeniert. Um die Überexpression von LeSBT3
in diesem System zu überprüfen, wurden zwei parallele SBT3-Kulturen (a und b) und als
Vergleich auch zwei Wildtyp Lp2-Kulturen (a und b) geerntet und ein Teil ihrer
Überstände unter Anwendung von SDS-PAGE und Western-Blot analysiert. Die
Überexpression von LeSBT3 in den transgenen Zellkulturen konnte durch das
Vorhandensein einer etwa 75 kD-Bande sowohl bei der Silberfärbung des Gels (Abb. 1 A)
als auch im Western-Immunoblot (Abb. 1 B) nachgewiesen werden.
3.1.2 Bestimmung der Sättigungsstufen für die Ammoniumsulfat-Präzipitation Nachfolgend sollte die optimale Stufe der Ammoniumsulfat-Sättigung für die als
Vorreinigungs- und Aufkonzentrierungsschritt geplante Ammoniumsulfat-Präzipitation des
LeSBT3-Proteins bestimmt werden. Hierzu wurde eine 6-Tage alte SBT3-Zellkultur
geerntet und das Volumen ihres Überstandes bestimmt. Es folgte die erste Stufe der
Ammoniumsulfat-Präzipitation mit 0 – 60 % Ammoniumsulfat-Sättigung (0 – 60 %
Sättigung entspricht 390 g/l an Ammoniumsulfat). Zu 900 ml des geernteten Überstandes
wurden 351 g Ammoniumsulfat portionsweise bei 4 °C unter ständigem Rühren
zugegeben. Die Suspension wurde abzentrifugiert und das Volumen des erhaltenen
Überstandes bestimmt. Es folgten dann die zweite und die dritte Stufe der
Ammoniumsulfat-Fällung mit 60 – 85 % und 85 - 100 % Ammoniumsulfat-Sättigung. Die
60 – 85 % Sättigung entspricht 179 g/l und 85 - 100 % Sättigung entspricht 114 g/l an
Ammoniumsulfat. Die Präzipitate der einzelnen Stufen der Ammoniumsulfat-Fällung
25
KAPITEL 3 RESULTATE
wurden anschließend dialysiert und die erhaltenen Dialysate auf ein SDS-Polyacrylamidgel
aufgetragen. Bei der SDS-PAGE- und Western-Immunoblot-Analyse zeigte sich, dass der
größte Teil der sich in der Lösung befindlichen LeSBT3-Protease bei einer
Ammoniumsulfat-Sättigung von 60 – 85 % präzipitiert (Abb. 2 A und B). Mit dem Schritt
der Ammoniumsulfat-Fällung wurde das Zielprotein nicht nur vorgereinigt, sondern auch
angereichert.
150 kD 100 kD 75 kD 50 kD
37 kD
25 kD
SBT3 Wt P M a b a b
A
100 kD
75 kD 50 kD
37 kD 25 kD
Wt SBT3 P M a b a b
B
Abb. 1: Überexpression von LeSBT3 in transgenen Tomatenzellkulturen.
Je 25 µl der Kulturüberstände, von 18 ml an Gesamtvolumen der SBT3a und SBT3b, sowie der Wt Lp2a und Wt Lp2b-Kulturen wurden pro Spur aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. Abb. 1 A: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %), Silberfärbung. Abb. 1 B: Western-Immunoblot, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT3 Antikörper. Die Expositionszeit betrug 10 Sekunden. Die Überexpression von LeSBT3 konnte durch das Vorhandensein von Banden bei ca. 75 kD nachgewiesen werden.
26
KAPITEL 3 RESULTATE
A SBT3a SBT3b P M Ü 1 2 3 Ü 1 2 3
100 kD
75 kD
50 kD
37 kD
B SBT3a SBT3b
P M Ü 1 2 3 Ü 1 2 3
100 kD 75 kD 50 kD 37 kD
Abb. 2: Bestimmung von Sättigungsstufen für die Ammoniumsulfat-Präzipitation.
Jeweils 15 µl der entsprechenden Kulturüberstände und Dialysate wurden pro Spur aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. Abb. 1 A: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %), Silberfärbung. Abb. 1 B: Western-Immunoblot, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT3 Antikörper. Die Expositionszeit betrug 10 Sekunden. SBT3a-Ü: Überstand der SBT3a-Zellkultur; 15 µl von 900 ml Gesamtvolumen. SBT3a-1: 0 - 60 % Ammoniumsulfatsättigung; 15 µl von 6.3 ml Gesamtvolumen. SBT3a-2: 60 - 85 % Ammoniumsulfatsättigung; 15 µl von 8.7 ml Gesamtvolumen. SBT3a-3: 85 - 100% Ammoniumsulfat-sättigung; 15 µl von 13.4 ml Gesamtvolumen. SBT3b-Ü: Überstand der SBT3b-Zellkultur; 15 µl von 900 ml Gesamtvolumen. SBT3b-1: 0 - 60 % Ammoniumsulfatsättigung; 15 µl von 8.5 ml Gesamtvolumen. SBT3b-2: 60 - 85 % Ammoniumsulfatsättigung; 15 µl von 8.2 ml Gesamtvolumen. SBT3b-3: 85 - 100 % Ammoniumsulfatsättigung; 15 µl von 13.6 ml Gesamtvolumen. Wie den beiden Abbildungen zu entnehmen ist, befindet sich der größte Teil der LeSBT3-Protease bei einer Ammoniumsulfat-Sättigung von 60 – 85 %.
