Quantitative Dünnschichtchromatographie ||

Quantitative Dünnschicht-chromatographie

Bernd SpangenbergChristel Weins

Eine Anleitung für Praktiker

Quantitative Dünnschichtchromatographie

Bernd Spangenberg � Christel Weins

Quantitative Dünnschicht-chromatographie

Eine Anleitung für Praktiker

Bernd SpangenbergHochschule OffenburgFB Maschinenbau und VerfahrenstechnikOffenburg, Deutschland

Christel WeinsBischmisheim, Deutschland

ISBN 978-3-642-55101-7 ISBN 978-3-642-55102-4 (eBook)DOI 10.1007/978-3-642-55102-4

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Planung und Lektorat: Rainer Münz, Stella SchmollRedaktion: Dr. Angelika Fallert-Müller

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Vorwort

Der Dünnschichtchromatographie (DC) haftet der Ruf des Vergangenen an. Mansieht sie oft als eine alte Methode, die, ähnlich der Papierchromatographie, vonneueren Techniken ersetzt werden wird. Eine solche Ablösung ist aber nicht inSicht, ganz im Gegenteil. Die Dünnschichtchromatographie ist eine häufig benutzteTrenntechnik, deren Anwendung im quantitativen Bereich auch heute noch weiterausbaufähig ist.

Christel Weins und Collin F. Poole publizierten 2011 mit mir zusammen dasBuch Quantitative Thin-Layer Chromatography. A Practical Survey. Die Resonanzin Deutschland war verhalten und gipfelte immer wieder in der Frage, wann es denneine deutsche Ausgabe gebe. Ich habe mich daher entschlossen, das ursprünglicheSkript zur englischen Ausgabe zu überarbeiten. Herausgekommen ist ein Buch zurquantitativen Dünnschichtchromatographie als Anleitung für den Anwender. DasBuch unterscheidet sich nur in wenigen Kapiteln von der englischsprachigen Aus-gabe. Kapitel 9 wurde um den Teil „Videodensitometrie“ erweitert, denn hier hatsich in den letzten Jahren, mit dem Aufkommen der 16-bit-Scanner, eine Entwick-lung vollzogen, die für die DC noch sehr bedeutsam werden wird.

Das nun vorliegende Buch wurde geschrieben für Wissenschaftler, die ihreKenntnisse zur modernen DC auffrischen möchten. Es enthält die vollständigeTheorie der quantitativen DC, von der Theorie der Chromatographie bis hin zurmesstechnischen Beschreibung der Auswertung. Auch wird die statistisch korrekteAuswertung der Messwerte bis zur fehlertechnischen Berechnung des Endergebnis-ses behandelt. Das Buch ist ebenfalls für Neueinsteiger geeignet, die keinen Zugriffauf die zum größten Teil nicht mehr im Handel verfügbare DC-Literatur haben.Für diese Lesergruppe wurde das Buch entsprechend der einzelnen Arbeitsschrittein der DC aufgebaut. Die ersten fünf Kapitel behandeln neben der Geschichte dieTheorie der chromatographischen Trennung und auch Wissenswertes über statio-näre und mobile Phasen sowie die Probeaufarbeitung mit Auftragung. Kapitel 6beschäftigt sich mit den verschiedenen Entwicklungstechniken, Kap. 7 beschreibtdie chemischen Reaktionen auf der Platte, während Kap. 8 die biologischen Umset-zungen thematisiert. Dieses Kapitel wurde dankenswerterweise von Frau Dr. Weinsübernommen, die sich als Biologin besonders für die wirkungsbezogene Analyse

V

VI Vorwort

einsetzt. In Kap. 9 werden die unterschiedlichen Auswertetechniken vorgestellt,wobei ein Schwerpunkt auf die Videodensitometrie gelegt wurde. Kapitel 10 bis 12sind eher theoretischer Natur und beschreiben die Theorie der Auswertung sowiederen Optimierung. Im vorletzten Kapitel wird die statistische Auswertung derErgebnisse behandelt, während im letzten Kapitel, dem Kap. 14, die Validierungvon Methoden besprochen wird.

Der Zusatz „Ein Überblick für Anwender“ soll den Leser ermutigen, das Gelese-ne im Labor direkt auszuprobieren. Daher wurden bei allen Chromatogrammen dieTrennbedingungen mitgeliefert. Die eher theorielastigen Kapitel habe ich nicht ge-kürzt, da die Herleitungen der relevanten Formeln in der Literatur schwer zu findenund noch schwerer zu verstehen sind. Zudem weiß ich aus Erfahrung, dass nur dieHerleitung eines Ausdrucks dem Leser das Verständnis der Gleichung ermöglicht.Im statistischen Teil habe ich die Formeln so geordnet, dass der Anwender sich dieAlgorithmen ohne große Probleme in Excel selbst programmieren kann. Dies istunbedingt nötig, da kommerzielle Programme z. B. die Fehlerrechnung nicht odernur eingeschränkt behandeln.

Im Jahre 1987 schrieb einer der Pioniere der DC, Prof. Dr. FRIEDRICH GEISS, inseinem Buch Fundamentals of Thin Layer Chromatography: „TLC is here to stay“.Ich glaube in der Tat, dass die DC bleiben wird und ihre Position innerhalb derverschiedenen Trenntechniken eher noch ausbaut. Allein die in Kap. 8 vorgestelltenneuen analytischen Möglichkeiten heben die Methode aus allen anderen Trenntech-niken heraus.

Für das Zustandekommen dieses Buches möchte mich bei meinem Laborperso-nal für die Unterstützung bedanken. Mein Dank gilt Frau R. Brämer, Frau A. Seigel,Frau B. Milz und Frau M. Broszat. Danken möchte ich auch Frau Dr. Christel Weinsfür die Übernahme des 8. Kapitels.

Offenburg, im Frühjahr 2014 Bernd Spangenberg

Inhaltsverzeichnis

1 Geschichte der Planarchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1 Die Geschichte der Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . 21.2 Geschichte der Dünnschichtchromatographie (DC) . . . . . . . . 71.3 Geschichte der quantitativen Planarchromatographie . . . . . . . 9Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Theoretische Grundlagen der Dünnschichtchromatographie (DC) 152.1 Planar- und Säulenchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.2 Die kapillare Fließbewegung in der DC . . . . . . . . . . . . . . . 182.3 Verteilungsgleichgewichte in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3.1 Adsorptionschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . 212.3.2 Verteilungschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.4 Der Retentionsfaktor (Rf-Wert) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.4.1 Der empirische Rf-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.4.2 Der thermodynamische R0

f-Wert . . . . . . . . . . . . . . 262.5 Die Phasenzusammensetzung in der DC-Schicht . . . . . . . . . 282.6 Übertragung von DC-Trennungen auf HPLC-Säulen . . . . . . . 302.7 Der Rm-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.8 Die Temperaturabhängigkeit von DC-Trennungen . . . . . . . . 322.9 Das allgemeine Chromatographiegesetz . . . . . . . . . . . . . . . 332.10 Trennung und Signalauflösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.11 Die Signalverbreiterung in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.11.1 Der A-Term . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.11.2 Der A-Term . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442.11.3 Der C -Term . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.11.4 Lokale Trennstufenhöhe H . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.11.5 Die van-Deemter-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.12 Optimale Trennbedingungen in der DC . . . . . . . . . . . . . . . 482.13 Die Trennzahl nach R. E. Kaiser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502.14 Reale Plattenhöhen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

VII

VIII Inhaltsverzeichnis

3 Die stationäre Phase in der Dünnschichtchromatographie . . . . . . 573.1 Aktivierung und Deaktivierung der stationären Phase . . . . . . 583.2 Das Adsorptionsmodell nach L. R. Snyder . . . . . . . . . . . . . 593.3 Die Schichtmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.3.1 Die Plattenschichtdicke (df) . . . . . . . . . . . . . . . . . 643.3.2 Die mittlere Korngröße (dp) . . . . . . . . . . . . . . . . . 643.3.3 Die Korngrößenverteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.3.4 Die spezifische Oberfläche (Os D VS=dp) . . . . . . . . 653.3.5 Porenvolumen (Vp) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.3.6 Der mittlere Porendurchmesser (Pd) . . . . . . . . . . . . 65

3.4 Die wichtigsten stationären Phasen in der DC . . . . . . . . . . . 663.4.1 Aluminiumoxid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.4.2 Magnesiumsilicat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.4.3 Kieselgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.4.4 Gebundene Kieselgelphasen . . . . . . . . . . . . . . . . . 703.4.5 Kieselgur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.4.6 Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.4.7 Polyamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 763.4.8 Ionenaustauscherharze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.4.9 Chirale DC-Phasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.4.10 Fluoreszenzindikatoren in der Schicht . . . . . . . . . . . 793.4.11 Selbst hergestellte Platten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3.5 Lichtabsorption an Plattenoberflächen . . . . . . . . . . . . . . . . 80Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4 Die mobile Phase in Absorptions- und Verteilungschromatographie 874.1 Die Eigenschaften von Fließmitteln . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.2 Die Theorie der Fließmittel in der Adsorptionschromatographie

(nach Snyder) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 904.2.1 Die Fließmittelstärke ("0) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

4.3 Die Theorie der Fließmittel in der Verteilungschromatographie 954.3.1 Theorie der Fließmittelstärke (nach Snyder) . . . . . . . 964.3.2 Andere Methoden zur Fließmittelcharakterisierung . . 99

4.4 Optimierung der Fließmittelzusammensetzung . . . . . . . . . . 994.5 Das PRISMA-Modell (nach Sz. Nyiredy) . . . . . . . . . . . . . . 1054.6 Fließmittel mit festen Zusätzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

5 Probevorbereitung und Probeauftragung . . . . . . . . . . . . . . . . . 1135.1 Die Probevorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

5.1.1 Der QuEChERS-Ansatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1135.1.2 Stirbar Sorptive Extractions . . . . . . . . . . . . . . . . . 1145.1.3 Solid-phase-Extraktion (SPE) . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.2 Die Qualität der Auftragung (QD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1175.3 Die Wahl der Auftragestelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

Inhaltsverzeichnis IX

5.4 Praktische Methoden der Auftragung . . . . . . . . . . . . . . . . 1225.4.1 Auftragung mit Plattenkontakt . . . . . . . . . . . . . . . 1225.4.2 Auftragung ohne Plattenkontakt . . . . . . . . . . . . . . 1235.4.3 Auftragung über Kontakt-Spotting . . . . . . . . . . . . . 1235.4.4 Plattenüberladung und unvollständiges Trocknen . . . . 125

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

6 Entwicklungstechniken in der Dünnschichtchromatographie . . . . 1296.1 Der Einfluss der Dampfphase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1296.2 Kammerarten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

6.2.1 Die N-Kammer (Trogkammer) . . . . . . . . . . . . . . . 1336.2.2 Die S-Kammer (Schmalkammer) . . . . . . . . . . . . . . 1346.2.3 Die Vario-KS-Kammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1356.2.4 Die H-Kammer (Horizontalkammer) . . . . . . . . . . . 136

6.3 Steuerung über die Dampfphase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1376.3.1 Entwicklung ohne Plattenvorbehandlung . . . . . . . . . 1376.3.2 Plattenvorbeladung über die Dampfphase . . . . . . . . 141

6.4 Zirkulare Trennungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1446.5 Gradienten in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

6.5.1 Theorie der Gradientenchromatographie . . . . . . . . . 1476.5.2 Dampfgesteuerte Gradientenentwicklung . . . . . . . . . 1546.5.3 Mehrfachentwicklungen in der DC . . . . . . . . . . . . 1556.5.4 Automatische Mehrfachentwicklung (AMD) . . . . . . 156

6.6 Normalphasentrennung mit wasserhaltigen Fließmitteln . . . . . 1596.7 Plattenentwicklungen mit erzwungenem Fluss . . . . . . . . . . . 159

6.7.1 Rotationsplanarchromatographie (RPC) . . . . . . . . . 1606.7.2 Overpressure Planar Layer Chromatography (OPLC) . 160

6.8 Zweidimensionale DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1626.8.1 Orthogonale Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 1626.8.2 Grafted TLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1636.8.3 Stabilitätstest und TRT-Technik . . . . . . . . . . . . . . 165

6.9 Trocknen der Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

7 Spezifische Färbereagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1717.1 Chemische Umsetzungen vor der Trennung

(prächromatographische Derivatisierungen) . . . . . . . . . . . . 1737.1.1 Anreicherung durch prächromatographische Derivati-

sierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1747.1.2 Prächromatographische In-situ-Reaktionen . . . . . . . 1777.1.3 Prächromatographische Farbstoff-

und Fluoreszenzderivatisierung . . . . . . . . . . . . . . . 1817.1.4 Reagenz im Fließmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

7.2 Chemische Umsetzungen nach der Trennung(postchromatographische Derivatisierungen) . . . . . . . . . . . . 186

X Inhaltsverzeichnis

7.2.1 Reagenzien zur Verstärkung der Fluoreszenz . . . . . . 1897.2.2 pH- und Redox-Indikatoren . . . . . . . . . . . . . . . . . 1907.2.3 Universell anwendbare Reagenzien

(Charring-Reagenzien) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1917.2.4 Aldehyd-Universalreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . 1927.2.5 CH- und NH-aktive Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . 1957.2.6 CH- und NH-aktive Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . 2017.2.7 Basenreagenzien und Säurereagenzien . . . . . . . . . . 2047.2.8 Chloramin-T-Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2057.2.9 Diazotierungsreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2067.2.10 Wurster-Reagenz und Iod-Stärke Reagenz . . . . . . . . 2077.2.11 Reaktionen mit Metallkationen . . . . . . . . . . . . . . . 2097.2.12 Reagenzien für Metallkationen . . . . . . . . . . . . . . . 213

7.3 Reaktionen über die Gasphase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2157.3.1 Ammoniumbicarbonat-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . 2157.3.2 Zinn(IV)-chlorid-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2167.3.3 HCl-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2167.3.4 Trichloressigsäurereagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2177.3.5 Salpetersäurereagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2177.3.6 tert-Butylhypochlorit-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . 218

7.4 Thermische Umsetzungen auf der Platte . . . . . . . . . . . . . . . 2187.5 Aktivitätsanalyse mit chemischen Reagenzien . . . . . . . . . . . 219

7.5.1 Folin-Ciocalteu-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2197.5.2 Prüfung auf Radikalfänger-Aktivität

mittels DPPH-Reagenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2207.5.3 Nucleophile Reaktionsfähigkeit . . . . . . . . . . . . . . 220

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221

8 Wirkungsbezogene Umsetzungen auf der DC-Platte (direktes Bio-monitoring) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2278.1 Prinzip der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228

8.1.1 Schadstoffanalytik in Umwelt und Lebensmittelnund das Prinzip der wirkungsbezogenen Analytik . . . 228

8.1.2 Zielvorgaben und Grundlagen der wirkungsbezogenenAnalytik mit der Dünnschichtchromatographie . . . . . 229

8.1.3 Dünnschichtchromatographie, ein geeignetes Verfahrenfür die wirkungsbezogene Analytik . . . . . . . . . . . . 229

8.1.4 Prinzip der wirkungsbezogenen Analytikin der Dünnschichtchromatographie . . . . . . . . . . . . 230

8.2 Allgemeine Voraussetzungenfür die Analyse bioaktiver Substanzen . . . . . . . . . . . . . . . . 233

8.3 Enzymtests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2348.3.1 Einflüsse der verschiedenen Sorbenzien

auf die Enzymaktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2348.3.2 Detektion von Inhibitoren der Cholinesterase . . . . . . 234

Inhaltsverzeichnis XI

8.3.3 Verfahren zur Durchführung des Cholinesterasehemm-tests mit der Dünnschichtchromatographie . . . . . . . . 236

8.3.4 Verfahren zur Bestimmung von Schwermetallenmittels des Enzyms Urease . . . . . . . . . . . . . . . . . 243

8.3.5 Einsatz von Redox-Enzymen zur selektiven Detektionvon Substraten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244

8.3.6 Definierte Bedingungen für Enzymtestsauf der Dünnschichtplatte zur Quantifizierungvon bioaktiven Stoffen und zur Validierung . . . . . . . 245

8.3.7 Anwendungsbeispiele für den Einsatz enzymatischerHemmteste mit der Dünnschichtchromatographie . . . 248

8.4 Detektion von Herbiziden durch die Hemmung der Fotosynthesein Chloroplasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2538.4.1 Isolierung der Chloroplasten und Lagerung

der Chloroplastensuspension . . . . . . . . . . . . . . . . 2548.4.2 Durchführung des Fotosynthesehemmtests

auf der Dünnschichtplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2548.5 Detektion bioaktiver Stoffe

mit Photobacterium fischeri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2558.5.1 Herstellung einer Kultur Leuchtbakterien . . . . . . . . 2578.5.2 Durchführung des Leuchtbakterienhemmtests

auf der Dünnschichtplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2588.5.3 Anwendungsbeispiele für den Einsatz des Leuchtbak-

terienhemmtests mit der Dünnschichtchromatographie 2608.6 Detektion fungizider Substanzen mit Hefe- bzw. Penicillium-

stämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2628.6.1 Methodenbeschreibung zur Detektion von Fungiziden . 2638.6.2 Reinheitskontrolle und Stabilitätstests

von Standardsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2648.6.3 Detektion von fungizid wirkenden Stoffen

im Oberflächengewässer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2658.6.4 Detektion von Fungiziden in Lebensmittelproben . . . 266

8.7 Detektion von Substanzenmit antibiotischer Wirkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2688.7.1 Methodenbeschreibung zur Detektion

von antibiotisch wirkenden Substanzen . . . . . . . . . . 2698.7.2 Detektion von antibiotisch wirkenden Stoffen

im Oberflächengewässer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2718.8 Detektion östrogener Wirkung

mit der Dünnschichtchromatographie (p-YES-Test) . . . . . . . 2738.8.1 Prinzip des p-YES-Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2758.8.2 Darstellung der Methode

und ihre Anwendungsbeispiele . . . . . . . . . . . . . . . 2768.8.3 Vorteile des p-YES-Testes

und seine Anwendungsmöglichkeiten . . . . . . . . . . . 278

XII Inhaltsverzeichnis

8.9 Schlussfolgerungen und Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280

9 Detektoren in der Dünnschichtchromatographie . . . . . . . . . . . . 2859.1 Transmissionsmessungen in der Dünnschichtchromatographie . 285

9.1.1 Das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz . . . . . . . . . . . . 2869.2 Remissionsmessungen in der DC und HPTLC . . . . . . . . . . . 287

9.2.1 Die Kubelka-Munk-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . 2889.3 Diodenarray-Scanner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291

9.3.1 Remissionsmessungen mittels Dioden-Array-Technik . 2919.3.2 Spezielle Lichtleiterinterfaces . . . . . . . . . . . . . . . . 2919.3.3 Ortsauflösung auf der Platte . . . . . . . . . . . . . . . . . 2959.3.4 Spektrale Lichtverteilung auf der Platte . . . . . . . . . . 2969.3.5 Transformationsalgorithmen in der Diodenarray-DC . . 2979.3.6 2-D-Auswertungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300

9.4 Videodensitometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3029.4.1 CCD-Kameras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3039.4.2 Flachbettscanner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3059.4.3 Tipps zum Kauf eines CCD-Gerätes . . . . . . . . . . . . 3099.4.4 Lumineszenzmessungen mit CCD-Kameras . . . . . . . 311

9.5 Infrarot- und Raman-Detektion in der DC . . . . . . . . . . . . . . 3159.5.1 DC-Messungen

durch diffuse Reflektions-Infrarotanalyse . . . . . . . . . 3159.5.2 DC-Analyse

durch Nahinfrarot-FT-Raman-Spektrometrie . . . . . . 3159.5.3 Messung von DC-Spektren mittels Surface-Enhanced

Raman Scattering Spectrometry (SERS) . . . . . . . . . 3169.6 Massenspektrometrische Detektion in der DC . . . . . . . . . . . 317

9.6.1 Direkte Plattenextraktion (SSSP) . . . . . . . . . . . . . . 3189.6.2 MALDI-Technik (MALDI-MS) . . . . . . . . . . . . . . 3189.6.3 Atmosphärendruck-Massenspektrometrie . . . . . . . . 320

9.7 DC-Radiochromatographie (DC-RC) . . . . . . . . . . . . . . . . 3229.7.1 Direkte Radioaktivitätsmessungen auf der Platte . . . . 3229.7.2 Phosphorbildplatten-Speicherung . . . . . . . . . . . . . 323

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325

10 Diffuse Reflexion an DC- und HPTLC-Platten . . . . . . . . . . . . . 33110.1 Das Lambert’sche Kosinusgesetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33110.2 Theorie der diffusen Reflexion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

10.2.1 Der Spezialfall der Kehrwertgleichung . . . . . . . . . . 33910.2.2 Der Spezialfall der Fluoreszenzformel . . . . . . . . . . 34010.2.3 Der Spezialfall der Fluoreszenzformel . . . . . . . . . . 341

10.3 Masseabhängige Remission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34210.4 Vereinfachte Formeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347

Inhaltsverzeichnis XIII

11 Fluoreszenz in der DC- und HPTLC-Schicht . . . . . . . . . . . . . . 34911.1 Theorie der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz . . . . . . . . . 34911.2 Fluoreszenzverstärkung auf der DC-Platte . . . . . . . . . . . . . 35111.3 Quantitative Fluoreszenzmessung auf der DC-Platte . . . . . . . 354

11.3.1 Fluoreszenz in streuenden Medienbei niedriger Analytkonzentration . . . . . . . . . . . . . 355

11.3.2 Fluoreszenz in streuenden Medienbei hoher Analytkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . 356

11.3.3 Kontourplot zur Fluoreszenzauswertung . . . . . . . . . 35711.4 Platten mit Fluoreszenzindikator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361

12 Chemometrie in der HPTLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36312.1 Bestimmung von Rf -Werten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36312.2 Substanzidentifizierungen

über UV-vis- und Fluoreszenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . 36512.3 Korrelationsspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367

12.3.1 Korrelationsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36712.3.2 Kombinierte Substanzerkennung mittels Rf-Werten

und UV-vis-Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36912.3.3 Überprüfung der Peakreinheit . . . . . . . . . . . . . . . . 370

12.4 Wahl der Auswertungswellenlänge . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37112.5 Statistischer photometrischer Fehler (Detektorvarianz) . . . . . . 373

12.5.1 Der Fehler im Kehrwertmodell . . . . . . . . . . . . . . . 37512.5.2 Der relative Fehler im Kubelka-Munk-Modell . . . . . . 37612.5.3 Der relative Fehler

im logarithmischen Absorptionsmodell . . . . . . . . . . 37712.5.4 Der relative Fehler im Fluoreszenzmodell . . . . . . . . 37712.5.5 Minimierung des statistischen Photometerfehlers . . . . 378

12.6 Bündeln von Dioden und Glätten der Daten . . . . . . . . . . . . 38012.7 Peakintegration: Fläche oder Höhe? . . . . . . . . . . . . . . . . . 38212.8 Mehrwellenlängen-Spektrometrie

zur Mehrkomponentenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38412.9 Neue Visualisierungsmethoden in der DC . . . . . . . . . . . . . . 388Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389

13 Quantitative Auswertung in der HPTLC . . . . . . . . . . . . . . . . . 39113.1 Der Mittelwert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39113.2 Varianz und Präzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392

13.2.1 Die Definition der Varianz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39313.2.2 Relative Varianz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39413.2.3 Bestimmung der relativen Varianz . . . . . . . . . . . . . 396

13.3 Präzision, Richtigkeit und Genauigkeit . . . . . . . . . . . . . . . 39713.4 Die Standardnormalverteilung (Gauß-Funktion) . . . . . . . . . . 398

13.4.1 Die Fläche der Gauß-Verteilung . . . . . . . . . . . . . . 399

XIV Inhaltsverzeichnis

13.4.2 Quantile der Gauß-Verteilung . . . . . . . . . . . . . . . . 39913.4.3 Test auf Normalverteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401

13.5 Die Student-Verteilung (t-Verteilung) . . . . . . . . . . . . . . . . 40213.6 Fehlerfortpflanzung in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40313.7 Kalibriermodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405

13.7.1 Lineare Kalibrierung (Geradenausgleich) . . . . . . . . 40613.7.2 Bestimmung der Datenschwerpunkte . . . . . . . . . . . 40713.7.3 Bestimmung der Geradensteigung . . . . . . . . . . . . . 40913.7.4 Varianzbestimmung der Steigung und des Schwerpunk-

tes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41013.8 Der F-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41113.9 Der Vertrauensbereich im Modell der „linearen Regression“ . . 41213.10 Die Analysenfunktion der linearen Regression . . . . . . . . . . . 41313.11 Quantitative Analyse über die Methode des externen Standards 41613.12 Kalibrierfunktion eines Polynoms zweiten Grades . . . . . . . . 418

13.12.1 Vertrauensbereich des Polynoms zweiten Grades . . . . 41813.12.2 Analysenfunktion des Polynoms zweiten Grades . . . . 421

13.13 Überprüfung auf systematische Fehler . . . . . . . . . . . . . . . . 42313.13.1 Konstante systematische Abweichungen . . . . . . . . . 42313.13.2 Proportionale systematische Abweichungen . . . . . . . 424

13.14 Methode des internen Standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42413.15 Standardadditionsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42613.16 Mittelwert-t-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430

14 Analysenplanung und Validierung in der HPTLC . . . . . . . . . . . 43114.1 Begriffsdefinitionen bei der Validierung . . . . . . . . . . . . . . . 43114.2 Methodenvalidierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433

14.2.1 Überprüfung der Selektivität . . . . . . . . . . . . . . . . 43314.2.2 Anzahl der Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43514.2.3 DC-Auftragung und Messen einer Bahn . . . . . . . . . 43514.2.4 Die Kalibrierung in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . . 437

14.3 Die Präzision in der DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44114.4 Wie werden richtige Ergebnisse erhalten? . . . . . . . . . . . . . . 441

14.4.1 Die Wiederfindungsrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44214.4.2 Bestimmung der Richtigkeit über Aufstockungen . . . 44214.4.3 Die Wiederfindungsfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . 443

14.5 Vertrauensbereich einer Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44414.6 Bestimmungs- und Nachweisgrenze . . . . . . . . . . . . . . . . . 445

14.6.1 Die Nachweisgrenze (LOD) . . . . . . . . . . . . . . . . . 44614.6.2 Die Bestimmungsgrenze (LOQ) . . . . . . . . . . . . . . 44614.6.3 Die Bestimmungsgrenze (LOQ) und Nachweisgrenze

(LOD), berechnet aus dem Vertrauensbereich derKalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447

Inhaltsverzeichnis XV

14.7 Robustheit der DC-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44914.8 Kontrollkarten in der Routineanalytik . . . . . . . . . . . . . . . . 450Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451

Sachverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453

1Geschichte der Planarchromatographie

Spektroskopische und spektrometrische Methoden wie die Infrarot-Spektroskopie(IR) oder die Ultraviolett-Spektrometrie (UV) sind in der Regel nicht ausreichend,um komplizierte Stoffgemische erschöpfend zu analysieren. Daher wird in der Ana-lytik vor der eigentlichen spektroskopischen (oder bei quantitativen Bestimmun-gen einer spektrometrischen) Messung meist eine Auftrennung in Einzelsubstanzenoder Substanzklassen durchgeführt.

Chromatographie ist die Bezeichnung für alle Trennmethoden, mit deren HilfeSubstanzgemische durch Verteilung zwischen zwei Phasen in ihre Komponentenzerlegt werden können. Die Phasen dürfen nicht miteinander mischbar sein.

In der Dünnschichtchromatographie (DC, engl. TLC: thin-layer chromatogra-phy) ist eine Phase unbeweglich auf einer Platte fixiert (stationäre Phase), und dieandere Phase ist beweglich (mobile Phase). Die bewegliche Phase fließt währendder Entwicklung des Chromatogramms durch die stationäre Phase. Während deschromatographischen Prozesses kommt es zur Einstellung einer großen Anzahl vonVerteilungsgleichgewichten, die zu einer Substanztrennung führen. Da bei der DCdie stationäre Phase auf einer planaren Platte fixiert ist, wird für diese Trenntechnikauch der Oberbegriff „Planarchromatographie“ verwendet.

Im Jahre 1947 äußerte Paul Karrer auf dem IUPAC-Kongress in seinem Plenar-vortrag, in dem er auf die in den vergangenen zwei Jahrzehnten neu- und weiterent-wickelte Untersuchungsmethoden einging: „. . . no other discovery has exerted asgreat an influence and widened the field of investigation of the organic chemist asmuch as Tswett’s chromatographic adsorption analysis“ [1].

Und wirklich, ohne Chromatographie ist die heutige Analytik undenkbar; diesgilt für die Säulen- wie auch für die Planarchromatographie. Moderne Entwicklun-gen wie die RP-Phasentechnik (Reversed-phase-Technik) oder die HPTLC (engl.high-performance thin-layer chromatography) machen aus der DC auch auf längereSicht ein häufig angewendetes chromatographisches Trennverfahren [2].

1B. Spangenberg und C. Weins, Quantitative Dünnschichtchromatographie,DOI 10.1007/978-3-642-55102-4_1, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

2 1 Geschichte der Planarchromatographie

1.1 Die Geschichte der Chromatographie

Im Altertum beschrieb Caius Plinius (der Ältere) in seinen „Libri naturalis his-toriae“ die Verwendung von mit Galläpfelextrakt imprägniertem Papyrus, um denZusatz von Eisensulfat in Grünspan zu identifizieren [1]. Plinius benutzte Papyrusals Träger der Reagenzien, wobei durch den Kapillarfluss die verschiedenen Rea-genzien im Papyrus gemischt und zur Reaktion gebracht wurden. Mit Hilfe vonPapyrus wurde so Analytik betrieben, aber es wurden keine Substanzen getrennt.Die eigentlichen Ursprünge der modernen Chromatographie sind jüngeren Datums.Im Jahre 1850 wurde von Friedlieb Ferdinand Runge (1795–1867) erstmals Papier

Abb. 1.1 Abgebildet ist ein von F. F. Runge hergestelltes Kapillarbild

1.1 Die Geschichte der Chromatographie 3

zur Auftrennung von Farbstoffgemischen verwendet. Runge benutzte zum erstenMal die „Haarröhrchenkraft des Papiers“ zum Trennen einzelner Substanzen auseinem Gemisch. Er schreibt: „Vermöge seiner Haarröhrchenkraft zerlegt es (dasPapier) nämlich einen darauf gebrachten Tropfen auf der Stelle in seine Bestandt-heile und dieser gestaltet sich, je nach Eigenthümlichkeit der Flüssigkeit, zu einemBilde mit dunkel gefärbtem Mittelpunkt und hell oder gar nicht gefärbten Kreisenoder Höfen“ [3].

Bekannt geworden sind Runges bunte Kapillarbilder (Abb. 1.1), die er als durchden „Bildungstrieb der Stoffe“, ein Vorbild der in „Pflanzen und Thieren thätigenLebenskraft“, entstanden beschrieb.

Ähnlich der Papieranalytik von Plinius ließ Runge verschiedene Reagenzien in-einander fließen und zu Farbstoffen reagieren [5]. Runge war der Erste, der dieEigenschaften des Papiers gezielt für eine Stofftrennung einsetzte. Hauptsächlichhatte er Freude an kuriosen Bildern, aber er benutzte die Methode auch zur Analy-se. Bei Farbstofffällungen durch Metallsalze z. B. konnte er die chromatographischabgetrennte Mutterlauge durch Farbreaktion auf einen Überschuss des Fällmittelsoder des Farbstoffes prüfen [1, 3].

Ähnliche Arbeiten wurden im gleichen Jahrzehnt von Christian F. Schönbein(1799–1868) durchgeführt, dem Entdecker des Ozons und der Schießbaumwolle.Im Jahre 1861 publizierte dieser Versuche mit ungeleimtem Papier, das er, in Strei-fen geschnitten, in Farbstofflösungen tauchte [5].

Es stellte dabei fest, dass Wasser aus den Farbstofflösungen dem gelösten Farb-stoff immer vorauseilt und die verschiedenen Farbstoffe im Papier verschieden hochwanderten. Sein Student Christoph Friedrich Goppelsröder (1836–1919) führte die-se Versuche weiter (Abb. 1.2) und dehnte sie über Papier hinaus auf andere Materia-lien wie Kieselgur, Sand, Wolle oder Holzfasern aus. Als Zusammenfassung vielerPublikationen kommt er 1906 zu dem Schluss, das Papier von Schleicher und Schüllaus Düren die besten Ergebnisse zeigte [6]. Aber, wie er selbst 1910 schreibt: „Na-türlich trennen sich aber die Farbstoffe bei einem solchen ersten Kapillarversuchnicht vollkommen voneinander“, denn „in den unteren Schichten sind immer nochgeringe Mengen derjenigen Farbstoffe enthalten, welche größtenteils hinaufgewan-dert sind“ [7, 8].

Das Manko aller bis dahin publizierten sogenannten Frontalchromatographie-Trennungen besteht darin, dass die Analysenlösung und die mobile Phase des Sys-tems identisch sind. Damit wird aber, wie Goppelsröder richtig beobachtet, bei derTrennung immer neue Probe nachgefördert, die die schon abgetrennten Substanz-zonen wieder verunreinigt.

Unabhängig von Goppelsröder versuchte Lester Reed eine größere Anzahl vongelösten Salzen durch „selective absorption in bibulous paper“ zu trennen. Histo-risch interessant ist der 1893 publizierte Schluss seines Aufsatzes: „I have obtainedsatisfactory results . . . by using tubes containing powdered kaolinlightly rammeddown, upon the top of which the solution was placed and allowed to soak down-wards“ [9, 10].

Die geniale Entdeckung der Elutionschromatographie, nämlich die Trennungzwischen Probe, mobiler und stationärer Phase sowie das einmalige Auftragen der


Abb. 1.2 Trennung auf Papierstreifen (nach Goppelsröder) [7]

Probe und das anschließende permanente Einwirken der mobilen Phase, machte1903 der in Italien geborene und in der Schweiz ausgebildete russische Botani-ker Michail Semenovich Tswett (1872–1919). Ihm gelang erstmals die Trennungvon Blattfarbstoffen mittels Säulenchromatographie [11–16]. Als stationäre Phasebenutzte Tswett Puderzucker, Inulin, CaCO3, Aluminiumoxid und viele weite-re Adsorbentien, die er in kleine Glasröhren packte. Im Anschluss ließ er durchleichten Überdruck eine Flüssigkeit durch die Packung fließen (Abb. 1.3). Erschreibt 1906 [13]: „Wird eine petrolätherische Chlorophylllösung durch eineSäule eines Adsorptionsmittels durchfiltriert (ich verwende hauptsächlich Calcium-carbonat, welches in Glasröhren dicht gestampft wird), so werden die Farbstoffegemäß der Adsorptionsreihe von oben nach unten in verschieden gefärbten Zo-nen auseinandergelegt, indem die stärker adsorbierten Farbstoffe die schwächerzurückgehaltenen weiter nach unten verdrängen. Diese Trennung wird praktischvollständig, wenn man nach dem Durchgange der Farbstofflösung durch die adsor-bierende Säule einen Strom des reinen Lösungsmittels herstellt.“

Hier wird zum ersten Mal die Auftragung der Probe auf die stationäre Phase, dasEinwirken der (sauberen!) mobilen Phase auf die Probe, wie auch die Ausbildungvon Substanzzonen und deren Verbreiterung im Laufe der Elution beschrieben. Wiegenial Tswetts Erfindung ist, kann man daran ermessen, dass Goppelsröder mehr als40 Jahre Papierstreifen in Hunderte von Lösungen hängte, ohne auf den aus heutigerSicht naheliegenden Gedanken zu kommen, die Papierstreifen nach dem Tauchenmit sauberem Lösungsmittel weiter zu entwickeln.

1.1 Die Geschichte der Chromatographie 5

Abb. 1.3 Abgebildet ist die Tswett-Apparatur zur Säulenchromatographie [14]. Die kleinen Säul-chen wurden mit leichtem Überdruck betrieben. Bilder oben zeigen die ebenfalls durchgeführteUnterdruckchromatographie

In der ersten seiner drei Arbeiten, die er 1906 in den „Berichte der Deut-schen Botanischen Gesellschaft“ publizierte [13–14], benutzt Tswett erstmals dievon ihm geschaffenen Begriffe „Chromatogramm“ und „Chromatographie“. Erschreibt: „Wie die Lichtstrahlen im Spektrum, so werden in der Calciumkabo-natsäule die verschiedenen Komponenten eines Farbstoffgemisches gesetzmässigauseinandergelegt, und lassen sich darin qualitativ und auch quantitativ bestim-men. Ein solches Präparat nenne ich ein Chromatogramm und die entsprechendeMethode, die chromatographische Methode“ [13].

Tswett verband mit dem Begriff „Chromatographie“ die wörtliche Übersetzung„Farbschreibung“ und war der Meinung, eine universell anwendbare Methode ge-funden zu haben. Er schreibt [13]: „Selbstverständlich sind die beschriebenen Ad-sorptionserscheinungen nicht nur den Chlorophyllfarbstoffen eigen, und es ist an-zunehmen, dass allerlei gefärbte oder farblose chemische Verbindungen denselbenGesetzen unterworfen sind. Ich habe bisher Lecithin, Alkannin, Prodigiosin, Sudan,Cyanin, Solanorubin, sowie Säurederivate der Chlorophylline mit positivem Erfolguntersucht“.

Tswett listete über 100 Substanzen auf, die er auf ihr Adsorptionsvermögen hingetestet hat [13]. Seine ersten Versuche führte er aber mit Filterpapier durch. Eskann heute allerdings nicht sicher gesagt werden, ob Tswett wirklich Papierchroma-tographie betrieben hat. Die Chromatographie als Trennmethode über eine gefüllteSäule geht aber eindeutig auf ihn zurück. Ja, er hat auch das Potenzial der Metho-


de voll erfasst. Er schreibt 1906: „Es lässt sich jetzt die Frage aufwerfen, ob diechromatographische Methode sich nicht zu einer chromatometrischen potenzierenlässt. Es wäre ja bestechend, die Qualitäten der Farbstoffe einfach in Volumina desvon ihnen gesättigten Adsorptionspulvers auszudrücken. Die Versuche, welche ichaber in dieser Richtung angestellt habe, haben bisher zu keinem befriedigendenResultate geführt“ [13].

Ein Schritt weiter auf dem Weg zur modernen Dünnschichtchromatographie istdie Entdeckung der Circularpapierchromatographie durch J. Grüss etwa im Jah-re 1908. Gestützt auf die Arbeiten von Goppelsröder tropfte Grüss, ähnlich wieRunge, Proben (hauptsächlich Enzyme) mittig auf rundes Filterpapier, brachte abernach der Ausbildung von Ringen erneut Wasser in der Papiermitte auf. Die erneuteAuftragung von Wasser bewirkte die vollständige Trennung der Substanzen. Umfarblose Zonen sichtbar zu machen, verwendete Grüss farberzeugende Reagenzien.Die „aneinandergereihten farbigen Sektoren“ nannte er „Chromogramm“ [17].

An die Arbeiten zur „Kapillaranalyse“ von Schönbein und Göppelsröder knüpfteR. E. Liesegang (1896–1947) an, der am 15. Mai 1943 mit einer bemerkenswertenArbeit weit über seine Vorgänger hinausging. Er schreibt unter dem Titel „Kreuz-Kapillaranalyse“: „Der Tropfen eines Farbstoffgemisches wird auf einer Ecke einesetwa 20 × 20 cm großen Blattes Filterpapier eintrocknen gelassen. Läßt man vonhier aus Wasser kapillar hochsteigen, so erhält man in Gegensatz zur gewöhnlichenKapillaranalyse nur einen schmalen Farbstreifen. Die Zerlegung in einzelne Farb-bänder ist gewöhnlich nicht so scharf, wie man sie bei der chromatographischenAnalyse durch die nachfolgende Entwicklung erreichen kann. Eine noch weiterge-hende Sonderung kann man aber herbeiführen, wenn man nach dem Trocknen dasPapier nochmals so in das Wasser hängt, dass es im rechten Winkel zum erstenmalkapillar aufsteigt. Auch die einzelnen Polymerisationsgrade eines einzelnen Farb-stoffs können so nach ihrer Wanderungsgeschwindigkeit räumlich weit voneinandergetrennt werden. Das kapillar aufsteigende Wasser kann durch organische Flüs-sigkeiten, das Filterpapier durch eine Gipsplatte usw. ersetzt werden“ [18]. Diesefür die Papier- wie auch der Dünnschichtchromatographie so wichtige Arbeit bliebkriegsbedingt ohne Wirkung auf nachfolgende Forscher [19].

Die einzige in deutscher Übersetzung vorliegende Dissertation von Tswett (ausdem Jahre 1910) wurde von Richard Martin Willstädter (1872–1942) an RichardKuhn (1900–1967) übergeben und leitete 1930 die Renaissance der Tswett’schenChromatographiemethode ein. R. Kuhn erhielt 1938 für seine Arbeiten über diesäulenchromatographische Trennung von Carotinoiden den Nobelpreis. Sein Assis-tent Alfred Winterstein (1899–1961) trug maßgeblich zur Verbreitung der Säulen-Adsorptionschromatographie bei. In zahlreichen Vorträgen und Demonstrationsver-suchen verhalf er der Säulenchromatographie in kürzester Zeit zum Durchbruch.Auch Archer John Porter Martin (1910–2002) erhielt 1933 in Cambridge durcheinen Vortrag Wintersteins erste Anregungen für seine späteren, grundlegenden Ar-beiten zur Chromatographie [1].

Martin hatte in den dreißiger Jahren größere Anlagen zur Gegenstromextrakti-on konstruiert, um Substanzen mit ähnlichen chemischen Eigenschaften zu trennen.Gemeinsam mit Richard Laurence Millington Synge (1914–1994) versuchte er die-

1.2 Geschichte der Dünnschichtchromatographie (DC) 7

se Methode, das wechselseitige Ausschütteln einer Lösung durch ein Extraktions-mittel, auf die Trennung von Aminosäuren anzuwenden. Man bemühte sich eineVersuchsanlage zu entwerfen, die eine möglichst schnelle Einstellung des Gleich-gewichtes zwischen beiden Flüssigkeiten ermöglichte. Dazu schrieb Martin 1975rückblickend [1]: „Then I suddenly realized that it was not necessary to move bothliquids; if I just moved one of them the required conditions were fulfilled . . . Syngeand I took silica gel intended as a drying agent from a balance case, grounded itup, sieved it and added water to it . . . We put this mixture of silica gel and waterinto a column . . . One foot of tubing in this apparatus could do substantially betterseparations than all the machinery we had constructed until then.“

Für die Entdeckung der Verteilungschromatographie erhielten Martin und Synge1952 den Nobelpreis für Chemie.

Zwei Jahre nach seiner fundamentalen Entdeckung der Verteilungschromatogra-phie publizierte Martin 1944 zusammen mit R. Consden und A. H. Gordon eineweitere Variante des chromatographischen Trennverfahrens. Er nannte die Metho-de: „. . . a Partition Chromatographic Method Using Paper“ [20]. In dieser Publi-kation geben die Autoren eine genaue Beschreibung ihrer einfachen Apparatur. EinStreifen Filterpapier wird nach dem Auftragen der Substanzen mit dem oberen En-de in einen Trog getaucht, der mit wassergesättigtem Lösungsmittel gefüllt ist. DasFilterpapier wird über eine oben liegende Kante umgelenkt, damit das Lösungsmit-tel nicht durch Kapillarkräfte „abgesaugt“ werden kann. Die gesamte Anordnungbefindet sich in der dampfgesättigten Atmosphäre einer geschlossenen Kammer.

Diese Art der Chromatographie revolutionierte die Analytik. Insbesondere dieAnalyse von Aminosäuren aus Proteinen wurde so entscheidend erleichtert. Brauch-te man früher mehrere Jahre für eine Proteinanalyse, so verkürzte diese einfacheTrennmethode die Arbeit auf wenige Tage. Im Jahre 1954 wurden schon mehr als4000 Publikationen zur Papierchromatographie gezählt, und ein Zeitgenosse be-merkte lakonisch: „Paper chromatographie is so widely used that it is impossible tomake more than a rough estimate of its applications“ [21].

1.2 Geschichte der Dünnschichtchromatographie (DC)

Im Jahre 1889 publizierte M. W. Beyerinck die Trennung von Substanzen durchDiffusion in Gelatine, die auf einer Glasplatte als Träger aufgetragen war [22]. Dieswar der erste, allerdings folgenlose Versuch, Planarchromatographie mit einer an-deren stationären Phase als Papier durchzuführen. Angeregt durch Tswetts Arbeitenübertrugen Nikcolai A. Izmailov (1907–1961) und Maria S. Shraiber (1904–1992)im Jahre 1938 die Ergebnisse der Säulenchromatographie auf sogenannte „offe-ne Säulen“. Auf gläserne Objektträger strichen die Forscher dünne, etwa 2 mmdicke Schichten verschiedener Sorbenzien wie Kalk, Magnesiumoxid oder Alumi-niumoxid auf [23–26]. Die Trennmethode ähnelte im Weiteren der Methode vonGrüss.

Im Jahre 1992 beschrieb Shraiber die Entdeckung der Dünnschichtchromato-graphie folgendermaßen: „The use of column chromatography for the analysis of


pharmaceutical samples took a lot of time. This limited the application of the me-thod throughout pharmaceutical analysis. For this reason our thoughts and effortswere directed to studying opportunities for accelerating the separation processfor complex samples“ [24, 25]. Weiter führt Shraiber aus, dass die ursprünglicheIdee der Planarchromatographie auf Tswett zurückgeht. Sie schreibt: „Thin layerchromatographic adsorption analysis was elaborated as a result of a number of ex-periments based on the separation of a mixture of compounds into zones on a thinlayer of adsorbent using one drop of sample. Developing M. S. Tswett’s idea it wasdemonstrated that the planar adsorbent layer is an analog of the chromatographiccolumn“ [25–28].

Im Jahre 1949 führten J. E. Meinhardt und N. F. Hall eine wesentliche tech-nische Verbesserung der „surface chromatography“ ein. Sie fixierten das SorbensAluminiumoxid mit Stärke als Binder auf einer Glasplatte [29]. Es entstanden riss-freie stabile Platten. J. G. Kirchner, J. M. Miller und G. J. Keller modifiziertendie Methode nach Meinhardt und Hall. Sie fügten dem Sorbens Zinksilicat undZinkcadmiumsulfid als Fluoreszenzindikator zu. So konnte man Substanzen ohneAnfärbung der Platte unter kurzwelligem UV-Licht (254 nm) als fluoreszenzgemin-derte Zonen zerstörungsfrei beobachten. Ihren beschichteten Glasstreifen nanntensie „Chromato strips“ und benutzten sie zur Trennung von Terpenen. Sie schrieben:„Very unreactive compounds can be located by spraying with concentrated sulfuric-nitric acid mixture and heating to cause charring of the compounds“. Sie kamen zufolgendem Ergebnis: „Of the numerous adsorbents tested, silicic acid proved to bethe best for terpenes“ [30].

R. H. Reitsema benutzte 1954 mit Kieselgel beschichtete Glasplatten der Größe12,5 cm × 17,5 cm, die er „Chromato-plates“ nannte. Durch simultanes Auftragenund Entwickeln mehrerer Proben konnte er bei Reihenuntersuchungen einen hohenProbedurchsatz erreichen [31].

Der eigentliche Durchbruch der DC als analytische Trennmethode sowie ihreNamensgebung sind jedoch ein Verdienst von Egon Stahl (1924–1986), der die-se Trenntechnik ab 1955 entscheidend standardisierte und in die Routineanalytikeinführte [32, 33]. Stahl benutzte 20 × 20 cm große Glasplatten, die mit den ver-schiedensten Sorbenzien belegt waren. Eine seiner ersten Trennungen ist in Abb. 1.4zu sehen. Nicht zuletzt sein 1962 erschienenes Handbuch der DC machte die Me-thode – ebenso wie das im gleichen Jahr erschienene Buch von Kurt Randerath –unter dem Kürzel „TLC“ weltweit bekannt [32–36].

Die nächsten Verbesserungen machte R. E. Kaiser Anfang der 1970er-Jahre amInstitut für Chromatography in Bad Dürkheim [37]. Mit einer handgestrichenenKieselgelplatte ohne Binder, aber mit 5 µm großen Teilchen enger Korngrößenver-teilung hergestellt, konnte er die Trennzeit entscheidend von Stunden auf Minutenverringern und gleichzeitig die chromatographische Auflösung steigern [37]. DieseEntwicklung führte im Jahre 1977 zu dem Buch von R. E. Kaiser HPTLC – HighPerformance Thin-Layer Chromatography, wo die ersten Anwendungen dieser neu-en Technik publiziert wurden [37]. H. Halpaap von der Fa. Merck führte die soge-nannten High-Performance-Thin-Layer-(HPTLC-)Platten Mitte 1970 im 10 × 10-cm-Format am Markt ein [38]. Dem Kieselgel folgte 1980 die RP-18-HPTLC-

1.3 Geschichte der quantitativen Planarchromatographie 9

Abb. 1.4 Abgebildet ist eine der ersten von E. Stahl entwickelten TLC-Platten [1]. Zu sehen istdie Trennung einer Probe Baldrianöl. Die Platte wurde mit SbCl3-Lösung in CHCl3 besprüht undanschließend erhitzt

Platte. Im Jahre 1982 führten W. Jost und H. E. Hauck die Aminoplatte, 1985 dieCyanoplatte und 1987 die Diolplatte ein [39].

1.3 Geschichte der quantitativen Planarchromatographie

Schon 1953 wies F. Cramer auf verschiedene Möglichkeiten hin, aus Papierchroma-togrammen quantitative Aussagen gewinnen zu können [40]. In einer Merck-Bro-schüre aus dem Jahre 1954 heißt es dazu: „Es gilt die Beziehung, dass die Größe desFleckens dem Logarithmus der Konzentration der Lösung des Stoffes proportionalist. Werden demnach gleiche Raumteile zweier Lösungen desselben Stoffes chro-matographiert und ergeben sich gleichgroße Flecke, so besitzen beide Lösungendie gleiche Konzentration (mit etwa 10 % Fehlerbreite). Die Fleckgröße ist auch inder Weise bestimmbar, dass Lösungen verschiedener (bekannter) Konzentrationenchromatographiert und die Flecke mit dem Fleck der Lösung unbekannter Kon-zentration verglichen werden. Die Fleckgröße wird entweder durch Ausmessen derFläche oder durch Ausschneiden der Flecke und Wiegen der Ausschnitte bestimmt.Auch auf photometrischem Wege kann eine Auswertung der Flecke vorgenommen


werden. Das Papier wird durch 5 Minuten langes Eintauchen in eine Mischungaus gleichen Teilen ˛-Bromnaphthalin und Paraffin flüssig (DAB 6) transparent ge-macht. Nach dem Trocknen werden die Flecke mit Hilfe eines photoelektrischenDetektors ausgemessen“ [41].

Zur Quantifizierung üblich war auch das Ausschneiden bzw. Auskratzen derSubstanzflecke und die Extraktion mit einer Mikrosoxhlet-Apparatur sowie eineranschließenden kolorimetrischen Konzentrationsbestimmung. In der Frühzeit derDünnschichtchromatographie konnte man nur durch Auskratzen eines Probeflecksund anschließendes Herauslösen der Probe eine Gehaltsbestimmung durchführen.J. G. Kirchner publizierte für diese Art der Quantifizierung 1954 immerhin einenmittleren Fehler von nur 2,8 % [42]. F. W. Hefendehl veröffentlichte 1960 eineMethode, wie man Dünnschichtchromatogramme zerstörungsfrei in Transmissionvermessen kann. Zu diesem Zweck besprühte er die DC-Platte mit einer Paraffin-Ether-Lösung (1 : 1), um die Platte transparent zu machen. Anschließend wurde diePlatte photographisch ausgewertet [43].

C. B. Barrett und M. S. J. Dallas nutzten zur DC-Auswertung von mit Schwe-felsäure behandelten DC-Platten ein Chromoscan-Densitometer und registriertenDensitogramme auch in Reflexion [44, 45].

Im Jahre 1964 publizierte A. Jork (1933–1993) erste in Reflexion gemesse-ne Densitogramme einer angefärbten TLC-Platte. Er benutzte ein Chromoscan-Densitometer der Fa. Joyce & Loeble (Newcastle, England). Durch automatischesIntegrieren des Flächeninhaltes unter der Messkurve erhielt er einen gut reprodu-zierbaren Wert mit einem Fehler von unter 1 % [47, 48].

Als messende Methode hat sich die quantitative DC mittels Reflexionsspek-trometrie mit den Jork’schen Arbeiten ab etwa 1964 durchgesetzt. Jork bestrahlteunbehandelte DC-Platten mit monochromatischem Licht und registrierte orts- undwellenlängenabhängig die von der Platte reflektierte Lichtintensität [47].

Lässt man auf die Sorbensschicht einer DC-Platte einen Lichtstrahl einfallen, sowird an jedem einzelnen Partikel der Schicht das Licht absorbiert. Der größte Teildes Lichtes wird jedoch gestreut und von der Platte reflektiert. Dieses reflektierteLicht (das Remissionslicht) ermöglicht eine schnelle und vor allem zerstörungs-freie Quantifizierung direkt von DC-Platten. Das von Jork umgebaute Zeiss-Spek-trometer KM2 konnte als KM3 routinemäßig Densitogramme sowie Spektren inRemission, Transmission und Fluoreszenz messen [47, 48]. Das KM3 ist in Abb. 1.5dargestellt.

Erste erfolgreiche quantitative Messungen mit einer Digitalkamera wurden imJahre 1984 von M. Prosek und R. E. Kaiser durchgeführt [37, 49].

S. Ebel kombinierte Anfang der 70er-Jahre des letzten Jahrhunderts einen in Re-flexion und Transmission messenden DC-Scanner mit einem Tischcomputer, der diePlattenaufnahme steuern und die gewonnenen Remissionsdaten auswerten konn-te [50].

Die ersten Spektren eines Lichtleiter-TLC-Scanners im Bereich von 300 nm bis700 nm wurden von B. L. Hamman und M. M. Martin publiziert [51]. Die ers-te Kombination eines DC-Scanners mit einem Dioden-Array-Detektor wurde imJahre 1989 von S. Bayerbach und G. Gauglitz beschrieben [52]. Die Firma J&M

Literatur 11

Abb. 1.5 Abgebildet ist der erste von H. Jork konstruierte DC-Scanner (ZR3) der Fa. Zeiss [46]

(Aalen, Deutschland) brachte 1998 den ersten Dioden-Array-Lichtleiterscanner fürdie Dünnschichtchromatographie auf den Markt [53]. Einen vollständigen Über-blick über 50 Jahre Publikationen und Geräteentwicklung zur DC geben G. Morlockund J. Sherma in [53]. Die Theorie zur DC wurde maßgeblich von F. Geiss [54],R. E. Kaiser [55] und G. Guiochon [56–60] erarbeitet, aber damit beschäftigt sichKap. 2.

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2Theoretische Grundlagen derDünnschichtchromatographie (DC)

2.1 Planar- und Säulenchromatographie

Eine Trennung von Stoffen erreicht man generell nur durch einen Phasenübergang.In der Chromatographie nutzt man dazu die Phasen fest/flüssig, flüssig/flüssig undgasförmig/fest bzw. gasförmig/flüssig. Dementsprechend unterscheidet man zwi-schen Flüssig- und Gaschromatographie, im Englischen gas chromatography (GC)und liquid chromatography (LC).

Unabhängig von der Art der Phasen kennt man drei verschiedene Chromatogra-phiearten: die Frontalchromatographie (engl. frontal chromatography), die Verdrän-gungschromatographie (engl. displacement chromatography) und die Elutionschro-matographie (engl. elution chromatography). Bei der Elutionschromatographie wirdweiter zwischen Verteilungschromatographie (engl. partition chromatography) undAdsorptionschromatographie (engl. adsorption chromatography) unterschieden.

Bei der Frontaltechnik wird die in der mobilen Phase gelöste Probe kontinuier-lich auf die stationäre Phase gegeben. Dies ist die Methode von Goppelsröder, aberauch die Probeaufarbeitung mittels SPE (engl. solid-phase extraction) nutzt dieseTechnik. Bei der SPE werden nur Substanzen hoher Retention auf der Reinigungs-kartusche zurückgehalten und so vom Rest der Probe abgetrennt.

In der Verdrängungstechnik wird eine stark sorbierte Komponente der Probe voneiner noch stärker sorbierenden Komponente aus der mobilen Phase eluiert, alsofreigesetzt. Die Technik findet man häufig in der Ionenchromatographie.

Bei der Elutionschromatographie verteilt sich die Probe zwischen stationärerund mobiler Phase. Zuerst eluiert werden die Verbindungen, die sich eher in dermobilen Phase anreichern. Die Elutionschromatographie ist die bei weitem am häu-figsten benutzte chromatographische Methode. Sie ist in der Regel gemeint, wennvon „Chromatographie“ gesprochen wird.

Weiter wird unterschieden, ob die stationäre Phase offen (Planarchromatogra-phie) oder in einem Rohr abgeschlossen vorliegt (Säulenchromatographie). In derSäulenchromatographie wird eine definierte Probemenge in eine fließende mobilePhase injiziert. Das Gemisch aus Probe und mobiler Phase läuft anschließend übereine Trennsäule. Bei geschickter Wahl der Trennparameter werden die verschie-


16 2 Theoretische Grundlagen der Dünnschichtchromatographie (DC)

denen Substanzen des Probegemisches aufgetrennt, verlassen der Reihe nach dieSäule und wandern durch den Detektor. Die dabei aufgenommenen Signale werdenin zeitlicher Reihenfolge als Chromatogramm registriert. Gemessen wird immer inder mobilen Phase. Meistens soll so nur eine Zielverbindung (der Analyt) von allenanderen Bestandteilen der Probe abgetrennt werden. Dann reicht es aus, die chro-matographischen Bedingungen so zu wählen, dass die Wanderungsgeschwindigkeitdes Analyten sich von der der Beiprodukte unterscheidet. Säulenchromatographi-sche Methoden arbeiten immer sequenziell. Zuerst wird die Probe injiziert, dannwird getrennt und anschließend gemessen. Diese Art der Chromatographie nenntman „Online-Chromatographie“. Die einzelnen Methoden der Säulenchromatogra-phie unterscheiden sich nur in der Art der verwendeten Phasensysteme.

Trennungen werden optimiert durch die Wahl einer geeigneten Säule und durchVeränderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase. Wird die Zusammen-setzung der mobilen Phase während der Trennung konstant gehalten, spricht manvon einer isokratischen Entwicklung. Ändert sie sich während der Trennung, nenntman dies eine Gradientenentwicklung.

Bei den planarchromatographischen Trennmethoden wie der Dünnschichtchro-matographie (DC), der Papierchromatographie (PC) oder der Flachbettelektropho-rese (PAGE, Polyacryl-Gelelektrophorese) ist die stationäre Phase nicht fest mitdem Reservoir der mobilen Phase oder mit dem Detektor verbunden. Damit kannsie schnell gewechselt werden, und es wird möglich, die Art der stationären Phaseals Steuerparameter zu benutzen. Im Anschluss an die Wahl der stationären Pha-se werden in der Regel mehrere Proben aufgetragen. Nach der Auftragung derProben fließt die mobile Phase durch die stationäre Phase und trennt die verschie-denen Bestandteile der Proben auf. Man nennt diesen Vorgang „Entwicklung“. Inder DC wird die mobile Phase anschließend entfernt, und erst dann wird detek-tiert. Gemessen wird immer in der stationären Phase. Das gemessene Signal wird inAbhängigkeit von der Trennstrecke registriert. Die graphische Auftragung der Si-gnalstärke gegen die Trennstrecke nennt man Densitogramm. Eine entwickelte DC-Platte mit dem dazugehörigen Densitogramm zeigt Abb. 2.1.

Bei den planarchromatographischen Trennmethoden wird nicht wie bei den säu-lenchromatographischen Trennmethoden sequenziell, sondern parallel gearbeitet.Dies bringt Vor- und Nachteile mit sich. Durch die sequenzielle Arbeitsweise lassensich säulenchromatographische Methoden sehr einfach automatisieren. Der Erfolgdieser Trennmethoden beruht ganz wesentlich darauf, dass während der Trennungkein manueller Zugriff das Trennergebnis beeinflussen kann. Damit sind säulen-chromatographische Trennmethoden relativ starr in ihrem Ablauf. Planarchroma-tographische Trennungen sind wesentlich flexibler, weil bei den einzelnen Trenn-schritten manuell eingegriffen werden kann. Dies erschwert allerdings die Validie-rung der Methode und hat dazu geführt, dass z. B. die pharmazeutische Industrieplanarchromatographische Trennungen bei der Prüfung von Arzneimitteln so gutwie nicht mehr einsetzt.

Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Planarchromatographie und Säu-lenchromatographie besteht in der flexiblen Benutzung der stationären Phase. Eswird in der Planarchromatographie nach jeder Trennung eine neue stationäre Pha-

2.1 Planar- und Säulenchromatographie 17

Abb. 2.1 Trennung von sechs Farbstoffen (CAMAG-III-Gemisch) auf einer SiO2-Platte, mit To-luol entwickelt, und das dazugehörige Densitogramm

se verwendet. Verschleppungen aus der Voranalytik sind damit nicht möglich. Sokönnen auch stark verschmutzte Analyte ohne Vorreinigung auf die stationäre Pha-se aufgetragen werden, ohne dass eine aufwändige Probevorreinigung nötig wäre.Bei der Detektion werden in der Regel keine Probebestandteile übersehen, weildie ganze stationäre Phase abgescannt werden kann. In der Säulenchromatographiewird nur das gemessen, was die Säule auch verlässt. Substanzen, die auf der Säulebleiben, können so leicht übersehen werden. Auch das Erkennen von Zersetzungs-reaktionen ist schwierig, da man Substanzen während der Trennung auf der Säulenicht beobachten kann.

Der größte Unterschied zwischen beiden Trennmethoden liegt jedoch in der Artder benutzten mobilen Phasen. Da in der Säulenchromatographie die zu messendenSubstanzen immer in der mobilen Phase gemessen werden, darf diese die Messungnicht stören. Damit ist die Anzahl der für die mobile Phase einsetzbaren Chemika-lien bei der Säulenchromatographie stark eingeschränkt. In der HPLC (engl. high-performance liquid chromatography) werden in mehr als 90 % aller Trennungenmobile Phasen aus Methanol, Acetonitril und wässrigen Puffersystemen benutzt.

In der DC wird die mobile Phase vor der Detektion entfernt und stellt damit keinProblem bei der Messung dar. Bei der Benutzung verschiedener mobiler Phasen istdie DC keinerlei Beschränkungen unterworfen. Damit wird es möglich, die Selek-tivität als zentralen Trennparameter einzusetzen.

Säulen- und planarchromatographische Verfahren sind prinzipiell unterschiedli-che Trennmethoden. Jede Methode hat Stärken und Schwächen und sollte entspre-chend ihren Stärken eingesetzt werden. Es wird oft eine Konkurrenz zwischen DCund HPLC gesehen, die so nicht existiert. Beide Methoden sollten als gegenseitigeErgänzung eingesetzt werden.


2.2 Die kapillare Fließbewegung in der DC

Der große Unterschied zwischen HPLC und DC besteht in der Art, wie die mobilePhase bewegt wird. Während in der HPLC ein Druckgradient für den Fluss dermobilen Phase verantwortlich ist, wird in der klassischen DC die mobile Phasedurch Kapillarkräfte vorwärtsbewegt.

In Lehrbüchern zur DC [1–11] findet man eine Vielzahl unterschiedlicher plan-archromatographischer Trennmethoden. Insbesondere gibt es eine Reihe von Ver-fahren, in denen der Fluss durch die Platte erzwungen wird, den sogenannten For-ced-flow-Methoden. Dazu gehört die klassische Gelelektrophorese, wobei spezielleGele als stationäre Phase dienen. Wird der Fluss der mobilen Phase mit Hilfe ei-nes elektrischen Feldes durch eine DC-Platte erzwungen, spricht man von electroplanar chromatography (EPC). Ähnlich der HPLC kann der Lösungsmittelflussdurch die DC-Platte auch mittels Druck erzwungen werden. Diese Methode wird alsOPLC (engl. overpressure layer chromatography oder auch optimum performancelaminar chromatography) bezeichnet. Weiter gibt es die Methode der Rotations-planarchromatographie (RPC), bei der der Laufmittelfluss durch eine zentrifugaleKraft erzeugt wird. Alle diese Methoden sollen hier nicht weiter besprochen wer-den. Es wird ausschließlich die Methode der klassischen DC behandelt, bei der diemobile Phase durch Kapillarkräfte vorwärts bewegt wird.

In der DC wirkt die poröse stationäre Phase wie ein Verbund feinster Kapillaren,wobei die Kohäsion der mobilen Phase von der Adhäsion an der Kapillarwand deut-lich übertroffen wird. Die Oberflächenspannung der mobilen Phase wird dadurchmerklich vermindert. Dieses äußert sich als Druckdifferenz, die die Flüssigkeit indie Kapillaren treibt. Die Ursache des mobilen Phasenflusses hat der DC den Na-men Kapillar-DC gegeben, im Unterschied zur DC mit erzwungenem Fluss, diedeshalb als Forced-flow-DC bezeichnet wird.

Die Flussbewegung der mobilen Phase bei aufsteigender Entwicklung in einerVertikalkammer kommt zum Stillstand, wenn der statische Gegendruck der ange-hobenen Flüssigkeit den Kapillardruck erreicht hat, der durch die Verminderungder Oberflächenspannung verursacht wird. Bei einer Horizontalentwicklung in einerHorizontalkammer bringen nur die größer werdenden Reibungskräfte den Kapillar-fluss nach einiger Zeit zum Erliegen. Die Laufmittelfront einer in die mobile Phaseeingetauchten DC-Platte wandert anfangs sehr schnell und wird mit der Zeit starkverlangsamt (Abb. 2.2). Die Wanderungszeit der Laufmittelfront (t) hängt mit demzurückgelegten Weg der Front (Zf) über die Funktion einer Wurzel zusammen:

Zf D p�t : (2.1)

Der Proportionalitätsfaktor � wird Fließ- oder Geschwindigkeitskonstante ge-nannt. Die Formel bringt zum Ausdruck, dass der durch Kapillarkräfte verursachteFluss zeitlich nicht konstant ist. Die Formel gilt nicht für den Fall, dass die Molekü-le der mobilen Phase während der Entwicklung von der DC-Platte abdiffundierenoder sich zusätzlich auf der DC-Platte niederschlagen. Werden Trennkammern mitgroßem Gasraum benutzt, kann Fließmittel an diesen Gasraum abgegeben und auch

2.2 Die kapillare Fließbewegung in der DC 19

Abb. 2.2 Wanderungs-geschwindigkeit einerMethanolfront in einer Hori-zontalkammer (NH2-Platte)

0

510

1520

2530

3540

45

0 200 400 600Zeit (s)

)m

m(ekcertsn ner T

von der Platte wieder aufgenommen werden. Die Adsorption und die Desorptionvon Fließmittelmolekülen überlagern sich dann in komplizierter Weise. Um repro-duzierbare Fließgeschwindigkeiten zu erhalten, sollte daher mit Entwicklungskam-mern gearbeitet werden, die möglichst kleine Dampfräume besitzen. Bei größerenKammern kann das Abdampfen des Fließmittels wirksam unterdrückt werden, in-dem der Dampfraum vor der Entwicklung der DC-Platte mit der mobilen Phasegesättigt wird. In dem Ausdruck für die Fließkonstante wird die innere Reibungder kapillaren Fließbewegung wie auch der statische Gegendruck bei aufsteigenderEntwicklung berücksichtigt. Es gilt [6, 11, 12]:

� D 2k0dp�

�cos # (2.2)

mitk0 Permeabilitätskonstante, k0 = 6�8 � 10�3

dp mittlere Korngröße der stationären Phase� Viskosität der mobilen Phase� Oberflächenspannung (Permeabilität)cos # Kontaktwinkel mit dem Randwinkel # (Benetzbarkeit)

Je größer die Viskosität � und je kleiner die Oberflächenspannung � des Fließ-mittels sind, desto langsamer wandert die Front. Der Quotient aus Viskosität undOberflächenspannung wird auch als Permeationsfaktor bezeichnet. Der Permeati-onsfaktor ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit der Laufmittelfront. Jegrößer der Permeationsfaktor ist, umso schneller fließt die mobile Phase. Der Per-meationsfaktor von Diisopropylether beträgt 9,1, während 1-Propanol einen Wertvon 1,05 besitzt. Eine mobile Phase aus Diisopropylether fließt damit pro Zeitein-heit dreimal weiter als eine mobile Phase aus 1-Propanol.

.Zf/2 D

�2k0dp

�

�cos #

�t (2.3)

Ob die Platte liegend oder stehend entwickelt wird, macht bei der Entwicklungs-zeit nur wenig Unterschied. Wird die Entwicklungsstrecke Zf zu verschiedenen Zei-ten gemessen und als Quadrat (Zf

2) aufgetragen, ergeben sich Geraden (Abb. 2.3).


250

200

150

100

50

25020015010050

t [min]

Zf2

[cm2]

n-butanol

KS-tank

S-tank

N-tankN-tank

5 h pre-adsorption

Abb. 2.3 Auftragungen von Zf2 verschiedener Laufmittel gegen die Entwicklungszeit. (Entnom-

men aus [6], mit freundlicher Genehmigung © Hüthig)

Der Kosinus des Kontaktwinkels ist bei lipophilen Laufmitteln in der Regel et-wa eins und kann in der obigen Formel vernachlässigt werden. Bei hydrophobiertenSchichten wie z. B. RP-18-Platten ist das nicht mehr der Fall. Hier kann der Kosi-nus des Kontaktwinkels im Extremfall null werden. Dann wird die Schicht von dermobilen Phase nicht mehr benetzt, und eine Trennung durch Kapillarfluss ist nichtmehr möglich. Aus der Gleichung ist auch ersichtlich, dass die Fließgeschwindig-keit bei kleiner Korngröße dp der stationären Phase sinkt, denn mit kleinerem dp

wird auch die Geschwindigkeitskonstante � kleiner. Die Front legt dann pro Zeitweniger Wegstrecke zurück. Die Entwicklung auf HPTLC-Platten (High-perfor-mance-thin-layer-Platten) mit Korngrößen von etwa dp < 10 µm dauert länger imVergleich zu den DC-Platten mit mittleren Korngrößen von etwa 40 µm.

2.3 Verteilungsgleichgewichte in der DC

Nachdem die Proben auf die DC- oder HPTLC-Platte aufgetragen wurden, wird diePlatte in Kontakt zur mobilen Phase gebracht, und die Entwicklung beginnt. Beider Entwicklung wird die auf die DC-Platte aufgetragene Substanzmenge zwischender stationären Phase und der mobilen Phase verteilt. Dazu müssen sich die aufge-tragenen Substanzen in der mobilen Phase lösen können. Bei der Wechselwirkungmit der stationären Phase werden nun zwei prinzipiell unterschiedliche Wechsel-wirkungsmechanismen unterschieden.

2.3 Verteilungsgleichgewichte in der DC 21

1. feste stationäre Phase/flüssige mobile Phase,2. flüssige stationäre Phase/flüssige mobile Phase.

Den ersten Fall nennt man Adsorptionschromatographie und den zweiten FallVerteilungschromatographie.

2.3.1 Adsorptionschromatographie

Unter Adsorption versteht man die Anlagerung eines Stoffs aus einer Flüssigkeitan einen festen Stoff. Der aus der Lösung angelagerte Stoff wird als Adsorbat, deradsorbierende Stoff als Adsorbens bezeichnet. Dieser Vorgang spielt sich an derGrenzfläche zwischen stationärer und mobiler Phase ab. Folgende Kräfte könnendabei zwischen Adsorbens und Adsorbat wirken:� Van-der-Waals-Kräfte (aus induzierten Dipolen)� Dipol-Dipol-Wechselwirkungen� Wasserstoffbrückenbindungen� �-Komplexbindungen

Für eine chromatographische Trennung muss der Adsorptionsvorgang reversi-bel und ungehemmt ablaufen, und die Bindung zwischen Adsorbens und Adsorbatmuss wieder gelöst werden können. Man spricht dann von einer Desorption.

Ein Molekül wird umso stärker adsorbiert, je mehr einsame Elektronenpaare (�-oder n-Elektronenpaare) oder Ladungen es besitzt. Ganz allgemein gilt: Je pola-rer ein Molekül ist, je mehr polare Gruppen es also besitzt, umso stärker wird esvon einer polaren Phase adsorbiert. Bei der Adsorption spielen allerdings auch diesterische Struktur der Moleküle und die Temperatur eine Rolle. Begünstigt die steri-sche Struktur den Kontakt, dann bilden sich stabilere Wechselwirkungen aus als beiMolekülstrukturen, die die Bindungszentren sterisch auf Abstand halten. Niedrige-re Temperaturen begünstigen ebenfalls eine Adsorption, da eine hohe Temperatureine stärkere Bewegung in der stationären Phase bedingt und dadurch die Kontakt-zentren immer wieder auseinander gerissen werden.

Das Gleichgewicht eines reversiblen Adsorptionsvorgangs hängt bei konstanterTemperatur nur von der Konzentration des Adsorbats in der mobilen Phase und derMenge der schon auf der stationären Phase adsorbierten Substanz ab. Die graphi-sche Auftragung der Menge an adsorbierten Molekülen gegen die Gleichgewichts-konzentration bei konstanter Temperatur wird Adsorptionsisotherme genannt. ImIdealfall verläuft sie linear. Es werden im Experiment aber auch andere Verläufebeobachtet.

Nimmt die Belegung der stationären Phase logarithmisch mit der Gleichge-wichtskonzentration ab, spricht man von einer Isotherme nach H. Feundlich. Ist dasVerhältnis zwischen adsorbierter Substanzmenge und Gleichgewichtskonzentrationlinear und zeigt bei molekularer Bedeckung der stationären Adsorptionszen-tren einen Sättigungseffekt, spricht man von einem Langmuir’schen Verlauf derIsotherme (nach Irving Langmuir). Es sind auch konkave Verläufe der Adsorptions-isothermen bekannt. Egal wie der Verlauf nun aussieht, reproduzierbare Ergebnissewerden immer nur im linearen Bereich der Isotherme erhalten. Befindet man sich


c

c

c

mm

mm

mm

Tailing

Fronting

cs

cm

cs

cs

cm

cm

Gaußpeak

Fließrichtung

Fließrichtung

Abb. 2.4 Zusammenhang zwischen Fleckform und Verteilungsisothermen. a Gauß-Profil, b Tai-ling, c Fronting [9]

(bei höheren Konzentrationen) im gekrümmten Bereich einer Adsorptionsisother-me, resultieren keine symmetrischen Signale. Wird die stationäre Phase überladen,so kann sie bei steigenden Konzentrationen in der mobilen Phase nicht mehrMoleküle binden. Dann laufen diese schneller als erwartet durch die stationärePhase. Man bezeichnet dieses Phänomen als „Tailing“, weil der Substanzfleck eineSchleppe oder einen Schwanz hinter sich herzieht. Der Sachverhalt ist in Abb. 2.4dargestellt.

Bei Isothermen nach Freundlich oder Langmuir erhält man ein Tailing. Bei einerkonkaven Adsorptionsisotherme wird mehr Substanz von der stationären Phase ad-sorbiert als bei einer linearen Isotherme. In diesem Fall spricht man von „Fronting“.

In der Adsorptionschromatographie besteht die stationäre Phase in der Regelaus Kieselgel, Aluminiumoxid, Kieselgur oder Magnesiumsilicat. Diese Substan-zen sind alle sehr polar und können im aktivierten Zustand leicht Wasser anlagern.Solche Phasen können durch Erhitzen entwässert werden. Dabei werden die be-legten Bindungsorte wieder aktiv und können andere Moleküle besser binden. ImUmkehrschluss deaktiviert Wasser die stationäre Phase sehr effektiv und führt inder Adsorptionschromatographie schnell zu einer Phasenüberladung. Dies erklärt,warum geringste Mengen Wasser das Retentionsverhalten in der Adsorptionschro-matographie nachhaltig verändern können.

2.3.2 Verteilungschromatographie

Der englische Chemiker A. J. P. Martin hatte Mitte der 30er-Jahre eine Anlagezur Gegenstromextraktion entwickelt, um Substanzen mit ähnlichen Eigenschaf-

2.3 Verteilungsgleichgewichte in der DC 23

ten durch Ausschütteln mit zwei verschiedenen Lösungsmitteln zu trennen. MitR. L. M. Synge zusammen fand er 1940 heraus, dass es zur Substanztrennung ge-nügt, wenn eine Flüssigkeit stationär vorliegt und die andere Flüssigkeit relativ dazufließt. Martin und Synge sättigten Kieselgel mit Wasser und ließen Chloroformdurch diese stationäre Phase laufen. Es gelang ihnen, auf diese Weise sehr ähnli-che Substanzen voneinander zu trennen. Neben Kieselgel können auch Cellulose,Kieselgur oder Aluminiumoxid Wasser adsorbieren und so als Träger der statio-nären Phase wirken. Die stationäre Phase ist fixiertes Wasser. Zwischen dem Wasserund der organischen mobilen Phase findet eine Verteilung der Probemoleküle ent-sprechend des Nernst’schen Verteilungsgesetzes statt. Von dieser Erkenntnis biszur Papierchromatographie, bei der immobilisiertes Wasser ebenfalls die stationärePhase bildet, war es nur ein kleiner Schritt. Die Idee zur Papierchromatographiewurde von den beiden Forschern im Jahre 1943 publiziert.

In der Verteilungschromatographie beruht die Trennung auf unterschiedlichenLöslichkeiten der zu trennenden Substanzen in zwei begrenzt miteinander misch-baren Lösungsmitteln. Die Verteilung zwischen den Volumina dieser beiden Phasenwird durch das Nernst’sche Verteilungsgesetz beschrieben:

K D cS

cmD Vmms

Vsmm:

K Verteilungskoeffizientcs Substanzkonzentration in der stationären Phasecm Substanzkonzentration in der mobilen PhaseVs,m Verteilungsvolumen der stationären bzw. mobilen Phasems,m Substanzmasse in der stationären bzw. mobilen Phase

Das Gesetz nach W. H. Nernst besagt, dass der Quotient aus der Substanz-konzentration in der stationären Phase (cs) und der mobilen Phase (cm) bei einergegebenen Temperatur eine Konstante ist, der sogenannte Verteilungskoeffizient.Mit der Definition der Konzentration folgt die oben beschriebene Massenabhängig-keit des Verteilungskoeffizienten:

c D n

VD m=M

V:

n SubstanzstoffmengeM relative Molmasse der Substanz

Weil eine Substanz zwischen mobiler und stationärer Phase verteilt wird, kannfür die Stoffmenge n auch die Masse m stehen.

Im Idealfall ist der Verteilungskoeffizient K unabhängig von der Gesamtkon-zentration eines Stoffes. In diesem Fall resultiert eine lineare Verteilungsisother-me. Diese Art der Verteilung nennt man eine Nernst-Verteilung. Liegen dagegenDissoziations- und Assoziationsvorgänge wie Säure-Base-Reaktionen oder Kom-plexbildungen vor, gibt es konvexe oder konkave Abweichungen von der Nernst-Verteilung, die sich – wie erwähnt – in einem Tailing oder Fronting der Substanzen


bemerkbar machen. Ideal für die Verteilungschromatographie ist das Arbeiten imBereich von K = 1 bis K = 10.

Heute werden in der Verteilungschromatographie neben Cellulose sogenannteRP-Phasen verwendet, bei denen das hydrophile Silicagel mit lipophilen organi-schen Resten belegt ist. Die Polarität der stationären Phase ist quasi umgepolt, wasin der Bezeichnung reversed phase (RP) zum Ausdruck kommt.

In der Adsorptionschromatographie sind eher Oberflächenphänomene und in derVerteilungschromatographie eher Verteilungen zwischen Volumina bestimmend.Damit wird in der Adsorptionschromatographie in erster Linie nach funktionel-len Gruppen und in der Verteilungschromatographie nach Polarität getrennt. DieÜbergänge zwischen beiden Methoden sind aber fließend. Lipophil belegte Kie-selgelphasen können z. B. noch unbelegte Adsorptionszentren besitzen, die nebendem „Lösen“ von Probemolekülen durch die lipophile Belegung auch Adsorp-tionen möglich machen. Um Adsorptionen zu vermeiden, werden bei endcappedPhasen adsorptionsaktive Zentren durch zusätzlich eingeführte lipophile Gruppenblockiert.

Cellulose-Phasen z. B. wirken durch das Oberflächenwasser als Verteilungspha-sen. Wird eine trockene Celluloseplatte zur Trennung verwendet, wirkt die Cellu-lose primär als Adsorptionsphase und trocknet dabei das Laufmittel. So kann espassieren, dass Aminosäuren auf einer trockenen Celluloseplatte im ersten Trenn-abschnitt gut separiert werden und im zweiten Trennabschnitt dann „verschmieren“.Das Wasser zum Aufbau der stationären Phase holt sich die Cellulose aus dem Lauf-mittel. Im zweiten Trennabschnitt gelingt das nicht mehr, weil die Phase wasserfreiwird und sich eine Verteilungschromatographie nicht mehr ausbilden kann.

NH2-Phasen wirken als hydrophile Verteilungsphasen. Bei sauren Laufmittelnwerden die NH2-Gruppen aber protoniert und wirken dann als oberflächenaktiveIonenaustauscher. Sie zeigen dann eher adsorptionschromatographisches Verhalten.

Cyanophasen zeigen eine besonders deutliche Ambivalenz in ihren Eigenschaf-ten. Mit lipophilen Laufmitteln werden Normalphasentrennungen erhalten. Bei hy-drophilen Laufmitteln zeigen sie das RP-Verhalten einer Verteilungschromatogra-phie. Ein Beispiel ist in Abb. 2.5 aufgeführt. Hier wurden Steroide mit reinem n-Hexan, reinem Aceton und reinem Wasser sowie mit binären Acetonmischungengetrennt. Der x-Wert (�50) in Abb. 2.5 bezieht sich auf ein Fließmittel, bestehendaus n-Hexan/Aceton (1 + 1, V / V). Dies beschreibt eine Normalphasentrennung.Der x-Wert (50) beschreibt das Laufverhalten in einem Fließmittel, bestehend ausAceton/Wasser (1 + 1, V / V). Dies sind RP-Bedingungen. Die Elutionsfolge kehrtsich ab dem Fließmittel Aceton (x-Achse: 0) um. Unter einer Normalphasentren-nung versteht man allgemein Trennbedingungen, bei denen die mobile Phase unpo-larer als die stationäre Phase ist. Unpolare Analyte laufen daher weiter als polareAnalyte. Bei Reverse-phase-Trennungen (RP-Trennung) ist die Situation geradeumgekehrt. Hier laufen polare Analyte weiter als unpolare. Cyanoschichten sindwegen ihres ambivalenten Verhaltens hervorragend für 2-D-Trennungen geeignet.

Ob eine Verteilungschromatographie oder eine Adsorptionschromatographievorliegt, ist für das Aussehen eines Densitogramms als Endergebnis einer Tren-nung nicht von Belang. Wichtig ist, dass reproduzierbare Ergebnisse immer nur

2.4 Der Retentionsfaktor (Rf-Wert) 25

Abb. 2.5 Dargestellt ist dasLaufverhalten von Steroi-den auf einer Cyanophaseunter a Adsorptionspha-senbedingungen und b RP-Bedingungen. Die Laufmit-telangaben beziehen sich aufprozentuale Mischungen mitAceton. (Mit freundlicherGenehmigung © Merck)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

-100 -50 0 50 100n-Hexan (-100), Aceton (0), Wasser (100)

RF

treW-

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

im linearen Bereich der Isotherme erhalten werden können. Symmetrische Peaksim Densitogramm zeigen an, dass im linearen Bereich der Isotherme gearbeitetwurde. Damit kann für den Fall symmetrischer Peaks immer eine Verteilungszahlfür das betreffende chromatographische System angegeben werden, egal, ob essich um eine Verteilungs- oder Adsorptionschromatographie handelt. Am bestendefiniert man die Verteilungszahl über die Substanzmassen, die sich jeweils in derstationären Phase (ms) oder der mobilen Phase (mm) befinden.

k D nS

nmD mS

mmD K

Vs

Vm(2.4)

Die Verteilungszahl k wird Kapazitätsfaktor genannt und ist mit dem Vertei-lungskoeffizienten über den Quotienten der Verteilungsvolumina verbunden.

2.4 Der Retentionsfaktor (Rf-Wert)

2.4.1 Der empirische Rf-Wert

Zur qualitativen Bewertung eines DC-Chromatogramms wird in der Regel der Rf-Wert (engl. retardation factor) benutzt. Er ist als Quotient aus der Entfernung vomStart zur Substanzzone und zur Fließmittelfront (zf) definiert. F. Goppelsröder warhistorisch gesehen der erste, der Rf-Werte (dt. Relation zur Front) zur Charakteri-sierung von Planartrennungen benutzte.

Rf � zs

zf � z0

(2.5)

zs Entfernung der Substanzzone von der Startlinie (mm)zf Entfernung der Fließmittelfront vom Eintauchspiegel (mm)z0 Entfernung zwischen Eintauchspiegel und Startlinie (mm)


Abb. 2.6 Berechnung vonRf-Werten Fließmittelfront

Startlinie

Eintauchspiegelz0

Probe

Standard

zSt

zSzF

Abbildung 2.6 zeigt ein Beispiel. Definitionsgemäß kann der Rf-Wert den Wert 1damit nicht überschreiten. In der Literatur wird, um das Komma zu vermeiden,dieser Wert häufig mit 100 multipliziert und dann als hRf-Wert bezeichnet. DieGröße des Retentionsfaktors hängt bei vorgegebener mobiler und stationärer Phase(und konstanter Temperatur) nur von den Eigenschaften der getrennten Substanzenab.

Die Rf-Werte in einem chromatographischen System sind substanzspezifischeMerkmale, die zur Identifizierung der abgetrennten Substanzen herangezogen wer-den können. In der DC ist es wichtig, dass Rf-Werte einwandfrei reproduzierbarsind. Das ist wegen der schlecht kontrollierbaren experimentellen Einflüsse auf dieTrennung nur schwer möglich.