27
KAPITEL 3 RESULTATE
3.1.3 Zeitlicher Verlauf der Expression von LeSBT3 Des weiteren wurde nach einem optimalen Zeitpunkt der Ernte für die SBT3-Zellkultur
gesucht. Hierzu wurden 10 Erlenmeyerkolben mit jeweils 50 ml der SBT3-Zellkultur
angesetzt und über einem Zeitraum von t = 10 d geerntet. Die Überstände der zu
angegebenen Zeitpunkten geernteten Kulturen wurden nachfolgend bei 4 °C aufbewahrt
und gemeinsam auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Bestimmung der
Proteinkonzentration nach Bradford (Abb. 3) zeigte eine starke Zunahme der
Proteinkonzentration bis zum 8. Tag der Zellkulturdauer. Nach dem 8. Tag zeigte sich nur
eine schwache Zunahme der Proteinkonzentration. Die anschließenden SDS-PAGE- und
Western-Immunoblot-Analyse, zeigte dagegen eine undifferenzierte und kontinuierliche
Akkumulation des LeSBT3-Proteins in den geernteten Überständen der 10-tägigen
Kulturdauer (Abb. 4 A und B). Aufgrund der beginnenden oxidativen Prozesse der SBT3-
Zellkultur bei t = 9 d, wurde beschlossen die Ernte zukünftig bei t = 8 d durchzuführen.
Prot
eink
onze
ntra
tion
[µg/
ml ]
2 4 6 7 8 9 10
Kultivierungsdauer [d]
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Abb. 3: Zeitlicher Verlauf der Proteinkonzentration in dem Überstand der transgenen SBT3-Zellkultur.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die SBT3-Zellkultur geerntet und ihre Proteinkonzentation nach Bradford bestimmt. Eine deutliche Zunahme der Proteinkonzentration bis zu dem achten Tag der Zellkulturdauer.
28
KAPITEL 3 RESULTATE
A
150 kD 75 kD 50 kD 37 kD 25 kD
Wt P M 2 4 6 7 8 9 10
B Wt P M 2 4 6 7 8 9 10
150 kD 75 kD 50 kD 37 kD 25 kD
Abb. 4: Zeitlicher Verlauf der Expression der LeSBT3-Protease.
Pro Spur wurden jeweils 25 µl des jeweiligen Überstandes aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. Abb. 4 A: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %), Silberfärbung. Abb. 4 B: Western-Immunoblot, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT3 Antikörper. Die Expositionszeit betrug 5 Sekunden. Dargestellt ist eine zeitabhängige Akkumulation des LeSBT3-Proteins bei t = 2d, 4d, 6d, 7d, 8d, 9d und 10d.
29
KAPITEL 3 RESULTATE
3.1.4. Anionenaustauschchromatographie des SBT3-Dialysates Für die Anionenaustauschchromatographie wurde das Tris/HCl –Puffersystem mit einem
pH-Wert von 9.0 und 9.4 getestet. Die Wahl dieser pH-Werte richtete sich nach dem für
die LeSBT3-Protease berechneten isoelektrischen Punkt von 8.2. Bei einem pH-Wert von
9.0 und 9.4 sollte die LeSBT3-Protease negativ geladen sein und dadurch gut an dem
Anionenaustauscher binden. Hierzu wurden 5 ml der zuvor in Puffer AAnion pH 9.0
dialysierten Proteinlösung auf die Anionenaustauschersäule (Resource Q, 6ml) appliziert
und mittels eines kontinuierlichen Salzgradienten mit dem Puffer BAnion pH 9.0 über 15
Säulenvolumen bei Raumtemperatur eluiert. Zum Vergleich wurde der Vorgang nochmals
bei pH 9.4 durchgeführt. Die Auswertung der beiden Anionenaustausch-
aufreinigungsschritte erfolgte durch den Vergleich der beiden Chromatogramme (Abb. 5
und 7), sowie immunologisch unter Anwendung von Western-Blot mit dem anti-LeSBT3
Antikörper (Abb. 6 und 8). Es wurde dabei festgestellt, dass das LeSBT3-Protein bei pH
9.4 auf sechs Fraktionen verteilt ist, dagegen bei pH 9.0 über vier Fraktionen (Abb. 6 und
8). Außerdem wurde ein Unterschied im Verlauf der „Peaks“ in der Anfangsphase der
Elution festgestellt (Abb. 5 und 7). Daraufhin wurde entschieden, dass für die
nachfolgenden Anionenaustauschaufreinigungsschritte das Tris/HCl-Puffersystem mit pH
9.0 eingesetzt wird.
Abb. 5: Aufreinigung des LeSBT3-Dialysates über Anionaustauschchromatographie bei pH 9.0.
Die Probe wurde über 15 Säulenvolumen mit einem kontinuierlichen Salzgradienten eluiert. F3: die ungebundenen Bestandteile der Probe.
121203002:1_UV1_280nm 121203002:1_UV2_0nm 121203002:1_UV3_0nm 121203002:1_Cond 121203002:1_Cond% 121203002:1_Conc 121203002:1_Flow 121203002:1_Fractions 121203002:1_Inject 121203002:1_UV1_280nm@01,BASEM 121203002:1_Logbook
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
mAU
0
20
40
60
80
%B
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 minF3 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D12 D11 D10 D9 D8 D7 D6 D5 D4 Waste
1.24
7.18
8.60
12.26 14.16
15.91
20.19 22.71
30.61 32.00
34.58
30
KAPITEL 3 RESULTATE
Abb. 6: Western-Blot-Analyse der eluierten Fraktionen des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes bei pH 9.0.
Jeweils 20 µl der entsprechenden Fraktionen wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und in Western-Blot unter Verwendung des anti-LeSBT3-Antikörpers analysiert. In den Fraktionen C7, C8, C9 und C10 konnte das LeSBT3-Protein detektiert werden. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen.
Abb. 7: Aufreinigung des LeSBT3-Dialysates über Anionenaustauschchromatographie bei pH 9.4.
Die Probe wurde über 15 Säulenvolumen mit einem kontinuierlichen Salzgradienten eluiert. F3: die ungebundenen Bestandteile der Probe.
121203001:1_UV1_280nm 121203001:1_UV2_0nm 121203001:1_UV3_0nm 121203001:1_Cond 121203001:1_Cond% 121203001:1_Conc 121203001:1_Flow 121203001:1_Fractions 121203001:1_Inject 121203001:1_UV1_280nm@01,BASEM 121203001:1_Logbook
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
mAU
0
20
40
60
80
%B
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 minF3 A12 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 C2 C3 C4 Waste
-0.45
-0.07
1.19
3.94
6.94
8.47
11.08 11.99
13.63
15.47
19.52 21.04
22.82
33.51 35.53
100 kD
75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
P M F3 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D12 D11 D6
31
KAPITEL 3 RESULTATE
P M F3 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B2 C2 C3
100 kD
75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
Abb. 8: Western-Blot-Analyse der eluierten Fraktionen des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes bei pH 9.4.
Pro Spur wurden jeweils 20 µl der Fraktionen aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. In den Fraktionen B12, B11, B10, B9, B8 und B7 wurde das LeSBT3-Protein mit dem primären anti-LeSBT3-Antikörper detektiert. Die Expositionszeit betrug 5 Sekunden. 3.1.5 Kationenaustauschchromatographie des SBT3-Dialysates Für den Kationenaustauschaufreinigungsschritt wurde ein Na2HPO4/NaH2PO4-
Puffersystem mit einem pH-Wert von 6.5 und 7.0 getestet. Die Wahl dieser pH-Werte
richtete sich ebenfalls nach dem für die LeSBT3-Protease berechneten isoelektrischen
Punkt von 8.2. Bei einem pH-Wert von 6.5 und 7.0 sollte die LeSBT3-Protease positiv
geladen sein und dadurch gut an den Kationenaustauscher binden. Hierzu wurden 5 ml der
zuvor in Puffer AKation pH 6.5 dialysierten Proteinlösung auf die Kationenaustauschersäule
(Resource S, 6 ml) appliziert und mittels eines linearen Salzgradienten mit dem Puffer
BKation pH 6.5 über 20 Säulenvolumen bei Raumtemperatur eluiert. Zum Vergleich wurde
der Vorgang nochmals bei pH 7.0 durchgeführt.
Die Auswertung der beiden Kationenaustauschaufreinigungsschritte erfolgte durch den
Vergleich der beiden Chromatogramme (Abb. 9 und 11), sowie immunologisch unter
Anwendung von Western-Blot mit dem anti-LeSBT3 Antikörper (Abb. 10 und 12). Bei der
Auswertung des Verlaufs der beiden Elutionsschritte konnten keine größeren Unterschiede
festgestellt werden. Es wurde entschieden, zukünftig das Na2HPO4/NaH2PO4-Puffersystem
mit pH 7.0 für die Kationenaustauschchromatographie zu verwenden.
32
KAPITEL 3 RESULTATE
Abb. 9: Aufreinigung des LeSBT3-Dialysates über Kationenaustauschchromatographie bei pH 6.5
Die Probe wurde über 20 Säulenvolumen mit einem linearen Salzgradienten eluiert. F3: die ungebundenen Bestandteile der Probe.
Abb. 10: Western-Blot-Analyse der eluierten Fraktionen des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes bei pH 6.5.
Pro Spur wurden jeweils 20 µl der Fraktionen aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. In den Fraktionen A6, A7, A8, A9, A10, A11 und A12 wurde das LeSBT3-Protein mit dem primären anti-LeSBT3-Antikörper detektiert. Die Expositionszeit betrug 5 Sekunden.
Kation120204b001:1_UV1_280nm Kation120204b001:1_UV2_0nm Kation120204b001:1_Cond Kation120204b001:1_Cond% Kation120204b001:1_Conc Kation120204b001:1_Flow Kation120204b001:1_Fractions Kation120204b001:1_Inject Kation120204b001:1_UV1_280nm@01,BASEM Kation120204b001:1_Logbook
0
50
100
150
200
250
300
mAU
0
20
40
60
80
%B
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 minF3 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 Waste
2.02
13.97
22.26
23.02
23.91
24.63
25.81
27.99
29.61 34.95
M F3 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B9 P
100 kD
75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
33
KAPITEL 3 RESULTATE
Abb. 11: Aufreinigung des LeSBT3-Dialysates über Kationenaustauschchromatographie bei pH 7.0
Die Probe wurde über 20 Säulenvolumen mit einem linearen Salzgradienten eluiert. F3: die ungebundenen Bestandteile der Probe.
Abb. 12: Western-Blot-Analyse der eluierten Fraktionen des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes bei pH 7.0.
Pro Spur wurden jeweils 20 µl der Fraktionen aufgetragen. Zusätzlich wurden 363 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease als Positivkontrolle P und 5 µl des Molekulargewichtsmarker M aufgetragen. In den Fraktionen A6, A7, A8, A9, A10, A11 und A12 wurde das LeSBT3-Protein mit dem primären anti-LeSBT3-Antikörper detektiert. Die Expositionszeit betrug 5 Sekunden.