Man umgeht dieses Problem durch die Angabe eines Retentionsfaktors (Rst), dersich auf eine im System mit abgetrennte Standardsubstanz bezieht.

Rst D zs

zst

zs Entfernung der Substanzzone vom Start (mm)zst Entfernung der Standardsubstanz vom Start (mm)

In der Regel werden geeignete Standardsubstanzen in den entsprechenden Hand-büchern (z. B. DAB) empfohlen.

2.4.2 Der thermodynamische Rf0-Wert

Während sich der empirische Rf-Wert nur aus dem Densitogramm ergibt, stellt derthermodynamische Rf

0-Wert (auch wahrer Rf-Wert genannt) einen Zusammenhangmit den Moleküldaten der getrennten Substanzen her. Der thermodynamische Rf

0-Wert ist definiert als der Bruchteil der Aufenthaltszeit eines Probemoleküls in der

2.4 Der Retentionsfaktor (Rf-Wert) 27

mobilen Phase (tm) im Verhältnis zur Gesamtzeit der Entwicklung (tms).

R0f D tm

tm C ts

Rf0-Wert thermodynamischer Rf-Wert

tm Aufenthaltszeit der Probemoleküle in der mobilen Phasets Aufenthaltszeit der Probemoleküle in der stationären Phase

Das Verhältnis zwischen den Massen der Moleküle in der mobilen und der statio-nären Phase ist zeitlich konstant, wie oben ausgeführt wurde. Damit gilt bei einemzeitlich konstanten Austausch der Moleküle zwischen stationärer und mobiler Pha-se für die Massen folgende Beziehung:

R0f D mm

mm C ms:

mm Masse der Probemoleküle in der mobilen Phasems Masse der Probemoleküle in der stationären Phase

Mit der Definition für die Konzentration (c = n / V = m / MV) kann man nach demKürzen durch die Molmasse M schreiben:

R0f D cmVm

cmVm C csVsD Vm

Vm C cscm

Vs:

cs,m Konzentrationen der Probe in der stationären bzw. der mobilen Phase (mol / l)Vs,m Verteilungsvolumen in der stationären bzw. mobilen Phase (l)

Wird die Formel für den Verteilungskoeffizienten in diese Gleichung eingesetztund durch das Volumen der mobilen Phase gekürzt, ergibt sich die sogenannte Mar-tin-Synge-Gleichung:

R0f D 1

1 C K VsVm

D 1

1 C k: (2.6)

K Verteilungskoeffizientk Kapazitätsfaktor

Die Abkürzung k ist mit dem oben eingeführten Kapazitätsfaktor identisch, dabei gleicher Molmasse das Verhältnis der Stoffmengen gleich dem Verhältnis derMassen ist. Die empirisch gemessenen Rf-Werte stimmen allerdings nur unter be-stimmten Bedingungen mit den thermodynamischen Rf

0-Werten überein. Eine Iden-tität ist gegeben,� wenn das Volumenverhältnis zwischen stationärer und mobiler Phase längs der

ganzen Schicht konstant ist,� wenn die Zusammensetzung der Phasen sich während der Entwicklung nicht

ändert,� wenn sich vor der Entwicklung noch keine mobile Phase in der stationären Phase

befindet und� wenn die Fließgeschwindigkeit der Front gleich der Fließgeschwindigkeit an der

Stelle des Fleckes ist.


Abb. 2.7 Dargestellt ist dieLaufmittelzusammenset-zung eines Gemisches ausEssigsäureethylester, Ben-zylalkohol und Mesitylen(18 : 1 : 1, V / V / V) auf ei-ner SiO2-HPTLC-Platte. DieKonzentration von Mesi-tylen liegt am Anfang derEntwicklung unter der vonBenzylalkohol

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60Trennstrecke (mm)

rel.

Inte

nsitä

tDiese Bedingungen sind in der Realität niemals erfüllt. Damit wird der beobach-

tete Rf-Wert immer etwas kleiner sein als der „wahre“ oder thermodynamische Rf0-

Wert. Für den beobachtbaren Rf-Wert werden in der Literatur Werte von 62 % bis100 % des thermodynamischen Rf

0-Wertes angegeben. Eine gute Näherung für denthermodynamischen Rf

0-Wert erhält man, wenn man den beobachteten Rf-Wert mitdem Durchschnittsfaktor 1,1 multipliziert. Im Weiteren wird der Rf-Wert benutzt,ohne eine Unterscheidung zwischen „gemessen“ oder „thermodynamisch“ zu ma-chen. Gemeint ist mit der Abkürzung „Rf“ immer ein korrekt gemessener Rf-Wert,der damit gleich dem thermodynamischen Wert ist.

2.5 Die Phasenzusammensetzung in der DC-Schicht

Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist in der Regel über die gesamte Trenn-strecke konstant. Am Start kann es allerdings Abweichungen geben, und fast immersind auch in Frontnähe Abweichungen von einer konstanten Phasenzusammenset-zung zu beobachten. Aussagekraft haben daher nur gemessene Rf-Werte im Bereichvon 0,1 bis etwa 0,9.

In Abb. 2.7 sind die gemessenen Verteilungen der Laufmittelbestandteile aufeiner Platte dargestellt. Das Laufmittel (oder Fließmittel) besteht aus unpolaremMesitylen (1,3,5-Trimethylbenzol) und polarem Benzylalkohol (im Gemisch mitEssigsäureethylester). Man erkennt bei 40 mm Trennstrecke einen steilen Front-gradienten aus Mesitylen. Die Erklärung des Befundes ist einfach. Der Anteil desMesitylens im Laufmittel ist größer als in der mobilen Phase. Die Differenz formtden Frontgradienten, denn der polare Benzylalkohol besetzt am Kieselgel bevorzugtdie Adsorptionszentren. Mesitylen wird vom Kieselgel weniger stark adsorbiert undkonzentriert sich während der chromatographischen Entwicklung vor der eigentli-chen Trennphase auf. Daraus folgt eine wichtige Erkenntnis:

I Die mobile Phase ist nicht mit dem Laufmittel (dem Fließmittel) identisch, sondernbildet sich während der Entwicklung durch Wechselwirkung zwischen Laufmittelund stationärer Phase aus!

2.5 Die Phasenzusammensetzung in der DC-Schicht 29

In Abb. 2.7 wird eine typische adsorptionschromatographische Normalphasen-entwicklung gezeigt. Damit ist gemeint, dass das Laufmittel in seiner Zusammen-setzung unpolarer ist als die stationäre Phase. Sehr unpolare Substanzen werden vondem unpolaren Frontgradienten mitgeführt, der hier fast nur aus Mesitylen besteht.So kommt es beim Trennen mitunter zu starken Frontsignalen, besonders wenn un-polare Probebestandteile im Frontgradienten mitlaufen. Dies ist oft erwünscht, umunpolare Begleitsubstanzen von der eigentlichen Zielsubstanz (des Analyten) ab-zutrennen. Natürlich werden die Begleitsubstanzen im Frontgradient untereinandernicht separiert, sondern zeigen ein gemeinsames Signal. In Abb. 2.7 ist erkennbar,dass bei einer Entwicklungshöhe von 40 mm die Benzylalkohol-Konzentration steilabfällt. Das eher flüchtige Mesitylen sammelt sich in der Front und diffundiert auchmerklich auf Plattenbereiche über die Entwicklungshöhe von 40 mm hinaus. Eineetwa konstante Fließmittelzusammensetzung ist bei dieser Entwicklung nur bis zueiner Trennstrecke von etwa 40 mm gegeben. In diesem Fließmittelgemisch sind Rf-Werte oberhalb von 0,85 nicht mehr aussagekräftig, da hier die Substanzen unge-trennt im Frontgradienten mitlaufen.

Der Abb. 2.7 kann auch entnommen werden, dass alle Substanzen mit Rf-Wer-ten < 0,85 von dem unpolaren Frontgradienten überlaufen wurden. Damit hat jedeSubstanz mit einer Laufhöhe von weniger als 40 mm eine gewisse Zeit im Front-gradienten zugebracht. In der Normalphasenchromatographie bremst die unpola-re Umgebung des überlaufenden Frontgradienten die „normale“ Wanderungsge-schwindigkeit der Probemoleküle. So erklärt sich, dass die gemessenen Rf-Werteetwas kleiner als die „richtigen“ thermodynamischen Rf

0-Werte sind.In Abb. 2.8 ist der typische Verlauf einer verteilungschromatographischen RP-

Trennung zu sehen. Die mobile Phase ist polarer als die stationäre Phase. Wie-der wurde ein Laufmittel, bestehend aus Mesitylen und Benzylalkohol (hier imGemisch mit Methanol), verwendet. Mesitylen läuft in diesem Trennsystem mitleicht fallendem Gradienten. Offensichtlich löst es sich in der stationären RP-18-Phase besser als Benzylalkohol und wird so weniger gut transportiert. Der Haupt-bestandteil des Laufmittels ist das relativ polare Methanol, das den Benzylalkoholund nicht das Mesitylen zu einem sehr breiten Frontgradienten aufschwemmt. Da-durch wird das Mesitylen an der Front verdrängt. Unter diesen Bedingungen laufenalle polaren Substanzen der Probe ungetrennt im Frontgradienten mit. Das klei-ne Mesitylensignal vor der Front hat sich aus abgedampftem Mesitylen gebildet,das vor der wandernden Front kondensierte und bei der Entwicklung zusammen-geschoben wurde. Erkennbar ist auch eine Störung am Beginn der Trennstrecke.Der Anteil des Mesitylens im Fließmittel ist etwas niedriger als nach der Gleich-gewichtseinstellung mit der stationären Phase. Beim Einfließen der mobilen Phasein die DC-Schicht muss sich damit das neue Verteilungsgleichgewicht erst nochausbilden. So konzentriert sich Mesitylen auf den ersten Millimetern der statio-nären Phase auf, während sich Benzylalkohol abreichert. Nach etwa 5 mm hat sichdas neue Gleichgewicht zwischen den beiden Laufmittelbestandteilen eingestellt.Aus gutem Grund sollten Rf-Werte unterhalb von 0,1 zur Substanzcharakterisierungnicht verwendet werden.


Abb. 2.8 Dargestellt ist dieLaufmittelzusammensetzungeines Gemisches aus Me-thanol, Benzylalkohol undMesitylen (18 : 1 : 1, V / V / V)auf einer RP-18-HPTLC-Platte. Die Konzentration vonMesitylen liegt am Anfangder Entwicklung über der vonBenzylalkohol

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 10 20 30 40 50 60 70Trennstrecke (mm)

rel.

Inte

nsitä

t

2.6 Übertragung von DC-Trennungen auf HPLC-Säulen

Der Rf-Wert beschreibt die Wanderungsstrecke, die die Probemoleküle auf der DC-Platte zurücklegen. Wandern kann eine Substanz auf der Platte allerdings nur, wennsie sich in der mobilen Phase befindet; anderenfalls bleibt sie ortsgebunden. Besitzteine Substanz einen Rf-Wert von 0,2, dann muss sie sich 1 / 5 der Entwicklungszeitin der mobilen Phase und dementsprechend 4 / 5 der Wanderungszeit in der statio-nären Phase aufgehalten haben. Der Wert für den Kapazitätsfaktor k berechnet sichdamit zu k = 4. Um auf den Rf

0-Wert von 0,2 zu kommen, muss die oben eingeführteBeziehung zwischen dem Rf

0-Wert und dem Kapazitätsfaktor gelten.

R0f D 1

k C 1D tm

tm C ts

Der Rf0-Wert ist bei vorgegebener fester und flüssiger Phase eine substanzspezi-

fische Konstante. Damit haben Platten- und Säulentechnik in dem Kapazitätsfaktoreine gemeinsame Bezugsgröße. Es gilt:

k D ts

tmD 1 � R0

f

R0f

: (2.7)

Die Übertragung von Trennbedingungen aus der DC auf die HPLC bringt inder Praxis Vorteile, da mit der DC die Entwicklung einer Trennmethode schnellerund preisgünstiger als mit der HPLC durchgeführt werden kann. Voraussetzung füreine Übertragung von der DC auf die Säulenchromatographie ist, dass die Vertei-lungskoeffizienten in beiden Systemen identisch sind. Dies ist dann der Fall, wenndie gleichen stationären und mobilen Phasen benutzt werden. Die Martin-Synge-Gleichung (2.6) nach dem Verteilungskoeffizienten aufgelöst, ergibt folgenden Aus-druck:

K D 1 � R0f

R0f

Vm

Vs: (2.8)

2.7 Der Rm-Wert 31

Werden die Verteilungskoeffizienten von DC und HPLC gleichgesetzt, und wirdfür das Volumen der stationären Phase VS das Gewicht W eingesetzt, ergibt sichfolgende Beziehung zwischen DC- und HPLC-Trennung:

�Vm

W

1 � R0f

R0f

�HPLC

D�

Vm

Wk

�HPLC

D�

Vm

W

1 � R0f

R0f

�DC

:

Der Rf0-Wert einer Säule ist im Gegensatz zum Rf

0-Wert in der DC eine Grö-ße, die man sich schlecht vorstellen kann. Aus der umgewandelten Martin-Synge-Gleichung folgt aber, dass der Quotient der Rf

0-Werte im HPLC-Teil der Gleichunggleich dem Kapazitätsfaktor der Säulenchromatographie ist. Wird durch Vm / W ge-teilt, folgt:

kHPLC D fVm=W gDC

fVm=W gHPLC

1 � R0f

R0f

:

Durch Auswiegen der stationären Phase und der Volumenbestimmung der mobi-len Phase kann über den gemessenen Rf

0-Wert der DC-Entwicklung auf den Kapa-zitätsfaktor der HPLC-Trennung geschlossen werden. Am einfachsten ist natürlichdie direkte Bestimmung des Doppelbruchs. Man vergleicht dazu eine DC-Entwick-lung mit einer HPLC-Trennung. Der gemessene Kapazitätsfaktor der HPLC-Tren-nung und der Rf

0-Wert der DC werden in die Bestimmungsgleichung eingesetzt undnach dem Gewichtsverhältnis der Phasen aufgelöst. So brauchen die Phasenmengenaus dem Doppelbruch nicht einzeln bestimmt zu werden [13].

2.7 Der Rm-Wert

Der thermodynamische Rf0-Wert steht in keiner linearen Beziehung zu den struk-

turellen Größen eines Moleküls. Eine lineare Korrelation mit strukturellen Mole-külgrößen ist jedoch dann gegeben, wenn statt des Rf

0-Wertes ein logarithmischerAusdruck benutzt wird. Dieser sogenannte Rm-Wert wurde 1950 von E. C. Beate-Smith und R. G. Westall [14] eingeführt.

Rm D lg�

1

R0f

� 1

�D lg k (2.9)

Mit dem Ausdruck für den Rm-Wert und der eingesetzten Martin-Synge-Glei-chung (2.8) lässt sich schreiben:

Rm D lgVs

VmC lg K : (2.10)

Durch Einsetzen der Gleichung ��0 D RT ln K D 2;3RT lg K für das chemi-sche Potenzial folgt die wichtige Martin-Beziehung:

Rm D lgVs

VmC ��0

2;3RT: (2.11)


-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1 2 3 4 5 6 7

Rm-W

erte

Anzahl der C-Atome

H-(CH2)nCOOH

HOOC-(CH2)n-COOH

H-(CH2)n-CHNH2COOH

Abb. 2.9 Rm-Werte aliphatischer Carbonsäuren [15]

Das chemische Potenzial ��0 setzt sich aus den freien Teilenthalpien der un-terschiedlichen funktionellen Gruppen im Molekül zusammen. Es beschreibt dieDifferenz der freien Energie des Phasenübergangs eines Mols einer gelösten Sub-stanz unter Standardbedingungen. Die Martin-Beziehung beruht auf thermodyna-mischen Überlegungen und gilt damit auch für die Adsorptionschromatographie.A. J. P. Martin erklärte mit dieser Gleichung die bemerkenswerte Trennleistung derChromatographie. Unterscheiden sich zwei Moleküle nur leicht in einem Struktur-element, ist der Unterschied im chemischen Potenzial proportional zur chemischenPotenzialänderung dieser Strukturdifferenz. Das erklärt, warum auch große Mole-küle mit nur kleinen Strukturunterschieden getrennt werden können, denn wichtigfür die Trennung ist die einzelne Strukturdifferenz und nicht der relative, auf dasgesamte Molekül bezogene Unterschied [7].

Die Martin-Gleichung kann als Grundlage für eine chromatographische Struk-turaufklärung dienen. Im Idealfall setzt sich das chemische Potenzial einer Substanzadditiv aus den Teilbeiträgen der Strukturelemente (Atome, funktionelle Gruppen,Bindungen) zusammen. Die Rm-Werte von Substanzen aus homologen Reihen sinddamit als Vielfache des Rm-Wertes der Grundstruktur berechenbar (Abb. 2.9). Kenntman die Rm-Werte einiger Reihenmitglieder, kann der Rm-Wert eines neuen Reihen-moleküls berechnet, oder es kann aus gemessenen Rm-Werten die Struktur abgelei-tet werden.

2.8 Die Temperaturabhängigkeit von DC-Trennungen

Der Einfluss der Temperatur auf eine DC-Entwicklung ist gering im Vergleich zuanderen Einflüssen. So ändert sich mit der Temperatur zuerst das Verhalten dermobilen Phase, insbesondere die Mischungseigenschaften ihrer Bestandteile. Auchdie Löslichkeit der Probe in den Verteilungsphasen ist temperaturabhängig. Aus

2.9 Das allgemeine Chromatographiegesetz 33

gutem Grund wird daher immer von Isothermen gesprochen, wenn von Verteilungs-gleichgewichten die Rede ist. Auch das Abdampfverhalten flüchtiger Bestandteileaus der mobilen Phase, ebenso wie die Viskosität, ändert sich mit der Tempera-tur. In der Adsorptionschromatographie spielt außerdem der temperaturabhängigeWassergehalt der Luft eine wichtige Rolle. Der allgemein bekannte Befund, dassadsorptionschromatographische DC-Trennungen in gemäßigten Klimazonen sta-bil laufen, in den Tropen oder an heißen Sommertagen aber total versagen, kannauf den geänderten Wassergehalt der Luft zurückgeführt werden. Dies ist letztend-lich auch ein Temperatureffekt. Alle diese temperaturabhängigen Einflüsse laufenteilweise gegeneinander und machen die Vorhersage von Temperatureffekten fastunmöglich.

Die Martin-Beziehung verknüpft Temperatur und Rm-Wert in einer Gleichung.Der Rm-Wert steigt danach mit fallender Temperatur. Damit sollten auch die Rf-Werte bei fallender Temperatur steigen. Experimentell gilt dies aber nur bei ei-ner konstanten Absolutfeuchte in der Gasphase [6]. Arbeitet man bei konstanterRelativfeuchte, steigen die beobachteten Rf-Werte an. Daraus folgt: Je höher dieTemperatur, desto niedriger ist die Aktivität der stationären Phase. Bei höherenTemperaturen sinkt außerdem die Viskosität der mobilen Phase, und damit steigtdie Geschwindigkeitskonstante. Dieser Effekt macht sich durch stärkeres Ausein-anderfließen der Probemoleküle bemerkbar. Damit werden größere Substanzfleckebeobachtet. Es ist also in keinem Fall sinnvoll, DC-Trennungen bei erhöhten Tem-peraturen durchzuführen. Im Gegenteil, einige Trennungen gelingen nur bei tiefenTemperaturen. Die DIN-Norm zur polyaromatischen Kohlenwasserstoff-Trennung(PAK-Trennung) mittels DC fordert z. B. die Entwicklung bei �20 °C [16, 17]. Zu-sammenfassend kann allerdings festgestellt werden, dass Temperaturänderungenim Bereich von ˙ 10 °C nur geringe bis keine Änderungen in der Trennung ver-ursachen, vorausgesetzt, der Wassergehalt im System wird konstant gehalten. EineTemperierung von DC-Trennungen ist in der Praxis daher nicht nötig.

2.9 Das allgemeine Chromatographiegesetz

Die fundamentalen Prozesse, die den Ablauf einer chromatographischen Trennungbestimmen, können aus thermodynamischen und kinetischen Betrachtungen abge-leitet werden. Thermodynamische Beziehungen sind für das Retentionsverhaltenund für die später noch zu diskutierende Selektivität verantwortlich. Dem gegenüberbeschreiben kinetische Beziehungen die Signalverbreiterung während der Tren-nung [18].

Alle Chromatographieverfahren benutzen einen Phasenübergang zur Stofftren-nung. In der DC z. B. verteilt sich die Probe zwischen einer stationären und einermobilen Phase. Dieses Modell gilt streng genommen nur für die Verteilungschro-matographie, aber mit der Annahme, dass sich adsorbierte Substanzen in der sta-tionären Phase „lösen“, können damit auch adsorptions- und ionenchromatographi-sche Trennungen beschrieben werden. So ist der Vorgang der chromatographischenTrennung mit dem Ausschütteln in einem Schütteltrichter vergleichbar, nur dass


sich im Laufe einer chromatographischen Entwicklung das Gleichgewicht zwischenstationärer und mobiler Phase sehr häufig einstellt. Es wird also sehr oft „aus-geschüttelt“. Im Unterschied zum Schütteltrichter bewegt sich die mobile Phasewährend einer chromatographischen Entwicklung durch die stationäre Phase. Diezu trennende Substanz (der Analyt) wird dabei permanent zwischen beiden Phasenverteilt, aber nur fortbewegt, wenn sie sich in der mobilen Phase befindet. Eine Si-mulation dieser Vorgänge auf die DC übertragen, führt zu dem Ergebnis, dass sichdie Probemoleküle in Form einer Binomialverteilung über die DC-Platte bewegen,was im Folgenden begründet werden soll.

Angenommen, es wird die Stoffmenge n einer Substanz auf eine DC-Platte auf-getragen. Vor der Zugabe der mobilen Phase ist damit die gesamte Stoffmenge amAuftrageort konzentriert, und die mobile Phase hat noch keinen Kontakt mit denProbemolekülen. Schematisch wird dieser Zustand durch folgenden Bruch darge-stellt: �

0

n

�D nmobile Phase

nstationäre PhaseD n.� C ˇ/0 :

Der Zähler soll die mobile Phase und der Nenner die stationäre Phase repräsen-tieren. Die Bedeutung der Hilfsausdrücke � und ˇ wird weiter unten erklärt.

Zwischen beiden Phasen hat sich ein Gleichgewicht noch nicht eingestellt, denndie gesamte Stoffmenge n befindet sich vollständig in der stationären Phase. NachZugabe von mobiler Phase verteilen sich die Probemoleküle der Stoffmenge n ent-sprechend des Kapazitätsfaktors auf die beiden Phasen. Dabei soll ns für die Stoff-menge stehen, die in der stationären Phase verbleibt, und nm bezeichnet die Stoff-menge, die in die mobile Phase wechselt. Für die Stoffmenge in der stationärenPhase gilt entsprechend (2.4) der Ausdruck:

ns D knm :

Da Probemoleküle nicht verloren gehen sollen und auch nicht in der zugeführtenmobilen Phase enthalten sein dürfen, muss ebenfalls gelten:

n D ns C nm :

Wird die obere Gleichung in die untere eingesetzt, führt dies zu dem Ausdruck

n D nm.k C 1/

und weiter, wenn nach nm aufgelöst wird, zu:

nm D 1

.k C 1/n � ˇn :

Von der aufgetragenen Stoffmenge n wird der Anteil ˇ in die mobile Phase wan-dern. Für den Anteil der Stoffmenge n, der in der stationären Phase verbleibt, giltentsprechend:

ns D knm D k

.k C 1/n � �n :


In der stationären Phase verbleibt der immobile Probeanteil �n. Die beiden ein-geführten Hilfsgrößen ermöglichen eine kürzere Beschreibung der Vorgänge. Nachihrer Definition wechselt der Anteil ˇ die Phase, während der Anteil � bleibt.Dementsprechend gilt: ˇ + � = 1.

Im nächsten Schritt fließt vom Anfang der DC-Platte her frische, mobile Phasenach und verschiebt den Anteil nˇ auf einen sauberen Plattenbereich. Der Anteiln� ist in der stationären Phase „fixiert“ und wird nicht verschoben. Damit kann dieSituation nach der ersten Gleichgewichtseinstellung wie folgt dargestellt werden:

�0

n�C nˇ

0

�D nmobile Phase


Die Stoffmengen in diesen zwei Plattenbereichen (Kompartimenten) werden sichbei der nächsten Gleichgewichtseinstellung wieder, entsprechend ihres Kapazitäts-faktors, auf die mobile und die stationäre Phase verteilen. Von der am Auftrageortverbliebenen Substanzmenge n� wird der Anteil ˇ in die mobile Phase wandern(also ˇn�), während sich der Anteil � von n� (also �n�) nicht bewegt. Aus derStoffmenge nˇ der mobilen Phase im zweiten Kompartiment wird sich der Anteil �

auf die unbenutzte stationäre Phase niederschlagen (also �nˇ), während der Anteilˇ von nˇ in der mobilen Phase verbleibt. Nun wird erneut saubere mobile Phasenachgeschoben. Es zeigt sich folgendes Bild:

�0

�n�C ˇn�

�nˇC ˇnˇ

0

�D nmobile Phase


Werden die einzelnen Teilstoffmengen der stationären und mobilen Phase auf-addiert, folgt für die drei hier betrachteten Gleichgewichtseinstellungen jeweils deram Ende der Formeln angegebene Binomialausdruck. Dieser ist von der Anzahlder Gleichgewichtseinstellungen abhängig. Für x Gleichgewichtseinstellungen er-gibt sich der Ausdruck n.ˇC�/x . Diese Formel beschreibt eine Binomialverteilung.Substanzen wandern in Form einer Binomialverteilung über die DC-Platte.

Interessant ist die Form der Substanzverteilung nach sehr vielen Gleichgewicht-seinstellungen. Berechenbar ist sie, wenn man die oben vorgestellte Betrachtungweiterführt, aber dann werden die Ausdrücke sehr schnell sehr unübersichtlich.Für kleine Kapazitätsfaktoren (k � 1) und für eine unendliche Anzahl an Gleich-gewichtseinstellungen geht die Binomialverteilung in eine Gauß-Verteilung über.Dabei ergibt sich folgender Ausdruck:

f .x/ D n1p

2 x�ˇe� .z�x�/2

2x�ˇ : (2.12)

Es wird oft davon gesprochen, dass Substanzen sich gaußförmig über die DC-Platte bewegen. Diese Aussage ist nicht ganz richtig, denn natürlich können sichauf keiner noch so großen DC-Platte unendlich viele Gleichgewichtseinstellungenabspielen. Die Gauß-Funktion ist jedoch eine ausreichend gute Beschreibung der


Abb. 2.10 Dargestellt ist dieVerteilung einer konstantenMenge Coffein auf einer DC-Platte nach unterschiedlichenTrennstrecken

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Trennstrecke (mm)(1

-R)/R

experimentell erhaltenen Chromatographiesignale und soll hier weiter benutzt wer-den. Die Verteilung der Substanzmenge n als Gauß-Verteilung, durch Mittelwertund Varianz dargestellt, ist folgendermaßen definiert.

f .x/ D n1

p

2 e� .x�zS/2

2�2

Wenn zS den Weg beschreibt, den die Probesubstanz auf der DC-Platte zurück-gelegt hat, wird bei x = zS die e-Funktion 1, und die Gauß-Funktion erreicht ihremaximale Höhe von f .zS/ D .1=

p2 / � 1. Der Wert zS eines Probesignals muss

also dort abgelesen werden, wo das Signal seinen größten Wert hat.Die Breite einer Gauß-Verteilung ist als Abstand zwischen dem Signalmittel

und den Wendepunkten definiert. Dieses Breitenmaß wird als Standardabweichungdes Signalpeaks bezeichnet. Das Quadrat der Standardabweichung wird Varianz(2) genannt.

In Abb. 2.10 ist die Verteilung einer konstanten Coffeinmenge nach unterschied-lichen Trennstrecken dargestellt. Das Coffein wurde auf die Platte aufgebracht,vermessen (erstes, sehr schmales Signal), dann eine kurze Strecke entwickelt underneut vermessen. Dieser Vorgang wurde neunmal wiederholt. Man erkennt, dassdie Breite der Coffeinsignale mit jedem Entwicklungsschritt vergrößert wird. Teiltman nun das Quadrat der Probeweglänge (zS) durch die Varianz, erhält man einekonstante Zahl.

z2S

2S

D .x�/2

x�ˇD x

�

ˇD xk � N 0 (2.13)

Das Produkt aus dem Kapazitätsfaktor (k) und der Anzahl der durchgeführtenVerteilungsschritte (x) repräsentiert sowohl die Effektivität als auch die Trennstre-cke (bzw. die Trenndauer) einer DC-Entwicklung. Dieses Produkt aus Effizienz undTrennlänge nennt man die „Anzahl theoretischer Trennstufen“ und kürzt mit N0 ab.Wird die Beziehung nach der Standardabweichung der Signale aufgelöst, ergibt


sich folgende Gleichung:

S D 1pN 0 zS (2.14)

S StandardabweichungzS Trennstrecke der SubstanzN0 Anzahl theoretischer Trennstufen

Gleichung 2.14 wird wegen ihrer großen Bedeutung auch als allgemeines Chro-matographiegesetz bezeichnet. Der Ausdruck besagt, dass mit höherer LauflängezS die Peakbreite (2S) eines Signals zunimmt. Dies genau zeigt das in Abb. 2.10dargestellte Experiment! Daraus folgt, dass auch bei unendlich großer Trennstreckenicht beliebig viele Substanzen aufgetrennt werden können.

Der Ausdruck „theoretische Trennböden“ in der Säulenchromatographie beziehtsich auf die Trennstrecke, die eine Substanz zurücklegt. Die Anzahl der theoreti-schen Trennböden kann in der Säulenchromatographie direkt aus einem Chroma-togramm berechnet werden, weil die Substanzen einer Säulentrennung zwar unter-schiedliche Wanderungszeiten zeigen, aber im Gegensatz zur DC alle die gleicheTrennstrecke durchlaufen. Bei einer DC-Trennung legen aber nicht alle Substanzendie gleiche Trennstrecke zurück. Daher wird in der Dünnschichtchromatographiedie reale Trennstufenzahl N noch um einen mittleren Rf-Wert korrigiert.

N 0 D NRf bzw. N D N 0

Rf(2.15)

Wird der Wert der Basispeakbreite des Gauß-Peaks mit w = 4 (genauer w =2 � 1,96 ) eingesetzt, gilt folgende wichtige Beziehung.

N 0 D�

zS

S

�2

D 16

�zS

wB

�2

(2.16)

N0 Anzahl theoretischer TrennstufenzS Trennstrecke der SubstanzwB Basispeakbreite = 4

N0 beschreibt die theoretische Trennstufenzahl einer DC-Platte, auf der jedegetrennte Substanz die gleiche Trennstrecke zurückgelegt hätte. Die Anzahl der(realen) Trennstufen N ist für alle DC-Signale eine Konstante und beschreibt diemessbare Effizienz des verwendeten Trennsystems. N repräsentiert das Produkt ausder Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen bei unterschiedlichen Trennstrecken[6, 11].

N D 1

Rf

�zS

S

�2

D 16zS.zf � z0/

w2B

(2.17)

N Anzahl (realer) TrennstufenS Standardabweichung der SubstanzwB Basispeakbreite der Substanz = 4S


Abb. 2.11 Densitogrammeiner Trennung von sechsFarbstoffen aus dem CA-MAG-Farbstoffgemisch III(aufgenommen bei 250 nm)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20 25 30 35Trennstrecke (mm)

-log(

R) (

250

nm)

z6

z4

z5

z3z2

z1

z0zf

Bleibt eine Substanz am Auftrageort liegen ohne zu wandern, ist ihre Trennstre-cke gleich null. Läuft eine Substanz mit der Front, findet keine Wechselwirkung mitder stationären Phase statt. Die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen ist eben-falls null. In beiden Fällen wird für N bzw. N0 der Wert null erhalten. Es findetkeine Abtrennung von anderen Substanzen statt. Nur wenn eine Substanz einen Rf-Wert im Bereich von 0 < Rf < 1 zeigt, ist der Wert für N ungleich null. Nur in diesenFall, wenn die Trennleistung des Systems ungleich null ist, findet eine chromato-graphische Trennung statt.

In Abb. 2.11 ist die Auftrennung von sechs Farbstoffen gezeigt. Man sieht hiersehr schön, wie mit höherer Lauflänge zS die Peakbreite der Signale zunimmt.

Aus dem Densitogramm können die Basispeakbreiten und die Laufstrecken ent-nommen und über (2.16) in Trennstufen umgerechnet werden (siehe Abb. 2.12).Unterschiedliche Trennsysteme sind so in ihrer Leistungsfähigkeit miteinander ver-gleichbar. In der DC/HPTLC werden Trennstufen von bis zu 5000 erreicht. Für dieHPLC sind Werte von bis zu 300.000 theoretische Trennböden beschrieben wor-den [6].

Oft wird zur Beschreibung eines chromatographischen Signals nicht die Basis-peakbreite, sondern die Bereite bei halber Höhe benutzt. Die Höhe eines Gauß-Peaks ist durch den Vorfaktor der e-Funktion (1=

p2 ) beschrieben. Der maxi-

male Funktionswert der Gauß-Funktion bei halber Höhe HP / 2 ist durch folgendeGleichung gegeben:

HP

2D 1

2p

2 D 1

p

2 e� .x/2

2�2 :

Damit kann gekürzt werden und es folgt

2 D e.x/2

2�2 und weiter: ln 2 D .x/2

22:

2.10 Trennung und Signalauflösung 39

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20 25 30 35

Trennstrecke (mm)

-log(

R) (

475

nm)

4σ

2σ

W½=2,354 σ 0,500

0,607

1,000

1σ 0,882

0,1344σ

Abb. 2.12 Dargestellt ist das Gauß-Signal des sechsten Farbstoffes einer Trennung des CAMAG-Farbstoffgemisches III (aufgenommen bei 475 nm)

Die Peakbreite bei halber Höhe WH läuft von � x bis + x. Damit wird WH1/2 = 2x,und es folgt in den logarithmischen Ausdruck eingesetzt die Gleichung:

W 2H D 82 ln 2 D 5;5452 : (2.18)

Das Chromatographiegesetz kann so auch in der folgenden Form angegeben wer-den:

N D 5;545zS.zf � z0/

W 2H

: (2.19)

Zusammengefasst wird die Anzahl der theoretischen Böden als Maßstab für dieQualität einer DC-Trennung benutzt. Je größer der Wert von N bzw. N0 eines Chro-matographiesystems ist, umso leistungsfähiger ist es.

2.10 Trennung und Signalauflösung

Was bedeutet es nun, eine Trennung zu optimieren? Man möchte natürlich denAnalyten oder auch mehrere Substanzen von allen anderen Bestandteilen der Probeabtrennen, damit ihre Quantifizierung ohne Störung möglich wird. Dazu muss daschromatographische System so gewählt werden, dass sich die Rf-Werte der einzel-nen Substanzen genügend unterscheiden.

In der Dünnschichtchromatographie wird die Trennung nach einer bestimmtenZeit abgebrochen, ohne dass die Substanzen, wie in der Säulenchromatographie üb-lich, die stationäre Phase verlassen hätten. Sie liegen vielmehr nebeneinander in derstationären Phase vor und beanspruchen den Platz ihrer Fleckgröße auf der Platte.Die Substanzverteilung im Fleck kann dabei, wie oben ausgeführt, näherungsweiseals Gauß-Funktion angenommen werden. Die Fläche der Gauß-Verteilung ist pro-portional zu der im Fleck enthaltenen Substanzmenge. Die Basissignalbreite (wB)


Abb. 2.13 Trennung benach-barter Signale im Abstandvon 4

60.7 %2σ

z1

z2

Trennstrecke (mm)

100 %

Peakhöhe

der Verteilung ist ein Maß für den beanspruchten Platz. Sie berechnet sich für eineeinzelne Substanz mit der Laufstrecke zS nach dem Chromatographiegesetz zu:

wB D 4pNRf

zS : (2.20)

Man definiert die Auflösung zweier benachbarter Flecke als 100 % (RS � 1),wenn ihre Signalmaxima genau den Abstand der Basissignalbreite zeigen. Die Auf-lösung RS zweier benachbarter Gauß-Kurven (zweier Peaks) ist damit durch denQuotienten aus der Differenz der beiden Signalmaxima (zS1 und zS2) und dem arith-metischen Mittel der beiden Basissignalbreiten (wB1 und wB2) definiert.

RS � zS2 � zS1

wB1CwB2

2

D 2zS2 � zS1

wB1 C wB2

D zS2 � zS1

2.1 C 2/:

Für RS = 0,5 beträgt der Abstand der Signalmaxima 1 + 2 � 2 . Man nenntdies auch eine „2 -Trennung“. Die beiden Signale überlappen sich an der Basisnoch stark, doch erkennt man in jedem Fall zwei Komponenten. Die Überlappungs-fläche liegt bei etwa 20 %. Bei einer Auflösung von RS = 1 sind die Signale fastvollständig voneinander getrennt. Die Flächen der Signale überlappen sich nur zu3 %. Diese Auflösung entspricht einer 4 -Trennung (Abb. 2.13).

Eine Auflösung von RS = 1,25 ist für die quantitative Bestimmung zweier Sub-stanzen völlig ausreichend. Größere Auflösungen als 1,5 sind für eine Quantifizie-rung nicht nötig, denn dann ist die Überlappung beider Signale kleiner als 0,3 %.Dies gilt natürlich nur für symmetrische Gauß-Signale. Beim Fronting oder Tailingvon Signalen ist für eine sichere Quantifizierung oft eine 10 -Trennung nötig. Diesentspricht einer Auflösung von RS = 2,5.

Mit der Definition des Rf-Wertes zS D Rf.zf � z0/ und der Vereinfachung 1 �2 � wird der Ausdruck für die Auflösung zu:

RS D .Rf2 � Rf1/.zf � z0/

4:

2.10 Trennung und Signalauflösung 41

Mit .zf � z0/ D zS1

Rf1und dem Einsetzen des Chromatographiegesetzes folgt:

RS D .Rf2 � Rf1/

Rf1

zS1

4D�

Rf2

Rf1� 1

�1

4

pNRf :

Der Wert von Rf berechnet sich aus dem Mittelwert von Rf1 und Rf2, da mit derVereinfachung 1 � 2 � gearbeitet wird.

Mit dem Ausdruck Rf D 1=.1 C k/ folgt:

RS D 1

4

pNRf.k1 � k2/Rf2

D 1

4

pNRf

.k1 � k2/

k2

k2Rf2 :

Mit der Gleichung für den Kapazitätsfaktor der zweiten Substanz k2 D .1 �Rf2/=Rf2 wird der Snyder’sche Ausdruck für die DC-Auflösung erhalten.

RS D 14

pNRf .1 � Rf2/

�k1

k2� 1

�a b c

(2.21)

Diese Gleichung ist der Schlüssel zum Verständnis grundlegender chromato-graphischer Zusammenhänge. Nach der Snyder-Gleichung wird die Auflösung RS

zweier Substanzen von drei Faktoren beeinflusst:a) Der erste Term in der Snyder-Gleichung beschreibt die Schichtqualität der

DC-Platte. Die Schichtgüte wird durch die theoretische Trennstufenzahl NRf

charakterisiert. Der Term beschreibt die durch Fleckdiffusion verursachte Re-duktion der Signalauflösung. Die Auflösung kann durch eine Erhöhung derTrennstufenzahl verbessert werden. Allerdings wächst die Auflösung nur pro-portional mit der Wurzel aus NRf. Damit verlieren die großen Trennstufen-zahlen der GC und der HPLC viel von ihrer imponierenden Größe, denn sietragen nur wurzelgedämpft zur Auflösung bei [6]. Die Auflösung zweier Si-gnale steigt mit der Größe des Rf-Wertes an, weil die Trennlänge ja mit demRf-Wert steigt. Je länger die Trennstrecke ist, umso besser ist die Auflösung.Zusammengefasst beschreibt der Wurzel-Term die „Physik“ der Trennung.

b) Der zweite Term in (2.21) läuft gegensinnig zum ersten. Je größer der Rf-Wertist, umso schlechter wird die Auflösung. Der Grund ist, dass sich Substanzenmit zunehmenden Rf-Werten länger in der mobilen Phase aufhalten, und des-halb immer weniger mit der stationären Phase wechselwirken. Die trennendeKraft eines Chromatographieprozesses hängt aber gerade von diesem Phasen-austausch ab. Alle Substanzen, die im Frontgradienten mitlaufen und damiteinen Rf-Wert von Rf = 1 haben, zeigen eine Auflösung von RS = 0, werden al-so nicht aufgetrennt.

c) Der Selektivitätsterm hängt über die Kapazitätsfaktoren von den beiden Ver-teilungskoeffizienten ab. Je unterschiedlicher diese beiden Koeffizienten sind,


Abb. 2.14 Gezeigt ist dieeffektive Trennstufenzahl inAbhängigkeit verschiede-ner Rf-Werte mit N0 = 6751.(Nach [21])

0

200

400

600

800

1000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

NQ

2

Rf -Werte

umso größer ist die Selektivität der Trennung und umso besser wird die Auf-lösung. Im Selektivitätsterm sind damit die Charakteristika der verwendetenTrennphasen zusammengefasst. Dieser Term beschreibt die „Chemie“ derTrennung.

Gleichung (2.21) kann auch etwas anders gedeutet werden. Die ersten beidenTerme (a und b) beschreiben die „potenzielle Auflösung“ des Systems Dünn-schichtplatte. Sie ist allgemein ein Maß für die örtlich variable Trennleistung, dieein bestimmtes chromatographisches System an einer bestimmten Stelle der Trenn-strecke besitzt. Daraus wird die tatsächliche Auflösung RS eines Substanzpaaresberechnet, indem man die Terme a und b mit dem Term c multipliziert [6]. Wirddie Abkürzung Q2 = Rf(1 � Rf2)2 gewählt [6], können die beiden Terme a und b aus(2.21) auch folgendermaßen geschrieben werden.

NQ2 Dhp

NRf.1 � Rf2/i2 D NRf.1 � Rf2/2

Das Produkt NQ2, das dem Quadrat der Auflösung proportional ist, nennt mandie „effektive Trennstufenzahl“.

Wird für Rf2 der Kapazitätsfaktor eingesetzt, kann die Gleichung auch folgen-dermaßen formuliert werden:

NQ2 D NRf

�1 � 1

1 C k2

�2

D N 0�

k2

1 C k2

�2

: (2.22)

In Abb. 2.14 ist die effektive Trennstufenzahl NQ2 graphisch gegen den Rf-Wertaufgetragen.

Die beste potenzielle Auflösung erhält man nach Abb. 2.14 für Rf-Werte um 0,33.Ausreichende Trennungen werden nur im Rf-Bereich von 0,1 bis etwa 0,9 erreicht.Bei kritischen Trennungen sollte das System so eingestellt werden, dass ein kriti-sches Substanzpaar um den Wert Rf = 0,33 läuft. In der DC wie auch in der HPLC istes äußerst schwierig, durch eine Optimierung der Platten- oder Säulenqualität denAusdruck

pN um einen Faktor von mehr als 2–3 zu vergrößern. Die Selektivität

(k1 / k2 � 1) kann dagegen durch geschickte Wahl des Fließmittels (und geschickte

2.11 Die Signalverbreiterung in der DC 43

Wahl der stationären Phase) leicht um den Faktor 10 bis 50 gesteigert werden. ZurVerbesserung der Auflösung ist es daher am effektivsten, das Laufmittel zu einervorgegebenen stationären Phase zu optimieren [6].

Zusammengefasst wird die Güte einer Trennung nicht alleine durch die Anzahlder Trennböden bestimmt, sondern auch durch die geschickte Wahl der mobilenund der stationären Phase. Wenn man die Art der beiden Phasen von vornher-ein festlegt, wie dies in der Reversed-phase-HPLC (RP-HPLC) geschieht, kannzur Verbesserung der Auflösung nur die Säule optimiert werden. Zu glauben, einChromatographiesystem sei gut, nur weil es wegen seiner großen Anzahl an theo-retischen Böden viele Substanzen potenziell trennen kann, läuft am Verständnis derSnyder-Gleichung vorbei. Ein hochselektives Trennsystem für wenige oder im Ex-tremfall für nur eine Substanz ist auf jeden Fall einer Methode vorzuziehen, dieviele Substanzen unselektiv trennt, ein kritisches Paar aber eventuell nicht genü-gend auflöst.

2.11 Die Signalverbreiterung in der DC

Wir können drei verschiedene Diffusionsprozesse unterscheiden, die in der DC zurZonenverbreiterung beitragen. Diese drei verschiedenen Ausdrücke werden als A-,B- oder C-Term bezeichnet [6, 20, 22–30].

2.11.1 Der A-Term

Der A-Term wird durch die Homogenität der DC-Schicht bestimmt. Diese wieder-um hängt von der Veränderung der lokalen Packungsdichte, der Partikelverteilung,der Partikelgröße und deren Form sowie von Plattenzumischungen wie Binder oderFluoreszenzindikatoren ab. Eine heterogen aufgebaute stationäre Phase verursachteinen heterogenen Laufmittelfluss. Das Laufmittel fließt langsamer durch das Po-rensystem der Partikel als um die Partikel herum [6]. Diesen Effekt nennt man Eddy-Diffusion, und er ist direkt proportional zum Partikeldurchmesser. G. Guiochon andA. Siouffi übertrugen dieses Modell auf die DC. Sie benutzten auch die sogenannteKnox-Konstante A, um die Packungsqualität der Trennschicht zu beschreiben [6].

2xA D A

3

qdp

4

3p

DmRft

dp PartikeldurchmesserDm Diffusionskoeffizient in der mobilen Phase (cm2 s�1)t Wanderungszeit (Aufenthaltszeit in der mobilen Phase) (s)A Knox-Konstante


2.11.2 Der B-Term

Während der chromatographischen Entwicklung diffundieren die Probemoleküle inder mobilen Phase in alle Richtungen. Nach der Einstein’schen Diffusionsgleichungverbreitert sich die Substanzzone mit der Zeit entsprechend ihres Diffusionskoeffi-zienten. Für die Zonenverbreiterung der Probemoleküle in der mobilen Phase, alsVarianz 2 ausgedrückt, gilt:

2 D 2Dmt :

Dm Diffusionskoeffizient in der mobilen Phase (cm2 s�1)t Wanderungszeit (s)

Die longitudinale Fleckverbreiterung ( x), also die Zonenverbreiterung in Fließ-richtung, berechnet sich aus der Zonenverbreiterung der Moleküldiffusion, kor-rigiert um den Anteil des Retentionsfaktors (der für die Zeit steht, die sich dieProbemoleküle in der mobilen Phase aufhalten). Der Labyrinthfaktor (m) berück-sichtigt, dass die Diffusion der mobilen Phase durch eine unregelmäßig aufgebautePackung nicht gradlinig, sondern gewunden erfolgt.

2x D 2DmmRft D BDmRft

x longitudinale Fleckverbreiterungm Labyrinthfaktor (mobile Phase)t Wanderungszeit (s)B Knox-Konstante

Für die transversale Standardabweichung v quer zur Fließrichtung gilt Ähnli-ches.

Bei einer Verteilungschromatographie kommt zur longitudinalen Zonenverbrei-terung noch ein weiterer Beitrag hinzu [20, 22–27]. Befindet sich ein Probemolekülin der stationären (flüssigen) Phase, berücksichtigen die Diffusionskonstante (Ds)und der Labyrinthfaktor der stationären Phase (s) den verzögerten Stoffaustauschmit der mobilen Phase, denn das Molekül wird von der zerklüfteten stationären Pha-se abgeschirmt. Die longitudinale Varianz in der Verteilungschromatographie lässtsich folgendermaßen ausdrücken [28].

2x D 2

�mDm C 1 � Rf

RfsDs

�Rft

x longitudinale Fleckverbreiterungm Labyrinthfaktor (mobile Phase)Dm Moleküldiffusionskoeffizient (mobile Phase)s Labyrinthfaktor (stationäre Phase)DS Moleküldiffusionskoeffizient (stationäre Phase)t Wanderungszeit (s)

Die Formel zeigt, dass in der Verteilungschromatographie nicht nur währendder Aufenthaltszeit in der mobilen Phase eine Fleckverbreiterung zu erwarten ist.In Longitudinalrichtung erhöht sich die Fleckbreite zusätzlich mit steigenden Rf-


Werten, was durch die Moleküldiffusion in der stationären Flüssigphase verursachtwird [6]. Durch diese zusätzliche Verbreiterung in Fließrichtung nimmt der Sub-stanzfleck in der Regel die Form einer Ellipse an. Bei kleinen Rf-Werten gibt esweniger Übergänge in die mobile Phase, und der Substanzfleck bleibt eher rundbzw. kompakt. Bei großen Rf-Werten geht die Substanz nur geringe Wechselwir-kungen mit der stationären Phase ein, da sie sich die meiste Zeit in der mobilenPhase befindet. Es kommt zu so gut wie keiner Diffusion in die Poren der statio-nären Phase. Die Fleckverbreiterung beruht dann nur auf Lösungsdiffusion, so dassder Probefleck die Gestalt eines diffusen Kreises annimmt.

2.11.3 Der C-Term

Der C-Term beschreibt die zeitliche Verzögerung während der Sorption und derDesorption von Laufmittelmolekülen. Dadurch kommt es zur unvollständigenGleichgewichtseinstellung zwischen mobiler und stationärer Phase. Die so ent-stehende Fleckverbreiterung ist umgekehrt proportional zur Trennzeit und demDiffusionskoeffizienten. Sie ist direkt proportional zum Quadrat des Partikeldurch-messers [26].

2xC D C

d 2p

DmRft

xC Zonenverbreiterung durch verzögerte Gleichgewichtseinstellungendp PartikeldurchmesserDm Diffusionkoeffizient in der mobilen Phase (cm2 s �1)t Wanderungszeit (s)C Knox-Konstante

Die Summe aller Beiträge zur Zonenverbreiterung beschreibt den Gesamtprozessder Zonenverbreiterung.

2S D 2

xA C 2xB C 2

xC

2.11.4 Lokale TrennstufenhöheH

Wie bereits erwähnt, beschreibt die Größe N (die Anzahl realer Trennstufen) dieTrennfähigkeit eines chromatographischen Systems. Je größer N ist, umso mehrSubstanzen können getrennt werden.

Häufig wird in der Chromatographie statt der Anzahl der realen Trennstufendie mittlere beobachtbare Trennstufenhöhe H als Charakteristikum einer Trennungangegeben. Diese erhält man, wenn die gesamte Trennstrecke durch die Trennstu-fenzahl N geteilt wird [6].

H � zf � z0

ND Rf

2S

zf � z0

z2S

D 2S

zS(2.23)


Der Ausdruck H beschreibt die über die gesamte Trennstrecke gemittelte theo-retische Trennstufenhöhe. In der DC kennzeichnet der Ausdruck die (imaginäre)Trennstrecke, auf der die Trennleistung einer theoretischen Trennstufe erreichtwird. Der H-Wert wird daher auch durch das Akronym HETP (engl. heightequivalent to a theoretical plate) ausgedrückt.

2.11.5 Die van-Deemter-Gleichung

Die van-Deemter-Gleichung stellt einen Zusammenhang zwischen der Trennstufen-höhe H und den einzelnen Größen her, die zu einer Zonenverbreiterung beitragen.Sie wurde empirisch sowohl für die Gaschromatographie als auch für die Flüssig-chromatographie erstellt, und soll hier in der Form der Guiochon-Siouffi-Adaptionfür die DC vorgestellt werden [6, 28]. Die Gleichung verbindet die Moleküldiffusi-on mit dem Massentransport und der Plattenhöhe H. Mit ihr lassen sich Aussagenüber die optimale Fließgeschwindigkeit in der Säulenchromatographie bzw. Aussa-gen zur optimalen Trennstrecke in der DC machen. Aus der Gleichung kann auchabgeleitet werden, mit welchen Partikel- und Porendurchmessern der stationärenPhase man optimale Trennleistungen erhält. Damit hat die modifizierte van-Deem-ter-Gleichung entscheidend zur Entwicklung der HPTLC-Platten beigetragen.

Die Geschwindigkeit der Probemoleküle auf der DC-Platte berechnet sich ent-sprechend der Definition einer Geschwindigkeit (Weg geteilt durch Zeit) zu:

u D zf � z0

t:

Mit der Beziehung (zf � z0) = zs / Rf gilt:

Rft D Rf.zf � z0/

uD zs

u:

Durch zs geteilt, können die Varianzen auch als Trennstufenhöhen geschriebenwerden.

H D 2S

zSD 2

xA C 2xB C 2

xC

zS

Eine modifizierte van-Deemter-Gleichung für die Adsorptionschromatographiekann folgendermaßen geschrieben werden [28]:

H D Adp

�dp

Dmu

�1=3

C BDm

uC C

d 2p

Dmu : (2.24)

Dm Moleküldiffusionskoeffizient (mobile Phase)dp mittlere Korngröße der stationären Phaseu konstante Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase u = (zf � z0) / tA–C Knox-Konstanten [29]


Die Konstante A charakterisiert die Qualität der stationären Phase, die KonstanteB die axiale Diffusion und C den Widerstand des Massentransports im chroma-tographischen Bett. Der Wert von H hängt hauptsächlich von der Strömungsge-schwindigkeit u der mobilen Phase ab. Wandert die mobile Phase langsam durchdie stationäre Phase, kann Diffusion die Signale verbreitern, und es resultiert eineschlechte Trennung. Läuft die mobile Phase sehr schnell durch die stationäre Pha-se, können sich keine Trenngleichgewichte ausbilden. Die Trennung ist ebenfallsschlecht, was sich in einem größeren Wert für H ausdrückt. Für jedes Trennsystemmuss es daher eine optimale Strömungsgeschwindigkeit der mobilen Phase geben,bei der H ein Minimum erreicht. Dieses Optimum hängt entscheidend von der Korn-größe (dp) der Partikel in der stationären Phase ab.

Nach J. C. Giddings [30] beschreibt der erste Term (A-Term) in der van-Deem-ter-Gleichung die Eddy-Diffusion und den Massentransport in der mobilen Phase.Diese Streudiffusion ist auf unterschiedliche örtliche Fließgeschwindigkeiten in derstationären Phase zurückzuführen. Ursache ist in der Regel die unterschiedlicheTeilchengeometrie der Packung. Der Wert der Konstante A wird umso kleiner, jeregelmäßiger und einheitlicher die Packung der stationären Phase ist. Eine weitereUrsache für die Streudiffusion ist der lokale Unterschied der Fließgeschwindig-keiten. In großen Kanälen ist der Geschwindigkeitsgradient von der Strömungs-mitte zum Rand hin größer als in kleinen Kanälen. Kleine Partikeldurchmesserbedingen kleine Strömungskanäle und damit ein einheitlicheres Strömungsprofil.Das ergibt eine geringere Streudiffusion. Natürlich kann man die Partikelgrößenicht beliebig verkleinern, da irgendwann die Kanäle zu eng werden und leichtverstopfen.

Der zweite Ausdruck in der modifizierten van-Deemter-Gleichung (B-Term) be-schreibt die Auswirkung der Moleküldiffusion in der mobilen Phase. Da in die-sem Term die Fließgeschwindigkeit umgekehrt proportional zur Zonenverbreite-rung ist, sinkt die Moleküldiffusion mit zunehmender Fließgeschwindigkeit. DieserZusammenhang erklärt die Beobachtung, dass bei langsamerem Fluss die Substanz-flecke deutlich diffuser als bei schnellerem Fluss aussehen. Eine Zonenverbreite-rung findet in der DC damit hauptsächlich bei größeren Rf-Werten statt, wenn dieFließgeschwindigkeiten klein sind. Hier ist für die DC das Fließgesetz ein großerNachteil und erklärt die vergleichsweise schlechte Trennleistung im Vergleich zurHPLC, die ja mit erzwungenem und damit konstantem Fluss arbeitet. Unter die-sem Gesichtspunkt haben in der DC auch Forced-flow-Methoden ihre Existenz-berechtigung.

Der dritte Term (C-Term) der van-Deemter-Gleichung berücksichtigt die in end-licher Zeit ablaufenden Adsorptions- und Desorptionsprozesse zwischen Probemo-lekülen und stationärer Phase. Adsorbierte Moleküle sind ortsfest gebunden, dochgleichzeitig wandern die in der mobilen Phase gelösten Probemoleküle weiter. DieFolge ist eine Fleckdiffusion in Fließrichtung. Da dieser Effekt etwas mit der Pa-ckungsoberfläche zu tun hat, geht die Partikelgröße quadratisch ein. Weiter wirdberücksichtigt, dass Moleküle aus dünnen Schichten schneller wieder in die mobilePhase gelangen können, der Diffusionsbeitrag also verringert wird [18].


2.12 Optimale Trennbedingungen in der DC

Eine optimale DC-Trennung wird erhalten, wenn der Wert H des Trennsystemsminimiert wurde. In der GC oder HPLC berechnet man den optimalen Fluss fürden kleinsten H-Wert, indem man H nach u ableitet und die Gleichung gleich nullsetzt. Geiss weist zu Recht darauf hin [6], dass die Fließgeschwindigkeit in derDC leider nicht konstant ist. Der Wert von H ist vielmehr, im Gegensatz zur GCoder HPLC, von der Lage der Substanzsignale im Chromatogramm abhängig. DieAngabe einer optimalen Fließgeschwindigkeit ist in der DC daher wenig sinnvoll.

Die Ortsabhängigkeit der mittleren Trennstufenhöhe kann über die Bildung einerneuen Größe, der lokalen Plattenhöhe (H / zf) beseitigt werden. Wird dieser Quo-tient aus Plattenhöhe und Frontlauflänge über alle (von z0 bis zf) zurückgelegteWegstrecken aufintegriert, erhält man eine mittlere Plattenhöhe HM, die nicht vonder Fließgeschwindigkeit, sondern nur von der Fließgeschwindigkeitskonstante �

abhängt. Der DC-Ausdruck für die lokale van-Deemter-Gleichung muss dazu überdie gesamte Trennstrecke integriert werden [6, 28].

HM D 1zfR

z0

dzf

zfZz0

H dzf D 1

zf � z0

zfZz0

Adp

�dp

Dmu

�1=3

C BDm

uC C

dp2

Dmu

!dzf

Aus dem Fließgesetz wird der Ausdruck z2f D �t zu der gemittelten lokalen

Fließgeschwindigkeit u D �

2zfumgeformt. Es ergibt sich aufintegriert die folgende

Formel:

HM D 3

2A

dp

4�

2Dm

!1=3zf

2=3 � z02=3

zf � z0

C BDm

�.zf C z0/ C C�dp

2

2Dm.zf � z0/ln

zf

z0

:

(2.25)A-Term und C-Term können durch die Wahl eines kleinen dp optimiert werden.

Der Diffusionskoeffizient der Moleküle in der mobilen Phase (Dm) ist nur schwerzu optimieren, da er sowohl im Zähler des zweiten wie auch im Nenner des drittenTerms erscheint. Ein Hauptbeitrag zur molekularen Diffusion liefert der B-Term.

Nach dem Einstein’schen Diffusionsgesetz vergrößern sich die Peaks mit 2Dmtin der Zeit t, und zwar in alle Richtungen. Daher sollten Trennungen schnell ablau-fen, um die Diffusion möglichst klein zu halten. Leider wird der Fluss der mobilenPhase durch kleine Korngrößen in der stationären Phase gebremst. Was den A-Term und C-Term verkleinert, vergrößert den B-Term. Benutzt man Laufmittel mitkleinen Diffusionskonstanten, halten sich die Peakverbreiterungen in Grenzen [6].Kleine Fließkonstanten verringern ebenfalls das Gewicht des B-Terms. Je höher dieFließkonstante ist, desto unvollständiger sind die Gleichgewichtseinstellungen, be-schrieben durch den C-Term. Zu beachten ist auch, dass bei einem Wert von z0 nahenull der logarithmische Ausdruck gegen unendlich läuft. Die Entfernung zwischenEintauchspiegel und Startlinie darf also nicht zu klein gewählt werden. Das optima-

2.12 Optimale Trennbedingungen in der DC 49

Tab. 2.1 Aufgelistet sind die typischen Daten zur TLC und HPTLC. (Entnommen aus [18])

Parameter TLC HPTLC

Dm 2,8 � 10�5 cm2 s�1

dp 8,8 µm 6,0 µm

Knox-Konstanten

A 2,83 0,75

B 1,18 1,56

C 0,84 1,42

Fließkonstante

� 0,044 cm2 s�1 0,019 cm2 s�1

Abb. 2.15 Abgebildet istdie Auftragung der mitt-leren Trennstufenhöhenunterschiedlicher TLC- undHPTLC-Entwicklungen überverschiedene Trennstrecken(Entnommen aus [33], mitfreundlicher Genehmigung© Elsevier)

le Verhältnis von zf zu z0 sollte nach Saunders und Snyder [6, 31] zwischen 7 und33 liegen.

Wie die zuletzt behandelte (2.25) zeigt, geht HM bezüglich der Trennstreckedurch ein Minimum. Bei einer Distanz zwischen Eintauchspiegel und Start vonz0 = 1 cm liegt das Minimum für eine TLC-Trennung bei einer Frontwanderungs-strecke zf von 7 bis 15 cm [18]. Die Stahl’schen Standardmaße für die klassischeDC von z0 = 1 cm und zf = 10 cm sind damit gut gewählt [6]. Wie Abb. 2.15 zeigt,liegt bei HPTLC-Trennungen das HM-Minimum bei etwas über 4 cm Trennstrecke[18]. Auch ist die minimale mittlere Trennstufenhöhe für Kapillarfluss-Trennungenimmer höher als für erzwungene Flüsse. Auch liefern HPTLC-Platten mit kleine-ren Partikeln als TLC-Platten bessere Trennungen, falls eine Trennstrecke von 5 cmnicht überschritten wird [33]. Das kommt auch in den Werten der Tab. 2.1 zumAusdruck.

Was kann der Chromatograph aus diesen Aussagen der (2.25) für Schlüsse zie-hen? Ideal ist das Aufrechterhalten einer konstanten Fließgeschwindigkeit über dieganze Trennstrecke, wie Abb. 2.15 zeigt. Dies ist in der OPLC (engl. optimumperformance laminar chromatography) erfüllt. Diese apparativ recht aufwändigeDC-Methode soll hier aber nicht weiter behandelt werden.


Wichtig ist weiter, mit DC-Platten enger Korngrößenverteilung zu arbeiten. Dieskann durch die Verwendung von HPTLC-Platten (engl. high-performance thin-layerchromatography plates) erreicht werden. Auch sollte die stationäre Phase eine ho-mogene Packung gleichbleibender Qualität aufweisen. Das spricht gegen eigenesPlattenstreichen und für industriell gefertigte Ware.

Man sollte – wenn möglich – auch Laufmittel mit kleinen Diffusionskonstantenverwenden, damit sich die Zonenverbreiterungen in Grenzen halten. Auch soll-te man immer über die optimale Trennstrecke entwickeln [6]. Belenkij leitet ausdiesen Betrachtungen die Empfehlung ab, für Substanzen mit kleinem Molekular-gewicht eher Platten mit dp = 10 µm über Trennstrecken von etwa zf = 10 cm und fürSubstanzen mit großen Molekulargewichten Schichten mit dp = 5 µm und Trenn-strecken von zf = 5 cm zu verwenden [12].

Der B-Term wird vergrößert, wenn der Diffusionskoeffizient der zu trennendenMoleküle in der stationären Phase (Ds) groß ist. Dies ist in der Verteilungschroma-tographie eher der Fall als in der Adsorptionschromatographie.

Messungen auf Platten mit Partikelgrößen kleiner als 10 µm zeigen statt der ty-pischen, durchhängenden van-Deemter-Kurven Geraden mit konstanter Steigung.Offensichtlich ist bei diesen kleinen Partikelgrößen nur der B-Term (die Molekül-diffusion in der mobilen Phase) an der Peakverbreiterung beteiligt. Alle anderenAusdrücke können vernachlässigt werden. Damit reduziert sich der Ausdruck fürHM bei kleinen Partikelgrößen (dp < 10 µm) auf [28]:

HM D B

�.zf C z0/ :

Die Gleichung zeigt, dass bei kleinen Partikelgrößen gute Trennstufenzahlen nurüber kurze Distanzen von wenigen Zentimetern erreicht werden. Will man überlängere Strecken trennen, muss auf DC-Platten mit größeren Partikeldurchmessernzurückgegriffen werden.

Hat der Anwender seine Wahl bezüglich mobiler Phase und des Plattenmaterialsgetroffen, und liegt auch der optimale Auftrageort fest, kann die Trennung nur nochdurch einen einzigen Parameter optimiert werden, durch die Wahl der optimalenTrennstrecke.

2.13 Die Trennzahl nach R. E. Kaiser

Natürlich ist eine Trennmethode, die viele Substanzen ausreichend gut trennt, höherzu bewerten, als ein Trennsystem, das nur wenige Substanzen trennen kann. DieTrennzahl nach R. E. Kaiser liefert solch eine Bewertungsgrundlage auf der Basisder Anzahl getrennter Substanzen [32]. Die Trennzahl beschreibt die Anzahl derSignale, die mit einer Trennmethode erkennbar zu trennen ist. Nach Kaiser ist dasgegeben, wenn die Signale mindestens in halber Signalhöhe aufgetrennt sind. Aufder Trennstrecke zS sollen sich SN Signale mindestens ab halber Signalhöhe nichtmehr überlappen. Da die Signalbreite wH (Signalbreite bei halber Signalhöhe) eine

2.13 Die Trennzahl nach R. E. Kaiser 51

Funktion der Laufstrecke ist, benutzte Kaiser eine mittlere Signalbreite, die er alsMittelwert der Startsignalbreite und des letzten Signals der Trennung (in Höhe derFront) berechnet.

wH D 1

2.wH.Start/ C wH.Front//

Die mittlere effektive Laufhöhe berechnet sich entsprechend zu:

zM D 1

2.zf � z0/ :

Mit der Definition für die Trennzahl SN (engl. separation number)

SN � zM

wH

� 1

folgt folgende Formel:

SN D .zf � z0/

wH.Start/ C wH.Front/� 1 : (2.26)

Die Formel ist einsichtig, denn sie liefert bei nur einem Signal der Trennungdie Trennzahl null. Ansonsten beschreibt der Wert der Trennzahl die Anzahl derSignale, die auf der Strecke (zf � z0), in halber Höhe getrennt, Platz haben.

Die Signalbreiten bei halber Höhe sind in der Regel experimentell direkt be-stimmbar, denn das Chromatographiegesetz

N 0 D�

zS

S

�2

D 5;545z2

S

w2HS

liefert einen linearen Zusammenhang zwischen der Laufhöhe und den Signalbreitender Substanzen.

wH D wH.Start/ C wHS D wH.Start/ Cr

5;545

N 0 z2s

Werden die Signalbreiten wH graphisch gegen die Laufhöhen zS aufgetragen,ergibt sich eine Gerade mit Achsenabschnitt. Aus dieser kann die Auftragsbreiteund aus der Steigung die theoretische Trennstufenzahl ermittelt werden (dargestelltin Abb. 2.16). Eine Trennung von sechs Farbstoffen auf Kieselgel (Abb. 2.11) ergibtz. B. die in Tab. 2.2 genannten Werte.

Die Steigung beträgt a = 0,06109. Der Achsenabschnitt, also die Auftragsbreitebei halber Signalhöhe wH(Start) , wird zu 0,64 mm berechnet. Die Anzahl der realenTrennstufen berechnet sich aus der Steigung der Ausgleichsgeraden zu:

N 0real D 5;545

a2D 5;545

�.zf � z0/

wH.Start/ � wH.Front/

�2

: (2.27)


0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20 25

wH

(mm

)

Trennstrecke (mm)

Abb. 2.16 Dargestellt sind Signalbreiten bei halber Signalhöhe von sechs Signalen (eines CA-MAG-Farbstoffgemisches, siehe Abb. 2.11), graphisch gegen die Laufhöhe aufgetragen. Ausder Steigung ergibt sich N0 = 1486. Aus dem Achsenabschnitt wird die Auftragsbreite zuwH(Start) = 0,64 mm berechnet

Tab. 2.2 Trennstrecke und Signalbreiten wH bei einer Trennung von sechs Farbstoffen

Substanz Trennstrecke (mm) wH (mm)

Z1 0,92 0,73

Z2 2,57 0,83

Z3 6,96 1,01

Z4 9,53 1,10

Z5 16,9 1,83

Z6 24,9 2,11

Front 34,8

Für das Beispiel der sechs Farbstoffe gilt:

N 0real D 5;545

0;061092D 1486 :

Die Größe der Signalbreite bei halber Höhe einer Verbindung, die mit der Frontläuft, berechnet sich zu:

wH.Front/ D wH.Start/ Cr

5;545

N 0 .zf � z0/ :

2.14 Reale Plattenhöhen 53

Mit der gemessenen Gesamttrennstrecke von .zf � z0/ D 34;8 mm folgt damit:

wH.Front/ D wH.Start/ Cr

5;545

148634;8 mm D 2;77 mm :

Die Anzahl der realen Trennböden berücksichtigt nur die Signalverbreite-rung während des Trennvorgangs. Durch Einsetzen von (2.27) in (2.26) mit5,545 = 4ln(4) folgt der Ausdruck [32]:

SN D 1

2

sN 0

real

ln.4/

wH.Front/ � wH.Start/

wH.Front/ C wH.Start/� 1 : (2.28)

Im konkreten Beispiel berechnet sich die Trennzahl gerundet zu 9, ein in der DCsicherlich üblicher Wert.

Maximale Trennzahlen werden durch kleine Auftragebreiten und durch geringeDiffusion während der Trennung erreicht. Nach der Wahl der Trennphasen kanndie Diffusion nicht mehr beeinflusst werden. Da die Signalbreite der AuftragungwH(Start) in (2.28) doppelt gewichtet wird, kann über sie die Trennzahl experimentelloptimiert werden. Man sollte vor einer Trennung die Auftragung fokussieren, umkleine Auftragebreiten zu erhalten. Wird dann mit einem Fließmittel hoher Visko-sität oder bei tiefen Temperaturen entwickelt, wird die durch Diffusion verursachteSignalverbreiterung minimiert. Eine Vergrößerung der Trennstrecke zf kann die ma-ximale Trennzahl nur erhöhen, wenn die Signalverbreiterung während der Trennung(also die Steigung der Geraden a) klein bleibt!

2.14 Reale Plattenhöhen

Bei der Betrachtung der Plattenhöhentheorie wurde bislang von der etwas unrea-listischen Annahme ausgegangen, dass die Signalverbreiterung (die Varianz derPeaks) nur durch die chromatographische Entwicklung entsteht. Bei einer unver-meidlich endlichen Fleckausdehnung schon bei der Auftragung, muss die theoreti-sche Plattenhöhe aber um diesen Betrag korrigiert werden. Man spricht dann vonder realen Plattenhöhe Hreal. R. E. Kaiser hat eine einfache und praktische Methodezur Bestimmung solcher realer Plattenhöhen vorgeschlagen [29–32]. Er argumen-tiert in folgender Weise. Die Peakbreite einer Probesubstanz bei halber Höhe (wHS)setzt sich additiv aus der realen, durch die chromatographische Entwicklung verur-sachte Signalbreite (wHreal), und der Auftragssignalbreite bei halber Höhe (wH(Start))zusammen.

wHreal D wH.Start/ C wHS

Für die Definition der realen Plattenhöhe

Hreal � zf � z0

N 0real

(2.29)


folgt mit dem Ausdruck für N 0real aus (2.27) sowie mit 5,545 = 4 ln(4):

Hreal D .wH.Front/ � wH.Start//2

4 ln.4/.zf � z0/: (2.30)

Im konkreten Fall des CAMAG-Farbstoffgemisches berechnet sich die realePlattenhöhe zu Hreal = 23,5 µm.

Um chromatographische Methoden in der DC miteinander vergleichen zu kön-nen, sollten immer die experimentell bestimmten realen Plattenhöhen angegebenwerden, die um die Varianz der Auftragung korrigiert wurden.

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3Die stationäre Phase in derDünnschichtchromatographie

Kieselgel ist die dominierende stationäre Phase in der Dünnschichtchromatogra-phie. Dies ist ein wichtiger Unterschied zur HPLC, denn dort werden die meis-ten Trennungen verteilungschromatographisch im Reversed-phase-Modus durch-geführt. Trennungen an Normalphase sind dort eher selten, da in umständlicherWeise der Wassergehalt aller verwendeten Laufmittel eingestellt werden muss. ImGegensatz zur HPLC ist die Verwendung von Normalphasensystemen in der DCmit keinerlei Problemen verbunden.

Ganz im Gegenteil! Die Adsorptionschromatographie wird in der DC weithäufiger angewendet als die Verteilungschromatographie. Dies belegt eine statisti-sche Auswertung von 1752 Publikationen aus den Jahren 1979 bis 1985 (Tab. 3.1).Kieselgel (reine SiO2-Phase) wird danach allen anderen stationären Phasen vorge-zogen [1]. Neben Kieselgel gehören Aluminiumoxid, Kieselgur, Magnesiumoxidund Magnesiumsilikat (Florisil®) zu den häufiger benutzten Adsorptionsphasen.Unter gewissen Bedingungen können Kieselgur und Kieselgele darüber hinaus auchverteilungschromatographisch wirken, wenn die mobile Phase merkliche Mengenan Wasser enthält. Eine Verteilungschromatographie liegt auch bei den chemischmodifizierten SiO2-Phasen wie der RP-18- oder der Aminophase vor. Auch die Cel-luloseplatte gehört – wie die Papierchromatographie – in diese Trennkategorie. ZurIonenaustauschchromatographie werden modifizierte Cellulosephasen oder che-

Tab. 3.1 Aufgelistet ist die Häufigkeit der verwendeten stationären Phasen (DC und HPTLC) derJahre 1979 bis 1985 [1]

Phasenart TLC HPTLC

Kieselgel G und H 73,3 % 73,5 %

Cellulose 5,2 % 3,1 %

Polyamid 1,8 % 1,4 %

gebundene Phasen 5,5 % 22,0 %

Aluminiumoxid 2,6 %

Kieselgur 0,3 %

Gele 0,4 %


58 3 Die stationäre Phase in der Dünnschichtchromatographie

misch gebundene Ionenaustauscherharze benutzt. Polyamidphasen können sowohlals Ionenaustauscher wie auch als Verteilungschromatographiephasen wirken.

Eine besondere Form der DC ist die Ausschlusschromatographie. Hierzu wer-den maßgeschneiderte Polymere benutzt, die an die unterschiedlichsten Trennan-forderungen angepasst sind. Meist werden Dextran- oder Polyamidgele verwendet.Die Trennung nutzt den Effekt des Größenausschlusses von Molekülen aus.

3.1 Aktivierung und Deaktivierung der stationären Phase

Die Aktivität der stationären Phase bestimmt entscheidend das Trennverhalten derAdsorptions-Chromatographie. Die Sorbensaktivität der stationären Phase setztsich aus zwei Anteilen zusammen: dem Energieanteil und dem Flächenanteil. DieStärke der Sorption wird durch die Größe der Sorptionsoberfläche bestimmt. DieAnzahl der Sorptionsstellen, die gleichzeitig wirksam sind, bildet die spezifischeOberfläche.

Die Anzahl der aktiven Zentren wird in der Normalphasenchromatographiedurch „Deaktivatoren“ verringert, die die aktiven Sorptionsstellen der stationärenPhase reversibel belegen. Statt des Ausdrucks Deaktivator wird häufig auch dieBezeichnung Modifier verwendet. Werden polare stationäre Phasen benutzt, sinddie Deaktivatoren bzw. Modifier in der Regel polare Moleküle, die die aktivenZentren der Sorptionsschicht belegen.

Wasser ist der in der Normalphasenchromatographie der am häufigsten verwen-dete Modifier, aber auch stark polare Substanzen wie Glycerin, Glykol oder Sub-stanzen mit stark polaren Gruppen können als Modifier wirken. In der Normal-phasen-DC lösen viele unpolare mobile Phasen wie Pentan oder Hexan nicht dennötigen Wasseranteil, der zur gewünschten Deaktivierung der stationären Phasegebraucht wird. Hier wird als Modifier häufig Acetonitril statt Wasser verwen-det. Bei unpolaren Adsorbenzien wie Aktivkohle, Graphit oder Ruß werden in derTechnik bevorzugt unpolare Deaktivatoren wie Toluol oder Stearinsäure eingesetzt.Schwarze Adsorbenzien werden in der DC allerdings nicht verwendet, da sie derspektroskopischen Detektion der getrennten Substanzen entgegenstehen.

Eine stationäre Phase ist vollständig deaktiviert, wenn alle aktiven Zentren derOberfläche mit einem Modifier belegt sind. Die Chromatographie geht dann (meist)in eine Flüssig-flüssig-Verteilung über. Der Anteil an Modifier in der stationärenPhase wird in der DC vor der Trennung über die Gasphase eingestellt. Die Plattenwerden dazu bei Temperaturen von über 100 °C aktiviert und dann bei einer vorge-gebenen „relativen Feuchte“ gelagert, damit die Platten den entsprechenden AnteilWasser aus der Gasphase aufnehmen können. Zur Einstellung der Aktivität kanndie Platte aber auch mit einem Laufmittel voraktiviert werden. Dazu wird die Plattemit einem Laufmittel, das den gewünschten Anteil Deaktivator enthält, entwickelt.Der positive Nebeneffekt dieser Methode besteht in einer Reinigung der stationärenPhase, denn lipophile Verschmutzungen aus der Laborluft oder aus den Plastik-verpackungen der Plattengebinde werden im Frontgradienten mitgetragen. Bei inPlastikfolie verschweißten Platten sind die häufigsten Kontaminanten wohl Weich-

3.2 Das Adsorptionsmodell nach L. R. Snyder 59

macher, die in der Folie – chemisch ungebunden – vorliegen. Auch die Klebstoffeder Plattenetikette sind oft für eine Kontamination der stationären Phase verant-wortlich zu machen. Die Anzahl der unbelegten aktiven Zentren sollte eigentlichkeinen Einfluss auf die Selektivität der stationären Phase haben. In der Praxis ist oftdas Gegenteil der Fall. Die Änderung der Deaktivatorbelegung kann sogar zur Um-kehrung der Elutionsreihenfolge führen. Die Oberflächenenergie einer guten DC-Platte sollte an allen Orten der stationären Phase konstant sein, aber dazu müsstedie Platte absolut gleichmäßig belegt sein und weder Risse noch eine unregelmäßi-ge Porenstruktur aufweisen. Dies ist schwer zu realisieren.

Die Oberflächenenergie einer stationären Phase ist schwierig zu messen. Sie wirdmeistens indirekt, über das chromatographische Ergebnis, bestimmt. Es ist daherschwierig, verschiedene stationäre Phasen bezüglich ihrer Adsorptionskraft mitein-ander zu vergleichen. Generell kann daher Fragen, ob eine Kieselgelschicht aktiverals eine Aluminiumoxidschicht ist, nicht beantwortet werden.

3.2 Das Adsorptionsmodell nach L. R. Snyder

Im Adsorptionsmodell nach L. R. Snyder [2] liefert jedes Adsorbens einen seinerAktivität entsprechen Anteil zum Rm-Wert. Zu seiner Berechnung benötigt manden Verteilungskoeffizienten. Für den einheitslosen Verteilungskoeffizienten, den„thermodynamischen Adsorptionskoeffizienten“, gilt in der Adsorptionschromato-graphie die schon eingeführte Formel:

K D cS

cm:

cs Konzentration der Probe in der stationären Phasecm Konzentration der Probe in der mobilen Phase

In der Adsorptionschromatographie wird der Adsorptionskoeffizient Ka häufignicht dimensionslos, sondern in der Einheit [cm3g�1] angegeben.

Ka D cs

cmVa

Ka Adsorptionskoeffizientcs Konzentration der Probe in der adsorbierten Fließmittelmonoschichtcm Konzentration der Probe in der mobilen PhaseVa Volumen der adsorbierten Fließmittelmonoschicht pro g Adsorbens

Das Volumen der Monoschicht an Fließmittelmolekülen ist proportional zur spe-zifischen Oberfläche eines Adsorbens bzw. ist proportional zur aktiven Oberflächeder stationären Phase. Dies gilt auch bei deaktivierender Vorbelegung mit einemModifier. Je größer Va ist, umso größer ist die Aktivität der stationären Phase.

Im „thermodynamischen Adsorptionskoeffizienten“ steckt die Differenz der Ad-sorptionsenergie der Probemoleküle (Ep) und der Fließmittelmoleküle (Em), welche


die Probemoleküle von der Oberfläche verdrängt haben.

lg K � lg Va D lgcs

cmD �0

s

2;3RT� �0

m

2;3RTD Ep � Em

�0s chemisches Potenzial der stationären Phase

�0m chemisches Potenzial der mobilen PhaseDie Größe der Adsorptionsenergie eines Substanzmoleküls ist eine Funktion der

Probemoleküle f (p). In diese Funktion gehen die Polarität der zu trennenden Ver-bindung und deren sterische Eigenschaften ein. Weiter muss die Oberflächenenergief(Ai) berücksichtigt werden. Sie ist eine Funktion der Oberfläche der stationärenPhase.

Ep D f .Ai /f .p/ D ˛aS0

S0 steht für die Adsorptionsenergie der Probe. Die Variable ˛a kennzeichnetdie Adsorbensaktivität und wird für Aluminiumoxid mit seiner höchsten Aktivitätwillkürlich auf ˛a = 1 gesetzt. Die Größe der Adsorptionsenergie aller Fließmittel-moleküle ist ebenfalls abhängig von der Oberflächenenergie der stationären Phase,und sie ist abhängig von der Art der mobilen Phase f (m).

Em D f .Ai /f .m/ D ˛a"0AP

Der Platzbedarf eines Probemoleküls an der Adsorbensoberfläche wird mit demFlächenmaß AP abgekürzt. Der Fließmittelparameter "0 beschreibt die Eigenschaf-ten der mobilen Phase. Für den logarithmierten Adsorptionskoeffizienten folgt:

lg Ka D f .Ai /Œf .p/ � f .m/� C lg Va :

Mitf .Ai /Œf .p/ � f .m/� D ˛a.S

0 � "0AP/

und durch Einsetzen in den Ausdruck des Rm-Wertes

Rm D lgVs

VmC lg Ka

ergibt sich die Fundamentalbeziehung der Adsorptionschromatographie [2, 3]:

Rm D lgVs

VmVa C ˛a.S

0 � "0AP/ : (3.1)

Häufig wird statt des Volumens der stationären Phase (Vs) auch dessen Gewichtangegeben, da dieses leichter zu bestimmen ist. Der Quotient Vs/Vm in der Sny-der’schen Beziehung (3.1) steht für die Volumina der stationären und der mobilenPhase und kann auch durch das Verhältnis Wa/VP ersetzt werden. Wa bezeich-net das Gewicht der DC-Schicht (in g) mit dem für das Fließmittel zugänglichenPorenvolumen VP. Ein Gramm der DC-Schicht wird mit dem Fließmittelvolumen

3.3 Die Schichtmaterialien 61

Va monomolekular bedeckt werden. Das Volumen Va ist damit ein Parameter derSchichtaktivität. Bei völliger Deaktivierung des Sorbens wird er null (und der Rf-Wert damit eins). Die Snyder’sche Beziehung für die Adsorptionschromatographiekann damit auch folgendermaßen geschrieben werden [2, 3]:

Rm D lgWa

VPVa C ˛a.S

0 � "0AP/ :

Va Volumen der adsorbierten Fließmittelmonoschicht pro g AdsorbensWa Gewicht der DC-Schicht (g)VP das für das Fließmittel frei zugängliche Porenvolumen (cm3)˛a Energiekomponente des Aktivitätsparameters (˛a = 1 für höchstaktives Alumi-

niumoxid)S0 Adsorptionsenergie der Probe"0 FließmittelparameterAP Platzbedarf eines Probemoleküls am Adsorptionszentrum

Wie oben erwähnt, ist die Aktivität der stationären Phase umso größer, je größerder Wert von Va ist. Wird Va nach vollständiger Deaktivierung gleich null, folgt fürRm = 1, und der Rf-Wert nimmt den Wert 1 ein. In diesem Fall werden alle Probe-moleküle unverzögert über die Platte transportiert, und es findet keine Adsorptionan der stationären Phase mehr statt.

Die praktische Bedeutung der Snyder’schen Formel (3.1) ist gering, da geziel-tes Ausprobieren ein Trennproblem in der Regel schneller löst als das Rechnen mitAktivitätsparametern. Außerdem haben Aktivität und Trennung nichts miteinanderzu tun. Es ist ein Irrtum zu glauben, hochaktive Adsorbenzien trennen besser als de-aktivierte Materialien. Der Wert der oben abgeleiteten Gleichung liegt vielmehr inder Möglichkeit, die Adsorbenzien zu standardisieren, denn die Rm-Werte ähnlicherSubstanzen auf einem identischen Adsorbens sind linear miteinander verknüpft.

Nach F. Geiss sollten, zur Charakterisierung neuer stationärer Phasen, die re-lativen Werte von ˛ und lg(VaVs / Vm) (hier als ˛0 und lg(VaVs / Vm)0 bezeichnet)durch Trennung von Polyphenylenen mit Hexan bei verschiedenen relativen Feuch-tigkeiten bestimmt werden [3]. Dazu werden die gemessenen Rm-Werte gegen einrelatives Maß, wie z. B. die Ringanzahl, graphisch aufgetragen (Abb. 3.1). Ausder Steigung der Geraden lässt sich ˛0 und aus dem Achsenabschnitt der Wert fürlg(VaVs / Vm)0 berechnen. Diese Werte sind im Laborbetrieb auch für neue Adsor-benzien schnell bestimmbar und völlig ausreichend, um neue stationäre DC-Phasenzu charakterisieren.

3.3 Die Schichtmaterialien

Die verschiedenen Schichtmaterialien unterscheiden sich in ihren physikalischenParametern wie Korngröße oder Porenvolumen. Die ersten DC-Platten, die kom-merziell vertrieben wurden, besaßen eine stationäre Schicht mit Korngrößen um20 µm und einer relativ breiten Korngrößenverteilung. Mit diesen Schichten arbei-tete E. Stahl, einer der Begründer der modernen DC [4].


Rm

Rm

F

slope α΄

2,0

1,6

1,2

0,8

+0,4

-0,4

0,8

1,2

0

0 1 2 3 4 5 6

Ø 2 Ø 3 Ø 4 Ø 5 Ø 6

n

ring number

m-polyphenylenes

durene

naphthalene

anthracene

triphenylene

3,4-benzopyrene[f(X,S)]

[f(X,S)]‘

9 % rel. hum.

24 %

37 %

58 %

72 %

Abb. 3.1 Aufgetragen sind die Rm-Werte von verschiedenen Polyphenylenen gegen die Anzahlihrer aromatischen Ringe. Die Steigung der Geraden entspricht dem Geiß’schen ˛0-Wert. DerAchsenabschnitt ist gleich lg(VaVs / Vm)0. (Entnommen aus [3], mit freundlicher Genehmigung© Hüthig)

In den Jahren 1968 bis 1973 gab es eine lebhafte Diskussion über die Möglich-keiten, diese Schichten zu optimieren [1]. Ab etwa 1973 tauchte der Begriff HPTLC(engl. high-performance thin-layer chromatography) auf. Bei dieser Technik wirdmit Plattenmaterialen von Korngrößen zwischen 5 µm und 15 µm gearbeitet. Cha-rakteristisch für die HPTLC ist außerdem eine relativ enge Korngrößenverteilung.Ergebnisse mit dieser neuen Plattenart wurden 1977 von A. Zlatkis und R. E. Kaiserpubliziert [5].

Der Vergleich von DC- und HPTLC-Platten geht zugunsten der HPTLC aus(Tab. 3.2). Die Nachweisgrenzen sowohl in Fluoreszenz als auch in Absorption (Re-flexion) liegen bei der HPTLC-Platte um den Faktor 2 bis 10 unter denen der DC-Platten [6, 7]. Die Trennzeiten bei HPTLC-Platten liegen unter denen der TLC-Plat-ten. Die Auflösung ist bei HPTLC-Platten um etwa 20 % verbessert. Die Selektivitätwird nicht beeinflusst.


Tab. 3.2 Aufgelistet sind die Parameter unterschiedlicher DC-Schichten [5–6]

Parameter TLC HPTLC UTLC

Plattengröße (cm) 20 × 20 10 × 10 6 × 3,6

Plattendicke (µm) 100–250 100–200 10

Korngröße (µm) 8–10 6–8 keine

Auftragevolumen (µl) 1–5 0,1–5 0,01–0,1

Trennstrecke (cm) 6–15 3–7 1–3

max. Spotdurchmesser der Auftragung (mm) 3–6 1–1,5 0,5–1

Trennzeit (min) 30–200 3–20 1–5

Trennstrecke (cm) 10–15 3–8 1–3

Trennstufenhöhe (µm) 35–75 23–25

Bahnen pro Platte 10 9–18 6

Nachweisgrenze in Absorption (ng) 1–5 0,5–1 0,5

Nachweisgrenze in Fluoreszenz (pg) 50–100 5–10 5

Anfang 1980 publizierte dann L. V. Andreev in einem Artikel die Daten seiner„optimalen“ DC-Trennschicht [8]. Andreev reduzierte die Plattendicke auf unter15 µm und lag damit weit unter den 100 µm der normalen HPTLC-Platten. Plat-tenstärken von 10 µm mit einer spezifischen Oberfläche von 350 m2 / g und einemspezifischen Porenvolumen von 0,3 ml / g wurde fast 20 Jahre später von E. Hauckbei der Firma Merck, Darmstadt, entwickelt und als UTLC-Platte (engl. ultrathin-layer chromatography plate) in den Handel gebracht [9]. Alle drei Plattenarten, DC,HPTLC und UTLC sind heute kommerziell verfügbar. Sicherlich dominiert im Au-genblick die traditionelle DC; allerdings wird der Anteil der Benutzer von HPTLC-Platten immer größer. Die DC-Benutzer werden jedoch so bald nicht aussterben,denn noch immer werden weltweit 80 % aller Platten als DC-Platten verkauft. DieZukunft wird zeigen, wie HPTLC- und UTLC-Platten von den Analytikern ange-nommen werden.

Wichtig für eine DC-Trennung ist die Polarität der Schichtmaterialien. Alle sta-tionären Schichten der DC-, UTLC- bzw. der HPTLC-Platten können wie folgt nachsteigender Polarität sortiert werden:

RP-18 < andere gebundene Kieselgelphasen < Papier < Cellulose

< Stärke < Gips .CaSO4/ < Kieselgel.SiO2/

< Florisil .Magnesiumsilicat/ < Magnesiumoxid .MgO/

< Aluminiumoxid.Al2O3/ :

Um die einzelnen kommerziellen Schichten charakterisieren zu können, solltenfolgende physikalischen Parameter der jeweiligen Phasen bekannt sein.


Abb. 3.2 Dargestellt sind die Korngrößenverteilungen von DC-, HPTLC- und für PLC-Schichten.(Mit freundlicher Genehmigung der Fa. Merck, Darmstadt)

3.3.1 Die Plattenschichtdicke (df)

Die Plattendicke moderner TLC- und HPTLC-Phasen liegt zwischen 0,1 und0,25 mm. Für präparative Zwecke werden Schichten von 1,0 bis 2,0 mm angeboten.Die Schichtdicke der UTLC-Platte liegt bei 10 µm.

Eine Reduktion der Schichtdicke verkürzt die Entwicklungszeit. Im Vergleich zuHPTLC-Platten mit einer Schichtdicke von 0,2 mm wandert die mobile Phase umden Faktor 1,5 bis 2,5 schneller durch HPTLC-Platten der Schichtdicke 0,1 mm. Da-durch werden die Signale schmaler und die Nachweisgrenzen sowohl in Absorption(bzw. Reflexion) als auch in Fluoreszenz sinken. C. F. Poole konnte eine Verbesse-rung der Nachweisgrenze um den Faktor 1,1 bis 1,5 beobachten [10]. Die Anzahlder Trennböden oder die Selektivität der stationären Phase wird nicht beeinflusst.

3.3.2 Die mittlere Korngröße (dp)

Die mittlere Korngröße (Partikelgröße) der klassischen DC lag bei etwa 30 µm, wur-de bei modernen Platten aber auf Werte um 9 µm reduziert. HPTLC-Platten besitzeneine mittlere Korngröße zwischen 6 und 8 µm. Die mittlere Korngröße in der Prä-parative-Layer-Chromatographie (PLC) liegt bei etwa 20 µm (Abb. 3.2).

Wie oben ausgeführt, muss eine Erniedrigung der mittleren Korngröße nicht un-bedingt zu einer Steigerung der Trennleistung führen. Ganz im Gegenteil, Plattenmit Korngrößen um 3 µm zeigen schlechtere Trennleistungen als Platten mit 5 µmKorngröße. Das hängt mit der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase zusammen.Je kleiner die Korngröße ist, umso langsamer fließt die mobile Phase. Damit steigtnatürlich auch die diffusionsbedingte Zonenverbreiterung [11].


3.3.3 Die Korngrößenverteilung

Die Korngrößenverteilung ist ein noch wichtigeres Maß für die Trenngüte als dieKorngröße selbst. Generell gilt, dass die Plattenqualität umso besser ausfällt, jeenger die Korngrößenverteilung ist, also je einheitlicher die Packung der Platte auf-gebaut ist. Die Korngrößenverteilung von HPTLC-Schichten ist wesentlich engerals die von DC-Schichten oder von präparativen Platten (Abb. 3.2). Die Korngrö-ßenverteilung hat einen Einfluss auf die Fließgeschwindigkeit. Diese nimmt mitsteigender Korngrößenverteilung zu [11].

3.3.4 Die spezifische Oberfläche (Os =VS /dp)

Die spezifische Oberfläche der DC-Sorbenzien berechnet sich aus dem Volumen derstationären Phase (Vs) geteilt durch die mittlere Korngröße (dp). Sie liegt im Bereichvon 100 bis 500 m2 / g. Nach der Snyder’schen Beziehung (3.1) steigt die Substanz-retention linear mit dem Wert der spezifischen Oberfläche an. Bedingung dabei ist,dass die Probemoleküle freien Zugang zur Adsorptionsstelle erhalten. Darüber ent-scheidet die Porengröße der Materialien.

3.3.5 Porenvolumen (Vp)

Das Porenvolumen gibt an, wie viel mobile Phase sich in 1 g stationärer Phase löst.Das Porenvolumen ist eng mit der spezifischen Oberfläche und dem Porendurch-messer verknüpft und liegt bei DC-Platten zwischen 0,8 ml / g und 1,2 ml / g. EineAusnahme machen monolithische UTLC-Platten mit 0,3 ml / g. Die Fließgeschwin-digkeit fällt mit steigendem Porenvolumen [11].

3.3.6 Der mittlere Porendurchmesser (Pd)

Der mittlere Porendurchmesser von DC-Sorbenzien liegt zwischen 5 nm und 10 nm.Aussagekräftiger als der mittlere Porendurchmesser ist die Angabe der Porengrö-ßenverteilung. Auch hier sollte die Varianz der Verteilung nicht zu groß sein. Dermittlere Porendurchmesser berechnet sich zu [12]:

Pd D 4VpŒml=g�

OsŒm2=g�Œnm� :

Vp PorenvolumenOS Spezifische Oberfläche

Alle kommerziellen DC-Platten sind hinsichtlich dieser Parameter standardi-siert. Die wichtigsten Eigenschaften der verschiedenen Schichtmaterialien sollenim Weiteren kurz vorgestellt werden. Eine gute Übersicht dazu findet sich bei N.Grinberg [1].


3.4 Die wichtigsten stationären Phasen in der DC

3.4.1 Aluminiumoxid

Aluminiumoxid für die DC wird aus Tonerden durch Entwässerung bei 500 °C ge-wonnen. Es gehört wie Kieselgel zur Gruppe der spezifisch wirkenden ionisch-polaren Adsorbenzien, besitzt aber eine etwas niedrigere Aktivität als Kieselgel. DiePartikelgröße kommerziell erhältlicher Al2O3-Phasen liegt zwischen 5 und 40 µm.Die spezifische Oberfläche wird in der Literatur mit 150 bis 200 m2 / g angegeben.Das Porenvolumen liegt bei 0,1 bis 0,4 ml / g, und die mittlere Porengröße bewegtsich zwischen 20 und 350 Å, beträgt also 2 bis 35 nm. Die mittlere Konzentrationvon OH-Gruppen auf der Oberfläche liegt bei etwa 13 µmol / m2. Das Porenvolumenund die aktive Oberfläche lassen sich durch die Wahl der Entwässerungstemperaturbeeinflussen.

Für die Substanzretention sind verschiedene Funktionen verantwortlich. Koor-dinativ ungesättigte Al3+-Zentren können als Lewis-Säuren an �-Elektronensyste-me und andere nukleophile bzw. basische Gruppen binden. Die O2�-Gruppen imKristallgitter können als basische Zentren für protonenfunktionelle Partner wirken.Außerdem fungiert die polare AlOH-Gruppe als Dipolpartner und schwacher Pro-tonendonator. Al2O3-Phasen sind besonders gut zur Trennung von aromatischenVerbindungen geeignet. Aluminiumoxid reagiert schwach alkalisch (pH = 9–10),wird von den Herstellern aber auch neutral (pH = 7–8) oder sauer (pH = 4–4,5)eingestellt. Saures Aluminiumoxid enthält Reste von Aluminiumchlorid, währendbasisches Al2O3 noch Natriumaluminate enthält. Nur neutrales Al2O3 besteht ausreinem Aluminiumoxid.

Ein wichtiger Parameter für Aluminiumoxidphasen ist der Wassergehalt. Voneinigen Herstellern wird dieser eingestellt, um eine definierte Aktivität zu erhalten.

Als Binder bei der Plattenherstellung werden Gips (CaSO4) oder organischePolymere, meist Polyacrylamid-Homo- oder -Copolymerisate, verwendet. Alumi-niumoxid ist katalytisch aktiv, sodass bei Ketonen und Estern im Laufmittel oder inder Probe mit chemischen Reaktionen gerechnet werden muss.

3.4.2 Magnesiumsilicat

Magnesiumsilicat wird als Adsorbens wenig benutzt und ist als Florisil® im Handel.Seine Polarität liegt zwischen der von Aluminiumoxid und Kieselgel. Eine kataly-tische Aktivität ist nicht bekannt. Florisil® wird häufig zur präparativen Trennungsowohl in der Dünnschicht- als auch in der Säulenchromatographie verwendet [1].

3.4.3 Kieselgel

Kieselgel ist auch heute noch das mit Abstand wichtigste DC-Adsorbens. Un-ter Kieselgel versteht man amorphes und hochporöses Siliciumdioxid mit großer

3.4 Die wichtigsten stationären Phasen in der DC 67

Oberfläche. Es wird durch Fällung mit Salzsäure aus Wasserglas (Natriumsilicat,Na2SiO3) synthetisch gewonnen. Durch Variation der Fällungsbedingungen unddurch spezielles Nachbehandeln lassen sich die gewünschten Oberflächen gezieltherstellen. Es werden spezifische Oberflächen von 400 bis 800 m2 / g erhalten. DasPorenvolumen liegt bei 0,5 bis 1,2 ml / g und die mittlere Porengröße bewegt sichzwischen 40 und 120 Å. Die mittlere Oberflächenkonzentration von OH-Gruppenliegt bei etwa 8 µmol / m2, das sind etwa 5 OH-Gruppen pro nm2. Als Binder, umKieselgel auf der Plattenunterlage zu fixieren, werden Gips, Stärke oder organischeBinder benutzt.

Die Sorptionseigenschaften von Kieselgel lassen sich auf polare SiOH-Gruppenzurückführen. Sie bewirken starke H-Brückenfunktionen, die das Kieselgel hydro-phil und polar machen. Kieselgel hat darüber hinaus auch schwache Eigenschafteneines sauren Kationenaustauschers. Kieselgel bindet bis zu drei Molekülschich-ten Wasser an sein SiOSi-Gerüst. Die beiden äußeren Wasserschichten lassen sichdurch trockene Laufmittel oder durch eine Wärmebehandlung bei 120 °C reversibelentfernen. Ab 200 °C spalten vicinale SiOH-Bindungen Wasser ab, das von der DC-Platte nur schlecht oder gar nicht wieder aufgenommen werden kann. Ab 1000 °Cverliert das Kieselgel seine Aktivität fast völlig und wird zu SiO2. Im Laborbetriebsollten Kieselgele daher nicht über 180 °C erhitzt werden, um die Kieselgelstrukturnicht nachhaltig zu verändern.

Das in der DC am weitesten verbreitete Kieselgel ist Kieselgel 60 der Fa. Merck(Darmstadt) mit einer Porengröße von 60 Å bzw. 6 nm. Die mittlere Partikelgrö-ße der klassischen 20 cm × 20 cm großen DC-Platten beträgt 10 bis 20 µm mit ei-ner relativ großen Korngrößenverteilung. Die Partikelgröße der 10 cm × 10 cm bzw.10 cm × 20 cm großen HPTLC-Platten liegt bei 5 bis 15 µm. Die Verwendung re-gulärer kugelförmiger, also sphärischer Partikel der Fa. Merck (Abb. 3.3) wird mitdem Namen LiChrospher® gekennzeichnet.

Die Entwicklungszeiten von LiChrospher-Phasen liegen um etwa 20 % unterdenen von irregulär strukturierten Kieselgelen. So gelingt das Zurückdrängen derDiffusion, und es werden kompaktere Flecke und damit bessere Auflösungen er-reicht. Dies ist in Abb. 3.4 bei Trennungen verschiedener Pestizide eindrucksvollzu sehen. Die Selektivität wird von der Partikelform nicht beeinflusst.

Mit den Materialien DurasilR® und Nano-DurasilR® hat die Fa. Macherey-Na-gel (Düren) sehr harte, wasserfeste und mit Wasser benetzbare Fertigschichten aufden Markt gebracht, auf deren Oberfläche man sogar mit Bleistift schreiben kann,ohne die Schicht zu zerstören. Ähnliche Platten werden auch von der Firma What-man (Großbritannien) angeboten. Das Kieselgel-60-Material Partisil® K6 der glei-chen Firma zeichnet sich durch große Reinheit des Schichtmaterials aus.

Kieselgelschichten werden vor der Trennung häufig mit den verschiedenstenChemikalien imprägniert. Das kann durch Eintauchen, durch gleichmäßiges Auf-sprühen oder durch ein Entwickeln der Platte mit der Imprägnierlösung erreichtwerden. Wird nur eine Änderung des pH-Wertes gewünscht, reicht es, die Plattein einer Entwicklungskammer Ammoniakdämpfen oder Essigsäure- bzw. Amei-sensäuredämpfen auszusetzen. Aus der Vielzahl von Trennbeispielen [1] sei dieImprägnierung mit Silberkationen oder mit methanolischer Borsäure erwähnt. Sil-


Abb. 3.3 Rasterelektronische Aufnahme von HPTLC-Platten mit a irregulärer Struktur und bregulärer sphärischer Struktur. (Mit freundlicher Genehmigung der Fa. Merck, Darmstadt)

berimprägnierte Kieselgele können Lipide trennen, die sich nur in einer Doppelbin-dung unterscheiden [13]. Auch cis-trans-Isomere sind so trennbar [14] ebenso wieorganische Sulfonsäuren [13], Cholesterinderivate [15], Steroide [16] und Chinone[17]. Eine große Anzahl von Publikationen zur Trennung ungesättigter Fettsäurenbeschreibt diese Imprägnierungsart [1]. Der Mechanismus der Trennung beruht aufder reversiblen Bildung von �-Komplexen zwischen Silberkationen und isoliertenDoppelbindungen. Zur Imprägnierung wird eine Kieselgelplatte zirka 3 Minuten ineine 3 %ige AgNO3-Lösung (Methanol/Wasser 93 + 7) getaucht. Danach wird diePlatte bei 100 °C im Trockenschrank getrocknet. Die so behandelte Platte muss un-ter Lichtausschluss gelagert werden. Unter Hexan können silberimprägnierte Plat-ten auch längere Zeit aufbewahrt werden.


2

1

3

4

5

6

7

8

Fro

nt

Start

2

1

3

4

5

6

7

8

Fro

ntStart

a b

Abb. 3.4 Dargestellt ist a auf Kieselgel KG 60 und b auf LiChrospher® KG 60 die Trennung(über 6 bzw. 5 cm) von Hexazinon, Metoxuron, Monuron, Aldicarb, Azinphosmethyl, Prometryn,Pyridat und Trifluralin mit Petrolether/Aceton (70 + 30, V / V) als Laufmittel. (Mit freundlicherGenehmigung der Fa. Merck, Darmstadt)

Durch Imprägnierung mit Borsäure lassen sich Moleküle mit vicinalen OH-Gruppen sehr effektiv auf der Platte verzögern. Es konnten Triglyceride [18, 19],Phospolipide [20, 21] und Urethanderivate [22] erfolgreich aufgetrennt werden.Diese Technik findet insbesondere in der Zuckeranalytik Anwendung [1, 23].

Auch die Imprägnierung von Kieselgelphasen mittels EDTA zur Trennung vonPhospholipiden [24], Cephalosporinen [25], Tetracyclinen [26] sowie Schwermetal-len [27] wurde in der Literatur beschrieben. Eine allgemeine Übersicht zur Platten-imprägnierung mit EDTA und Borsäure findet sich unter [28]. Bekannt ist auch dieAuftrennung von polyaromatischen Kohlenwasserstoffen auf coffeinimprägnierterKieselgelphase [29]. Hier ist die Ausbildung von Charge-Transfer-Komplexen füreine Verbesserung der Trennung verantwortlich.

Eine interessante Idee, das Reflexionsverhalten einer DC-Platte zu verändern,besteht darin, eine Kieselgelplatte in eine Berberin-Lösung (2 mg / 100 ml, gelöst inMethanol) zu tauchen. Auf der trockenen Platte fluoreszieren lipophile Verbindun-gen besonders intensiv [30].

Beschrieben werden auch Imprägnierungen, die die Löslichkeit der Probe inder mobilen Phase verändern. Dazu werden häufig Formamid und (NH4)2SO4

benutzt.Wie schon erwähnt, ist Kieselgel auch heute noch das mit Abstand wichtigs-

te DC-Adsorbens. Fast immer beginnt eine Methodenentwicklung in der DC aufeinfachem, unbehandeltem Kieselgel 60. Meistens reichen deren Eigenschaften für


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Trennstrecke (mm)

-lg(R

)

Abb. 3.5 Gezeigt ist das Densitogramm einer Trennung von Harnsäure (1), Cytosin (27),Guanin (38), Coffein (51), Adenin (59), Uracil (68) und Thymin (82) auf Kieselgel 60 mitIsopropanol/Toluol/NH3 (25 %ig) (6 + 3 + 1). Die Rf-Werte sind in Klammern angegeben

eine erfolgreiche Trennung völlig aus, wie die Trennung der fünf Nukleotide inAbb. 3.5 zeigt.

3.4.4 Gebundene Kieselgelphasen

Kieselgel kann wegen seiner sehr reaktiven Silanolgruppen chemisch leicht mo-difiziert werden. Eine Vielzahl von Gruppen mit den verschiedensten chemischenFunktionen lassen sich mit der Kieselgelmatrix verknüpfen [1, 31]. Man erhält ge-bundene Phasen (engl. bonded phases), die für einen weiten Anwendungsbereichgeeignet sind. Gebundene Phasen werden meist mit organischen Polymeren alsBinder auf der Trägerplatte fixiert. Hier sollen nur die wichtigsten, kommerziellerhältlichen Plattenarten vorgestellt werden.

Werden die Kieselgelphasen mit unpolaren Resten reiner Kohlenwasserstoffeverbunden, entstehen unpolare stationäre Phasen, die für die Verteilungschromato-graphie mit hydrophilen mobilen Phasen hervorragend geeignet sind. Kommerziellerhältliche Reversed-phase-Platten sind nach der Kettenlänge der CH2-Glieder mitRP-1, RP-2, RP-8 oder RP-18 gekennzeichnet.

Interessant sind auch Amino-, Cyano- und Diolphasen mit ihren unterschiedli-chen Eigenschaften. Zur Erhöhung der Hydrolysestabilität sind Diol-, NH2- undCN-Gruppen über eine n-Propylgruppe (–CH2–CH2–CH2–) mit der Kieselgelma-trix verbunden. Diese Schichten erhalten dadurch teilweise RP-Charakter, sodasssie sowohl mit wasserhaltigen als auch mit wasserfreien Laufmitteln entwickeltwerden können. Besonders die Cyanophase zeigt eine Zwitternatur. Je nach Lauf-


mittel kann sie als Normalphase oder als RP-Phase benutzt werden. Die Cyano-phase ist damit für 2-D-Entwicklungen hervorragend geeignet. Für modifizierteKieselgelschichten ergibt sich folgende Polaritätsabstufung (von polar zu apolar):

SiO2 > �CH2�CH2�CH2�NH2

> �CH2�CH2�CH2�CN,�CH2�CHOH�CH2�OH

> �CH2�CH3 (RP-2)

> �.CH2/7�CH3 (RP-8) > �.CH2/17�CH3 (RP18) :

Die verschiedenen gebundenen Kieselgelphasen haben alle unterschiedliche Mi-krostrukturen, die gut untersucht sind [1, 32]. Allgemein kann konstatiert werden,dass die Ketten kurzer Reste senkrecht von der Kieselgeloberfläche abstehen, wäh-rend längere Ketten eher gebogen sind. Die verschiedenen Längen der funktionellenGruppen beeinflussen direkt den Porendurchmesser und damit das Porenvolumen[32]. Cyano- und Diolphasen sind wie reines Kieselgel für alle Trennproblemegeeignet. Die schwach basische Aminophase wird bevorzugt zur Trennung vonCarbon- und Sulfonsäuren, Phenolen, Purinen, Steroiden und Zuckern eingesetzt.Je nach pH-Wert des Laufmittels liegt die Aminogruppe als neutrale –NH2-Grup-pe oder protoniert als kationische –NH3

+-Gruppe vor. In protonierter Form wirktdie Aminophase als schwacher Anionenaustauscher. Die Aminophase zeigt eineBesonderheit. Sie reagiert chemisch mit Carbonylverbindungen und deshalb soll-ten Ketone nicht als Laufmittel verwendet werden. Wird die Aminophase nach derTrennung auf etwa 120 °C (oder darüber) erhitzt, reagieren Carbonylgruppen mitder NH2-Gruppe unter Wasserabspaltung zu stark fluoreszierenden Zonen, wobeieine –N=C-Gruppe ausgebildet wird. Dies stellt eine elegante Art zur Fluoreszenz-detektion von Zuckern dar [33].

Im Bereich der unpolar gebundenen Phasen hat sich die RP-18-Belegung durch-gesetzt. Mit ihr lassen sich klassische verteilungschromatographische Trennungendurchführen, die der RP-Chromatographie in der HPLC entsprechen. Allerdingswird die RP-18-Phase ab einem bestimmten Wasseranteil nicht mehr benetzt. Da-mit können reine wässrige Proben nicht mehr auf die Platte aufgetragen werden.Im Handel werden jedoch teilsilanisierte RP-18-Platten angeboten, die dieses Pro-blem nicht mehr zeigen (Fa. Macherey-Nagel und Merck). Diese Platten sind nurnoch zu etwa 6 % (und nicht zu 32 %) silanisiert. Die unpolare RP-Belegung hatsich zur Trennung von unpolaren bis mittelpolaren Substanzen als hervorragendgeeignet erwiesen. Abbildung 3.6 zeigt die Trennung unpolarer Blattfarbstoffe wieCarotin, Chlorophyll a und b sowie die gelben Farbstoffe Lutein, Violaxanthin undNeoxanthin mit einem Laufmittel aus Methanol, Wasser und Aceton. In ihrer Auf-lösung steht die RP-18-Phase den reinen Kieselgelsorbenzien in nichts nach. Beiden gebundenen Phasen werden zur Plattenfixierung sowohl Gips wie auch organi-sche Binder eingesetzt. Die Porengröße liegt in der Regel um 6 nm (60 Å) und diePartikelgröße zwischen 5 und 25 µm. Die Plattendicke beträgt 0,2 bis 0,25 mm.

Abbildung 3.7 zeigt die Trennung unpolarer polyaromatischer Kohlenwasser-stoffe (PAKs) mit einem Laufmittel aus Methanol und Aceton. Für die Trennungfluoreszierender Verbindungen wie PAKs eignet sich die RP-18-Platte besonders,


Abb. 3.6 Dargestellt ist eineRP-18-Trennung von ˇ-Caro-tin (bei 4 mm), Chlorophyll aund b, Lutein, Violaxanthinund Neoxanthin, entwickeltmit Methanol/Aceton/Wasser(30 + 30 + 5, V / V) und imBereich von 425–465 nmvermessen

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Trennstrecke (mm)

-lg(R

)

da auf ihr die Fluoreszenz in der Regel stärker zu sehen ist als auf polaren Kiesel-gelplatten.

Ein Problem der chemisch modifizierten Phasen ist eher trivial: Viele in derLiteratur erwähnten Modifizierungen sind kommerziell nicht erhältlich. In der Lite-ratur werden dazu einfache Verfahren beschrieben, Kieselgelplatten nachträglichbeliebig zu modifizieren [34, 35]. Am einfachsten geht man wie folgt vor. DieKieselgelplatte wird etwa 2 h ohne Abdeckung bei 110 °C getrocknet. Unter Was-serausschluss wird eine 1 %ige bis 2 %ige Lösung von Di- oder Trichchloralkylsilanin trockenem Toluol oder Propylencarbonat hergestellt. Immer zwei Platten werden,Glasrücken an Glasrücken, in die Reaktionslösung getaucht. Nach 15 Minuten Ul-traschallbehandlung (zur optimalen Reagenzverteilung in der stationären Phase und

Abb. 3.7 Dargestellt ist eine RP-18-Trennung von zehn polyaromatischen Kohlenwasserstoffen,entwickelt mit dem Laufmittel Methanol/Aceton (8 + 3, V / V) und im Bereich von 218 bis 228 nmvermessen


Abb. 3.8 Reaktionsgleichungen zur Darstellung chemisch gebundener Phasen [34, 35]

VI

IVIII

III

VIII

VII

V

basisch

dipolarsauer

Aminophase

Cyanophase

Diolphase

KieselgelundAluminium-oxid

Abb. 3.9 Dargestellt ist die schematische Einordnung der verschiedenen Phasen bezüglich derdrei Eigenschaften sauer, basisch und dipolar. (Aus [3])

zur Beseitigung eventueller Luftblasen) werden die Platten 12 h in der Reaktions-lösung belassen. Anschließend werden die Platten 2 h bei 110 °C getrocknet undim Anschluss mit Methanol gewaschen. Die ablaufende Reaktion ist in Abb. 3.8dargestellt.

Die bis hierher besprochenen stationären Phasen lassen sich entsprechend ihrerbasischen, sauren oder dipolaren Eigenschaften in ein Selektivitätsdiagramm ein-ordnen (Abb. 3.9). Man sieht sehr schön, dass die Cyanophase in der graphischenDarstellung dieser drei Eigenschaften etwa in der Mitte liegt.


3.4.5 Kieselgur

Unter Kieselgur versteht man die fossilen Skelette von mikroskopisch kleinen Kie-selalgen. Kieselgur besteht zu über 90 % aus Kieselsäure, enthält aber auch Restevon Al2O3, Fe2O3, MgO, TiO2, CaO und Carbonaten. Kieselgur wird aus geolo-gischen Lagerstätten gefördert und ist nur nach aufwendiger Reinigung als DC-Adsorbens einsetzbar. Im Vergleich zum Kieselgel besitzt es mit 1 bis 3 ml / g eingrößeres Porenvolumen. Die Porengröße liegt zwischen 104 und 105 Å. Wegen die-ser Makroporen sind die spezifischen Oberflächen von Kieselgur mit 1 bis 5 m2 / grelativ klein. Die Partikelgröße liegt zwischen 5 und 40 µm. Als Binder zur Fi-xierung auf der Plattenunterlage wird in der Regel Gips benutzt. Kieselgur wirdwegen seiner geringen Aktivität zum Verdünnen von Kieselgel benutzt und auchals Material in Konzentrierungszonen verwendet. Wegen der geringen Aktivitätlaufen die Probemoleküle hier schneller als auf anderen Trennphasen. Kieselgur-platten werden wegen ihres großen Porenvolumens auch als „Stützphase“ für dieVerteilungschromatographie verwendet, indem sie mit Paraffin oder Siliconöl ge-tränkt und zur Reversed-phase-Chromatographie eingesetzt werden. Natürlich kannKieselgur auch mit polaren Substanzen belegt werden, um Normalphasenchroma-tographie zu betreiben. Neben Wasser eignen sich zur Belegung z. B. Dimethyl-sulfoxid, Ethylenglykol, Ethylendiamin oder andere polare Substanzen. Diese Artder Chromatographie ist wirkliche Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie, dakeine Phase mehr kovalent gebunden ist. Der Vorteil liegt im schnellen und fastbeliebigen Aufbau eines gewünschten Verteilungssystems. Man ist nicht auf dieAngebote der kommerziellen Plattenlieferanten angewiesen. Der Nachteil liegt im„Bluten“ der Platten, denn die Belegung kann während der Entwicklung teilweiseausgewaschen werden, was sich spätestens bei der Detektion als ansteigende Basis-linie bemerkbar macht.

Als Kieselgurersatz wird das Kieselgel 50.000 angeboten. Es ist sehr porös undabsolut inaktiv. Es zeigt ähnliche chromatographische Eigenschaften wie Kieselgur,besitzt aber nicht dessen Verunreinigungen. Es hat einen mittleren Porendurch-messer von 5000 nm, ein spezifisches Porenvolumen von etwa 0,6 ml / g und einespezifische Oberfläche von 0,5 m2 / g. Kieselgel 50.000 ist damit ebenfalls für dieoben beschriebene Verteilungschromatographie geeignet. Zur Plattenfixierung wer-den in der Regel organische Binder verwendet.

3.4.6 Cellulose

Pulverförmige Cellulose für die DC wird aus Baumwollcellulose gewonnen. Derchemischen Struktur nach ist Cellulose polymere Glucose. Es werden zwei Quali-täten unterschieden:� native Cellulose mit weitgehend erhaltener Faserstruktur. Der durchschnittliche

Polymerisationsgrad dieser Cellulose liegt in der Größenordnung von 300 bis600 Zuckereinheiten.


� chemisch stark abgebaute sogenannte „mikrokristalline“ Cellulose, die eingroßes Quellvermögen besitzt. Die Herstellung erfolgt durch Hydrolyse mit2,5-molarer HCl. Der durchschnittliche Polymerisationsgrad liegt hier zwischen40 und 200 Zuckereinheiten.Die Faserlänge des Cellulosematerials beträgt 2 bis 20 µm, was auch in etwa der

Korngröße dieses Materials entspricht. Die kurzen Fasern der DC-Cellulose ver-hindern einen zu schnellen Laufmitteltransport entlang der langen Faserteile, wieer bei unbehandelter Cellulose zu beobachten ist. Die Substanzflecke sind daherwesentlich kompakter als in der Papierchromatographie. Bei behandelter Cellulo-se werden spezifische Oberflächen von etwa 2 m2 / g erhalten. Bei Celluloseplattensind Binder nicht nötig, da Cellulose wegen der großen Anzahl an OH-Bindungenselbst ein guter Kleber ist.

Unter Aufquellen nimmt Cellulose vor allem Wasser, aber auch andere polareLösungsmittel wie z. B. Alkohole auf. Es werden dabei H-Brücken zu den OH-Gruppen der Glucoseeinheiten ausgebildet. Cellulose ist das klassische Trägerma-terial für Wasser in der Verteilungschromatographie. Cellulose besitzt auch einengeringen Anteil an Carbonsäuregruppen (aus Lignin) und zeigt damit schwach sau-re Ionenaustauschereigenschaften.

Die Cellulosephase kann chemisch leicht modifiziert werden. Durch Acetylie-rung entstehen hydrophobe Phasen für RP-chromatographische Trennungen. Sol-che Phasen werden auch in Zigarettenfiltern zur Adsorption von polyaromatischenKohlenwasserstoffen benutzt. Große Bedeutung besitzen Ionenaustauscher auf Cel-lulosebasis, weil sie einfach herzustellen sind. Wichtige Austauschertypen sind:

Kationenaustauscher� phosphoryllierte Cellulose (–OPO(OH)2)� Carboxymethylcellulose (–OCH2COOH)� Cellulosecitrat (–OOC(CH2COOH)2OH)� Carboxycellulose (–COOH)� Sulfomethylcellulose (–OCH2SO3H)� Sulfoethylcellulose (–OCH2CH2SO3H)

Anionenaustauscher� Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose) (–OCH2CH2NH+(CH2CH3)2)� Triethylaminoethylcellulose (TEAE-Cellulose) (–OCH2CH2N+(CH2CH3)3)� Aminoethylcellulose (–OCH2CH2NH3

+)� p-Aminobenzylcellulose (–OCH2C6H4NH3

+)Mit diesen modifizierten Cellulosefasern können Anionen wie z. B. Phosphate

und auch Aminosäuren getrennt werden (Abb. 3.10). Ein wichtiger Einsatzbereichinnerhalb der Biochemie ist die Trennung und Aufreinigung von empfindlichen Ver-bindungen wie Proteinen, Enzymen, Hormonen oder Nukleinsäuren.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Separation distance (mm)

lgR

Abb. 3.10 Abgebildet ist die Trennung der Aminosäuren Asparaginsäure, Glutaminsäure, Histi-din, Tyrosin, Valin und Isoleucin auf Cellulose mit n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4 + 1 + 1, V / V)als mobiler Phase (zweifach entwickelt). Im zweiten Lauf wird Ninhydrin zugegeben, das nachder Trennung bei 80 °C innerhalb von 10 min mit den Aminosäuren zu einem roten Farbstoff ab-reagiert

3.4.7 Polyamid

Für DC-Trennungen werden zwei Polyamidtypen benutzt, Nylon 6 (Perlon) undNylon 11. Nylonphasen besitzen die funktionelle Gruppe –NH–COO–, wobei dieZahl im Namen jeweils die Anzahl der CH2-Bindungen neben der NH-Gruppe an-gibt. Daneben gibt es auch Polyamidphasen, bei denen die –NH-Gruppe acetyliertist.

Die Amidgruppe verleiht dem Polyamid eine besondere Selektivität für pro-tonenfunktionelle Moleküle. Nylon 6 besitzt hydrophile Eigenschaften, währendNylon 11 eher hydrophob reagiert und für Umkehrphasen-Trennungen geeignetist. Herausragendes Merkmal der Polyamidphasen ist ihre Beladbarkeit mit großenProbemengen, was auf die gute Quellfähigkeit der Phase zurückzuführen ist. Po-lyamidplatten können daher auch für präparative Zwecke eingesetzt werden. Siekommen in der Regel ohne Binder in den Handel.

Besonders gut werden hoch polare, wasserlösliche Verbindungen wie Phenoleund Carbonsäuren bzw. Naturstoffe, die diese Gruppen enthalten, an Polyamid-phasen getrennt. Ebenso gut sind strukturisomere Verbindungen zu trennen. Ab-bildung 3.11 zeigt die Trennung der drei isomeren Nitroaniline. Polyamid ist gegenstarke Säuren und Laugen nicht beständig [31].


Abb. 3.11 Abgebildet ist dieTrennung von p-Nitroanilin(1), m-Nitroanilin (2) undo-Nitroanilin (3) auf Poly-amid-6-Phase. Als Laufmittelwurde CCl4 und Essigsäure(9 + 1, V / V) benutzt. Es wur-de bei 400 nm in Remissiongemessen. (Mit freundlicherGenehmigung von Macherey-Nagel Düren, Deutschland)

0,8

1

3

2

start 50 front

0,4

0,0

3.4.8 Ionenaustauscherharze

Für Spezialanwendungen sind kationische oder anionische Ionenaustauscherharzeim Gemisch mit Kieselgel und organischen Bindern im Handel. Interessant sinddiese Phasen zur Trennung von polaren Verbindungen wie Aminosäuren, Protei-nen, Aminozuckern, Aminocarbonsäuren, Antibiotika sowie Anionen und Katio-nen. Kationenaustauscher bestehen in der Regel aus Polystyrolharzen, die durchDivinylbenzol mit einem Gehalt von 4 % bis 12 % quervernetzt sind. Die Har-ze tragen starke Säuregruppen als funktionelles Element. Es werden Sulfonsäuren(–SO3H), Phosphorsäure (–OPO(OH)2) oder Carbonsäuren (–COOH) eingesetzt.Als schwache Säuren können auch Phenolgruppen (–C6H4–OH) benutzt werden.

Anionenaustauscher besitzen das gleiche Trägerharz wie Kationenaustauscher.Als funktionelle Gruppen werden quaternäre Ammoniumsalze der Struktur –N+(CH3)3 verwendet.

3.4.9 Chirale DC-Phasen

Mit chiralen DC-Platten können optisch aktive Substanzen in ihre Enantiomere auf-getrennt werden, obwohl diese gleiche physiko-chemische Eigenschaften besitzen.Möglich ist dies, weil die Enantiomere vor der Trennung zu Diastereomeren um-gesetzt wurden oder sich während der Trennung Diastereomere im Zusammenspielmit der stationären Phase bilden [36].

lg K D 1

2;3RT.�0

R � �0S/ :


K Verteilungskoeffizient�0

R, �0S Chemische Potenziale zweier Diastereomere

Diastereomere sollten bei niedrigen Temperaturen getrennt werden, denn aus derMartin-Beziehung folgt, dass der Verteilungskoeffizient mit steigender Temperaturabnimmt, eine Trennung also verschlechtert wird [36].

Reine Cellulose ist optisch aktiv und in der Lage, Enantiomere zu trennen. Cel-lulose besteht aus langen Ketten und kann mit Salzsäure hydrolysiert werden. Dabeientsteht eine mikrokristalline Phase, die durch ihre chirale Struktur in der Lage ist,die optisch aktiven Enantiomere unterschiedlich zu fixieren. Modifizierte Formendieser mikrokristallinen Cellulose, wie Cellulosetriacetat, erlauben ebenfalls eineAuftrennung chiraler Moleküle [36].

Die DC-Platte kann aber auch mit einer chiralen Substanz imprägniert werden,und die Diastereomeren bilden sich erst während der Trennung aus. Häufig wirdKieselgel benutzt, an das chirales Prolin bzw. Hydroxyprolin kovalent gebundenist. Es können auch andere chirale Aminosäuren genutzt werden. In der Schichtsind außerdem noch Cu(II)-Ionen enthalten. Die Trennung optisch aktiver Isomereerfolgt auf der Basis von Ligandenaustauschreaktionen. Die optisch aktive Substanzin der Probe bildet mit dem Kupfer als Zentralatom und dem kovalent gebundenen,optisch aktiven Prolin einen Mischkomplex.

Diese, in ihrer Struktur entweder enantiomer oder diastereomer angeordne-ten Kupferkomplexe besitzen unterschiedliche chemische Eigenschaften, und sokönnen die optisch aktiven Reinsubstanzen aufgetrennt werden. Trennbar sind op-tisch aktive Aminosäuren wie auch Peptide. Prinzipiell können alle Substanzen,die Cu(II)-Komlexe bilden, auf diese Art in ihre optischen Antipoden aufgetrenntwerden [34, 36–38]. Diese speziell imprägnierten Cu-Platten werden von der Fa.Macherey-Nagel unter dem Namen CHIRALPLATE® angeboten.

Eine weitere Möglichkeit der chiralen Trennung besteht in der Zumischung op-tisch aktiver Komponenten zum Laufmittel, wie Campherderivate, d-Galacturon-säure oder Erythromycin. Bei dieser Art der Trennung werden häufig Diolplattenverwendet [36]. Bei RP-18-Platten werden als chiraler Zusatz häufig modifizierteund unmodifizierte ˇ-Cyclodextrine, Rinderserumalbumin (engl. bovine serum al-bumin) oder Makrolitantibiotika benutzt [36]. Auch kann man vor der Trennungeine chirale Derivatisierung z. B. mit Marfeys Reagenz (1-Fluor-2,4-dinitrophenyl-5-l-alaninamid) durchführen [39]. So werden schon vor der Trennung Diastereome-re gebildet, die dann auf einer nichtchiralen Platte getrennt werden können.

Eine relativ neue Entwicklung zur chiralen Trennung stellen die sogenannten„imprited“ Phasen dar. Dazu werden Polymermoleküle in Anwesenheit chiralerSubstanzen wie z. B. Chinin hergestellt. Die chiralen Substanzen hinterlassen beider Polymerisierung einen Abdruck, der nach ihrem Auswaschen über die „chi-ralen“ Hohlräume eine unterschiedliche Verzögerung optischer Antipoden ermög-licht [40].


Tab. 3.3 Aufgelistet sind die unterschiedlichen Kodierungen von DC-Platten [41]

Kodierung Bedeutung

G als Binder wird Gips verwendet (13 %)

H Platte ohne Binder

R Material ist speziell gereinigt

P präparative Platten

W Wasser tolerierende, benetzbare Platten

F Schicht enthält einen Fluoreszenzindikator

F254, 366 Anregungs- und Emissionswellenlänge des Fluoreszenzindikators

F254S säurestabiler Fluoreszenzindikator

40, 60 usw. mittlere Porengröße der Schicht in (Å)

C Schicht in Teilbereiche getrennt

RP Reversed phase (umgekehrte Phase)

RP-8, -18 Anzahl der Kohlenstoffatome in der Kette

AMD automated multiple development

NH2 Belag mit Propylamin

CHIR chirale Plattenbelegung

CN Cyanophase

DIOL Dipolphase

3.4.10 Fluoreszenzindikatoren in der Schicht

Zum besseren Erkennen von Substanzen, die im UV-Bereich Licht absorbieren,werden kommerziell vertriebene Platten mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzin-dikatoren belegt. Eine grüne Fluoreszenz wird durch Mangan-aktiviertes Zinksilicatund eine blaue Fluoreszenz durch Magnesiumwolframat in der Schicht hervorgeru-fen. Nur der Indikator Magnesiumwolframat ist säurestabil. Solche Platten werdenmit einem „F“ (für Fluoreszenz) kodiert. Oft wird auch noch die Anregungswel-lenlänge angegeben. Weitere nützliche Angaben zur Plattencharakteristik sind inTab. 3.3 aufgelistet.

3.4.11 Selbst hergestellte Platten

Üblicherweise werden DC-Platten vom Anwender nicht selbst hergestellt, sonderngebrauchsfertig gekauft. Die reproduzierbare Produktion von Kieselgel oder Alumi-niumoxid ist nicht trivial und übersteigt in der Regel die Fähigkeiten auch eines gutausgerüsteten Labors. Man kann diese Phasen natürlich fertig kaufen und sich sei-ne Platten selber streichen. Solche Platten werden aber nie die Reproduzierbarkeitgekaufter Platten erreichen. Außerdem ist, wenn die Arbeitszeit bei der Herstel-lung mit berücksichtigt wird, der Preisvorteil minimal. Es gibt aber eine Reihe vonAnwendungen, für die man seine Platten selbst herstellen muss. Sorbenzien, diez. B. mit Silber-Ionen belegt sind, zeigen keine große Lagerstabilität. Solche Pha-


Abb. 3.12 Schematische Darstellung, wie mit einem Glasstab und zwei Schlauchstücken eineDC-Platte mit konstanter Schichtdicke gestrichen werden kann. (Aus [42], mit freundlicher Ge-nehmigung © Wiley-VCH)

sen müssen in der Regel kurz vor der Verwendung hergestellt werden. Außerdemsind kommerziell erhältliche Platten relativ teuer und für Laboratorien in unter-entwickelten Ländern oft unbezahlbar. Häufig scheitert die Verwendung industriellgefertigter Platten auch an der Abwesenheit von Bezugsquellen.

Hier liegen Gründe für die Verwendung selbst hergestellter DC-Platten. Für La-boratorien in Entwicklungsländern wird sich auch der Bezug von Sorbenzien alswenig praktikabel erweisen. Daher bieten sich natürliche Substanzen als Plattenbe-lag an, die weltweit verfügbar sind.

Eine reproduzierbare Plattenbelegung erhält man z. B., wenn man 27 g Stärkemit 3 g Gips (CaSO4) in 20 ml Wasser und 10 ml Ethanol suspendiert und Glas-platten damit bestreicht [19, 43]. Für Kieselgelplatten wird Kieselgel mit 5 bis13 % Gips gemischt und in 85 %igem Ethanol-Wasser-Gemisch (8,6 + 1,4, V / V)suspendiert. Zum Bestreichen wird ein Glasstab auf beiden Seiten mit einem StückGummischlauch (als Abstandsgeber) überzogen und gut gefettet. Die fertige Sus-pension wird auf eine Glasplatte gegeben und mit dem präparierten Glasstab verteilt(Abb. 3.12), bei Raumtemperatur getrocknet und bei 120 °C aktiviert. Mit der Stär-keplatte gewinnt man eine stationäre Phase, die fast allen analytischen Anforderun-gen in der Lebensmittelanalytik gerecht wird. Mit dieser überall leicht herzustellen-den Plattenbelegung können organischen Säuren, Aminosäuren, die Vitamine E undD2, Anthocyanine sowie die Zucker Fructose, Glucose und Saccharose aufgetrenntwerden [19]. Hier zeigt sich, wie mit einfachen Mitteln gute Analytik betriebenwerden kann!

3.5 Lichtabsorption an Plattenoberflächen

Bei quantitativen Messungen ist das Lichtabsorptionsvermögen von DC-Plattenein wichtiges Auswahlkriterium, denn bei der Vermessung der Platte muss beson-ders auf die Absorptionscharakteristik der stationären Phase Rücksicht genommenwerden. Die spektrale Verteilung des eingestrahlten Lichtes ist in der Regel nicht

3.5 Lichtabsorption an Plattenoberflächen 81

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

200 300 400

Wellenlänge (nm)

-lg(I/

IMgO

)Al2O3

Si60

UTL

LiChrospher

Abb. 3.13 Dargestellt ist der Lichtverlust, gemessen an regulären und irregulären Si60-Platten,UTLC-Platte und Al2O3-Phase im Vergleich zu Magnesiumoxid

identisch mit der spektralen Verteilung des von einer DC-Platte reflektierten Lich-tes, denn ein Teil das Lichtes wird wellenlängenabhängig von der Plattenoberflächeabsorbiert. Mit der Diodenarray-DC steht ein leistungsfähiges System zur Verfü-gung, um die wellenlängenabhängige Plattenabsorption problemlos bestimmen zukönnen. Die Auswertung erfolgt nach folgender Formel:

A./ D � lg

�I./

IMgO./

�: (3.2)

I() von der DC-Platte reflektierte spektrale LichtverteilungIMgO() von einem MgO-Weißstandard reflektierte spektrale Lichtverteilung

Als Weißstandard wird Magnesiumoxid benutzt (MgO), das als Pulver nebendie zu vermessende Platte – leicht angedrückt – aufgeschichtet wird. Bei glei-chem Abstand zum Messinterface werden der Weißstandard mit der Intensität IMgO

und die stationären Phasen mit der Intensität I bei verschiedenen Wellenlängenvermessen. Der berechnete Wert A() bei der Wellenlänge beschreibt einen antei-ligen Lichtverlust der Plattenoberfläche im Vergleich zum Weißstandard. Bei einemAbsorptionswert von A = 1 wird nur noch 1 / 10 der Lichtintensität einer MgO-Ober-fläche reflektiert, bei einem Wert von A = 0,5 nur noch etwa 1/3 der reflektiertenLichtintensität des Weißstandards.

In Abb. 3.13 sind verschiedene Kieselgel-Phasen (Si60, irregulär und regulär be-schichtete LiChrospher®-Platte) dem Reflexionsspektrum von Aluminiumoxid ge-genübergestellt. Oberhalb von 300 nm reflektieren alle anorganischen Phasen (mitAusnahme der UTL-Schicht) Licht mit einer der Magnesiumoxid-Belegung ver-gleichbaren Intensität.

Es zeigt sich, dass die Plattenabsorption des Lichtes stark von der verwendetenstationären Phase abhängt, denn gerade chemisch modifizierte Plattenoberflächen


absorbieren Licht im Bereich unter 300 nm stärker als reines Kieselgel. Bei allenin Abb. 3.13 dargestellten Platten wird unterhalb von 300 nm nur etwa 1 / 3 derLichtintensität reflektiert (A = 0,48), die von einer MgO-Oberfläche gestreut wird.LiChrospher®- und Si60-Platten unterscheiden sich leicht im Streuvermögen, wasauf unterschiedliche Bindersysteme zurückgeführt werden kann. Zwischen Al2O3

und SiO2 ist so gut wie kein Unterschied feststellbar.Interessant ist das Streuvermögen der UTLC-Platte. Über den ganzen spektralen

Beeich reflektiert diese Plattenart nur etwa 1/3 der Lichtintensität, die alle anderenPlattenoberflächen reflektieren. Dies ist eine Folge der äußerst geringen Schichtdi-cke von nur 10 µm und der damit verbundenen Transmissionsverluste. Alle anderenPlatten haben eine Schichtdicke von 100 µm. Interessant an der UTLC-Platte ist diegeringe Lichtabsorption bei 200 nm. Auch fehlt das markante Absorptionssignal um220 nm. Offensichtlich ist dieser Absorptionspeak nicht auf Kieselgel- oder Alumi-niumoxid, sondern entweder auf Verunreinigungen in der stationären Phase oderauf den Binder zurückzuführen. In einer UTLC-Schicht ist kein Binder enthalten,allerdings wird das UTLC-Kieselgel auch nicht in Eisenbehältern hergestellt. DieVorstufe des UTLC-Plattenmaterials wird aufgedampft und erst auf der Platte che-misch modifiziert.

Vieles spricht dafür, dass das Absorptionssignal der Aluminiumoxid- und Kie-selgelplatten von Eisen-Ionen herrührt, die um 220 nm absorbieren. Es ist bekannt,dass diese Sorbenzien während des Malvorgangs leicht mit Eisen verunreinigt wer-den können.

Chemisch modifizierte Phasen zeigen im Bereich unterhalb von 250 nm einenansteigenden Lichtverlust, wie in Abb. 3.14 zu erkennen ist. Die Aminophase ab-sorbiert dabei mehr Licht als eine RP-18-Belegung. Bei Aminophasen machen sichdie freien Elektronenpaare der NH2-Gruppe mit einer starken Absorption im Be-reich unterhalb von 250 nm bemerkbar. Die Absorptionsspektren von RP-2-, RP-8-und RP-18-Phasen sind absolut identisch.

In Abb. 3.14 ist auch der prozentuale Lichtverlust einer Cellulosebelegung dar-gestellt. Cellulose ist die stationäre Phase mit den meisten funktionellen Gruppen.Die starke Absorption dieser Phase im UV-Bereich zwischen 300 und 400 nm istdaher nicht überraschend. Diese relativ starke Absorption oberhalb von 300 nm zei-gen Kieselgel- und Aluminiumoxidplatten nicht, ebenso wie gebundene Phasen.Trotzdem ist die Cellulosephase, ebenso wie alle anderen Belegungen, für Messun-gen im Bereich unterhalb von 400 nm uneingeschränkt einsetzbar. Eine Ausnahmebildet die NH2-Phase, die für Messungen unterhalb von 230 nm nur eingeschränktverwendbar ist, denn diese Plattenart zeigt in diesem Bereich doch eine sehr starkeLichtabsorption.

Kieselgur und Ionenaustauscherphasen reflektieren im Wellenlängenbereich un-terhalb von 250 nm nur noch 1 / 10 des Lichtes, das die MgO-Oberfläche reflek-tiert (Abb. 3.15). Verunreinigungen sind bei dem Naturprodukt Kieselgur wohlunvermeidlich. Die auf der Basis von organischen Polymeren aufgebaute Austau-scherphase zeigt im Bereich unterhalb von 300 nm starke Absorptionen, die diesePlattenart für spektrometrische Aufnahmen in diesem Bereich stark einschränken.

3.5 Lichtabsorption an Plattenoberflächen 83

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

200 300 400Wellenlänge (nm)

-lg(I/

IMgO

)

NH2

RP-18

Cellulose

Abb. 3.14 Dargestellt ist der Lichtverlust von NH2-, RP18- und Celluloseplatten, gegen MgOaufgenommen

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

200 300 400

-lg(I/

IMgO

)

Wellenlänge (nm)

Kationenaustauscher

Kieselgur

Abb. 3.15 Dargestellt ist der Lichtverlust einer Kieselguroberfläche und einer Kationenaustau-scherphase, gegen MgO gemessen

Insbesondere sieht man ein starkes Signal um 280 nm, das von den Phenylgruppender Polystyrolharze und des Quervernetzers Divinylbenzol verursacht wird.

Auch Nylon 6 und Nylon 11 zeigen intensive Absorptionsbanden im Bereichunterhalb von 250 nm, die wesentlich intensiver sind als die der NH2-Phasen. Kie-selgur, Austauscherharze und Polyamidphasen sollten daher bei Remissionsmes-sungen nur im Bereich oberhalb von 300 nm Verwendung finden.


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4Diemobile Phase in Absorptions- undVerteilungschromatographie

In der Dünnschichtchromatographie sind eigentlich nur drei Freiheitsgrade vor-handen, über die das chromatographische Resultat tiefgreifend beeinflusst werdenkann. In der Verteilungschromatographie kann die Polarität der stationären Phaseund in der Adsorptionschromatographie deren Aktivitätseigenschaften zur Steue-rung der Trennung benutzt werden. Über die Art der Entwicklungskammer gewinntman Einfluss auf die Dampfphase. Der bei Weitem wichtigste Einflussparameter beiDC-Trennungen ist jedoch die Wahl der mobilen Phase.

Die Entwicklung einer DC-Platte beginnt immer mit einer Einstellung desGleichgewichtes zwischen mobiler und stationärer Phase. Dies ist ein Unterschiedzur HPLC, bei der eine Trennung immer erst nach der Gleichgewichtseinstellungzwischen mobiler und stationärer Phase gestartet wird. In der DC kommt das Fließ-mittel erst bei Beginn der Trennung mit der trockenen Phase in Kontakt, und erstdurch diesen Vorgang bildet sich die mobile Phase in Wechselwirkung mit Sor-bens, Fließmittel und Gasraum aus. Das Fließmittel wird in der DC vorgegeben.Das Laufmittel, also die Zusammensetzung der mobilen Phase, bildet sich erstdurch Wechselwirkungen während der chromatographischen Entwicklung.

Auch das Schichtmaterial der Platte (das Sorbens) ist nicht mit der stationärenPhase identisch, sondern bildet sich ebenfalls erst in Wechselwirkung mit demFließmittel aus. Dieser Vorgang wird durch die Verteilungszahl bestimmt. Bei derAusbildung der stationären Phase entsteht in der mobilen Phase ein Frontgradi-ent aus den Fließmittelmolekülen, die zur Ausbildung der stationären Phase nichtbenötigt wurden.

Nimmt das Sorbens über seine Oberfläche direkt am chromatographischen Pro-zess teil, wird dies als Adsorptionschromatographie bezeichnet. Ist die stationärePhase nur Träger einer fixierten Flüssigkeit, liegt eine Verteilungschromatogra-phie vor. Auf jeden Fall bestimmt das Fließmittel maßgeblich die Art der Trennung.

Da mobile und stationäre Phase sich erst im Wechselspiel zwischen Fließmittelund Sorbens ausbilden, ist eine Gleichsetzung von Fließmittel und mobiler Phasefür so gut wie alle DC-Trennungen falsch [1, 2].


88 4 Die mobile Phase in Absorptions- und Verteilungschromatographie

4.1 Die Eigenschaften von Fließmitteln

Fließmittel haben in der Chromatographie eine Doppelfunktion: Sie sind für denTransport der Analyte und für die Ausbildung der beiden Trennphasen verantwort-lich. Die entscheidende Eigenschaft für eine Transportfunktion ist die Fließmittel-stärke. Für eine Trennwirkung ist die Selektivität verantwortlich.

Zum Transport eines Analyten muss dieser im Fließmittel bzw. in der mobi-len Phase gelöst und an der stationären Phase verzögert werden. Eine Substanzzu lösen bedeutet, sie in die Struktur eines Lösungsmittels zu integrieren. Die da-für benötigte Energie, die sogenannte Solvatationsenergie, wird durch die Bindungvon Lösungsmittelmolekülen an den Analyten aufgebracht. Es entsteht ein Ana-lyt-Lösungsmittel-Komplex. Ähnlich läuft auch der Mischungsvorgang zwischenzwei Lösungsmitteln ab. Beide verlieren ihre Struktur zugunsten einer gemeinsa-men, homogenen Verteilung. Unterscheiden sich die Lösungsmittel zu stark, bildetsich eben keine homogene Mischung aus, sondern es zeigen sich zwei oder mehrPhasen. Allgemein gilt dabei der Grundsatz: Gleiches löst Gleiches (like dissolveslike). Wir unterscheiden zwischen „hydrophilen“ und „hydrophoben“ Lösungsmit-teln. Nur hydrophile Lösungsmittel sind in der Lage, sich mit Wasser zu mischen.Hydrophile Lösungsmittel lösen hydrophile Analyte und umgekehrt.

Wird eine gelöste Substanz chromatographiert, kann diese direkt oder über ih-re Solvathülle mit der stationären Phase wechselwirken. Anorganische Ionen (wiez. B. Metallkationen oder auch NO�

3 -, PO3�4 -Ionen usw.) besitzen meist eine stabil

gebundene Hydrathülle (Aquakomplexe), die von unpolaren organischen Lösungs-mittelmolekülen nicht aufgebrochen werden kann. Dies ist der Grund, warum sichIonen in organischen Lösungsmitteln kaum lösen. Kombiniert man diese Ionen al-lerdings mit einem genügend großen Gegenion, erhält man ein lösliches Ionenpaar,das über einen Verteilungsprozess chromatographiert werden kann.

Prinzipiell können in der Dünnschichtchromatographie alle Flüssigkeiten alsFließmittel genutzt werden. In der Praxis gilt dies leider nur mit Einschränkun-gen. Fließmittelbestandteile sollten so weit wie möglich ungiftig sein, weder einenzu hohen noch einen zu niedrigen Dampfdruck aufweisen und eine ausreichendechemische Stabilität besitzen. Alle chlorierten Kohlenwasserstoffe wie Methylen-chlorid oder Chloroform sind gesundheitsbedenklich und sollten als Fließmittelmöglichst gemieden werden. Werden sie trotzdem benutzt, sollten gebrauchteFließmittel getrennt in Abfallbehältern für chlorierte und unchlorierte Laufmittelgesammelt werden. Nachweislich kanzerogene Substanzen wie Benzol oder Te-trachlorkohlenstoff sollten ebenfalls nicht Verwendung finden. Auch der Einsatzvon Diethylether ist wegen seines hohen Dampfdruckes problematisch. Bei allenEthern (wie Diethylether, Dioxan oder THF) muss generell mit der Bildung vonexplosiblen Peroxiden gerechnet werden. Diese Substanzen dürfen nur in braunenFlaschen gelagert werden, da Peroxide durch Licht (und Sauerstoffeintrag) gebil-det werden. Generell sollten Ether daher nur in kleiner Menge am Arbeitsplatzvorgehalten werden. Eine Ausnahme bildet der Methyl-tert-Butylether (MTBE),der keine Peroxide bilden kann. Dieser Ether wird mikrobiologisch allerdings nurschlecht abgebaut und darf deshalb auf keinen Fall in die Umwelt gelangen.

4.1 Die Eigenschaften von Fließmitteln 89

Fließmittel müssen in genügender Reinheit verfügbar sein. Dies ist bei Chloro-form häufig nicht der Fall, da Chloroform in der Regel mit Ethanol stabilisiert wird.Chloroform wurde deshalb früher in der eluotropen Reihe falsch eingeordnet, weilman den Ethanolgehalt übersehen hatte.

Ein generelles Problem bei Fließmitteln ist deren Wassergehalt. Er kann starkschwanken, besonders wenn sie lange und offen zur Atmosphäre gelagert wurden.Daher sollten Fließmittel am Arbeitsplatz immer nur in kleinen Portionen gelagertund regelmäßig durch frische Fließmittel ersetzt werden.

Natürlich ergibt nur die Wahl eines Fließmittels Sinn, das die geforderte Selekti-vität zur Lösung des Trennproblems liefert. Auch sollte die Viskosität bzw. richtigerder Permeationsfaktor nicht zu groß sein, um die Entwicklungszeit der Platte sogering wie möglich zu halten, denn anderenfalls reduziert die Zonendiffusion dieSignalauflösung. Auch sollte man möglichst immer nur Reinsubstanzen als Fließ-phase verwenden. Erst wenn die gewünschte Selektivität so nicht zu erreichen ist,sollte auf binäre, ternäre oder auch quaternäre Mischungen ausgewichen werden.Höhere Mischungssysteme sind in der Regel nicht nötig. Hüten sollte man sich vorVorschriften, bei denen Ober- oder Unterphase zweier schlecht mischbarer Flüssig-keiten als Fließmittel empfohlen wird. Die Einstellung eines solchen Phasensystemsist extrem temperaturabhängig und damit in seiner Zusammensetzung nicht sehr ro-bust. Wenn schon Mischungen benutzt werden, dann sollten sie aus Reinsubstanzengemischt sein!

Auch sollte die Nutzung „alter“, abgestandener Fließmittelsysteme vermiedenwerden, denn der Nachteil von Fließmittelmischungen liegt in ihrer geringen Lang-zeitstabilität begründet. Bei Mischungen, von denen man nicht sicher weiß, wielange sie schon gemischt vorliegen, können chemische Reaktionen die ursprüngli-che Zusammensetzung längst verändert haben. Besonders die Mischung von Säurenmit Alkoholen führt relativ schnell zu Veresterungen. Generell sollten Fließmit-telgemische daher immer frisch angesetzt werden! Eine Wiederverwendung vongebrauchten Fließmitteln verbietet sich von selbst, denn Fließmittel ändern währendder Entwicklung im Wechselspiel mit dem Sorbens fast immer ihre Zusammenset-zung. Um unnötige Abfälle zu vermeiden, sollten die Fließmittebestandteile immernur in der Größenordnung von wenigen Millilitern gemischt werden. Dosierspritzenarbeiten dabei genauer als Messzylinder.

Die Wahl des Fließmittelgemisches erfolgt weitgehend empirisch. Trotzdemkann man bei der Fießmittelwahl systematisch vorgehen. In der Adsorptionschro-matgraphie wird ein Modifier (meist ein polares Fließmittel) verwendet, um dieAnzahl der aktiven Adsorptionszentren in der stationären Phase einzustellen. DieAktivität dieses Modifiers wird allerdings nicht nur durch dessen Menge im Fließ-mittel beeinflusst. Besitzt das Fließmittel insgesamt eine geringe Polarität, wird sichmehr polarer Modifier auf der stationären Phase festsetzen, als wenn das Laufmitteleine höhere Polarität besitzt.

Die Polarität eines Laufmittels wird mit einem „Verdünner“ eingestellt. In derAdsorptionschromatographie sind das meist Pentan, Hexan, Cyclohexan oder einanderes, sehr unpolares Fließmittel. In der RP-Chromatographie wird umgekehrtmeist Wasser als Verdünner benutzt. Hier wird kein Modifier benötigt, weil es


auf der stationären Phase keine aktiven Zentren gibt. Um Modifier und Verdün-ner zusammenzubringen, wird oft noch ein Vermittler (oder ein Vermittlergemisch)benötigt. Der Vermittler soll das Entmischen der Phasenbestandteile verhindern.Einen Hinweis auf geeignete Mischungen – zumindest für die Adsorptionschroma-tographie – liefert die Theorie nach Snyder.

4.2 Die Theorie der Fließmittel in derAdsorptionschromatographie (nach Snyder)

Trennungen über Adsorption sind, da ein Verdrängungswettbewerb zwischen Ana-lyt- und Fließmittelmolekülen um die Besetzung der aktiven Zentren an der Sor-bensoberfläche stattfindet, durch folgende Merkmale charakterisiert:� Hydrophile Moleküle (wie Wasser) deaktivieren, also blockieren schon in kleiner

Menge alle aktiven Zentren und haben damit enormen Einfluss auf die Tren-nung. Bei höheren Konzentrationen an Wasser bildet sich meist eine wässrigePhase an der Sorbensoberfläche aus, und die Adsorptionstrennung geht in eineVerteilungstrennung über.

� Die Luftfeuchtigkeit zeigt einen sehr großen Einfluss auf den Rf-Wert.� Eine Substanzüberladung der Schicht führt schnell zu einem Tailing.� Adsorptionssysteme trennen bevorzugt nach Polarität bzw. nach polaren Grup-

pen und eher nicht nach der Molekülgröße. Die Ausbildung von Wasserstoff-brückenbindungen spielt eine wichtige Rolle.

� Als Fließmittel werden gering bis mäßig polare, hydrophobe Lösungsmittel mitmeist hohem Dampfdruck benutzt. Daher hat die Art der Trennkammer, insbe-sondere die Größe des Dampfraumes, einen größeren Einfluss auf die Entwick-lung, als dies bei der Verteilungschromatographie der Fall ist.Die Snyder’sche Fundamentalbeziehung für die Adsorptionschromatographie

lautet [1–3]:

Rm D lgWa

VPVa C ˛a.S

0 � "0AP/ : (4.1)

Va Volumen der adsorbierten Fließmittelmonoschicht pro g AdsorbensWa Gewicht der DC-Schicht (g)VP das für das Fließmittel frei zugängliche Porenvolumen (cm3)˛a Energiekomponente des Aktivitätsparameters, mit ˛a = 1 für höchstaktives Alu-

miniumoxidS0 Adsorptionsenergie der Probe"0 FließmittelparameterAP Platzbedarf eines Probemoleküls (am Adsorptionszentrum)

Die Snyder-Gleichung beschreibt den Einfluss der wichtigsten Parameter eineschromatographischen Systems auf den Rm-Wert. Die Parameter der DC-Schichtwerden durch das logarithmierte Phasenverhältnis ausgedrückt. Die Aktivität dermobilen Phase wird durch den Aktivitätsparameter ˛a beschrieben. Die Eigenschaf-ten der zu trennenden Probemoleküle sind in den Parametern S0 (Adsorptionsener-

4.2 Die Theorie der Fließmittel in der Adsorptionschromatographie (nach Snyder) 91

gie der Probe) und AP (Platzbedarf eines Probemoleküls am Adsorbens) enthalten.Die Eigenschaften des Fließmittels repräsentiert der Fließmittelparameter ("0).

Ein Analytmolekül beansprucht die Fläche Ap und kann eine entsprechende An-zahl an Fließmittelmolekülen verdrängen, die auf dieser Fläche an die aktiven Zen-tren gebunden waren. Bei diesem Prozess wird die Adsorptionsenergie S0 frei. Fürunpolare Aliphate ist sie definitionsgemäß null.

Alle Parameter sollten im Idealfall voneinander unabhängig sein. In der Praxissind die Adsorptionsenergien verschiedener Proben aber durchaus abhängig vonden Eigenschaften der verschiedenen Sorbenzien. Dies gilt ebenfalls für AP und fürden Fließmittelparameter "0.

Qualitativ sagt die Snyder-Gleichung Folgendes aus. Je größer die Adsorpti-onsenergie S0 eines Analytmoleküls ist, desto größer wird der Rm -Wert dieserSubstanz und desto kleiner ist damit ihr Rf-Wert. Je größer die Fließmittelstärke("0) eines Fließmittels ist, desto größer wird der Rf-Wert. Für unpolare aliphati-sche Verbindungen wird kein spezifischer Adsorptionsbeitrag aufgebracht ("0 = 0und S0 = 0). Für unpolare Verbindungen, die die Sorptionszentren nicht absättigenkönnen, bleibt dann nur der erste Teil der Gl. (4.1) bestehen. Für S0 � AP"0 (dasFließmittel verdrängt den Analyten am aktiven Zentrum) wird der Rm-Wert negativ,und der Rf-Wert geht gegen eins. Für S0 � AP"0 (das Fließmittel kann die Analyt-moleküle an den aktiven Zentren nicht verdrängen) wird der Rm-Wert positiv, undder Rf-Wert geht gegen null [1–3].

4.2.1 Die Fließmittelstärke ("0)

Die Fließmittelstärke in der Adsorptionschromatographie (nach L. R. Snyder [1, 2])beschreibt den Einfluss der Fließmittelmoleküle auf die Adsorption der Analytmo-leküle. Snyder definiert die Fließmittelstärke als Quotient der Adsorptionsenergie(EP) der Fließmittelmoleküle, die von einem Analytmolekül verdrängt werden, unddes Platzbedarfes (AP) eines Fließmittelmoleküls an der Oberfläche der stationärenPhase. Die Fließmittelstärke beschreibt damit die Adsorptionsenergie eines Lö-sungsmittelmoleküls pro Oberflächeneinheit des Adsorbens [1].

"0 D EP

APD �G

ı

2;3RT AP(4.2)

EP Adsorptionsenergie der FließmittelmoleküleAP Platzbedarf eines Fließmittelmoleküls�G° freie Standardenthalpie

Diese Definition der Fließmittelstärke zeigt, dass "0 keine alleinige Funktion desFließmittels ist, sondern dass hier auch die Eigenschaften der stationären Phase miteingehen.

Zur Bestimmung der Fließmittelstärke wird mit einem Fließmittel der Stärke"0 = 0 (z. B. Pentan) auf Adsorbenzien verschiedener Aktivitäten ˛a chromatogra-phiert und über die Messung des resultierenden Rm-Wertes der (4.1) der Molekül-


parameter S0 (als Steigung) bestimmt:

Rm D lgWa

VPVa C ˛aS

0 � ˛aAP"0 D C � ˛aAP"0 :

Werden die Rm-Werte einer Substanz auf einer Plattenart mit verschiedenenFließmittelstärken chromatographiert, resultieren Geraden mit der Steigung ˛aAP

und dem Achsenabschnitt C. So kann der "0-Wert eines beliebigen Fließmittelsüber die Festlegung "0 = 0 für Pentan und die Ermittlung von (˛aAP) und C durcheine Rm-Messung bestimmt werden.

Die "0-Werte sind tabellarisch in der sogenannten eluotropen Reihe aufgelis-tet [2]. Sie gelten für unterschiedliche (˛aAP)-Werte und sind für Aluminiumoxid-und Kieselgelphasen angegeben (Tab. 4.1).

Für binäre Gemische leitet Snyder eine logarithmische Beziehung zwischen derFließmittelstärke des Gemisches und dem Mischungsgrad ab [2]. Aus (4.1) folgtmit Rm = lgk (k: Kapazitätsfaktor) für die Differenz zweier Rm-Werte:

RmB � RmA D lg�

kB

kA

�D ˛aAP."0

A � "0B/ :

Tab. 4.1 Dargestellt sind die Molvolumina Vm in Molmasse/Dichte verschiedener Fließmittel undderen experimentell bestimmten Fließmittelstärken "0 (und Ap) [2, 4, 5]

Lösungsmittel Vm Fließmittelstärken "0 AP

(MG/d20) SiO2 Al2O3

n-Pentan 114,9 0,0 0,0 5,9

n-Octan 163,0 0,0 0,0 7,6

Isopropylether 142,0 0,28 0,28 5,1

Toluol 106,5 0,22 0,29 6,8

Benzol 89,2 0,25 0,32 6,0

Ethylether 104,4 0,43 0,38 4,5

Methylenchlorid 64,4 0,3 0,4 4,1

Dichlorethan 63,7 0,32 0,47 4,8

MTBE 119,1 0,35 0,48 –

Aceton 73,8 0,5 0,58 4,2

Methlethylketon 89,3 0,51 4,6

THF 81,2 0,53 0,45 5,0

Acetonitril 52,7 0,6 0,55 3,1

Ethylacetat 98,1 0,48 0,6 4,5

Dioxan 85,5 0,6 0,61 6,0

Methanol 40,6 0,7 0,95 8,0

2-Propanol 76,8 0,6 0,82 8,0

4.2 Die Theorie der Fließmittel in der Adsorptionschromatographie (nach Snyder) 93

Abb. 4.1 Dargestellt sindexperimentell bestimmteFließmittelstärke "0

AB binärerGemische. Rot CH2Cl2 inOctan, grün Diethyletherin Pentan, violett Methyl-tert-butylether (MTBE) inOctan, gelb Methylacetat inPentan und blau Methanol inCH2Cl2. (Aus [2])

Für ein Gemisch zweier Fließmittel A und B gilt völlig analog, nach "0AB aufge-

löst:

"0AB D "0

B C lg .kB=kAB/

˛aAP:

Mit der Vereinfachung

kB

kAB� nB

nA C nB� NB

folgt:

"0AB D "0

B C lg .NB/

˛aAPB

: (4.3)

NB molarer Anteil des stärkeren Fließmittels˛a Aktivitätsparameter (für Al2O3, eine Funktion der relativen Feuchte, liegt zwi-

schen 0 und 1; für SiO2 ist er 0,7)APB Platzbedarf von B auf der Plattenoberfläche

Gleichung 4.3 kann auch experimentell verifiziert werden. Wie in Abb. 4.1 zusehen ist, steigt bei prozentualer Zunahme der polaren Komponente (CH2Cl2, Die-thylether, MTBE, Methylacetat oder Methanol), gelöst in n-Pentan, n-Octan oderCH2Cl2, die Fließmittelstärke zunächst steil an, um dann allmählich einen Endwertzu erreichen. Klar zu sehen ist, dass ein logarithmischer Zusammenhang zwischender Fließmittelstärke des Gemisches und der Gemischzusammensetzung besteht.

Die theoretische Diskussion zeigt, dass die Fließmittelstärke eines Gemischesvom Aktivitätsparameter ˛a abhängt (4.3). Binäre Gemische können damit in dereluotropen Reihe nicht exakt eingeordnet werden [2]. Die eluotrope Reihe ist keinausreichendes Instrument für eine Laufmitteloptimierung, da Protonenakzeptor-,Protonendonator- und Dipoleigenschaften der Fließmittel nicht berücksichtigt wer-den! Zu einer ersten, vorsichtigen Einschätzung, welchen Einfluss ein Fließmittelauf den Rf-Wert eines Analyten hat, reicht die eluotrope Reihe jedoch völlig aus.

Als Beispiel soll die Fließmittelstärke einer Mischung, bestehend aus 75 % Ben-zol (A) und 25 % Acetonitril (B), berechnet werden. Der molare Anteil des stärkeren


Tab. 4.2 Dargestellt sind Fließmittelkombinationen mit gleichen Fließmittelstärken "0. DCE1,2-Dichlorethan, OCTn-Octan, MTBE Methyl-tert-buthylether, ACN Acetonitril, PENn-Pentan,MeOH Methanol [2]

"0 DCE/OCT MTBE/OCT ACN/PEN MTBE/DCE ACN/DCE MeOH/DCE

0,00 0 0 0 0 0 0

0,05 3,5

0,10 10 0,2 0,3

0,15 18 0,6 0,6

0,20 32 1,4 1,1

0,25 58 4,3 2

0,30 100 13 3,5 0 0 0

0,35 35 8 30 12

0,40 57 24 60 30 3,5

0,45 84 52 88 55 6

0,50 88 88 9

0,60 100 100 16

0,70 28

0,80 52

0,90 95

Fließmittels NB ist:

NB D 0;25 � 0;55

0;25 � 0;55 C 0;75 � 0;32D 0;364 :

F. Geiss [2] gibt den Wert an mit: "0B 0;38, AP � 10. Die Fließmittelstärke

nach (4.3) kann für eine Kieselgelschicht (˛a = 0,7) dann wie folgt berechnet wer-den:

"0AB D 0;6 C lg .0;364/

0;7 � 10D 0;54 :

Der experimentell gemessene Wert ist 0,58 [2].Eine Optimierung der mobilen Phase, aufbauend auf dem Konzept der Fließ-

mittelstärke, ist von F. Geiss publiziert worden [2]. Er schlägt zur Bestimmung derbenötigten Fließmittelstärke vor, die in Tab. 4.2 fett gekennzeichneten 13 Laufmit-telgemische (plus n-Octan) zu benutzen. Eine optimale Trennung wird bei einemRf-Wert von 0,33 erhalten. Kennt man die erforderliche Fließmittelstärke für die-sen Rf-Wert, kann durch Kombination der einzelnen Mischungen untereinander(bei gleicher Fließmittelstärke) die Selektivität der Trennung optimiert werden. DieFließmittelstärke der neuen Kombination kann dabei über den Ausdruck in (4.3)berechnet werden. Mit diesem empirischen Verfahren werden relativ schnell guteErgebnisse erhalten.

Für Umkehrphasensysteme kann die eluotrope Reihe unter Beachtung zweierEinschränkungen ebenfalls zum Abschätzen der Retentionswerte verwendet wer-den. Bei Reversed-phase-Systemen (RP-Systemen) steigt die Fließmittelstärke mit

4.3 Die Theorie der Fließmittel in der Verteilungschromatographie 95

fallenden Polaritäten, d. h. mit fallendem "0-Wert. Wasser als Verdünner wird dieFließmittelstärke null zugewiesen. Damit bleiben Modifier und Lösungsvermittlerauf wenige, mit Wasser mischbare Substanzen beschränkt. Zahlen zu "0-Werten inRP-Systemen sind unter [4] aufgelistet.

4.3 Die Theorie der Fließmittel in derVerteilungschromatographie

In der Verteilungschromatographie verteilt sich der Analyt zwischen stationärerund mobiler Phase. Bei DC- und HPLC-Trennungen sind beide Phasen flüssig. Inder Gaschromatographie bestehen sie aus einer Gas- und einer Flüssigphase. EineTrennung ist nur dann zu beobachten, wenn eine unterschiedliche Verteilung derAnalytmoleküle zwischen den beiden Phasen zustande kommt, der Verteilungsko-effizient also ungleich eins ist.

K D cs

cmD cflüssige Phase

cGasphase

K Verteilungskoeffizient (hier dargestellt für eine GC-Trennung)cs Substanzkonzentration in der stationären Phasecm Substanzkonzentration in der mobilen Phase

Eine Verteilungschromatographie in der DC kann an folgenden Punkten erkanntwerden:� Eine stationäre Flüssigphase baut sich während der Trennung aus dem Fließmit-

tel auf. Bevorzugte Komponenten für solch eine Trennphase sind Wasser oderniedere aliphatische Alkohole. Als Stützphase dienen oft Cellulose, eine Ami-nopropylphase oder Kieselgel.

� Der Wassergehalt im Laufmittel ist hoch und hat alle aktiven Zentren deaktiviert.� Die Luftfeuchtigkeit hat keinen Einfluss mehr auf den Rf-Wert.� Der Querschnitt der Flüssigphase muss groß genug sein, damit sich der Analyt

wie in einer „richtigen“ Flüssigkeit lösen kann.� In Systemen mit Wasser als stationärer Phase werden vorteilhaft sehr polare

Substanzen wie Zucker, Säuren, Aminosäuren oder Salze mit dem Standardfließ-mittel Butanol/Essigsäure/Wasser (4 + 1 + 1, V / V) getrennt.

� Die Trennung an RP-18-Phasen kann als Verteilungsprozess gedeutet werden,durchgeführt mit einer lipophilen stationären Phase und einer eher hydrophilenmobilen Phasen. RP-2-Phasen zeigen wegen eines zu kleinen Querschnitts meistkeine reine Verteilungschromatographie.

� Die Signalverbreiterung ist größer als in der Adsorptionschromatographie.Das Vorliegen einer Verteilungschromatographie kann eindruckvoll an der Tren-

nung von Aminosäuren mit Butanol-Wasser-Gemischen aufgezeigt werden. Wirdz. B. eine trockene Cellulosephase verwendet und der Wassergehalt im Fließmittelreduziert, können die Analytzonen bei höheren Rf-Werten „verschmieren“, wennim oberen Bereich der Platte keine ausreichende Wassermenge mehr zum Aufbauder stationären Phase zur Verfügung steht.


4.3.1 Theorie der Fließmittelstärke (nach Snyder)

In der HPLC als Verteilungschromatographie, ebenso wie in der DC, wird zur Be-schreibung der mobilen Phase das Fließmittel-Selektivitätsmodell nach Snyder mitAbstand am häufigsten benutzt [4, 5]. Ausgehend von Verteilungskoeffizienten ausgaschromatographischen Messungen führte L. R. Snyder einen Polaritätsindex P0ein, der sich additiv aus verschiedenen Selektionsinkrementen zusammensetzt.

Historisch gesehen bestimmte L. Rohrschneider im Jahre 1973 mittels Gaschro-matographie von 81 Fließmitteln die Verteilungskoeffizienten zwischen der Gas-und der Flüssigphase. Er löste dazu jeweils eine bestimmte Menge der 81 Fließmit-tel in den Lösungsmitteln Octan, Toluol, Ethanol, Methylethylketon, Dioxan undNitromethan. Dann bestimmte Rohrschneider die Konzentration des Fließmittels inder Gas- und in der Flüssigphase [5]. Im Jahre 1974 berechnete Snyder aus diesenVerteilungskoeffizienten speziell korrigierte Rm-Werte [6]. Snyder korrigierte dieexperimentell ermittelten Koeffizienten mit ihren molaren Volumina (Vm) und be-zog diesen Wert auf den Verteilungskoeffizienten des Fließmittels x, gelöst in z. B.Ethanol.

R0m.x/Ethanol � lg

0@ K.x/EthanolVm.x/

.K.x/OctanVm.x//Vm EthanolVm Octan

1A

K(x) Verteilungskoeffizient des Fließmittels x (z. B. Aceton), hier gelöst inEthanol

Vm Molvolumen (ml/mol)Vm(x) Molvolumen des FließmittelsK(x)Octan Verteilungskoeffizient des Fließmittels in n-Octan (als Bezugswert)Vm,Octan Vm,Octan = MGOctan/d20,Octan = 114,23/0,703 = 163 ml/mol

Der Wert von R0m.x/ ist damit proportional zur freien Verdampfungsenthalpie

des Fließmittels (x), bezogen auf den Energiewert eines n-Alkans (hier: Octan) mitgleichem molaren Volumen. Snyder berechnete die R0

m-Werte aller 81 Fließmittelfür die Lösungsmittel Octan, Toluol, Ethanol, Methylethylketon, Dioxan und Ni-tromethan nach obiger Formel. Eine genaue Beschreibung des Rechenweges findetsich in [7]. Die berechneten R0

m.x/-Werte für n-Hexan, Isooctan und Cyclohexan inden verschiedenen Lösungsmitteln sind sich sehr ähnlich und zeigen im Vergleichzu allen anderen R0

m.x/-Werten die kleinsten Zahlen. Snyder hat daher den Mittel-wert dieser drei R0

m.x/-Werte für jedes Lösungsmittel bestimmt und zieht diesenWert von allen 81 bestimmten R0

m.x/-Fließmittelwerten ab. Damit werden die sokorrigierten R00

m.x/-Werte für n-Hexan, Isooctan und Cyclohexan natürlich null.

R00m.x/Ethanol � log .K 00/Ethanol

D R0m.x/E � 1=3fR0

m.n-Hexan/E � R0m.Isooctan/E � R0

m.Cyclohexan/Eg

Als Nächstes definierte Snyder einen Polaritätsindex (P0) als Maß für die Fä-higkeit eines Fließmittels, mit verschiedenen Lösungsmitteln wie n-Octan, Ethanol,Dioxan, Methyl-ethylketon oder Nitromethan in Wechselwirkung treten zu können.

4.3 Die Theorie der Fließmittel in der Verteilungschromatographie 97

Zur Berücksichtigung von Protonenakzeptor-, Protonendonator- und Dipoleigen-schaften benutzte Snyder die Verteilungskoeffizienten der Fließmittel, gelöst in denLösungsmitteln Ethanol, Dioxan und Nitromethan. Die Daten für n-Octan dientenihm als Bezugswert. Die Verteilungskoeffizienten der Fließmittel mit dem Lösungs-mittel Methylethylketon verwarf er, da sie mit den Ethanoldaten korrelierten [6].

Aus diesen Daten berechnete Snyder log(K00)-Werte, die er additiv zu einem P0-Wert zusammensetzte.