Cation120204001:1_UV1_280nm Cation120204001:1_UV2_0nm Cation120204001:1_Cond Cation120204001:1_Cond% Cation120204001:1_Conc Cation120204001:1_Flow Cation120204001:1_Fractions Cation120204001:1_Inject Cation120204001:1_UV1_280nm@01,BASEM Cation120204001:1_Logbook
0
50
100
150
200
250
300
mAU
0
20
40
60
80
%B
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 minF3 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 Waste
-0.09
14.75 20.55
22.24
23.02
23.31
24.30
25.03
26.46
29.23
31.86 36.77 64.14
M F3 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10 B9 B8 P
100 kD
75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
34
KAPITEL 3 RESULTATE
3.2 Aufreinigung der LeSBT3-Protease Die in den Vorversuchen durchgeführten Einzelschritte zur Gewinnung und Aufreinigung
der LeSBT3-Protease haben sich als reproduzierbar und zuverlässig erwiesen. Sie wurden
deshalb zur Aufreinigung dieses Proteins eingesetzt. Die LeSBT3-Zellkultur mit einem
Gesamtvolumen von ca. 2 Litern wurde nach 8 Tagen geerntet und ihr Kulturüberstand
einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Präzipitation unterzogen. Die daraus gewonnenen
Sedimente der 60 – 85 % Ammoniumsulfatsättigung wurden in 20 ml des Dialysepuffers
(Anion pH 9.0) resuspendiert. Um die Zelltrümmer und Polysaccharide des Dialysates zu
beseitigen, wurde dieses im nachfolgenden Schritt abzentrifugiert (15 min. bei 4 °C und
2000 x g) und anschließend abfiltriert (Membranfilter Sartorius 0,45 µm).
3.2.1 Anionenaustauschchromatographie Das gewonnene Dialysat wurde schrittweise in 5 ml Proben auf die zuvor mit dem
Bindungspuffer (AAnion pH 9.0) äquilibrierte Säule (Resource Q, 6 ml) appliziert. Die
gebundenen Proteine wurden mit einem kontinuierlichen Salzgradienten über 17 Säulen-
volumen mit dem Elutionspuffer (BAnion pH 9.0) eluiert (Abb. 13). Die gewählte
Flussgeschwindigkeit betrug 2 ml/min. Dieser Vorgang wurde insgesamt unter gleichen
Bedingungen vier Mal wiederholt. Die Fraktionen der vier einzelnen Läufe wurden bei 4
°C für weitere Analysen aufbewahrt.
3.2.2 Analyse des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes 3.2.2.1 Aktivitätstest Bei den Aufreinigungsschritten der Zellkultur war es wichtig, die LeSBT3-Protease in
einer aktiven Form aufzureinigen und zu gewinnen. Die aufgefangenen Fraktionen des
vorangegangenen Aufreinigungsschrittes wurden deshalb zuerst einem Aktivitätstest
unterzogen. Der Aktivitätstest wurde mit je 40 µl der jeweiligen Fraktionen in einem
Gesamtvolumen von 200 µl wie im Methoden-Abschnitt 2.2.7 beschrieben durchgeführt.
Als Positivkontrolle wurden 40 µl der vorgereinigten LeSBT3-Protease vorgelegt. Als
Negativkontrolle diente der Dialysepuffer. Die Auswertung des Aktivitätstestes zeigte eine
deutliche Zunahme der Aktivität im Bereich der Fraktionen A4, A5, A6, A7 und A8 (Abb.
14).
35
KAPITEL 3 RESULTATE
36
Abb. 13: Anionenaustauschchromatographie des SBT3-Dialysates.
Dargestellt ist ein Chromatogramm des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes des SBT3-Dialysates bei pH 9.0. Die Probe wurde über 17 Säulenvolumen mit einem kontinuierlichen Salzgradienten eluiert. F3 - die ungebundenen Bestandteile der Probe. Abb.14: Aktivitätstest der eluierten Fraktionen des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes.
Dargestellt sind die Messergebnisse des Aktivitätstestes der einzelnen Fraktionen nach dem Anionenaustauschchromatographieschritt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 420 nm, gemessen über einen Zeitraum von 30 Minuten. P - als Positivkontrolle diente die vorgereinigte LeSBT3-Protease. N - als Negativkontrolle wurde der Dialysepuffer verwendet.
Anion150404Leszek2001:1_UV1_280nm Anion150404Leszek2001:1_UV2_0nm Anion150404Leszek2001:1_UV3_0nm Anion150404Leszek2001:1_Cond Anion150404Leszek2001:1_Cond% Anion150404Leszek2001:1_Conc Anion150404Leszek2001:1_Fractions Anion150404Leszek2001:1_Inject Anion150404Leszek2001:1_UV1_280nm@01,BASEM Anion150404Leszek2001:1_Logbook
0
50
100
150
200
mAU
0
20
40
60
80
%B
0 20 40 60 80 minF3 A1 A2 A3A4A5A6A7A8A9 A11 B12 B10 B8B7B6B5B4B3B2B1C1 C3C4 C5 C6 C7 C8 C9 Waste
5.84
30.57 32.16
33.16
35.15 39.25 46.57
50.36
53.83 60.67 68.19
99.56
∆F
luor
esze
nz [I
nt/m
in]
18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
F3 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A12 B10 B9 N P
Fraktion
KAPITEL 3 RESULTATE
3.2.2.2 SDS-PAGE-Analyse und Western-Blot Zusätzlich zu dem durchgeführten Aktivitätstest wurden die eluierten Fraktionen mittels
SDS-PAGE und Western-Blots analysiert. Dazu wurden die Fraktionen auf ein SDS-
Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Der Nachweis der
Proteine erfolgte mittels einer Coomassie-Färbung und eines Western-Blots. Vor allem in
den Fraktionen A4, A5, A6, A7 und A8 konnte bei der Auswertung der Coomassie-
Färbung eine deutliche, etwa 75 kD große Bande nachgewiesen werden (Abb. 15 A). Die
Western-Blot-Analyse mit dem primären anti-LeSBT3 Antikörper bestätigte diesen
Befund, welcher auf das Vorhandensein des LeSBT3-Proteins in den Fraktionen hindeutete
(Abb. 15 B). Die Coomassie-Färbung zeigte allerdings, dass der vorangegangene
Anionenaustauschaufreinigungsschritt nicht zur vollständigen Reinheit des LeSBT3-
Proteins führte (Abb. 15 A).