P 0 � log .K 00/Ethanol C log .K 00/Dioxan C log .K 00/CH3NO2

Über diese Beziehung können aus den Messdaten die verschiedenen Wechsel-wirkungsanteile der Fließmittel mit den Lösungsmitteln Ethanol, Dioxan und Ni-tromethan berechnet werden, wie z. B. xe D log .K 00/Ethanol=P 0. Damit gilt:

P 0 D xeP0 C xdP

0 C xnP 0

.xe C xd C xn D 1/(4.4)

P0 Polaritätsindexxe Anteil der Fließmittelwechselwirkung mit Ethanol (Protonendonatoreigenschaf-

ten)xd Anteil der Fließmittelwechselwirkung mit Dioxan (Protonenakzeptoreigenschaf-

ten)xn Anteil der Fließmittelwechselwirkung mit Nitromethan (Dipoleigenschaften)

Der Fließmittelparameter ("0) ist mit dem Polaritätsindex P0 nur bedingt ver-gleichbar, da er aus einem völlig anderen Ansatz gewonnen wurde. Als brauchbareNäherung kann aber mit

"0 � 0;1P 0 (4.5)

gerechnet werden. Man sieht, der Polaritätsindex (ein Rm-Wert!) ist ein Maß fürdie Fließmittelstärke eines Gemisches. Die drei experimentell bestimmten Selek-tivitätsparameter (xd, xe, xn) charakterisieren die wichtigsten Eigenschaften einerFließmittelkombination. Ihre Summe ergibt immer eins. Die Werte für die einzelnenFließmittel sind im Anhang dieses Kapitels aufgeführt. Eine Korrektur verschiede-ner Daten auf Grundlage neuer Messungen von Verteilungskoeffizienten führte zuleichten Korrekturen bei den Werten von Triethylamin, CHCl3 und CH2Cl2. Methy-lenchlorid wechselt nach dieser Einteilung die Polaritätsgruppe von V nach VII [8].

Unter Berücksichtigung der verschiedenen Fließmittelstärken (P0) und der unter-schiedlichen Selektivitätsparameter lassen sich alle Fließmittel in sieben verschie-dene Gruppen, sogenannte Cluster, einordnen. Jede Gruppe umfasst Fließmittel mitähnlichen Eigenschaften. Die Verdünner (n-Pentan, Hexan, Isooctan und auch Cy-clohexan) werden keiner Gruppe zugeordnet, da sie die Fließmittelstärke null habenund keine chromatographische Aktivität zeigen. Da die Summe der Selektivitätsfak-toren definitionsgemäß immer eins ist, reicht der Quotient aus zwei Faktoren aus,um alle drei Werte darzustellen. Die Definition dieses Selektivitätsfaktors (Sf) gehtauf Sz. Nyiredy zurück [9, 10].

Sf D xe

xd


Abb. 4.2 Dargestellt ist die Einteilung der Fließmittel in verschiedene Selektivitätsgruppen.(Nach L. Snyder [6])

Abb. 4.3 Dargestellt sinddie mittleren Selektivitäts-faktoren (Sf), gegen denPolaritätsindex (P0) aufge-tragen [9, 10]

Sf Selektivitätsfaktorxe Protonenakzeptoreigenschaftenxd Protonendonatoreigenschaften

Werden die gemittelten Selektivitätsfaktoren einer Gruppe gegen deren mittlerenPolaritätsindex graphisch aufgetragen, ergeben sich zwei Geraden wie in Abb. 4.3dargestellt.

Die Fließmittel der Gruppen I–IV und VIII liegen auf einer Geraden, ebensowie die Fließmittel der Gruppen I, V und VII. Die Substanzen in Gruppe I (Etherund Amine) zeigen die höchsten Selektivitätsfaktoren, also die größten Protonen-akzeptoreffekte. Die Fließmittel der Gruppe VIII und VII weisen die geringstenausgeprägten Protonenakzeptoreigenschaften auf. Die Gruppen VIa und VIb liegenzwischen beiden Geraden. Fließmittel aus diesen beiden Gruppen sind hervorragen-de Lösungsvermittler. Dazu gehören Ethylacetat, Methylethylketon, Cyclohexanon,Dioxan, Aceton und Acetonitril.

4.4 Optimierung der Fließmittelzusammensetzung 99

4.3.2 Andere Methoden zur Fließmittelcharakterisierung

Neben den beiden vorgestellten Ansätzen zur Charakterisierung von Fließmittelngibt es noch weitere Methoden [11]. Hier wird nur noch der „Solvachrom-Ansatz“nach C. Reichardt vorgestellt [4, 12]. Reichardt benutzte einen auf K. Dimroth zu-rückgehenden Ansatz, bei dem das spektroskopische Verhalten insbesondere derSubstanz „Reichardt’s dye“ in verschiedenen Lösungsmitteln vermessen wurde.Aus der lösungsmittelabhängigen spektralen Verschiebung können ein Polaritäts-parameter, ein Parameter zur Wasserstoffbindungsaktivität sowie die Basizität einesLösungsmittels bestimmt werden. Diese in der organischen Chemie weit verbreiteteMethode zur Charakterisierung von Lösungsmitteln konnte sich in der Chroma-tographie nicht gegen die Snyder’sche Beschreibung durchsetzen. Reichardt’s dyekann allerdings zur genauen Messung des Wassergehaltes eines DC-Sorbens be-nutzt werden [13].

4.4 Optimierung der Fließmittelzusammensetzung

Ziel einer Laufmitteloptimierung ist die ausreichende Auftrennung eines Gemi-sches. Aus den theoretischen Betrachtungen des Kap. 2 folgt, dass eine optimaleTrennung bei Rf-Werten um 0,33 zu beobachten ist. Ziel einer Laufmitteloptimie-rung muss es daher sein, ein kritisches Substanzenpaar so über die Platte zu bewe-gen, dass ihre Rf-Werte in etwa bei 0,33 liegen. Dabei ist die Wahl des Fließmittel-gemisches aus mehreren Gründen entscheidend.� Das Laufmittel muss die Analyte auf einen günstigen Rf-Wert zubewegen. Das

wird durch den Polaritätsindex beeinflusst.� Die Selektivität des Laufmittels bestimmt die Auflösung zweier Substanzen, also

die Güte der Trennung. Verantwortlich dafür sind die Selektivitätsparameter.� Die Diffusion während der Trennung sollte so gering wie möglich sein. Dazu

bedarf es einer möglichst kurzen Trennzeit sowie einer hohen Viskosität desFließmittels.Während die ersten beiden Punkte schon behandelt wurden, muss auf die Trenn-

zeit noch einmal kurz eingegangen werden. Bei vollständiger Benetzbarkeit derstationären Phase (cos # = 1) gilt (2.2) in folgender Form:

Zf Dr

2k0dp�

�t :

Zf Laufstrecke der Frontt Trennzeitk0 Permeabilitätskonstante, k0 = 6–8 � 10�3

dp mittlere Korngröße der stationären Phase� / � Quotient aus der Oberflächenspannung und der Viskosität der mobilen Phase

Je größer dp ist, umso schneller wandert das Fließmittel. Daher werden nochrelativ viele Trennungen mit DC-Platten großer Korngröße durchgeführt. Das � / �-


Abb. 4.4 Selektivitäts-dreieck zur Auswahl desFließmittels in der Adsorpti-onschromatographie

Verhältnis sollte groß sein, damit eine schnelle Entwicklung abläuft. Leider ist dieseAussage nicht eindeutig, da auch Fließmittel mit kleinen � / �-Verhältnissen (z. B.n-Butanol) gute Auflösungen zeigen, weil zwar die Trennung lange dauert, aber dieQuerdiffusion durch die relativ hohe Viskosität unterdrückt ist. Trotzdem führt einErsatz von n-Butanol durch 1-Propanol oftmals zu verbesserten Trennungen.

Eine Abschätzung der Trennleistung eines Fließmittels bei so vielen Einflusspa-rametern ist schwierig. In der Literatur finden sich viele Artikel, die mithilfe desRm-Wertes und diverser chemometrischer Verfahren theoretische Trenntechnik be-treiben [4, 11, 15]. Publiziert werden immer wieder theoretische Ansätze, mit denendas Trennverhalten eines chromatographischen Systems am Computer erfolgreichsimuliert wurde. Die Vielzahl der Ansätze ist aber auch ein Beleg für das momenta-ne Scheitern umfassend arbeitender Simulationen. Vereinzelt kann der Rechner beider Fließmittelsuche gute Dienste leisten. Ein umfassendes Programm, das ohne La-bor ein Fließmittelsystem erfolgreich entwirft, ist aber nicht in Sicht. Zur Lösungeines Trennproblems ist daher immer noch der Analytiker gefordert, und am erfolg-reichsten ist immer noch das Verfahren „Versuch und Irrtum“ [4, 11, 15]. Hierbeikann die Snyder’sche Theorie dazu dienen, die Suche gezielter durchzuführen.

Für die Adsorptionschromatographie lassen sich die besten Trennbedingungenmithilfe des Dreieckschemas in Abb. 4.4 ermitteln [16–19]. Stellt man sich das in-nere Dreieck als drehbar vor, muss die untere Spitze nur auf den Polaritätsbereichdes Untersuchungsgutes „gedreht“ werden. Die beiden anderen Ecken des Drei-eckes zeigen dann auf die optimalen Eigenschaften der stationären und der mobilenPhase. Sollen z. B. polare Analyte getrennt werden, also hydrophile Verbindungenwie Ionen, sollte in der Adsorptionschromatographie die stationäre Phase inaktivund die mobile Phase polar (also hydrophil) sein. Bei der Trennung von lipophilen(unpolaren) Analyten muss die stationäre Phase aktiv und die mobile Phase unpolar(lipophil) sein.

Für die Verteilungschromatographie gilt prinzipiell immer der Satz: „Gleicheslöst Gleiches“. Kennt man die chemische Struktur des Analyten, ist die benötigtePolarität eines Fließmittels abschätzbar, denn die Polarität einer Verbindung wirddurch ihre funktionellen Gruppen bestimmt. Bei funktionellen Gruppen gilt folgen-de Reihenfolge, mit der die Polarität einer Gruppe am Rest R ansteigt: RH < RN–


Abb. 4.5 Selektivitäts-dreieck zur Auswahl desFließmittels in der Vertei-lungschromatographie

(CH3)2 < RCOOCH3 < RNH2 < ROH < RCONH2 < RCOOH. Bei der Trennung vonlipophilen Substanzen gilt: Die stationäre Phase sollte eher lipophile und die mobi-le Phase eher polare Eigenschaften besitzen. Zur Trennung hydrophiler Substanzensollte die stationäre Phase hydrophile und die mobile Phase unpolare, also lipophileEigenschaften zeigen (Abb. 4.5).

Der Satz „Gleiches löst Gleiches“ gilt auch für Säuren und Basen. Säuren solltenin sauren Laufmitteln getrennt werden, die Essigsäure, Ameisensäure oder ver-dünnte HCl enthalten. Basen trennt man am besten unter Zusatz von Aminen oderverdünnter wässriger Ammoniaklösung. Meistens findet man schon in der Litera-tur wichtige Hinweise, für welche funktionellen Gruppen sich welche Fließmittelbewährt haben [19, 20].

Findet man für ein Trennproblem in der Literatur keine Angaben zur stationärenPhase, sollten die Untersuchungen mit einer Kieselgel-60-HPTLC-Platte starten.Um eine grobe Übersicht über das Laufverhalten zu erhalten, sollte weiter aus je-der Selektivitätsgruppe der Snyder’schen Klassifizierung mindestens ein Fließmittelzur Trennung ausprobiert werden. Die verschiedenen Selektivitätsgruppen sind inAbb. 4.2 dargestellt. Alle verfügbaren Einzeldaten der verschiedensten Reinsub-stanzen, die in der DC als Fließmittel Verwendung finden, sind in Tab. 4.6 am Endedieses Kapitels aufgelistet.

Zu erwähnen ist noch, dass es eine Reihe von azeotropen Fließmittelgemischengibt, bei denen sich während der Entwicklung keiner der beiden Partner an- oder ab-reichert. Diese azeotropen Gemische können daher wie Reinsubstanzen behandeltwerden. Eine Auflistung findet sich in Tab. 4.3.

Aus Polaritätsgründen und unter Berücksichtigung ihrer Toxizität werden zumScreening oft die Laufmittel der Tab. 4.4 vorgeschlagen.

Das Laufverhalten einer zu trennenden Verbindung sollte mit allen zehn inTab. 4.4 aufgelisteten Fließmitteln bestimmt werden. Der schnellste und einfachsteWeg ist dazu die Benutzung von Alu-Karten, die man mit einer Schere in handlicheStreifen schneidet. Wenige Mikroliter Laufmittel in einem kleinen Gefäß genügen,um das Laufverhalten über ca. 4 cm zu beurteilen. Bei farblosen Verbindungenkann die Laufhöhe der Substanz über eine UV-Imprägnierung der Trennschichtund einer Ansicht unter UV-Licht (bzw. Stellen der getrockneten Platte in eine Iod-


Tab. 4.3 Aufgelistet sind einige azeotrope Fließmittelgemische mit ihren P0-Werten und Siede-punkten

Fließmittel (ml) P0-Wert Sdp. (°C)

Propanol (20,3)+ i-Propylether (115,6)

2,6 66,2

Methylacetat (52,3)+ Methanol (22,5)+ Cyclohexan (43,25)

2,9 50,8

CH2Cl2 (70,0)+ Methanol (9,2)

3,3 37,8

CHCl3 (62,6)+ Ethanol (9,9)

3,5 59,4

Aceton (85,3)+ Cyclohexan (41,8)

3,7 53,0

CHCl3 (59,5)+ Methanol (15,9)

3,8 53,4

Methanol (22,4)+ Methylacetat (88,5)

4,4 54,0

Ethanol (118,5)+ Wasser (4,0)

4,5 78,2

CHCl3 (11,6)+ 2-Butanon (103,2)

4,6 79,9

Methanol (15,2)+ Aceton (111,3)

5,4 55,5

Tab. 4.4 Aufgelistet sind geeignete Fließmittel zur Laufmitteloptimierung

Gruppe Name P-Wert

0 n-Pentan 0,0

I Methyl-tert-Butylether 2,7

II 2-Propanol + Methanol 3,9 + 5,1

III Methoxyethanol 5,5

IV Essigsäure 6,0

V Dichlormethan 3,1

VI Ethylacetat + Aceton 4,4 + 5,1

VII Toluol 2,4

dampfkammer) einfach ermittelt werden. Optimale Laufhöhen liegen – wie schonerwähnt – bei Rf-Werten um 0,33. Liegt der Rf-Wert zu hoch, muss die Lösungsstär-ke des Laufmittels erniedrigt werden. Soll der Rf-Wert angehoben werden, muss dieLösungsstärke des Fließmittels erhöht werden. Wandern Substanzen im geeignetenRf-Bereich, werden untereinander aber nicht getrennt, sollte man die Kompositiondes Fließmittels bei gleicher Lösungsstärke variieren.

Wichtig ist, dass immer zwischen Normalphasen- und RP-Phasensystemen un-terschieden wird. Kieselphasen sind immer sehr polar. Mit einer unpolaren mobilenPhase wie z. B. Heptan/Propanol erhält man so ein typisches Normalphasensystem.


Caroten

Chlorophyll b

Rp - und Kieselgeltrennungvon Blattgrün

Kubelka/Munk-Signal

0,4

0,3

0,2

0,100

525

3035

4045

1520

Trennstrecke (mm

)

100

525

3035

4045

1520

10 00,1

0,2

0,3

0,40,5

0,6

0,7

-lg(R)

Tren

nstr

ecke

(mm

)

a

b

Abb. 4.6 Gezeigt ist eine RP- und eine Normalphasentrennung von Blattfarbstoffen (mit Acetonaus Spinatblättern extrahiert) auf a einer RP-18-Platte (Methanol/Aceton/Wasser, 6 + 6 + 1) undb einer Kieselgel-Platte (n-Heptan/1-Propanol, 9 + 1), zweifach entwickelt. Die Reihenfolge dergetrennten Substanzen ist komplementär

Da kein Wasser in der mobilen Phase vorhanden ist, wird man mit diesem SystemAdsorptionstrennungen durchführen. Entscheidet man sich für die sehr unpolarestationäre Phase RP-18 und wählt gleichzeitig eine polare mobile Phase (wie z. B.Methanol, Aceton, Wasser), erhält man ein Umkehr-Phasensystem. Die Reihenfol-ge der Elution sollte sich hier im Vergleich zum Normalphasensystem umdrehen,da sich die Polaritäten der beiden Phasen im Vergleich zum Normalphasensystemumgedreht haben. Ein Beispiel zeigt Abb. 4.6.

Abbildung 4.1 zeigt, dass die Lösungsstärke einer binären Fließmittelmischungeine logarithmische Funktion des Mischungsgrades ist. Eine erhöhte Selektivitäterreicht man, wenn man das stärkere Fließmittel nicht über 5 % Anteil dem schwä-cheren Fließmittel zudosiert. Kleine Konzentrationswechsel erzielen in diesem Be-reich große Änderungen der Fließstärke. Oft wird auch eine Mischung mit über50 % Volumenanteilen des starken Fließmittels empfohlen, da solche Mischungenrelativ konstante Fließmittelstärken zeigen, auch bei kleinen Änderungen der Mi-schungsanteile [2]

Zur Fließmitteloptimierung wird oft der sogenannte Spottest empfohlen, bei demca. 1–2 µl der Probesubstanz auf eine Platte aufgetragen werden [15]. Anschließendsetzt man eine leere Pipettenspitze mittig auf den Fleck, füllt diese mit 35 µl Lauf-mittel auf und lässt dieses dann auslaufen. Es entstehen zirkulare Chromatogramme,bestehend aus Flecken mit etwa 1 bis 1,5 cm Durchmesser (Abb. 4.7). Dieses zir-kulare Verfahren ist anzuwenden, wenn keine Alu-Platte sondern nur (schlecht zuzerteilende) Glasplatten zur Verfügung stehen.


a b c

d e f

Abb. 4.7 Gezeigt ist eine Spottest-Optimierung eines CAMAG-Farbstoffgemisches (auf Kiesel-gel) mit jeweils 35 µl a Cyclohexan, b Diethylether, c Methyl-tert-Buthylether, d CH2Cl2, e Toluolund f Ethylacetat. CH2Cl2 und Toluol zeigen die besten Trennergebnisse

Bei dieser Art der Chromatographie muss man allerdings bei der Fleckbeurtei-lung vorsichtig sein, denn für die Übertragung linearer Rf-Werte auf die Zirkular-chromatographie gilt folgende Beziehung.

.Rf/zirkular D p.Rf/linear (4.6)

Diese Gleichung beschreibt, dass sich bei einer zirkularen Entwicklung größereRf-Werte als bei einer linearen Entwicklung ergeben. Um zirkularchromatographi-sche Ergebnisse auf eine Linearkammer übertragen zu können, sollten bei Spottestsdie Substanzen unter optimalen Polaritätsbedingungen etwa den halben Durchmes-ser des Spots durchwandern.

Hat man auf einer DC-Platte die einzelnen Flecken entwickelt, wird der Um-fang des nassen Flecks mit einem Bleistift markiert. Nach dem Trocknen markiertman alle Substanzkreise mit einem Durchmesser von etwas mehr als der Hälfte desfeuchten Flecks. Die Fließmittel aus diesen Versuchen sind brauchbar. Bei der Über-tragung auf Trennungen in Linearkammern muss allerdings berücksichtigt werden,dass diese Vorversuche ohne Kammersättigung durchgeführt wurden [2].

In der zirkularen Dünnschichtchromatographie wird die Auftrennung von Kom-ponenten mit kleinen Rf-Werten begünstigt, ohne die Trennung von Komponentenhoher Rf-Werte zu benachteiligen. Die Reihenfolge der Elution unterscheidet sichnicht grundlegend von der in der Linearchromatographie; sie liefert allerdings meistschärfere Trennungen als diese. Auch kann die Schicht 10- bis 100-mal stärker mitProbe belastet werden als in der Linearchromatographie. Nachteile liegen in derzentralen Fließmittelzuführung, die oft stark gestörte Fließmittelprofile verursacht.

Wird ein Zirkularchromatogramm nicht von der Mitte nach außen, sondern vonaußen zur Mitte entwickelt, spricht man von „antizirkularen“ oder „zentripetalen“Trennungen. Zur Übertragung linearer Rf-Werte auf diese Technik gilt folgendeFormel [2]:

.Rf/zentripetal D 1 �p1 � .Rf/linear : (4.7)

4.5 Das PRISMA-Modell (nach Sz. Nyiredy) 105

Die Rf-Werte sind entsprechend kleiner als die der Lineartechnik. Die Zen-tripetaltechnik zeigt bei hohen Rf-Werten bessere Ergebnisse als die Linear-technik.

4.5 Das PRISMA-Modell (nach Sz. Nyiredy)

Das von Sz. Nyiredy et al. [20, 21] vorgeschlagene PRISMA-Modell hat den großenVorteil, dass zur Optimierung keine Computerprogramme oder Vorkenntnisse überdie Analyten benötigt werden. Zur Bestimmung des optimalen Laufmittels (einerquaternären Mischung) ermittelt man die ungefähre Fließstärke (den Polaritätsin-dex), bei der die Analyte im optimalen Bereich laufen. Dann verdünnt man einebeliebige Anzahl Laufmittel mit Hexan, Pentan oder Cyclohexan bis zur gewünsch-ten Fließmittelstärke. In der RP-Chromatographie wird entsprechend mit Wasser,Diethylamin oder Essigsäure verdünnt. Natürlich dürfen sich bei der Verdünnungkeine zwei Phasen bilden.

Nun werden aus den reinen Laufmitteln bzw. den Zweiergemischen die drei bes-ten Fließmittel bzw. Fließmittelgemische ausgewählt und mit einem Verdünner aufdie Fließmittelstärke des schwächsten ausgewählten Laufmittels gebracht. Diesedrei Mischungen mit den Fließmittelstärken P 0

A; P 0B; P 0

C repräsentieren drei Eckeneines gleichseitigen Dreiecks mit den Zusammensetzungen 1/0/0, 0/1/0 und 0/0/1.Die Kanten des Dreiecks beschreiben binäre Mischungen, während in der Flächedie Zusammensetzungen aller ternären Mischungen liegen. Das Prisma entsteht,wenn in der dritten Dimension über der Dreiecksfläche die Fließmittelstärken alsKanten aufgetragen werden. Hat man diese drei Komponenten mit dem Verdünnerauf gleiche Fließmittelstärke gebracht, entsteht ein reguläres Prisma.

Als Beispiel ist in Abb. 4.8 das Fließmittelsystem Chloroform/Methylenchlorid/Methyl-tert-butylether (MTBE) aufgeführt. Aufgabe soll sein, ein Gemisch dieserdrei Fließmittel mit der Fließmittelstärke 2,7 herzustellen, zu dem alle drei Einzel-komponenten den gleichen Beitrag (nämlich 33 %) liefern. Als Berechnungsformelfür den Polaritätsindex des Gemisches gilt folgender Ausdruck:

P 0 D xAP 0MTBE C xBP 0

CHCl3 C xCP 0CH2Cl2 :

Der P0-Wert des Methyl-tert-butylethers beträgt genau P 0MTBE = 2,7. Er kann da-

mit unverdünnt eingesetzt werden. Der Teiler xA erhält den Wert 0,33.Chloroform hat einen Polaritätsindex von P 0

CHCl3= 4,1 und Methylenchlorid von

P 0CH2Cl2

= 3,1. Beide Fließmittel müssen mit Heptan auf den Wert P0 = 2,7 verdünntwerden. Damit ergibt sich für den CHCl3-Anteil:

xB D 0;33 � 2;7=4;1 D 0;217 :

Die Differenz von 33 % zu 21,7 % (= 11,3 %) für Chloroform muss mit Heptanverdünnt werden. Für Methylenchlorid ergibt die Rechnung:

xC D 0;33 � 2;7=3;1 D 0;287 :


P‘

P‘

P‘‘

P‘‘

P‘

1

2

3 47

6

5

CHCL3

CHCL3

CH2CL2

MTBE= 4,1

= 2,7 (21,7%)

= 2,7 (28,7%)

= 2,7 (33,3%)

CH2CL2

= 3,1

0,5/0/0,51/0/0

0,5/0,5/0

0/1/00/0,5/0,5

0/0/1

0,33/0,33/0,33

Abb. 4.8 PRISMA-Modell für das Fließmittelsystem CHCl3/CH2Cl2/Methyl-tert-butylether.(Aus [3], mit freundlicher Genehmigung © Wiley-VCH)

Der Anteil des Methylenchlorids muss um 33 % – 28,7 % = 4,3 % mit Heptan ver-dünnt werden. Damit ergibt sich für die Endmischung:

P 0ABC D 33 % MTBE C 21;7 %CHCl3 C 28;7 % CH2Cl2 C .11;3 C 4;3/ % Heptan:

Es werden nun neue Selektivitätspunkte in der ganzen Fläche (PA0/PB

0/PC0) so

ausgewählt, dass deren Summe immer 10 ergibt. Diese verschiedenen Mischungender drei Ausgangsfließmittel (z. B. 1/1/8 oder 1/8/1 oder 8/1/1 an den Außenkantenoder 3/3/3 in der Mitte) werden zur Optimierung der Trennung (zwischen Rf = 0,2und Rf = 0,8 mit der besten Auflösung bei Rf = 0,33) benutzt. Auf diese Art wirddurch Versuch und Irrtum das für die Trennung optimale quaternäre Fließmittel er-mittelt. Das PRISMA-Modell bringt Elutionsstärke und Fließmittelselektivität in

4.6 Fließmittel mit festen Zusätzen 107

einen anschaulichen Zusammenhang und visualisiert so das Auffinden eines opti-malen Fließmittelgemisches.

4.6 Fließmittel mit festen Zusätzen

Neben Modifier, Verdünner und Vermittler werden in einigen Fließmitteln auchfeste Zusätze benutzt. Meistens sind es Puffermischungen, die den pH-Wert desFließmittels auf einen bestimmten Bereich festlegen. Für die Bestimmung des pH-Wertes eines Puffers kann die sogenannte Puffergleichung, die logarithmierte Dis-soziationsgleichung einer Säure (HA) zum Proton (H+) und ihrem Anion (A�),benutzt werden.

pH � � lg.cHC/ D pKS C lg

cA�

cHA(4.8)

Die Formel gilt analog natürlich auch für Basen, allerdings muss dann der pKB-Wert statt des pKS-Wertes verwendet werden.

Wenn die Konzentration der Säure und der korrespondierenden Base (des Salzes)gleich sind, wird der logarithmische Ausdruck null, und es gilt:

pH D pKS :

Einfach herstellbar sind daher Puffer, deren pH-Wert gleich dem pKS-Wert desPuffersystems sein soll. Hier müssen nur gleiche molare Mengen Säure und Salzbzw. Base und Salz abgewogen werden. Im Laboralltag gibt man praktischerweisedas Salz vor und fügt die Säure oder Base als Lösung solange zu, bis der gewünschtepH-Wert erreicht ist. Ein Puffer funktioniert in einem pH-Fenster von etwa ˙ 30 %um den pKS-Wert (Tab. 4.5).

Wie verändert nun ein Puffer das Laufverhalten der Analyte? Die Säure HAverteilt sich zwischen mobiler und stationärer Phase:

ŒHA�m ! ŒHA�s C ŒA��s C ŒHC�s :

Tab. 4.5 pKS-Werte verschiedener für die DC geeigneter Puffersysteme. Beide Substanzen immolaren Verhältnis 1 : 1 gemischt, ergeben einen Puffer mit pH = pKs

Puffersystem pKs-Wert

H3PO4/H2PO�

4 1,96

HCOOH/HCOO� 3,7

CH3COOH/CH3COO� 4,75

H2PO�

4 /HPO2�

4 6,16

H3BO3/H2BO�

3 9,24

NH+4 /NH3 9,25

HCO�

3 /CO2�

3 10,4

HPO2�

4 /PO3�

4 12,3


Abb. 4.9 Dargestellt ist die Trennung von a Paraquat, b Diquat, c Mepiquat, d Chlor-mequat und e Difenzoquat (von unten nach oben) mit den Fließmittelgemischen 1-Propa-nol/Methanol/Wasser/0,5 N, 1 N, 1,5 N, 2 N und 2,5 N wässriger NaCl-Lösung (4 + 4 + 12, V / V).Die Verbindungen wurden mit Tetraphenylborat/HCl in Wasser angefärbt und fluoreszieren bei360 nm

Für die Säure HA lässt sich ein scheinbarer Verteilungskoeffizient K* schreiben:

K� D ŒcHA�s C ŒcA� �s

ŒcHA�m:

Mit der Definition der Säurekonstante in der stationären Phase KS D ŒcHCcA�=

cHA�s und der Definition des Verteilungskoeffizienten K = [cHA]s/[cHA]m kann fürden scheinbaren Verteilungskoeffizienten K* auch geschrieben werden:

K� D ŒcHA�s

ŒcHA�mC ŒcA� �sŒcHC

�sŒcHA�s

ŒcHA�mŒcHC�sŒcHA�s

D K

�1 C Ks

cHC

s

:

Durch Einsetzen des scheinbaren Verteilungskoeffizienten in die Definition desRm-Wertes in (2.10) folgt:

Rm D lgVs

VmC lg K� D lg

Vs

VmC lg K C lg

�1 C Ks

CHC

s

:

Mit der Definition des pH-Wertes der (4.8) und des pKs-Wertes für die stationärePhase folgt für den Bereich starker Dissoziation (pH � pKs) bzw. KS=cHC

� 1 [2]:

Rm D lg KVs

VmC pH � pKs : (4.9)

Für dissoziierende Analyte gilt damit: Ihre Rm-Werte steigen linear mit den pH-Werten der stationären Phase an. Entsprechend fällt der Rf-Wert mit steigendem

4.6 Fließmittel mit festen Zusätzen 109

Tab. 4.6 Daten verschiedener Fließmittel – Polaritätsindex-Werte mit Wichtungsfaktoren undGruppenzugehörigkeit (interpolierte Werte für die RP-Chromatographie in Klammern), � /� (m/s),*Wert von Methylbutylketon, Kursiv: Werte nach [8]

Lösungsmittel P0-Wert xe xd xn Gruppe � /� (25°)+

n-Hexan 0,1 – – – 0 56

n-Pentan 0,1 – – – 0 67

Cyclohexan 0,2 – – – 0 28

Di-n-buthylether 2,1 0,44 0,18 0,38 I 91

Diisopropylether 2,4 0,48 0,14 0,38 I 91

Toluol 2,4 0,25 0,28 0,47 VII 48

Triethylamin 1,9 (2,2) 0,56 (0,66) 0,12 (0,08) 0,32 (0,26) I 52

Methyl-tert-Butylether

2,7 0,49 0,14 0,37 I 72

Diethylether 2,8 0,53 0,13 0,34 I 71

Methylenchlorid 3,1 (4,3) 0,29 (0,27) 0,18 (0,33) 0,53 V (VII) 62

n-Octanol 3,4 0,56 0,18 0,25 II 3,7

1,1-Dichlorethan 3,5 0,30 0,21 0,49 V 41

2-Propanol 3,9 0,55 0,19 0,27 II 8,7

n-Butanol 3,9 0,56 0,19 0,25 II 8,3

THF 4,0 (4,4) 0,38 0,20 0,42 III 56

1-Propanol 4,0 0,54 0,19 0,27 II 11

tert-Butanol 4,1 0,56 0,20 0,24 II 7,3

Chloroform 4,1 (4,3) 0,25 (0,31) 0,41 (0,35) 0,34 (0,34) VIII 47

Ethanol 4,3 (3,6) 0,52 0,19 0,29 II 19

Ethylacetat 4,4 0,34 0,23 0,43 VIa 52

Bis-(2-Ethoxyethyl)-ether

4,6 0,37 0,21 0,42 VIa –

Cyclohexanon 4,7 0,36 0,22 0,42 VIa 40*

Methylethylketon 4,7 0,35 0,22 0,43 VIa 57

Dioxan 4,8 0,36 0,24 0,40 VIa 26

Chinolin 5,0 0,41 0,23 0,36 III 26

Aceton 5,1 (3,4) 0,35 0,23 0,42 VIa 74

Methanol 5,1 (3,0) 0,48 0,22 0,31 II 38

Pyridin 5,3 0,41 0,22 0,36 III 39

Methoxyethanol 5,5 0,38 0,24 0,38 III 18

Benzylalkohol 5,7 0,40 0,30 0,30 IV –

Acetonitril 5,8 (3,1) 0,31 0,27 0,42 VIb 75

Essigsäure 6,0 0,39 0,31 0,30 IV 21

Ameisensäure 6,0 – – – IV –

Nitromethan 6,0 0,28 0,31 0,41 VII –

Methylformamid 6,0 0,41 0,23 0,36 III –

Propylcarbonat 6,1 0,31 0,27 0,42 VIb –

DMF 6,4 0,39 0,21 0,40 III 40


Tab. 4.6 Fortsetzung

Lösungsmittel P0-Wert xe xd xn Gruppe � /� (25°)+

Ethylenglykol 6,9 0,43 0,29 0,28 IV 2,3

DMSO 7,2 0,39 0,23 0,39 III 2,4

m-Kresol 7,4 0,38 0,37 0,25 VIII 2,8

Dodecafluoroheptanol 8,8 0,33 0,40 0,27 VIII –

Formamid 9,6 0,37 0,33 0,30 IV 17

Wasser 10,2 (0,0) 0,37 0,37 0,25 VIII 73

pH-Wert. Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass die Änderung des pH-Wertesdie Rf-Werte von dissoziierenden Verbindungen (also Säuren, Basen und Salzen)verändert, nicht aber die Rf-Werte nichtdissoziierender Verbindungen.

Werden ionische Verbindungen chromatographiert, sollte im Laufmittel für ei-ne ausreichende Anzahl von Gegenionen gesorgt sein. Hierzu werden gerne die inorganischen Lösungen relativ leicht löslichen Salze KBr, LiCl, NH4Cl oder Na-triumacetat benutzt. Über die Konzentration der Gegenionen lässt sich auch dasRetentionsverhalten beeinflussen. In Abb. 4.9 ist die Trennung verschiedener Ka-tionen in der Gegenwart unterschiedlicher NaCl-Konzentrationen dargestellt. DerEinfluss der Salzkonzentration auf die Trennung ist deutlich zu erkennen. OhneSalzzugabe verbleiben die Kationen ungetrennt an der Aufgabestelle. Die beidenVerbindungen Paraquat und Diquat werden nur getrennt, wenn die NaCl-Konzen-tration im Fließmittel über 1 M liegt.

Ionenpaarreagenzien werden eingesetzt, um ionische Verbindungen in unpola-ren Laufmitteln lösen zu können. Zu kationischen Verbindungen werden lipophileAnion zugegeben. Anionen werden mit lipophilen Kationen in Lösung gebracht.Bewährt haben sich als Kationen Salze der Pentan- und Hexansulfonsäure. Anionenkönnen z. B. mit Cetylpyridiniumchlorid lipophilisiert werden. In einem Ionenpaarneutralisieren sich die beiden gegensätzlichen Ladungen und werden durch die lipo-hilen Reste nach außen hin abgeschirmt. Auf diese Weise können auch ionischeProben über PR-18-Platten chromatographiert werden.

Zur Trennung von Zuckern bzw. Polyalkoholen hat sich die Zugabe von Borsäurebewährt, da Borsäure mit vicinalen OH-Gruppen (cis-1,2-Diolgruppen) Komple-xe bildet. Solchermaßen komplexierte Zucker zeigen ein verändertes Laufverhaltenauf der Platte. So kann Borsäure zur Änderung der Selektivität eines Trennsystemseingesetzt werden. Dasselbe gilt für den Einsatz von Kronenethern, die Kationender 1. Hauptgruppe des Periodensystems komplexieren können. Auch hier ist beiZugabe eine Änderung der Selektivität erreichbar.

Chirale Reagenzien wie Cyclodextrine bilden mit chiralen Proben diastereomereEinschlussverbindungen, die chromatographisch getrennt werden können [23].

Literatur 111

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5Probevorbereitung und Probeauftragung

Die Art der Probeaufgabe beeinflusst die Qualität der Trennung wie auch die Quan-tifizierung. Für den Praktiker ist wichtig, dass die Auftragung experimentell beein-flusst werden kann. Damit bildet die Probeauftragung einen weiteren Freiheitsgrad,den der Analytiker optimieren kann [1–4]. Allerdings beeinflusst die Probeauf-tragung die Selektivität eines Trennsystems nur indirekt. Eine schlechte Auftra-gung verhindert lediglich, dass die maximal mögliche Selektivität und die maximalmögliche chromatographische Trennzahl erreicht werden können. Bei Quantifizie-rungen sollte die Probeauftragung außerdem immer automatisch erfolgen, da dieVarianz des Auftragevolumens einer der Hauptverursacher des analytischen Ge-samtfehlers ist.

5.1 Die Probevorbereitung

In den seltensten Fällen kann eine Probe direkt vermessen werden, und dann istdies auch nur bei flüssigen Proben möglich. Der eigentlichen Analytik muss in derRegel eine Probevorbereitung vorausgehen. Hierbei werden immer zwei Ziele ver-folgt: Der Analyt soll angereichert und Störstoffe (also die Matrix der Probe) sollenabgereichert werden. Trivialerweise müssen feste Proben in einem geeigneten Lö-sungsmittel aufgelöst werden, bevor sie auf die Platte aufgetragen werden können.Geeignete lipophile Extraktionsmittel wie Ethylacetat, Pentan oder Hexan sowieMethylenchlorid lösen im Idealfall den Analyten und bilden mit der wässrigen Ma-trixlösung eine Phase.

5.1.1 Der QuEChERS-Ansatz

Die Substanzen Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF), 2-Propanol oder Ethanol sindmit Wasser vollständig mischbar, können jedoch mit einem Trick zur Extraktion vonWasser benutzt werden. Dazu werden diese Substanzen mit der wässrigen Probegemischt. Dann wird dem Gemisch ein Salz im Überschuss zugefügt (z. B. NaCl


114 5 Probevorbereitung und Probeauftragung

Tab. 5.1 Liste der Lösungsmittel, die für einen QuEChERS-Ansatz einsetzbar sind. Die Men-genangaben sind für 10 ml wässriger Probe berechnet. Die angegebenen Salzmengen erlauben dieTrennung in zwei Phasen, mit der Angabe des organischen Phasenvolumens

Lösungsmittel (10 ml) P0-Wert Salzmenge Extraktionsvolumen

2-Propanol 3,9 4 g MgSO4 � 6 H2O + 1 g NaCl 12,4 ml

Tetrahydrofuran 4,0 4 g MgSO4 � 6 H2O + 1 g NaCl 10,4 ml

Ethanol 4,3 8 g K2CO3 11,4 ml

Dioxan 4,8 4 g MgSO4 � 6 H2O + 1 g NaCl 3,4 ml

Aceton 5,1 4 g MgSO4 � 6 H2O + 1 g NaCl 9,0 ml

Acetonitril 5,8 4 g MgSO4 � 6 H2O + 1 g NaCl 9,8 ml

oder MgSO4). Das Salz „hydrophilisiert“ das Wasser, macht es also polarer. AlsFolge davon entmischen sich beide Phasen, und die organische Phase mit den inihr gelösten unpolaren Substanzen kann abgetrennt werden. Diese Art der Flüssig-flüssig-Extraktion umgeht das Ausschütteln, da die Phasentrennung aus homogenerLösung erfolgt.

Diesem Ansatz folgend, können z. B. Pestizide aus meist wasserreichen Obst-oder Gemüseproben mit Acetonitril extrahiert werden. Acetonitril hat gegenüberdem ebenfalls verwendbaren Aceton oder Ethylacetat den Vorteil, dass geringereMengen von den lipophilen Matrixbestandteilen wie Fette und Wachse mitextra-hiert werden. Die Salzzugabe von z. B. Natriumchlorid kontrolliert die Polarität derWasserphase und beeinflusst so den Anteil an Matrixbestandteilen, die mitextrahiertwerden. Zu hohe Salzanteile verringern die Löslichkeit polarer Analyte. Daher isteine auf Matrix und Analyt abgestimmte Dosierung wichtig.

Gute Ergebnisse erhält man, wenn man als Standardprotokoll 10 g Probe mit10 ml Acetonitril extrahiert und die Phasentrennung mit 4 g MgSO4 und 1 g NaClerzwingt, die durch Zentrifugation beschleunigt werden kann [5]. Nach dem Ab-trennen der organischen Phase wird diese abgedampft, und der zurückbleibendeAnalyt wird mit wenig Lösungsmittel wieder aufgenommen. Meistens befindet sichin der wieder aufgenommenen Probe noch ein Rest an Matrix, der aber bei einerDC-Trennung nicht weiter stört, da hier mit Einwegplatten gearbeitet wird. An-schließendes Zentrifugieren beider Phasen beschleunigt die Phasentrennung. Dieseneue Methode zur Probevorbereitung wird QuEChERS-Ansatz genannt (ein Akro-nym, gebildet aus Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe). Die Methodewurde zur Pestizidanalytik [5], zur Analyse von Pharmaka in Blut [6] sowie zurBestimmung von Aflatoxinen entwickelt [7].

5.1.2 Stirbar Sorptive Extractions

Eine interessante Methode, bei der nur geringe Mengen einer Extraktionsphase be-nötigt werden, ist die sogenannte „Stir Bar Sorptive Extraction“ (SBSE) [8, 9]. EinRührfisch wird in ein Glasrohr gesteckt und dieses auf beiden Seiten mit der Ex-traktionsphase verschlossen. Als Extraktionsphase wird in der Regel Polysiloxan

5.1 Die Probevorbereitung 115

verwendet. Die Probelösung wird mit dem präparierten Rührfisch für etwa eineStunde gerührt, wobei sich der Analyt in der lipophilen Polysiloxanphase anrei-chert. Anschließend kann der Analyt mit wenig Lösungsmittel aus der stationärenExtraktionsphase rückextrahiert werden [10].

Eine vielversprechende Variante ist die sogenannte Solvent-Bar-Microextractionmit einem Silicamonolith (SBME/SM) [9]. Hierbei wird ein runder RP-18-Silica-monolith – mit einer Länge von ca. 15 mm und einem Durchmesser von 4,6 mm –mit der Extraktionsflüssigkeit beladen und in der wässrigen Probe ca. eine Stundebewegt. Dann wird mit einem kleinen Volumen rückextrahiert. Der Monolith nimmtca. 100 µl Extraktionsflüssigkeit auf, die bis zu einem Liter Probe extrahieren kann.Als Extraktionsflüssigkeit können alle Lösungsmittel benutzt werden, auch Acetonoder Acetonitril.

5.1.3 Solid-phase-Extraktion (SPE)

Die Festphasenextraktion (SPE) ist wohl die am häufigsten eingesetzte Vorbehand-lungsmethode, wenn es darum geht, Analyte im Spurenbereich aus wässrigen Pro-ben anzureichern [11–13]. Eine SPE-Anreicherung läuft in fünf Schritten ab. Imersten Schritt werden entweder 0,5 bis 1 g einer stationären Phase (Tab. 5.2) in einekurze Glas- oder Polyethylensäule gegeben, oder man greift auf kommerziell gefüll-te Kartuschen zurück. Die Kartusche wird mit einer organischen Phase gewaschen(konditioniert), damit sie wasserbenetzbar wird. Die Wahl der Festphase hängt vomAnalyten ab. Auswahlkriterien dazu sind in Tab. 5.2 aufgeführt. Im zweiten Schrittwird die Probe oder der Probeextrakt durch die Packung der Säule gesaugt. Idea-lerweise sollte der Analyt dabei adsorbiert werden, während die Matrix die Säulevollständig passiert. In einem dritten Schritt wird die Festphase mit einem hydrophi-len Lösungsmittel gewaschen, um letzte Matrixreste von der Säule zu entfernen. Imvierten Schritt wird der Analyt mit wenig lipophilem Lösungsmittel von der Fest-

Tab. 5.2 Auswahlschema für verschiedene SPE-Phasen. Phenyl phenylsubstituiert, PA 66 Poly-amid, DMA Dimethylamino-substituiert, SA Benzosulfonsäure, SB quaternäres Amin

Probe wasserlöslich oder organisch löslich

Probe nichtionisch Probe ionisch

Lösungsmittel wässrig/organisch Lösungsmittel wässrig

unpolar mittelpolar polar kationisch anionischC18 SiOH CN SA SBC8 NH2 OH NH2C4 PA 66 DMAC2 DMA

Phenyl NH2CN


Abb. 5.1 Gezeigt ist a die Festphasenextraktion mittels hydrostatischem Druck, b die Extraktiondurch Unterdruck. Dieser Aufbau entspricht der Tswett’schen Säulenchromatographie (Abb. 1.3)

phase eluiert. Abschließend wird das lipophile Lösungsmittel abgedampft und dieProbe mit einem definierten Volumen wieder aufgenommen. Die SPS liefert sehrsaubere Extrakte. Analyte aus Wasserproben können auf diese Weise einfach an-gereichert werden [14]. Die Methode ist aber auch zeitaufwändig und relativ teuer.Aufpassen muss man beim Durchleiten der Probe. Das Probevolumen darf nicht zugroß gewählt sein, da sonst ein Teil des Analyten aus der Kartusche gespült werdenkann. Ein Vorteil liegt darin, dass der Verbrauch größerer Mengen an Extraktions-mittel vermieden wird.

Unpolare Proben können mit Hexan, CH2Cl2, Acetonitril oder Alkoholen vonder Festphase eluiert werden. Mittelpolare und polare Proben sollten mit CHCl3,CH2Cl2, Ethylacetat, Alkoholen oder Wasser von der Festphase gewaschen wer-den. Zur Elution von kationischen Analyten können Säuren oder Salzlösungen, zurElution von anionischen Analyten Basen und Salzlösungen verwendet werden.

Zur Elution mit kleinen Lösungsmittelmengen eignet sich das Durchsaugen mit-tels Unterdruck. Hierzu werden spezielle Gefäße im Handel angeboten, die dieparallele Verarbeitung mehrerer Extraktionsröhrchen ermöglichen. In Abb. 5.1b istsolch eine Anordnung dargestellt, bei der mit Unterdruck durch die Festphase in einVial extrahiert wird. Große Volumina (z. B. zur Anreicherung von Wasserproben)

5.2 Die Qualität der Auftragung (QD) 117

lässt man am einfachsten hydrostatisch durch das Extraktionsröhrchen fließen, wiein Abb. 5.1a gezeigt ist.

Egal, für welche Probevorbereitung man sich entscheidet, man sollte immer imBlick behalten, dass die einfachste Vorbereitung auch den geringsten Fehler verur-sacht. Außerdem sollte man bedenken, dass der Fehler der Probevorbereitung in derRegel sehr viel größer ist, als der Fehler, der bei der eigentlichen Messung gemachtwird. Eine nicht zu unterschätzende Stärke von Einwegplatten ist, das auch unsau-bere flüssige Proben ohne Vorbereitung direkt auf die Platte aufgetragen werdenkönnen. Hier reduziert sich der Fehler in der Probevorbereitung auf den Fehler derProbeauftragung. Solche einfach aufgebauten Methoden sind deshalb nach Mög-lichkeit den komplizierteren Aufarbeitungstechniken vorzuziehen.

5.2 Die Qualität der Auftragung (QD)

Die Auftragebreite einer Probe ist der entscheidende Faktor, um die erreichbarenTrennzahlen zu optimieren. Um das zu verstehen, muss man sich den Ausdruck fürdie Trennzahl nach Kaiser ansehen (2.28). Er lautet:

SN D 1

2

sN 0

real

ln.4/

�wH.Front/ � wH.Start/

wH.Front/ C wH.Start/

�� 1 :

Die Qualität der Auftragung QD kann nach Kaiser über folgenden Ausdruck be-stimmt werden:

QD D wH.Front/ � wH.Start/

wH.Front/ C wH.Start/: (5.1)

Der Wert für QD ist immer kleiner als 1, da immer wH(Start) > 0 gilt. Mit Gl. (5.1)wird der Ausdruck zur Trennzahl zu:

SN D 1

2

sN 0

real

ln.4/QD � 1 : (5.2)

Man sieht, dass eine große Trennzahl nur mit einem QD-Wert nahe 1 erreichtwird. Allgemein gilt: Eine maximale Trennzahl wird nur durch eine möglichstkleine Auftragebreite (wH(Start)) erreicht. Vor der Trennung lässt sich aber die Auf-tragebreite (wH(Start)) minimieren. Man kann z. B. strichförmig statt fleckförmigauftragen oder die Auftragung fokussieren. Zum Fokussieren der Auftragung wirdmit einem Laufmittel hoher Stärke eine kurze Strecke entwickelt. Dies kann auch –nach einem Trocknungsschritt – mehrfach durchgeführt werden. Der Effekt beruhtdarauf, dass die Zone, noch bevor sie vorne zu wandern beginnt, hinten zusammen-geschoben wird. Die Zonenbreite nach n Konzentrierungsschritten berechnet sichzu:

n D 0.1 � Rf/n : (5.3)


N‘=2000

N‘=1000

N‘=500

0

2

4

6

8

10

Tren

nzah

l (SN

)

12

14

16

18

20

0 0,5 1

Auftragebreite (mm)

1,5 2

Abb. 5.2 Dargestellt sind Trennzahlen in Abhängigkeit von der Auftragebreite. Sie wurden mitwH(Front) = 3 mm für verschiedene Bodenzahlen mit N0 = 500, N0 = 1000 und N0 = 2000 berechnet

n Zonenbreite nach n Fokussierungen0 Zonenbreite vor der FokussierungRf Rf-Wert im Fokussierungslaufmittel

Aus der Formel für die Fokussierung ergibt sich, dass nur Laufmittel mit hoherStärke (also großen Rf-Werten) schmale Banden erzeugen. Der Effekt ist multipli-kativ.

Aus der Kaiser’schen Formel (5.1) ist ersichtlich, das die Trennzahl bei klei-nen Auftragebreiten ansteigt. Oder anders ausgedrückt: Der Klammerausdruck wirdbei zunehmender Auftragebreite immer kleiner. Er läuft proportional zur Trennzahl(5.2) und ist damit ein gutes Maß für die Auftragequalität.

In Abb. 5.2 sind Trennzahlen – entsprechend der Kaiser’schen Trennzahlfor-mel (5.1) – für verschiedene Bodenzahlen (N 0 = 500–2000) in Abhängigkeit vonder Auftragebreite dargestellt. Gerade bei hohen Bodenzahlen, also in gut trennen-den Systemen, fällt die Trennzahl mit zunehmender Auftragebreite relativ schnellab. Große Auftragebreiten von 1,5 mm und mehr lassen in der DC Trennzahlen vonüber 10 nicht mehr zu. Aus Abb. 5.2 ist gut abzuschätzen, das auch bei optimalarbeitenden Trennsystemen (N 0 = 2000) und einer Auftragebreite von 0,2 mm nureine maximale Trennzahl von etwa SN = 20 erreicht werden kann.

Bei fleckförmiger Auftragung kommt es zu einem Zielkonflikt. Für eine besse-re Nachweisempfindlichkeit sollte möglichst viel Probe auftragen werden, die dann

5.2 Die Qualität der Auftragung (QD) 119

einen entsprechend großen Fleck bildet. Zur Steigerung der Trennzahl (und der Auf-lösung) werden aber Auftrageflecke mit kleinem Durchmesser benötigt. Die Lösungliegt auf der Hand. Man trägt die (möglichst konzentrierte) Probe auf HPTLC-Plat-ten strichförmig über mehrere mm Breite auf. So können noch 10 µl Probe mit einerin Laufrichtung relevanten Auftragebreite von nicht mehr als 1 mm auf die Plattegebracht werden.

Die Elutionskraft des Probelösungsmittels ist für die Auftragebreite (bzw. dieFleckgröße der Auftragung) von entscheidender Bedeutung. Generell gilt, dass mitmöglichst kleiner Fließmittelstärke aufgetragen werden sollte, damit die Probemo-leküle nicht schon während der Auftragung mit dem Lösungsmittel wandern. Inder Adsorptionschromatographie sollte die Probe daher – wenn irgend möglich –in Hexan oder in anderen unpolaren Lösungsmitteln gelöst sein. In der RP-Chro-matographie ist Wasser oder eine polare Verbindung wie Methanol das optimaleLösungsmittel.

Liegt das Lösungsmittel der Probe fest, weil z. B. die Probevorbereitung eineandere Wahl nicht zulässt, sollte die Auftragung in einem ersten Lauf mit einemstarken Laufmittel fokussiert werden. Dies gilt auch für den Fall, dass eine großeMenge an Probe auf die Platte gebracht werden muss.

Eine weitere Möglichkeit zur Minimierung der Auftragebreite liegt in der Ver-wendung von Platten mit Konzentrierungszone. Solche Platten besitzen einen Auf-tragebereich und einen Trennsektor. Der Auftragebereich besteht aus wenig aktiven,also schwach oder gar nicht retardierenden, Adsorbenzien. Diese Technik geht aufD. C. Abbott und J. Thomson zurück und wurde 1965 zum ersten Mal angewendet[15]. Als Material für den Auftragebereich wird oft Kieselgur oder Si50000 benutzt.Der Ort der Auftragung ist bei Platten mit Konzentrierungszone nebensächlich, wieAbb. 5.3a zeigt. Alle Probemoleküle laufen mit Beginn der Entwicklung auf denTrennsektor auf und werden unabhängig von ihrem Auftrageort zu einem Strich ge-staucht. So beginnt die Trennung mit einer kleinen Auftragebreite, und es könnendementsprechend höhere Trennzahlen erreicht werden. Unvorteilhaft ist eine fleck-förmige Auftragung, wie auf den Bahnen 1, 2 und 6 in Abb. 5.3b zu erkennen ist.Runde Auftragungen führen zu einer ungleichen Massenverteilung der gestauch-ten, strichförmigen Startzone und verursachen halbmondartige Trennzonen. Diesehaben oft unvollständige Trennungen zur Folge.

Wird die Probe in einem Zickzack-Muster aufgetragen, können große Volumi-na gleichförmig auf die Platte gebracht werden, ohne dass die Auflösung zu starkleidet. Auf Bahn 4 in Abb. 5.3 ist solch eine Auftragung dargestellt.

Die Verwendung von Platten mit Startzone zeigt noch einen weiteren Vorteil.Im Auftragebereich können stark polare Verunreinigungen wie Salze immobilisiertwerden, die so nicht auf den Trennbereich gelangen. Auch große Moleküle wie Po-lymere oder Proteine wandern nicht und können noch vor der eigentlichen Trennungvom Analyten separiert werden. Kratzt man auf einer Platte mit Konzentrierungs-zone die Ränder der einzelnen Bahnen aus, können auch größere Mengen an Probeaufgetragen werden. Bei dieser Art der Auftragung werden Nachbarbahnen nichtkontaminiert, auch wenn fleckförmig und mit großen Volumina aufgetragen wird.


Abb. 5.3 Gezeigt ist die Verwendung einer HPTLC-Platte mit Auftragezone. a Auftragung, bEntwicklung

Auf diese Weise dient die Auftragezone als „Vorsäule“ und kann zur Reinigung derProbe eingesetzt werden.

5.3 Die Wahl der Auftragestelle 121

5.3 DieWahl der Auftragestelle

Der Auftrageort der Probe, gemessen im Abstand z0 vom Eintauchspiegel der Plat-te, hat nach C. F. Pool einen großen Einfluss auf die theoretische Plattenhöhe einesTrennsystems [16]. Der Abstand zwischen Fließmittelzuführung und Auftrageortsollte bei HPTLC-Trennungen zwischen 4 und 6 mm und bei DC-Trennungen zwi-schen 5 und 10 mm liegen. Bei größeren Abständen steigt die Plattenhöhe sowohlin der TLC als auch in der HPTLC an, wie in Abb. 5.4 zu sehen ist. Der Grund,warum die Auftragung nicht zu nahe am Eintauchspiegel des Fließmittels liegendarf, hängt mit der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase zusammen.

Ist diese beim Auftreffen auf die Probe zu hoch, wird ein Lösen der Probe er-schwert. Dies folgt auch aus dem Ausdruck für die mittlere Plattengröße HM derlokalen van-Deemter-Gleichung (2.25). HM wird hier bei sehr kleinen z0-Werten,

00

100

200

300

2 4 6 8 10 12

Zf [cm]

HPTLC (Zo=5)

TLC (Zo=5)

TLC (Zo=15)

HPTLC (Zo=15)

[µm]

H1

Abb. 5.4 Graphisch aufgetragen sind theoretische Plattenhöhen gegen die Trennstrecke ver-schiedener DC- und HPTLC-Trennungen, gemessen jeweils für zwei verschiedene Auftrageorte(z0 = 5 mm und z0 = 15 mm). (Aus [16], mit freundlicher Genehmigung © Akadémiai Kiadó)


trotz der Logarithmierung, sehr groß.

HM � lnzf

z0

Industriell gefertigte DC-Platten zeigen eine hohe Qualität; trotzdem kann sichdie Schichtgüte von einem Bereich der Platte zum anderen ändern. Dies hat einendirekten Einfluss auf das quantitative Messergebnis.

Um solche Qualitätsunterschiede auszugleichen, sollten Probe und Standardüber die Platte verteilt aufgetragen werden („Data-pair-Technik“) [17]. So werdenunrichtige Analysenergebnisse verhindert, weil auf schlechten Plattenbereicheneben nicht nur die Analyse, sondern auch die Referenz gemessen wird. EinSchwachpunk aller Trennplatten ist der Schichtbereich an den Plattenseiten, dennhier variiert herstellungsbedingt die Schichtdicke am deutlichsten. Daher sollte mandort mindestens die Breite eines Zentimeters nicht zur Trennung verwenden.

5.4 PraktischeMethoden der Auftragung

5.4.1 Auftragungmit Plattenkontakt

Die einfachste Methode, eine Probelösung auf die DC-Platte zu bringen, ist dieVerwendung von Kapillaren (Abb. 5.5). Im Handel sind Einwegkapillaren aus Glassin den Größen 0,5 µl, 1,0 µl, 2,0 µl und 5,0 µl erhältlich. Die Kapillaren füllen sichbeim Eintauchen in die Probelösung vollständig mit dem angegebenen Volumen.Damit gleichen sie kleinen Vollpipetten. Dosierunsicherheiten von höchstens 1 %können erreicht werden.

Abb. 5.5 Abgebildet sind verschiedene Einwegkapillaren mit Halter und Ansaugkappe

5.4 Praktische Methoden der Auftragung 123

Messkapillaren mit Eichmarken zur Abmessung verschiedener Flüssigkeitsmen-gen sollten nicht benutzt werden, da die Auftragemengen nur schlecht reprodu-zierbar sind. Auch sollte man beachten, dass mit Glaskapillaren keine wässrigenProben aufgetragen werden können. Wässrige Proben können mit ca. 30 % Metha-nol verdünnt werden, damit das Glas von der Probelösung benetzt werden kann.Mit Glaskapillaren kann nur fleckförmig aufgetragen werden, und diese Kapillarensollten nur einmal benutzt werden. Ein Auftragesystem mit geeichten und wie-derverwendbaren Glas- oder Stahlkapillaren wird von der Fa. CAMAG unter demNamen Nanomat® im Handel vertrieben [2]. Ein automatisch arbeitendes Auftra-gesystem, bei dem Kapillaren auf die Platte aufgesetzt werden, wurde von der Fa.Lothar Baron Laborgeräte, Reichenau angeboten [18].

5.4.2 Auftragung ohne Plattenkontakt

Bei Kapillaren wird die Probe über einen Plattenkontakt aufgetragen. Daher be-steht immer die Gefahr einer Beschädigung der Plattenoberfläche. Eleganter istdie Sprühmethode, bei der die Probelösung an der Spritzenspitze ohne Platten-kontakt versprüht wird. Mit geeigneten Düsen sind Auftragebreiten von wenigen100 µm erreichbar. Im Handel werden verschiedene halbautomatisch oder auch voll-automatisch arbeitende Auftrageautomaten angeboten, die die Probelösung mittelsPräzisionsspritzen auf die Platte bringen (Abb. 5.6 und 5.7).

Die verfügbaren Systeme hat T. Omori zusammengetragen [18]. Der große Vor-teil einer automatisierten Auftragung liegt natürlich in einer größeren Präzision desaufgesprühten Volumens. Auch können mehr Proben als von Hand pro Zeiteinheitaufgetragen werden. Allerdings verliert die DC spätestens bei einer halbautoma-tischen Auftragung ihren Status als preiswerte Trenntechnik, die mit minimalemGeräteaufwand auskommt.

Für quantitative DC-Messungen ist eine möglichst konstante Verteilung des Ana-lyten im Messbereich essenziell. Bei quantitativen Messungen sollte deshalb immerauf eine automatisch ausgeführte, strichförmige Auftragung zurückgegriffen wer-den. Für quantitatives Arbeiten sind Auftrageautomaten daher unerlässlich.

5.4.3 Auftragung über Kontakt-Spotting

Eine interessante Variante, um große Probevolumina mit kleiner Auftragebreitepunktförmig auf die Platte zu bringen, stellt das sogenannte „Kontakt-Spotting-Ver-fahren“ dar [2]. Bei diesem System wird die Probe in einer Größenordnung von biszu 100 µl auf einen Teflonstreifen aufgebracht, der durch ein anliegendes Vakuumin eine Vertiefung gesaugt wird und so die Probe aufnimmt. Nun wird eine kleineMenge einer schwer verdampfbaren Transportflüssigkeit wie Glycerin oder Dime-thylsulfoxid zur Probe in die Vertiefung gegeben. Im Anschluss wird die Probedurch einem warmen Stickstoffstrom getrocknet. Die gesamte Probe soll sich inder zugesetzten, geringen Menge der schwer flüchtigen Transportflüssigkeit lösen.So verbleibt sie mit einem geringen Volumen auf dem Teflonstreifen. Nun wird eine


Abb. 5.6 Abgebildet sind die halbautomatisch arbeitenden Systeme a der Fa. DESAGA (AS 30)und b der Fa. CAMAG (Linomat V). (Mit freundlicher Genehmigung von DESAGA, Heidelberg,und CAMAG, Muttenz, CH)

DC-Platte mit der stationären Phase nach unten auf das Teflonband gelegt. Wird dasVakuum durch Überdruck ersetzt, schnellt der Teflonstreifen gegen die DC-Platteund überträgt die Transportflüssigkeit samt Probe auf die stationäre Phase. Einenschematischen Ablauf der Auftragung zeigt Abb. 5.8.

5.4 Praktische Methoden der Auftragung 125

Abb. 5.7 Abgebildet ist der ATS 4 der Fa. CAMAG, ein computerprogrammiertes und vollau-tomatisch arbeitendes Auftragesystem. (Mit freundlicher Genehmigung von CAMAG, Muttenz,CH)

Diese Technik ermöglicht ein Aufkonzentrieren der verdünnten Probe und diepunktförmige Auftragung in einem Arbeitsgang. Die Methode ist vor allem in derSpurenanalytik für den verlustfreien Auftrag größerer Probevolumina geeignet [20].Das entsprechende Gerät TRANSPOTTM (Modell 1010) der Fa. Clarke AnalyticalSystems, Sierra Madre, Kalifornien wird im Handel leider nicht mehr vertrieben.

5.4.4 Plattenüberladung und unvollständiges Trocknen

Die mögliche Gefahr bei der DC-Auftragung liegt in einer Überbeanspruchung derstationären Phase. Es kann nicht beliebig viel Probe aufgetragen werden. Je nachMatrix können auf eine HPTLC-Platte mit 200 µm Schichtdicke maximal 5–20 µlaufgebracht werden, ohne dass eine Trennung gestört wird.

Ein nicht robustes Fließmittelgemisch kann sich während der Entwicklung ver-ändern und dann in Kombination mit einer Schichtüberladung zu dem in Abb. 5.9dargestellten Effekt führen. Auf der abgebildeten Kieselgelplatte wurden drei me-thanolische Gingkoextrakte abwechselnd mit 1 µl und 5 µl aufgetragen.

Auf den Bahnen 2, 4 und 6 wurden die stationären Phasen mit lipophiler Ma-trix überladen. Im oberen Teil der Platte sind alle Zonen ungestört aufgetrennt. Diestationäre Phase reichert sich im Laufe der Trennung mit Wasser an und zeigt imunteren Teil der Platte einen erhöhten Wasseranteil. Das Übermaß an lipophilenMatrixanteilen auf den überladenen Bahnen 2, 4 und 6, die den unteren Teil der


Trennbahnen lipophilisieren, zwingen das hydrophile Fließmittel in diesem Bereichzu einem punktuellen Durchbruch. So entsteht die konusförmige Verteilung der un-teren, blau fluoreszierenden Bande. Der lipophile, wenig gewanderte Matrixanteil„verstopft“ förmlich die Trennbahn. Eine Vorreinigung der Probe, die Verwendungeines stabileren Fließmittels oder eine verringerte Auftragung, wie auf den Bahnen1, 3 und 5 geschehen, vermeiden das Problem.

Abb.5.8 Ablauf einer Kontak-Spotting-Auftragung. a Polymerfilm auf dem Auftragegerät, b An-saugen des Polymerfilms, c Probeaufgabe, d Eindampfen der Probe, e Übertragung der Probe aufdie DC-Schicht. (Aus [19], mit freundlicher Genehmigung © Hüthig)

Literatur 127

Abb. 5.9 Dargestellt ist die Trennung eines Gingkoextraktes auf Kieselgel mit dem FließmittelEthylacetat/Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (100 + 11 + 11 + 22, V / V)

Literatur

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6Entwicklungstechniken in derDünnschichtchromatographie

Die Wahl des Sorbens und des Fließmittels sowie die Minimierung der Auftrage-breite sind wichtige Schritte auf dem Wege zu einem optimalen Trennergebnis. Indieser Hinsicht ist die DC sehr flexibel und erlaubt viele Lösungen. Die DC besitztdabei eine Einflussgröße, die anderen chromatographischen Verfahren fehlt: Diesist der Einfluss der Dampfphase auf die Trennung. Die DC ist ein offenes System.Während der Trennung bilden sich mobile und stationäre Phase im Wechselspielzwischen Sorbens und Fließmittel, unter Einbeziehung der Dampfphase, aus. In derHPLC z. B. ist dieser Einfluss nicht gegeben. Dort werden die beiden Phasen nurdurch das Zusammenwirken von Fließmittel und Sorbens gebildet. In der DC be-sitzt der Analytiker über die Wahl der Trennkammer eine weitere Möglichkeit, umEinfluss auf die Trennung nehmen zu können [1, 2].

6.1 Der Einfluss der Dampfphase

Die mobile Phase entwickelt sich während der Trennung aus dem Wechselspiel vonFließmittel und Sorbens. Bei der Ausbildung der Fließbedingungen hat man dabeilange Zeit die Dampfphase nicht berücksichtigt. Erst R. A. de Zeeuw machte 1968deutlich, welch wichtigen Einfluss die Dampfphase in einer Entwicklungskammerauf die Einstellung der Trennparameter und damit auf das chromatographische Er-gebnis hat [1]. Er konnte zeigen, dass merkliche Mengen Fließmittel von einertrockenen Platte über die Dampfphase aufgenommen werden und so an der Tren-nung teilnehmen. Eine schematische Darstellung dieser Vorgänge zeigt Abb. 6.1.De Zeeuw war damit der Erste, der die Ausnutzung der Dampfphase als weiterenFreiheitsgrad zur DC-Optimierung empfahl.

Die Aufnahme von Fließmittelmolekülen aus der Dampfphase nennt man Sorpti-on [2, 3]. Der Umfang der Sorption hängt eng mit der Vorgeschichte der DC-Plattezusammen und kann über die Art der benutzten Kammer gesteuert werden. Dieswurde ausführlich von F. Geiss beschrieben [2, 3]. In einer normalen Trogkammerz. B. läuft eine Reihe von Vorgängen über die Dampfphase ab. Wird ein Fließmit-telgemisch in eine Trennkammer gegeben, dampft mit der Zeit ein Teil davon ab.


130 6 Entwicklungstechniken in der Dünnschichtchromatographie

Abb. 6.1 Schematische Darstellung wichtiger chromatographischer Begriffe. (Entnommen aus[2, 3])

Das Konzentrationsverhältnis der Komponenten in der Dampfphase stellt sich dabeiüber das Raoult’sche Gesetz entsprechend der Konzentrationen im Fließmittel ein.Nach einiger Zeit hat sich ein dynamisches Gleichgewicht ausgebildet: Es gehengleich viele Moleküle aus der Flüssigkeit in die Dampfphase über, wie sich Mole-küle aus der Dampfphase flüssig niederschlagen. Die Konzentration an Fließmittelin der Dampfphase ist damit stabil. Diesen Zustand nennt man Kammersättigung(engl. chamber saturation). Bis zum Zustand der Kammersättigung ist die Dampf-phase der Kammer ungesättigt. Wird eine DC-Platte in eine Trennkammer gestellt,werden sich Fließmittelmoleküle aus der Dampfphase auf der Platte niederschla-gen. Es findet eine sorptive Sättigung der Plattenoberfläche statt. Die Platte wirdvorbeladen.

Unter sorptiver Sättigung (engl. sorptive saturation) versteht man den Zustand,bei dem die chromatographische Schicht mit allen Komponenten der gesättigtenDampfphase im Gleichgewicht steht. Die sorptive Sättigung stellt also eine Vorbe-ladung der Platte dar. Werden die Hohlräume der Sorbensschicht vollständig mitFließmittelmolekülen aufgefüllt, nennt man dies eine kapillare Sättigung (engl. ca-pillary saturation) [2, 3].

Wird Fließmittel in eine Kammer gegeben und die DC-Platte sofort hineinge-stellt, hat sich die Dampfphase noch nicht mit Fließmittelmolekülen gesättigt. Esdauert über 30 Minuten, bis die Sorbensschicht einer trockenen DC-Platte mit Fließ-mittelmolekülen aus der Dampfphase gesättigt ist (Abb. 6.2). Wird die trockene DC-Platte dagegen in eine Kammer gestellt, in der Kammersättigung herrscht, ist dieSorbensschicht der Platte schon nach etwa 5 Minuten gesättigt (Abb. 6.3). Durchdie kapillare Sättigung der Sorbensschicht beim Aufsteigen des Fließmittels ver-größert sich deren Oberfläche, was den Austausch zwischen der Plattenoberfläche

6.1 Der Einfluss der Dampfphase 131

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 10 20 30Minuten

mm

ol a

dsor

bier

ter D

ampf

a

b

Abb. 6.2 Dargestellt ist die Dampfadsorption von a Ether und b Chloroform durch eine Kiesel-gelplatte (keine Kammersättigung, aus [1])

0

0,2

0,40,6

0,8

1

1,21,4

1,6

1,8

0 10 20 30Minuten

mm

ol a

dsor

bier

ter D

ampf

a

b

Abb. 6.3 Dargestellt ist die Dampfadsorption von a Ether und b Chloroform durch eine Kiesel-gelplatte (Kammersättigung, aus [1])

und der Dampfphase begünstigt. Da die leichter flüchtige Komponente aus demFließmittel verstärkt abdampft, wird sich diese auf der Plattenoberfläche an- undim Phasengemisch abreichern. Liegt keine Kammersättigung vor, wird mehr Fließ-mittel als bei einer Kammersättigung benötigt, um die Platte über eine bestimmteStrecke zu entwickeln.

Eine trockene Platte soll während der chromatographischen Entwicklung dasVolumen Vm aus dem Fließmittel aufnehmen, um die Plattenhohlräume zu befüllen.Bei einer vorbedampften Platte soll sich das effektive Hohlraumvolumen um Vv,verringern, denn diese Menge Fließmittel hat die Platte durch die Vorbedampfung


schon aufgenommen. Bei der Entwicklung solch einer vorbedampften Platte solleine Substanz die Strecke zx wandern. Diese Wanderungsstrecke ist proportional zudem bei der Entwicklung aufgenommenen Fließmittelvolumen. Damit gilt: zf �.Vm � Vv/.

Aus der Definition des Rf-Wertes folgt weiter, dass die Wanderungsstrecke derSubstanz auch proportional zum Rf-Wert ist. Es gilt:

zx D Rf.zf � z0/ :

Beide Gleichungen vereint zeigen, dass der Rf-Wert proportional zum Volumendes während der Entwicklung aufgenommenen Fließmittels ist.

Rf � .Vm � Vv/

Berücksichtigt man den reduzierten Fließmittelfluss bei einer Vorbeladung, istleicht zu verstehen, dass unter gesättigten Bedingungen bei gleicher Steighöhe undgleichem Fließmittel die Probesubstanzen weniger weit laufen, als bei Bedingungenohne Kammersättigung. Schlägt man eine Trogkammer mit Filterpapier aus, sodassFließmittel über eine große Oberfläche abdampfen kann, wird eine Sättigung derSorbensschicht schon nach etwa 5 Minuten erreicht. Eine chromatographische Ent-wicklung unter Kammersättigung ist besser reproduzierbar als unter ungesättigtenBedingungen, da die mobile Phase nicht durch Abdampfen verändert wird.

Ohne Kammersättigung erhält man oft bessere Auflösungen als mit Kammer-sättigung. Wenn der Dampfraum der Kammer mit Fließmittelmolekülen gesättigtist, wird aufgrund des erhöhten Flusses des Fließmittels bzw. der größeren Trenn-strecke eine größere Anzahl der vorhandenen Trennstufen ausgenutzt [1]. Dies istin Abb. 6.4 bei der Gemischauftragung gut zu sehen. Während sich auf der unterKammersättigung entwickelten Platte die Verbindungen 3 und 4 nicht vollständigtrennen, wird ohne Kammersättigung eine Trennung erreicht. Das Arbeiten mit ei-ner ungesättigten Dampfphase mag in Einzelfällen bessere Ergebnisse zeigen alsEntwicklungen mit einer gesättigten Dampfphase, doch geht die Vorgeschichte derDC-Platte ganz wesentlich in das chromatographische Ergebnis mit ein. Wichtigist beim Arbeiten unter ungesättigten Bedingungen z. B. die Zeitdifferenz zwischendem Einfüllen des Fließmittels und dem Zeitpunkt, an dem die Platte in die Kam-mer gestellt wird. Auch die Temperatur hat über die VerdampfungsgeschwindigkeitEinfluss auf die Trennung, wie natürlich auch die Dampfraumgröße der Trennkam-mer. Um unter optimal reproduzierbaren Bedingungen arbeiten zu können, bautenM. Brenner und A. Niederwieser die sogenannte BN-Kammer, die es erlaubte, dieDC-Schicht gegen die Fließmitteldämpfe abzuschließen. Mit dieser Kammer entwi-ckelten sie die „polyzonale“ Dünnschichtchromatographie [4, 5]. Die BN-Kammerwurde damit zum Vorläufer der Vario-KS-Kammer (KS steht für Kammersätti-gung), die noch zu besprechen sein wird.

6.2 Kammerarten 133

1 2 3 3-6 4 5 6 1 2 3 3-6 4 5 6

a b

Abb. 6.4 Dargestellt ist die Trennung von 1 Heptobarbital, 2 Phenobarbital, 3 Allobarbital,4 Hexobarbital, 5 Methyl-Phenobarbital und 6 Bromisoval auf Kieselgel mit CHCl3/Diethylether(75 + 25, V / V) getrennt, a mit Kammersättigung, b ohne Kammersättigung. (Aus [1], mit freund-licher Genehmigung © Elsevier)

6.2 Kammerarten

In der Dünnschichtchromatographie werden die meisten Trennungen in Linearkam-mern durchgeführt. Das interessante Feld der Zirkularentwicklungen soll hier nurkurz (in Abschn. 6.4) besprochen werden. Die heute üblichen linear arbeitendenKammertypen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die N-Kammer (Trogkam-mer) und die S-Kammer (Schmalkammer).

6.2.1 Die N-Kammer (Trogkammer)

Die N-Kammer ist die am häufigsten benutzte Trennkammer (Abb. 6.5). Das „N“im Namen dieser Kammerart steht für normal. Bei diesem Kammertyp ist die Gas-raumtiefe viel größer als 3 mm. In einer solchen Kammer dauert es unter Umständenmehrere Stunden, bis sich eine Kammersättigung eingestellt hat. Der verhältnismä-ßig große Dampfraum dient als Puffer, um Entwicklungen ohne Kammersättigungdurchzuführen. Die Kammer muss allerdings gesäubert und getrocknet werden,wenn eine Fließmitteländerung durchgeführt wird, denn nur so können Verschlep-pungen verhindert werden. Soll unter Kammersättigung gearbeitet werden, müssendie Seiten der Trogkammer mit Filterpapier ausgeschlagen werden. Nun füllt man


Abb. 6.5 Bild mehrerer Doppeltrogkammern verschiedener Größe. (Mit freundlicher Genehmi-gung der Fa. CAMAG, Muttenz, CH)

Fließmittel ein, das sich über die große Oberfläche des Filterpapiers im Dampfraumverteilt. So wird sichergestellt, dass nach dem Schließen des Kammerdeckels inner-halb von wenigen Minuten Kammersättigung eintritt.

Um eine DC-Platte mit Fließmittel aus dem Dampfraum vorzubeladen, solltezur Entwicklung eine Doppeltrogkammer verwendet werden. In der Doppeltrog-kammer steht die Platte im trockenen Trog, während sich das Fließmittel in demanderen Trog befindet. Mit der Zeit wird die Platte über den Gasraum konditioniert,also mit Fließmittel aus der Dampfphase beladen. Zum Starten der Entwicklungkippt man die Doppeltrogkammer und füllt den trockenen Trog, in dem die DC-Platte steht, mit Fließmittel auf.

6.2.2 Die S-Kammer (Schmalkammer)

Das „S“ im Namen steht für schmal, denn hier beträgt die Gasraumtiefen weni-ger als 3 mm. In einer S-Kammer wird die DC-Platte durch einen Dichtstreifen andrei Seiten gegenüber der Deckplatte abgedichtet. Mit der vierten, offenen Seitewerden Platte und Gegenplatte in das Fließmittel gestellt. Zu Beginn der Entwick-lung ist der nur wenige Milliliter große Dampfraum völlig ungesättigt, weil sich imGasraum keine Fließmittelmoleküle befinden. Ebenso ungesättigt ist damit auch dieDC-Schicht. In einer S-Kammer stellt sich die Kammersättigung wegen des kleinenGasraums sehr schnell ein, allerdings nur über die schon entwickelte Plattenober-fläche. Wegen der geringen Tiefe des Dampfraumes kann Konvektion praktischausgeschlossen werden. Da die Platte ohne Vorkonditionierung entwickelt wird,ist keine Schichtvorbeladung gegeben. Diese Art der Entwicklung arbeitet höchst

6.2 Kammerarten 135

Abb. 6.6 Gezeigt ist der Querschnitt einer Horizontal-S-Kammer. 1 HPTLC-Platte, 2 Dampf-raumbegrenzung nach unten, 3 Fließmittel, 4 Verbinder zum Sorbens, 5 Abdeckung, 6 Reservoirzur Vorkonditionierung. (Mit freundlicher Genehmigung von CAMAG, Muttenz, CH)

reproduzierbar, da die Gassättigung des sehr kleinen Kammervolumens aus derSchicht heraus so gut wie keine Erhöhung des Fließmitteldurchsatzes bewirkt. Inder unkonditionierten S-Kammer sind die Rf-Werte stabil.

DC-Platten in Trogkammern werden stehend, also vertikal entwickelt. Auch dieersten S-Kammern waren stehende Kammern und wurden schon 1959 von E. Stahlbeschrieben [3]. Eine elegante Variante der S-Kammer ist die horizontale S-Kam-mer (Abb. 6.6). Der Vorteil liegt in einer etwas kürzeren Entwicklungszeit, da dievertikal wirkende Schwerkraftkomponente entfällt. Bei dieser Kammerart (und derVario-KS-Kammer) wird das Fließmittel über eine Glasplatte auf das Sorbens über-tragen. Außerdem kann in dieser Kammerart die Platte gleichzeitig von beiden Plat-tenseiten aus entwickelt werden. Benutzt man eine 10 cm × 10 cm große HPTLC-Platte mit einer optimalen Entwicklungsstrecke von 4 bis 5 cm, verdoppelt sich dieAnzahl der Proben, die auf einer Platte chromatographiert werden können. Da ineiner Horizontalkammer die Platte mit der Schicht nach unten liegt, ist auch ei-ne Trennung unter Kammersättigung bzw. eine Vorbeladung der Schicht möglich.Zur Vorbeladung wird die Platte einfach über ein mit Fließmittel oder beliebigenanderen Chemikalien gefülltes Reservoir gelegt.

6.2.3 Die Vario-KS-Kammer

Eine Weiterentwicklung der Horizontalkammer ist die Vario-KS-Kammer (Abb.6.7), die maßgeblich von F. Geiss, H. Schlitt und A. Klose entwickelt wurde [2,6–8]. Vario-KS steht für einen Kammertyp, der Kammersättigung für die verschie-densten Trennmethoden ermöglicht. Dieser Kammertyp kann – wie die Horizontal-kammer – nur zur einseitigen Entwicklung von Platten benutzt werden. Die Vario-KS-Kammer besitzt verschiedene Lösungsmitteltanks, über die eine Platte gezieltmit bis zu sechs unterschiedlichen Lösungen vorkonditioniert werden kann.

Werden durch das Auskratzen von Stegen auf einer 10 cm × 10 cm großenHPTLC-Platte sechs getrennte Bahnen erzeugt, kann auf diesen Bahnen gleichzeitigmit sechs unterschiedlichen Dampfräumen und sechs verschiedenen Fließmittelnchromatographiert werden. Für die schnelle Optimierung von Fließmitteln ist dieserKammertyp hervorragend geeignet.


Abb. 6.7 Bild einer Vario-KS-Kammer mit Plattenritzer. (Mit freundlicher Genehmigung der Fa.CAMAG, Muttenz, CH)

Abb. 6.8 Bild einer H-Kammer (nach Prof. L. Kraus) mit einer 10 cm × 10 cm großen HPTLC-Platte. (Mit freundlicher Genehmigung der Fa. Biostep, Jahnsdorf)

6.2.4 Die H-Kammer (Horizontalkammer)

Die von L. Kraus entwickelte sogenannte H-Kammer (Horizontalkammer) zeich-net sich durch ihren äußerst einfachen Aufbau aus (Abb. 6.8). Sie besitzt – wie dieHorizontal-S-Kammer – ebenfalls ein Reservoir zur Vorkonditionierung. Eine Glas-fritte führt das Fließmittel aus dem Vorratsraum einseitig auf die Platte, die mit derSchicht nach unten aufliegt [6]. Die Entwicklung wird durch Zugabe des Fließmit-

6.3 Steuerung über die Dampfphase 137

tels gestartet. Die H-Kammer wird von der Fa. Biostep (Jahnsdorf) in den Maßen5 cm × 5 cm und 10 cm × 10 cm vertrieben. Für eine schnelle Trennung auf wenigenBahnen z. B. zur qualitativen Bestimmung eines Arzneibestandteiles ist die kleine-re H-Kammer bestens geeignet. HPTLC-Platten in der Größe 5 cm × 5 cm sind fürdiese Kammerart im Handel erhältlich.

Eine gute Übersicht zu den verschiedenen Kammertypen ist unter [9] zufinden.

6.3 Steuerung über die Dampfphase

Die Entwicklung eines Dünnschichtchromatogramms ist ein komplizierter Ablauf,da die mobile Phase auf die trockene stationäre Phase trifft. Sie wird dabei einerfrontalchromatographischen Trennung unterworfen.

6.3.1 Entwicklung ohne Plattenvorbehandlung

Ist die mobile Phase ein Lösungsgemisch, werden die Komponenten, die mit derstationären Phase wechselwirken können, der Reihe nach aus der mobilen Phaseabgetrennt. Dabei wird zuerst die Komponente abgetrennt, die am stärksten an dasSorbens bindet. Übrig bleibt der Bestandteil der mobilen Phase, der am schwächs-ten bindet. Dieser Bestandteil formt den Frontgradienten. Im Extremfall bildet jedeKomponente einen eigenen Adsorptionsbereich aus, der sich durch eine scharfeÄnderung der Laufmittelzusammensetzung bemerkbar machen kann. Solch ein Ver-halten mehrerer, sich überlagernder Prozesse ist theoretisch extrem schwer zu be-schreiben. Daher gilt in der DC, dass Ausprobieren am schnellsten zum Ziel führt.Das Zusammenwirken von Fließmittel und Sorbens zur Ausbildung der mobilenund stationären Phase birgt immer wieder Überraschungen.

Wird z. B. mit der Fließmittelkombination Benzylalkohol (Modifier), 1,3,5-Tri-methylbenzol (Mesitylen) als Verdünner und Ethylacetat (Vermittler) (1 + 1 + 10,V / V) Normalphasenchromatographie auf Kiegelgel betrieben, bildet sich eine mo-bile Phase aus, die den erwarteten Frontgradienten aus Verdünner zeigt. Ansonstensind die Verteilungsverhältnisse zwischen Modifier und Verdünner über die gan-ze Entwicklungsstrecke stabil (siehe Abb. 2.7). Wird als dritte Komponente nichtEthylacetat, sondern Methanol benutzt, stellt sich die in Abb. 6.9 gezeigte Vertei-lung zwischen Mesitylen und Benzylalkohol ein.

Methanol ist ein sehr polares Fließmittel, denn es ist mit Wasser vollständigmischbar. Methanol ist auch polarer als Benzylalkohol. Damit wirkt Methanol imGemisch mit Mesitylen und Benzylalkohol als Modifier. Es belegt die aktiven Zen-tren des Sorbens und bildet dort einen Teil der stationären Phase. Dem Benzylalko-hol wird in diesem Trennsystem die Aufgabe des Vermittlers zugewiesen.

Wie in Abb. 6.9 zu erkennen ist, bilden sowohl Verdünner (Mesitylen) als auchVermittler (Benzylalkohol) nacheinander einen Frontgradienten aus. Allerdingsliegt der Benzylalkohol-Frontgradient mitten im Mesitylen-Gradienten und spaltet


0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

0 10 20 30 40 50 60 70Trennstrecke (mm)

rel.