3.2.3 Kationenaustauschchromatographie Um eine weitere Reinigung der mit Hilfe der Anionenaustauschchromatographie
vorgereinigten LeSBT3-Protease vorzunehmen, wurden die Fraktionen A4, A5, A6, A7
und A8 des vorangegangenen Aufreinigungsschrittes vereinigt und mit Hilfe eines
Konzentrators auf pH 7.0 umgepuffert. Damit sollte der störende Einfluss des
Bindungspuffers (AAnion pH 9.0) bei der Kationenaustauschchromatographie vermieden
werden. Die vereinigten und umgepufferten Fraktionen wurden durch zentrifugieren auf
ca. 500 µl aufkonzentriert und anschließend mit dem Bindungspuffer (AKation pH 7.0) auf 5
ml aufgefüllt. Die Probe wurde auf die zuvor mit dem Bindungspuffer (AKation pH 7.0)
äquiliebrierte Säule (Resource S, 6 ml) appliziert und mit einem kontinuierlichen
Salzgradienten über 16 Säulenvolumen mit dem Elutionspuffer (BKation pH 7.0) eluiert
(Abb. 16). Der Aktivitätstest der eluierten Fraktionen erfolgte unmittelbar nach der
Beendigung des Durchlaufes.
37
KAPITEL 3 RESULTATE
38
M D F3 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A12 B10 B9
150 kD
75 kD 50 kD 37 kD
A
150 kD
75 kD
50 kD
37 kD
M D F3 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A12 B10 B9
B Abb. 15 A und B: Analyse des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes der LeSBT3-Protease.
Pro Spur wurden jeweils 20 µl der jeweiligen Fraktionen A3, A4, A5, A6, A7, A8, A12, B10, B9 und des Durchlaufs - F3, sowie 10 µl des Dialysates - D aufgetragen. Abb. 15 A: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %); Coomassie-Färbung. Abb. 15 B: Western-Immunoblot, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT3 Antikörper; Expositionszeit betrug 10 Sekunden. Molekulargewichtsmarker - M 5 µl.
KAPITEL 3 RESULTATE
39
Abb. 16: Kationenaustauschchromatographie der vorgereinigten LeSBT3-Protease.
Dargestellt ist ein Chromatogramm des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes. Die zuvor aufkonzentrierten und umgepufferten Fraktionen A4, A5, A6, A7 und A8 des Anionenaustausch-chromatographieschrittes wurden auf die Resource S - Säule appliziert und über 17 Säulenvolumen mit einem kontinuierlichen Salzgradienten eluiert. F3 - die ungebundenen Bestandteile der Probe. 3.2.4 Analyse des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes 3.2.4.1 Aktivitätstest Bei dem nachfolgenden Test wurde die Aktivität der Fraktionen des Kationenaustausch-
aufreinigungsschrittes gemessen. Entsprechend der im Abschnitt 3.2.2.1 beschriebenen
Vorgehensweise wurden zu den 160 µl des Testansatzes 40 µl von den jeweiligen
Fraktionen zugegeben und somit die Reaktion gestartet. Als Negativkontrolle diente hier
der Bindungspuffer AKation pH 7.0. Bei der Auswertung des Tests zeigten sich deutliche
Unterschiede in der Aktivität der einzelnen Fraktionen (Abb. 17). Die Fraktionen A8 und
A9 zeigten gegenüber den restlichen Fraktionen eine starke Protease-Aktivität. Dieses
Messergebnis korreliert mit dem „Peak“ im Chromatogramm des Kationenaustausch-
aufreinigungsschrittes (Abb. 16) und stellt ein Hinweis auf die Anwesenheit der LeSBT3-
Protease dar. Die Fraktionen A8 und A9 wurden anschließend auf pH 9.0 umgepuffert und
auf 200 µl aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde im flüssigen Stickstoff eingefroren und
für die nachfolgenden biochemischen Tests bei -80 °C aufbewahrt.
Cation260404001:1_UV1_280nm Cation260404001:1_UV2_0nm Cation260404001:1_UV3_0nm Cation260404001:1_Cond Cation260404001:1_Cond% Cation260404001:1_Conc Cation260404001:1_Fractions Cation260404001:1_Inject Cation260404001:1_UV1_280nm@01,BASEM Cation260404001:1_Logbook
0
100
200
300
400
500
mAU
0
20
40
60
80
%B
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 minF3 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9A10 A12 B11 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 Waste
-0.09
21.74
23.97 25.99
27.59
29.85
31.54 37.61 43.36 46.11
KAPITEL 3 RESULTATE
∆Fl
uore
szen
z [I
nt/m
in]
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00 F3 A7 A8 A9 A10 B12 B11 B10 N P
Fraktion
Abb. 17: Aktivitätstest der eluierten Fraktionen des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes.
Dargestellt sind die Messergebnisse des Aktivitätstestes der einzelnen Fraktionen nach dem Kationenaustauschaufreinigungsschritt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 420 nm, gemessen über einen Zeitraum von 30 Minuten. P - als Positivkontrolle dient die vorgereinigte LeSBT3-Protease. N - als Negativkontrolle wurde der Bindungspuffer AKation pH 7.0 verwendet. 3.2.4.2 SDS-PAGE-Analyse und Western-Blot Wie im Abschnitt 3.2.3 beschrieben, wurden die eluierten Fraktionen auf ein Proteingel
aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Bei der anschließenden Auswertung der
SDS-PAGE-Analyse und des Western-Blots wurde angenommen, dass es sich bei den
Fraktionen A8 und A9 um eine aufgereinigte und aktive Form der LeSBT3-Protease
handelt. Das Auftreten einer starken Bande (etwa 75 kD) bei beiden Fraktionen (Abb. 18 A
und B) korreliert mit dem Ergebnis des Aktivitätstests (Abb. 17) und dem ersten „Peak“
des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes (Abb. 16).