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nsitä

ten

Abb. 6.9 Dargestellt ist die Laufmittelzusammensetzung von Mesitylen und Benzylalkohol mitMethanol als Vermittler auf einer Si60-Phase. Rot Mesitylen, blau Benzylalkohol. StationärePhase: Kieselgel (Fa. Merck), 0,1 mm Schichtdicke, Kammersättigung. Fließmittel: CH3OH (Ver-mittler), Mesitylen (Verdünner) und Benzylalkohol (Modifier) im Verhältnis (18 + 1 + 1, V / V)

diesen zu einem Doppelsignal auf. Ansonsten ist die Konzentration an Benzylalko-hol auf den ersten 40 mm der Trennstrecke konstant. Mesitylen zeigt über die ganzeTrennstrecke einen Gradienten, also eine sich ändernde Konzentration. Offensicht-lich wird Mesitylen wegen des großen Anteils an Alkoholen im System sowohl vonder mobilen als auch der stationären Phase nur zögernd aufgenommen. Seine größteKonzentration liegt im Kontaktbereich der Platte mit dem Fließmittel. Allgemeinist damit zu rechnen, dass bei Mehrkomponenten-Fließmitteln auch mehrere Front-gradienten ausgebildet werden. Im Extremfall bilden sich so viele Fronten, wiesich Komponenten unterschiedlicher Polarität im Fließmittel befinden [2]. Da dieseFronten „Platz“ benötigen, wird die effektive Trennstrecke im Vergleich zu stabilenGleichgewichtsbedingungen reduziert. Dies spricht eindeutig für die Verwendungvon Fließmitteln mit möglichst wenigen Bestandteilen!

Einen wesentlichen Einfluss auf die Eigenschaften des Fließ- oder Laufmittelshat der Lösungsvermittler, was im Folgenden verdeutlicht werden soll. Als Beispielwird, bei sonst gleichen Trennbedingungen, statt Methanol das wesentlich unpola-rere Methylenchlorid als Lösungsvermittler verwendet.

Methylenchlorid ist eine relativ unpolare Verbindung. Das zeigt sich schon dar-an, dass Methylenchlorid in Wasser nur wenig löslich ist. Abbildung 6.10 zeigtdie gemessene Zusammensetzung der mobilen und der stationären Phase, aufgetra-gen über die gesamte Trennstrecke. Man erhält für Benzylalkohol, von der Störungdurch den Startgradienten abgesehen, eine isokratische Verteilung über eine Trenn-strecke von ca. 30 mm.

Bemerkenswert ist eine Entmischungszone bei 30 mm Laufhöhe. Eine solchscharfe Änderung der Fließmittelzusammensetzung wird als ˇ-Front bezeichnetund wirkt wie ein zweiter Frontgradient. Die ˇ-Front kommt folgendermaßen


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 10 20 30 40 50 60 70

Trennstrecke (mm)

rel.

Inte

nsitä

ten

Abb. 6.10 Dargestellt ist die Laufmittelzusammensetzung von Mesitylen und Benzylalkoholmit Methylenchlorid als Vermittler auf Kieselgel-Si60-Phase (Kammersättigung, Platte gewa-schen). Rot Mesitylen, blau Benzylalkohol. Stationäre Phase: Kieselgel Si 60 (Fa. Merck), 0,1 mmSchichtdicke. Fließmittel: CH2Cl2 (Vermittler), Mesitylen (Verdünner), Benzylalkohol (Modifier)(18 + 1 + 1, V / V)

zustande: Bedingt durch den relativ unpolaren Vermittler Methylenchlorid wirdrelativ viel polarer Benzylalkohol in die stationäre Phase gedrängt, sättigt dortdie aktiven Zentren ab und bildet zusammen mit dem Kieselgel eine relativ po-lare stationäre Phase aus. Zur Erinnerung, in Abb. 6.9 hatte diese Aufgabe dasMethanol übernommen! In der mobilen Phase wird der Modifier Benzylalkoholgleichzeitig abgereichert und durch das Sorbens in seinem Fluss verzögert. Dieaus Kieselgel und Benzylalkohol neu gebildete stationäre Phase zeigt bis zurˇ-Front – im Vergleich zum Fließmittel – einen erhöhten Anteil an Benzylalkohol.Am Eintauchpunkt und kurz hinter der ˇ-Front kann die ursprüngliche Benzylal-koholkonzentration des Fließmittels noch abgelesen werden. Diese nimmt dann biszur Front weiter ab, da das Sorbens bis dahin ja Benzylalkohol aus dem Fließmitteladsorbiert hat. Im vorderen Bereich der Trennung (bei Trennstrecken über 40 mm)verarmt die mobile Phase stark an Modifier, und das Frontsignal enthält überhauptkein Benzylalkohol mehr. Der Modifier bildet eine Art „negativen“ Frontgradien-ten. Die Konzentration an Benzylalkohol liegt sogar unter der Konzentration, diesich auf der Platte nur über die Dampfphase konstant einstellte. Man erkennt diesam Verlauf der Benzylalkoholkonzentration, die über die Front hinaus bei 47 mmwieder ansteigt.

Zum Aufbau der mobilen Phase wird nur ein Teil des vorhandenen Verdün-ners gebraucht. Anders ausgedrückt: Vom Sorbens wird Mesitylen im Vergleichzum Benzylalkohol kaum adsorbiert. Mesitylen wandert daher ohne große Verzö-gerung über die Platte und formt den Frontgradienten. Rechts der ˇ-Front springtdie Mesitylenkonzentration auf der Platte abrupt nach oben, da hier die fehlendeBenzylalkoholmenge in der Schicht durch Mesitylen ersetzt wird.


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 10 20 30 40 50 60 70 80Trennstrecke (mm)

-lg(R

)

Abb. 6.11 Gezeigt ist die Trennung von 150 ng Sucralose® (bei 45 mm Trennstrecke) auf einerAminoplatte in einer S-Kammer ohne Vorbeladung, getrennt mit dem Fließmittel Acetoni-tril/Wasser (8 + 2, V / V). Das Sucralosesignal erscheint so scharf, weil die Substanz in einerˇ-Front läuft. Durch eine Acetonitril-Vorbedampfung verschwindet die ˇ-Front und das Signalwird breiter

Je trockener die Platte ist (bzw. die Atmosphäre war, in der die Platte lagerte),umso mehr aktive Zentren sind unbesetzt und umso größer ist die Aufnahmefähig-keit der Schicht. Damit wird bei trockener, aktiver Schicht mehr polarer Modifierzur Ausbildung der stationären Phase benötigt, als dies im Fall einer mit Fließ-mittelmolekülen abgesättigten stationären Phase der Fall wäre. Die ˇ-Front würdekleiner ausfallen und bei guter Vorbeladung ganz verschwinden.

ˇ-Fronten sind in der DC nicht beliebt, da sie eine gleichbleibend stabile Zu-sammensetzung der mobilen und stationären Phase über die ganze Trennstrecke hinverhindern. Außerdem ist im Bereich einer ˇ-Front weder das Chromatographiege-setz noch das Snyder-Gesetz zur chromatographischen Auflösung gültig. Trotzdemwerden ˇ-Fronten vereinzelt zur Trennung von Substanzen benutzt, da der scharfeFließmittelwechsel als Gradient wirkt, der sehr scharfe Signale produzieren kann.Eine ˇ-Front als Laufmittelgradient wurde in der DC zum ersten Mal von A. Nie-derwieser und C. C. Honegger eingesetzt [4, 5].

Als praktische Anwendung einer ˇ-Front zeigt Abb. 6.11 die Bestimmung vonSucralose® in Getränken. Sucralose® ist ein künstlicher Süßstoff und besitzt mitfünf OH-Gruppen sehr polare Reste, die acide wirken können. Es sind mit drei Cl-Gruppen aber auch Gruppen im Molekül vorhanden, die dipolare Eigenschaftenzeigen. Sucralose® reagiert wegen seiner ambivalenten Struktur auf kleinste Lauf-mitteländerungen mit einer Verschiebung des Rf-Wertes.

Die ˇ-Front, die sich auf unkonditionierter Aminophase mit dem LaufmittelAcetonitril/Wasser (8 + 2, V / V) in einer S-Kammer ausbildet, „fängt“ die Sucra-lose® „ein“ und verursacht eine sehr schmale Substanzzone mit guter Nachweis-empfindlichkeit und robustem Rf-Wert. Sucralose® ist so über ihren Rf-Wert leichtzu identifizieren.


Die ˇ-Front kann vermieden werden, wenn unter gleichen Bedingungen in einerTrogkammer mit Kammersättigung gearbeitet wird. Infolge der sorptiven Belegungder aktiven Zentren durch die Gasphase wird die polare Komponente im Fließmittelnicht abgereichert. So sind die Bedingungen zur Ausbildung einer ˇ-Front nichtmehr gegeben.

Allgemein gilt: Ist eine Komponente des Fließmittels nur in unzureichenderMenge vorhanden, wird sich beim Bilden der mobilen Phase ein zweiter Front-gradient, eine ˇ-Front, bilden. Wurde die stationäre Phase mit dem Fließmittelkonditioniert, so sind alle nötigen Bestandteile der mobilen Phase vorhanden, und eswird sich keine ˇ-Front ausbilden. Gerade bei Trennungen mit der S- oder H-Kam-mer können ˇ-Fronten durch eine Vorkonditionierung verhindert werden. Manch-mal sind ˇ-Fronten bei Trennungen hilfreich, doch sollte immer beachtet werden,dass im Bereich der Front das Chromatographiegesetz keine Gültigkeit hat. Auchkönnen Optimierungsmodelle wie der Prismen-Ansatz auf Laufmittelsysteme mitEntmischungen während der Entwicklung nicht angewendet werden [3].

6.3.2 Plattenvorbeladung über die Dampfphase

In der DC werden die höchsten Rf-Werte ohne Plattenvorbeladung erreicht. Ei-ne Vorbeladung des Sorbens mit Fließmittelmolekülen steigert die Wanderungs-geschwindigkeit der Front, weil sich schon vor der Entwicklung ein Teil der sta-tionären Phase über die Dampfphase mit Fließmittel aufgefüllt hat. Die kapillareSättigung läuft damit während der Entwicklung schneller ab. Aus der Vorbeladungresultieren kleinere Rf-Werte im Vergleich zu einer nicht vorkonditionierten Platte.Der Vorteil ist, dass ˇ-Fronten weitgehend vermieden werden.

Das Verhältnis der Rf-Werte (beladen/unbeladen) entspricht dem Verhältnisdes Porenvolumens zum Volumen, das bei der Entwicklung kapillar zu füllen ist(Vm � Vv). In der Praxis schwankt das Verhältnis zwischen 1,0 und 1,6 [2].

R0f D Vm

Vm � Vv.Rf/Vorbeladung (6.1)

Rf Rf-Wert ohne Plattenvorbeladung (wahrer Rf-Wert)Vm Porenvolumen der PlatteVv Volumen der Vorbeladung

Über die Messung wahrer Rf-Werte und die Messung von Rf0-Werten unter Vor-

beladung kann die Menge an Fließmittel (Vv) bestimmt werden, die während derKonditionierung von der Platte aufgenommen wurde. Wird der Ausdruck nach Vv

aufgelöst, kann über die Rf-Werte das Volumen der Vorbeladung direkt berechnetwerden.

Vv D Vm � Vm

R0f

.Rf/Vorbeladung (6.2)

In Abb. 6.12 ist die Laufmittelzusammensetzung einer mit Mesitylen vorbela-denen Platte abgebildet. Die Platte wurde nach der Entwicklung über eine Trenn-strecke von 45 mm abgescannt. Während der Entwicklung hat die wahre Front das


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60

Trennstrecke (mm)

rel.

Inte

nsitä

ten

Abb. 6.12 Fließmittelzusammensetzung eines Laufmittels, bestehend aus Mesitylen (in Ver-bindung mit Benzylalkohol in Essigsäureethylester (1 + 1 + 18, V / V)). Die Schicht wurde überMesitylen/Ethylacetat (1 + 5, V / V) sorptiv gesättigt. Der Mesitylenfrontgradient hat sich im Be-reich der Trennstrecke zwischen 30 und 45 mm gebildet

Mesitylen, das über die Vorbeladung schon vor der Entwicklung auf die Plattegebracht worden war, zu einem breiten, gut sichtbaren Frontgradienten zusammen-geschoben. Die wahre Front, bis zu der Probemoleküle maximal wandern können,ist bei etwa 30 mm Laufhöhe zu erkennen.

Damit hat sich durch die Vorbeladung der Platte mit Mesitylen die maximaleTrennstrecke von 45 mm auf etwa 30 mm, also um 1/3 verringert. Es können somitkeine Rf-Werte größer als Rf = 0,7 beobachtet werden, wenn die sichtbare Front alsBerechnungsmaß verwendet wird. Auf die problematische Rf-Bestimmung vorbe-ladener Platten hat F. Geiss ausdrücklich hingewiesen [3]. Ein Rf -Wert von 0,7 imoben beschriebenen System bedeutet nämlich, dass die Substanz im Frontgradien-ten mitläuft, also nicht mit der stationären Phase wechselwirken kann. Wird die„wahre“ Front nicht erkannt, kann es passieren, dass der Anwender versucht, eineTrennung zu optimieren, die gar keine Trennung ist!

Interessant ist in der Adsorptionschromatographie natürlich die Einstellung derOberflächenaktivität über die definierten relativen Luftfeuchten, um die Aktivitätder Platte gezielt zu verändern. F. Geiss gibt eine Vielzahl von Mischungen an, dieim Dampfraum über der Platte eine bestimmte relative Feuchte einstellen [2].

Am einfachsten aktiviert man die Platte durch Erhitzen auf 110 °C. Dann lagertman die Platte bei definierten Feuchtigkeiten. Dazu werden verschiedene Salzlösun-gen oder Lösungen unterschiedlicher Schwefelsäurekonzentrationen benutzt, überdenen sich definierte Luftfeuchten einstellen.

Eine einfache Art, den Wassergehalt der Platte zu variieren, besteht auch darin,die Platte über Schwefelsäure unterschiedlicher Konzentration zu lagern. Schwefel-säure ist zwar sehr aggressiv, aber mit dieser Art der Plattenkonditionierung wirddas Arbeiten mit unterschiedlichen Salzlösungen vermieden.


Tab. 6.1 Relative Feuchtigkeiten über gesättigten Salzlö-sungen (aus [2])

Feste Phase % rel. Feuchte

H3PO4 + 1/2 H2O 9

LiCl � H2O 15

K+(CH3COO)– 22,7

CaCl2 � 6 H2O 32,3

NaI 38,4

K2CO3 � 2 H2O 44

NaHSO4 � H2O 52

NaBr � 2 H2O 58

CuCl2 � 2 H2O 67

NaCl 75,7

KCl 85

Na2SO4 10 H2O 93

CaSO4 � 2 H2O 98

Tab. 6.2 Relative Feuchtigkeiten, die sich über Schwefel-säurelösungen einstellen (aus [2])

Gew.-% H2SO4 % rel. Feuchte

10 96

25 83

35 66

45 46

55 26

60 16

65 10

70 4

In Abb. 6.13 wurde in einer Vario-KS-Kammer ein Farbstoffgemisch über Kie-selgelphase bei verschiedenen relativen Feuchten chromatographiert. Man erkenntsehr schön, dass bei geringer relativer Feuchte die Aktivität der stationären Plattesehr groß ist und für kleine Rf-Werte sorgt. Die Wanderungsstrecken der Farbstoffs-pots sind minimal. Weil die verschiedenen Substanzen nur ungenügend wandern,werden sie nicht vollständig aufgetrennt. Das Trennoptimum dieses Systems liegtbei einer rel. Feuchte von 66 %. Hier reichen die verbliebenen aktiven Zentren ge-rade aus, alle Farbstoffe optimal aufzutrennen.

Wird die Bahn über reinem Wasser konditioniert, werden alle aktiven Zentrenabgesättigt. Die verschiedenen Farbstoffe werden durch die Platte nicht mehr ver-zögert und laufen ungetrennt im Frontgradienten. Das Ergebnis ist in Abb. 6.13f zuerkennen. Dieses Beispiel zeigt, dass bei einer Methodenentwicklung, zumindest inder Adsorptionschromatographie, immer auch die Dampfphase mit zu optimierenist. Die Vario-KS-Kammer ist dafür hervorragend geeignet [2].


a b c d e f

Abb.6.13 Farbstofftrennung mittels Toluol auf Si60-Phase, gemessen bei verschiedenen relativenFeuchten. a 10 %, b 16 %, c 26 %, d 46 %, e 66 % und f 100 % relative Feuchte

Zusammengefasst werden die höchsten Rf-Werte mit einer ideal ungesättigtenS-Kammer erhalten. Dieser Kammertyp zeigt Trennungen mit den „richtigen“ Rf-Werten. Bei der Benutzung von Trogkammern wird die Schicht mehr oder wenigervorbeladen, ein Vorgang, der nur in einer ideal gesättigten Kammer reproduzierbarabläuft. Auf diese Weise werden ˇ-Fronten vermieden, und deshalb ist diese Artder DC-Entwicklung mit weitem Abstand die beliebteste. Die gemessenen Rf-Wertemüssen aber mit Vorsicht behandelt werden.

6.4 Zirkulare Trennungen

Bis hierher wurde der Entwicklungsprozess als linear beschrieben. Das Fließmit-tel wandert dabei von einer Seite aus zur Gegenseite, oder von beiden Seiten zurPlattenmitte. Neben der linearen Entwicklung gibt es noch zwei zirkulare Entwick-lungsmöglichkeiten: die zentrifugale und die zentripetale Entwicklung [2].

Unter dem Begriff zentrifugale Entwicklung versteht man „aus dem Zentrumfliehen“. Das Fließmittel wird über einen Docht dem Zentrum der Platte zugeführtund fließt nach außen. Die Proben sind auf einem Kreis punktförmig um das Plat-tenzentrum angeordnet und werden radial nach außen bewegt.

Im linearen Entwicklungsmodus ist die Menge des Fließmittels (S) konstant, diepro Zentimeter Entwicklungsstrecke (z) in das Sorbens fließt, und es gilt S � z. Bei

6.4 Zirkulare Trennungen 145

a

c

b

Abb. 6.14 Trennung eines Farbstoffgemisches mit dem Fließmittel Toluol als a zentrifugale, bzentripetale und c lineare Entwicklung (gleichzeitig von beiden Seiten). Bei niedrigen Rf-Wertenzeigt die zentrifugale Technik bessere Trennungen als die zentripetale und lineare Entwicklung.Die zentripetale Technik begünstigt die Substanztrennung bei hohen Rf-Werten. Beachtenswert istdie transversale Zonendiffusion der Zentrifugaltechnik im Vergleich zur zentripetalen Entwick-lung. Eine lineare Entwicklung erlaubt strichförmiges Auftragen, das zu rechteckigen Trennzonenführt

einer zentrifugalen Entwicklung hängt die in das Sorbens einfließende Menge anFließmittel von der Menge an Sorbens ab, das dieses Fließmittel aufnimmt. Beikonstanter Schichtdicke ist die einfließende Menge an Fließmittel deshalb propor-tional zu einem Kreissegment. Hier gilt S � �z2. Geiss [2] gibt die Abhängigkeitzwischen linearen und zentrifugalen Rf -Werten an mit:

.Rf/linear D .Rf/2zentrifugal : (6.3)

Die zentrifugalen Rf-Werte sind größer als ihre linearen Äquivalente, mit derAusnahme von Rf = 0 und Rf = 1, die logischerweise gleich sind. Insbesondere beiniedrigen Rf-Werten ist der Unterschied groß [2]. Eine zentrifugale Entwicklungbegünstigt damit Trennungen bei niedrigen Rf-Werten ohne Nachteile bei höherenRf-Werten zu zeigen. Dies ist sehr schön in Abb. 6.14a zu sehen, in der bei höherenRf-Werten die Flecken zur Seite hin diffundieren und damit die Fleckdiffusion nichtauf Kosten der Auflösung geht.

Wird eine Platte kreisförmig von außen nach innen entwickelt, spricht man voneiner zentripetalen Entwicklung. Diese Technik wurde zuerst von H. Van Dijckbeschrieben und wird manchmal auch antizirkulare Entwicklung genannt [10]. Ineiner zentripetalen Entwicklung wird das Fließmittel kreisförmig auf der Außen-


seite der Platte aufgebracht und fließt Richtung Zentrum. Zentripetal bedeutet, „dasZentrum zu suchen“. Die Proben werden fleckförmig auf einem Außenkreis mitgroßem Durchmesser aufgetragen. Dies erlaubt die Trennung sehr vieler Probenauf einer Platte. Bis zu 48 Auftragungen auf einer 10 cm × 10 cm großen HPTLC-Platte wurden schon parallel innerhalb von 4 Minuten getrennt [10]. Sowohl bei ei-ner linearen als auch bei einer zentrifugalen Entwicklung gilt, dass sich der mobilePhasenfluss quadratisch mit der Zeit verlangsamt. Bei einer Zentripetalentwicklungsinkt die benetzte Fläche während der Entwicklung ebenfalls quadratisch. Da aberkreisförmig von außen nach innen chromatographiert wird, resultiert eine konstanteFlussgeschwindigkeit der Front.

Zentripetale Entwicklungen lassen sich experimentell durchführen, indem einePetrischale mit Filterpapier ausgelegt wird. Die zu entwickelnde Platte wird mit derSchicht nach unten auf die Petrischale gelegt. Wurde die mobile Phase vorher indie Petrischale gegeben, fließt sie über das Filterpapier auf die Plattenoberfläche[11]. Wird eine Petrischale von oben auf die Schichtoberfläche gelegt, kann auf diePetrischale tropfendes Fließmittel über die Schale auf die Schicht laufen und dieEntwicklung durchführen. Bei Zentripetalentwicklungen erhält man kleinere Rf-Werte als im linearen Modus. Substanzen mit großen Rf-Werten werden besser auf-getrennt als solche mit niedrigen Rf-Werten. Mehrfachentwicklungen sind wegender kurzen Entwicklungszeiten von Vorteil.

Eine Umrechnung von zentripetalen Rf-Werten in lineare Rf-Werte kann nach G.Geiss [2] über (6.4) vorgenommen werden.

.Rf/linear D 1 � 1 � .Rf/zentripetal

�2(6.4)

Die Gleichung ist nur gültig für reine Fließmittel und nicht für Fließmittelgemi-sche. Auch darf die Platte nicht vorbeladen sein.

Die Selektivität aller drei Trennverfahren ist gleich, was sehr schön in Abb. 6.14zu sehen ist. Zirkulare Trennungen ergeben oft bessere Auflösungen. Hier geht dieunvermeidliche Diffusionsverbreiterung der Zonen nicht auf Kosten der Auflösung,da der radiale Laufmittelfluss die Banden auseinanderzieht. Im Vergleich zur li-nearen Entwicklung kann bei gleicher Auflösung die Schicht um den Faktor 10bis 100 überladen werden [10]. Der Nachteil bei Zirkulartrennungen liegt in derschwierigen Zuführung des Fließmittels. Eine nicht zentrale oder ungleichförmi-ge Zuführung von außen hat hier stark gestörte Trennprofile zur Folge. Ihr Vorteilist die einfache Durchführung. R. E. Kaiser gibt dazu ein überzeugendes Beispiel.Er publizierte eine simple Methode, wie Arzneifälschungen mittels zirkularer DCaufgedeckt werden können [12, 13]. Arzneifälschungen sind heutzutage ein großesProblem, und das gilt insbesondere für Viagra-Präparate.

Zur Durchführung der Analyse wird auf einer HPTLC-Kieselgelplatte um dasPlattenzentrum herum mit einem Bleistift ein Startkreis von 1 cm Durchmessermarkiert, auf dem Probe und Vergleichprobe mit einem feinen Pinsel aufgetra-gen werden. Dies geschieht halbkreisförmig, aber überlappend. Nach der Fokus-sierung und der Entwicklung entstehen – je nach Probeinhalt – konzentrische Krei-

6.5 Gradienten in der DC 147

se, die bei Identität gleiche Durchmesser zeigen. In Abb. 6.15 ist der Vergleichzwischen dem Präparat „Kamagra Oral Yelly“ und einer original Viagra-Formu-lierung gezeigt. Nach Herstellerangaben enthalten beide Präparationen ausschließ-lich die Wirksubstanz Sildenafil. Zur Überprüfung werden gleiche Mengen bei-der Präparate mit Methanol extrahiert. Mit einem feinen Malerpinsel werden dieExtrakte halbkreisförmig auf dem Startkreis aufgetragen, sodass die Auftragun-gen sich in einem Bereich überlappen. Das Präparat Oral Jelly ist tiefrot gefärbtund hinterlässt bei der Auftragung eine stark gefärbte Auftragezone. Zur Fokus-sierung wird die Auftragung mit wenig Methanol, dann mit absolutem Ethanol,mit einem Gemisch aus Propanol und Wasser (7 + 3, V / V) und zum Schluss mitCH2Cl2 jeweils eine kurze Strecke entwickelt. Zwischen den einzelnen Fokussie-rungsschritten wird die Platte jeweils getrocknet. Die chromatographische Tren-nung wird durch einen Doppellauf erreicht. Die erste Trennung wird mit Methy-lenchlorid/Methanol (95 + 5, V / V) durchgeführt, die zweite Entwicklung mit demFließmittel Methylenchlorid/Methanol (80 + 20, V / V). Das Ergebnis in Abb. 6.15ist eindeutig. Das Präparat „Viagra“ enthält nur eine Substanz, die auch in demPräparat „Kamagra Oral Yelly“ enthalten ist. Dies beweist der durchgängige Kreis.Allerdings enthält das Präparat Kamagra eine nicht unerhebliche Menge an Verun-reinigung, die etwas weiter als die Substanz Sildenafil läuft. Zusammengefasst istdie Methode der zirkularen DC einfach durchzuführen und könnte zum Nachweisvon Arzneimittelfälschungen in jeder Apotheke eingesetzt werden.

6.5 Gradienten in der DC

6.5.1 Theorie der Gradientenchromatographie

In der HPLC wird häufig die Zusammensetzung der mobilen Phase während derEntwicklung kontinuierlich geändert. Solch eine Gradientenchromatographie istwesentlich für die überaus hohen Trennzahlen der HPLC verantwortlich. Auch inder DC wurden Vorschläge zur kontinuierlichen Änderung der Laufmittelzusam-mensetzung gemacht. Theoretische Überlegungen zeigen, dass Lösungsmittelgra-dienten die Trennzahlen in der DC nicht wesentlich steigern können [14].

Bei isokratischem Arbeiten, also bei Trennungen ohne eine Änderung der Zu-sammensetzung des Fließmittels, können benachbarte Zonen nur bei Rf-Werten um0,33 maximal aufgelöst werden. Dies entspricht einem k-Wert des Trennsystemsvon etwa k = 2, was aus der Beziehung k = (1 – Rf)Rf abgeleitet werden kann. EineDC-Trennung findet immer in einem Rf-Bereich von etwa 0,05 bis 0,95 statt. Dasentspricht k-Werten von 0,05 bis 19. Damit können nur Substanzen untereinandergetrennt werden, deren k-Werte sich in einem Bereich von etwa 2,6 Zehnerpotenzenbefinden. Substanzen mit k-Werten außerhalb dieses Bereiches werden sich entwe-der nur wenig vom Auftrageort wegbewegen oder in der Front mitlaufen, sich alsoim Rf-Bereich unterhalb von 0,05 oder oberhalb von 0,95 bewegen. Diese Substan-zen können potenziell nicht voneinander getrennt werden. Damit kann in der DC beieinem zu trennenden Gemisch aus vielen Substanzen, die große unterschiedliche


Abb. 6.15 Trennung von Sildenafil aus zwei Präparationen, die halbkreisförmig 12 bis 7 Uhr(Kamagra oral Yelly) und von 7 bis 12 Uhr (original Viagra) aufgetragen wurden. Ein durchgän-giger Ring zeigt an, dass in beiden Präparaten Sildenafil enthalten ist. Das Präparat „Kamagraoral Yelly“ enthält noch eine zweite Substanz, die etwas weiter als Sildenafil läuft und keinendurchgängigen Kreis bildet. Diese Substanz ist im Vergleichspräparat also nicht enthalten. (Mitfreundlicher Genehmigung von Prof. Dr. R. E. Kaiser)

Polaritäten besitzen, eine optimale Trennbedingung immer nur für wenige Substan-zen eingestellt werden. Alle anderen Verbindungen bleiben entweder am Startflecksitzen oder laufen in der Front mit. Die Dünnschichtchromatographie besitzt im-mer nur ein relativ kleines Polaritätsfenster für die potenzielle Trennung wenigerVerbindungen.

In Abb. 6.16 wurde ein Farbstoffgemisch mit verschiedenen Fließmitteln überetwa die gleiche Strecke entwickelt. In Abb. 6.16a sieht man die Entwicklung mitreinem Cyclohexan. Das Gemisch wandert so gut wie gar nicht. Allerdings kannman einen roten „Schimmer“ über der schwarzen Auftragung erahnen, was auf einebeginnende Trennung deutet.

Die Fließmittel auf den Bahnen 2–4 (Cyclohexan/Methyl-tert-butylether 9 + 1,V / V; (Abb. 6.16b), Toluol (Abb. 6.16c) und Methylenchlorid (Abb. 6.16d)) ziehendie Farbstoffe des Gemisches weit auseinander, während die Farbstoffe auf denBahnen 5 und 6 (Methyl-tert-butylether (Abb. 6.16e) und Ethylacetat (Abb. 6.16f)fast alle in der Front mitlaufen. Damit sind nur die Fließmittel der Bahnen 3 und 4für eine Basislinientrennung aller Substanzen geeignet.

Bahn 4 zeigt sehr schön, dass alle Farbstoffe des Gemisches isokratisch aufge-trennt werden können. Man braucht also nur das richtige Fließmittel (wie Toluoloder Methylenchlorid), um aus der potenziellen Auflösung über die ganze Trenn-strecke eine reale Auflösung zu erreichen. Aber es sei nochmals daran erinnert:


a b c d e f

Abb. 6.16 Trennung eines CAMAG-Farbstoffgemisches mit a Cyclohexan, b Cyclohexan + Me-thyl-tert-butylether (9 + 1, V / V), c Toluol, d CH2Cl2, e Methyl-tert-butylether und f Ethylacetatbei gleicher Laufhöhe. Man beachte auch die transversale Zonenverbreiterung

Es können mithilfe der DC immer nur wenige Substanzen mit k-Werten in einemBereich von etwa 2,6 Zehnerpotenzen gleichzeitig aufgetrennt werden. Liegen in ei-nem Gemisch Substanzen vor, deren k-Werte sich um mehr als 2,6 Zehnerpotenzenunterscheiden, können diese nicht durch einen isokratischen Lauf getrennt werden.Ihre Polaritäten sind dazu viel zu unterschiedlich.

L. R. Snyder und D. L. Saunders publizierten 1969 einen Artikel, der sich mitden Grundlagen der DC-Gradiententechnik beschäftigt [14]. Die theoretischen Er-gebnisse dieser Publikation sind so wichtig, dass sie hier kurz abgeleitet werdensollen.

Snyder und Saunders stellen sich zwei Substanzen am Auftrageort einer DC-Platte vor, durch die eine Reihe von Fließmittelzonen wandert. Die Trennung sollüber die Gesamtstrecke L laufen und dabei die Fließmittelmenge V0 verbrau-chen. (Bei einer HPTLC-Platte liegt L im Bereich von 4–8 cm und V0 hat für eine10 cm × 10 cm große Platte einen Maximalwert von etwa 1,4 ml.)

Im ersten Trennschritt soll nun die Fließmittelmenge V1 durch das Zentrum derbeiden Substanzen laufen. Beide Substanzen werden die Strecke L1 in Frontrich-tung bewegt. Die Verteilung der Substanzen auf das stationäre Volumen Vs bzw.


das mobile Volumen des Fließmittels Vm wird durch den Kapazitätsfaktor k (2.7)beschreiben.

k D ts

tmD L � Lm

LmD 1 � R0

f

R0f

Der Kapazitätsfaktor ist das Bindeglied zwischen der Planar- und der Säulen-chromatographie. Er beschreibt das Verhältnis zwischen Aufenthaltszeit in der sta-tionären Phase ts und Wanderungszeit (Aufenthalt in der mobilen Phase tm).

Im Modell von Snyder und Saunders wandern gleiche Volumina gleiche Stre-cken. Die Porengröße der stationären Phase wird also als konstant angesehen. Pas-siert nun der Fließmittelanteil V1/V0 die beiden Substanzen, bewegen sich diesedabei die relative Strecke L1/L. Der Kapazitätsfaktor k1 beschreibt das relative Ver-hältnis dieser beiden Größen.

k1 D V1=V0

L1=L

Aus dieser Beziehung lässt sich die relative Wanderungsstrecke Rf1 beider Sub-stanzen ableiten, wenn das Volumen V1 des Fließmittels diese passiert. Es folgt:

L1

L� Rf 1 D V1=V0

k1

: (6.5)

Völlig analog wird der Schwerpunkt beider Substanzen die relative Strecke Rf2

wandern, wenn das Volumen V2 beide Zonen passiert. Haben i Fließmittelanteiledie Zonen passiert, sind diese um die relative Strecke ˙Rfi gewandert. Die Strecke,die die Lösungsfront beim Passieren des i-ten Volumenelementes gewandert ist,berechnet sich zu:

LF D L

"iX0

.Vi =V0/ CiX0

Rfi

#:

Die Trennung endet, wenn die Front das Ende der Trennstrecke erreicht hat, alsoLF = L wird.

Damit kann eine Trennung simuliert werden, solange folgende Beziehung gilt:

iX0

.Vi =V0/ CiX0

Rfi 1 : (6.6)

In Abb. 6.17 ist der ganze Sachverhalt graphisch dargestellt.Der Ausdruck für die effektive Trennstufenzahl NQ2 ergibt sich aus (2.22) zu:

NQ2 D NRf

�k2

1 C k2

�2

D N

Rf

�Rf

k2

1 C k2

�2

D N

jPiD1

.Q

Gm/2Rfi

"jX

iD1

�YGm

�Rfi

ki

.1 C ki /

#2

:(6.7)


Abb. 6.17 Schematische Entwicklung zweier Zonen nach dem Durchlauf von i Volumina

NQ2 effektive TrennstufenzahlRfi relative Wanderungsstrecke im i-ten VolumenGm Zonenkompressionsfaktor (multiplikativ)ki Kapazitätsfaktor des i-ten FließmittelsN Anzahl der theoretischen Trennböden

Snyder und Saunders berechneten die effektive Trennstufenzahl für verschie-dene k-Werte nach (6.7). Dazu simulierten sie die Durchgänge der Teilmengendes Fließmittels durch ein Zonenpaar entsprechend (6.5), bis die Abbruchbedin-gung (6.6) erfüllt war. Die so bestimmten Werte der effektiven Trennstufenzahl (fürGm = 1) sind in Abb. 6.18 gegen die logarithmierten Kapazitätsfaktoren graphischin schwarz aufgetragen. Die Funktion zeigt die Größe der effektiven Trennstufen-zahl in Abhängigkeit vom Kapazitätsfaktor. Sie hat den gleichen Verlauf wie dieFunktion in Abb. 2.14. Wie schon ausgeführt, können merkliche Trennstufen nur ineinem Bereich von etwa �0,6 < lg(k )< + 2 erreicht werden.

Der Vorteil dieser etwas komplizierten Formel von Snyder und Saunders für dieeffektive Trennstufenzahl ist, dass sich jetzt auch die effektiven Trennstufenzahleneiner Gradientenentwicklung simulieren lassen. Dazu muss allerdings noch berück-sichtigt werden, dass bei einer Änderung der Fließmittelstärke eine Kompressionder Zonen erfolgen kann.

Der Kompressionsfaktor berechnet sich aus (6.12) mit Rf = k/(1 + k) zu:

Gm D iC1

i

D�1 � Rf .iC1/

�1 � Rf .i/

D kiC1.1 C ki /

ki .1 C kiC1/: (6.8)


0

50

100

150

200

250

-4 -1 2 5 8 11 14lg (k)

NQ

2

Abb. 6.18 Dargestellt ist die effektive Trennstufenzahl (für N = 1486) ohne Gradient sowie miteiner Gradientensteilheit von b = 2, 4, 6, 10. Schwarz ohne Gradient, grün b = 2, gelb b = 4, blaub = 6, rot b = 10

Gm Zonenkompressionsfaktor i Kompression in der Zone i i+1 Kompression in der Zone i + 1

Der Kompressionsfaktor wirkt multiplikativ und wird in Form einer geometri-schen Reihe berücksichtigt.

In Abb. 6.19 wird gezeigt, wie durch das Mischen zweier Fließmittel (A und B)die Fließmittelstärke während einer Entwicklung geändert werden kann. Die Rm-Werte (lg(k)-Werte!) ändern sich linear mit der Fließmittelzusammensetzung. DieÄnderung der Kapazitätsfaktoren während des simulierten Durchflusses durch dasZonenpaar wurde daher über folgende Formel verändert.

lg .k/� D lg.k/ � bVi

V0

(6.9)

lg(k)* simulierter Kapazitätsfaktorlg(k) Kapazitätsfaktor, mit dem der Gradient startetb Steilheit des GradientenbV i Volumen der MischkammerV i zudosiertes Volumen im i-ten SchrittV0 Gesamtvolumen der Entwicklung


S

CC‘

DAA B

H

L

CH

Abb. 6.19 Einfache Apparatur zur Gradientenentwicklung mit einer Horizontalkammer. DasFließmittel in A wird sukzessiv mit einem Fließmittel stärkerer Elutionskraft aus B gemischt. (Aus[15], mit freundlicher Genehmigung © Marcel Dekker)

Das Ergebnis der Simulation für verschiedene Steilheitswerte b, aufgetragengegen die Kapazitätsfaktoren, mit denen der Gradient beginnt, sind ebenfalls inAbb. 6.18 dargestellt. Man erkennt, dass der Trennbereich mit steigenden Steil-heitswerten ausgeweitet wird. Mit einem Wert von b = 10 können Substanzen ineinem k-Bereich von mehr als 10 Zehnerpotenzen potenziell getrennt werden. Al-lerdings nimmt die effektive Trennstufenzahl auf etwa ein Viertel der isokratischenTrennleistung ab.

Gradienten haben allgemein die Eigenschaft, die chromatographische Auflösungim optimalen Bereich abzuschwächen, gleichzeitig aber die Trennung in einemgrößeren Polaritätsbereich zu ermöglichen. So können Verbindungsgemische mitGradienten über einen weiten Polaritätsbereich aufgetrennt werden. Den Verlustder optimalen Auflösung zweier Substanzen bei homogener Entwicklung handeltman bei einem guten Gradienten gegen den Gewinn an Auflösung für eine grö-ßere Anzahl von Substanzen ein [2, 14]. Ein kritisch zu trennendes Substanzpaarsollte daher immer isokratisch getrennt werden, denn hier erreicht man die größ-te chromatographische Auflösung. Sollen Substanzen mit stark unterschiedlichenEigenschaften in einem Lauf aufgetrennt werden, z. B. beim Screening zum schnel-len Überblick über alle Inhaltsstoffe einer Probe, ist eine Gradiententrennung ideal.Aus weiteren Simulationen leiten Snyder und Saunders auch ab, das für die DCein Gradient in der stationären Phase vorteilhafter ist als die Änderung der mobilenPhase während der Entwicklung [14].

Ein guter DC-Gradient ist immer ein antiparalleler Gradient. Man nennt einenGradienten antiparallel, wenn er entgegen der Fließrichtung wirkt, also Verbin-dungen mit höheren Rf-Werten proportional stärker verzögert als Substanzen mitniedrigeren Rf-Werten. Im Gegensatz dazu verschlechtert ein parallel wirkenderGradient die Trennung, weil er Substanzen in Fließrichtung beschleunigt undPeaks damit auseinanderzieht, die Peakbreite also erhöht [14]. Die von Snyder und


Saunders berechnete Gradientenentwicklung nach (6.7) beschreibt einen antipar-allelen Gradienten, da die DC-Entwicklung mit der schwächsten mobilen Phasestartet.

6.5.2 Dampfgesteuerte Gradientenentwicklung

Einen antiparallelen Gradienten erhält man durch Steigerung der Schichtdicke inFließrichtung, ebenso wie durch eine Steigerung der Plattenaktivität in Fließrich-tung. Auch die Änderung der Fließmittelzusammensetzung während der Trennunghin zu kleineren Aktivitäten produziert einen antiparallelen Gradienten. F. Geissnennt noch die Temperatur, die Änderung des pH-Wertes oder eine ortsabhängigeImprägnierung der DC-Platte als Möglichkeiten, einen Gradienten zu erzeugen [2].

Am einfachsten lässt sich ein Aktivitätsgradient durch unterschiedliche Was-sergehalte im Sorbens aufbauen, hergestellt über unterschiedliche rel. Feuchtenmittels einer Vario-KS-Kammer. Eine Kieselgelplatte wird über Tröge unterschied-licher Salzlösungen bestimmter relativer Feuchten vorkonditioniert und so die un-terschiedlichen Feuchten auf die DC-Platte übertragen. Ein antiparalleler Gradientkönnte z. B. von 96 % relativer Feuchte am Start bis zu 4 % relativer Feuchte amEnde der Entwicklungsstrecke reichen.

Über die Dampfphase lässt sich auch direkt auf die Zusammensetzung der mobi-len Phase Einfluss nehmen. Auf diese Weise kann eine einfache Gradientenentwick-lung durchgeführt werden. In Abb. 6.20 wurde eine DC-Platte mit dem LaufmittelEthylacetat/Mesitylen/Benzylalkohol (18 + 1 + 1, V / V) über reinem Mesitylen ent-wickelt. Der Hauptbestandteil des Laufmittels besteht aus leicht flüchtigem Essig-säureethylester. Dieser dampft während der Entwicklung von der Plattenoberfläche

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 50 60

Trennstrecke (mm)

rel.

Inte

nsitä

ten

Abb. 6.20 Dargestellt ist die Fließmittelzusammensetzung eines Laufmittels, bestehend aus Me-sitylen und Benzylalkohol, gemischt mit Essigsäureethylester (1 + 1 + 18, V / V). Die Platte wurdeunkonditioniert über Mesitylen bis zu einer Trennstrecke von 45 mm entwickelt. Rot Mesitylen,blau Benzylalkohol


ab, während gleichzeitig Mesitylen aus dem Dampfraum auf der Platte auskonden-siert. So wird während der Entwicklung der Anteil an Mesitylen in der mobilenPhase kontinuierlich – auf Kosten des Essigsäureethylesteranteils – erhöht. Wieman auf der Trennstrecke zwischen 5 und 25 mm sehen kann, steigt der Mesity-lenanteil in immer stärkerem Maße.

Mesitylen wird natürlich auch auf trockene Plattenbereiche aufgedampft. Je län-ger die Entwicklung dauert, desto mehr Mesitylen scheidet sich auf der Platteno-berfläche ab. Dieses Mesitylen wird ab zirka 25 mm Trennstrecke zu einem breitenFrontgradienten zusammengeschoben. So bildet sich ein zweiter Gradient aus, indessen Verlauf der Anteil an Benzylalkohol deutlich abnimmt, während die Mesi-tylenkonzentration steil ansteigt. Damit besteht die mobile Phase in Abb. 6.20 auszwei, über die Dampfphase aufgebaute nichtlineare Gradienten.

6.5.3 Mehrfachentwicklungen in der DC

Die einfachste Methode, einen DC-Gradienten herzustellen, ist die Mehrfachent-wicklung. Man trennt über eine kurze Strecke oder auch über die ganze Plattendi-stanz, trocknet die Schicht und wiederholt das Verfahren mit einem anderen Fließ-mittel. Allerdings erreicht die Front bei späteren Entwicklungen die Substanzen,die weniger weit gelaufenen sind. Damit werden die Zonen kleiner Rf-Werte mitder Zeit auf die Zonen höherer Rf-Werte auflaufen.

Wird die Platte mit immer gleichem Laufmittel über die immer gleiche Distanzentwickelt, hängt der Rf-Wert nach n Entwicklungen (Rfn) vom Rf-Wert der erstenEntwicklung ab. Im ersten Entwicklungsschritt bewegt sich die Substanz entspre-chend ihres Rf-Wertes über die Distanz zn0 = (zf � z0)Rf. Die Platte wird getrocknet,und dann bewegt sich die mobile Phase erneut über die Strecke (zf � z0). Der Ana-lyt wandert dabei die Strecke zn1 = (zf � z0)Rf(1 � Rf), weil für ihn die Entwicklungerst von der Plattenposition zn0 an beginnt. Nach einer erneuten Trocknung und Ent-wicklung über die Strecke (zf � z0) bewegt sich der Analyt von der Position zn1 auszur Stelle zn2 = zn1(1 � Rf) = (zf � z0)Rf(1 � Rf)2. Bei der n-ten Wiederholung desVorgangs wandert der Analyt über die Strecke zn = (zf � z0)Rf(1 � Rf)n. Die Summealler Strecken, über die der Analyt nach n Entwicklungen gewandert ist, berechnetsich zu:

zsn DnX

iD0

.zf � z0/Rf.1 � Rf/i D .zf � z0/Œ1 � .1 � Rf/

n� :

Mit der Definition des Rf-Wertes [Rfn = zsn/(zf � z0)] wird (6.10) erhalten [16].

Rfn D 1 � .1 � Rf/n (6.10)

Rf Rf-Wert nach einer EntwicklungRfn Rf-Wert nach n Entwicklungenn Anzahl der Entwicklungen


Der Abstand zweier Substanzen (�Rf = Rf2 – Rf1) geht bei der Mehrfachentwick-lung durch ein Maximum. Bei einer größeren Anzahl von Entwicklungen nähernsich beide Peaks in ihrem Abstand wieder an, denn der langsamere Substanzfleckwird von der von unten nachströmenden mobilen Phase früher erfasst als die weitervorgelaufene Zone. Die optimale Anzahl der Entwicklungen berechnet sich empi-risch [16] zu:

nopt � 1

Rf1;2

� 1 : (6.11)

Zusammengefasst sollten Mehrfachentwicklungen bei Substanzen mit Wertenvon Rf > 0,45 nicht durchgeführt werden, da sich solche Trennungen gegenüber Ein-fachentwicklungen verschlechtern [2].

6.5.4 AutomatischeMehrfachentwicklung (AMD)

Die einfachste Art, in der DC mit einem Gradienten zu arbeiten, ist die Kombina-tion aus Mehrfachentwicklung und Gradientenelution. Die Methode hat sich trotzeines relativ großen apparativen Aufwands am Markt durchgesetzt. Sie ist unter derAbkürzung AMD bekannt, die für automated multiple development steht. Die Me-thode wurde von J. A. Perry entwickelt und in automatisierter Form von K. Burgerim Jahre 1984 eingeführt [17, 18]. Bei der AMD handelt es sich um eine vollauto-matisierte Mehrfachentwicklung. Es wird ein antiparalleler Gradient erzeugt, wobeimit Laufmitteln großer Elutionsstärke begonnen wird. So erzielt man trotz der fal-lenden Fließmittelstärke noch einen Fokussierungseffekt, weil die Auftragung zuBeginn fokussiert wird. Die Platte wird computergesteuert konditioniert, über einedefinierte Strecke entwickelt und dann getrocknet. Nach einer Konditionierung überneuer Dampfphase wird der Vorgang wiederholt.

In der AMD wird die Technik der Mehrfachentwicklung mit der Gradienten-technik kombiniert. Während der ersten 5 bis 10 Entwicklungsschritte werden dieEntwicklungen mit relativ fließstarken Laufmitteln jeweils über sehr kurze Trenn-strecken durchgeführt. Dadurch wird die Auftragung fokussiert, was sich positivauf die chromatographische Trennung auswirkt. Die Fleckkompression ist dabeidem Rf-Wert proportional.

Der Zusammenhang zwischen Zonenbreite und Rf -Wert ist folgender. Der Ab-stand zwischen dem unteren Teil der Analytzone und der Immersionslinie ist z0, wieAbb. 6.21 zeigt. Der Wert z0 ist identisch mit dem Wert za0, dem Abstand des un-teren Zonenrandes von der Immersionslinie. Nach dem ersten Entwicklungsschrittüber die Strecke zf erhält man für den unteren Bereich der Analytzone den Abstandza1 von der Immersionslinie. Mit der Definition des Rf-Wertes gilt [19]:

za1 � za0 D Rf.zf � z0/

za1 D .Rfzf � Rfza0/ C za0 D zfRf C za0.1 � Rf/:


Laufmittelfront

Eintauchliniez0

za0

zf

zb0

za0 zb0

Peakbreitewab0= 4σ0 = zb0-za0

vor der Elutionzan

zbn

zbn+1zan+1

nach der Elution

A B C

Abb. 6.21 Illustration des Mechanismus der Zonenfokussierung mit den entsprechenden Abkür-zungen. A vor der Entwicklung, B während der Entwicklung, C nach der Entwicklung

Dasselbe gilt für die Wanderung des oberen Bereichs der Analytzone vonzb0 zum Ort zb1. Wird die Zonenbreite abgekürzt mit zb0 � za0 = wab0 = 40 undzb1 � za1 = wab1 = 41, ergibt sich der Ausdruck:

zb1 � za1 D wab1 D wab0.1 � Rf/:

Daraus folgt:n D 0.1 � Rf/

n: (6.12)

n Peakbreite nach n Entwicklungen0 ursprüngliche Peakbreite

Wird bei der Fleckkompression mit starken Laufmitteln gearbeitet, die hohe Rf-Werte produzieren, folgt mit Rf � 1 aus der Formel für die Fleckkompression so-fort 0 = 0. So können beim Fokussieren mit fließstarken Laufmitteln zu Beginn derEntwicklung sehr kleine Zonenbreiten erreicht werden. Deshalb ist es in der AMDmöglich, bis zu 50 µl Probe ohne Verlust der chromatographischen Auflösung di-rekt aufzutragen, weil die breite Auftragungszone im ersten Entwicklungsschritt zueiner scharfen Bande fokussiert wird.

Im Anschluss an die Auftragung und die Fokussierung wird die Platte in 20 bis30 Einzelschritten mit einem antiparallelen Gradienten entwickelt. Dabei muss dieFront mit jedem Entwicklungsschritt einige wenige Millimeter weiterlaufen undschiebt beim Auftreffen auf die nächste Zone diese zusammen. Am Anfang derEntwicklung laufen alle Substanzen der Probe im Frontgradienten mit und werdenso fokussiert. Eine Wiederholung verstärkt diesen Effekt.

Durch die Mehrfachentwicklung werden die Substanzen weiter fokussiert, wennsie sich in der mobilen Phase lösen, denn beim Auftreffen des Frontgradienten


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

UV

(240

nm

)

Trennstrecke (mm)

Abb. 6.22 Abgebildet ist die AMD-Trennung von Monuron, Chlortoluron, Desethylatrazin, Cya-nazin, Methobromuron, Propazin, Vinclozolin und Pendimethalin (je 500 ng, Vinclozolin 1 µg).Entwickelt wurde mit dem Gradienten aus Abb. 6.23, bestehend aus Methyl-tert-butylether, Ace-tonitril und n-Hexan

auf eine lösliche Zone wird diese zusammengeschoben. Da die Elutionskraft desantiparallel arbeitenden Gradienten mit steigendem Rf-Wert abnimmt, werden dieSubstanzen der Reihe nach von der Front gestoppt und auf diese Weise immobi-lisiert. Da die Substanzen förmlich aus dem Laufmittel „ausgefällt“ werden, kannder schwächer werdende Gradient im nächsten Schritt diese Zonen nicht wiederin Lösung bringen. Weil sich diese Verbindungen während der weiteren Entwick-lung nicht mehr in der mobilen Phase aufhalten, können sich die Substanzzonendurch Diffusion auch nicht mehr verbreitern [18–24]. Dies zeigt die Trennung inAbb. 6.22.

In Abb. 6.23 ist ein typischer AMD-Gradientenverlauf dargestellt. Die Frontläuft bei jeder neuen Entwicklung knapp 4 mm weiter. Die dargestellte Entwicklungbesteht aus 25 Einzelschritten. Der antiparallele Gradientenverlauf ist gut zu erken-nen, da die unpolare Fraktion (n-Hexan) mit zunehmender Laufhöhe des Fließmit-tels zunimmt, während die polare Fraktion (Methyl-tert-butylether/Acetonitril) bisauf den Wert Null am Ende des Gradientenverlaufs absinkt.

Mit der AMD können relativ große Trennzahlen von über 10 erreicht werden.Die große Auftragemenge erlaubt eine Bestimmung ohne Probeanreicherung imSpurenbereich. Damit und durch das Überstreichen eines weiten Polaritätsberei-ches eignet sich die AMD hervorragend für das Screening im Umweltbereich [22,23, 25], aber auch für die Analytik komplexer Proben z. B. in der Lebensmittelana-lytik [26].

6.6 Normalphasentrennung mit wasserhaltigen Fließmitteln 159

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

%

Entwicklungsschritte

tert-

CH3CN 9+1n-Hexan

Butylmethylether

Abb. 6.23 Abgebildet ist eine typische Zusammensetzung eines AMD-Gradienten

6.6 Normalphasentrennung mit wasserhaltigen Fließmitteln

Sehr polare Substanzen können auf Kieselgel erfolgreich mit wasserhaltigen Fließ-mittelsystemen getrennt werden. Bei solch einer Trennung bildet sich die stationärePhase aus immobilisiertem Wasser, das sich an Kieselgel anlagert. Diese Methodeist als hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC, engl. hydrophilic interacti-on liquid chromatography) bekannt.

Der Vorteil gegenüber lipophilen Normalphasentrennungen liegt auf der Hand.Es muss nicht auf den Wassergehalt der Trennphasen geachtet werden. In Abb. 6.24ist die Trennung geladener Verbindungen auf Kieselgel mit einem Fließmittel zu se-hen, das zu 60 % aus Wasser besteht. Ionische Moleküle können generell nur in sehrpolaren Fließmitteln aufgetrennt werden. Die Trennung in Abb. 6.24 benötigt etwa50 Minuten, da die mobile Phase sehr viskos ist. Trotzdem werden gute Trennungenmit scharfen Zonen erreicht.

6.7 Plattenentwicklungenmit erzwungenemFluss

Der im Vergleich zur HPLC große Nachteil der DC bzw. der HPTLC ist die nichtli-neare Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase. Publiziert wurde daher eineReihe von Methoden, mit deren Hilfe eine DC-Platte mit einem erzwungenen Lauf-mittelfluss entwickelt wird [27].

Die einfachste Art ist, die DC-Platte in einer Horizontalkammer mit der Schichtnach oben zu platzieren, und mit einer Deckplatte so abzudecken, dass ein schmalerStreifen DC-Schicht frei bleibt. Hier wird das Fließmittel abgedampft, was einen


0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 10 20 30 40 50 60 70 80Trennstrecke (mm)

(R-1

)

a

b

c d

e

Abb. 6.24 Trennung der Herbizide a Paraquat, b Diquat, c Mepiquat, d Chlormequat und eDifenzoquat mit den Fließmittelgemischen 1-Propanol/Methanol/2,5 M wässriger NaCl-Lösung(1 + 1 + 3, V / V). Die Verbindungen wurden mit Tetraphenylborat/HCl in Wasser angefärbt und imBereich von 560 bis 590 nm in Fluoreszenz vermessen

kontinuierlichen Laufmittelfluss zur Folge hat. Sz. Nyiredy beobachtete dabei einegleichbleibende Fließgeschwindigkeit [27].

6.7.1 Rotationsplanarchromatographie (RPC)

In der Rotationsplanarchromatographie lässt man die Platte um ihren Mittelpunktrotierten. Gleichzeitig wird hier das Laufmittel aufgebracht. Durch die Fliehkräf-te wandert die mobile Phase in einem erzwungenen Fluss nach außen und trenntdie Analyte auf. Es werden Umdrehungsgeschwindigkeiten von bis zu 1500 Rpm(Umdrehungen pro Minute) angewendet. Zur analytischen Bestimmung wird derProzess abgebrochen, bevor die mobile Phase die Plattenseiten erreicht hat. Beipräparativen Trennungen wird das am äußeren Rand austretende Fließmittel auf-gefangen. Geräte für präparative Rotationsplanarchromatographie sind unter demNamen Rotachrom® [28] oder ExtraChrom® kommerziell erhältlich [27].

6.7.2 Overpressure Planar Layer Chromatography (OPLC)

Wird eine DC-Platte nach oben hin abgedichtet und das Fließmittel unter Druck indie stationäre Phase eingepresst, erhält man das planare Gegenstück zur HPLC.

Die einfachste Art der Realisierung besteht in dem Abdichten der DC-Platte vonunten mit einer starken Glasplatte, die unter Druck steht und in der Mitte eine Lauf-mittelzuführung besitzt [29]. R. E. Kaiser konnte mit dieser einfachen Apparaturinnerhalb weniger Minuten sowohl zirkulare Trennungen hoher Trennschärfe als

6.7 Plattenentwicklungen mit erzwungenem Fluss 161

HPTLC

TLC

OPLC

OPLC

OPLC

X(cm)

NUS

NS

UM

NUS

UMNS

H(μm)

11 μm 11 μm

5 μm

5 μm

3 μm

4,0 8,0 12,0 16,0

10

20

30

40

50

60

Abb. 6.25 Dargestellt ist die theoretische Plattenhöhe NH , aufgetragen gegen die Trennstreckefür TLC- und HPTLC-Entwicklungen in gesättigter und ungesättigter Normalkammer, getrenntohne Gasphase (auf mit Glasplatten bedeckten TLC- und HPTLC-Platten) oder mittels OPLCbei verschiedenen Korngrößen. (Aus [30], mit freundlicher Genehmigung © Marcel Dekker) Nus

ungesättigte Normalkammer, Ns gesättigte Normalkammer, UM ohne Gasphase

auch antizirkulare Trennungen (bei denen das Laufmittel von außen nach innenfließt) durchführen. Bei zirkularen Trennungen wird eine optimale Trennung fürSubstanzen mit niedrigen Rf-Werten erreicht. Für antizirkulare Trennungen gilt dasGegenteil. Kaiser stellte fest, dass zwei hintereinander durchgeführte antizirkulareTrennungen einer linearen Trennung entsprechen [29].

Die Technik für Hochdruck-Horizontalentwicklungen wurde im Jahre 1979 vonE. Tyihák und Mitarbeitern eingeführt [30]. Bei Drücken bis über 100 bar wird einähnliches Trennverhalten wie in der HPLC erreicht. Der Unterschied zur HPLCliegt im parallelen Arbeiten. Detektiert werden kann sowohl nach Entwicklungsab-bruch direkt auf der Platte als auch im Durchfluss, wenn die Substanzen mit dermobilen Phase die Platte verlassen.

In Abb. 6.25 sind die HETP-Werte (engl. height equivalent to a theoretical plate)verschiedener TLC-, HPTLC- und OPLC-Systeme aufgeführt. Auf den ersten Blicksieht man die Vorteile der HPTLC gegenüber der TLC. Man erkennt aber auch, dassdie OPLC der HPTLC nicht nur bei der Verwendung von 3-µm-Phasen überlegen


ist. Entscheidend bei der OPLC ist, dass die Trenngüte ( NH ) unabhängig von derTrennstrecke ist. Interessant ist auch die leicht verbesserte Trenngüte ungesättigterNormalkammern (Nus) gegenüber der gesättigter Normalkammern (Ns).

Die OPLC benötigt eine aufwändige Trenneinrichtung und Spezialplatten, diean den Rändern mit einer Dichtmasse versehen sind. Diese speziellen Anforderun-gen haben es bisher verhindert, dass diese interessante Methode weite Verbreitunggefunden hat. Erwähnt werden soll noch, dass mit der OPLC zweidimensionaleTrennungen möglich sind.

6.8 Zweidimensionale DC

6.8.1 Orthogonale Entwicklungen

In der auf R. Consden zurückgehenden 2-D-Chromatographie wird nacheinanderin zwei unterschiedliche Richtungen entwickelt [31]. Bei Verwendung des gleichenLaufmittels können Trennzahl und Auflösung allerdings nur um den Faktor

p2

gesteigert werden. Bei der Verwendung verschiedener Laufmittel bietet die zwei-dimensionale Entwicklung eine Leistungsfähigkeit, die von kaum einer anderenTrennmethode erreicht wird. In einem ersten Übersichtsartikel listete G. Guichonviele Anwendungen dieser Technik auf [32]. Für zweidimensionale Trennungen be-sonders geeignet sind Cyano-, Amino- und Diolplatten. Sie bieten den Vorteil, dassdurch einfache Änderung des Fließmitttels die Selektivität auf diesen Phasen verän-dert werden kann. Gelingt es, orthogonale Bedingungen herzustellen, also z. B. ineiner Richtung eine Normalphasentrennung und in der anderen Richtung eine RP-Trennung durchzuführen, quadriert sich die Trennzahl im Vergleich zu einer eindi-mensionalen Entwicklung [33]. Auch Trennungen im Sauren und Basischen könnenorthogonale Bedingungen erzeugen, allerdings nur, wenn die Analyte selbst Säurenoder Basen sind.

In einer 2-D-Trennung mittels Horizontalkammer wird die Probe punktförmigan allen vier Ecken aufgetragen, denn es kann von beiden Seiten aus gleichzeitigentwickelt werden. Die Standards werden mittig zwischen die vier Probeauftra-gungen gesetzt. Werden die Standards doppelt aufgetragen, erhält man auf einer10 cm × 10 cm großen HPTLC-Platte vier 2-D-Trennungen mit jeweils zwei Stan-dardbahnen. Dann wird die Platte von beiden Seiten gleichzeitig mit Fließmittel Aüber eine Strecke von knapp 5 cm entwickelt. Nach dem Trocknen wird die DC-Platte um 90° gedreht und mit dem Fließmittel B erneut über diese Strecke chroma-tographiert.

Wurden Standards aufgetragen, darf nicht bis zum Aufeinandertreffen der beidenFronten entwickelt werden. Die Zuordnung der einzelnen Flecke erfolgt anhand derStandards.

Wird eine 2-D-Platte auf diese Weise jeweils mit zwei unterschiedlichen Fließ-mitteln von beiden Seiten aus gleichzeitig entwickelt, können auf einer Platte je-weils vier unterschiedliche Fließmittelkombinationen getestet werden. Ein Problem

6.8 Zweidimensionale DC 163

bildet die Quantifizierung einer 2-D-Trennung mittels eines Spaltscanners, aber hierkann fleckförmig gescannt werden. Auch ist mit der Videodensitometrie, zumin-dest bei farbigen Substanzen, eine elegante Messmethode gegeben, die 2-D-Plattenschnell auswerten kann.

Möchte man auf zwei verschiedenen stationären Phasen trennen, kann man sicheinen schmalen Streifen auf einer DC-Platte mit einem anderen Phasenmaterial che-misch modifizieren. Auf diesem Streifen startet man die erste Trennung. Für TLC-Platten sind solche Zweiphasenschichten im Handel erhältlich. Die Fa. Whatmannz. B. bietet unter dem Namen „Multi-K dual phase“ eine 20 cm × 20 cm große Kie-selgelplatte an, die am Rand mit einem 3 cm breiten Streifen aus RP-18-Materialbelegt ist. Leider sind entsprechende HPTLC-Platten im Handel nicht verfügbar.

6.8.2 Grafted TLC

Eine 2-D-DC mit unterschiedlichen stationären Phasen lässt sich einfach durchfüh-ren, wenn man eine HPTLC-Platte in kleine, 10 bis 20 mm breite Streifen schneidet[34]. Am besten geeignet dafür sind Glasplatten, aber auch Phasen auf Aluminium-folie eignen sich. Auf solch einem Streifen trennt man eine Auftragung (die auchstrichförmig sein kann) in der ersten Dimension über die ganze Länge auf. Nachdem Trocknen klemmt man diesen Streifen mit der Oberfläche auf eine zweite Plat-te mit einer anderen Phase, sodass beide stationäre Phasen Kontakt haben. Dazubewährt haben sich kleine Magnete, die beide Platten zusammenhalten.

Soll z. B. die erste Dimension der Trennung auf einer RP-18-Platte durchgeführtwerden, trennt man die Probe auf und schneidet anschließend die Trennplatte inkleine, etwa 1 cm breite Streifen. Diese Streifen pfropft man (engl. to graft) einerzweiten Platte auf, die z. B. mit einer Kieselgelphase belegt ist. Zum Pfropfen kratztman von der großen Platte mit der zweiten Trennphase an einem Rand (oder an bei-den Rändern) ca. 5 mm stationäre Phase bis zur Grundplatte ab. Der Streifen derersten Trennung wird mit der Trennphase nach unten auf diesen Bereich der frei-gelegten Grundplatte gelegt und durch leichte Schleifbewegung passgenau an diestationäre Phase der großen Platte angefügt. Auf die andere Seite der großen Plattelegt man einen Abstandshalter. Das Ganze wird mit einer Gegenplatte abgedecktund mit zwei Magneten fixiert (Abb. 6.27). Wichtig ist, dass die aufgetrennten Sub-stanzen nicht von der zweiten Platte überdeckt werden.

Nun kann der schmale Streifen mit der ersten Trennphase in Kontakt mit demFließmittel gebracht werden. Das Fließmittel überträgt die Substanzen auf die zwei-te stationäre Phase. Damit die Substanzflecke auf die zweite Platte überlaufen, mussein guter Kontakt zwischen beiden stationären Phasen vorhanden sein. So kann manzwei beliebige stationäre Phasen kombinieren, ohne auf kommerzielle Angeboteangewiesen zu sein. Die Methode des „Aufpfropfens“ nennt man „grafted TLC“[34].


a

b

Abb. 6.26 2-D-Platte (auf Kieselgel) a nach der ersten Entwicklung mit Fließmittel A (Toluol)und b nach der zweiten Entwicklung mit Fließmittel B (Methyl-tert-butylether). Sichtbar sind vier2-D-Trennungen und vier Standardbahnen

6.8 Zweidimensionale DC 165

Haltemagnete

ersteTrennphase

zweiteTrennphase

Gegenpla�e

Abstandshaltera b

Abb. 6.27 a Eine aufgepfropfte Trennbahn (unten) an eine 10 cm × 10 cm große HPTLC-Platte,b schematische Darstellung des Vorgangs

6.8.3 Stabilitätstest und TRT-Technik

Eine 2-D-Entwicklung bietet die interessante Möglichkeit, Zersetzungen der Probewährend der Entwicklung zu erkennen. Der Test dazu ist einfach durchzuführen.Die Probe wird in einer (bzw. allen vier Ecken) aufgetragen und mit dem gewähl-ten Fließmittel entwickelt. Nach dem Trocknen wird die DC-Platte um 90° gedrehtund mit dem gleichen Fließmittel erneut chromatographiert. Zersetzen sich die ge-trennten Substanzen während der Entwicklung nicht, müssen sie nach der zweitenEntwicklung alle auf einer Diagonalen liegen. Substanzen, die außerhalb der Dia-gonalen laufen, haben während der Entwicklung ihre chemischen Eigenschaftenverändert und verraten damit die Instabilität der entsprechenden Substanz [35]. InAbb. 6.28 ist eine 2-D-Trennung eines Farbstoffgemisches (CAMAG III) abgebil-det. Nach der Trennung mit Toluol liegen alle Substanzen auf einer Diagonalen.Damit ist gezeigt, dass sich während der beiden Trennungen keine der Substan-zen zersetzt hat. Jede DC-Methode sollte während der Validierung mittels diesesVerfahrens auf die Bildung von Zersetzungsprodukte während der Trennung hinüberprüft werden.


ersteTrennrichtung

zweite Trennrichtung

Probeauftragung

Abb. 6.28 Gezeigt ist die Zuordnung einer 2-D-Entwicklung mit Toluol auf Kieselgel. Die Sub-stanzen liegen nach der Trennung auf einer Diagonalen und zeigen damit an, dass sie sich währendder Trennung nicht zersetzt haben

zweiteTrennrichtung

erste Trennrichtung

Probeauftragung

Zersetzungsprodukt

Abb. 6.29 Zuordnung einer TRT-Entwicklung mit Toluol auf Kieselgel. Im Reaktionsschritt hatsich die gelbe Substanz (mit dem größten Rf-Wert) teilweise zersetzt

Bei der TRT-Methode wird die Probe in der ersten Trennrichtung getrennt (T),anschließend einer gezielten Reaktion unterworfen (R) und in der zweiten Dimensi-on unter Verwendung des gleichen Fließmittels erneut getrennt (T). Im Unterschiedzum Stabilitätstest wird die Platte zwischen den beiden Trennschritten einer gewoll-ten Reaktion unterworfen.

Substanzen, die bei dieser gezielten „Stressung“ der Probe reagieren, geben sichdurch eine Abweichung von der Diagonalen zu erkennen. Dieses Verfahren kannangewendet werden, um die Robustheit einer Trennung zu überprüfen.

6.9 Trocknen der Platte 167

In Abb. 6.29 ist die TRT-Trennung eines Farbstoffgemisches dargestellt. Nachder ersten Trennung mit Toluol wurden die Farbstoffe einer HCl-Atmosphäre aus-gesetzt. Nach der zweiten Trennung, ebenfalls mit Toluol als Laufmittel, zeigt sichbei einer Substanz eine Teilprotonierung. Diese Zersetzung kann durch das unter-schiedliche Laufverhalten des Zersetzungsproduktes leicht identifiziert werden.

6.9 Trocknen der Platte

Nach der Entwicklung wird die Platte getrocknet, um die aufgetrennten Substanzenim Anschluss zu derivatisieren oder direkt zu vermessen. Dem Trocknungsschrittwird dabei in der Regel wenig Aufmerksamkeit gewidmet. In den meisten Lehrbü-chern wird er gar nicht behandelt.

Wahrscheinlich ist jedoch das Trocknen der Platte bei einer quantitativen DC-Methode einer der entscheidenden Schritte [36]. Während des Trocknens diffun-diert die mobile Phase zur Plattenoberfläche und dampft dort ab. Damit werdendie in der Sorbensschicht verteilten Analytmoleküle zum Teil mit an die Platteno-berfläche getragen. So ändert sich während des Trocknungsvorgangs die Substanz-verteilung innerhalb der stationären Phase. Generell werden die Analyte an derPlattenoberfläche angereichert. Dies ist sehr wichtig, da ein Mehr an Substanz ander Plattenoberfläche empfindlicher zu messen ist. Für quantitative Auswertungenwichtig ist, dass die Analytverteilung während des Trocknungsprozesses auf derganzen Platte konstant bleibt. Daher sollte man nie mit einem Handföhn trocknen,da hier die Platte immer ungleichmäßig erwärmt wird. Gleichmäßigeres Trocknenerreicht man mit einer Heizplatte, die auf jeden Fall größer als die zu trocknendeDC-Platte sein muss. Ein Heizschrank leistet ebenfalls gute Dienste. Eine DC-Plattekann man sehr effektiv durch das Überleiten eines laminaren Luftstromes trocknen,oder man legt die Platte einfach an einen Ort ohne Luftzug ab, wo der Vorgang vonallein abläuft. Wedeln mit der Platte in der Hand, oder zugige Plätze, wo die Platteungleichmäßig trocknet, sollte man vermeiden.

Literatur

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7Spezifische Färbereagenzien

Die Stärke der Dünnschichtchromatographie liegt zweifellos darin, dass man ohnegroßen apparativen Aufwand die Qualität einer Trennung mit dem bloßen Auge be-gutachten kann. Dies ist nicht nur bei der Trennung farbiger Substanzen möglich.Bei der Verwendung von DC-Platten, die mit einem Fluoreszenzindikator imprä-gniert sind, reicht eine UV-Lampe aus, um die Qualität der Trennung auch beinichtfarbigen Substanzen beurteilen zu können. Im Handel befinden sich dazu Plat-ten, bei denen das Sorbens einen Farbstoff enthält, der bei Lichteinstrahlung von256 nm oder 366 nm eine Fluoreszenz zeigt. Verhindert eine Substanzzone die Be-strahlung dieses Fluoreszenzfarbstoffes, erscheint diese als dunkle Zone auf hellemGrund. Substanzen, die im Bereich der Farbstoffanregung kein Licht absorbieren,können damit allerdings nicht detektiert werden. Bei fluoreszierenden Proben kanndurch eine Bestrahlung mit UV-Licht die Substanzzone zum Leuchten gebracht undso identifiziert werden.

Zur schnellen visuellen Überprüfung einer Trennung existiert jedoch ein univer-seller Detektor, der jede organische Substanz auf einer Kieselgel- oder Al2O3-Plattezerstörungsfrei sichtbar machen kann. Es ist gasförmiges Iod. Wird etwas festesIod in eine geschlossene Kammer gegeben, verdampft es schon bei Raumtempera-tur, und der Universaldetektor ist einsatzbereit. Das braune, gasförmige Iod reichertsich in lipophilen Zonen an und färbt diese reversibel braun, denn das eher hydro-phile Plattenmaterial nimmt das unpolare Iod kaum auf. Substanzzonen erscheinenso dunkelbraun auf hellbraunem Untergrund. Wird die gefärbte Platte anschließendder Färbekammer entnommen, verschwindet die Iodfärbung mit der Zeit. Die Fär-bedauer reicht aber für eine visuelle Auswertung oder ein schnelles Bild völlig aus.Die Iodfärbung kann mit wässriger Stärkelösung (0,5 % Stärke in Wasser aufge-kocht, 2 s getaucht) dauerhaft fixiert werden.

In Abb. 7.1 ist eine iodgefärbte HPTLC-Platte abgebildet. Wie empfindlich dieIodfärbung ist, zeigt der braune Fleck im mittleren unteren Plattenbereich. Hier istdie Platte ohne Handschuhe angefasst worden. Dabei wurde Hautfett auf die Platteübertragen und durch die Iodeinlagerung sichtbar gemacht.

Eine weitere, oft unterschätzte Methode, lipophile Substanzen auf Kieselplat-ten sichtbar zu machen, ist das schnelle Tauchen (maximal 1 s) in reinem Wasser.


172 7 Spezifische Färbereagenzien

a b

c d

Abb. 7.1 Abgebildet ist eine iodgefärbte Kieselgelplatte. Aufgetragen sind verschiedene Stoff-mengen a Doxylamin, b Metoclopramid (250 ng bis 1000 ng), c Zopiclon, d Tramadol (250 ng bis1000 ng) sowie ein Referenzgemisch aus Morphin, Codein, Coffein, Trimipramin und Nicotin. AlsFließmittel wurde Ethylacetat/Methanol/NH3 (25 %ig) (85 + 10 + 5, V / V) benutzt

Die Platte wird an denjenigen Stellen, an denen sich lipophile Banden befinden,nicht oder nur wenig benetzt. Wird die DC-Platte anschließend mit einem weichenWischer an der Oberfläche abgewischt und auf eine schwarze Unterlage gelegt,erscheinen die Substanzzonen beim Antrocknen weiß auf dunklem Grund. Dar-gestellt ist in Abb. 7.2 eine Kieselgelplatte, auf der Extrakte aufgetrennt wurden,die lipophile Fungizide enthalten. Die Fungizidzonen erscheinen deutlich sichtbarals weiße Banden auf einem durchscheinenden schwarz-grauen Untergrund. Nachdem Trocknen der Platte kann mit dieser Methode eine Trennung erneut sichtbargemacht werden.

Die Dünnschichtchromatographie ist eine offene Trenntechnik. Nach einer Tren-nung liegt die Platte offen vor und ist für chemische Reaktionen leicht zugänglich.Ein nicht zu unterschätzender Vorteil der DC ist die sehr große Zahl an mehr oderweniger spezifisch färbenden Reagenzien, die als „chemische Detektoren“ einge-setzt werden können. Auflistungen der gebräuchlichsten Reagenzien finden sichunter [1–9]. Die spezifische Reaktion eines Analyten mit einem Reagenz ist einebesondere Form des Detektierens, denn so kann mit dem Auge als Detektor ei-ne einfache, aber effektive Analytik durchgeführt werden. Eine mehr oder wenigerspezifische chemische Reaktion in Verbindung mit einem von der Platte aufgenom-menen Spektrum macht die DC extrem spezifisch. Allerdings erhöht ein Anfär-ben der Platte die Messunsicherheit. Quantitative Bestimmungen sollten daher –

7.1 Chemische Umsetzungen vor der Trennung 173

Abb. 7.2 Dargestellt sind durch Tauchen in Wasser sichtbar gemachte weiße Zonen, die lipophileFungizide enthalten

wenn möglich – an der ungefärbten Platte erfolgen. Erst wenn die Selektivität derTrennung nicht ausreicht, sollte auf eine Färbereaktion zurückgegriffen werden.Zum gezielten Einsatz einer chemischen Reaktion auf der Platte sind zwei prinzi-piell unterschiedliche Techniken anwendbar: die Derivatisierung vor der Trennung(prächromatographische Derivatisierung) und die Umsetzung nach der Trennung(postchromatographische Derivatisierung). Beide Verfahren haben Vor- und Nach-teile. Bei DC-Trennungen wird in der Regel das zweite Verfahren durchgeführt,weil es einfacher anzuwenden ist und mehr Anwendungen publiziert sind. Trotz-dem besitzt auch eine Derivatisierung vor der Trennung Vorteile.

7.1 Chemische Umsetzungen vor der Trennung(prächromatographische Derivatisierungen)

Die prächromatographische Derivatisierung ermöglicht es, Substanzen mit gleichenoder ähnlichen chromatographischen Eigenschaften, aber unterschiedlichen chemi-schen Reaktionsvermögen durch eine Reaktion vor der Trennung zu unterscheiden.Dabei kann z. B. die Stabilität der Substanzen erhöht werden, um bei reaktivenVerbindungen eine Reaktion während der chromatographischen Entwicklung zuunterdrücken. Flüchtige Substanzen können durch prächromatographische Umset-zungen in Derivate umgesetzt werden, die für eine DC-Trennung geeignet sind.Nicht zuletzt ermöglicht das gezielte Einbringen von Substitutionsresten die geziel-


0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Trennstrecke (mm)

KM

-Sig

nal

Abb. 7.3 Abgebildet ist die Trennung von Schwermetall-Dithizon-Komplexen auf einer RP-18-Platte mit dem Laufmittel H2O/CH3CN/Ethanol (3 + 15 + 5, V / V), aufgenommen im Bereich von313 nm bis 324 nm. Folgende Schwermetallkomplexe sind getrennt: Hg2+ (orange, 16 mm), Ni2+

(violett, 19 mm), Cu2+ (grünbraun, 28 mm), Cd2+ (orangerot, 35 mm) und Pb2+ (blaugrün, 40 mm)

te Veränderung des Extraktionsverhaltens, die Ausformung einer Fluoreszenz odereine bessere Lichtabsorption.

Prächromatographische Derivatisierungen zeigen im Vergleich zur postchroma-tographischen Derivatisierung einen prinzipiellen Nachteil: Der Analyt wird mitdem Derivatisierungsreagenz umgesetzt, und dieses muss dann zusätzlich abge-trennt werden. Durch Reaktion wird das Analytmolekül vergrößert, und damit glei-chen sich unterschiedliche Verbindungen bei der Reaktion mit einem Reagenz inihrer Struktur an. Sie werden sich ähnlicher und können damit schlechter aufge-trennt werden. Eine prächromatographische Derivatisierung lohnt sich daher nurbei einem Vorteil, den eine postchromatographische Derivatisierung nicht zeigt.

7.1.1 Anreicherung durch prächromatographische Derivatisierung

Schwermetalle bilden mit Dithizon farbige Komplexe bei pH-Werten kleiner als4,5. Diese Komplexierungsreaktion hat zwei Vorteile. Der erste Vorteil ist, dass nurdie giftigsten Metallkationen wie Zn2+, Cd2+, Pb2+, Hg2+, Ag+, Co2+, Ni2+ sowieCu2+ bei solch niedrigen pH-Werten mit Dithizon (Abb. 7.4) reagieren. AndereMetallkationen setzen sich nicht um und stören die Bestimmung daher nicht.

Lipophile Metall-Dithizon-Komplexe können mit Essigsäureethylester oder Me-thylenchlorid aus der Probelösung extrahiert und so angereichert werden. Anrei-cherungsfaktoren von über 100 machen diese Art des Schwermetallsreenings sehrempfindlich. Die Trennung auf unpolarem RP-18-Material ermöglicht eine quanti-tative Bestimmung der farbigen Metallkomplexe, die auf Kieselgel nur kurze Zeitstabil sind, dagegen auf RP-18-Platten über eine Stunde unzersetzt bleiben [10–13].


NHN

NNH

S

N

NN

HO

OH

O

SH

S

N

4321

CH3 CH3

SH

N+

Abb. 7.4 Strukturen von 1 Dithizon, 2 4-(2-Pyridylazo)resorcinol (PAR), 3 1-Hydroxy-2-pyri-dinthion (HTP) und 4 Diethyldithiocarbamat

Der Komplexbildner 4-(2-Pyridylazo)resorcinol (PAR, Abb. 7.4) bildet ebenfallsaus Wasser extrahierbare farbige Komplexe mit Schwermetallen, die auf Cellulose-schicht mit dem Fließmittel Toluol/Chloroform (50 + 5, V / V) aufgetrennt werdenkönnen [13].

Die Kationen der Elemente V, Mo, Mn, Fe, Co, Ni, Rh, Pd, Os, Ir, Pt, Cu, Zn, Hg,Tl, Pb und Te können mit dem Komplexbildner 1-Hydroxy-2-pyridinthion (HPT,Abb. 7.4) im pH-Bereich von 3 bis 8 zu farbigen Verbindungen umgesetzt wer-den. Diese Komplexe lassen sich auf Kieselgel mit Dichlormethan/Tetrahydrofuran(9 + 1, V / V) auftrennen [14–16].

Diethyldithiocarbamat (Abb. 7.4) bildet bei einem pH-Wert von 8,5 stabile,extrahierbare Komplexe mit folgenden Metallionen: Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+,Zn2+, Pd2+, Ag+, Cd2+, In3+, Sn4+, Sb3+, Pt4+, Au3+, Hg+, Tl+, Tl2+, Pb2+ undBi3+ [17].

Formaldehyd kann im Spurenbereich durch eine prächromatographische DC be-stimmt werden. Diese Bestimmung basiert auf einer Reaktion von Formaldehyd mitDimedon unter Bildung eines stabilen Farbstoffes. Zur Bestimmung von Formalde-hyd in Zähnen werden 0,25 g gereinigte und pulverisierte Zähne mit einer Dimedon-Lösung in Methanol (0,05–3 mg/ml) gemischt. Die Suspension wird zentrifugiert,ein Aliquot von 20 µl direkt auf eine Kieselgelschicht aufgetragen und mit einemGemisch aus Chloroform/Dichlormethan (1 + 3) chromatographiert. Der Dimedon-Formaldehyd-Farbstoff wird bei 275 nm quantifiziert [18].

Eine interessante und sehr empfindliche In-situ-Derivatisierung mit anschließen-der Aufkonzentrierung beschreibt W. Funk für Selen, das sehr empfindlich mit 2,3-Diaminonaphthalin unter Bildung einer fluoreszierenden rotorangen Selenverbin-dung bestimmt werden kann (Abb. 7.5) [19]. Diese Verbindung lässt sich auchextrahieren.

Flüchtige Aldehyde und Ketone wie Acetaldehyd, Formaldehyd oder Acetonkönnen mit der DC nicht direkt bestimmt werden. Zur Bestimmung von Aldehydenund Ketonen wird in der Literatur meistens eine Umsetzung mit Dinitrophenyl-hydrazin empfohlen. Die so gebildeten Hydrazone besitzen den Nachteil, dass siesich mit Sauerstoff in verschiedene Abbauprodukte umsetzen. Diese unkontrollier-ten Reaktionen erschweren eine Trennung. Trotzdem lassen sich auf diese WeiseAceton und Formaldehyd in der Luft durch eine Gas-Festkörper-Reaktion mit an-schließender photometrischer Detektion bestimmen [20]. Lipophile Aldehyde und


Abb. 7.5 Reaktion vonSelenoxid mit 2,3-Diami-nonaphthalin

NH2

NH2

2 H2O

SeO2

N

N

Se

–

+

andere Carbonylverbindungen in Ratten- und Humanurin reagieren mit 2,4-Dini-trophenylhydrazin (Abb. 7.6) unter Bildung farbiger Hydrazone, die mit CH2Cl2extrahiert werden können [21].

Durch eine Reaktion mit NBD-hydrazin (Nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-7-hydra-zin, Abb. 7.6) oder mit Methyl-NBD-hydrazin (Abb. 7.6) bilden Aldehyde undKetone rote bis rotgelbe Kopplungsprodukte, die auf einer DC-Platte abgetrenntwerden können [14]. Die Kopplungsprodukte sind ausreichend stabil, um in Luft-sammlern über Monate hin angereichert werden zu können. So ist der Nachweisgeringster Mengen an Aldehyden oder Ketonen in der Luft möglich [22]. Bei derVerwendung von MNBD-hydrazin wird das Derivatisierungsreagenz durch oxidie-rende Agenzien zu einer definierten Substanz abgebaut. Am Gehalt dieses Oxidati-onsproduktes kann zusätzlich die Expositionsdauer der Probe in der Luft abgelesenwerden.

Die nichtmethylierte Verbindung, das NBD-hydrazin (NBDH), wurde von R. W.Frei als Derivatisierungsreagenz eingesetzt [23]. Es hat den Vorteil, fluoreszierendeProdukte zu bilden und ebenso wie Methyl-NBD-hydrazin schon bei Raumtempe-ratur mit Carbonylgruppen reagieren zu können. Ein Nachteil der Hydrazine ist,dass bei der Umsetzung mit Carbonylgruppen cis- und trans-Isomere gebildet wer-den, die sich auf einer DC-Platte in der Regel nicht auftrennen lassen. Daher zeigtdas Densitogramm in Abb. 7.7 ein breites Signal für Acetaldehyd-methyl-NBD-hydrazon.

NH2HN

NH2 NH2

N

NH3C

N

NO2NO2

O

N

N

O

NO2

NO2

HN

321

Abb. 7.6 Strukturen von 1 2,4-Dinitrophenylhydrazin, 2 NBD-hydrazin und 3 Methyl-NBD-hy-drazin


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 10 20 30 40Trennstrecke (mm)

-lg(R

)

Abb. 7.7 Gezeigt ist die Trennung von Acetaldehyd-methyl-NBD-hydrazon bei einer Trennstre-cke von 24 mm, abgetrennt von MNBD-hydrazin (4 mm) und Abbauprodukten. Als Fließmittelwurde Cyclohexan/n-Butanol/Toluol (9 + 1 + 1, V / V) benutzt

7.1.2 Prächromatographische In-situ-Reaktionen

Ein weites Feld, das hier nur kurz behandelt werden soll, sind die prächromato-graphischen In-situ-Reaktionen. Hierbei wird eine analytspezifische Reaktion ein-gesetzt, um den Analyten von anderen Substanzen unterscheiden zu können. DerAnalyt wird in einer vorchromatographischen Reaktion chemisch so modifiziert,dass er leicht von Begleitsubstanzen abgetrennt werden kann. Dabei sollten – wennmöglich – auch die Stabilität des Analyten erhöht sowie seine Reaktivität bei derTrennung und die Messempfindlichkeit gesteigert werden.