40
KAPITEL 3 RESULTATE
M D F3 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10
150 kD
75 kD
50 kD
37 kD
A
M D F3 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B12 B11 B10
150 kD
75 kD
50 kD
37 kD
B
Abb. 18: Analyse des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes.
Pro Spur wurden jeweils 20 µl der jeweiligen Fraktionen A7, A8, A9, A10, A11, A12, A12, B12, B11, B10 und des Durchlaufs - F3, sowie 10 µl des Dialysates - D aufgetragen. Abb. 18 A: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %); Coomassie-Färbung. Abb. 18 B: Western-Immunoblot, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT3-Antikörper; Expositionszeit betrug 10 Sekunden. Molekulargewichtsmarker - M 5 µl. 3.2.5 Zusammenfassung zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease Die in dem Abschnitt 3.2 beschriebene Vorgehensweise zur Aufreinigung und Gewinnung
der LeSBT3-Protease erwies sich in der Praxis als zuverlässig und gut reproduzierbar.
41
KAPITEL 3 RESULTATE
Wobei die Ausbeute des Proteins zwischen 133,35 und 279,3 µg an reinem LeSBT3 pro
Liter Zellkultur lag.
Zum Abschluss wurden die einzelnen Schritte der Aufreinigung von der LeSBT3-Protease
auf einem Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gel dargestellt. Dabei zeigte sich von dem
Überstand der Zellkultur bis hin zu dem Konzentrat der Fraktionen des
Kationenaustauschaufreinigungsschrittes eine zunehmende Homogenität des LeSBT3-
Proteins (Abb. 19). Die Diskrepanz zwischen der Proteinkonzentration der vereinigten
Fraktionen der einzelnen Aufreinigungsschritte und ihrer Konzentrate ist auf die Verluste
des Proteins bei Verwendung des Konzentrators zurück zu führen.
150 kD 75 kD
50 kD
37 kD
25 kD
20 kD
M Ü D AV KV AK KK P Abb. 19 A und B: Aufreinigung der 75 kD-Form von LeSBT3-Protease aus dem Zellkulturüberstand der transgenen Tomatenzellkultur.
Dargestellt wurden die einzelnen Schritte der Aufreinigung, von dem Rohextrakt der Zellkultur bis hin zu dem Konzentrat der Fraktionen des letzten Aufreinigungsschrittes. SDS-PAGE-Polyacrylamidgel (8,5 %); Coomassie-Färbung. Es wurden aufgetragen: Ü - Überstand der SBT3-Zellkultur (3,5 µg von 168,67 mg Gesamtprotein), D – Dialysat der SBT3-Zellkultur (20 µg von 12,98 mg Gesamtprotein), AV - die vereinigten Fraktionen des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes A4/A5/A6/A7/A8 (2 µg von 1,655 mg Gesamtprotein), AK - Konzentrat der vereinigten Fraktionen des Anionenaustauschaufreinigungsschrittes (2 µg von 1,06 mg Gesamtprotein) KV - die vereinigten Fraktionen des Kationenaustausch-aufreinigungsschrittes A8/A9 (2 µg von 812,36 µg Gesamtprotein), KK - Konzentrat der vereinigten Fraktionen des Kationenaustauschaufreinigungsschrittes (10 µg von 558,6 µg Gesamtprotein). P - als Positivkontrolle wurde 36,3 ng der vorgereinigten LeSBT3-Protease aufgetragen. Molekulargewichtsmarker - M 5 µl.
42
KAPITEL 3 RESULTATE
3.3 Biochemische Charakterisierung der LeSBT3-Protease Anschließend an die im Abschnitt 3.2 beschriebene Aufreinigung der LeSBT3-Protease,
sollten einige grundlegende biochemische Tests durchgeführt werden, die zur
Charakterisierung dieses Proteins beitragen sollen.
3.3.1 Bestimmung des Aufbewahrungsoptimums Nachdem die LeSBT3-Protease aufgereinigt wurde, war es in erster Linie wichtig ein
Aufbewahrungs-Optimum zu bestimmen und dadurch die möglichen Aktivitätsverluste zu
minimieren. Hierzu wurde die LeSBT3-Protease in einer Konzentration von 0,15 µg/µl in
folgenden Puffern vorgelegt: Na-acetat/HAc, pH 6.0; NaH2PO4 /Na2HPO4, pH 7.0 und
Tris/HCl, pH 8.0 und 9.0. Alle Puffer lagen in einer Endkonzentration von 50 mM vor.
Zusätzlich wurde eine Messreihe mit 5 mM EDTA angesetzt, um den eventuell störenden
Einfluss der noch vorhandenen Metalloproteasen auszuschließen. Die nachfolgende
Inkubation der Proben erfolgte über 5 Tage parallel bei +4 und –80 °C. Nach 5 Tagen
erfolgte eine Auswertung der Proben mit Hilfe des Aktivitätstestes. Die Messung der
Aktivität wurde 3 Mal durchgeführt (Abb. 20). Bei der Auswertung des Tests wurde
festgestellt, dass Proben, die bei –80 °C inkubiert waren, eine höhere Aktivität aufwiesen
gegenüber den bei +4 °C inkubierten Proben. Ein Einfluss von unterschiedlichen pH-
Werten auf die Aktivität konnte nicht eindeutig festgestellt werden. Der Rückgang der
Aktivität bei pH 6.0 konnte auf einen möglichen Pipettierfehler zurückgeführt werden. Es
konnte ebenfalls kein Unterschied in der Aktivität bei Proben, die mit oder ohne EDTA
inkubiert wurden beobachtet werden. Infolge dessen wurde beschlossen, zukünftig die
LeSBT3-Protease in 25 mM Tris/HCl, pH 8.0, bei –80 °C aufzubewahren.