Die Anforderungen solch einer prächromatographischen In-situ-Reaktion sindhoch [24].

Gefordert sind:� einheitliche, stabile Reaktionsprodukte� hohe Reaktionsausbeuten über einen weiten Konzentrationsbereich� einfache und schnelle Reaktionen� kein Einfluss der Reagenzien auf die Trennung� möglichst keine Beeinflussung der chemischen Analyteigenschaften (z. B. beim

Einführen einer großen Gruppe, die dann die Trenneigenschaften des Reaktions-produktes dominiert)J. M. Miller und J. G. Kirchner [25] publizierten 1953 ein elegantes Derivati-

sierungsverfahren für die DC. Danach wird die auf die Platte aufgetragene Probemit wenigen µl des Derivatisierungsreagenzes übersprüht. Die Zone wird durch dasAufsprühen der Reagenzlösung feucht und ermöglicht eine Derivatisierungsreakti-on. Eventuell muss diese Reaktion durch Erwärmen der Platte beschleunigt werden.Aufpassen sollte man, dass das Aufbringen der Reagenzlösung die Breite der Pro-beauftragung nicht zu sehr vergrößert. In der Praxis haben sich die strichförmige


Auftragung und das anschließende strichförmige Übersprühen mit Reagenz als amerfolgreichsten erwiesen. Unter diesen Bedingungen kann die Auftragebreite derProbe sehr klein gehalten werden. Bei manchen Reagenzien reicht eine Reaktions-zeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur für eine vollständige Umsetzung aus. Beianderen Reagenzien muss 10 Minuten bei 60 bis 100 °C derivatisiert werden. Einevollständige Reaktion wird oft nur erhalten, wenn die Trennschicht mit einer sau-beren Glasplatte abgedeckt wird. Bewährt hat sich die Zudosierung einer kleinerenMenge an Dimethylsulfoxid. Die Reaktion läuft dann in einer Flüssigphase ab undliefert höhere Umsetzungsraten. Allgemein gilt: Die Reagenzienlösungen solltenstets frisch hergestellt werden.

Prächromatographische In-situ-Reaktionen müssen einheitliche, stabile Produk-te hoher Ausbeute liefern. Die benutzten Reagenzien dürfen außerdem bei der chro-matographischen Entwicklung nicht mit der mobilen Phase reagieren. Trotz dieserEinschränkungen ist in der Literatur eine Vielzahl von In-situ-Derivatisierungsreak-tionen beschrieben worden, von denen hier nur ein paar Beispiele aufgeführt werdensollen. Eine gute Übersicht ist unter [1, 24] zu finden.

7.1.2.1 OxidationsreaktionenOxidationsreaktionen werden häufig benutzt, um die Stabilität des Analyten zuerhöhen. Phenothiazine können z. B. durch Übersprühen mit 10 %- bis 20 %igerH2O2-Lösung und anschließendem Trocknen bei 60 °C in Sulfoxide umgewandeltwerden [26]. Hydroxidgruppen können mit 10 %iger wässriger NaIO4-Lösung (Na-triumperiodat-Lösung) bei 50 °C zu Ketogruppen reagieren. Gezeigt werden konn-te dies am Beispiel von 17-Hydroxycorticosteroid, das zu 17-Ketosteroid reagiert[1, 24]. Polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs) können durch das Aufbringenvon Trifluoressigsäure als Katalysator und anschließendem Erwärmen auf 100 °Cdurch Luftsauerstoff oxidiert werden [27]. Iod in einer Iodkammer kann empfindli-che Substanzen ebenfalls oxidieren. Aus Benzo[a]pyren entsteht z. B. dessen Dimer,das Bis-benzo[a]pyren [28]. Beschrieben wurde auch die Umwandlung von Alka-loiden auf Kieselgelphase allein durch Erhitzen in Gegenwart von Sauerstoff [1].

7.1.2.2 ReduktionsreaktionenIn-situ-Reduktionen auf der DC-Platte werden meist mit Natriumborhydrid (NaBH4)durchgeführt. Oft wird eine 1 %- bis 10 %ige ethanolische oder methanolische Lö-sung benutzt. Zur Reduktion von Steroiden wird eine 10 %ige ethanolische NaBH4-Lösung 1 : 1 mit 0,1-molarer NaOH-Lösung gemischt. Nach 30 Minuten wird dieAuftragung mit Säure neutralisiert [1, 24]. Außer Carbonylgruppen können auchDisulfide reduziert werden.

7.1.2.3 HydrolysereaktionenEine Hydrolyse auf der DC-Platte kann sowohl sauer als auch basisch durchgeführtwerden. Sulfonamide z. B. hydrolysieren unter HCl-Dampf schon bei 100 °C [29].Dazu wird die Platte in eine HCl-gesättigten Atmosphäre gestellt. Es genügt, etwaskonz. HCl in eine Doppeltrog-Trennkammer zu geben und diese einige Minuten auf100 °C zu halten.


Flavon-, Cumarin- und Triterpenglykoside können durch Übersprühen der Pro-beauftragung mit 10 %iger ethanolischer HCl-Lösung und anschließendem Erhit-zen auf 55 °C für etwa 4–5 Stunden in einer HCl-Ethanol-Atmosphäre (1 + 1, V / V)hydrolysiert werden. Die Platte wird anschließend bei 90 °C getrocknet und zurNeutralisation mit einer 25 %igen NH3-Lösung in Ethanol (1 : 1) übersprüht [24,30].

Zur alkalischen Hydrolyse wird am zweckmäßigsten alkoholische KOH- oderNaOH-Lösung benutzt. Ester lassen sich durch einfaches Übersprühen spalten [24,31], während Carbamate 20 Minuten abgedeckt auf 170 °C erwärmt werden müssen[24, 32]. Digitalisglykoside werden schon gespalten, wenn die Platte 24–48 Stundenin NH3-Atmosphäre gehalten wird [33].

7.1.2.4 HalogenierungenIn der Literatur wird die Umsetzung ungesättigter Verbindungen mit Chlor- undBromdampf unter Mithilfe von Licht beschrieben [24]. Auch die Reaktion mit Iod-dampf wird erwähnt, obwohl Iod in der Dampfphase erheblich reaktionsträger alsChlor oder Brom ist [24].

Chlorierungen Cholesterol wird durch Thionylchlorid (SOCl2) in der Gasphaseinnerhalb von 4 h chloriert [30]. Verschiedene Verbindungen wie Coffein, Codein,Acetanilide oder Harnstoffverbindungen lassen sich bei Raumtemperatur innerhalbvon Sekunden durch gasförmiges Chlor chlorieren [34–36]. Gasförmiges Chlor istdurch die Reaktion von KMnO4 mit ein paar Tropfen konz. HCl leicht zugänglich.Die Platten sollten nach der Chlorierung 5 Minuten auf 100 °C erhitzt werden, umdas restliche Chlor von der Platte zu entfernen. Oft genügt es auch, die Platte etwa5 Minuten einem Luftstrom auszusetzen, um restliches Chlor vollständig zu entfer-nen.

Bromierungen Phenylbutazon und Cholestanol können durch Übersprühung miteiner 0,1 %igen Bromlösung in Dichlormethan bromiert werden [37, 38]. Ein-facher lässt sich eine Bromierung über die Gasphase durchführen. Dazu werdengleiche Mengen NaBr und NaBrO3 gemischt und in eine Entwicklungkammer ge-geben. Nach Zugabe weniger Tropfen konzentrierter Schwefelsäure wird durchSynproportionierung elementares Brom freigesetzt. Auf diese Art lassen sich beiRaumtemperatur z. B. Capsaicinoide vollständig bromieren [1, 24]. Barbiturate undThiobarbiturate können so als reaktive und nichtreaktive Verbindungen unterschie-den werden [1, 24, 34].

Iodierungen Iodierungen benötigen bei Raumtemperatur in der Regel über10 Stunden Reaktionszeit und sind damit für schnelle Analysen unpraktikabel[24]. PAKs, Naphthylamine und Phenolsteroide lassen sich bei Raumtemperaturallerdings schon innerhalb von Minuten zu dimeren Verbindungen umsetzen [28].Benötigt wird nur eine Entwicklungskammer, in die ein paar Kristalle Iod gegebenwerden.


7.1.2.5 NitrierungenAromatische Nitroverbindungen sind oft farbig, und das ist der Grund, warum Ni-trierungen in der DC so beliebt sind. PAKs z. B. lassen sich durch konzentrierteHNO3 unter trockenen Bedingungen innerhalb von 20 Minuten nitrieren. Dazu wer-den wenige Milliliter HNO3 zusammen mit dem Trocknungsmittel P2O5 in eineEntwicklungskammer gegeben [24, 27]. Naphthole lassen sich durch Übersprühenmit 90 %iger HNO3 auf der Platte bei 105 °C innerhalb von 30 Minuten nitrie-ren [35]. Die Vielzahl bekannter Nitrierungsreaktionen macht diese Form der In-situ-Derivatisierung für die DC sehr interessant, insbesondere weil aromatische Ni-trogruppen leicht zu Aminogruppen reduziert werden können. Diese bilden untermilden Reaktionsbedingungen leicht Diazoverbindungen.

7.1.2.6 DiazotierungenDiazotierungen werden immer dann eingesetzt, wenn farbige Verbindungen ausaromatischen Aminen, Phenolen oder anderen aktivierten Aromaten gewonnen wer-den sollen. Die Reaktion wird insbesondere zur Identifizierung von Benzodiaze-pinen eingesetzt [24]. Die Auftragung wird dazu mit einer NaNO2-Lösung in 1-molarer HCl übersprüht und abgedeckt für 5 Minuten auf 105 °C erhitzt. Nach demAbkühlen wird mit einer 5 %igen ˛-Naphthol-Lösung in Methanol übersprüht. DerDiazofarbstoff bildet sich bei Raumtemperatur sofort [24]. Einfacher durchzufüh-ren sind Diazotierungen, indem die Auftragung mit einer gesättigten ethanolischenEchtblausalz-B-Lösung (oder anderen Diazotierungsreagenzien) bei Raumtempe-ratur übersprüht wird [1].

7.1.2.7 VeresterungenDie Veresterungsreaktion ist eine wichtige Derivatisierungsmethode, da einerseitsAlkohole und andererseits Carbonsäuren reagieren können. Die Veresterung vonprimären und sekundären Alkoholen läuft wesentlich schneller ab als die entspre-chende Reaktion mit tertiären Alkoholen. Dies ermöglicht die Unterscheidung ter-tiärer von primären und sekundären Alkoholen [1, 24].

Die Veresterung von Alkoholen wird meistens mit Trifluoressigsäureanhydriddurchgeführt. Es lassen sich Aflatoxine, Ochratoxin A, Sterigmatocystin und Patu-lin durch Übersprühen mit Trifluoressigsäureanhydrid bei Raumtemperatur veres-tern [39]. Eine Mischung aus Essigsäureanhydrid und Pyridin (1 + 1, V / V) kanndiese Mycotoxine innerhalb von nur 5 Minuten bei Raumtemperatur in Essigsäu-reester umwandeln. Dieses Reagenz kann auch über die Gasphase verestern [41].Die Veresterung von Säuren benötigt in der Regel sehr reaktive Verbindungen wieDiazomethan oder Iodmethan. Diese Verbindungen sind leicht flüchtig und karzi-nogen und sollten daher in einem Analytiklabor nicht verwendet werden. Sorbin-säure und Benzoesäure können aber auch mit einer 0,5 %igen 4-Bromphenacyl-bromid-Lösung in N,N-Dimethylformamid durch Übersprühen der Auftragung undanschließendem 40-minütigem Erwärmen auf 80 °C verestert werden [1, 24].


H2NNH

321

O NHN

O

ONH2

NH2

N

Abb. 7.8 Strukturen von 1 Phenylhydrazin, 2 Isonicotinsäurehydrazid und 3 2-Diphenylacetyl-1,3-indandion-1-hydrazon (DIH-Reagenz)

7.1.3 Prächromatographische Farbstoff- undFluoreszenzderivatisierung

Es gibt eine große Zahl unterschiedlicher Reagenzien, die nur mit ganz bestimmtenfunktionellen Gruppen zu farbigen oder fluoreszierenden Verbindungen reagieren.Als Tauchreagenz sind diese Substanzen nur geeignet, wenn sie selbst keine odernur eine verminderte Eigenfluoreszenz bzw. keine zu starke Eigenfärbung zeigen.Auch sollten sie nicht zu teuer sein, denn beim Tauchen einer DC- oder HPTLC-Platte werden merkliche Mengen an Reagenz benötigt. Teure Reagenzien oder Sub-stanzen mit Eigenfluoreszenz können nur prächromatographisch benutzt werden.Dazu wird der Analyt mit einer kleinen Menge Reagenz vor der Trennung zurReaktion gebracht. Wichtig dabei ist, dass sich der Überschuss des Reagenzes chro-matographisch gut von den Analyten abtrennen lässt.

Von W. Funk, R. W. Frei und R. Wintersteiger wurden verschiedene prächro-matographische Derivatisierungsverfahren zur Bildung fluoreszierender Derivatepubliziert [19, 34, 39, 42–44]. In-situ-Derivatisierungen verbrauchen sehr wenigReagenz und können mit einem Dosierautomaten gut reproduzierbar durchgeführtwerden. Die teilweise hohen Preise dieser Reagenzien spielen bei In-situ-Reak-tionen keine Rolle, da die Auftragung der Probe nur mit wenigen Mikroliter desDerivatisierungsreagenzes übersprüht wird.

7.1.3.1 Reaktionen mit CarbonylverbindungenCarbonylverbindungen lassen sich mit Phenylhydrazin, Dinitrophenylhydrazin, Iso-nicotinsäurehydrazid oder Phenylhydrazin und 2-Diphenylacetyl-1,3-indandion-1-hydrazon (Abb. 7.8) in situ derivatisieren [1].

J. G. Kirchner beschriebt als Erster die Reaktion mit Phenylhydrazin direkt aufder Platte [25]. Dazu werden 10 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 10 ml eines Me-thanol-Essigsäure-Gemischs (10 + 1, V / V) gelöst und die aufgetragene Probe damitübersprüht [1]. Eventuell muss die Platte auf ca. 100 °C erwärmt werden. Proges-teron kann mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (10 mg in 10 ml Ethanol mit 30 µl konz.Salzsäure) zur Reaktion gebracht werden. Man übersprüht die Auftragung, lässt10 min reagieren und trocknet 5 min bei 100 °C [45]. Auf dieselbe Art reagierenAldehyde und Ketone wie Carvon, Menthon, Acetophenon, 4-Benzochinonderivate


H3C H3C H3CCH3

1 32

CH3 CH3

N N N

NCIO O O O OO

S S SNH

NH2

Abb. 7.9 Strukturen von 1 Dansylhydrazin, 2 Dansylchlorid und 3 Dansylazirin

und Steroidketone [1]. Zur Herstellung der Reagenzlösung werden 10 mg Isonico-tinsäurehydrazid in 1 ml Ethanol gelöst und mit 5 µl Trifluoressigsäure oder 10 µlkonzentrierter Essigsäure versetzt [1].

Phenylhydrazin reagiert in Gegenwart von verdünnter Schwefelsäure ebenfallsmit Carbonylgruppen. Patulin kann z. B. durch Übersprühen mit einer Lösung aus50 mg Phenylhydrazin in 9 ml Methanol und 1 ml DMSO (dem 100 µl konzen-trierte H2SO4 zugesetzt werden) bei 100 °C innerhalb von 10 Minuten zu einerfluoreszierenden Verbindung umgesetzt werden, die auf Kieselgel mit Methyl-tert-butylether/Heptan (8 + 2, V / V) von Beiprodukten abgetrennt werden kann [44, 46].

Ketone lassen sich auch durch das DIH-Reagenz (2-Diphenylacetyl-1,3-indan-dion-1-hydrazon) derivatisieren. Zur Herstellung des Reagenzes werden 7 mg 2-Diphenylacetyl-1,3-indandion-1-hydrazon in 1 ml Methanol–Toluol (1 : 1) gelöstund mit einem Tropfen konzentrierter HCl versetzt. Zur Umsetzung wird die Plattefür 10 Minuten auf 100 °C erhitzt [47].

Dansylhydrazin (Abb. 7.9) ergibt bei In-situ-Reaktionen mit Carbonylgruppenfluoreszierende Reaktionsprodukte. Es lassen sich Cortisol, Testosteron und auchPatulin als fluoreszierende Derivate bestimmen.

Nach einer Probeauftragung wird mit einer Lösung aus 30 mg Dansylhydrazinin 4,5 ml Methanol und 50 µl DMSO übersprüht und für 2 Minuten auf 190 °C er-wärmt. G. Morlock konnte auf diese Weise Acrylamid auf der Platte derivatisieren[48]. Das fluoreszierende Acrylamidderivat kann auf Kieselgel mit Essigsäureethy-lester als Fließmittel abgetrennt werden.

7.1.3.2 Reaktionen mit SH-, NH- und OH-aktiven GruppenDansylchlorid (Abb. 7.9) reagiert auf der DC-Platte selektiv mit NH- und OH-Grup-pen, kann aber wegen seiner blauen Eigenfluoreszenz nicht postchromatographischverwendet werden. Zur Analyse von ˇ-Blockern, Östriol, Morphin, Morphinderi-vaten und Albuminen wird eine Lösung von 5 mg Dansylchlorid in 1 ml Acetonauf die Probeauftragung aufgesprüht und im Anschluss mit einer 8 %igen wässri-gen Na2CO3-Lösung übersprüht. Zur Neutralisation der Auftragung kann die Plattefür 10 min in NH3-Atmosphäre gestellt werden. Dann wird für 15 min auf 120 °Cerhitzt, und im Anschluss kann die Platte entwickelt werden [1, 49].

Werden primäre und sekundäre Amine oder Phenole derivatisiert, kann das Über-sprühen mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung entfallen [39, 49]. Carbamat- und


O

4321

OO

O

OF

N N

N

CI

NOO O

O O

CI

NO2NO2NO2

Abb. 7.10 Strukturen von 1 Fluorescamin, 2 2,4-Dinitrofluorobenzol, 3 NBD-chlorid und 4 3,5-Dinitrobenzoylchlorid

Harnstoffherbizide wie Metoxuron, Diuron und Linuron müssen vor der Deriva-tisierung hydrolysiert werden. Dazu wird die Auftragung mit wenigen Mikrolitereiner 1-molaren wässrigen NaOH-Lösung übersprüht und – je nach Probe – etwa 20bis 30 min zwischen 20 °C und 180 °C hydrolysiert. Im Anschluss wird mit Dansyl-Reagenz (10–20 mg Dansylchlorid, gelöst in 10 ml Aceton) übersprüht. Eventuellmuss bis zur vollständigen Reaktion eine Zeit lang gewartet werden, oder die Plattewird kurz erwärmt [1].

Mit der Verbindung Dansylazirin (Abb. 7.9) steht ein Reagenz zur Verfügung,das nur mit der SH-Gruppe fluoreszierende Verbindungen bildet [50, 51]. Als Rea-genzlösung werden 10 mg Dansylaziridin in 1 ml Methanol gelöst. Der pH-Wert derProbe wird auf 8,2 (Phosphatpuffer) eingestellt und die Probe mit der Dansylaziri-dinlösung übersprüht, dann mit einer Glasplatte abgedeckt und 60 min bei 60 °Cgehalten [50, 51].

Die Verbindung Fluorescamin (Abb. 7.10) eignet sich zur In-situ-Derivatisie-rung von Aminosäuren bzw. primären und sekundären Aminen. Zur Herstellung desReagenzes werden 0,3–1,0 mg Fluorescamin in 1 ml Aceton gelöst. Die Probeauf-tragung wird mit dem Reagenz übersprüht. Die Reaktion startet beim Übersprühenmit einer Pufferlösung im pH-Bereich von 8–10. Nach einer Reaktionszeit von30 min im Dunkeln kann die Platte entwickelt werden. Die Fluorescaminlösung istim Kühlschrank mehrere Monate haltbar [49, 52].

Zur Derivatisierung von Aminosäuren und Peptiden auf der Platte kann auch dieVerbindung 2,4-Dinitrofluorobenzol (DNFB-Reagenz, Abb. 7.10) verwendet wer-den [53]. Das Reagenz ist ebenfalls geeignet, Alkohole unter Abspaltung von HFin Phenylether umzuwandeln. Zur Derivatisierung wird die Auftragung der Probemit einer 4 %igen Lösung in Aceton übersprüht. Die Platte wird im Anschluss für10 bis 40 min auf 190 °C erwärmt [1, 53]. Das Reagenz kann nicht auf Aminophaseeingesetzt werden.

Neben 2,4-Dinitrofluorobenzol wird in der Literatur zur Derivatisierung von Al-koholen auf der Auftragung eine Reihe von Reagenzien beschrieben. Eines derwichtigsten ist das NBD-chlorid (Abb. 7.10). 7-Chlor-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-dia-zol-Reagenz (NBD-chlorid-Reagenz) ist ein vielseitiges Reagenz, das zur Deriva-


H3CN

1 2

O

O O

O S N

N

NHS NH

H3C

H2N

CH3 CH3

Abb. 7.11 Strukturen von 1 Dansylsemicadaverin und 2 Dansylpiperizid

tisierung von Phenolen, Mercaptanen, primären und sekundären Aminen, Amino-säuren und Peptiden sowie Sulfonamiden und Alkaloiden eingesetzt werden kann[1, 24]. Als Reagenzlösung werden 10–20 mg NBD-Cl in 10 ml Ethanol, Methanoloder Acetonitril gelöst. Die Derivatisierungsreaktion läuft im Alkalischen ab. Dahermuss die Probeauftragung zuerst mit einer alkalischen Lösung (200 mg NaHCO3

oder 0,5 g NaOH, gelöst in 10 ml Wasser) übersprüht werden. Im Anschluss wirddie trockene Auftragung mit der Reagenzlösung übersprüht und gegebenenfalls er-wärmt [1, 49]. Es entstehen meist farbige Verbindungen, die unter Anregung bei365 nm gelb bis gelbgrün fluoreszieren. Aminoplatten können nicht benutzt wer-den. Das Reagenz ist aber auf Kieselgel- und RP-Phasen einsetzbar [1].

Die Substanz NBD-Cl wird als Ausgangsverbindung zur Synthese der schon er-wähnten Reagenzien 4-Hydrazino-7-nitrobenzofurazan (NBDH) und N-Methyl-4-hydrazino-7-nitrobenzofurazan (MNBDH) eingesetzt. Zur Derivatisierung von Al-dehyden und Ketonen auf der Platte werden 10 mg MNBD-Hydrazin oder 10 mgMethyl-NBD-Hydrazin in 1 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit einem Trop-fen konz. H3PO4 versetzt. Die Reaktion läuft in der Regel bei Raumtemperatur ab[B. Spangenberg unveröffentlichte Ergebnisse].

Zur Derivatisierung von Alkoholen auf der Auftragung ist das Reagenz 3,5-Di-nitrobenzoylchlorid (Abb. 7.10) ebenfalls geeignet [1]. Als Reagenzlösung wird1,0 g 3,5-Dinitrobenzoylchlorid in 7,5 ml p-Xylol und 1 ml Tetrahydrofuran gelöst.Alkohole reagieren bei 185 °C direkt auf der Platte. Nach der Reaktion wird einReagenzüberschuss mit 10 %iger NaOH-Lösung hydrolysiert [54].

7.1.3.3 Reaktionen mit CarbonsäurenCarbonsäuren wie Sorbin-, Benzoesäure oder C6- bis C24-Fettsäuren können mitDansylpiperizid und Dansylsemicadaverin (Abb. 7.11) zu fluoreszierenden Deriva-ten umgesetzt werden [1, 24, 55].

10 mg Dansylpiperazid oder Dansylsemicadaverin werden in 1 ml Methanol ge-löst. Nach dem Übersprühen der Probe muss zum Binden des bei der Reaktion frei-werdenden Wassers mit 1 %iger N,N 0-Dicyclohexyl-carbodiimid-Lösung in Etherübersprüht werden. Hier muss vorsichtig gearbeitet werden, da diese Verbindungkanzerogen ist. Die Platte wird getrocknet und kann dann entwickelt werden [55].


7.1.3.4 Reaktionen mit Alkoholen und AminenIsocyanate, Phenylisocyanat wie auch o-Nitrophenylisocyanat [1, 54] reagieren mitAlkoholen und Aminen ebenso wie mit Aminosäuren zu definierten Produkten.Naphthylisocyanat ist – ebenso wie Fluorescein-Isothiocyanat – ein selektives Rea-genz auf Alkohole und Amine. Beide Reagenzien bilden mit Alkoholen und Ami-nen fluoreszierende Urethane bzw. Harnstoffe oder Thioharnstoffe. Zur Deriva-tisierung mit Naphthylisocyanat werden zum Analyten die äquimolare Menge anTriethylendiamin, gelöst in Xylol, und ein 30-fach molarer Überschuss an Naphthy-lisocyanat gegeben. Primäre und sekundäre Alkohole werden für 30 min bei 95 °Cund tertiäre Alkohole für 2 Stunden bei 140 °C gehalten. Die Reaktionslösung wirdunbehandelt auf die DC-Platte aufgetragen [56]. Die Derivatisierung mit Naphthyi-socyanat ist spezifisch für Alkohole und Aminosäuren und führt zu gelben, nichtfluoreszierenden Verbindungen.

Zur Derivatisierung mit Fluorescein-Isothiocyanat werden 10 mg Reagenz in1 ml Xylol gelöst und mit 100 µl Triethylamin versetzt. Die Probe wird auf die Platteaufgetragen und mit der Lösung übersprüht. Um das freiwerdende Reaktionswasserzu binden, muss anschließend mit einer 1 %igen N,N 0-Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung in Diethylether übersprüht werden. Eventuell ist es nötig, die DC-Platteabzudecken und für mehrere Minuten auf 100 °C aufzuheizen. Beide Reagenzlö-sungen müssen stets frisch hergestellt werden. Fluorescein-Isothiocyanat wird in

HO

HO O O

HN NH

S

HO O

R

O O

COO–Na

+

COO–Na

+

N=C=S

+

NH2

R

O

OH

Abb. 7.12 Reaktion von Fluorescein-Isothiocyanat mit einer Aminosäure unter Bildung einesfluoreszierenden Thioharnstoffderivates


Abb. 7.13 Struktur von Nin-hydrin

O

OH

OH

O

der modernen Aminosäureanalytik zur Bestimmung von Aminosäuren in niedrigs-ten Konzentrationen verwendet (Abb. 7.12), da die Reaktionsprodukte sehr starkfluoreszieren.

7.1.4 Reagenz im Fließmittel

Primäre Aminosäuren können mit Ninhydrin (Abb. 7.13) bei 80 °C zu einem rotenFarbstoff umgesetzt werden. Sekundäre Aminosäuren wie Prolin reagieren zu ei-nem gelben Produkt. Eine elegante Art der Derivatisierung ist das Zumischen desfarblosen Ninhydrins zum Laufmittel.

Die Platte wird nach der Trennung für 10 Minuten auf 80 °C erhitzt, um Nin-hydrin mit den getrennten Aminsäuren reagieren zu lassen. Diese Art der Deri-vatisierung ist besonders für quantitative Bestimmungen geeignet, da Ninhydringleichmäßig in der stationären Phase verteilt wird. Man muss allerdings daraufachten, dass der Wasseranteil im Laufmittel nicht zu hoch ist, da sonst die Deriva-tisierungsreaktion, eine Reaktion unter Wasserabspaltung, gehemmt wird. Für Cel-luloseplatten hat sich das Laufmittelgemisch n-Butanol/Essigsäure/H2O (4 + 1 + 1,V / V) (Abb. 3.9) bewährt. Zur Aminosäurefärbung sind nur wenige mg Ninhydrinpro 10 ml Laufmittel nötig.

7.2 Chemische Umsetzungen nach der Trennung(postchromatographische Derivatisierungen)

Die Fülle der mehr als 300 bekannten Reagenzien für eine postchromatographi-sche Derivatisierung kann hier nicht annähernd aufgelistet werden [1, 2, 9, 57]. Diewichtigsten Reagenzien werden im Folgenden vorgestellt. Auswahlkriterien sinddie Giftigkeit von Reagenzien, das Anwendungsspektrum, die Empfindlichkeit derDetektion und die Anzahl der benötigten Reaktionsschritte. Verfahren, bei deneneine spezifische Detektion erst durch unterschiedliche Reaktionen mit mehrerenTauchvorgängen erfolgt, wurden ebenfalls nicht berücksichtigt, denn hier summie-ren sich die Fehler der einzelnen Schritte zu Werten auf, die in der quantitativen DCnicht mehr akzeptabel sind. Zur qualitativen Bestimmung einzelner Gruppen sindsolche Reaktionskaskaden sicherlich gut geeignet. Eine hervorragende Übersicht

7.2 Chemische Umsetzungen nach der Trennung 187

Abb. 7.14 Automatisches Sprühgerät der Fa. DESAGA. (Mit freundlicher Genehmigung der Fa.Biostep, Jahnsdorf)

bietet das Buch von H. Jork, aus dem die meisten der folgenden Vorschriften unddie wichtigsten Zusammensetzungen der Tauchreagenzien entnommen sind [1].

Ein generelles Problem der chemischen Derivatisierung ist, dass einige Chemi-kalien giftig oder gar krebserregend sind und dementsprechend vorsichtig gehand-habt werden müssen. Ein Beispiel ist die lange unterschätzte Giftigkeit von Natri-umnitroprussid (Na2[Fe(CN)5NO]). Eine Reihe von Reagenzien zur Bestimmungvon Aldehyden, Aminen, Alkaloiden, Harnstoff und Thioharnstoff, Sulfonamiden,Zucker sowie zur Erkennung von –S–S- und –SH-Gruppen nutzt diese Verbindung.Diese Reagenzien werden nicht vorgestellt. So weit wie möglich wurde auch auf dieVerwendung bekannter Kanzerogene wie Benzidin verzichtet. Ist dies nicht mög-lich, wird auf die kanzerogene Wirkung hingewiesen. Auf die Verwendung vonPikrinsäure wurde ebenfalls verzichtet, da Pikrate bekanntermaßen zu Explosionenneigen.

In der Literatur wird häufig das Ansprühen mit der Reagenzlösung empfohlen.Für quantitative Messungen ist vom Ansprühen der Platten jedoch abzuraten, dadie Reagenzlösung nur ungleichmäßig auf der Platte verteilt wird. Wenn gesprühtwerden soll, sollte dies automatisiert geschehen. Der Vorteil eines automatischenSprühsystems besteht nicht nur in der Gleichmäßigkeit des Sprühvorgangs; derAnwender ist gleichzeitig vor unvermeidlichen Lösungsmitteldämpfen geschützt.Außerdem verbraucht das System nur wenige Milliliter Sprühlösung, was insbeson-dere bei sehr giftigen oder sehr teuren Reagenzien von Vorteil ist. Abbildung 7.14zeigt solch ein computergesteuertes Sprühsystem, das mit 2 ml Reagenzlösung eine10 cm × 10 cm große Platte gleichmäßig besprühen kann. Die Auftragung mehre-rer Lösungen nebeneinander oder hintereinander ist mit diesem System problemlosmöglich.

Steht ein automatisch arbeitendes Sprühsystem nicht zur Verfügung, empfiehltsich statt des Handsprühens ein Plattentauchen (Abb. 7.15), da hierbei das Reagenzgleichförmig auf die Platte gebracht wird. Die Platte sollte aber auf keinen Fall per


Abb. 7.15 Tauchapparatur (der Fa. L. Baron). a Vor dem Tauchvorgang, b beim Tauchen

Hand in die Reagenzlösung getaucht werden, da sonst die Gefahr von Schlierenbil-dung besteht.

Beim Tauchen zur quantitativen Auswertung sollte man immer auf eine auto-matische Taucheinrichtung zurückgreifen! Entsprechende Geräte werden von meh-reren Firmen angeboten. Ein Nachteil dieser Tauchsysteme ist ihr relativ großerBedarf an Reagenzlösung. Für eine 10 cm × 10 cm große Platte werden 45 ml undfür eine 10 cm × 20 cm große Platte etwa 90 ml Lösung benötigt. Die Konzentrationder Tauchlösungen liegt etwa um den Faktor 10 bis 20 unter der einer Sprühlö-sung [1]. Alle postchromatographischen Reagenzien in diesem Kapitel sind – wennnicht anders ausgeführt – für einen Tauchenvorgang berechnet.


Oft wird nach dem Tauchen zur vollständigen Umsetzung eine Reaktionstem-peratur von 80 bis 200 °C benötigt. Hierzu reicht ein Trockenschrank völlig aus.Bequemer in der Handhabung sind allerdings die von verschiedenen Herstellernangebotenen Heizplatten.

Eine Alternative zum Sprühen ist ein inerter Polymerschwamm, der das Reagenzaufsaugen kann. Dieser wird dann unter leichtem Druck auf die Platte gedrückt undüberträgt das Reagenz gleichmäßig [58].

Postchromatographische Derivatisierungen auf DC-Platten werden in der Um-weltanalytik, der forensischen Medizin, der Pharmaanalytik und hier besonders imBereich der Phytoanalytik angewendet. Das Anfärben von Pflanzeninhaltsstoffendirekt auf der Platte und die Bestimmung anhand der farbigen Anordnung cha-rakteristischer Zonen sind weit verbreitet. Hier wird die DC auch in Zukunft dieMethode der Wahl bleiben [59]. Das klassische Buch zur Phytoanalytik von Wag-ner und Bladt [9] listet in seiner zweiten Ausgabe von 1996 über 50 Reagenzienzur Identifizierung von mehr als 250 Pflanzenarten auf. Dabei entfallen 70 % allerIdentifizierungsreaktionen auf fünf Reagenzien. An erster Stelle steht das Vanillin-Reagenz mit 19 %, gefolgt vom Dragendorff-Reagenz mit 16 % und dem Natur-stoffreagenz nach Neu mit 15 % der Nennungen. Das Anisaldehyd- und das KOH-Reagenz folgen etwas abgeschlagen mit 11 und 9 %. Dies ist ein sicherer Belegdafür, dass im Laboralltag die über 300 bekannten Reagenzien in der Regel nichtbenötigt werden, die Substanzen also auch nicht vorrätig zu halten sind. Die folgen-den Ausführungen beschränken sich daher auf die Reagenzien, die in der Praxis amhäufigsten angewendet werden.

7.2.1 Reagenzien zur Verstärkung der Fluoreszenz

In der Literatur wird eine Reihe von Tauchreagenzien beschrieben, die eine Fluo-reszenz des Analyten verstärken. Häufig handelt es sich dabei um dünnflüssigesParaffin, das im Verhältnis (3 + 7, V / V) in CH2Cl2 gelöst ist. In der Literatur sindnoch eine Reihe anderer, in der Regel lipophiler Verbindungen aufgeführt, die eben-falls diese Fluoreszenzverstärkung zeigen [1]. Bei polaren Analyten hat sich auchdas Tauchen in methanolischer oder wässriger Lösung bewährt. Dazu werden 2 gdes Natriumsalzes von Alkylsulfonsäuren (z. B. n-Hexansulfonat oder n-Octansul-fonat) in 40 ml Methanol oder Wasser gelöst [60]. Sehr effektiv bei polaren Ana-lyten wirkt auch eine 10 %ige Lösung von Polyethylenglykol 600 (PEG 600) oderPolyethylenglykol 4000 (PEG 4000) in Methanol oder Aceton (1 + 1, V / V), eineLösung von 20 % Triethanolamin in 2-Propanol oder von Triton-X-100 in Chlo-roform (1 + 4, V / V). Verstärkungen der Fluoreszenz auf Kieselgelplatten um denFaktor 10–300 wurden beschrieben [1]. Auf RP-18-Platten ist dieser Effekt eben-falls beobachtbar. Hier erreicht man allerdings nur Fluoreszenzverstärkungen umden Faktor 2 [60].

Der Effekt all dieser Mischungen ist einfach zu erklären. Hat ein fluoreszierendesMolekül Kontakt zur Plattenoberfläche, kann die durch Bestrahlung aufgenomme-ne Energie über einen Plattenkontakt strahlungslos abfließen. Lipophile Moleküle


können sich zwischen den gelösten Analyten und die Plattenoberfläche schiebenund so eine strahlungslose Deaktivierung verhindern [60]. Daher ist für den Erfolgder Fluoreszenzverstärkung eher die Art des Lösungsmittels und nicht die Art derVerbindung entscheidend, die nach dem Tauchen auf der Platte verbleibt. Der Effektist besonders auf Kieselgelplatten und bei niedrigen Analytkonzentrationen zu be-obachten. Auf RP-18-Platten zeigen solche lipophilen Fluoreszenzverstärker kaumeinen Effekt, da die RP-18-Belegung eine strahlungslose Deaktivierung in der Re-gel verhindert. Daher ist eine Fluoreszenz auf RP-18-Phasen meist auch viel stärkerals auf Kieselgelplatten.

Umgekehrt wird bei lipophilen, nichtfluoreszierenden Molekülen wie Fett-säuren, Cholesterin usw. häufig empfohlen, die DC-Platte in fluoreszierendeReagenzlösungen zu tauchen, um fluoreszierende Zonen zu erhalten [1]. Beschrie-ben wurden Lösungen von Rhodamin B, Rhodamin 6 G, Nilrot (alle mit 0,5–2 mgin 100 ml Methanol/Wasser) (8 + 2, V / V) gelöst, Pinakryptolgelb, 2,7-Dichlorfluo-rescein, Primulin (Direct Yellow 7) oder Acridinorange (0,1–1 mg, gelöst in 100 mlMethanol), Berberin (0,2–1 mg in 100 ml Methanol) oder 8-Anilino-naphthalen-1-sulfonsäure (ANS-Reagenz : 100 mg, gelöst in 40 ml 0,1-molarer NaOH und 57 mleiner wässrigen Citronensäurelösung, die pro Liter 21 g Citronensäure und 8 gNaOH enthält). Gerade das ANS-Reagenz zeigt, im Gegensatz zu unpolaren Lö-sungsmitteln, in Wasser so gut wie keine Fluoreszenz. Auch hier wird das Reagenzbei Kontakt mit der Plattenoberfläche strahlungslos deaktiviert und fluoresziert nurin der Probezone, da der Analyt den Plattenkontakt behindert.

7.2.2 pH- und Redox-Indikatoren

Zum Anfärben von Säuren oder Basen werden oft pH-Indikatoren verwendet, diebei Kontakt zum Analyten ihre Farbe ändern. Bromkresolgrün wird häufig zur Fär-bung von Säuren und Basen benutzt. Eine Reagenzlösung kann aus 20 mg Brom-kresolgrün hergestellt werden, das in 10 ml Ethanol gelöst und mit 1 ml 0,1-molarerNaOH- oder 1 ml 0,2 %iger wässriger Citronensäurelösung versetzt wird.

Säuren wechseln in Anwesenheit von 2,6-Dichlorphenol-indophenol (Tillmans-Reagenz, 40 mg gelöst in 100 ml Ethanol) ihre Farbe von Blau nach Rot.

Verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe ändern pH-abhängig ihre Fluoreszenz [1].Acridinorange (20 mg in 100 ml Ethanol) ändert pH-abhängig im Bereich von 8–10seine Fluoreszenz von Grüngelb nach Gelb, 1-Naphthol (100 mg in 100 ml Ethanol)ändert seine Fluoreszenzfarbe von farblos nach Blaugrün (im pH-Bereich von 7–9), Umbelliferon (10 mg in 100 ml Ethanol) von Orange nach Blau (pH 6,5–8),Thioflavin (100 mg in 100 ml Ethanol) von farblos nach Grün, Acridin (10 mg in100 ml Ethanol) von Grün nach Blau (pH 4,5–6) und Resorufin (10 mg in 100 mlEthanol) von farblos nach Orange (pH 4–6).

Stark reduzierende Substanzen wie Ascorbinsäure können mit einer 2,6-Dichlor-phenol-indophenol-Lösung oder mit Tetrazolblau (je 40 mg in 100 ml Methanol)identifiziert werden. Dichlorphenol-indophenol ändert seine Farbe von Blau (oxi-dierte Form) zu farblos (reduzierte Form), die bei 365 nm grün fluoresziert [1].


Tetrazolblau ändert durch Reduktion seine Farbe von farblos zu blauviolett fluo-reszierend, allerdings nur nach einer Behandlung mit NH3-Dampf.

Schwach reduzierende Verbindungen wie aromatische Amine, Phenole, pheno-lische Steroide, Enamino-Ketone, Enol-Ketone, Thiosulfate, Isothiocyanate sowieThioharnstoffderivate lassen sich mit Eisen(III)-chlorid/Kaliumhexacyanoferrat(III)-Reagenz (Barton-Reagenz) detektieren. Der Reaktion liegt die Bildung von BerlinerBlau (Turnbull-Blau) zugrunde. Der blaue Farbstoff bildet sich aus Hexacyanofer-rat(III) mit Eisen(II)-Salzen (oder aus Hexacyanoferrat(II) mit Eisen(III)-Salzen)nach folgender Formel:

ŒFe.CN/6�3� C Fe2C ! ŒFe3CFe2C.CN/6�� :

Zur Herstellung werden 18 ml einer roten Blutlaugensalz-Lösung (80 mgK3[Fe(CN)6] in 18 ml Wasser) mit 2 ml einer FeCl3-Lösung (40 mg in 2 ml Wasser)und 1 ml konz. Salzsäure (36 %ig) gemischt und mit Methanol zu 100 ml aufgefüllt.Reduzierende Zonen bilden Eisen(II)-Ionen und färben sich im Zusammenspiel mitEisen(III)-Ionen blau. Das Reagenz ist zwei Wochen stabil und kann auf allenstationären Phasen eingesetzt werden [1].

Mit dem gelben Vanadium(V)-Schwefelsäure-Reagenz (Mandelin-Reagenz)werden reduzierend wirkende Stoffe wie Kohlenhydrate und Derivate, Glykole,reduzierende Carbonsäuren, Steroide, Antioxidantien, Vitamine, Phenole, aroma-tische Amine usw. oxidiert. Dabei wandelt sich das gelbe Vanadyl(V)-Ion in dasblaue Vanadyl(IV)-Ion um. Zur Herstellung der Tauchlösung werden 600 mg Am-moniummonovanadat (NH4

+)3VO4 in 47,5 ml Wasser gelöst und vorsichtig mit2,5 ml konz. H2SO4 versetzt. Die trockene Platte wird 2 s getaucht und für 5 minauf 100–120 °C erhitzt. Reduzierend wirkende Substanzen zeigen blaue Zonen aufhellgelbem Untergrund. Das Reagenz kann auf Kieselgel- und Celluloseschichteneingesetzt werden und ist längere Zeit haltbar.

Durch Wasserstoffperoxid (H2O2) werden viele aromatische Carbonsäuren (wieauch Thiabendazol) in fluoreszierende Derivate umgewandelt, die bei 365 nm blaufluoreszieren. Da Wasserstoffperoxid ein starkes Oxidationsmittel ist, werden dieCarbonsäuren wahrscheinlich oxidiert. Der Reaktionsmechanismus ist aber nichtgeklärt. Zur Herstellung des Reagenzes werden 1–3 ml 30 %ige H2O2-Lösung mitWasser zu 100 ml aufgefüllt. Zur Umsetzung mit Thiabendazol werden noch 10 mlEssigsäure zur Mischung gegeben. Die Platte wird für 2 s getaucht und für wenigeMinuten mit intensivem UV-Licht (365 nm) bestrahlt.

7.2.3 Universell anwendbare Reagenzien (Charring-Reagenzien)

In der Literatur wird eine Reihe von unspezifisch reagierenden Gemischen aufge-führt, die mit kohlenstoffhaltigen Substanzen bei 80–120 °C unter „Verkohlung“reagieren. Diese im Englischen charring reagents genannten Mischungen zerstö-ren die Molekülstruktur des Analyten, ohne Kieselgel- oder Al2O3-Schichten zubeschädigen. RP-Phasen oder Schichten mit organischem Binder färben sich aller-


dings, je nach Organikanteil, dunkel und können häufig nicht benutzt werden. Amhäufigsten wird Schwefelsäure in Kombination mit Mangan-, Kupfer- oder Molyb-dänsalzen eingesetzt [1, 2].

Folgende Mischungen des Manganreagenzes haben sich bewährt: 100 mg MnCl2 �2 H2O werden in 30 ml Wasser gelöst, mit 30 ml Methanol verdünnt und anschlie-ßend vorsichtig mit 2 ml konz. H2SO4 gemischt. Die trockene Platte wird für 2 sgetaucht und ca. 10 min bei 120 °C gehalten, bis sich braune Zonen bilden.

Das Kupferreagenz stellt man am besten folgendermaßen her: 3 g Cu(II)-Ace-tat werden in 100 ml 8 %iger H3PO4 gelöst und mit 100 ml einer Mischung ausEssigsäureanhydrid und konz. H2SO4 (9 + 1, V / V) gemischt. Auch hier wird dietrockene Platte für 2 s getaucht und im Anschluss auf 120 °C erwärmt. Es bildensich braunschwarze Zonen.

Phosphormolybdänsäure (H3Mo12O40P) oxidiert die meisten organischen Sub-stanzen unter Bildung eines blaugrauen Farbstoffes. Das Reagenz wird aus 250 mgPhosphormolybdänsäure hergestellt, gelöst in 50 ml Methanol. Die getauchte Plattewird so lange auf 120 °C gehalten, bis sich blaugraue Flecken bilden.

7.2.4 Aldehyd-Universalreagenzien

In der Literatur ist eine ganze Reihe von Aldehyden beschrieben, die im Saurennucleophil an –NH2 bzw. –CH2-Gruppen angreifen und C = C-Doppelbindungenoder N = C-Doppelbindungen (Schiff’sche Basen) ausbilden. Die Schiff’schen Ba-sen (Azomethin-Verbindungen) zeigen dabei meist eine Fluoreszenz. Die Reakti-vität hängt sowohl vom Aldehyd selbst, aber auch von der verwendeten Säure ab.Am reaktivsten sind erwartungsgemäß Formaldehyd und Furfural. Weniger reaktivsind aliphatische Aldehyde wie Glucose und Thymol. Mischungen mit Schwe-felsäure sind reaktiver als solche mit HCl oder Phosphorsäure. Generell solltenalle Mischungen mit Schwefelsäure unter Eiskühlung hergestellt werden. WerdenAlkohole als Lösungsmittel benutzt, muss mit der Bildung karzinogener Sulfate ge-rechnet werden. Daher sollten diese Reagenzien auf keinen Fall als Sprühlösungenverwendet werden. Alle Aldehydreagenzien haben nur eine begrenzte Lagerstabi-lität und sollten nicht mehr benutzt werden, wenn sie sich leicht rotviolett gefärbthaben.

Das reaktivste Aldehydreagenz ist eine Mischung aus Formaldehyd und Schwe-felsäure. (Marquis-Reagenz). Es werden 0,2 ml Formaldehydlösung (37 %ig) mit9 ml Methanol und 1 ml konz. H2SO4 vorsichtig gemischt. Die Platte wird kurzgetaucht (2 s) und 20 min bei 120 °C gehalten. Es lassen sich aromatische Kohlen-wasserstoffe, ˇ-Blocker, Alkaloide, Amphetamine und Tannine anfärben.

Das wichtigste Aldehydreagenz ist ohne Zweifel das Vanillin-Reagenz. Vanil-lin (3-Hydroxy-4-Methoxybenzaldehyd, Abb. 7.17) wird in der Mischung mit ver-schiedenen Säuren (H2SO4, HCl, H3PO4) benutzt. Für das Schwefelsäurereagenzwird 100 mg Vanillin in 9 ml Ethanol (96 %ig) oder 9 ml Diethylether gelöst und mit1 ml konz. Schwefelsäure versetzt. Das Salzsäurereagenz wird analog mit 1 ml HCl(36 %ig) hergestellt. Zur Herstellung des Phosphorsäurereagenzes werden 100 mg


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Abb. 7.16 Trennung von Essigsäureethylester-Extrakten verschiedener Islandmoose (CetrariaIslandica) auf HPTLC-Si60 F254 mit dem Fließmittel Aceton/Methanol/Ameisensäure/Toluol(5 + 5 + 10 + 80, V / V), Kammersättigung, gefärbt mit Anisaldehyd/Schwefelsäure. Bahnen 1–6 verschiedene Islandmoos-Extrakte, 7 Kaffeesäure, 8 Anethol, 9 Usnic-Säure, 10 und 11 Is-landmoos-Extrakte, 12 Eichenmoos, 13 Baumbart-Moos, 14 Baumbart-Tinktur. (Mit freundlicherGenehmigung durch CAMAG, Muttenz, Schweiz)

Vanillin in 5 ml Ethanol (96 %ig) gelöst und dann 5 ml konz. Phosphorsäure zuge-geben. Das Reagenz mit HCl färbt Phenole, Catechine und Alkaloide. Das Schwe-felsäurereagenz färbt Steroide, etherische Öle, Terpene, Carotinoide, Phenole, Ca-techine, Flavonoide, Ginsenoside, Fettsäuren und Antibiotika.

Das Anisaldehydreagenz wird häufig zur phytoanalytischen Untersuchung ver-wendet (Abb. 7.16). Zur Herstellung des Anisaldehydreagenzes werden 50 µL 4-Methoxybenzaldehyd (Anisaldehyd, Abb. 7.17) zu einer Mischung aus 1,0 ml Es-sigsäure und 10 ml Methanol oder Diethylether gegeben. Dann werden vorsichtig0,5 ml konz. H2SO4 zugemischt (Ekkert-Reagenz). Auf der getauchten Platte wan-deln sich die Analyte bei 100–110 °C innerhalb von 5 bis 10 Minuten zu farbigenZonen um. Es werden Antioxidantien, Steroide, Prostaglandine, Kohlenhydrate,Phenole, Glycoside, Saponine, etherische Öle, Antibiotika und Mykotoxine zu rotenund blauen Farbstoffen umgesetzt. Eine Mischung aus 50 mg 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd (Abb. 7.17) mit 0,5 ml konz. H3PO4 (85 %ig) in 10 ml Essigsäurekann ebenfalls verwendet werden (EP-Reagenz). Bei der Verwendung von 4-(Dime-thylamino)-benzaldehyd muss die Platte nach dem Tauchen für 20 min auf 120 °Cerwärmt werden. Es werden Terpene und Sesquiterpene gefärbt.

Mit 100 mg 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd, 0,5 ml HCl (35 %ig) in 10 mlMethanol (Ehrlich-Reagenz) können auch Sulfonamide, Mykotoxine, Pestizide,Sprengstoffe, Alkaloide und Pyridinderivate angefärbt werden.

Das van-Urk-Reagenz wird folgendermaßen hergestellt: 100 mg 4-(Dime-thylamino)-benzaldehyd werden in 4,5 ml Wasser und 0,5 ml konz. H2SO4 gelöstund mit Wasser zu 10 ml aufgefüllt. Nach dem Tauchen wird die Platte für 20 min


O H

O

O

O H HH

H

H

OO

OO

NOH

CH3

CH3 CH3H3C

1 2 3 4 5

Abb. 7.17 Strukturen von 1 Vanillin, 2 Anisaldehyd, 3 4-(Dimethylamino)-benzaldehyd, 4 Zimt-aldehyd und 5 Furfural

bei 120 °C gehalten. Es lassen sich primäre Amine, Alkaloide, Pharmazeutika,Indole und Carbamat-Pestizide anfärben.

Die Carbonylverbindungen 2-Methoxybenzaldehyd und Pyridoxal (je 200 mg in35 ml Methanol + 5 ml 85 %ige H3PO4) zeigen ebenfalls gute Resultate. Auch hiersollte die Platte für einige Minuten auf 120 °C erwärmt werden.

Sehr interessant sind Umsetzungen mit Zimtaldehyd (Abb. 7.17), da dieser sehrreaktiv ist und auch mit reaktionsträgen NH2-Gruppen reagiert. Zur Herstellung desZimtaldehydreagenzes werden 80 µL Zimtaldehyd in 40 ml Aceton gelöst. Im An-schluss werden 2,4 ml 85 %ige H3PO4 zugegeben. Die Platte wird für 2 s getauchtund 10 min auf 130 °C erwärmt. Methyl- und Ethylcarbamat sowie Acrylamidkönnen auf Kieselgel mit dem Fließmittel Methyl-tert-butylether/Cyclohexan(7 + 3, V / V) getrennt werden und zeigen fluoreszierende Zonen. Die Nachweis-grenzen liegen im unteren ng-Bereich. Das Reagenz ist nur für zwei Tage haltbarund kann nicht auf Aminoplatten benutzt werden.

Glucose in Kombination mit Schwefelsäure reagiert auch mit weniger reaktivenAmidgruppen und kann z. B. zur Färbung von Carbamatestern eingesetzt werden.Zur Herstellung des Glucosereagenzes werden 300 mg Glucose in 40 ml Wassergelöst. Anschließend wird 1 ml konz. H2SO4 zugegeben. Das Reagenz ist für Wo-chen stabil und macht als wässrige Lösung keine Probleme bei der Entsorgung. DiePlatte wird für 2 s getaucht und anschließend für 10 min bei 80–120 °C gehalten.Carbamatesterzonen färben sich braun und fluoreszieren unter UV-Licht (366 nm).Glucose in Kombination mit Phosphorsäure (2 g Glucose in 40 ml Wasser und 10 ml85 %ige H3PO4 gelöst und mit Methanol zu 80 ml aufgefüllt) färbt aromatischeAmine schon bei 45 °C.

In der Literatur werden als reaktive Aldehyde neben Glucose noch Furfural(Abb. 7.17), Thymol und o-Phthalaldehyd genannt. (Zur Präparation der Reagenz-lösungen werden je 0,5 g Thymol oder Phthalaldehyd in 45 ml Methanol gelöst undmit 5 ml konz. H2SO4 versetzt). Furfural ist sehr reaktiv und kann mit Carbama-testern reagieren. Die getrocknete Platte wird zuerst in einer 1 %igen Furfurallö-sung (1 % in Aceton) getaucht und im Anschluss (ohne Trocknungsschritt) in eine10 %ige Schwefelsäurelösung (ebenfalls in Aceton) getaucht. Gegebenenfalls muss


leicht erwärmt werden. Beide Lösungen können auch gemischt (1 + 1, V / V) ein-gesetzt werden. Das Furfuralreagenz ist allerdings nur einen Tag lang stabil. DurchErhitzen von Zucker in Gegenwart einer Säure entstehen Furfuralderivate. Daherkann die Reaktion des Furfuralreagenzes auch zur Bestimmung von Zuckern oderSäuren herangezogen werden.

Im Anilin-Aldose-Reagenz wird das gleiche Reaktionsprinzip zur Detektion vonorganischen Säuren verwendet. Es werden 2 ml Anilin (frisch destilliert) in 18 mlEthanol gelöst. In einer zweiten Lösung werden 2 g Glucose in 20 ml Wasser gelöst.Unmittelbar vor Gebrauch werden je 20 ml der beiden Lösungen gemischt und mit1-Butanol zu 100 ml aufgefüllt [1]. Unter Säureeinwirkung (10 min bei 90–140 °C)entstehen farbige Zonen. Für eine empfindliche photometrische Detektion ist dasReagenz allerdings nicht geeignet, da die Nachweisgrenzen im oberen ng-Bereichliegen.

Reaktionen von Ketonen als aktive Reagenzgruppe sind so gut wie nicht be-kannt. Eine Ausnahme ist Anthron (9,10-Dihydro-9-oxoanthrazen). Es reagiert mitKetozuckern zu gelben Zonen. Das Reagenz wird aus 300 mg Anthron in 10 ml Es-sigsäure und 20 ml Ethanol gemischt. Man gibt 3 ml 85 %ige Phosphorsäure zu und1 ml Wasser. Das Reagenz ist im Kühlschrank für Wochen stabil.

7.2.5 CH- und NH-aktive Reagenzien

Phosphorsäure kann, ebenso wie auch andere starke Mineralsäuren, Mono- undDisaccharide, Oligosaccharide wie auch Zuckeralkohole und Glycoside in Fur-furalderivate umwandeln. Furfuralderivate reagieren mit Anilin in der Wärme zuSchiff’schen Basen. Auch können Furfuralderivate unter Wärmeeinwirkung zuFormaldehyd abgebaut werden, das mit Diphenylamin und Furfuralverbindun-gen unter Wasserabspaltung kondensiert. Aus beiden Reaktionen entstehen grauebis graublaue Zonen, die unter UV-Bestrahlung bei 366 nm eine blaue Fluoreszenzzeigen [1]. Dies ist der chemische Hintergrund des Anilin-Diphenylamin-Phosphor-säure-Reagenzes. Auf Kieselgel können z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Lac-tose, Maltose und Raffinose mit dem Fließmittel Acetonitril/Wasser/Phosphatpuffer(16 + 3 + 2, V / V) gut getrennt werden. Eine fluorometrische Auswertung nach ei-ner Reagenzbehandlung ermöglicht Zuckerbestimmungen im 10-ng-Bereich [1].Zur Herstellung des Reagenzes werden 1 g Anilin und 1 g Diphenylamin in 70 mlMethanol gelöst und mit 10 ml konz. H3PO4 versetzt. Die trockene Platte wird ge-taucht und auf 80–120 °C erwärmt. Es können alle Plattenarten verwendet werden.Das Reagenz ist bei 4 °C einige Tage haltbar. Anilin und Diphenylamin sind alskanzerogen eingestuft. Das Reagenz sollte daher nicht zum Sprühen verwendetwerden.

Ketocarbonsäuren können nach dem gleichen Prinzip mit o-Phenylendiamin alsHCl-Addukt in fluoreszierende Derivate umgewandelt werden. Zur Herstellung derReagenzlösung werden 1 g o-Phenylendiamin-HCl in 8 ml Wasser gelöst, zu 50 mlmit Ethanol aufgefüllt und vorsichtig unter Kühlen mit 1,5 ml konz. H2SO4 versetzt.


H3C

OH

OH OH

OH OH

321

Abb. 7.18 Strukturen von 1 Orcinol, 2 1,3-Naphthalendiol und 3 1-Naphthol

Cellulose- oder Kieselgelplatten werden für 2 s getaucht. Vorsicht, das Reagenz istgiftig und kanzerogen.

Zur Herstellung des Anilin-Phthalsäure-Reagenzes werden 0,9 ml Anilin und1,66 g Phthalsäure in 100 ml Aceton gelöst. Die trockene DC-Platte wird für eineSekunde getaucht und dann für 20–30 Minuten auf 80–130 °C erwärmt. Mono- undOligosaccharide erscheinen als gefärbte und teilweise auch fluoreszierende Zonenauf weißem Untergrund [1].

Aktivierte aromatische CH-Gruppen können mit Aldehyden zu komplexen, far-bigen Strukturen reagieren. Dabei bildet sich aus zwei Protonen, die von aktivier-ten CH-Bindungen abgespalten werden, und dem Sauerstoff der AldehydgruppeWasser. Mit dem Orcinol-H2SO4-Reagenz reagieren fast alle Aldehydzucker unterFurfuralbildung zu blauvioletten Farbstoffen. Es werden 250 mg Orcinol (1,3-Dihy-droxy-5-methylbenzol, Abb. 7.18) und 100 mg FeCl3 in 95 ml Ethanol gelöst. Dannwerden 5 ml konz. H2SO4 zugemischt. Nach kurzem Tauchen und 15-minütigemErwärmen bei 100 °C färben sich die Zonen.

1,3-Naphthalendiol reagiert (Abb. 7.18) in ähnlicher Weise mit Zuckern unterAusbildung von farbigen Zonen. Das Reagenz wird aus 200 mg 1,3-Naphthalendi-ol, gelöst in 90 ml Ethanol, und 10 ml 85 %iger Phosphorsäure hergestellt. Die DC-Platte wird für 2 s in die Reagenzlösung getaucht und im Anschluss für 5–10 Minu-ten auf 100–105 °C erhitzt. Das 1-Naphtholreagenz reagiert in ähnlicher Weise. Eswerden 150 mg 1-Naphthol (Abb. 7.18) in 10 ml Ethanol gelöst und dann mit 1,6 mlkonz. H2SO4 versetzt. Anschließend gibt man 40 ml Ethanol und 0,4 ml Wasser da-zu.

Das Dimedon-Phosphorsäure-Reagenz reagiert mit Ketozuckern unter Wasser-abspaltung. Die Reagenzlösung wird hergestellt aus 300 mg Dimedon (5,5-Dime-thylcyclohexan-1,3-dion), gelöst in 90 ml Ethanol, und 10 ml 85 %iger Phosphor-säure. Nach dem Tauchen wird die Platte für 15–20 Minuten auf 110 °C gebracht.Es zeigen sich blaue Zonen, wenn die Platte mit UV-Licht (366 nm) bestrahlt wird[57]. Das Dimedonreagenz reagiert bei Raumtemperatur mit Formaldehyd.

Das Indandionreagenz wird aus 0,5 mg 1,3-Dioxoindan in 20 ml Wasser und0,3 ml 36 %iger HCl hergestellt. Carotinoidaldehyde reagieren bei Raumtemperatur[57].

Die Verbindungen 4-Aminohippursäure, 2-Aminophenol, 4-Anisidin und o-Phe-nylendiamin (Abb. 7.19) besitzen alle eine -NH2-Gruppe, die mit Carbonylverbin-dungen fluoreszierende Schiff’sche Basen bilden können.


NH2

NH

HO

O

O

NH2

OH

NH2 NH2

NH2

CH3O

41 2 3

Abb. 7.19 Strukturen von 1 4-Aminohippursäure, 2 2-Aminophenol, 3 4-Anisidin und 4 o-Phe-nylendiamin

Eine 0,3 %ige (w/v) Lösung von 4-Aminohippursäure in Ethanol (Aminohippur-säurereagenz) kann ohne Zumischung einer Säure verwendet werden. Aldehydzu-cker bilden charakteristisch fluoreszierende Zonen, nachdem die Platte für 10 minauf 140 °C gehalten wurde. Das 2-Aminophenolreagenz (300 mg 2-Aminophenolwerden in 95 ml Ethanol gelöst und mit 5 ml 85 %iger Phosphorsäure versetzt)reagiert in ähnlicher Weise mit reduzierend wirkenden Zuckern unter Ausbildungbrauner Zonen [57]. Für das 4-Anisidinreagenz werden 100 mg 4-Anisidin und100 mg Phthalsäure in 50 ml Ethanol gelöst. Nach dem Tauchen wird die DC-Plattefür 10 min auf 100 °C erwärmt. Ketosäuren reagieren in derselben Art und Weisemit dem o-Phenylendiaminreagenz. Sie bilden heterocyclische aromatische Stick-stoffverbindungen (2-Chinoxalinon-Derivate), indem beide Carbonylgruppen unterWasserabspaltung mit je einer Aminogruppe reagieren. Für das o-Phenylendiamin-reagenz werden 1 g o-Phenylendiamin � HCl in 8 ml Wasser gelöst. Anschließendwerden 50 ml Ethanol und 1,5 ml konzentrierte H2SO4 zugegeben. Die Reaktiondauert 20 min bei 120 °C. Alle aromatischen Amine sollten mit Vorsicht behandeltwerden, da sie alle kanzerogen sind.

Phenylhydrazin, Isonicotinsäurehydrazid und 2,4-Dinitrophenylhydrazin rea-gieren ebenfalls mit Carbonylverbindungen unter Ausbildung farbiger Substanzen.Carbonylgruppen sind sehr reaktiv und können mit Hydrazinen zu Hydrazonenumgesetzt werden, die dann den Farbstoff bilden. Zur Herstellung der Reagenz-lösungen werden 50 mg Phenylhydrazin oder 50 mg 2,4-Dinitrophenylhydrazin in15 ml Ethanol gelöst und mit 15 ml H3PO4 (85 %ig) gemischt. Die trockene Plat-te wird für 2 s getaucht und 10–20 min auf 110 °C gehalten. Aldehyde und Ketoneergeben mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin gelbe bis orangegelbe Zonen auf farblosemGrund. Die analoge Reaktion mit Phenylhydrazin führt zu fluoreszierenden Verbin-dungen. Das Reagenz kann auf Kieselgel- und Celluloseplatten eingesetzt werden.Die Reagenzlösungen sind mehrere Tage haltbar.

Zur Herstellung der Isonicotinsäurehydrazid-Lösung werden 100 mg Pyridin-4-carbonsäurehydrazid in 9 ml Ethanol gelöst und mit 1 ml Essigsäure versetzt. Dietrockene Platte wird 10 s getaucht. Mit Ketosteroiden (wie Testosteron) bilden sich


Abb. 7.20 Reaktion von 4-Aminoantipyrin mit Phenol H3C

H3C

H3C

H3C

N

NH2

N

N

NN

O

O

O

OH

+

gefärbte Hydrazone, die unter UV-Licht bei 366 nm fluoreszieren. Das Reagenzkann auf Kieselgel- und Celluloseplatten eingesetzt werden und ist im Kühlschrankmehrere Tage haltbar.

Harnstoff reagiert mit der Carbonylgruppe von Ketosen zu blauen Verbindungen.Das Harnstoff-HCl-Reagenz wird hergestellt, indem 5 g Harnstoff in 20 ml 2-mo-larer HCl gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt werden. Nach dem Tauchenwird die Platte für 10 min auf 100–120 °C erwärmt [1].

In diese Gruppe der NH-reagierenden Reagenzien gehört auch der Ammoni-ak, der aus Ammoniumhydrogencarbonat wasserfrei gewonnen werden kann. DasReagenz wird unter dem Kapitel Gasreaktionen behandelt. Auch die Reaktion vonCarbonylverbindungen auf Aminophasen fällt unter dieses Schema.

7.2.5.1 4-Aminoantipyrin-Reagenz (Emerson-Reagenz)Das Emerson-Reagenz reagiert mit einer NH2-Gruppe an aktivierten Aromaten. DieReaktion ist relativ spezifisch für Phenole, die in para-Stellung nicht substituiertsind (Abb. 7.20). Zur Färbung mit der ersten Reagenzlösung wird eine 2 %ige Lö-sung aus 4-Aminoantipyrin (4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on) inEthanol über die DC-Platte gesprüht. Im Anschluss wird die Platte mit einer wässri-gen 8 %igen Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung besprüht. Dann wird die Platte ineine mit NH3-Dampf gesättigte Entwicklungskammer gestellt. Phenole zeigen roteZonen auf hellgelbem Untergrund.

7.2.5.2 2,6-Dibromchinon-4-chlorimid (Gibbs-Reagenz)Das Gibbs-Reagenz wird zur Detektion von in para-Stellung unsubstituierten Aro-maten bzw. NH-aktiven Verbindungen eingesetzt. Dabei läuft die in Abb. 7.21 dar-gestellte Reaktion ab.

Es reagieren Phenole, Antioxidantien, primäre und sekundäre Amine, aromati-sche Kohlenwasserstoffe, Indole und N-haltige Heterocyclen wie Barbiturate und


Abb. 7.21 Reaktion desGibbs-Reagenzes mit Phenol

Br

Br

Br

Br

N

O

NCI

OH

OH

HCI––

+

HO

O

Nukleotide sowie Phenoxyessigsäure-Herbizide zu unterschiedlich gefärbten Ver-bindungen. Das Reagenz bindet unter Kopplung an einer freien p-Stellung einesAromaten bzw. an einer aktivierten NH-Gruppe. Die Reaktion ähnelt der Umset-zung von 4-Aminoantipyren mit Phenolen. Zur Herstellung der Reagenzlösungwerden 100 mg 2,6-Dibromchinon-4-chlorimid in 10 ml mit NaHCO3 gesättigtemDimethylsulfoxid gelöst. Anschließend wird die Lösung mit Dichlormethan oderEthanol zu 100 ml aufgefüllt. Die Platte wird für 5 s in die Lösung getaucht unddann für wenige Minuten auf 110 °C erhitzt. Das Reagenz kann auf Kieselgel-,Aluminiumoxid-, Cellulose-, Amino-, Polyamid- und Kieselgurschichten einge-setzt werden. Die Reagenzlösung muss immer frisch angesetzt werden.

Die dem Gibbs-Reagenz analoge Verbindung, das 2,6-Dichlorchinon-4-chlo-rimid, reagiert vorzugsweise mit Anilinen und Phenolen, die in p-Stellung nichtsubstituiert sind, wie Capsaicin [62]. Mit Phenol entsteht der blaue Farbstoff 2,6-Dichlorphenol-indophenol (Tillmans-Reagenz). Die Herstellung der Reagenzlö-sung und deren Anwendung erfolgen analog dem Gibbs-Reagenz. Beide Imidekönnen sich exotherm zersetzen und sollten nur in kleinen Mengen im Kühlschrankgelagert werden [1]!

7.2.5.3 MBTH-Reagenz (Besthorn-Reagenz)3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon-Hydrochloridsalz (MBTH � HCl) ist ein emp-findliches Reagenz auf Aldehyde und Ketone. Die Reagenzlösung wird hergestelltaus 0,5–1,0 g MBTH � HCl, gelöst in 100 ml Methanol oder einer Mischung aus Me-thanol und Wasser (1 + 1, V / V). Vor Gebrauch muss diese Lösung filtriert werden.Diese Tauchlösung ist mehrere Tage stabil. Die getrocknete Platte wird 1 s getauchtund 2 Stunden auf 110–120 °C erhitzt. MBTH reagiert mit Carbonylverbindungenunter Ausbildung blauer Zonen auf hellgelbem Untergrund (Abb. 7.22). Die Zonenfluoreszieren gelb bis orange, wenn sie mit UV-Licht bei 365 nm bestrahlt werden.

Die getauchte Platte färbt sich nach einigen Tagen an der Luft blau, da MTBHdurch Sauerstoff oxidiert wird (Abb. 7.22). Das Reagenz kann auf Kieselgel, Cel-


N

N

N

N

N

N

NH2

N

N

R

N

S

R

O

O2

S

SS

NH2

NH2

CH3CH3

CH3

CH3

+

+

+

Abb. 7.22 Reaktion von MBTH mit Aldehyden und Oxidation durch Sauerstoff zum blauenMBTH-Kation

O

O

+

O

N

OHNH2

SO3

–Na

+

Abb. 7.23 Reaktion von 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat mit Anilin

lulose und Amidplatten eingesetzt werden. [1]. MBTH kann auch mit Phenolenreagieren, wenn die getauchte Platte noch in eine Cer(IV)-sulfat-Lösung getauchtwird. Es bilden sich rote Zonen auf blauem Grund [1]. Eine densitometrische Aus-wertung ist daher schwierig.

7.2.5.4 1,2-Naphthochinon-4-sulfonsäure-Reagenz (Folin-Reagenz)Das Folin-Reagenz färbt Aminosäuren, Peptide, aromatische und aliphatische Ami-ne, Piperidinderivate, Mutterkornalkaloide sowie phenolische aromatische Sulfide,Sulfoxide und Sulfone.

Als Reagenzlösung werden 500 mg 1,2-Naphthochinon-4-sulfonsäure in 30 mlWasser gelöst und mit 65 ml Ethanol und 5 ml Essigsäure versetzt. Für Aminosäu-ren und aliphatische Amine werden 200 mg 1,2-Naphthochinon-4-sulfonsäure in100 ml Natriumcarbonatlösung (5–10 %ig) gelöst [1]. Diese Lösung sollte immerfrisch hergestellt werden, während die Essigsäure-Tauchlösung einige Tage haltbarist.

Primäre Amine und Substanzen mit aktiven Methylengruppen reagieren zu in-tensiv gefärbten chinoiden Derivaten (Abb. 7.23). Auch Prolin und Hydroxyprolinreagiern mit dem Folin-Reagenz.


Abb. 7.24 Struktur von 7-Chlor-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-chlorid)

CI

N

O

OO

N

N

Die Nachweisgrenze für Aminosäuren liegt im unteren ng-Bereich. Bis auf dieAminopropylphase können alle Plattentypen (auch Polyamidplatten) verwendetwerden.

7.2.5.5 7-Chlor-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-Reagenz(NBD-chlorid-Reagenz)

NBD-chlorid (Abb. 7.24) ist ein vielseitiges Reagenz, das zur Derivatisierung vonPhenolen, Mercaptanen, primären und sekundären Aminen, Aminosäuren und Pep-tiden sowie Sulfonamiden und Alkaloiden eingesetzt werden kann [1]. Das Reagenzfluoresziert selbst nicht und kann daher als Tauchreagenz genutzt werden.

Als Reagenzlösung werden 40–80 mg NBD-Cl in 40 ml Ethanol, Methanol oderAcetonitril gelöst. Die Derivatisierungsreaktion muss im Alkalischen ablaufen, dadas bei der Reaktion freigesetze HCl abgefangen werden muss. Die Platte wirdnach der Trennung daher zuerst in eine alkalisch reagierende Natriumacetatlösunggetaucht. Dazu werden 10 g Natriumacetat in 20 ml Wasser gelöst und mit 40 mlMethanol verdünnt. Nach dem ersten Tauchen wird die Platte getrocknet. Die tro-ckene Platte wird für 1 s in die Reagenzlösung getaucht. Es entstehen meist farbigeZonen, die unter Anregung bei 365 nm gelb bis gelbgrün fluoreszieren. Aminoplat-ten können nicht benutzt werden. Das Reagenz ist auf Kieselgel- und RP-Phaseneinsetzbar [1].

7.2.6 CH- und NH-aktive Reagenzien

7.2.6.1 Universalreagenz auf Naturstoffe (Neu-Reagenz)Mit dem Naturstoff-Reagenz nach R. Neu setzen sich Flavonoide, Kohlenhydra-te, Anthocyanidine und Zimtsäuren zu farbigen Verbindungen um. Der Mechanis-mus ist unbekannt. Diskutiert wird die Bildung zwitterionischer Borate [1]. SchöneFarben ergeben sich beim Betrachten unter UV-Licht (256 nm und 356 nm), wieAbb. 7.26 zeigt.

Zur Herstellung der Reagenzlösung werden 200 mg Diphenylborsäure-2-ami-noethylester (Abb. 7.25) und 1 g Polyethylenglykol-4000 (PEG 4000) in 20 ml Me-thanol gelöst. Die Platte wird 1 s in die Mischung getaucht. Die Reagenzlösung istim Kühlschrank mehrere Tage haltbar.


Abb. 7.25 Struktur vonDiphenylborsäure-2-amino-ethylester (Neu-Reagenz)

H2N

O

B

7.2.6.2 Diphenylborsäureanhydrid-Salicylsäure-Reagenz(DOOB-Reagenz)

Mit dem DOOB-Reagenz setzen sich primäre Amine, Aminosäuren, Antibiotika,Hydrazine und substituierte Aniline zu blau fluoreszierenden Zonen (bei 356-nm-Anregung) um. Zur Herstellung der Reagenzlösung werden 35 mg Diphenylborsäu-reanhydrid und 25 mg Salicylaldehyd in 100 ml CH2Cl2 gelöst. Dabei bildet sich dieVerbindung 2,2-Diphenyl-1-oxa-3-oxonia-2-borata-naphthalin (DOOB, Abb. 7.27).Die trockene Platte wird 2 s in die Reagenzlösung getaucht und anschließend 10–20 min auf 110 °C erwärmt.

Die Reaktion ist sehr empfindlich, z. B. können Aminosäuren mit niedrigerenNachweisgrenzen detektiert werden als mit Fluorescamin [1]. Die Derivate sindnoch nach Wochen auf der Platte stabil, wenn diese im Dunklen gelagert wurde.Das Reagenz kann auf Kieselgel-, Aluminiumoxid- und RP-Schichten eingesetztwerden. Amino- oder Polyamidschichten sind nicht geeignet. Die Reagenzlösungist auch im Kühlschrank bei 4 °C nur kurze Zeit haltbar [63].

7.2.6.3 Tetraphenylborat-ReagenzEine Variante dieser Reaktion ist die Umsetzung auf der Platte unter UV-Licht miteiner wässrigen Lösung von Natrium-Tetraphenylborat (Kalignost®) und Salzsäure.

Abb. 7.26 Auftrennungen von Sumpf-Schachtelhalm-Extrakten (Equisetum palustre) auf Kiesel-gel mit einer Mischung aus Essigsäureethylester, Dichlormethan, Ameisensäure, Essigsäure undWasser (100 + 25 + 10 + 10 + 11, V / V) als Fließmittel, angefärbt mit dem Neu-Reagenz und unterUV-Licht bei 365 nm aufgenommen. ([9], mit freundlicher Genehmigung von CAMAG, Muttenz,Schweiz)


OB B

H

O

2

O

O+

–H2O

OH

+

–B

Abb. 7.27 Bildung von 2,2-Diphenyl-1-oxa-3-oxonia-2-borata-naphthalin (DOOB) aus Diphe-nylborsäure und Salicylaldehyd

Die DC-Platte wird für 2 s in eine Lösung, für die 50 mg Natrium-Tetraphenyl-borat (Na[B(C6H5)4]) in 50 ml Wasser gelöst und 50 µl einer 36 %igen HCl-Lösungzugesetzt wurde, getaucht. Das Reagenz ist bei Raumtemperatur für 8 h stabil. Dienasse Platte wird für 5 min unter intensives UV-Licht bei 256 nm gelegt und imAnschluss für 10 min bei 365 nm. Es können quaternäre Ammoniumverbindungenangefärbt werden. Das Reagenz wandelt Paraquat, Diquat, Mepiquat, Chlorome-quat, und Difenzoquat in blau fluoreszierende Zonen um. Mepiquat, Chlormequatund Difenzoquat fangen nach 5 Minuten Bestrahlung mit UV-Licht bei 256 nm anzu fluoreszieren. Weitere 10 Minuten Bestrahlung bei 365 nm wandelt auch die Pa-raquat- und Diquatzonen in fluoreszierende Bereiche um. Die Nachweisgrenzenaller fünf quartären Ammoniumverbindungen liegen im unteren Nanogrammbe-reich pro Zone. Ebenfalls bestimmt werden können Codein, Pilocarpin und Papa-verin. Auch Pflanzenextrakte wie Primulae-flos-Extrakte können gefärbt werden(Abb. 7.28). Wird die Platte anschließend in eine Lösung aus Ethylenglykol undMethanol (1 + 1, V / V) getaucht, verstärkt sich die Fluoreszenz um den Faktor zwei.Die fluoreszierenden Zonen bleiben für Monate stabil, wenn die Platte im Dunkelngelagert wird [64, 65].

7.2.6.4 Alizarin als BorsäurereagenzDie vorgestellten Borsäurereagenzien reagieren offensichtlich mit einer OH-Grup-pe des Analyten unter Bildung fluoreszierender Borsäureester. Die Reaktion kannumgekehrt auch zur Detektion von Borsäure und deren Derivate verwendet werden[67]. Zur Durchführung stellt man eine Lösung aus 12 mg Alizarin in 50 ml Acetonher und taucht die getrocknete Platte für 2 s bei Raumtemperatur in die Lösung. DiePlatte wird so lange getrocknet, bis sie rosa erscheint. Man beobachtet fluoreszie-rende Zonen unter UV-Licht bei 366 nm. Borsäurederivate mit zwei OH-Gruppenergeben gelb fluoreszierende Zonen, Bosäurederivate mit einer OH-Gruppe (z. B.das Neu-Reagenz) zeigen orange fluoreszierende Zonen. Bei der Reaktion der Bor-säurereagenzien mit Alizarin bilden sich Borsäureester (Abb. 7.29) [67].


Abb. 7.28 Trennung eines Schlüsselblumenblüten-Extraktes (Primulae-flos-Extrakt) auf Kiesel-gel mit dem Fließmittel Essigsäureethylester/Essigsäure/Ameisensäure/Wasser (100 + 11 + 11 +26, V / V). Bahn 1 und 2 wurden mit dem Tetraphenylborat-Reagenz, Bahn 3 und 4 mit Neu-Rea-genz und Bahn 5 und 6 mit 1 %igem Diphenylborsäureanhydrid in Methanol gefärbt

Abb. 7.29 Bildung von fluoreszierenden Borsäureestern mit Alizarin

7.2.7 Basenreagenzien und Säurereagenzien

7.2.7.1 BasenreagenzienMit starken Basen wie KOH oder NaOH reagieren Cumaringlykoside, Anthrachi-nonglykoside, Xanthonglykoside, Dalberinglykoside, Thiophosphorsäure-Pestizi-de, Nitroarylester, Acetylcholin, Sennoside, Steroide so wie Dinitrophenylhydra-zone zu unterschiedlich gefärbten Verbindungen, die im langwelligen UV-Lichthäufig intensiv fluoreszieren. Eine Fluoreszenz ist immer dann zu beobachten, wennvon einem fluoreszierenden Grundgerüst Reste, die nichtbindende Elektronen be-sitzen, hydrolytisch abgespalten werden.

Zur Herstellung der Tauchlösung werden 1 g KOH (oder NaOH) in 3–10 ml Was-ser gelöst und mit Ethanol zu 25 ml aufgefüllt. Die trockene Platte wird 2 s in eineder beiden Reagenzlösungen getaucht und anschließend 5–30 min auf 100–200 °Cerhitzt. Oft ist es von Vorteil, wenn die Schicht mit einer Glasplatte abgedecktist. Es resultieren farbige Zonen auf farblosem Untergrund, die unter langwelli-gem UV-Licht (365 nm) häufig fluoreszieren. Die Laugen können auf Kieselgel-,Cellulose und Polyamidschichten eingesetzt werden und sind – gut verschlossen –lagerstabil.


Abb. 7.30 Struktur vonChloramin T

O+O

S N–CI Na

CH3

7.2.7.2 SäurereagenzienSäuren sind ebenfalls in der Lage, hydrolytisch Reste mit nichtbindenden Elek-tronen von einer chemischen Grundstruktur abzuspalten. Meistens wird dazuSchwefelsäure benutzt. Es können Steroide und steroidähnliche Strukturen wieˇ-Sitosterol, Hydrocortisonacetat, Prednisolon, Testosteron, Progesteron, 19-No-rethindron, Estron, 17˛-Ethinylestradiol und Estriol zu farbigen Zonen umgesetztwerden. Auch Alkaloide, Saponine, Lipide, Mykotoxine, Vitamin-A-Säure undAntibiotika reagieren [1]. Die Nachweisgrenze für 17 ˛-Ethinylestradiol liegt bei5 ng pro Zone [67].

Die entwickelte Platte wird für 10 min auf 110 °C erhitzt und dann sofort für 1 sin eine Mischung aus H2SO4 (98 %ig) und Wasser (1 + 49, V / V) getaucht. Nachdem Tauchen wird die Platte erneut für 10 Minuten auf 110 °C erwärmt [67].

7.2.8 Chloramin-T-Reagenzien

In der Literatur ist eine ganze Reihe von Chloramin-T-Reagenzien beschriebenworden. Chloramin T wird dabei zu Chlorierungs- oder Oxidationsreaktionen her-angezogen. Chloramin T ist ein weißes Pulver, das etwa 25 % aktives Chlor enthält(Abb. 7.30). Eine Reaktion kann entweder im Sauren oder im Basischen stattfinden.Auf jeden Fall sollte man die getrocknete Platte zuerst in die Chloramin-T-Lösungund dann erst in eine Säure- oder Basenlösung tauchen.

Zur Anwendung als Chloramin-T-Säurereagenz werden 2,5 g Chloramin T in20 ml Wasser gelöst und mit Methanol zu 50 ml aufgefüllt. Als Säurelösung wer-den 2,5 ml konzentrierte Schwefel- oder Salzsäure vorsichtig mit 47,5 ml Methanolgemischt.

Purinderivate wie Coffein, Theophyllin, Theobromin werden zu purpurrotenFarbstoffen oxidiert. Zur Reaktion wird die getrocknete Platte für 2 s in die Chlo-ramin-T-Lösung getaucht und im Anschluss 10 min in HCl-Atmosphäre gehaltenoder in die HCl-Methanol-Lösung getaucht. Die feuchte Platte wird für wenigeMinuten auf 110 °C erwärmt, um freies Chlor zu entfernen. Dann wird die Plattein NH3-Atmosphäre gestellt und gegebenenfalls erneut auf 110 °C erwärmt [1]. Esentstehen rote Zonen, die blau und gelb fluoreszieren. Steroide und Sterine wieCholesterin, Östrogene oder Testosteron ergeben gelbbraune Zonen, die unter UV-Licht (365 nm) gelb fluoreszieren.


Digitalisglykoside reagieren mit dem Chloramin-T-Trichloressigsäure-Reagenz(Jensen-Reagenz) zu gelb oder blau fluoreszierenden Verbindungen. Zur Bereitungder Reagenzmischung werden 0,2 g Chloramin T mit 1 ml Wasser, 9 ml Methanolund 5 g Trichloressigsäure gemischt (in dieser Reihenfolge). Die Lösung wird mitDichlormethan zu 50 ml aufgefüllt. Die trockene DC-Platte wird für 2 s getauchtund anschließend für 5–30 min auf 100–150 °C erhitzt [1].

Phenole und Flavonoide reagieren mit dem Chloramin-T-Natriumhydroxid-Rea-genz zu gelb- bzw. purpurfarbenen Derivaten, die im langwelligen UV-Licht fluo-reszieren. Zur Bereitung der Reagenzlösung werden 2,5 g Chloramin T in 25 mlWasser gelöst. Dann werden 250 mg festes NaOH zugegeben und nach dem Lösenmit 25 ml Methanol verdünnt. Die getrocknete Platte wird für 2 s getaucht, für 5 minbei Raumtemperatur gehalten und für weitere 5 min auf 120 °C erwärmt [1].

Chloramin-T-Reagenzlösungen können auf allen Plattenarten eingesetzt werden.Alle Reagenzlösungen sind im Kühlschrank für mehrere Tage haltbar. Das Jensen-Reagenz bleibt bei 4 °C sogar für Wochen stabil.

7.2.9 Diazotierungsreaktionen

Eine häufig angewendete Derivatisierungsreaktion ist die Umsetzung von Aminenund Phenolen mit Diazoniumverbindungen zu farbigen Kupplungsprodukten. DieDiazoniumsalze werden zweckmäßigerweise als stabile Diazonium-Kationen ein-gesetzt. Es können damit komplizierte Bildungsreaktionen umgangen werden, beidenen die Diazoniumsalze aus Amin und Nitrit erst auf der Platte hergestellt wer-den müssen. Das Arbeiten mit nitrosen Gasen zum Zwecke einer Diazotierungkann so vermieden werden. Üblicherweise werden die Verbindungen Echtschwarz-salz K, 4-Nitrobenzo-diazonium-tetrafluoroborat oder Echtblausalz B eingesetzt.Am häufigsten wird in der Literatur die Verwendung von Echtblausalz B beschrie-ben. Trotzdem haben sowohl das Bratton-Marshall-Reagenz als auch das Pauly-Reagenz ihre Berechtigung. Bei beiden wird in situ aus Sulfanilsäure durch Diazo-tierung mit NO+ ein Diazofarbstoff hergestellt.

75 mg Echtblausalz B (fast blue salt B, Abb. 7.31) oder 150 mg Echtschwarz-salz K (fast black salt K, Abb. 7.31) bzw. 4-Nitrobenzo-diazonium-tetrafluoroboratwerden in 10 ml Wasser gelöst und anschließend mit Methanol zu 40 ml aufgefüllt.20 ml dieser Lösung werden unter Rühren zu einer Mischung aus 55 ml Methanolund 25 ml CH2Cl2 gegeben. Es ist Vorsicht geboten, denn die Diazotierungsreagen-zien sind möglicherweise kanzerogen und sollten nicht versprüht werden.

Zur Durchführung wird die getrocknete Platte für 10 min in NH3-Atmosphä-re gestellt und dann für 5 s getaucht. Manchmal werden bessere Ergebnisse er-zielt, wenn 75–150 mg Diazotierungsverbindung direkt in 0,1 %iger methanolischerNaOH oder KOH gelöst werden. Es können Phenole, Gerbstoffe, Cumarine, Fla-vonole, Cannabinoide, Phenolcarbonsäuren und Amine detektiert werden [1]. DieEchtblausalz-B-Lösung ist maximal einen Tag haltbar. Es können Kieselgel-, Alox-,Cellulose-, Polyamid- und RP-Platten verwendet werden.


Abb. 7.31 Struktur des Echt-blausalzes B (fast blue saltB) und Echtschwarzsalzes K(fast black salt K)

Eine Variante der Diazotierungsreaktion wird beim Bratton-Marshall-Reagenzverwendet. Das Reagenz dient zur Bestimmung primärer aromatischer Amine wiez. B. Benzodiazepinen. Zur Umsetzung wird die getrocknete Platte nach der Tren-nung in eine Doppeltrogkammer gestellt. In die zweite Troghälfte werden 5 ml einerwässrigen 20 %igen NaNO2-Lösung eingefüllt, die mit 10 Tropfen konzentrierterSalzsäure gemischt werden. Auf diese Art werden in der geschlossenen Kammer ni-trose Gase erzeugt, die mit primären aromatischen Aminen Diazoniumkationen bil-den. Nach 10 min Reaktionsdauer wird die Platte (im Abzug!) entnommen, kurz ineinem Luftstrom von den nitrosen Gasen befreit und 1 s in eine Lösung getaucht, die1 g N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydrochlorid (gelöst in 10 ml Wasser) enthältund mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt wurde [1]. Es erscheinen bei Raumtempera-tur gefärbte Zonen auf weißem Untergrund. Eine Reihe von Benzodiazepinen ohnefreie -NH2-Gruppe kann durch eine vorgeschaltete Hydrolyse des Benzodiazepinszur Reaktion gebracht werden. Dazu wird die Platte in Gegenwart konzentrierterSalzsäure für 30 min bei 110 °C über die Gasphase hydrolysiert, bevor die Diazo-tierung erfolgt [1, 68, 69].

Das Pauly-Reagenz detektiert Phenole, aromatische Amine und Heterocyclen.Zur Herstellung werden 750 mg Sulfanilsäure in 40 ml Wasser gelöst. Dann gibtman 5 ml HCl (36 %ig) zu. Man kühlt die Lösung auf 0 °C ab und gibt 750 mgNaNO2, gelöst in 5 ml Wasser, dazu. Diese Lösung ist für drei Tage bei Raumtem-peratur stabil [2]. Unmittelbar vor dem Tauchen wird die Lösung mit der gleichenMenge einer 10 %igen Na2CO3-Lösung gemischt und dann getaucht. Es entstehenrote Zonen auf farblosem Untergrund.

7.2.10 Wurster-Reagenz und Iod-Stärke Reagenz

Zur Bestimmung von aromatischen Aminen, Polynitro-Aromaten, Triazinen, Mela-min, Acrylamid, Nulleotidderivaten, Urethan, Aminosäuren sowie Anilin-, Carba-mat-, Harnstoff- und Organophosphorsäure-Pestiziden kann sowohl das Iod-Stärke-also auch das Wurster-Reagenz verwendet werden. Das Prinzip dieser Reagenzi-en ist nicht das spezifische Färben einer Verbindung. Vielmehr wird ausgenutzt,


Abb. 7.32 Bildung vonWursters Rot aus N,N-Di-methyl-1,4-phenylendiamin

H3C H3CCH3 CH3N N+

O

NH2 NH2

Oxidation

Abb. 7.33 Struktur vonWursters Blau H3C

H

CI–

CI–

HN+

N+

H3C CH3

CH3

dass Chlorgas spezifisch mit Stickstoffgruppen im Molekül reagiert. Diese aktivenChlorderivate wirken oxidieren, und diese Eigenschaft zeigen beide Reagenziendurch eine Farbänderung an.

Zur Durchführung wird die getrocknete Platte für wenige Minuten in eineChloratmosphäre gestellt und anschließend für 1 min im Kaltluftstrom vom Chlor-gas vollständig befreit [1]. Chlorgas kann schnell durch das Mischen von 10 mlKMnO4 (300 mg in 10 ml Wasser) mit 10 ml 32 %iger HCl erzeugt werden. Nachder Chlorumsetzung wird die Platte 2 s in die Reagenzlösung getaucht. Ähnlich wiePeroxide oxidieren die durch die Chlorgasbehandlung entstehenden Halogenderi-vate fast aller Verbindungen mit Stickstoffatomen zu farbigen Verbindungen. Diesekönnen bei 608 nm vermessen werden. Die Nachweisgrenzen liegen zwischen 5und 100 ng pro Zone.

7.2.10.1 Wurster-ReagenzienDie Verbindung N,N-Dimethyl-1,4-phenylendiamin (N,N-DPDD-Reagenz) wirddurch Peroxide zu Wursters Rot, einer radikalischen Semichinondiimin-Verbin-dung, oxidiert (Abb. 7.32).

Ein ähnlich reagierendes Reagenz lässt sich aus o-Toluidin und Kaliumiodid her-stellen. Es werden jeweils 50 mg o-Toluidin in 1 ml Essigsäure sowie 200 mg KI in1 ml Wasser gelöst, gemischt und zu 50 ml mit Wasser aufgefüllt. Das Reagenzreagiert wie Wursters Blau und wird auch so eingesetzt. Die Mischung ist im Kühl-schrank für zwei Wochen stabil. o-Toluidin sollte mit Vorsicht verwendet werden,denn es ist kanzerogen.

Wird die Verbindung N,N,N0,N0-Tetramethyl-1,4-phenylendiamin benutzt, ent-steht durch Peroxide das analoge Radikal Wursters Blau, ebenfalls eine Semichi-nondiimin-Verbindung (Abb. 7.33).

Zur Herstellung der Reagenzlösungen werden 100 mg N,N,N0,N0-Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid (TPDD-Reagenz) in 5 ml Methanol und 4 mlWasser gelöst zu dem 1 ml Eisessig zugegeben wurde. Oft reicht zur Reaktion aucheine Lösung von 500 mg TPDD aus, die in 100 ml Aceton gelöst wurde. Die Plat-ten werden 2 s in die Reagenzlösung getaucht. Das Reagenz kann auf Kieselgel-,Aluminiumoxid- und Kieselgurschichten eingesetzt werden.


7.2.10.2 Iod-Stärke-ReagenzÄhnlich wie das Wurster-Blau-Reagenz reagiert eine Mischung aus 250 mg KI in25 ml Wasser, gemischt mit 750 mg Stärke (nach Zulkowsky), gelöst in 25 ml Was-ser. Die Mischung wird mit 30 ml Ethanol versetzt. Das Reagenz ist für einen Tagstabil und kann auf allen Platten als Sprühreagenz eingesetzt werden. Als Tauch-reagenz eignet sich eine Mischung aus 600 mg KI in 15 ml Wasser, 600 mg Stärkein 15 ml Wasser und 18 ml Ethanol.

Nach der Umsetzung mit Chlorgas wird die Platte für 1 s in die Iod-Stärke-Lö-sung getaucht. Die Färbung entsteht unmittelbar durch Oxidation des Iodids zu Iod,welches mit der Stärke den blaubraunen Farbstoff bildet, der zwischen 400 und500 nm detektiert werden kann.

Das Wurster-Blau-Reagenz ist stabiler als das entsprechende Wurster-Rot-Rea-genz oder die o-Toluidinverbindung. Trotzdem sollte eine getauchte Platte zügigvermessen werden, da die blaue Farbe innerhalb von Stunden verblasst. Stabiler inder Farbe, bei gleichen Nachweisgrenzen, ist das Iod-Stärke-Reagenz. Die beidenWurster-Reagenzien zeigen unterschiedliche Reaktionseigenschaften. Es sind we-sentlich mehr Substanzen beschrieben worden, die zu Wurster-Blau reagieren alszu Wurster-Rot [1].

7.2.10.3 Iod-Kaliumiodid-Reagenz (sauer)Das Iod-Kaliumiodid-Reagenz wird aus 0,8 g Iod und 0,4 g KI durch Lösen in 5 mlWasser und anschließende Zugabe von 40 ml 96 %iges Ethanol und 5 ml 36 %igeHCl hergestellt [1]. Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur ab. Das Reagenz färbtstickstoffhaltige Fungizide, Alkaloide, Polyethylenglykole und tertiäre Stickstoff-verbindungen, wie Antibiotika und Purine. Dieses Reagenz bietet die einzige Mög-lichkeit, Coffein und Theobromin dauerhaft anzufärben. Im Allgemeinen resultie-ren rotbraune bis blauviolette Zonen auf hellgelbem Untergrund. Die Zonen ver-blassen nach einigen Stunden.

7.2.11 Reaktionenmit Metallkationen

7.2.11.1 Phosphatbestimmung mit AmmoniummolybdatAmmoniumheptamolybdat (NH4)6[Mo7O24 � 4 H2O] reagiert spezifisch mit Phos-phatanionen zu einem blauen Farbstoff. Zur Herstellung der Reagenzlösung werden100 mg Ammoniummolybdat und 100 mg Ascorbinsäure in 12 ml Wasser (im Ul-traschallbad) gelöst und im Anschluss mit 12 ml Methanol verdünnt. Das Reagenzkann auf Celluloseplatten eingesetzt werden und ist einen Tag lang stabil. ZurUmsetzung wird die getrocknete Platte für 2 s in die Reagenzlösung getaucht und10 min bei 55 °C gehalten. Phosphatzonen erscheinen blau auf farblosem Unter-grund.

Phospholipide [71] werden mit dem Molybdänreagenz ebenfalls selektiv zublauen Zonen gefärbt. Zur Reagenzherstellung werden 2,5 g Ammoniumhepta-molybdat und 0,05 g Cersulfat [Ce(SO4)2 � 4 H2O] in 3 ml konz. Schwefelsäureund wenig Wasser gelöst und dann zu 50 ml mit Wasser aufgefüllt. Eine andere


Abb. 7.34 Zu sehen sind die Trennung von Milch (Bahn 1 + 2), 80 ng Melamin (1,3,5-Triazin-2,4,6-triamin) in Milch (Bahnen 3 + 4), Melamin und Cyanursäure (2,4,6-Trihydroxy-1,3,5-triazin,200 ng) in Milch (5 + 6) sowie Cyanursäure in Milch (Bahnen 7 + 8) auf Kieselgel, gefärbt mit aIod-Stärke- und b Wuster-Blau-Reagenz. Als Laufmittel verwendet wurde eine Mischung aus 2-Propanol, CH2Cl2 und Wasser (3 + 1 + 1, V / V) [70]

Komposition besteht aus 60 ml Molybdatlösung und 10 ml Essigsäure. Zur Her-stellung der Molybdatlösung werden 1 g Ammoniumheptamolybdat in 10 ml 9-molarer Schwefelsäure gelöst, mit 180 mg Ascorbinsäure versetzt und mit Wasserzu 100 ml aufgefüllt [72]. Nach dem kurzen Tauchen (1 s) wird die Platte für 10 minauf 120 °C erwärmt.


a b c d e

Abb. 7.35 Gezeigt ist die Trennung von a Paraquat, b Diquat, c Mepiquat, d Chlormequatund e Difenzoquat, getrennt mit dem Fließmittelgemisch 1-Propanol/Methanol/2-molare wässrigeNaCl-Lösung (4 + 4 + 12, V / V). Die Verbindungen wurden mit Dragendorff-Reagenz angefärbt.Chlormequat zeigt keine Reaktion

7.2.11.2 Dragendorff-ReagenzDas Dragendorff -Reagenz (nach Munier and Macheboeuf) färbt alle stickstoffhal-tigen Substanzen. Meist resultieren rote Flecke auf schwachgelbem Untergrund.Rotorange erscheinen Alkaloide und Cholinphosphatide wie Lecithin und Sphin-gomyelin sowie quaternäre Ammoniumverbindungen (Abb. 7.35). Violett gefärbtwerden z. B. Atropin, Nicotin, Narcein und Phenothiazin.

Lösung A 100 mg Bi(NO3)2 � 5H2O werden in 1 ml Eisessig gelöst und anschlie-ßend mit 4 ml H2O verdünnt.

Lösung B 300 mg KI werden in 2 ml H2O gelöst.Zur Färbung werden 0,5 ml Lösung A und 0,5 ml Lösung B mit 2 ml Essigsäure

zu 10 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Platte wird für 5 s getaucht und bei Bedarf auf80 °C erhitzt. Die Reagenzienlösungen A und B sind einige Monate im Dunkeln,das fertige Reagenz mehrere Wochen bei Raumtemperatur haltbar. Polyethylen-glykol und andere Polyether werden rotorange gefärbt, wenn der fertigen Lösung200 mg BaCl2 beigegeben werden [2]. Ein Erwärmen ist bei diesem modifiziertenReagenz nicht nötig. Alle Plattentypen (außer Aminoplatte und Amidphase) könnenverwendet werden.

7.2.11.3 Antimon(III)-chlorid (Carr-Price-Reagenz)Das Antimon(III)-chlorid-Reagenz (Carr-Price-Reagenz) färbt alle Analyte, dieisolierte Doppelbindungen enthalten. Das aktive Agens ist ein Antimon(V)-Kom-plex. Man nimmt an, dass aus SbCl3 der [SbCl3OH]�-Komplex zusammen miteinem farbigen Kation gebildet wird, das durch Doppelbindungen stabilisiert wird.


Mit dem Carr-Price-Reagenz werden Vitamin A und D, Corticoide, Terpene,Sterine, Steroide, Gallensäuren, Sapogenine, Glykoside, Flavonoide und Phospholi-pide in farbige Antimon-�-Komplexe umgewandelt, die im langwelligen UV-Licht(356 nm) häufig fluoreszieren.

Zur Herstellung des Reagenzes werden 500 mg SbCl3 in 12 ml CHCl3 gelöst.Bei manchen Rezepten wird noch 3 ml Essigsäure zugemischt.

Die trockene Platte wird für 1 s in die Lösung getaucht und 5–10 min auf 110–120 °C erhitzt. Das Reagenz kann auf Kieselgel-, Aluminiumoxid- und Kieselgur-schichten eingesetzt werden und muss stets frisch hergestellt werden.

7.2.11.4 SilbernitratreagenzMit dem Silbernitratreagenz (AgNO3-Reagenz) können chlorierte oder bromierteVerbindungen wie z. B. Chlorpestizide detektiert werden. Die Nachweisgrenze ein-zelner Pestizide liegt zwischen 20 ng und 100 ng pro Zone [69]. Zur Herstellungder Tauchlösung werden 10 mg Silbernitrat in 6 ml Wasser gelöst und mit Acetonzu 10 ml aufgefüllt. In einer anderen Vorschrift werden 500 mg Silbernitrat in 1 mlWasser gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Die Reagenzienlösungen sindim Dunkeln längere Zeit haltbar. Beschrieben ist auch die Kombination von 100 mgAgNO3, gelöst in 1 ml Wasser. Dann werden 20 ml 2-Phenoxyethanol zugefügt, undes wird mit Aceton zu 200 ml aufgefüllt. Anschließend gibt man 100 µL 30 %igeH2O2-Lösung zu. Die Lösung kann im Kühlschrank für maximal 4 Tage aufbewahrtwerden [69]. Die Platten werden 5 s in die Reagenzlösung getaucht und anschlie-ßend 30 min in die Sonne gelegt oder mit einer hellen Lampe beleuchtet. BeimTauchen entstehen Silberhalogenide, aus denen unter Lichteinwirkung elementa-res, schwarzes Silber gebildet wird. Das Reagenz kann auf Kieselgelschichten undauf Cellulose eingesetzt werden. Es ist auch möglich, die Platte vor der Trennungin eine 1 %ige wässrige AgNO3-Lösung zu tauchen, zu trocknen und nach der Ent-wicklung mit Licht der Wellenlänge 256 nm zu bestrahlen.

7.2.11.5 Aluminiumchlorid- und Zirconiumoxychlorid-ReagenzAluminiumkationen, wie auch Eisenkationen, bilden mit aromatischen Hydroxyke-tonen Komplexe, bei denen jeweils sechs Sauerstoffatome als Elektronendonatorenoktaedrisch um das Zentralatom angeordnet sind.

Als Reagenzlösung werden 0,2 g bis 1,0 g AlCl3 � 6 H2O in 100 ml Ethanolgelöst. Flavonoide, Mykotoxine wie Zearalenon, Ochratoxin, Citrin oder Sterigma-tocystin, Cholesterin, Triglyceride und Phospholipide reagieren nach dem Tauchen(1 s) teilweise schon bei Raumtemperatur zu gelb fluoreszierenden Zonen, diebei 365 nm angeregt werden müssen. Eventuell muss die Platte für 10 min auf80–100 °C erwärmt werden. Das Reagenz kann auf allen Schichten eingesetztwerden.

Eine gesättigte Lösung von Zirconiumoxychlorid (ZrOCl2) in Methanol ergibtoft eine stärkere Fluoreszenz als Aluminiumchlorid. Das Mykotoxin Sterigmato-cystin kann so noch mit 1 ng pro Zone nachgewiesen werden [32]. Beide Reagenz-lösungen sind über Monate stabil.


7.2.11.6 Eisen(III)-chlorid-ReagenzZur Herstellung der Reagenzlösung werden 1 g FeCl3 � 6 H2O in 5 ml Wasser ge-löst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Nach dem Tauchen (1 s) muss die Plattefür 10 min auf 110 °C erwärmt werden. Flavonoide erscheinen rot- bis blauviolett,Flavonoidglykoside grün oder rotbraun, Catechin grün, Tannine blau, Phenothia-zine pink und anorganische Anionen hellgelb bis blaugrün. Werden dem Reagenznoch 2 ml 70 %ige Perchlorsäure beigemischt (Reagenz nach Salkowski), könnenAlkaloide und Indole teilweise schon vor einem Erwärmen unterschiedlich ange-färbt werden [1]. Das Reagenz kann auf allen Plattenarten eingesetzt werden. DieReagenzlösung ist mehrere Monate stabil.

7.2.11.7 Kaliumhexaiodoplatinat-ReagenzZur Bestimmung von organischen Stickstoffverbindungen wie Alkaloiden, quater-nären Ammoniumverbindungen, Thiolen, Thioethern und Sulfoxiden hat sich dasIodoplatinatreagenz bewährt. Die Nachweisgrenzen für Urethane und einige Alka-loide liegen bei 10 ng pro Zone, für Penicillinderivate bei 50 ng [1].

Zur Herstellung des Reagenzes werden 300 mg Hexachloroplatin(IV)-säure in3 ml Wasser (oder 1-molare Salzsäure für den Nachweis von Benzodiazepinen) ge-löst und mit 97 ml Methanol, Ethanol oder Aceton verdünnt. Diese Lösung wird mit100 ml einer 6 %igen wässrigen KI-Lösung gemischt. Die Mischung ist im Kühl-schrank bei 4 °C eine Woche haltbar [73]. Zur Reaktion wird die getrocknete Plattefür 1–4 s getaucht. Bei Raumtemperatur entstehen unterschiedlich gefärbte Zonenauf schwach rosa gefärbtem Untergrund. Das Reagenz kann – mit Ausnahme derAminophase – auf allen Plattenarten verwendet werden.

7.2.11.8 Palladium(II)-chlorid-ReagenzMit dem Palladium(II)-chlorid-Reagenz können Schwefelverbindungen wie Mer-captane, Disulfide, Phenothiazine, Thiophosphorsäureester und Antioxidantien zugelbbraunen bis schwarzen Zonen umgesetzt werden. Es werden 100 mg Palladi-um(II)-chlorid in 1 ml konz. HCl gelöst und mit Ethanol zu 20 ml aufgefüllt. Diegetrocknete Platte wird 1 s in die Reagenzlösung getaucht. Es resultieren (ohne Er-wärmen) braune bis schwarze Zonen auf farblosem oder hellbraunem Untergrund[73]. Das Reagenz kann auf Kieselgelschichten, auf RP- und Polyamidphasen ein-gesetzt werden. Die Reagenzienlösung ist etwa einen Monat haltbar.

7.2.12 Reagenzien für Metallkationen

7.2.12.1 AlizarinreagenzEs gibt eine große Anzahl von Verbindungen, die selektiv nur mit bestimmtenMetallen farbige Komplexe bilden [74–76]. Ein häufig angewendetes Reagenz istAlizarin (Abb. 7.36) [1]. Es werden 50 mg Alizarin in 50 ml Ethanol gelöst. Die tro-ckene Platte wird 1 s in die Reagenzlösung getaucht. Anschließend wird die feuchtePlatte für 1 min in NH3-Dampf gestellt. Viele Metallkationen werden durch das


O

321

O OH

OH

OH

N H2N

NH 2S

S

Abb. 7.36 Strukturen von 1 Alizarin, 2 8-Hydroxychinolin und 3 Rubeansäure

Alizarin komplexiert. Es entstehen rotviolette Zonen auf schwach rotviolettem Un-tergrund. Wird die Platte in 1 %ige (G/V) Borsäure (Methanol/Wasser 9 + 1, V / V)getaucht und gegebenenfalls für 2–5 min auf 100 °C erhitzt, werden rote Zonen aufgelbem Untergrund erhalten. Die getauchte Platte muss schnell vermessen werden,da die Farben nicht sehr stabil sind.

Folgende Elemente reagieren mit den freien Elektronenpaaren der beiden OH-bzw. der Carbonylgruppen zu einem Komplex, bestehend aus ein bis zwei Alizarin-molekülen und einem Kation: Li, Cu, Ag, Au, Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Zn, Cd, Hg, Al,Ga, Sc, In, La, Sn, Pb, Ti, Zr, As, V, Sb, Bi, Se, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Pd und Pt. DasAmmoniumkation reagiert ebenfalls. Das Reagenz kann auf Kieselgel- oder Cellu-loseschichten eingesetzt werden. Die Reagenzlösung ist mehrere Monate stabil.

7.2.12.2 8-Hydroxychinolin-ReagenzZur Herstellung der Reagenzlösung werden 50 mg 8-Hydroxychinolin (Abb. 7.36)in 50 ml Essigsäureethylester oder in Ethanol/Wasser (8 + 2, V / V) gelöst. ZurDurchführung wird die trockene Platte für 5 s in die Reagenzlösung getaucht undanschließend die getrocknete Platte für 5 min in NH3-Dampf gestellt. Die Plattemuss unter UV-Licht (254 nm) ausgewertet werden. Es entstehen gelb gefärbteZonen, die gelb bis rot fluoreszieren. Es können die Kationen von Be, Mg, Ca, Sr,Ba, Sn, Cr, Fe, Al, Ni, Co, Cu, Bi, Zn, Cd und Hg in der Oxidationsstufe +2 bzw. +3nachgewiesen werden. Das Reagenz kann auf Kieselgel- oder Celluloseschichteneingesetzt werden. Die Reagenzlösung ist mehrere Tage haltbar.

7.2.12.3 Rubeanwasserstoff-ReagenzEine 0,5 %ige Lösung von Rubeanwasserstoff (Thiooxamid, Abb. 7.36) in Metha-nol komplexiert die Kationen Pb2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Ni2+, Hg+ und Bi3+ durcheinfaches Tauchen. Die Platte wird nach leichtem Trocknen in eine Kammer mitNH3-Atmosphäre gestellt. Das Reagenz ist für mehrere Wochen stabil und auf allenPlattenarten einsetzbar.

7.2.12.4 Selenbestimmung mit 2,3-DiaminonaphthalinSelen reagiert spezifisch mit 2,3-Diaminonaphthalin (Abb. 7.37) unter Bildung ei-nes roten, stark fluoreszierenden Farbstoffes. Zur Herstellung des Reagenzes wer-

7.3 Reaktionen über die Gasphase 215

Abb. 7.37 Struktur von 2,3-Diaminonaphthalin

den 10 mg 2,3-Diaminonaphthalin in 1 ml Cyclohexan gelöst und dann mit 100 µlkonz. H3PO4 versetzt [11]. Selen der Oxidationsstufe +IV reagiert zu rot fluoreszie-renden Zonen. Selenomethionin kann direkt auf der Platte bestimmt werden, dennin einer HNO3-Atmosphäre wird Selenomethionin innerhalb von 30 min bei 110 °Czu SeO2 hydrolysiert [B. Spangenberg, unveröffentliche Ergebnisse]. Es können al-le Plattenarten eingesetzt werden. Die Lösung des Reagenzes ist im Kühlschranknur für einen Tag stabil.

7.3 Reaktionen über die Gasphase

Gasphasenreaktionen laufen sehr gleichmäßig ab und sind daher für die quanti-tative Bestimmung bestens geeignet. Am einfachsten wird die DC-Platte mit derTrennschicht nach oben in eine große Petrischale gelegt, die mit einer PE-Folie(Bratenfolie) und dem Deckel abgedichtet wird. Werden zwei Glasstäbe unter diePlattenunterseite gelegt, können dort die Reagenzien platziert werden, ohne dassdie oben liegende Trennschicht verschmutzt wird.

Häufig reicht eine Begasung aus, um Reaktionen auf der Plattenoberfläche an-zustoßen. Die Substanzen Chinin und Chinidin z. B. erscheinen als verstärkt fluo-reszierende Zonen, wenn die Platte für kurze Zeit Ameisensäuredampf ausgesetztwird [2].

7.3.1 Ammoniumbicarbonat-Reagenz

Interessant sind Gasphasenreaktionen, die zu stark fluoreszierenden Zonen führen.R. Segura und A. M. Gotto publizierten 1974 die erste Dampfphasen-Fluoreszenz-reaktion mit Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3), die sogenannte Vapour-phase-fluorescence- (VPF-)Reaktion [77]. Das Salz gibt in der Wärme NH3 ab, dassich mit vielen Substanzen zu fluoreszierenden Verbindungen umsetzt. Es reagie-ren alle Substanzen mit aktiven Carbonylgruppen wie Morphin, Heroin, Ochratoxinund Patulin, Flavonoide, Sennoside, Naphtochinone, Valepotriate, Tetracyclin, Ri-famycin und Anthracen-Derivate. Dabei scheinen die unterschiedlichsten Molekülezu nur einer fluoreszierenden Gruppe zu reagieren, denn in der Literatur wird zurDetektion immer nur eine Anregungswellenlänge um 380 nm und eine Emissions-wellenlänge um 450 nm angegeben.

Zur Durchführung wird die getrocknete Platte mit einer Spatelspitze NH4HCO3

für 30 min bei 100–110 °C in einem geschlossenen Behälter gehalten. Es resultie-ren verschieden gefärbte Zonen, die bei einer Anregung mit langwelligem UV-Lichtfluoreszieren. Zur Erhöhung der Fluoreszenz kann in dünnflüssiges Paraffin/CH2Cl2


0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Trennstrecke (mm)

-lg(R

)

Abb. 7.38 Aufgetragen wurden 50 ng Patulin auf Kieselgel, getrennt mit dem FließmittelCH2Cl2/Aceton (9 + 1, V / V) und 20 min bei 130 °C mit Ammoniumhydrogencarbonat behandelt.Es wurde im Wellenlängenbereich von 280 bis 320 nm in Absorption vermessen. Die abfallendeBasislinie ist auf die unzureichende Trocknung der Platte vor der Reaktion zurückzuführen

(3 + 7, V / V) getaucht werden. Diese Reaktion kann als (fast) universeller Fluores-zenzdetektor verwendet werden. Bei dieser Derivatisierung machen nur organischePhasen wie Cellulose, Polyamid oder RP-Platten Probleme. Diese reagieren mitdem Reagenz zu einem teilweise stark fluoreszierenden Untergrund. Auch Kiesel-gel- und Al2O3-Schichten mit organischen Bindern sind aus diesem Grund nicht zugebrauchen. Auch unvollständig getrocknete Platte bereiten Probleme (Abb. 7.38).

7.3.2 Zinn(IV)-chlorid-Reagenz

Mit Zinn(IV)-chlorid können Sterine, Steroide, Sapogenine, Terpene, Fettsäuren,Aminosäuren, Purine, Pyrimidine, Kohlenhydrate, Flavonoide und Phenole in gel-be, fluoreszierende Zonen umgesetzt werden. Zur Durchführung wird die getrock-nete Platte bei 160 °C mit wenigen Milligramm des Reagenzes in einem geschlos-senen Behälter gehalten. Es resultieren gelbe Zonen, die bei einer Anregung mitlangwelligem UV-Licht (365 nm) gelb bis rötlich auf farblosem Untergrund fluo-reszieren. Das Reagenz kann auf Kieselgelschichten eingesetzt werden.

7.3.3 HCl-Reagenz

Mit konzentrierter Salzsäure (36 %ige HCl, gelöst in Wasser) können Antiepilepti-ka, Chalkone, Digitalisglykoside, Kohlenhydrate, Diazepam, Testosteron, Alkaloi-de, Anabolika, Penicillinsäure und andere Verbindungen in farbige und teilweisefluoreszierende Zonen umgewandelt werden. Auch dieser Reaktion liegt, ebenso

7.3 Reaktionen über die Gasphase 217

wie der Umsetzung mit NaOH, KOH oder Schwefelsäure, meist eine Hydrolysezugrunde.

Zur Durchführung wird die getrocknete Platte bei ca. 110 °C in Gegenwart we-niger Tropfen konzentrierter Salzsäure in einem geschlossenen Behälter (z. B. einerGlasentwicklungskammer) für 30 min eingeschlossen. Es resultieren verschiedengefärbte Zonen, die bei einer Anregung im langwelligen UV-Licht fluoreszieren.Zur Erhöhung der Fluoreszenz kann in dünnflüssiges Paraffin-CH2Cl2-Gemisch(3 + 7) getaucht werden. Das Reagenz ist auf Kieselgel- und RP-Schichten einsetz-bar.

Die Reaktionstemperatur, die zu fluoreszierenden Zonen führt, kann zur Unter-scheidung verschiedener Substanzen genutzt werden. Zucker wie Glucose, Fucoseund Galactose oder Aminozucker wie N-Acetylglucosamin wie auch Gangliosideund N-Acetylneuraminsäure können auf Kieselgel mit einem Gemisch aus CHCl3,Methanol und H2O (60 + 35 + 8, V / V) aufgetrennt und durch Tauchen oder Be-sprühen mit 18 %iger wässriger Salzsäure und anschließendem Erwärmen in fluo-reszierende Zonen umgewandelt werden. Die DC-Platte wird dazu für 10 min miteiner zweiten Glasplatte abgedeckt und für 2 min (ohne Abdeckung) erhitzt. N-Acetylneuraminsäure wie auch Ganglioside werden schon bei 100 °C, Zucker undAminozucker erst bei 150–170 °C in fluoreszierende Zonen umgewandelt. Bei derReaktion bilden sich primär Furfuralderivate, die mit nicht umgesetzten Molekülenkondensieren. Durch die Wahl der Temperatur können Zuckersignale unterdrücktwerden [78].

7.3.4 Trichloressigsäurereagenz

Mit Trichloressigsäure können Steroide, Alkaloide, Digitalisglykoside, Vitamin D3und Benzodiazepin-2-on-Derivate in hellblau fluoreszierende Substanzen umge-wandelt werden. Die getrocknete Platte wird für 10 min auf 120 °C erwärmt. Esresultieren verschieden gefärbte Zonen, die bei einer Anregung mit langwelligemUV-Licht (365 nm) fluoreszieren. Zur Erhöhung der Fluoreszenz kann in dünnflüs-siges Paraffin-CH2Cl2-Gemisch (3 + 7, V / V) getaucht werden. Das Reagenz kannauf Kieselgelschichten sowie auf Cellulose eingesetzt werden.

7.3.5 Salpetersäurereagenz

Mit wenigen 100 µl konz. HNO3 (100 %) im Gasraum reagieren viele aromatischeVerbindungen, aber auch Testosteron, Zucker und Phospholipide zu meist farbigenund oft auch fluoreszierenden Zonen. Die Salpetersäure ist sehr aggressiv und soll-te nur mit Handschuhen dosiert werden. Zur Reaktion wird die getrocknete Plattefür 15 min auf 160 °C bis 180 °C erwärmt. Zur Erhöhung der Fluoreszenz kann indünnflüssiges Paraffin-CH2Cl2-Gemisch (3 + 7, V / V) getaucht werden. Das Rea-genz kann auf Kieselgel-, Aluminiumoxid, RP-, Diol-, NH2- und Cyanoschichtensowie Cellulose eingesetzt werden.


Abb. 7.39 Struktur von tert-Butylhypochlorit

7.3.6 tert-Butylhypochlorit-Reagenz

Mit tert-Butylhypochlorit (Abb. 7.39) kann Vitamin B1 in eine gelb fluoreszierendeSubstanz (bei Anregung mit UV-Licht der Wellenlänge 365 nm) umgewandelt wer-den. Auch Triglyceride, Fettsäuren, Zucker, Aminosäuren, Steroide, Prostaglandineund Carbamazepin reagieren zu fluoreszierenden Substanzen. Zur Durchführungder Reaktion wird die getrocknete Platte für 10 min bei 120 °C gehalten. Es resul-tieren verschieden gefärbte Zonen, die bei einer Anregung mit langwelligem UV-Licht fluoreszieren.

Zur Erhöhung der Fluoreszenz kann in dünnflüssiges Paraffin-CH2Cl2-Gemisch(3 + 7, V / V) getaucht werden. Das Reagenz ist auf Kieselgelschichten einsetz-bar.

7.4 Thermische Umsetzungen auf der Platte

Die Reaktion von Carbonylverbindungen auf Aminopropylphase ist gut dokumen-tiert [79–86]. Nach der Auftrennung bilden Aldehyde und Ketone allein durchErhitzen der Platte stark fluoreszierende Zonen ohne Hintergrundfluoreszenz. DieCarbonylverbindungen führen wahrscheinlich eine Maillard-Reaktion durch, indemsie durch den Ausstoß von Wasser Schiff’sche Basen bilden. Hier gleicht die Reakti-on der schon beschriebenen Umsetzung mit Ammoniak in der Gasphase [80]. Meistreichen Temperaturen von unter 150 °C aus, um hell fluoreszierende Zonen zu bil-den. Neben Zuckern [79, 80] reagieren auch Creatin, Creatinin und Harnsäure [81],Catecholamine [82], Steroidhormone [83], der Süßstoff Sucralose® (der zur Reakti-on allerdings eine Temperatur von 190 °C benötigt) [84], Sterigmatocystin [85] wieauch Glucosamin [86].

Viele Substanzen wandeln sich beim Erhitzen auf der DC-Platte unspezifisch influoreszierende Verbindungen um. Diskutiert wird, dass hierbei das fein verteilteSorbens katalytisch wirkt. Testosteron z. B. lässt sich auf einer Aluminiumoxidplat-te mit einem Toluol-Propanol-Gemisch (10 + 1, V / V) trennen und durch Erhitzen(20 min) auf 180 °C in eine fluoreszierende Verbindung umwandeln. Die Intensitätder Fluoreszenz lässt sicht durch Tauchen in Triton-X-100/Chloroform (1 + 4, V / V)um den Faktor 25 erhöhen [9]. Testosteron kann so mit einer Nachweisgrenze von2 ng pro Fleck bestimmt werden. Allgemein lassen sich alle Substanzen, die aroma-tische Strukturen besitzen, auf Aluminiumoxidplatte und auch auf Kieselgelplatteoft allein durch einfaches Erhitzen zum Fluoreszieren bringen [87, 88]. Der Reakti-onsmechanismus ist unbekannt. Vermutlich spielt neben Oxidationsprozessen auchdie Bildung von stabilen aromatischen Ringsystemen eine Rolle. Jork erwähnt in

7.5 Aktivitätsanalyse mit chemischen Reagenzien 219

seinem Buch DC: Reagenzien und Nachweismethoden [1] die Umwandlung in fluo-reszierende Verbindungen mittels eines Hochspannungsplasmas. Jork beschreibt,dass die Plasmaaktivierung bei Raumtemperatur ähnliche Nachweisgrenzen wie diethermische Aktivierung ermöglicht [1]. Auch hier wird neben dem Energieeintragdie Mitwirkung des Sorbens als Katalysator benötigt.

7.5 Aktivitätsanalyse mit chemischen Reagenzien

Die klassische analytische Chemie kann einen Analyten nur bestimmen, wenn die-ser Analyt als Reinsubstanz verfügbar ist. Diese Reinsubstanz wird als Vergleichs-substanz (als Standard) eingesetzt und dient zur Qualifizierung und Quantifizierungder Probe. Damit kann der Analyt nur identifiziert werden, wenn gezielt auf ihngetestet wird. Der dabei gewonnene Informationsgehalt wird in „Bit“ gemessen,der „binary digit“. Ein bit ist die kleinste Informationseinheit, die aus einem Expe-riment gewonnen werden kann. Ein bit Informationsgewinn erhält man, wenn dieFrage mit „ja“ oder „nein“ beantwortet werden konnte. Eine typische 1-bit-Analytikist z. B. die Beantwortung der Frage, ob der Analyt in der Probe enthalten ist odernicht. Eine erfolgreiche qualitative Analyse ist somit eine typische 1-bit-Analyse,denn durch diese Messung wird der Informationsgewinn von 1 bit generiert.

Wir sprechen von quantitativer Analytik, wenn der Informationsgewinn grö-ßer als 1 bit ist. Die Zahl, die für den Informationsgewinn steht, kann auch alsanalytische Auflösung gedeutet werden. Sie steht für die Fähigkeit, verschiede-ne Analytgehalte zu unterscheiden. Ein typisches Beispiel ist hier das pH-Papier,bei dem nach dem Tauchen in die Probelösung in der Regel nicht mehr als 8 ver-schiedene Farben unterscheidbar sind. Solch eine pH-Messung liefert damit eineanalytische Auflösung von 3 bit, da 23 = 8 gilt.

Der analytische Ansatz in der Aktivitätsanalyse ist breiter. In der Aktivitätsana-lyse wird nicht nur ein Analyt durch seine Aktivität, also seine spezielle Wirkungauf etwas, beschrieben. Es wird damit auch eine Zugehörigkeit zu einer Klasse vongleich wirkenden Substanzen getroffen. Das Besondere dabei ist, dass man kei-nen Standard braucht. Es ist z. B. möglich, einen Analyten unbekannter Strukturals ein Antibiotikum zu qualifizieren, ohne diesen als Reinsubstanz zur Verfügungzu haben. Damit erlaubt die Aktivitätsanalyse eine neue Art von Screeningtestsauf Substanzen einer bestimmten biologischen oder chemischen Aktivität, ohnedass durch die vor der Messung getroffene Wahl des Vergleichsstandards (oder dieNichtwahl!) der Erkenntnisgewinn der Messung eingeschränkt wird.

7.5.1 Folin-Ciocalteu-Reagenz

Das Folin-Ciocalteu-Reagenz wurde ursprünglich zur Analyse von Proteinen ent-wickelt. Dabei machte man sich die Empfindlichkeit von Tyrosin zunutze. DieMethodik wurde auf die Analyse des Gesamtphenolgehaltes in Wein ausgeweitetund dient heute als Maß für die Reduktionskapazität einer Probe. Chemisch gemes-sen wird dabei der Gehalt an phenolischen Antioxidantien.


Abb. 7.40 Struktur von2,2-Di-(4-tert-octylphenol)-1-picrylhydrazyl (DPPH-Reagenz)

O2N NO2

NO2

N

N o

Das Reagenz wird hergestellt, indem 10 g Natriumwolframat (Na2WO4 � 2 H2O)mit 2,5 g Natriummolybdat (Na2MoO4 � 2 H2O) in 10 ml konzentrierter HCl(36 %ig), 5 ml H3PO4 (85 %ig) und 70 ml Wasser für 10 Stunden zum Siedenerhitzt wird. Danach werden der Lösung 15 g Lithiumsulfat (Li2SO4 � 4 H2O) zuge-setzt, das dadurch eine intensiv gelbe Farbe erhält. Diese Lösung wird für 15 minunter Rückfluss erhitzt und mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Verunreinigungenkönnen die gelbe Farbe in grün umschlagen lassen. Das kann durch Zugabe einesTropfens elementaren Broms rückgängig gemacht werden. Die chemische Strukturdes Reagenzes ist unbekannt.

Zur Analyse wird die trockene Platte zuerst für 2 s in eine 2 %ige (w/v) wässri-ge Natriumcarbonatlösung getaucht und dann in eine 1 : 10 mit Wasser verdünnteFolin-Ciocalteu-Reagenzlösung. Reduzierende Substanzen wie Phenole oder auchVitamin C (Ascorbinsäure) zeigen blaue Zonen auf leicht gelbem Untergrund[2, 3, 88].

7.5.2 Prüfung auf Radikalfänger-Aktivität mittels DPPH-Reagenz

Die Bestimmung von Radikalfängereigenschaften in Pflanzenprodukten und Le-bensmitteln wird üblicherweise mithilfe des Reagenzes DPPH [2,2-Di-(4-tert-oc-tylphenol)-1-picrylhydrazyl, Abb. 7.40] durchgeführt. DPPH ist ein stabiles Radikalmit violetter Färbung. Die Verbindung ändert ihre Farbe in Gelb, wenn sie durcheinen Radikalfänger reduziert wird.

Zur Durchführung des Testes wird die getrocknete Platte für wenige Sekundenin eine Reagenzlösung getaucht, die 25 mg DPPH in 50 ml Aceton oder Methanolenthält. Die Reagenzlösung kann auch zum Sprühen verwendet werden. Zonen mitfreier Radikalaktivität färben sich innerhalb von 30 s von blauviolett nach gelb [90,91].

7.5.3 Nucleophile Reaktionsfähigkeit

Verbindungen, die als Nucleophile reagieren können, stehen immer unter Verdacht,kanzerogen zu wirken. Die Substanz 4-(4-Nitrobenzyl)-pyridin (NBP) besitzt einfreies Elektronenpaar am Pyridinstickstoff, das leicht mit alkylierenden Substanzenreagiert (Abb. 7.41). Das Reagenz ändert dabei seine Farbe von farblos zu Blau bis

Literatur 221

N

NO O

O

O ON

N

+

R R

R

R

OH

HO–

Abb. 7.41 Bildung einer rotvioletten Verbindung durch eine nucleophile Reaktion

Rotviolett. Wird die Platte alkalischen Substanzen ausgesetzt, dunkelt der Hinter-grund nach [1, 92]. Alkylierende Substanzen sind z. B. halogenierte Alkylamine,Diazoalkane, Aziridine, Epoxide oder aktivierte Olefine. Es reagieren aber auchCumarin, Antrachinon und Pyrethroide. Das NBP-Reagenz wird hergestellt, indem1,2 g NBP in 40 ml Aceton gelöst werden. Die trockene Platte wird für 2 s in dieLösung getaucht und dann für 15–30 min auf 120–150 °C erhitzt. Nach dem Ab-kühlen wird die Platte in eine Kammer mit Ammoniak- oder Triethylamin-Dampfgestellt.

Das Reagenz kann auf Kieselgel-, Cellulose-, Cyano- und RP-Platten eingesetztwerden. Die Reagenzlösung ist für mehrere Tage stabil, wenn sie bei 4 °C in einemKühlschrank aufbewahrt wird [1].

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8Wirkungsbezogene Umsetzungen auf derDC-Platte (direktes Biomonitoring)

Christel Weins

Die Effizienz einer chromatographischen Analytik basiert auf der Selektivität derTrennung und der Spezifität der Detektionsmethode. Im Falle der Dünnschichtchro-matographie können die getrennten Substanzen direkt auf dem Chromatogrammdetektiert und quantifiziert werden. Außer mit physikalischen und mikrochemi-schen Detektionsverfahren können biologisch und toxikologisch aktive Stoffe mitentsprechenden Verfahren auch in situ erfasst werden [1].

Das bedeutet, neben den zerstörungsfreien physikalischen Detektionsverfahrenkönnen auf dem gleichen Chromatogramm noch physiologische und biochemi-sche Detektionsverfahren eingesetzt werden. Diese Verfahren selektieren aus einemvorliegenden Komponentengemisch die Stoffe mit einer physiologischen bzw. toxi-kologischen Wirkung. Diese sog. wirkungsbezogene Analytik mit der Dünnschicht-chromatographie stellt ein Verfahren dar, mit dem biologische Wirkungen schnellund selektiv bestimmten chemischen Substanzen oder Substanzgruppen zugeordnetwerden können. So ist es möglich, unbekannte Substanzen zu identifizieren, auchwenn Referenzsubstanzen nicht verfügbar sind. Dies ist bei Screeningtests von be-sonderem Interesse, da in der klassischen Analytik häufig auf Substanzen untersuchtwird, die in einer Probe nicht enthalten sind, während andererseits vorhandene Sub-stanzen und Toxine wegen einer fehlenden Referenzsubstanz nicht erkannt werden.

Mehrere Hundert Pflanzenschutzmittel sind weltweit im Einsatz. Allein inDeutschland ist eine komplette und flächendeckende Überwachung der derzeitca. 650 zugelassenen Wirkstoffe und ihrer toxischen Abbauprodukte aufgrundder vorhandenen begrenzten Ressourcen nicht möglich. Aufgrund dieser analyti-schen Schwachstelle kann es vorkommen, dass im Agrar- und Lebensmittelbereichbisweilen ausländische Pestizide rechtswidrig verwendet werden, die aber nichtgeahndet werden können, weil die Überwachung der eingesetzten Pestizide durchBehörden bei der Vielzahl an möglichen Verbindungen mit der instrumentellenAnalytik eine Überforderung darstellt. Hier sind Methoden, die nicht bestimmteSubstanzen, sondern bestimmte Wirkungen detektieren können, von besonderemInteresse.

Die wirkungsbezogene Analytik benötigt notwendigerweise keine Standard-substanzen, sondern gibt Auskunft darüber, ob in einer Probe mit unbekannten


228 8 Wirkungsbezogene Umsetzungen auf der DC-Platte (direktes Biomonitoring)

Inhaltsstoffen eine Schadwirkung vorhanden ist, die wiederum Rückschlüsse aufdie Anwesenheit von Schadstoffen geben kann.

Biochemische und biologische Detektionsverfahren auf dem Dünnschichtchro-matogramm sind sehr selektiv und sensitiv und schließen damit die Lücke zwischenbiologischen In-vitro-Testverfahren und der instrumentellen Analytik.

8.1 Prinzip derMethode

Die wirkungsbezogene Analytik stellt eine Kopplung zweier unterschiedlicher Ver-fahren dar. Zum einen wird für die Schadstoffanalytik ein analytisches Verfahrenin der Spurenanalytik für die Bestimmung ausgewählter organischer Schadstoffeeingesetzt, zum anderen schließt sich nach der physikalisch-chemischen Auswer-tung ein biologischer bzw. ein biochemischer Toxizitätstest an und ermöglicht somitnach der chemisch-physikalischen Charakterisierung der Probe eine direkte wir-kungsbezogene Beurteilung.

8.1.1 Schadstoffanalytik in Umwelt und Lebensmittelnund das Prinzip der wirkungsbezogenen Analytik

Die Geschichte der Schadstoffanalytik im Wasser, im Boden, in der Luft und inLebensmitteln zeigt, dass die Einzelstoffanalytik prioritärer Schadstoffe das Risi-kopotenzial nur unzureichend abbildet und daher kein geeignetes Instrument desRisikomanagements im Sinne eines vorsorgenden Umweltschutzes darstellt.

Der Einsatz biologischer Toxizitätstests sowie enzymatischer Hemmtests (z. B.der Agardiffusionstest für Antibiotika) als Screeningverfahren in der Grund-,Trink-, Oberflächen-, Abwasseranalytik und bei Lebensmitteluntersuchungenbringt den ersten Hinweis auf das Vorhandensein toxischer Schadstoffe in einerUmwelt- bzw. Lebensmittelprobe. Die Ergebnisse dieses „Biomonitorings“ zeigenin der Regel die Summeneffekte von Schadwirkungen in einem definierten Test-system auf, wobei eine Einzelstoffidentifizierung zu diesem Zeitpunkt noch nichtmöglich ist.

Der Beweis für die Anwesenheit eines oder mehrerer Schadstoffe, die für dentoxischen Effekt im oben eingesetzten Testsystem verantwortlich sind, muss an-schließend durch die instrumentelle Analytik, wie z. B. die Gaschromatographieoder Flüssigkeitschromatographie (HPLC, HPTLC) erbracht werden, mit der dieEinzelstoffe mittlerweile in geringsten Spuren (im ng- bzw. pg-Bereich) identifi-ziert und quantifiziert werden können.

Die instrumentelle Analytik bedarf ihrerseits einer selektiven Anreicherung desWirkstoffes aus der entsprechenden Matrix: Nach einer anschließenden selekti-ven Trennung erfolgt die Identifizierung mithilfe ausgewählter Referenzsubstan-zen, an die sich die Quantifizierung des Wirkstoffes anschließt. Hier ergeben sichSchwierigkeiten bei der Verwendung relevanter Referenzsubstanzen. Nur die Sub-stanzen, nach denen der Analytiker sucht, können gefunden werden, sodass bei der

8.1 Prinzip der Methode 229

routinemäßigen Überwachung von Lebensmittel- und Umweltproben eine Erfas-sung unbekannter Substanzen oder Metabolite mit einer biologisch-toxikologischenSchadwirkung in der Einzelstoffanalytik nicht erfolgt.

Die wirkungsbezogene Analytik basiert auf dem Gedanken, in nativen Probenoder definierten Extrakten durch biologische Systeme (wie z. B. Zellkulturen, Mi-kroorganismen) oder biochemische Reaktionen vorhandene Effekte zu ermitteln.Mit diesem Verfahren sollen möglichst alle Wirkäquivalente und somit das Gefähr-dungspotenzial einer Probe abgebildet werden. Zur weiteren Charakterisierung derWirkstoffe gilt die Fraktionierung einer Probe als zielführend, wobei die Frakti-onsschritte die Gesamttoxizität nicht verändern sollen. Bei einem positiven Befundkönnen durch weitere analytische Verfahren die für den Effekt verantwortlichenSubstanzen identifiziert werden [2].

8.1.2 Zielvorgaben und Grundlagen der wirkungsbezogenenAnalytik mit der Dünnschichtchromatographie

Eine Zielvorgabe der wirkungsbezogenen Analytik ist, bioaktive Stoffe, wie z. B.pharmakologisch aktive Stoffe oder Kontaminanten in Lebensmittel- und Umwelt-proben im Spurenbereich von 50 bis 100 ng/kg nachweisen und identifizieren zukönnen. Daher sollte das Verfahren so universal wie möglich sein, um unbekann-te Substanzen mit biologischer Wirksamkeit in einer Probe bestimmen zu können.Hierbei handelt es sich nicht um eine Einzelstoffanalytik, sondern um die Erfas-sung von Wirkäquivalenten, die Rückschlüsse auf die in der Probe vorliegendenKontaminanten geben können.

Sind Substanzen gegenüber einem Testorganismus sehr wirksam, dann sind be-reits geringe Mengen der Substanz nachweisbar. Dies kann zur Folge haben, dassdiese Substanzen bereits in der nativen Probe detektierbar sind und eine Anreiche-rung nicht notwendigerweise erfolgen muss.

Es hängt von der Fragestellung des Analytikers ab, ob zunächst Wirkäquivalentein der nativen Probe ermittelt werden sollen, ob Fraktionen untersucht werden sol-len und inwieweit eine Probenvorbereitung und Anreicherung durchgeführt werdensoll, die in der Dünnschichtchromatographie mit der nativen Probe bereits auf derPlatte erfolgen kann.

8.1.3 Dünnschichtchromatographie, ein geeignetes Verfahrenfür die wirkungsbezogene Analytik

Die Dünnschichtchromatographie gehört zu den ältesten Verfahren, die eingesetztwurde, um bioaktive Stoffe, wie z. B. Antibiotika oder Pflanzenschutzmittel, zu be-stimmen.

Als die Rückstandsanalytik von Pflanzenschutzmitteln in den fünfziger Jahren anBedeutung gewann, standen den Analytikern lediglich die Spektralfotometrie unddie Papierchromatographie als Analysenmethoden zur Verfügung. Mit der Papier-


chromatographie wurde es möglich, mehrere Substanzen, die als Gemisch vorlagen,auf einfache Art zu trennen und anschließend zu identifizieren. Die Methode wur-de bald durch die Dünnschichtchromatographie (DC, engl. TLC) verdrängt, diegegenüber den herkömmlichen Verfahren zahlreiche Vorteile besaß, wie z. B. ei-ne schnellere Auftrennung, eine höhere Nachweisempfindlichkeit und eine größereVariabilität bei den Trennsystemen. Der Einsatz der Dünnschichtchromatographiemachte es möglich, eine Vielzahl von Pflanzenbehandlungsmitteln zu trennen undmit verschiedenen Reagenzien nachzuweisen und zu identifizieren. Zahlreiche Pu-blikationen sind in der Folgezeit erschienen, die sich mit der toxikologischen Be-deutung und der Analytik von Pflanzenschutzmitteln im Spurenbereich beschäftig-ten, insbesondere von Fungiziden und Insektiziden [36].

8.1.4 Prinzip der wirkungsbezogenen Analytikin der Dünnschichtchromatographie

Die wirkungsbezogene Analytik setzt sich aus einer Kopplung von instrumentellerAnalytik und biologischem Testverfahren zusammen.

Der 1. Schritt besteht aus einer Bestimmung organischer Schadstoffe mittels derDünnschichtchromatographie als instrumentelles analytisches Verfahren.

Die Bestimmung organischer Pflanzenbehandlungsmittel aus Trinkwasser er-folgt z. B. mit der AMD-Technik nach DIN 38407, Teil 11, die ein dünnschicht-chromatographisches mehrstufiges Verfahren nach einer Anreicherung der Schad-stoffe durch eine Festphasenextraktion beschreibt [7]. Die Trennung der einzelnenKomponenten erfolgt bei diesem universellen Verfahren durch eine Stufen- undMehrfachentwicklung in der Regel mittels einer Normalphasenchromatographie,wobei die Elutionskraft der mobilen Phase polar beginnt und unpolar endet. Die-ses Verfahren erlaubt die Trennung der Substanzen aufgrund ihrer Polarität, wasin der Regel genuine Kontaminanten und ihre polareren Metabolite unterscheidet.Die Identifikation und Bestimmung wird durch eine In-situ-Remissionsmessung beiverschiedenen Wellenlängen durchgeführt. Die Identifikation einzelner Stoffe er-folgt zunächst – ähnlich wie in der HPLC – aufgrund der Lage im Chromatogrammund mithilfe einer Spektrenbibliothek anhand des Remissionsspektrums. Die Nach-weisgrenze ist hierbei in der Regel abhängig vom Adsorptionskoeffizienten desentsprechenden Stoffes oder Derivates.

Unbekannte Substanzen können zunächst durch ihre Retentionsfaktoren und ihrUV-Spektrum charakterisiert werden. Chemische Reaktionen, die direkt auf derPlatte durchgeführt werden können, sind geeignet, die bisher gewonnenen Ergeb-nisse zu verifizieren. Neben den physikalischen und mikrochemischen Nachweis-verfahren ist es möglich, die Identifizierung der getrennten Substanzen durch ihrebiologische bzw. biochemische Wirksamkeit zu bestätigen.

Im 2. Schritt werden auf dem gleichen Chromatogramm mittels einer Kopp-lung mit einem biologischen/biochemischen Toxizitätstest die Wirkstoffe detek-tiert, die den entsprechenden Organismus im Testsystem schädigen. Hierbei könnenTestorganismen wie Pilzsporen, Hefezellen oder Bakterien bzw. auch Zellorganel-

8.1 Prinzip der Methode 231

HPTLC-Pla e nachder Entwicklung

Applika on eines Test-enzyms, Testorganismus;Inkuba on

Detek on von Effekten

Addi on von Substratoder Farbstoff; Inkuba on

Fließrichtung

physikalisch/chemische Detek on

Immersion

Abb. 8.1 Prinzip der Vorgehensweise bei der toxikologischen Schadstoffbestimmung mit zellulä-ren und subzellulären HPTLC-Detektionsverfahren

len wie Chloroplasten in einem entsprechenden Nährmedium auf das Chromato-gramm gebracht werden. Das biologische Signal wie Hemmung oder Stimulati-on des Wachstums, Hemmung oder Stimulation der Lumineszenz oder Hemmungder Fotosynthese dient zum einen der Zuordnung von toxischen Substanzen imChromatogramm oder weist zum anderen auf die Gegenwart unbekannter toxiko-logisch relevanter Stoffe erst hin (Abb. 8.1). Neben dem Einsatz von organismi-schen oder suborganismischen Testverfahren können postchromatographisch aufder Dünnschichtplatte auch Enzymhemmtests als biochemische Marker für toxi-kologisch relevante Stoffe durchgeführt werden.

Zusätzlich bietet die Dünnschichtchromatographie die Möglichkeit, detektiertebioaktive Stoffe anschließend direkt von der stationären Phase durch ein DC-MS-Verbindungsstück zu eluieren und per Massenspektroskopie die Struktur der Kom-ponente zu ermitteln.

Bei der wirkungsbezogenen Analytik hat der Einsatz der Dünnschichtchromato-graphie gegenüber dem Einsatz einer Säulenchromatographie folgende Vorteile:� Bis zu 20 Proben können auf einer Dünnschichtplatte parallel untersucht werden.� Bioaktive Stoffe können in nativen Proben u. U. ohne Probenvorbereitung unter-

sucht werden, wie z. B.– Abwässer, insbesondere Abwässer mit einer hohen Kontamination von Bak-

terien und anderen Mikroorganismen– Abwässer mit einem hohen Salzgehalt– Wässrige Extrakte und Sickerwässer– Eluate von Sedimenten und Porenwasser von Sedimenten– Wässrige Lösungen von Einzelsubstanzen und Substanzmischungen– Wasserproben mit einer hohen Trübung– Cremes– Pflanzenextrakte

� Die Trennung der Komponenten komplexer Gemische gelingt in einem weitenPolaritätsbereich (z. B. von Alkylphenolen und deren Ethoxylate) sowie eine Fo-kussierung der getrennten Substanzen zu schmalen Banden mithilfe der AMD-Technik.


BiolumineszenzHemmung

GentoxizitätUMU-Test

FungizidePenicillium exp.

HormoneHefe Test (Sumpter)

AntibiotikaBazillus subtilis

HerbizideAlgen, Chloroplasten

InsektizideEnzymhemmung

Abb. 8.2 Beispiele für Wirkungstests auf der Dünnschichtplatte

� Alle getrennten Substanzen bleiben dem Analytiker auf der DC-Platte erhalten,um selektiv mit physikalischen, mikrochemischen oder biologischen/biochemi-schen Verfahren detektiert werden zu können.

� Postchromatographisch dient die vom Lösemittel befreite stationäre Phase alsOberfläche für biologische und biochemische Testsysteme [8].Für die Identifizierung bioaktiver Stoffe ist die Auswahl des biologischen bzw.

biochemischen Testsystems von entscheidender Bedeutung. Bei diesen Systemenkönnen organismische und suborganismische Testverfahren unterschieden werden(Abb. 8.2).

Bei den organismischen Testverfahren werden Organismen wie Pilzsporen, He-fezellen oder Bakterien in einem geeigneten Nährmedium direkt auf das Chromato-gramm auf die Platte appliziert. Das biologische Signal kann erkannt werden durchz. B.:� Wachtumshemmung oder -stimulation� Hemmung oder Stimulation der Biolumineszenz� Induktion eines Enzyms (z. B. bei transgenen Organismen)

Zusätzlich zu den organismischen Testverfahren können sog. suborganismischeTestverfahren eingesetzt werden, wie z. B. bei der Verwendung von Chloroplasten,Enzymen oder Antikörpern.

Das biochemische Signal kann erkannt werden durch z. B.:� Enzymhemmung oder -stimulation� Fotosynthesehemmung� Antikörper-Antigen-Bindung

Diese biologischen/biochemischen Signale werden genutzt, um bioaktive Sub-stanzen im Chromatogramm zu lokalisieren. Die Dokumentation kann per Flach-bettscanner oder per Videokamera erfolgen und die Hemmung in definierten Toxi-zitätseinheiten mithilfe der Bildanalyse quantitativ angegeben werden. Die Nach-weisgrenze ist hierbei abhängig von der Toxizität des entsprechenden Stoffes indiesem definierten Testsystem.

8.2 Allgemeine Voraussetzungen für die Analyse bioaktiver Substanzen 233

8.2 Allgemeine Voraussetzungen für die Analysebioaktiver Substanzen

Zur Analyse bioaktiver Substanzen wird das Chromatogramm vom Fließmittel be-freit und nach der physikalischen Auswertung können bioaktive Schadstoffe mithil-fe von zellulären und subzellulären Testverfahren postchromatographisch auf demChromatogramm detektiert werden, indem die Organismen, Suborganismen oderEnzyme durch Tauchen, Sprühen oder Überschichten auf das Chromatogramm ap-pliziert werden. Das Sorbens der stationären Phase dient in diesem Fall als Trägerfür den biologischen/biochemischen Test.

Je nach eingesetztem Sorbens bedarf es für die physiologischen Detektions-methoden einer Pufferung des Plattenmaterials, die ausgerichtet ist auf das pH-Optimum des jeweiligen Biotestsystems. Abbildung 8.3 zeigt den Einfluss der Io-nenstärke eines TRIS-Puffers, pH 7,6, auf den gemessenen pH-Wert des Sorbens.

Mobile Phasen mit starken Säuren oder Ameisensäure sollten bei der voraus-gegangenen Chromatographie vermieden werden. Toxische Lösemittel mit einemhohen Siedepunkt wie z. B. Toluol sollten bei einem postchromatographischen phy-siologischen Detektionsverfahren nicht eingesetzt werden, da bereits geringe Rück-stände zu falschen Ergebnissen führen können. Bei der AMD-Entwicklung wirddie stationäre Phase in der Regel im letzten Schritt mit Pentan oder Hexan chro-matographiert. Das hat den Vorteil, dass störende Bestandteile der mobilen Phaseherausgewaschen werden.

Abb. 8.3 Einfluss der Ionenstärke des Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffers, pH 7,6,auf den gemessenen pH-Wert des Sorbens. (Weins [9])


8.3 Enzymtests

Biochemische Umsetzungen in der Dünnschichtchromatographie sind von beson-derer Aussagekraft, da hier physiologische Wirkungen von Substanzen direkt ge-messen werden. Es wird bei biochemischen Bestimmungen nicht auf eine speziellechemische Substanz oder eine chemische Substanzklasse untersucht, sondern aufeine biochemische Wirkung.

8.3.1 Einflüsse der verschiedenen Sorbenzienauf die Enzymaktivität

Die hydrophilen funktionellen Gruppen der verschiedenen in der Dünnschichtchro-matographie verwendeten Sorbenzien erfüllen zum einen die Funktion einer Träger-schicht für die eingesetzten Enzyme, zum anderen bewirken sie bei einem direktenKontakt mit dem Enzym dessen Hemmung oder sogar Denaturierung. Durch Tau-chen der Dünnschichtplatte in eine Enzymlösung wird eine bestimmte Menge anEnzym auf dem Sorbens adsorbiert. Dessen Gehalt kann durch die entsprechen-de Umsetzung eines Substrates in ein farbiges Endprodukt sichtbar gemacht wer-den. Die Adsorption auf Kieselgel erfolgt durch elektrostatische Wechselwirkungen(z. B. mit SiO-/NH+-Gruppen) beim Kontakt zwischen Sorbens und Protein. DieseAdsorption der Enzymproteine auf der Schicht kommt durch Wasserstoffbrücken-bindung oder auch hydrophobe Wechselwirkungen zustande [10]. Diese Wechsel-wirkungen bedingen die teilweise Deaktivierung der adsorbierten Enzymmoleküle.Durch die Zugabe von enzymatisch inertem Rinderserumalbumin (BSA) und Sen-kung der spezifischen Aktivität in der Tauchlösung kann die Menge an aktivemEnzym auf dem Sorbens jedoch gesteuert und standardisiert und somit eine optima-le Reaktionsgeschwindigkeit für den Test eingestellt werden [9].

8.3.2 Detektion von Inhibitoren der Cholinesterase

Der Cholinesterasehemmtest ist ein sensitives und selektives biochemisches Ver-fahren, um phosphororganische Insektizide und insektizide Carbamate qualitativund quantitativ zu bestimmen. Phosphororganische Insektizide und insektizide Car-bamate sind starke Inhibitoren des Enzyms, das vor allem im Zentralnervensystemeine wichtige Rolle bei der Signalübertragung durch Nervenzellen spielt. Diese In-sektizide haben zwar teilweise die persistenten Organochlor-Insektizide ersetzt, diephosphororganischen Insektizide und insektiziden Carbamate zeichnen sich aberdurch eine hohe Toxizität, geringe Stabilität und gute hydrolytische Abbaubarkeitaus, verbunden mit einer hohen Wasserlöslichkeit und -mobilität.

Mendoza fasste bereits 1973 in drei Abhandlungen die breite Anwendungsmög-lichkeit von Enzymhemmtests in der Dünnschichtchromatographie zusammen [11–14]. Er diskutierte die Bestimmung und die Identifizierung von Insektiziden beider Rückstandsanalytik von Lebensmitteln, Boden- und Wasserproben sowie die

8.3 Enzymtests 235

toxikologische Betrachtung der aktiven Metabolite dieser Substanzgruppe. SeineZusammenfassungen geben die Nachweisgrenzen von mehr als 100 phosphororga-nischen Insektiziden [11–13] und insektiziden Carbamaten wieder [14].

1981 verglichen Ambrus et al. 6 unterschiedliche Methoden, mit denen 188 ver-schiedene Pestizide aufgrund ihrer Wirkung mit der Dünnschichtchromatographiedetektiert werden konnten [15]. Neben Pestiziden können mit dem Cholinesterase-hemmtest auf der Dünnschichtplatte auch Inhibitoren aus Pflanzenextrakten nach-gewiesen werden, die eine Bedeutung bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheithaben [16–18].

8.3.2.1 Die physiologische Bedeutung der AcetylcholinesteraseDie Acetylcholinesterase hat bei der Signalübertragung durch Nervenzellen im Zen-tralnervensystem eine Schlüsselfunktion. Sie steuert die Übertragung der Impulsevon Nerv zu Nerv oder von einem Nerv auf ein Organ (Muskel, Drüse etc.) inden sogenannten Synapsen, die in cholinergen Synapsen durch Acetylcholin alsTransmitter erfolgt. Das Enzym ist für die rasche hydrolytische Spaltung von Ace-tylcholin verantwortlich, das während der parasympathischen Stimulation gebildetwird. Kristallstrukturanalysen machten möglich, das aktive Zentrum auf molekula-rer Ebene darzustellen, und zeigten, dass Acetylcholinesterasen zu der Familie derSerinhydrolasen gehören [17].

8.3.2.2 Der molekulare Mechanismus der CholinesterasenhemmungDie irreversible Hemmung der Cholinesterase beruht auf einer kovalenten Phos-phorylierung oder Carbamylierung der Serin-OH-Gruppe im aktiven Zentrum desEnzyms. Die überwiegende Zahl an Organophosphor- und Carbamatinsektizidensind gegenüber der Cholinesterase irreversible Hemmstoffe. Die Carbamate werdenhier unter dem Aspekt des Reaktionsmechanismus zu den irreversiblen Hemmstof-fen gerechnet, auch wenn sie wegen einer spontanen hydrolytischen Reaktivierungder carbamylierten Cholinesterase im Vergleich zu den Organophosphorsäureesternbisweilen als reversible Hemmstoffe eingestuft werden [16].

Neben der toxischen irreversiblen Hemmung der Cholinesterase gibt es Substan-zen, die das Enzym reversibel hemmen. Diese Substanzen werden gerade wegendieser Wirksamkeit als Arzneistoffe eingesetzt, wie z. B. Bambuterol und Terbu-talin als Broncholytika sowie cholinerge Parasympathomimetika wie Neostigminund Tacrin. Reversible Cholinesteraseinhibitoren sind in der Therapie der Alzhei-mer-Demenz etabliert. Präparate wie z. B. Donepezil (Aricept®) und Rivastigmin(Exelon®) sind für die Indikation „leichte und mittelschwere Demenz vom Alzhei-mer-Typ“ seit 1996 zugelassen und erhältlich. Diese Wirkstoffe werden als zentralwirksame Hemmstoffe der Acetylcholinesterase bezeichnet. Sie binden sich rever-sibel an die katalytisch wirksame Seite des Cholinesterasemoleküls und blockierenso die Enzymaktivität.

Die Hemmung der Serinhydrolasen, wie Cholinesterase, Esterase aus Kanin-chenleber oder Bacillus subtilis und Kutinase von Fusarium solani pisi, sind schonlange bekannt als biochemische Methode für die Detektion von Organophospat-insektiziden und insektiziden Carbamaten.


Man kann eine Reaktion als irreversibel ansehen, wenn sich während der Mess-zeit kein Gleichgewicht einstellt. Die meisten irreversiblen Inhibitoren hemmen dieenzymatische Reaktion vollständig z. T. durch Ausbildung einer kovalenten Bin-dung, wenn ihre Konzentration die der reaktionsfähigen Gruppen im Enzym über-steigt.

Die irreversible Hemmung wird mathematisch mit folgenden Gleichungenausgedrückt, wobei ki die Bildungskonstante des Enzym-Inhibitor-Konjugatesdarstellt [9].

E C Iki! EI (8.1)

ki D ln 2 � t�11=2c�1

I (8.2)

Aus (8.2) ergibt sich die Bezeichnung für ki [l � mol�1 � min�1].E EnzymI Inhibitorki Hemmkonstante [l � mol�1 � min�1]t1/2 Halbwertszeit der Inhibitorkonzentration (50 % der Inhibitorkonzentration

wurde kovalent gebunden)cI Inhibitorkonzentration

Die Größe der Hemmkonstanten ki drückt die Stärke der Hemmwirkung des In-hibitors aus. Die Hemmkonstanten einiger Pestizide und ihrer Metabolite gegenüberden Cholinesterasen unterscheiden sich bis zu einem Verhältnis von 1 : 500. VielePhosphorsäure-Derivate, insbesondere die Thio- und Dithiophosphorsäure-Deriva-te, zeigen gegenüber der Cholinesterase nur eine sehr geringe Inhibitionswirkung.Sie können aber durch eine Oxidation mit Br2 zu Phosphorsäure-Analogen in ihrerinhibitorischen Wirkung bis um den Faktor 1000 gesteigert werden [17].

Die Nachweisgrenze (LOD) einzelner Wirkstoffe ist somit abhängig von derHemmkonstante der jeweiligen Substanz und kann im unteren Pikogrammbereichliegen (Tab. 8.1).

Die Hemmwirkung von Paraoxon, Malaoxon und Carbofuran wurde von Akkadand Schwack mit verschiedenen Esterasen untersucht, z. B. mit der Esterase aus derLeber von Kaninchen, der Bacillus-subtilis-Esterase und der Kutinase von Fusa-rium solani pizi. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Esterasen von Bacillussubtilis und von Kaninchenleber eine besonders hohe Sensitivität für Organophos-phate und insektizide Carbamate aufweisen. [16].

8.3.3 Verfahren zur Durchführung des Cholinesterasehemmtestsmit der Dünnschichtchromatographie

Bei allen vorgestellten Methoden werden die Proben vor der Detektion mittels einerDC- bzw. HPTLC-Platte aufgetrennt und nach folgender Anweisung die Hemm-stoffe detektiert:� Das vom Fließmittel befreite Chromatogramm wird in eine Enzymlösung ge-

taucht (in Einzelfällen auch besprüht).

8.3 Enzymtests 237

Tab. 8.1 Detektionsgrenzen von einigen Organophosphaten, Carbamaten und Pentachlorphenolmit Cholinesterase aus Pferdeserum und ihre Hemmkonstanten auf der Dünnschichtplatte [17]

Aktive Substanz (Enzyminhibitor) Detektionsgrenze[ng/5 mm Band]

Hemmkonstante ki

[l � mol�1 � min�1]

Parathion (nach der Oxidation) 0,045 –

Paraoxon-ethyl 0,013 4,9 � 105

Paraoxon-methyl 0,400 2,2 � 104

Dichlorvos 0,100 5,2 � 104

Mevinphos 0,200 1,4 � 104

Cabaryl 0,200 2,7 � 104

Aldicarb 0,400 1,6 � 104

Butoxycarboxim 0,100 3,2 � 103

Butocarboxim 0,800 1,6 � 103

Oxamyl 0,800 1,4 � 105

Pentachlorphenol 20,00 1,0 � 10

� Die Platte wird in einer feuchten Kammer inkubiert,� nach der Inkubation in eine Substratlösung getaucht (in Einzelfällen auch be-

sprüht).� Die Umsatzreaktion des Enzyms wird durch Hitze bzw. Trocknung gestoppt,� anschließend das Ergebnis auf der Platte dokumentiert und ausgewertet.

Der Hemmeffekt wird durch die verminderte oder fehlende enzymatische Hydroly-se des Substrats ermittelt. Diese wird deutlich durch die Farbdifferenz des Hinter-grunds und der Stellen, an der die Enzymhemmung stattgefunden hat. Die Cholines-terase ist in der Lage, verschiedene Ester zu hydrolysieren. Im Folgenden werdenfünf verschiedene Methoden vorgestellt. Als Haupteinsatzgebiet dieses Enzymtestsgilt insbesondere der Nachweis von lipophilen Enzymhemmstoffen. Bei Thiophos-phorestern und Carbamaten kann eine Behandlung mit Bromdampf vor dem Tau-chen in die Enzymlösung die Bestimmungsgrenze stark erhöhen [24, 25]. Bevor diePlatte in die Enzymlösung eingetaucht wird, muss das überschüssige Brom abge-dampft werden.

Herstellung der Enzymlösung 11 mg Cholinesterase (50 U/mg) werden in 180 ml0,05 TRIS-HCl-Puffer, pH 7,8, gelöst. Um das Enzym auf der Platte zu stabilisie-ren, werden 0,1 % Rinder-Serumalbumin zugesetzt [18]. Das Rinder-Serumalbuminwird bei kleinen Enzymmengen auch als inertes Zusatzprotein zugesetzt, um ei-ne Deaktivierung der Cholinesterase an den Silanolgruppen zu minimieren. Somitkönnen definierte Mengen an Enzymeinheiten auf die Platte appliziert werden. DieEnzymlösung ist bei 4 °C etwa drei Wochen haltbar.

Alternativ werden 5 g Rinderleber in 45 ml TRIS-Puffer 2 min homogenisiert.Der Überstand des Zentrifugats (4000 U/min) wird im Kühlschrank aufbewahrt undbei Bedarf 1 + 4 mit Wasser verdünnt [28]. Ebenso kann eine gut gefilterte 10 %igeSuspension aus Leber in Phosphatpuffer, pH 7, benutzt werden, die bei 0–5 °C meh-rere Monate haltbar ist [21, 22].


Abb. 8.4 Enzymatische Hydrolyse von 1-Naphthylacetat und anschließende Diazotierung durchCholinesterase auf der DC Platte. (Weins [9])

8.3.3.1 Methode 1: Detektion mit Bromthymolblau als pH-IndikatorDas vom Fließmittel befreite Chromatogramm wird in eine Enzymlösung, die aucheinen Säureindikator wie Bromthymolblau enthält, getaucht. Dann wird die Plattemit einer wässrigen Lösung von Acetylcholinbromid oder -chlorid besprüht. Durchdie Abspaltung von Essigsäure verfärbt sich der Indikator, allerdings nur dort, wodas Enzym ungehemmt Acetylcholin spalten kann. Enthält die Probe eine Substanz,die das Enzym blockiert, kann hier keine Essigsäure abgespalten werden. Bei derVerwendung von Bromthymolblau als Säure-Base-Indikator erscheinen Hemmbe-reiche als blaue Flecken auf gelbem Untergrund [18, 19]. Da die Farbänderung nuraufgrund einer Änderung des pH-Wertes zustande kommt, ist die gefärbte Plattenicht langzeitstabil und muss schnell z. B. mithilfe einer Fotodokumentation ausge-wertet werden. Dieses Verfahren eignet sich daher nicht für eine densitometrischeAuswertung.

8.3.3.2 Methode 2: Detektion mit 1-Naphthylacetat als EnzymsubstratBei der auf H. Ackermann [21] zurückgehenden Methode 2 wird die Probe auf-getrennt und anschließend die vom Fließmittel befreite Dünnschichtplatte in dieEnzymlösung getaucht. Nach der Inkubation wird die Platte in eine Mischung aus1-Naphthylacetat (ˇ-Napththylacetat) im Gemisch mit einer Diazoverbindung wieEchtblausalz B getaucht. Das ungehemmte Enzym spaltet die Verbindung 1-Naph-thylacetat in Essigsäure und 1-Naphthol, das mit dem Diazonium-Kation einenAzofarbstoff bildet (Abb. 8.4). In gehemmten Bereichen bildet sich der Diazofarb-stoff nicht, denn die erforderliche Kopplungssubstanz 1-Naphthol ist nicht verfüg-bar.

8.3 Enzymtests 239

1 2 3 4 M

Abb. 8.5 Postchromatographische Detektion von: 1 Paraoxon-Methyl, 0,4 ng/Band; 2 Paraoxon-Ethyl, 2 ng/Band; 3 Naled, 0,4 ng/Band; 4 Dichlorvos, 2 ng/Band; M Mischung aus 1–4 mit demCholinesterase-Inhibitionstest. Stationäre Phase: HPTLC KG 60 F254 (10 cm × 10 cm), mobilePhase: THF/n-Hexan (7 : 25, V/V), Migrationsstrecke: 5 cm, Migrationszeit: 15 min, Dokumenta-tion: Flachbettscanner von Hewlett Packard. (Weins [9])

Eine Variante von Methode 2 benutzt 1-Thionaphthylacetat als Enzymsub-strat. Die Umsetzung zum 1-Thionaphthyl wird durch das SH-spezifische Reagenz2,20-Azo(1-naphtho-l,8-chloro-3,6-disulfonsäure)-4,40-diphenyldisulfid sichtbargemacht [23]. Das Reagenz zeigt rosa Zonen auf blauem Untergrund.

8.3.3.3 Methode 3: Detektionmit Indophenolacetat als EnzymsubstratDie Methode 3 geht auf W. Winterlin zurück [24]. Hier wird das farblose Indophe-nolacetat enzymatisch in das blaue Indophenol umgewandelt [25] (Abb. 8.6).

DurchführungReagenz B: 10 mg Indophenolacetat werden in 10 ml absolutem Ethanol gelöst.

Die vom Fließmittel befreite Platte wird 2 s in die Enzymlösung getaucht und für30 min bei 37 °C in eine Kammer mit 90 %iger Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Anschließend wird die Platte 2 s in die Reagenzlösung B getaucht. Es erscheinenweiße Hemmflecke auf hellblauem, nichtfluoreszierendem Untergrund.

8.3.3.4 Methode 4: Detektion mit Indoxylacetat als EnzymsubstratDie häufig benutzte Methode, das Spaltprodukt 1-Naphthol mit einem Diazonium-kation zu einer farbigen Substanz zu kuppeln, hat ebenso wie die Indophenolblau-Methode einen Nachteil: Man kann densitometrisch nur in Absorption messen. Ei-ne Alternative ist die enzymatische Spaltung von Indoxylacetat [27, 28], 5-Brom-4-chlorindoxylacetat [29], N-Methylindoylacetat [30] oder Bromindoxylacetat [31].

Hier wird das nichtfluoreszierende Indoxylacetat in das stark fluoreszierende In-doxyl (oder die entsprechenden substituierten Indoxyle) umgesetzt. Allerdings setzt


O

O

CCH3

O

O O-N

N

Enzym

Indophenolblau

Abb. 8.6 Enzymatische Hydrolyse von Indophenolacetat durch Cholinesterase in das Indophe-nolblau

sich Indoxyl in einer weiteren Reaktion mit Sauerstoff zu dem nichtfluoreszieren-den blauen Indigo (bzw. substituierten Indigo) um (Abb. 8.7).

Ein alternativer Reaktionsweg wird bei der Spaltung von Resorufinacetat (nicht-fluoreszierend) in das fluoreszierende Resorufin begangen (Abb. 8.8). Hier erhältman nichtfluoreszierende Hemmzonen auf fluoreszierendem Untergrund [27].

DurchführungReagenz C1: 10 mg Indoxylacetat werden in 6 ml absolutem Ethanol gelöst [28].

Es kann auch eine 0,5 %ige N-Methylindoxylacetat-Lösung in Ace-ton/Wasser (2 : 3) verwendet werden [30].

Reagenz C2: Zu 2,85 ml TRIS-Puffer (0,01 m, pH 7,4) werden 0,15 ml 0,001 mResorufinacetat-Lösung gemischt [27].

Die von Fließmittel befreite Platte wird 2 s in die Enzymlösung getaucht und für30 min bei 37 °C in eine Kammer bei 90 %iger Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Anschließend wird die Platte 2 s in die Reagenzlösung C1 oder C2 getaucht. Eserscheinen bei Verwendung von Reagenz C1 weiße Hemmflecke auf hellblauem,teilweise fluoreszierendem Untergrund. Bei Verwendung von Reagenz C2 zeigensich nichtfluoreszierende Hemmzonen auf fluoreszierendem Untergrund.

8.3.3.5 Methode 5: Detektion mit Acetyl-Thiocholin als EnzymsubstratAls Substrat für das Enzym Acetylcholinesterase kann auch Acetyl-Thiocholin ver-wendet werden. Nach der enzymatischen Abspaltung von Essigsäure entsteht Thio-

8.3 Enzymtests 241

O

OC

CH3

N

Enzym

OH

N

O2Ascorbinsäure

OH

O2

OH

N

N

N

N

O

O

Indigo

Abb. 8.7 Enzymatische Hydrolyse von Indoxylacetat durch Cholinesterase in das stark fluores-zierende Indoxyl

O

O

CCH3

OOO

N NEnzym

nichtfluoreszierend stark fluoreszierend

O-O

Abb. 8.8 Enzymatische Hydrolyse von Resorufinacetat durch Cholinesterase in das fluoreszie-rende Resorufin

cholin, das als SH-aktive Verbindung z. B. mit Ellmann-Reagenz (5,50-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure), DTNB) umgesetzt werden kann [30]. Die Methode ist für dieDC nur bedingt geeignet, da weiße Zonen auf schwach gelbem Untergrund erschei-nen.

Vielversprechender ist die Detektion von Thiochinolin mit Maleimid CPM. DieVerbindung 7-Diethylamino-3-(-40-maleimidyl-phenyl)-4-methylcoumarin, kurzCPM oder Maleimid CPM genannt, reagiert selektiv mit SH-Gruppen zu einemblau fluoreszierenden Farbstoff (Abb. 8.9).


O

SCCH3

O

O O

O

N

Enzym

blau, fluoreszierend

Cl-

CH2CH2

CH3

CH3

CH3

NCl-

+

-CH3COOH

O

N

OO

CH3

CPMC2H5

C2H5

N+

Thiocholin

CH3 +

N CH3

CH3CH2

CH2

HS

C2H5

C2H5

CH3

O

N

H

S

CH2

CH2

+CH3

CH3

CH3

N

Abb. 8.9 Kopplungsreaktion des Thiochinolins mit Maleimid CPM zu einem blau fluoreszieren-den Farbstoff

Neben der Kopplung des enzymatisch gebildeten Thiochinolins mit Maleimidgibt es noch eine Variante dieser Reaktion. Thiocholin kann leicht oxidiert wer-den. Wird als Redox-Indikator 2,6-Dichlor-phenolindophenol benutzt, ergeben sichblaue Hemmzonen auf farblosem Untergrund, da reduzierende Verbindungen dasReagenz zu einer farblosen Verbindung, die grün fluoresziert, umsetzen. Leider istdie blaue Farbe an Luft nicht sehr stabil, doch wenn die Platte in Paraffin (dünnflüs-sig)/n-Hexan (1 + 2) getaucht wird, bleibt die Färbung für über eine Stunde stabilund kann densitometrisch ausgewertet werden [20].

8.3 Enzymtests 243

Durchführung 1 mit Maleimid als Farbstoff-KopplungsreagenzReagenz D1: 0,3 mM Acetylthiocholin in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 8

[31].Reagenz D2: 0,4 mM Maleimid CPM, gelöst in Dimethylsulfoxid [31].

Nach der Entwicklung wird die DC-Platte vom Fließmittel befreit. Die Plattewird dann für 2 s in die Enzymlösung getaucht und für 30 min bei 37 °C in eineKammer bei 90 %iger Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wird die Platte indie Reagenzlösung D1 (Acetylthiocholin) und nach 10 min in Reagenzlösung D2getaucht. Es erscheinen farblose Zonen auf blau fluoreszierendem Untergrund [32].