43
KAPITEL 3 RESULTATE
∆Flu
ores
zenz
[Int
/min
]
6.0 6.0 7.0 7.0 8.0 8.0 9.0 9.0 EDTA+ EDTA- EDTA+ EDTA- EDTA+ EDTA- EDTA+ EDTA- pH
8,00 7,00 6.00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
- 80°C+ 4°C
Abb. 20: Das Aufbewahrungsoptimum der LeSBT3-Protease.
Die LeSBT3-Protease wurde 5 Tage lang parallel bei +4 °C und –80 °C in einer Konzentration von 0,15 µg/µl in den Na-acetat/HAc, pH 6.0; NaH2PO4 /Na2HPO4, pH 7.0 und Tris/HCl, pH 8.0 / 9.0 – Puffer inkubiert. Zusätzlich wurde eine Messreihe mit 5 mM EDTA angesetzt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 420 nm, gemessen über einen Zeitraum von 30 Minuten. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte aus drei Messungen dar. 3.3.2 Bestimmung des pH-Optimums der Enzymaktivität Im diesem Test wurde eine aktive und aufgereinigte LeSBT3-Protease zur Bestimmung des
Optimums ihrer Aktivität in Abhängigkeit vom pH eingesetzt. Hierzu wurde die LeSBT3-
Protease in einer Konzentration von 0,2 µg/µl in folgenden Puffern vorgelegt: Na-
acetat/HAc, pH 4.0 bis 6.0; NaH2PO4 /Na2HPO4, pH 7.0; Bis-Tris/HCl, pH 7.0; Tris/HCl,
pH 8.0 und 9.0; und Glycine/HCl, pH 10.0 und 11.0. Alle Puffer lagen in einer
Endkonzentration von 50 mM vor. Der Aktivitätstest wurde drei Mal durchgeführt. Die
LeSBT3-Protease zeigte über den ganzen getesteten pH-Bereich eine hydrolytische
Aktivität, wobei das Aktivitätsmaximum bei pH 9.0 lag (Abb. 21).
44
KAPITEL 3 RESULTATE
∆Flu
ores
zenz
[Int
/min
]
4.0 5.0 6.0 7.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0
pH
7,00
6.00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Abb. 21: Bestimmung des pH-Optimums der Enzymaktivität.
Die LeSBT3-Protease in 0,2 µg/µl Konzentration wurde in Na-acetat/HAc, pH 4.0 bis 6.0; NaH2P04 /Na2HPO4, pH 7.0; Bis-Tris/HCl, pH 7.0; Tris/HCl, pH 8.0 und 9.0; Glycin/HCl, pH 10.0 und 11.0 vorgelegt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 420 nm, gemessen über einen Zeitraum von 30 Minuten. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte aus drei Messungen dar. 3.3.3 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration Nachdem der pH-Wert, bei dem das Enzym das Aktivitätsmaximum aufweist, gefunden
wurde, sollte die Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration
untersucht werden. Das Substrat (fluorogenes Systemin-Peptid) wurde in dem dreifach
durchgeführten Test in folgenden Endkonzentrationen vorgelegt: 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10
µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM und 200 µM. Die aufgereinigte LeSBT3-Protease wurde in
einer Konzentration von 0.2 µg/µl im Puffer Tris/HCl, pH 9.0 eigesetzt. Die Messung
ergab eine deutliche Zunahme der LeSBT3-Aktivität mit steigender Substratkonzentration
(Abb. 22). Es konnte allerdings auch bei einer Substratkonzentration von 50 µM kein
Sättigungsbereich erreicht werden. Die Daten für die Messung der 100 und 200 µM
Substratkonzentration konnten Aufgrund der hohen Fluoreszenz der gemessenen Proben
nicht erfasst werden. Somit war die Berechnung der Maximalgeschwindigkeit Vmax und der
Michaelis-Konstante Km nicht möglich.
45
KAPITEL 3 RESULTATE
∆Flu
ores
zenz
[Int
/min
]
1 µM 2 µM 5 µM 10 µM 20 µM 50 µM
Substratkonzentration
18,00 16.00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
Abb. 22: Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration.
Bei der Untersuchung zur Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Substratkonzentration wurde das fluorogene Systemin-Peptid in der Konzentration von 1 µM, 2 µM, 5 µ M, 10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM und 200 µM vorgelegt. Das Auswerten der Messdaten bei der Substratkonzentration von 100- und 200 µM war aufgrund der hohen Fluoreszenz nicht möglich. Die aufgereinigte LeSBT3-Protease wurde in einer Konzentration von 0,2 µg/µl angesetzt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Emissionswellenlänge von 420 nm, gemessen über einen Zeitraum von 30 Minuten. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte aus drei Messungen dar. 3.3.4 Untersuchung zur autokatalytischen Prozessierung von LeSBT3 Um festzustellen, ob bei der 75 kD-Form der Protease eine zusätzliche pH-abhängige
Prozessierung stattfindet, wurde diese in einer Konzentration von 0,12 µg/µl in sechs
verschiedenen Puffern (Na-acetat/HAc, pH 4.0, 5.0, 6.0; Tris/HCl, pH 7.0, 8.0 und 9.0)
über einen Zeitraum von 6d bei 4 °C inkubiert. Alle Puffer lagen in einer Endkonzentration
von 25 mM vor. Es ist bekannt, dass viele der Subtilasen eine Ca2+ Abhängigkeit
aufweisen (Schaller et al., 1999; Sajid et al., 2000; Hamilton 2003). Um einen möglichen
Einfluss von Ca2+ Ionen zu untersuchen wurde zusätzlich eine Testreihe mit 5 mM CaCl2
vorbereitet. Die zu den definierten Zeitpunkten von t = 0h, 2h, 6h, 1d, 2d, 3d, 4d und 6d
entnommenen Aliquots wurden anschließend bei –80 °C aufbewahrt. Zur Analyse wurden
die Proteinproben (jeweils 1 µg) auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und
anschließend mit Coomassie gefärbt. Es zeigte sich, dass bei der Inkubation der LeSBT3-
Protease bei pH 4.0 und 5.0 sofort nach der Zugabe des Puffers drei kleinere Banden
46
KAPITEL 3 RESULTATE
generiert wurden (Abb. 23 A). Dieser Zustand des Proteins änderte sich über den ganzen
Zeitraum der Aliquotentnahme von 6d nicht und war von der Zugabe der Ca2+ Ionen
unabhängig (Abb. 23 B). Bei pH-Werten von 6.0, 7.0, 8.0 und 9.0 blieb das Protein
dagegen über den ganzen Zeitraum von 6d stabil (Abb. 23 A und B).
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KAPITEL 3 RESULTATE
pH 4.0
pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0
pH 8.0
pH 9.0
0h 2h 6h 1d 2d 3d 4d 6d M
75 kD
50 kD
75 kD 50 kD
75 kD
50 kD 75 kD
50 kD
75 kD
50 kD 75 kD
50 kD
A
0h 2h 6h 1d 2d 3d 4d 6d M
75 kD
50 kD
75 kD 50 kD
75 kD
50 kD 75 kD
50 kD
75 kD
50 kD 75 kD
50 kD
pH 4.0
pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0
pH 8.0
pH 9.0
B Abb. 23: pH-abhängige Prozessierung der 75 kD-Form von LeSBT3.
Die aufgereinigte 75 kD-Form von LeSBT3-Protease wurde in einer Konzentration von 0,12 µg/µl in sechs verschiedene Puffer (Na-acetat/HAc, pH 4.0, 5.0, 6.0; Tris/HCl, pH 7.0, 8.0 und 9.0) bei 4 °C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten (t = 0h, 2h, 6h, 1d, 2d, 3d, 4d und 6d) wurden Aliquots entnommen und bei –80 °C aufbewahrt. Je 1 µg des Proteins wurden auf einem Coomassie Brillant Blue gefärbten SDS-PAGE-Gel (8,5 %) analysiert. Abb. 23 A: die pH-abhängige Prozessierung unter Zusatz von 5 mM EDTA. Abb. 23 B: die pH-abhängige Prozessierung unter Zusatz von 5 mM CaCl2. M- 5 µl Molekulargewichtsmarker.
48
KAPITEL 4 DISKUSSION
4. Diskussion Obwohl das Prinzip der proteolytischen Spaltung einer Amidbindung bei allen Proteasen
gleich bleibt, sind die genaueren Mechanismen dieser Spaltung sehr unterschiedlich. Viele
der für die Pflanzen essentiellen physiologischen Abläufe können durch die stark
gefächerte Bandbreite der proteolytischen Prozesse der Endo- und Exoproteasen gesteuert
werden.
Die primäre Klassifizierung der Proteasen nach der Art der beteiligten Aminosäuren im
aktiven Zentrum der Protease (Serin-, Cystein-, Threonin-, Metallo- und
Aspartatproteasen) und der nachfolgende Vergleich von Aminosäureresten der
katalytischen Triade führte letztendlich zu einer Unterteilung der Serinproteasen in
verschiedene Familien (Rawlings und Barrett, 1994; Barrett et al., 1998), wie z.B. in
Chymotripsine und Subtilasen. Nachdem die Subtilasen in nahezu allen eukaryotischen
Organismen gefunden waren, wurden sie anhand des Sequenzvergleiches (Siezen und
Leunissen, 1997) in sechs Familien unterteilt (Abb. 1).
Die pflanzlichen Subtilasen gehören mit vielen Vertretern der Pro- und Eukaryoten zu der
Familie der Pyrolysine. Aufgrund dessen, dass die pflanzlichen Subtilasen der Pyrolysin-
Familie eine breite Substratspezifität aufweisen, wurde zuerst angenommen, dass sie eher
eine degradative Funktion in der pflanzlichen Entwicklung übernehmen (Kaneda et al.,
1995; Uchikoba et al., 1995; Rudenskaya et al., 1995 und 1998). Die jüngsten Befunde
zeigten allerdings, dass es innerhalb der Pyrolysin-Familie pflanzliche Subtilasen gibt, die
gewebespezifisch und zeitlich beschränkt exprimiert werden, was als eine gezielte Antwort
der Pflanze auf die schnell wechselnden Umweltbedingungen angesehen werden kann
(Jorda et al., 1999 und 2000; Meichtry et al., 1999; Janzik et al., 2000; Hamilton et al.,
2003). Einige der pflanzlichen Subtilasen weisen zu dem eine der tierischen
Proproteinkonvertasen der Kexin- und Pyrylosin-Familie ähnliche Substratspezifität auf
und können eventuell spezifische Prozessierungsaufgaben wie die Reifung der
Proteinvorstufen von Peptidhormonen in der pflanzlichen Entwicklung übernehmen (Park
et al., 1996; Jiang und Rogers, 1999; Janzik et al., 2000).
Wie in der Einleitung erwähnt wurde, lag der Schwerpunkt dieser Arbeit in der
Ausarbeitung und Etablierung eines Protokolls für die Aufreinigung der in der
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KAPITEL 4 DISKUSSION
Suspensionskultur des Lycopersicon peruvianum exprimierten LeSBT3-Protease und der
anschließenden Durchführung von ersten biochemischen Tests. Die durchgeführten Tests
sollten die ersten Weichen zur Aufklärung der biochemischen Eigenschaften der
untersuchten Protease stellen.
4.1 Vorversuche zur Aufreinigung der LeSBT3-Protease Zu Beg