Durchführung 2 mit 2,6-Dichlor-phenolindophenol als Farbstoff-Kopplungs-reagenzReagenz E1: 100 mg S-Acetylthiocholinchlorid werden in 10 ml Wasser gelöst.Reagenz E2: 50 mg 2,6-Dichlor-phenolindophenol-Natriumsalz werden in 100 ml

Wasser gelöst [33].Reagenz E3: 20 g Paraffin (dünnflüssig) werden in 200 ml Petrolether (alternativ

auch in n-Hexan oder n-Pentan) gelöst [34].Nach der Entwicklung wird die DC-Platte vom Fließmittel befreit, 2 s in die

Enzymlösung getaucht und 30 min bei 37 °C (wasserdampfgesättigt) inkubiert. An-schließend wird die Platte in Reagenz E1 getaucht und 15 min bei 37 °C gehalten.Nach dem Trocknen wird die Platte 2 s in Reagenz E2 getaucht, erneut getrocknetund in Reagenz E3 getaucht. Es sind blaue Zonen auf farblosem Untergrund zusehen, was densitometrisch gut auszuwerten ist.

8.3.4 Verfahren zur Bestimmung von Schwermetallen mittelsdes Enzyms Urease

Das Enzym Urease kommt in Bakterien, Pilzen und höheren Pflanzen vor. Ureasewandelt Harnstoff in Ammonium-Kationen um.

Harnstoff .H2N � CO � NH2/ C H2OUrease! CO2 C 2NH3 (8.3)

Das bei dieser Umsetzung freiwerdende Ammoniak kann mithilfe von pH-Indi-katoren nachgewiesen werden. Cadmium, Zink, Kupfer, Silber, Quecksilber undOrgano-Quecksilberverbindungen sind sehr starke Inhibitoren der Urease. Blei in-hibiert das Enzym jedoch nicht [35].

DurchführungUrease-Lösung: Urease wird in einem 0,1 mM Phosphatpuffer, pH 7, gelöst

(75 U/ml).Reagenz-Lösung: Als Substratlösung werden 500 mg Harnstoff in 12,5 ml einer

0,01 %igen Bromthymolblaulösung gelöst, die mit Na2CO3 aufden pH-Wert 7 eingestellt wurde.

Nach der chromatographischen Trennung wird die von Fließmittel befreite DC-Platte mit 10 ml Enzymlösung/Platte besprüht oder 2 s in die Enzymlösung ge-taucht, 30 min bei 80 bis 90 %iger Luftfeuchtigkeit und 25 °C in einem Brutschrank


inkubiert und anschließend mit 12,5 ml Reagenz-Lösung pro Platte besprüht. DieHemmflecke treten als gelbe Flecke auf blauem Grund auf [35]. Quecksilber-Orga-nyle können im ng-Bereich detektiert werden [36].

8.3.5 Einsatz von Redox-Enzymen zur selektiven Detektionvon Substraten

Flavinabhängige Redox-Enzyme kann man nach ihrer Fähigkeit unterscheiden, wiesie mit unterschiedlichen Elektronenakzeptoren reagieren. Üblich ist die Unter-scheidung in Dehydrogenasen und Oxidasen. Die flavinabhängigen Dehydrogen-asen zeigen kaum eine Tendenz, die reduzierte Form des Flavinnukleotids durchmolekularen Sauerstoff zu reoxidieren. Im Gegensatz dazu werden reduzierte Fla-vin-Oxidasen durch Sauerstoff wieder oxidiert und bilden dabei H2O2. Wasserstoff-peroxid kann dann leicht durch eine chemische Reaktion identifiziert werden.

1979 wurde von Pazur und Romanic die Bestimmung von Zuckermolekü-len wie Galaktose, N-Acetyl-D-galaktosamin und 2-Deoxy-D-galaktose durch ei-ne Umsetzung mit der Galaktose-Oxidase beschrieben. Nach der DC-Trennungwird die Platte in eine Lösung, bestehend aus 125 Units Galaktose-Oxidase und500 Units Meerrettich-Peroxidase in 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, ge-taucht oder mit ihr besprüht. Findet das Enzym ein Substrat, wird das gebildeteH2O2 mit einer 0,5 %igen Lösung von o-Tolidin in Ethanol als blaue Zone identifi-ziert [37].

Mit einer substratspezifischen Enzymreaktion gelang es Krüger 1991 bei derdünnschichtchromatographischen Zuckertrennung, bei der sich Glucose und Galak-tose auf dem Chromatogramm überlagerten, die jeweiligen Einzelzucker mit einemspezifischen Enzym selektiv nachzuweisen: ˇ-Galaktose wird in Gegenwart vonNAD+ durch die ˇ-Galaktose-Dehydrogenase in D-Galaktono-ˇ-Lacton oxidiertunter Bildung von NADH + H+. Phosporylierte D-Glucose (Glucose-6-phosphat)wird in Gegenwart von NADP+ durch die Glucose-6-P-Dehydrogenase in Gluco-nat-6-phosphat oxidiert unter Bildung von NADPH + H+ [38].

Nach dem gleichen Prinzip können 3ˇ-Hydroxysteroide direkt auf der DC-Platte identifiziert werden. Benutzt wird eine Lösung, in der 10 Units 3ˇ-Hydro-xysteroid-Oxidase, 100 Units Peroxidase, 15 mg Phenol, 2 mg 4-Aminoantipyrinund 0,02 ml Triton X-100 in 20 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst oder sus-pendiert sind.

Die nach der Trennung vom Fließmittel befreite DC-Platte wird in die Reakti-onslösung getaucht und für 30 min bei 37 °C in einem feuchten Raum inkubiert.Setzt das Enzym das Substrat um, entstehen rosa gefärbte Zonen [39].

Eine Dehydrogenase-Aktivität wird in der Biochemie durch die Umsetzungeines (farblosen) Tetrazolium-Salzes zu einer tief rosa gefärbten Formazan-Ver-bindung angezeigt (Abb. 8.10). Auf diese Weise können lebende von toten Zellenunterschieden werden. Diese Reaktion bildet damit die Grundlage für erkennbareHemmungen lebender Kulturen (wie z. B. Bacillus subtilis) auf der DC-Platte (sieheauch Abschn. 8.6).

8.3 Enzymtests 245

NO2

I

NN

N N+

NO2

Cl-

N

NN

I

HNElektronendonor (z.B. NADH)

Succinat-Dehydrogenase

INT (farblos) INT red. (roter Farbstoff)

Abb. 8.10 Enzymatische Reaktion von Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-ni-trophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid). Die weiße Substanz wird enzymatisch durch lebendeZellen zum roten Formazan reduziert

3˛-Hydroxysteroide reagieren mit NAD+ zu 3-Ketosteroiden unter Bildung vonNADH. Das Coenzym NADH reduziert 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phe-nyl-2H-tetrazoliumchlorid (INT) mithilfe des Enzyms Diaphorase (Dihydrolipo-amid-Dehydrogenase) zu einem rosafarbigen Formazan-Farbstoff. Als Reagenzlö-sung werden 6 mg INT, 1 Unit 3˛-Hydroxysteroid-Dehydrogenase, 50 Units Dia-phorase und 5 µmol NAD+ in 10 ml 0,2 M K2HPO4-Puffer, pH 8,5, gelöst bzw.suspendiert. Nach der Trennung wird die vom Fließmittel befreite DC-Platte in dieReagenzlösung getaucht und für 30 min bei 37 °C in einem feuchten Raum inku-biert. An jenen Stellen, an denen NADH gebildet wurde, erscheinen auf der DC-Platte rosafarbige Zonen [40].

8.3.6 Definierte Bedingungen für Enzymtestsauf der Dünnschichtplatte zur Quantifizierungvon bioaktiven Stoffen und zur Validierung

Neben der qualitativen Erfassung bioaktiver Stoffe ergeben definierte Bedingun-gen für Enzymtests auf dem Chromatogramm reproduzierbare Ergebnisse, die eserlauben, Nachweisgrenzen dieser Stoffe in einem ausgewählten Testsystem zu be-stimmen. Mithilfe von Kalibrierstandards kann entweder durch eine Auswertungder Fotodokumentation oder durch eine Messung der Farbdifferenzen mittels einesdensitometrischen Scanners eine Dosis-Wirkungs-Beziehung erstellt und somit dieStoffkonzentration bestimmt werden.

Die Validierung einer linearen Korrelation zwischen der Enzymhemmung undder Konzentration des Inhibitors kann erfolgreich durchgeführt werden, indem ei-ne Enzymlösung mit einer konstanten spezifischen Aktivität (Units/mg Protein)verwendet und eine konstante Inkubationszeit eingehalten wird (Abb. 8.11 undAbb. 8.12). Die Kalibrierung kann über einen weiten Bereich erfolgen. Die obereGrenze des linearen Bereiches wird bestimmt durch die Vergrößerung der Effektein großen ovalen Flecken [16, 18].


1 98765432

1,1 110835528118,35,52,8

Abb. 8.11 Kalibrierungsstandards von Paraoxon im Bereich von 1–110 pg pro Band, Detektionmit dem Cholinesterasehemmtest (Methode 2), Dokumentation per Flachbettscanner

Die Nachweisgrenze von Paraoxon wurde mit dem postchromatographischenCholinesterasehemmtest bei 20 pg/5 mm Band ermittelt. Bei einer konstanten En-zymkonzentration und einer konstanten Reaktionszeit ist die Höhe (bzw. die Fläche)des Hemmsignals der Konzentration des Inhibitors (bei Paraoxon zwischen 20 und400 pg/5 mm Band) proportional. Bei höheren Inhibitorkonzentrationen zeigt dieKalibrierkurve einen polynomen Kurvenverlauf 2. Ordnung.

Bei der Messung des Höhen- bzw. Flächensignals während der Enzyminhibiti-onsmessung auf der Dünnschichtplatte entspricht die Basislinie der Menge an un-gehemmtem Enzym E0, wobei in Gegenwart von Enzyminhibitoren in den weißenHemmflecken die Enzymkinetik von EI zu messen ist. Das gemessene Hemmsignal(die Höhe oder Fläche) ist somit das Resultat von E0 � EI (Abb. 8.13).

Da auf der Platte beide enzymatischen Reaktionen (E0 und EI) ablaufen und dasMesssignal aus der Differenz beider Reaktionen resultiert, ist für die Validierung ei-ne optimale Reaktionszeit zu ermitteln. Bei der in Abb. 8.14 dargestellten Reaktionerhält man das deutlichste Signal nach 3 Minuten.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Pg Paraoxon

Pea

khöh

e

0 50 150 250 350100 200 300 400

Abb. 8.12 Lineare Kalibriergerade von Paraoxon im Bereich 20–400 pg per Band, Detektiondurch den Cholinesterasehemmtest und vermessen der Peakhöhen densitometrisch bei 533 nm

8.3 Enzymtests 247

–[EO(t) – El(t)]

EO(t)

Abb. 8.13 Differenz in der Kinetik bei der enzymatischen Umsetzung von 1-Naphthylacetat derungehemmten Cholinesterase E0(t) und der inhibierten Cholinesterase EI (t) durch 0,4 ng Parao-xon-Methyl (Methode 2)

Allgemein bedeutet dies, dass die Höhe des Signals abhängig ist von der Reak-tionszeit, da in der „steady state“-Phase des ungehemmten Enzyms E0 das Gleich-gewicht bereits vorliegt, während die Reaktion des gehemmten Enzyms in Abhän-gigkeit von der Inhibitorkonzentration ihren „steady state“ noch nicht erreicht hat.

I Die Bestimmung der Detektionsgrenze (LOD) eines Inhibitors mit einem spezifi-schen Enzym ist abhängig von:1 der Enzymaktivität der Tauch- bzw. Sprühlösung (Units/mL).

Begründung: Lagerungszeit und -bedingung können die Enzymaktivität verän-dernunddahermuss die Enzymaktivität vor der Bestimmungüberprüftwerden.

2 der spezifischenEnzymaktivität der Tauch- bzw. Sprühlösung (Units/mgProtein).Begründung:DerGehalt anbiochemisch inertemProteinwie z. B. Rinderserum-proteinbestimmtdenGehalt anaktivemEnzymauf der stationärenPhasederDCPlatte.

3 der Reaktionszeit der enzymatisch katalysierten Substratumsetzung.

0

200

400

600

800

1000

1200

Pea

kflä

che

0 1-1 3 5 7

(min)

Abb. 8.14 Abhängigkeit der Fläche des Paraoxon-Hemmsignals von der Zeit, 0,1 ng/5 mm Bandauf einer KG-60-F-HPTLC-Platte, Detektion mit dem Cholinesterasehemmtest, = 533 nm


Begründung: Die Reaktionszeit auf der DC-Platte bestimmt die Differenz zwi-schen ungehemmter und gehemmter Reaktion und somit die Intensität desMesssignals.

Aufgrund der Einflussfaktoren des Testsystems auf die Detektionsgrenze einerSubstanz können nur statistisch gesicherte Aussagen gemacht werden, wenn dieKalibrierung und Probenbestimmung gemeinsam auf einer Dünnschichtplatte erfol-gen. Bei einer HPTLC-Platte mit dem Format 10 cm × 20 cm stehen z. B. bei einerBandbreite von 5 mm und einem Bahnabstand von 5 mm 18 Auftragemöglichkeitenzur Verfügung.

8.3.7 Anwendungsbeispiele für den Einsatz enzymatischerHemmtestemit der Dünnschichtchromatographie

Der Einsatz enzymatischer Hemmtests mithilfe der Dünnschichtchromatographieist besonders geeignet bei der Identifizierung lipophiler Stoffe, die in Wirkungtestsin vitro wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit nur bedingt nachgewiesen werdenkönnen. Aufgrund der Möglichkeit, in einer komplexen Probe diese Stoffe nach ih-rer Polarität aufzutrennen, können Verunreinigungen in Standardlösungen erkanntsowie die Gegenwart von Schadstoffen in Umwelt- und Lebensmittelproben darge-stellt werden.

8.3.7.1 Reinheitskontrolle von Standardsubstanzenmit dem Cholinesterasehemmtest

Ein Standard ist ein Präparat einer chemischen Substanz, das als Referenzprobeverwendet werden kann, um z. B. die Richtigkeit eines Analysenverfahrens zu beur-teilen. Standardproben sind Proben, deren Konzentration der interessierenden Sub-stanz hinreichend genau bekannt ist und die somit als „Standards“ verwendet wer-den. Wichtig ist, dass diese kommerziell erhältlichen Materialien „eine“ definierteMatrix (z. B. reines Lösemittel) und „eine“ Konzentration enthalten (z. B. eine Oxi-dationsstufe eines Elements etc.) [42].

Die Dünnschichtchromatographie stellt ein robustes Verfahren dar für die Über-prüfung und Reinheitskontrolle von Standardsubstanzen. Besonders bei hohen Un-tersuchungszahlen z. B. bei Prozesskontrollen in der chemischen Industrie oder beider Reinheitskontrolle von Pharmazeutika gilt die HPTLC als eine zuverlässige undschnelle Methode.

Parathion (O,O-Diethyl-O-4-nitro-phenylthiophosphat)wird mithilfe der Biotrans-formation, aber auch abiotisch transformiert (Abb. 8.15). Das entstandene Paraoxonbesitzt eine 1000-fach höhere Toxizität gegenüber der Cholinesterase als das genu-ine Parathion.

Bei der Überprüfung von Parathion als Standardsubstanz konnte mithilfe derHPTLC im Chromatogramm bei einer Messwellenlänge von = 280 nm ein einzel-

8.3 Enzymtests 249

O

ON N

Parathion Paraoxon

OO

POS

O2

H2O H2SO

O

OO O

OP

Abb. 8.15 Oxidative Desulfurierung von Parathion zu Paraoxon

ner Substanzpeak nachgewiesen werden. (Das Absorptionsmaxium von Parathionliegt bei einer Messwellenlänge von = 280 nm.) (Abb. 8.16a)

Die anschließende Hemmung der Cholinesterase auf dem gleichen Chromato-gramm weist Paraoxon – eine bisher nicht erkannte Verunreinigung des Parathions –als toxikologisch relevanten Hauptpeak (bei 17 mm Migrationsstrecke) nach sowieeine weitere bisher nicht identifizierte Komponente, die aufgrund der Migrations-strecke etwas unpolarer ist als Paraoxon. Nach der quantitativen Bestimmung desParaoxons beträgt die Verunreinigung von 500 ng Parathion mit Paraoxon 0,350 ng;das entspricht einer Verunreinigung von 0,07 % [42].

Methiocarb (3,5-dimehyl-4-methyl-thiophenyl-N-methylcarbamat) gehört zu derGruppe der Methylcarbamate und wurde 1965 als Insektizid eingeführt. Methiocarbwird bis heute hauptsächlich als Pflanzenschutzmittel gegen Insekten (Insektizid),Milben (Akarizid) und Schnecken (Molluskizid) in zahlreichen Kulturen und Saat-gutbehandlungsmitteln gegen Vogelfraß verwendet [43].

Der abiotische Abbau von Methiocarb (1) durch Fotooxidation verläuft von dergenuinen Substanz über das Methiocarbsulfoxid (2) zu Methiocarbsulfoxid (3) oderzu Methiocarbphenolsulfon (4) [44] (Abb. 8.17a).

Neben Methiocarb selbst sind die Oxidationsprodukte Methiocarbsulfoxid undMethiocarbsulfon ebenfalls hochwirksame Inhibitoren der Cholinesterase. Auf-grund der Hemmkonstanten zeigt das Methiocarbsulfoxid eine 3-mal höhereHemmwirkung als das genuine Methiocarb. Die Hemmkonstante von Methio-carb gegenüber der Cholinesterase (BChe/H) ist ki = 1,3 � 104 [l mol�1 min�1], beiMethiocarbsulfoxid beträgt ki = 4,3 � 104 [l mol�1 min�1] [17]. Abbildung 8.17bzeigt das Ergebnis der Chromatographie einer Standardlösung von Methiocarb.Durch die Lage im Chromatogramm und die Wirkstärke werden mögliche Tran-formationsprodukte von Methiocarb (1) wie das 3-fach wirksamere und polarereMethiocarbsulfoxid (2) deutlich. Methiocarbphenolsulfoxid (3) und Methiocarb-phenolsulfon (4) liegen als Phenolderivate klar abgetrennt im unteren Teil desChromatogramms [44].

8.3.7.2 Detektion von Inhibitoren der Cholinesteraseim Oberflächengewässer

Für die Charakterisierung eines Oberflächengewässers wurde zur Erstellung einesGewässerprofils an sechs Probestellen je 1 l Wasserprobe auf esterasehemmendeVerbindungen untersucht. Die Probenvorbereitung und chromatographische Auf-


Abb. 8.16 Absorptions-Orts-Kurve in mm von 500 ng Parathion. a Messwellenlänge: = 280 nm,b postchromatographischer Cholinesterasehemmtest; Messwellenlänge: = 533 nm. KG 60 F(Merck), mobile Phase: THF/n-Hexan (7 + 25, V/V), Original Scannerausdruck CD 60, Desaga,Heidelberg, Deutschland

8.3 Enzymtests 251

a b

600 400 100 20 60 10 6 2 1 ng/band

1

2

3

4

O - C - N -CH3

H

Methiocarb sulfoxie (2)

Methiocarb sulfone

O

O - C - N -CH3

HO

O - C - N -CH3

HO

CH3

CH3

H3CS = O

CH3

CH3

H3CO = S = O

CH3

CH3

H3CO = S = O

CH3H3C

CH3

S

OH CH3

CH3

S = OH3C

OH

CH3

CH3H3C

OH

S

Methiocarb phenolsulfone (4)

Methiocarb phenolsulfoxide (3)

Methiocarb phenol

Methiocarb (1)

Abb. 8.17 a Abiotische Abbauwege von Methiocarb (Marrs [44]), b postchromatographischeDetektion der Abbauprodukte von Methiocarb mit dem Cholinesteraseinhibitionstest; stationärePhase: KG 60 F 254 s (MERCK, Art. Nr. 5365), Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm,chromatographische Entwicklung: automatische Mehrfachentwicklung nach DIN 38407 Teil 11mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Dokumentation mit Peltier Cooled CCDs/w Kamera SensiCam® (AVT Horn, Aalen, BRD); 1 Methiocarb, 2 Methiocarbsulfoxid, 3 Me-thiocarbphenolsulfoxid, 4 Methiocarbphenolsulfon. (Weins [9])

trennung der Verbindungen erfolgten gemäß DIN 38 407 Teil 11. Nach der chro-matographischen Trennung wurden Inhibitoren der Cholinesterase auf der Plattedetektiert und qualitativ mittels Fotodokumentation ausgewertet.

Abbildung 8.18 macht deutlich, dass insbesondere die Kläranlagenausläufe (1)und (5) mit Inhibitoren der Cholinesterase belastet sind. Neben möglichen urba-nen Pestiziden können auch Arzneistoffe, wie z. B. Bambuterol und Terbutalin alsBroncholytika, sowie cholinerge Parasympathomimetika, wie Neostigmin und Ta-crin, als Ursache für die Hemmung der Cholinesterase in Frage kommen (sieheAbschn. 8.3.2). Diese binden sich reversibel an die katalytisch wirksame Seitedes Cholinesterase-Moleküls und blockieren so die Enzymaktivität. Damit wird dieAcetylcholinkonzentration im synaptischen Spalt erhöht, d. h. die cholinerge Akti-vität nimmt zu. In hohen (normalerweise klinisch nicht erreichten) Konzentrationenhat Tacrin auch Auswirkungen auf andere Neurotransmitter [45].


K L 1 2 3 4 5 6

Abb. 8.18 Gegenwart von Inhibitoren der Cholinesterase in einem Gewässer. 1 und 5 Kläran-lagenauslauf, 2 und 6 ca. 100 m unterhalb der Kläranlage, 3 und 4 Probestellen, K unbelasteteWasserprobe, L Leerbahn; stationäre Phase: HPTLC KG 60 F254, Format: 10 cm × 20 cm, Schicht-dicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung: automatische Mehrfachentwicklung mit demAMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Dokumentation: Peltier Cooled CCD Kamera Sen-siCam®, AVT Horn, Aalen, BRD. (Weins [9])

Die Tagesdosis beträgt zwischen 5 mg und 160 mg. Die Nachweisgrenze vonTacrin im Cholinesterasehemmtest in der HPTLC-AMD beträgt 20 pg/pro Fleck[9].

8.3.7.3 Detektion von Inhibitoren der Cholinesterase in LebensmittelnZur Untersuchung auf Rückstände in Lebensmitteln wurden Extrakte von Karot-ten und Salat auf Cholinesterase-Inhibitoren untersucht. Die Wirkstoffe wurden ausden pflanzlichen Lebensmitteln gemäß dem deutschen Einheitsverfahren extrahiert(DFG S19).

Hierbei wurden 100 g pflanzliches Untersuchungsmaterial mit Aceton versetzt.Dabei wurde so viel Wasser zugegeben, dass unter Berücksichtigung des natürli-chen Wassergehalts der Probe das Verhältnis Aceton : Wasser während der Extrak-tion jeweils 2 : 1 Volumenteile beträgt. Zu dieser Lösung bzw. zum filtrierten Extraktwurde Dichlormethan zugegeben, wobei überschüssiges Wasser abgeschieden wur-de. Der Abdampfrückstand der organischen Phase wurde durch eine Gelpermeati-onschromatographie an dem Polystyrol Bio-Beads S-X3 durch Elution mit einemCyclohexan-Essigsäure-Gemisch gereinigt. Von der rückstandshaltigen Fraktion,die auf eine Konzentration von 4,5 g Untersuchungsmaterial/ml eingestellt wurde,wurden für die Analyse 50–100 µl Extrakt auf die HPTLC-Platte appliziert.

In Abb. 8.19 wird ersichtlich, dass eine der vier Salatproben mit einem Choli-nesterase-Inhibitor belastet ist. Hier besteht der Verdacht einer Kontamination derProbe mit einen insektiziden Pestizid, z. B. Methiocarb oder einem Metaboliten vonMercaptodimethur.

Alle vier Extrakte aus den verschieden Chargen von Karottenproben weiseneinen charakteristischen Substanzgehalt an Inhibitoren der Cholinesterase auf.

Da die instrumentelle Analytik keine Belastung gängiger Pestizidwirkstoffe be-stätigen konnte, sollten hier durch die Extraktion freigesetzte sekundäre Pflanzen-

8.4 Detektion von Herbiziden durch die Hemmung der Fotosynthese in Chloroplasten 253

S0 K0 L MethImaz. MeSalat Karotten

Abb. 8.19 Gegenwart von Cholinesterase-Inhibitoren in verschiedenen pflanzlichen Lebensmit-telproben. S0 Kontrolle Salat, Salat 4 Salatproben, K0 Kontrolle Salat, L Leerbahn, Standards:Imaz Imazalil 10 ng, Me Mercaptodimethur 30 ng, Meth Methiocarb 30 ng; stationäre Phase:HPTLC KG 60 F254, Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwick-lung: automatische Mehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz),Dokumentation: Peltier Cooled CCD Kamera SensiCam®, AVT Horn, Aalen, BRD (Weins [9])

inhaltsstoffe diskutiert werden, die als pflanzliche Insektizide fungieren können.Insgesamt konnten bei dieser Untersuchung in 10 von 35 Proben 1–4 Wirkstoffe alsKontaminanten detektiert werden.

8.4 Detektion von Herbiziden durch die Hemmungder Fotosynthese in Chloroplasten

Die Gruppe der Herbizide umfasst eine Vielzahl von Stoffen mit unterschiedli-chen chemischen Strukturen. Sie können an vielen verschiedenen Stellen im Pflan-zenhaushalt eingreifen und das Wachstum der Pflanze blockieren. Die wichtigstenkommerziell erhältlichen Herbizide hemmen die Fotosynthese. Dazu zählen dieVerbindungen Atrazin, Simazin, Defenuron, Linuron und Ähnliche [46]. MittelsDC können diese Herbizide in einem einfachen Test identifiziert und in einem Be-reich von 50 µg bis 1000 µg pro kg Probe quantifiziert werden. Gute Übersichtenzur Methode finden sich unter [47] und [48].

Das Detektionsverfahren basiert auf der Hemmung der Hill-Reaktion. Die Hill-Reaktion beschreibt den durch Licht induzierten Elektronentransport unter Bildungvon Sauerstoff in den inneren Membranstrukturen der Chloroplasten (Thylakoi-de). Der Elektronentransport kann durch Einsatz künstlicher Elektronenakzeptorendargestellt werden. Hierbei kann z. B. die blaue Verbindung 2,6-Dichlor-pheno-lindophenol (DCPIP) durch aktive Chloroplasten entfärbt werden, da diese unterLichteinwirkung Reduktionsäquivalente (NADPH) bilden. DCPIP fungiert hierbeials Elektronenakzeptor, wird durch das gebildete NADPH reduziert und verliert da-bei seine blaue Farbe. Mit der im Folgenden beschriebenen Methode können 40 bis45 % aller kommerziell vertriebenen Herbizide erfasst werden [47].


8.4.1 Isolierung der Chloroplasten und Lagerungder Chloroplastensuspension

Pufferlösung A1: Es wird eine Pufferlösung mit pH 8,6 hergestellt, bestehend aus0,1 M Borax (Na2B4O7) und 0,1 M HCl im Verhältnis 7 : 3.

Pufferlösung A2: Es kann auch eine Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eingesetztwerden. Dazu werden 700 mg KH2PO4 in einem Liter Wassergelöst und der pH-Wert mit KOH oder H3PO4 auf 7,5 einge-stellt.

Chloroplastensuspension (CS) 300 g frische Spinatblätter werden mit destillier-tem Wasser gewaschen. Anschließend wird mit einem scharfen Messer oder Skal-pell die Mittelrippe entfernt. Ca. 140 g präparierte Blätter werden mit 20 g Eis ineinen mit Aluminiumfolie umwickelten PE-Behälter unter Zugabe von 30 ml Puf-ferlösung A1 in Eiswasser getaucht und homogenisiert. Das Homogenisat wirddurch eine feine Gaze (Verbandmull) mit leichtem Handdruck gefiltert und auf dreiFalcon-Röhrchen (mit Aluminiumfolie umwickelt) verteilt. Das Homogenat wirdzentrifugiert (14 °C, 10 min bei 3600 Umdrehungen pro Minute). Der Überstandwird verworfen. Die Chloroplastenpellets werden in 30 ml Phosphatpuffer A2 und3 g Glycerin wieder aufgenommen und in 5-ml-Portionen eingefroren. Die Chloro-plastenlösungen müssen stets im Dunkeln gehalten und gehandhabt werden.

8.4.2 Durchführung des Fotosynthesehemmtestsauf der Dünnschichtplatte

Der Fotosynthesehemmtest kann auf Kieselgel- und Celluloseplatten durchgeführtwerden.Reagenz A3: Es werden 20 mg 2,6-Dichlor-phenolindophenol in 50 ml Wasser ge-

löst.Reagenz A4: Es werden 5 ml Chloroplastensuspension (CS) mit 45 ml Wasser ver-

mischt. Diese Suspension wird mit Reagenz A3 im Verhältnis 4 : 1gemischt.

Die vom Fließmittel befreite Platte wird für 4 s in Reagenz A4 getaucht [22].Die DC-Platte wird mit einer Glasplatte abgedeckt, um die Schicht feucht zu halten.Anschließend wird die Platte ca. 2–5 min mit intensivem weißem Licht aus kurzemAbstand bestrahlt (ca. 40 Watt). Geeignet sind dazu Halogenscheinwerfer, die ineinem Abstand von etwa 20 cm über der Platte angebracht sind. Inhibitorsubstan-zen der Hill-Reaktion zeigen innerhalb von 1–2 min dunkelblau-graue Zonen aufschwach gelb-grünem Untergrund. Steht nur Sonnenlicht zur Verfügung, kann dieReaktion unter Umständen Stunden dauern. Die Beleuchtung sollte beendet wer-den, wenn sich der Untergrund nicht weiter entfärbt. Die Platten müssen schnellund möglichst im Dunkeln ausgewertet werden.

8.5 Detektion bioaktiver Stoffe mit Photobacteriumfischeri 255

1 2 3(M) 4 5 6

Abb. 8.20 Trennung von fünf Triazin-Herbiziden. 1 Atraton (2 ng pro Band), 2 Terbumeton (1 ngpro Band), 3 (M) Standardmischung, 4 Simazin (2 ng pro Band), 5 Atrazin (1 ng pro Band) and6 Terbuthylazin (1 ng pro Band); stationäre Phase: Kiesegel KG 60 F254, mobile Phase: Cyclo-hexan/Methyl-tert-butylether (1 + 1, V/V). (Mit freundlicher Genehmigung von B. Spangenberg,Fachhochschule Offenburg, 2011)

Zur Verstärkung der Kontraste kann die feuchte Platte für 2 s in eine Polyethylen-glykollösung (10 % PEG-6003 in Methanol) getaucht werden. Diese Tauchlösungverstärkt die rote Fluoreszenz des Chlorophylls.

Abbildung 8.20 zeigt die Trennung von fünf Triazin-Herbiziden. Auf den Bah-nen 1 und 2 sowie auf den Bahnen 4 bis 6 wurden Standardsubstanzen chromato-graphiert. Die Standardmischung wurde auf Bahn 3 aufgetrennt.

8.5 Detektion bioaktiver Stoffemit Photobacteriumfischeri

Das nichtpathogene gram-negative Leuchtbakterium Vibrio fischeri kommt frei imMeer wie auch symbiotisch in vielen Meerestieren vor und ist als biologischerDetektor für Schadstoffe besonders geeignet. Leuchtbakterien der Gattung Vibriofischeri sind deshalb die Testorganismen der Wahl für die schnelle und exakte Erfas-sung toxischer Einflüsse von Flüssigkeiten und Feststoffen. Seit mehr als zwanzigJahren werden Leuchtbakterien allgemein zur Messung der Toxizität von Wasser-proben eingesetzt, beschrieben in der Norm EN ISO 11348 Teil 1 bis Teil 3: „Be-stimmung der Hemmwirkung von Wasserproben auf die Lichtemission von Vibriofischeri (Leuchtbakterientest)“.

Leuchtbakterien sind in der Lage, Stoffwechselenergie in Licht umzuwandeln.Die Lichtemission ist dabei direkt an die Vitalität gekoppelt. Werden Leucht-bakterien mit toxischen Stoffen konfrontiert, kommt es zu einer Verminderungder Leuchtintensität in Abhängigkeit von der toxischen Potenz dieser Stoffe. DerLeuchtbakterientest wird seit 1991 zur Prüfung von Abwasser herangezogen. Er istebenso für Chemikalienprüfungen anwendbar.

Genauere biochemische Untersuchungen des Leuchtvorganges zeigen, dass ersehr eng mit der Atmung der Bakterien zusammenhängt. Die Leuchtreaktion von


HPTLC-Pla e nachder Entwicklung

Applika on des Test-organismus; keine Inkuba on

Detek on der Hemmung

Dokumenta on durcheine CCD-Kamera

Fließrichtung

PhysikalischeDetek on

Immersion von Vibrio fisheri

Abb. 8.21 Allgemeine Vorgehensweise der toxikologischen Schadstoffbestimmung mithilfe derBiolumineszenzhemmung auf der HPTLC-Platte. (Weins [9])

Photobakterium phosphoreum benötigt Energie in Form von reduziertem Flavin-Mononukleotid FMNH2. Dabei reagiert FMNH2 mit molekularem Sauerstoff undeinem langkettigen Aldehyd unter Abgabe von Licht zu FMN, Wasser und der kor-respondierenden Fettsäure nach der folgenden Reaktionsgleichung [49]:

FMNH2 C O2 C RCHOLuciferase�! FMN C H2O C RCOOH C h� : (8.4)

Die Reaktion wird katalysiert durch das Enzym Luciferase und ist sehr ener-gieaufwendig. Für die Erzeugung eines Lichtquants im blaugrünen Bereich ( =490 nm) werden ca. 6 Moleküle ATP benötigt. Berücksichtigt man noch die Quan-tenausbeute der Fluoreszenzreaktion, die zwischen 0,1 und 1 liegt, so ergibt sichein ATP-Bedarf zwischen 6 und 60 Molekülen pro Lichtquant. Aus der Leucht-kraft eines Bakteriums (max. ca. 104 Photonen/s) lässt sich abschätzen, dass derAnteil des Sauerstoffverbrauchs der Leuchtreaktion am Gesamtsauerstoffverbrauchdes Bakteriums etwa 20 % beträgt [49]. Eine Störung der Energieversorgung (At-mung) durch die Einwirkung von Chemikalien wirkt sich deshalb sehr schnell aufdie Leuchtkraft der Bakterien aus. Da sämtliche Stoffwechselvorgänge Energie er-fordern, ist die Stärke der Hemmwirkung einer Chemikalie ein direktes Maß für dieBeeinträchtigung des gesamten Stoffwechsels des Bakteriums.

Das verhältnismäßig schnelle und preislich günstige Biotestverfahren mit demmarinen Photobacterium phosphoreum, Stamm NRRL-B-11177, hat eine großeBedeutung z. B. bei der Überwachung von industriellen Abwässern und bei der Ri-sikobeurteilung verschiedener Chemikalien erlangt. Viele toxische Substanzen (ca.1350 organische Einzelsubstanzen) zeigen eine Hemmwirkung der Biolumineszenzvon Photobacterium phosphoreum und Photobacterium fischeri in vitro [50].

1996 gelang es Eberz, Weisemann und Weins erstmalig, den Leuchtbakterien-hemmtest als Detektionsverfahren in der Dünnschichtchromatographie einzusetzen[51]. Das Tauchen einer DC-Platte in eine Leuchtbakterienlösung ist eine eleganteMethode, toxische Stoffe direkt auf der Platte zu erkennen. Die Vorgehensweise istin Abb. 8.21 dargestellt.


8.5.1 Herstellung einer Kultur Leuchtbakterien

Photobacterium Vibrio fischeri, Stamm NRRL B-11177, oder Stamm Vibrio fischeriDSM 7151, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, gefriergetrock-net, wird gemäß DIN 38 412 Teil 32 rekonstituiert. Die Zellen werden in einemVollmedium nach einem Verfahren, das in DIN 38 412 Teil 34 beschrieben wird,20 h auf einem Schüttelgerät (150 Umdrehungen pro Minute) bei 21 °C kultiviert.

Reaktivierungslösung Als Reaktivierungslösung dient folgende Kombination vonSalzen, die zu 1 l gelöst und autoklaviert werden:20 g NaCl0,3 g KCl2,035 g MgSO4 � 7 H2O

Nährmedium Die Leuchtbakterien werden in folgendem Medium (2-Liter-An-satz) kultiviert:60 g NaCl12,2 g NaH2PO4 � H2O4,2 g K2HPO4

0,4 g MgSO4 � 7H2O1,0 g (NH4)2HPO4

3,4 ml Glycerin (87 %)10 g Pepton aus Casein1 g Hefeextrakt

Nach dem Auffüllen auf 2 l wird der pH-Wert mit NaOH oder verdünnter Salz-säure auf 7,0 ˙ 0,2 eingestellt. Das Nährmedium wird für 20 min bei 121 °C auto-klaviert und im Kühlschrank aufbewahrt. Es sollte eine hellgelbe Farbe besitzen.

8.5.1.1 Durchführung der Reaktivierung und Kultivierungder Leuchtbakterienzellen

Zur Reaktivierung der Bakterien werden 5 ml aufgetaute, möglichst kalte Reakti-vierungslösung in die Mitte der (noch kalten) gefriergetrockneten Leuchtbakterienpipettiert (Stamm: Vibrio fischeri DSM 7151, Deutsche Sammlung von Mikroorga-nismen, Göttingen). Die Mischung wird für 15 min ruhig stehen gelassen und dannin 220 ml Nährmedium gefüllt. Bei Raumtemperatur wird die angeimpfte Bakteri-enkultur 25 bis 30 Stunden geschüttelt. Bei einer gewissen Konzentration der Zellenim Medium wird ein Autoinducer freigesetzt (N-(ˇ-Hydroxybutyryl)-homoserin-lacton), der die Bakterien zum Leuchten anregt. Dies ist der Fall, wenn die Bakteri-en (leicht geschüttelt) etwa 24 bis 40 h bei Raumtemperatur bzw. etwa 16 h bei 28 °Cinkubiert wurden. Die Leuchtdauer im Emissionsmaximum beträgt etwa 10 Stun-den (Abb. 8.22).


0 10 20 30 40 50 60Zeit (h)

0

50

100

150

200

250

300

Lich

tinte

nsitä

t (Zä

hlim

puls

e)

Abb. 8.22 Lichtemission des Leuchtbakteriums Vibrio fischeri in Abhängigkeit von der Wachs-tumszeit (bei 26 °C). Das Emissionsmaximum wird nach 40 h erreicht. (Mit freundlicher Geneh-migung von B. Spangenberg, Fachhochschule Offenburg, 2011)

8.5.2 Durchführung des Leuchtbakterienhemmtestsauf der Dünnschichtplatte

Vor der Applikation der Bakterien auf die Platte kann zur Verstärkung der Lumi-neszenz 15 min vor dem Tauchen der Suspension (40 ml) 1,25 ml Phosphatpuffer(2,27 g KH2PO4 in 50 ml) und 0,15 ml einer 3,5 %igen H2O2-Lösung zugesetztwerden.

Für den Leuchtbakterienhemmtest auf der Dünnschichtplatte sind Kieselgelplat-ten, Nylon und CN-Platten geeignet. Das vom Fließmittel befreite Chromatogrammwird 3 s in eine leuchtende Bakteriensuspension von Vibrio fischeri getaucht und dieüberschüssige Lösung mit einem Wischer leicht von der Platte abgestreift. Dannwird eine saubere Glasplatte aufgelegt und die Lumineszenz nach 10 min Inkubati-onszeit für 2 bis 20 min mit einer empfindlichen Kamera vermessen, z. B mit einergekühlten CCD-Kamera in einer dunklen Kammer. Alternativ kann die Biolumines-zenzhemmung auch direkt auf dem Chromatogramm mit dem für diese Applikationspeziell entwickelten BioLuminizer® (Camag) dokumentiert werden (Abb. 8.23).Die Belichtungszeit hängt von der Empfindlichkeit der jeweils eingesetzten Kameraab. Eigene unveröffentlichte Untersuchungen haben gezeigt, dass die Biolumines-zenz mindestens 20 Minuten auf der HPTLC-Platte stabil bleibt.

Die Leuchtbakterien bilden dunkle Hemmhöfe mit Arsen- und Schwermetallver-bindungen wie Kupfer und Quecksilber, Diphenylamin, Aflatoxin, Atrazin, Thia-bendazol, Benz-[a]-pyren, Strychnin, Ochratoxin, Carbaryl-Insektiziden, Quinto-zen, aber auch mit Coffein, das oft als Positivstandard verwendet wird [51]. Einelineare Korrelation zwischen der Konzentration des Inhibitors und der Hemmung


Abb. 8.23 a Darstellung einer in eine Vibrio-fischeri-Suspension getauchte Platte; auf drei Bah-nen wurden Fungizid-Standards aufgetrennt. b Trennung von Diclofenac (2 und 3 µg) auf einerCyanopropyl-Kieselgel-Platte mit Dichlormethan/Methanol/Cyclohexan (95 + 5 + 30 V/V); dieHemmung der Biolumineszenz von Vibrio fischeri wird in Abhängigkeit der Inkubationszeit dar-gestellt. (Mit freundlicher Genehmigung von B. Spangenberg, Fachhochschule Offenburg, 2011)

der Biolumineszenz kann dargestellt werden. Die Detektionsgrenze (LOD) liegtfür Pentachlorphenol bei 10 und 20 ng/Auftragungsfleck und für Dichlorphenol bei7,5 ng/Auftragungsfleck [9].


Abb. 8.24 Detektion von Hemmstoffen der Bakterienlumineszenz in Abflusswasser einerSchnellstraße und einem Regenwasserüberlaufbecken. Desmetryn, p-Chlorophenyl-methyl-sulfonund 3,4-Dichloroanilin wurden als Referenzsubstanzen eingesetzt. (W. Schulz [41])

8.5.3 Anwendungsbeispiele für den Einsatzdes Leuchtbakterienhemmtestsmit der Dünnschichtchromatographie

Die Probenvorbereitung spielt bei der wirkungsbezogenen Analytik eine wichtigeRolle, um die Gesamtheit der bioaktiven Substanzen bzw. Schadstoffe zu detektie-ren. Dies hat Vorrang vor der Isolierung einzelner Substanzen. Aus diesem Grundkann eine Probe sowohl nativ untersucht werden als auch vor der Chromatographienach Polarität, Molekülgröße oder pH-Verhalten fraktioniert werden [51].

8.5.3.1 Charakterisierung von Biolumineszenzinhibitorenin Gewässerproben

Mithilfe des Leuchtbakterienhemmtests wurden Wasserproben aus einem Regen-überlaufbecken und aus einem Bach, der neben einer Schnellstraße fließt, aufSchadstoffe untersucht. Teile der Wasserproben wurden jeweils auf pH 2 und pH 7eingestellt. Die Anreicherung der organischen Bestandteile erfolgte über eine Fest-phasenanreicherung (SPE) mit einem Anreicherungsfaktor von 500. Aus einemTeil der Wasserproben wurden mit Methyl-tert-butylether (MTBE) die organischenBestandteile in einer Flüssig-flüssig-Extraktion von der Matrix befreit. 30 �L der sogewonnenen Extrakte wurden auf eine Dünnschichtplatte appliziert und mit einemGradienten chromatographiert (HPTLC-AMD). Die qualitativen Ergebnisse vonSchulz et al. [41] zeigten, dass bei der Festphasenanreicherung bei pH 2 die meis-ten Hemmstoffe der Biolumineszenz extrahiert wurden und dass der Bach nebender Schnellstraße stärker belastet war als das Wasser des Regenüberlaufbeckens(Abb. 8.24) [40].

Abbildung 8.25 zeigt die Hintergrundstoxizität eines Deponiesickerwassers, des-sen organische Substanzen sowohl bei pH 7 als auch bei pH 2 über eine Festpha-senextraktion extrahiert wurden. Nach einer Gradientenchromatographie (HPTLC-


1 μL 2 μL 5 μL 10 μL 1 μL 2 μL 5 μL 10 μL

Abb. 8.25 Detektion der Hintergrundstoxizität eines Deponiesickerwassers mithilfe des Leucht-bakterienhemmtests mit Aliivibrio fischeri auf der Dünnschichtplatte, Inkubationszeit 10 min. (Mitfreundlicher Genehmigung von Stefan C. Weiss, Wolfgang Schulz, Walter H. Weber, alle Zweck-verband Landeswasserversorgung, Langenau, 2013)

AMD) wurden die Hemmstoffe in diesen Extrakten mithilfe des Leuchtbakteri-enhemmtests detektiert und qualitativ ausgewertet. Die genaue Betrachtung derAbbildung macht die Unterschiede der Hemmäquivalente in den einzelnen Po-laritätsbanden deutlich, die durch die unterschiedlichen pH-Einstellungen bei derExtraktion bedingt sind.

8.5.3.2 Charakterisierung von Biolumineszenzinhibitorenin Ultrafiltraten von Gewässerproben

Bei der Ultrafiltration (UF) wird die Ausschlussgrenze (engl. cut-off) auf die Mole-külmasse anstatt auf die Partikelgröße bezogen. Sie liegt im Bereich von ca. 1000–2 � 106 Dalton. Die UF wird im Prozessbereich überwiegend dynamisch durchge-führt, d. h. mit Membranüberströmung. Dabei fällt neben dem Filtrat, auch Permeatgenannt, zusätzlich noch das Konzentrat an. Der Einsatz der wirkungsbezogenenAnalytik mit der HPTLC-AMD bietet die Möglichkeit, die Wirkung der Schadstoffenicht nur in fraktionierten Extrakten einer Wasserprobe, sondern auch in Ultrafiltra-ten mit einem definierten Bereich ihrer Molmasse zu verfolgen. So können dieseToxine einerseits hinsichtlich ihrer Molmasse, aber auch hinsichtlich ihrer Polaritätnäher charakterisiert werden. Durch die Chromatographie und UV-Detektion ist zu-nächst eine erste Charakterisierung und Differenzierung der einzelnen Fraktionenmöglich.

Untersucht wurden eine verhältnismäßig unbelastete Wasserprobe eines Ober-flächengewässers (A1) und eine durch den Auslauf einer kommunalen Kläran-lage belastete Wasserprobe (A2). Die einzelnen Fraktionen werden von > 30 kDabis < 1 kDa augetrennt (UF1 > 30 kDa, UF2 30–30 kDa, UF3 3–10 kDa, UF4 1–3 kDa, UF5 < 1 kDa), nach DIN 38 407 Teil 11 mit einem Universalgradien-ten chromatographiert und mittels eines Mehrwellenlängenscans (200 nm bis320 nm) ausgewertet. Der Nachweis von Biolumineszenzinhibitoren auf demChromatogramm erfolgt mit dem Leuchtbakterienhemmtest. In Abb. 8.26 wer-


A1 LUF1 UF2 UF3 UF4 UF5 UF5* UF1 UF2 UF3 UF4 UF5 UF2*A2* A2

Abb. 8.26 Postchromatographischer Leuchtbakterienhemmtest von Wasserproben. A1 Original-probe eines Oberflächengewässers, A2 Originalprobe des Auslaufs einer kommunalen Kläranlage,UF1–UF5 Ultrafiltrate, L Leerwert, * 10-fach konzentriert; stationäre Phase: HPTLC KG 60 F254,Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung: automatischeMehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Testorganismus: Vi-brio fischeri, Dokumentation: Peltier Cooled CCD Kamera SensiCam® (AVT Horn, Aalen, BRD),Belichtungszeit: 800 s. (Weins [9])

den eindrücklich zahlreiche toxische Substanzen im polaren wie im unpolarenBereich detektiert.

Die Wasserprobe A2 erweist sich als weitaus belasteter als die Wasserprobe A1,nicht nur hinsichtlich der Intensität an toxischen Stoffen, sondern auch bezüglichder Anzahl gegenwärtiger Toxine. Polare Toxine werden über alle Fraktionen ver-schleppt. Biolumineszenzinhibitoren, die im mittelpolaren Bereich zu finden sind,werden bei A2 im UF3 bis UF4 angereichert. Dies gilt aber ebenso wie für dieweniger belastete Wasserprobe A1. Für diesen Effekt können Toxine mit einer be-stimmten Molmasse (1–10 kDa) verantwortlich sein. Ebenso muss die Fähigkeitkleinerer Moleküle zur möglichen Assoziation an größere Moleküle diskutiert wer-den. Eine starke Anreicherung verschiedener Substanzgruppen bei A2 ist im UF3

zu beobachten.

8.6 Detektion fungizider Substanzenmit Hefe- bzw. Penicilliumstämmen

Unter Fungiziden versteht man Substanzen, die das Wachstum von Pilzen hemmen(Fungistatika) oder völlig unterbinden (Fungizide). Fungizide können sowohl zurVorbeugung als auch zur Bekämpfung von Pilzinfektionen eingesetzt werden. Siewerden beispielsweise im Pflanzenschutz, aber auch zum Schutz von Farben, La-cken, Holz und Papier verwendet. In der Humanmedizin werden Wirkstoffe zurBehandlung von Pilzinfektionen als Antimykotika bezeichnet.

8.6 Detektion fungizider Substanzen mit Hefe- bzw. Penicilliumstämmen 263

Fungizide bzw. antimykotische Wirkstoffe können auf der HPTLC-Platte sowohlmit Penicilliumsporen als auch mit Hefestämmen qualitativ und quantitativ post-chromatographisch nachgewiesen werden.

8.6.1 Methodenbeschreibung zur Detektion von Fungiziden

Neben einer Reihe von Testorganismen hat sich insbesondere Penicillium expan-sum ATCC 7861 als geeignet zur Bestimmung von Fungiziden erwiesen [52]. Inder Literatur werden auch andere Organismen wie Curvularia lunata, Aspergillusniger, Alternaria brassicicola, Cladosporium cucumerinum oder Rhizopus sp. ge-nannt [53–57]. Eine Übersicht der verschiedenen Techniken wird bei Hostettmannet al. beschrieben [55]. Neben dem Einsatz von Penicilliumsporen hat sich derHefestamm Rhodoturula rubra ATCC 70403 als sehr geeigneter Testorganismusgezeigt, der bei guten Wachstumsbedingungen auf der Dünnschichtplatte nach ca.24 h eine rote Eigenfärbung entwickelt. Bei Anwesenheit eines fungiziden Wirk-stoffes erscheint ein weißer Hemmhof, dessen Größe durch die applizierte Mengeund durch die Wirkungsspezifität des Fungizids bestimmt wird [9].

8.6.1.1 Kultivierungsbedingungen

Tab. 8.2 Allgemeine Kulturbedingungen von Penicillium- und Hefestämmen

Organismus Kulturbedingung

Penicillum sp. (z. B. Penicillum expansum ATCC 7861) Sabouraud-Agar

Hefestamm (z. B. Rhodoturula rubra ATCC 70403) Sabouraud-flüssig-Medium

8.6.1.2 Herstellung der TauchlösungenIm Folgenden werden die Tauchlösungen mit Penicillium-Sporen und mit Hefezel-len beschrieben.

Stammlösung A 7 g KH2PO4, 3 g Na2HPO4 � 7 H2O, 4 g KNO3, 1 g MgSO4 � 7 H2Ound 1 g NaCl werden in 1 l autoklaviertem Wasser gelöst.

Stammlösung B 30 % Glucoselösung, autoklaviert.

Glucose-Mineralsalz-Lösung 10 ml Stammlösung A werden mit 60 ml Stammlö-sung B und 0,1 % Tween 20 angesetzt.

Tauchlösung mit Pilzsporen Die Sporen von Penicillium-Spezies werden für denTest in einer Glucose-Mineralsalz-Lösung suspendiert [55], die Suspension sollte107 bis 109 Zellen pro ml enthalten.

Tauchlösung mit Hefezellen Die Hefezellen, die in einem Sabouraud-flüssig-Me-dium (3–4 Stunden Wachstum vor dem Test) kultiviert wurden, werden mit 0,035 %Gelrite® versetzt.


8.6.1.3 DurchführungDas vom Fließmittel befreite Chromatogramm wird 3 s in die Pilzsporen (Conidi-al)-Suspensionslösung bzw. Hefezellensuspension getaucht und die überschüssigeLösung am Boden der Platte mit Haushaltspapier abgezogen. Die HPTLC-Plattenwerden in einer feuchten Kammer (am Kammerboden mit wassergetränktem Haus-haltspapier ausgelegt) 1–3 Tage bei 25 °C inkubiert.

Bei gutem Wachstum färbt sich Penicillium grün. Die Hemmhöfe können alsweiße Zonen detektiert werden. Das Verfahren ist auch für 2-D-Trennungen ein-setzbar [59].

Auf Kieselgelplatten mit Fluoreszenzindikator, der bei = 254 nm angeregtwird, können die durch die fungiziden Wirkstoffe hervorgerufenen Hemmhöfe be-reits nach 16 h Inkubation sowohl bei Pilzen als auch bei Hefezellen mithilfe derVideo- oder Fotodokumentation aufgezeichnet werden – unter einer Bestrahlungder Platte mit UV-Licht der Wellenlänge = 254 nm.

8.6.2 Reinheitskontrolle und Stabilitätstestsvon Standardsubstanzen

Abbildung 8.27a und 8.27b zeigen zwei mithilfe der AMD-Technik entwickelteHPTLC-Platten mit sieben Standardlösungen von Fungiziden, deren Wirksam-keit mit einer Conidial-Suspensionslösung von Penicillium sp. postchromato-graphisch detektiert wurde. Die Sporen, die nach drei Tagen bei 25 °C auf demChromatogramm gebildet wurden, wurden mit einem Mattlack auf der Platte sta-bilisiert. Das mit der AMD entwickelte Chromatogramm trennt Benomyl vonseinem Abbauprodukt Carbendazim (Abb. 8.27a). Benomyl (Methyl-1-(butylcar-bamoyl)benzimidazol-2-yl-carbamat) ist ein systemisch wirkendes Fungizid, dasdurch Blätter und Wurzeln aufgenommen wird. In der Standardlösung ist Beno-myl nach 6 Tagen völlig in sein polareres Abbauprodukt Carbendazim zerfallen(Abb. 8.27b).

Neben dem qualitativen Nachweis von Fungiziden gelingt auch die quantitativeBestimmung fungizider Wirkstoffe auf der Dünnschichtplatte unter Verwendungzellulärer Organismen.

Bei Tebuconazol, einem Azol-Derivat und hochwirksamem Fungizid, konntenach der AMD-HPTLC auf dem Chromatogramm mit dem Hefestamm Rhodotu-rula rubra als Testorganismus eine Detektionsgrenze bei 1,8 ng/5 mm Band, die Er-fassungsgrenze bei 3,6 ng/5 mm Band und die Bestimmungsgrenze bei 5,2 ng/5 mmBand ermittelt werden. Abbildung 8.28 zeigt, dass die fungizide Hemmwirkungbereits nach einer Inkubationsdauer der Testorganismen von 16 h erkennbar ist. DieDetektion über die Wirksamkeit der Standardsubstanz erfolgte in diesem Fall aufeiner Kieselgelplatte mit Fluoreszenzindikator und einer Beleuchtungswellenlängevon 254 nm. Fungizid wirkende Zerfallsprodukte konnten bei Tebuconazol nichtdetektiert werden.


1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

Benomyl

Carbendazim

Carbendazim

a

b

Abb. 8.27 Überprüfung verschiedener Standardlösungen von Fungiziden mithilfe ihrer fungi-ziden Wirksamkeit a an Tag 1 und b an Tag 6. Stationäre Phase: KG 60 WRF 254 s (Merck,Art. Nr. 12363), Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung:automatische Mehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Te-storganismus: Penicillium sp., Detektion: nach 72 Stunden, dokumentiert mit einem HP-Scanner.1 Isoproturon 612 ng, 2 Linuron 648 ng, 3 Diuron 590 ng, 4 Benomyl 550 ng, 5 3,5 Dichlorphenol600 ng, 6 Pentachlorphenol 620 ng, 7 Pentachlorphenol + 3,5-Dichlorphenol 600 ng. (Weins [9])

8.6.3 Detektion von fungizid wirkenden StoffenimOberflächengewässer

Die wirkungsspezifische Analytik hat sich als ein geeignetes Instrument herausge-stellt, um bei der Gewässerüberwachung die Belastung der Gewässer mit Fungizi-den zu ermitteln.

Die Probenvorbereitung der Gewässerproben und die chromatographischeAuftrennung der Verbindungen erfolgt mit einem Universalgradienten gemäßDIN 38 407 Teil 11. Mithilfe einer densitometrischen Auswertung bei mehre-ren Wellenlängen (von 200 nm bis 320 nm) und Vergleich der Ergebnisse mit dervorhanden Spektrenbibliothek können bereits erste Wirkstoffgruppen identifiziertwerden. Inwieweit es sich um mögliche Fungizide handelt, kann mit der wirkungs-spezifischen Detektion überprüft und verifiziert werden.

In Abb. 8.29 werden die fungiziden Wirkstoffe von zehn verschiedenen Pro-bestellen in unterschiedlichen Oberflächengewässern detektiert. Aufgrund diesesBefundes konnte zum einen bei der Suche nach den entsprechenden Schadstoffenin einer Wasserprobe zahlreiche Fungizide wie z. B. Procymidon, Vinclozolin, Cap-tafol, Chlozolinat bereits ausgeschlossen werden, da ihre Lage im Chromatogramm


2,06 3,12 4,16 5,2 10,4 20,8 32,2 41,6 52,0 104 208 312 413 520 ng

Abb. 8.28 Bestimmung der Detektionsgrenze von Tebuconazol, postchromatographisch auf derHPTLC Platte. Stationäre Phase: KG 60 F 254 s (Merck, Art. Nr. 5365), Format: 10 cm × 20 cm,Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung: automatische Mehrfachentwicklung mitdem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Testorganismus: Hefestamm Rhodoturula ru-bra, Detektion: nach 16 Stunden, dokumentiert mit einer Peltier Cooled CCD Kamera SensiCam®

(AVT Horn, Aalen, BRD) bei 254 nm. (Weins [9])

nicht den hier detektierten Stoffen entspricht. Die sehr zeit- und kostenaufwendigeEinzelstoffanalytik auf Fungizide konnte mit diesem Verfahren weitgehend einge-grenzt werden. Zum anderen wurden nach der UV-Detektion anhand der vorlie-genden Spektrenbibliothek und nach dem postchromatographischen Biomonitoringausgewählte Fungizide stärker überwacht, wie z. B. Imazalil, Fenpropidin (Met.),Benalaxyl, Iprodion, Propiconazol, Carbendazim und Epoxiconazol. Aufgrund derMöglichkeit eines Gehaltes an fungiziden Azolen in der Probe 8 von ca. 0,02 µg/lTebuconazoleinheiten wurde an dieser Probestelle vermehrt die Belastung der imHinblick auf Resistenzentwicklungen humaner Mykosen bedenklichen Azolderiva-te überwacht.

8.6.4 Detektion von Fungiziden in Lebensmittelproben

Zur Untersuchung auf Rückstände in Lebensmitteln wurden Extrakte von Erdbee-ren und Trauben auf Fungizide untersucht. Die Wirkstoffe wurden aus den pflanzli-chen Lebensmitteln gemäß dem deutschen Einheitsverfahren extrahiert (DFG S19).Diese Verfahren wird im Abschn. 8.3.7 beschrieben.

Die postchromatographische Untersuchung auf Fungizide wurde mit Penicilli-umsporen als Testorganismus durchgeführt. Das Chromatogramm mit Penicillium-mycel wurde bei einer Beleuchtung der Dünnschichtplatte mit einer Lichtquellevon = 254 nm dokumentiert. Die Hemmhöfe werden sichtbar durch den spezi-ellen Phosphoreszenzindikator in der stationären Phase. Mit optischen Methodenkönnen somit belastete und unbelastete Lebensmittelproben direkt auf dem Chro-matogramm unterschieden werden (Abb. 8.30).


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 LW1 LW2 LW3 T1 T2

Abb. 8.29 Detektion von fungiziden Verbindungen in 10 Proben verschiedener Oberflächenge-wässer. LW Leerwert, T1, T2 Standards von Tebuconazol 20 ng, 10 ng. Stationäre Phase: KG 60 F254 s (Merck, Art. Nr. 5365), Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographischeEntwicklung: automatische Mehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz,Schweiz), Testorganismus: Penicillium expansum (Weins [9])

1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 154

Abb. 8.30 Gegenwart von Fungiziden in verschiedenen pflanzlichen Lebensmittelproben.1, 6 Kontrolle, 2–5, 9 Erdbeeren, 7, 8, 10 Trauben, 11–15 Standards: Fenpropathrin 30 ng, Imaza-lil 10 ng, Mercaptodimethur 30 ng , Procymidon 100 ng. Stationäre Phase: HPTLC KG 60 F254,Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung: automatischeMehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Dokumentation:Peltier Cooled CCD Kamera SensiCam® (AVT Horn, Aalen, BRD), Testorganismus: Penicilli-umsporen. (Weins [9])

Die Ergebnisse zeigen, dass bei den Erdbeeren zwei Proben und bei den Traubendrei Proben mit Fungiziden belastet sind. Nach der UV-Detektion kann anhand dervorliegenden Spektrenbibliothek und nach dem postchromatographischen Biomo-nitoring eine erste Auswahl vorhandener Fungizide getroffen werden. Die Migrati-onsstrecken fungizider Wirkkomponenten werden mit den Migrationsstrecken der


Tab. 8.3 Fungizide als Referenzsubstanzen und ihre Migrationsstrecken in der HPTLC-AMD,stationäre Phase: HPTLC KG 60 F254 (Format: 10 cm × 20 cm; Schichtdicke 200 µm), mobilePhase: Universalgradienten nach DIN 38407 Teil 11

Fungizide AMD-Migrationsstrecke[mm]

Fungizide AMD-Migrationsstrecke[mm]

Aniliazin 55,3 Iprodion 52,4

Benalaxyl 30,3 Myclobutanil 23,8

Benomyl 58,4 Oxadixyl 23,0

Bitertanol 23,1 Penconazol 24,8

Bupirimat 26,8 Prochloraz 23,6

Captafol 53,7 Procymidon 55,6

Captan 52,2 Propiconazol 24,0

Carbendazim 21,4 Pyrazophos 38,5

Chlorthalonil 58,5 Pyrimethanil 29,7

Chlozolinat 55,0 Quintozen 71,0

Epoxiconazol 32,8 Tebuconazol 24,9

Fenarimol 23,8 Tecnazen 69,7

Fenpropidin 16,9 Tolcophos-methyl 60,3

Fenpropimorph 29,6 Tolyfluanid 56,5

Flusilazol 26,5 Triadimefon 30,2

Imazalil 18,5 Vinclozolin 58,1

entsprechenden Referenzsubstanzen verglichen. Somit kann die Anzahl möglicherFungizide zu diesem Zeitpunkt schon eingeschränkt und eine Vorauswahl für dieweitere Analytik getroffen werden (Tab. 8.3).

Somit können folgende in Tab. 8.4 aufgeführten Fungizide als Kontaminantender Lebensmittelproben in die engere Auswahl gelangen.

Die Liste mit den 32 Referenzsubstanzen (Tab. 8.3) ist in keinem Fall vollstän-dig und soll nur die Möglichkeiten aufzeigen, inwieweit die wirkungsbezogeneAnalytik ein geeignetes Instrument darstellt, fungizide Wirkungsäquivalente in ei-ner Lebensmittelprobe aufzuspüren. Selbst eine Auflistung der Migrationsstreckenvon weiteren fungiziden Standardsubstanzen wird die Analytiker aufgrund physiko-chemischer Detektionsverfahren nicht davor bewahren, aktive Metabolite von Fun-giziden zu übersehen, mit denen eine Lebensmittelprobe kontaminiert sein kann.

8.7 Detektion von Substanzenmit antibiotischer Wirkung

In den letzten Jahren konnte ein deutlicher Anstieg der Anzahl antibiotikaresistenterBakterien beobachtet werden, die auf bis zu acht Antibiotika gleichzeitig resistentsein können. Antibiotikaresistente Bakterien treten vor allem in Bereichen vermehrtauf, in denen Antibiotika zum Einsatz kommen. Es konnte gezeigt werden, dass an-tibiotikaresistente Bakterien in großen Mengen in die Umwelt eingetragen werden.

8.7 Detektion von Substanzen mit antibiotischer Wirkung 269

Tab. 8.4 Auswertung der Proben 1–10 nach der wirkungsbezogenen Detektion (Abb. 8.30) aufmögliche Fungizide anhand der Migrationsstrecken von Referenzsubstanzen

Probe Nr. Lebensmittel Mögliche Fungizide

1 Kontrolle –

2 Erdbeeren –

3 Erdbeeren keine Referenzsubstanz vorhanden, aktiver Metabolitmöglich

4 Erdbeeren Procymidon, Vinclozolin

5 Erdbeeren –

6 Kontrolle –

7 Trauben Burpirimat, Epoxiconazol, Fenpropimorph, Flusilazol,Pyrimethanil, Triadimefon, Procymidon, Carbendazim undggf. aktive Metabolite

8 Trauben Carbendazim

9 Erdbeeren –

10 Trauben Burpirimat, Epoxiconazol, Fenpropimorph, Flusilazol,Pyrimethanil, Triadimefon

Zum einen werden sie aus der Intensivtierhaltung über die Gülle und Mistausbrin-gung direkt in die Umwelt freigesetzt, zum anderen aus klinischen und häuslichenAbwässern in den Kläranlagen gesammelt und von dort über das geklärte Abwasserin die Umwelt entlassen [58].

8.7.1 Methodenbeschreibung zur Detektion von antibiotischwirkenden Substanzen

Zur Bestimmung von Antibiotika hat sich der Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633als äußerst geeignet erwiesen. Bei der Wirkungsdetektion mit der Dünnschichtchro-matographie wird die Platte mit den Wirkstoffen in eine Bakterienkultur getaucht,damit die Keime direkt auf der Platte wachsen können. Die Platte wird aus diesemGrund in einer feuchten Kammer (mit wassergetränktem Haushaltspapier ausge-legt) bei 25 °C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von ca. 16 h kann die Vitalitätder Bakterien durch Besprühen des bewachsenen Chromatogramms mit einer Lö-sung eines Tetrazoliumsalzes (MTT-Lösung 3 mg/ml) dargestellt werden. Anschlie-ßend wird die Platte in der Laborluft getrocknet und mit einem Flachbettscannerdokumentiert. Bei diesem Vitalitätstest wird die Aktivität der mitochondrialen De-hydrogenasen bestimmt. Die Methode beruht auf der enzymatischen Reduktion deslöslichen, gelben Tetrazoliumsalzes MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-nyl-tetrazoliumbromid) zu einem blauen, unlöslichem Formazan, die nur in leben-den Zellen abläuft [59]. (siehe auch Abschn. 8.3.5)

Organismus Bacillus subtilis ATCC 6633 (Heubazillus).


Nährlösung für die Zucht (1 l) 3,5 g Pepton aus Casein und 3,5 g Pepton ausFleisch, 3 g NaCl und 2 g Na2HPO4 werden in 1 l deionisiertem Wasser gelöst,der pH auf 7,0 bis 8,0 eingestellt. Die Nährlösung wird anschließend bei 121 °Cfür 20 min autoklaviert. Das so hergestellte Nährmedium kann bis zu 4 Tage imKühlschrank aufbewahrt werden. Bei dem Einsatz saurer Laufmittel in der Chro-matographie ist diese Nährlösung zur Pufferung der stationären Phase mit 0,5 MTRIS-Puffer anzusetzen und mit 1 M HCl auf einen pH-Wert von 7,2 einzustellen.

Tauchlösung Die Nährlösung wird unter sterilen Bedingungen mit der Bakte-riensuspension angeimpft. Anschließend wird die Kultur 4–8 Stunden bei 25 °C(˙3 °C) auf einem Schüttler inkubiert. Danach ist die Tauchlösung einsatzbereit.

Móricz et al. fanden heraus, dass die Bakterienzellen in ihrer logarithmischenWachstumsphase für diesen Test am empfindlichsten reagieren [61]. Bei der De-tektion von Aflatoxin B1 mit einer Pseudomonas-savastanoi- bzw. Phaseolicola-Bakteriensuspension konnte der Effekt durch Zugabe von Cu(II)-Ionen, als Verstär-ker der Formaldehydbildung, stark erhöht warden [60].

Färbelösung 30 mg Triphenyltetrazolium-Chlorid werden in 10 ml Wasser gelöst.

Durchführung Die vom Fließmittel befreite Dünnschichtplatte wird 2 s in dieTauchlösung getaucht und dann für 19 Stunden bei 23–35 °C in einer feuchtenKammer inkubiert [62]. Um die Kammer feucht zu halten, empfiehlt es sich, denKammerboden eine Stunde vor der Inkubation mit einem nassen Stück Filterpapierauszulegen.

Nach der Inkubation wird die Platte für 2 s in die Färbelösung getaucht oderbesprüht. Nach 5–30 min erscheinen gelbe Hemmhöfe auf blau-violettem Hinter-grund.

Die Fa. Merck hat die dazu benötigten Komponenten als Kit (Chrom Biodip®

Antibiotika-Testkit) zusammengestellt [61].Die Größe der Hemmhöfe wird durch die Konzentration der aufgetragenen Wirk-

stoffmenge und der spezifischen Aktivität der Substanz bestimmt. Abbildung 8.31zeigt die Wirkung von drei verschiedenen Antibiotika – Chloramphenicol, Oxyte-tracyclin und Lasalocid – auf das Wachstum von Bacillus subtilis postchromatogra-phisch auf der HPTLC-Platte.

Als Testorganismus in der HPTLC hat sich Bacillus subtilis für die Detektionzahlreicher Antibiotika als sehr sensitiv erwiesen und liegt für Chloramphenicol bei5 ng/4 mm Band. Die Detektionsgrenze von Oxytetracyclin liegt unter 5 ng/4 mmBand und bei Lasalocid, einem sehr selektiv wirkenden Antibiotikum, konnte eineDetektionsgrenze von 15 ng/4 mm Band unter den beschriebenen Versuchsbedin-gungen ermittelt werden.

In Tab. 8.5 sind weitere Bakterienstämme aufgelistet, die es ermöglichen, diegroße Anzahl an Antibiotika wirkungsspezifisch zu erfassen.

8.7 Detektion von Substanzen mit antibiotischer Wirkung 271

a1 a2 a3 c1 c2 c3

b1 b2 b3

Abb. 8.31 Detektion von Antibiotika postchromatographisch auf der HPTLC Platte. StationärePhase: KG 60 WRF 254 s (MERCK, Art. Nr. 12363), Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke:100 µm, mobile Phase: Ethylacetat/Methanol/Ammoniak 25 %ig (60/20/2, V/V/V). a1–a3 Chlor-amphenicol, b1–b3 Oxytetracyclin, c1–c3 Lasalocid, jede Komponente 25 ng, 15 ng, 5 ng proFleck, Testorganismus: Bacillus subtilis. (Weins [9])

Tab. 8.5 Häufig verwendete Testorganismen (Hamburger MO, Cordell GA [59])

Stammbezeichnung Stamm-Nr. der ATCC

Bacillus subtilis ATCC 6633

Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778

Escherichia coli ATCC 25922

Micrococcus flavus ATCC 10240

Microsporium gypseum ATCC 14683

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Staphylococcus epidermis ATCC 12228

8.7.2 Detektion von antibiotisch wirkenden StoffenimOberflächengewässer

Für die Untersuchung von Umweltproben auf Schadwirkungen wurden primärWasserproben aus Oberflächengewässern und Abwasserproben aus kommunalenKläranlagen herangezogen. Die Probenvorbereitung erfolgte gemäß DIN 38 407Teil 11. Die organischen Inhaltsstoffe von 100 ml nativer kommunaler Abwasser-probe bzw. 500 ml Oberflächenwasser wurden an einer mit Methanol konditionier-ten RP18-Kartusche angereichert, mit Methanol extrahiert, unter N2 eingedampftund in 200 µl Methanol wieder aufgenommen. Parallel dazu wurden 40 ml Ab-wasserprobe gefriergetrocknet und die Trockenmasse mit Methanol extrahiert. DieWiederfindungsrate wurde mit Coffein als Modellsubstanz für kommunale Abwäs-ser bestimmt und betrug bei der Anreicherung über eine RP18-Kartusche 90 ˙ 3 %und bei der Anreicherung mittels Gefriertrocknung 94 ˙ 3 %. Die Wiederfindungs-raten bei den Modellsubstanzen Pentachlorphenol (PCP) und Dichlorphenol lagenbeim Einsatz von RP18-Kartuschen bei 83 ˙ 4 % und bei Verwendung der Gefrier-trocknung bei 89 ˙ 3 %.

Die Auftrennung der Substanzen in der Normalphasen-Dünnschichtchromato-graphie erfolgt mit einem Universalgradienten aufgrund ihrer Polarität mittels Au-tomated-Multiple-Development- (AMD-)Technik gemäß DIN 38 407 Teil 11. Der


A1* HO17 BO Z1 A1A2* A3* Z1*

Abb. 8.32 Bakterientoxische Wirkstoffe im Zulauf und Ablauf einer Kläranlage. Z Zulauf,A Ablauf, HO17 Negativkontrolle für unbelastetes Oberflächengewässer (Hohlosee), BO Ne-gativkontrolle für unbelastetes Oberflächengewässer (Bostalsee), *methanolische Extrakte derTrockenmasse aus 40 ml nativer Abwasserprobe. Stationäre Phase: KG 60 F 254 s (Merck,Art. Nr. 5365), Format: 10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung:automatische Mehrfachentwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Test-organismus: Bacillus subtilis (ATCC 6633). (Weins [9])

Gradient ist ein 33-Stufengradient basierend auf Dichlormethan, der mit Aceto-nitril als polare Komponente beginnt und mit n-Hexan als unpolare Komponenteendet. Nach der Chromatographie wurden die Chromatogramme zunächst mithilfedes Mehrwellenlängenscans (200 nm bis 320 nm) ausgewertet und anschließend diebakterientoxischen Substanzen detektiert.

8.7.2.1 Detektion bakterientoxischer Wirkstoffe im Zu- und Ablaufeiner Kläranlage

Abbildung 8.32 macht deutlich, dass die methanolischen Extrakte (z. B. A*) derAbwassertrockenmasse eine bessere Ausbeute an bakterientoxischen Verbindungenaufweisen als eine Festphasenextraktion mit RP18-Material (z. B. A). Die extra-hierten bakterientoxischen Verbindungen werden durch die Normalphasenchroma-tographie mit der HPTLC-AMD in 5–7 Polaritätsgruppen klar aufgetrennt. DieAbläufe der Kläranlagen weisen im Vergleich mit den Kläranlagenzuläufen deut-lich auf eine Reduzierung der antibiotischen Wirksamkeit hin. Dennoch ist bei zweiProben im Ablauf eine mögliche Neusynthese von antibiotisch wirksamen Substan-zen mit einer unpolareren Struktur zu beobachten (A1* und A2*).

8.7.2.2 Detektion bakterientoxischer Wirkstoffe im Längsprofileines Oberflächengewässers

An insgesamt sechs Probestellen eines Oberflächengewässers wurden je 1 l Was-serprobe auf bakterientoxische Verbindungen untersucht. Hierbei handelt es sichbei den Probestellen 2 und 5 um Ausläufe kommunaler Kläranlagen, während die

8.8 Detektion östrogener Wirkung mit der Dünnschichtchromatographie (p-YES-Test) 273

1 2 3 4 5 6 K L 1* 2* 3* 4* 5*

Abb. 8.33 Detektion von antibiotisch wirksamen Substanzen in der Alb. 1–5 Probestellen Alb 1bis Alb 5, K unbelastete Wasserprobe, L Leerbahn, *methanolische Extrakte der Trockenmasseaus 40 ml nativer Wasserprobe. Stationäre Phase: KG 60 F 254 s (Merck, Art. Nr. 5365), Format:10 cm × 20 cm, Schichtdicke: 200 µm, chromatographische Entwicklung: automatische Mehrfach-entwicklung mit dem AMD2-Gerät von Camag (Muttenz, Schweiz), Testorganismus: Bacillussubtilis (ATCC 6633). (Weins [9])

Probestellen 6 und 3 ca. 4 km hinter der Kläranlage flussabwärts liegen. Die Probe-stellen 1 und 4 liegen unmittelbar vor der Einlaufstelle der Kläranlage (Abb. 8.33).Die Probenvorbereitung und chromatographische Auftrennung der Verbindungenerfolgt mit der HPTLC-AMD gemäß DIN 38 407 Teil 11.

Auf dem Chromatogramm werden durch den Einsatz von Bacillus subtilis alsTestorganismus antibiotisch wirksame Substanzen deutlich sichtbar. Das Chroma-togramm (Abb. 8.33) lässt erkennen, dass bereits die Probe 1 unmittelbar vor derKläranlage mit antibiotisch wirksamen Substanzen belastet ist. Bei der Probe 2erfolgt ein stärkerer Eintrag von Antibiotika über die Kläranlage in das Gewäs-ser. Diese Belastung wird bis zur Probe 5, dem Einlauf einer weiteren Kläranlageverdünnt und erfährt eine starke Zunahme dieser Wirkstoffe durch den Kläran-lageneintrag. Abbildung 8.33 macht deutlich, dass die Haupteintragsquellen fürAntibiotika in die Oberflächengewässer die Ausläufe der kommunalen Kläranlagensind.

Durch die Zuordnung von Referenzsubstanzen kann im Bereich der Startpunktedes Chromatogramms die Anwesenheit von Tetracyclinen vermutet werden.

8.8 Detektion östrogener Wirkungmit derDünnschichtchromatographie (p-YES-Test)

Gerade in den letzten Jahren haben die sogenannten endokrinen Disruptoren(ECDs) zunehmend für Aufmerksamkeit gesorgt. ECDs können bei Wildpopula-tionen zur Feminisierung männlicher sowie zur Maskulinisierung weiblicher Tiere


Tab. 8.6 Stoffe mit nachgewiesener oder vermuteter östrogener Wirksamkeit (aus: Bundesge-sundheitsblatt 8/98)

Stoffgruppe Stoffe

Pestizide mit Verdacht aufunerwünschte östrogeneWirksamkeit

Aldrin, Atrazin, Chinalphos, 2,4-Dichlorphenol, Dicofol,DDT, Dieldrin, Endosulfan, Heptachlor,Hexachlorcyclohexan (ˇ-HCH und Lindan), Kepon(Chlordecon), Methoxychlor, Mirex, Phosmet, Toxaphen

Industrie- und andere Chemikalienmit Verdacht auf unerwünschteÖstrogenwirkung

Alkylphenole (4-Nonylphenol, 4-Octylphenol),Benzophenon, Bis-(2-ethylhexyl)adipat (DEHA),Bisphenol A, Bisphenol-A-dimethacrylat, Butylbenzol,t-Butylhydroxyanisol, Nitrotoluol, Phenolrot, Phthalate(Butylbenzylphthalat, Di-n-butylphthalat), polychlorierteBiphenyle, polychlorierte Hydroxybiphenyle

Phytoöstrogene (Auswahl) Butin, Citral, Coumestrol, Daidzein, Formononetin,Genistein, Luteolin, Naringenin, Panoferol, Quercetin,Tetrahydrocannabiol

Mykotoxine mit Östrogenwirkung Zearalenon, ˛- und ˇ-Zearalenol

führen. Weiter werden sie für Fertilisationsstörungen, Stoffwechselanomalien,Verhaltensstörungen und ein erhöhtes Krebsrisiko in Geschlechtsorganen verant-wortlich gemacht. ECDs wirken wie Hormone und sind biochemische Botenstoffe,die diverse Körperfunktionen steuern, vom Wachstum über die Fortpflanzung bishin zum Verdauungsvorgang. Nicht nur im menschlichen Körper sind die Hormonevon größter Wichtigkeit. Werden sie in die Umwelt eingebracht, haben sie ungeahntgroße Auswirkungen auf eine Vielzahl von natürlichen Prozessen.

Tabelle 8.6 stellt einige Chemikalien vor, die als hormonaktive Substanz identi-fiziert sind oder als hormonaktiv verdächtig sind

Mittlerweile sind mehr ca. 200 Chemikalien bekannt, die östrogenwirksam sind.Da die Effekte je nach Chemikalie, Konzentration, Tierart und Entwicklungsstadi-um sehr verschieden sind, ist es schwierig, allgemeine Aussagen abzuleiten. Vieledieser Substanzen konnten in Abwässern und Ausläufen von kommunalen Klär-anlagen nachgewiesen werden, die über diese Wege in die Umwelt gelangen. Dieöstrogene Wirkung kann bereits in sehr geringen Konzentrationen (<0,1 ng/l) erfol-gen. Somit stellt die Analytik dieser Wirkstoffgruppe eine große Herausforderungdar [8]. Zur Überprüfung der östrogenen Wirksamkeit einer Substanz wurden zahl-reiche biologische In-vivo- und In-vitro-Methoden entwickelt. Der Hefezellentestnach Routledge und Sumpter wurde 1996 als ein In-vitro-Test zum Nachweis östro-genwirksamer Substanzen entwickelt und dient als Grundlage für den Wirkungstestmit der Dünnschichtchromatographie (p-YES-Test) [8, 63]. Als Standardsubstanzenwerden für dieses Testverfahren in der Regel Ethinylestradiol (EE2) oder Estradi-ol (E2) verwendet. Ethinylestradiol (17˛-Ethinylestradiol; CAS Number: 57-63-6;C20H24O2) ist ein synthetisches Hormon, ein Derivat des natürlich vorkommendenHormons Estradiol.


HPTLC-Pla�e nachEntwicklung

Applika�on derTest Organismen

Addi�on desSubstrats;Inkuba�on

Fließrichtung

PhysikalischeDetek�on

Zellsuspension

Inkuba�on Detek�on östrogen-wirksamer Substanzen

Abb. 8.34 Allgemeine Vorgehensweise der Bestimmung östrogen wirkender Substanzen mit demp-YES-Test. (Weins [9])

8.8.1 Prinzip des p-YES-Tests

Der Hefezellentest auf der Dünnschichtplatte (planar Yeast Estrogen Screen, p-YES) basiert auf dem In-vitro-Testverfahren nach Routledge und Sumpter zumNachweis östrogenwirksamer Substanzen. Durch molekularbiologische Methodenwurden fremde Gene in den Hefezellenstamm Saccharomyces cerevisiae einge-schleust (Transfektion) und dadurch östrogensensitive Zellen hergestellt. In die He-fezellen ist das Gen für den menschlichen Östrogen-Rezeptor (hER) in das Chro-mosom eingebaut. Zusätzlich enthält die Hefezelle ein Expressionsplasmid. DiesesPlasmid besteht aus einer östrogenrezeptorbindenden DNA-Sequenz (engl. estro-gene responsive element, ERE), dem Reporter-Gen Lac-Z und einer Promotorse-quenz. In der Hefezelle wird der menschliche Östrogen-Rezeptor über das im Zell-kern vorhandene hER-Gen synthetisiert. Gelangt eine östrogenwirksame Substanzin die Zelle, kann sie an den hER binden. Der entstandene Komplex bindet dannan das ERE im Plasmid. Durch diese Bindung wird die Transkription des Reporter-Gens Lac-Z ausgelöst und es kommt zur Produktion des Enzyms ˇ-Galaktosidase(Expression). Dieses wird in das die Zelle umgebende Medium ausgeschieden. DemMedium wird ein chromogenes Substrat zugegeben, welches durch die ˇ-Galakto-sidase metabolisiert wird und zu einem farbigen oder fluoreszierenden Endproduktführt [63]. 2004 wählten Müller, Dausend und Weins [8] den YES-Test aus allenbisher eingesetzten In-vivo-Biotests auf östrogene Wirksamkeit aus, da sich He-fezellen für die Kultivierung auf einer Dünnschichtplatte besser eignen als andereTestorganismen, wie z. B. der sog. E-Screen-Test, bei dem menschliche Brustzellendie östrogene Wirksamkeit durch ein vermehrtes Wachstum (Proliferation) anzei-gen.

8.8.1.1 Verfahren des p-YES-TestsDer p-YES-Test erfolgt in 3 Schritten (Abb. 8.34):1. Schritt: Immobilisierung der Probe auf einer Kieselgel-Dünnschichtplatte mit

der Option, die östrogenwirksamen Substanzen von der Matrix mit einem chro-matographischen Verfahren zu trennen.


2. Schritt: Immobilisierung des Testorganismus auf der lösemittelfreien Kiesegel-schicht und Schaffung guter Wachstumsbedingungen mit Kontakt der Zellenmit den zu untersuchenden Verbindungen. Hierbei wird die von organischenLösemitteln befreite Dünnschichtplatte ca. 2 s in eine 24 h alte östrogensensi-tive Hefekultur getaucht, die überschüssige Lösung am Boden der Platte mitHaushaltspapier abgezogen und die Platte bei 32 °C für ca. 3 h bei 90–95 %igerLuftfeuchtigkeit inkubiert.

3. Schritt: Nach der Inkubation und Induktion der ˇ-Galaktosidase durch dieöstrogenwirksamen Substanzen erfolgt eine Substratumsetzung zum Nachweisdes gebildeten Enzyms. Zum Nachweis der induzierten ˇ-Galaktosidase wirddas fluorogene Substrat 4-Methylumbelliferyl-ˇ-D-Galaktopyranosid (MUG)auf die Platte gesprüht. Innerhalb von 15–30 min bei 32 °C wird dieses Substratdurch die ˇ-Galaktosidase in Galaktose und das fluoreszierende 4-Methy-lumbelliferon (4MU) gespalten. Die Fluoreszenz des Reaktionsproduktes kannnach einer Bedampfung des Chromatogramms mit Ammoniakdampf bei 460 nmsowohl im Fluoreszenzmodus mit einem TLC-Scanner als auch per Videodo-kumentation vermessen und quantitativ ausgewertet werden. Ebenso kann alsSubstrat Chlorophenol-rot-ˇ-D-Galaktopyranosid eingesetzt werden, das in Ge-genwart der ˇ-Galaktosidase in einen roten Farbstoff umgesetzt wird, der bei540 nm detektiert werden kann.

8.8.2 Darstellung der Methode und ihre Anwendungsbeispiele

Im Gegensatz zum YES-Test, der in vitro durchgeführt wird, konnte die Testzeitdes p-YES-Tests von Buchinger, Spira und Schönborn in den letzten Jahren vonca. 18 h auf ca. 3 h verkürzt werden. Die derzeitige Nachweisgrenze liegt bei 0,5–2 pg/Auftragestelle [64, 65, 66].

Abbildung 8.35 zeigt eine Reihe von Kalibrierstandards von E2 nach einer chro-matographischen Entwicklung. Die Proben wurden als 6-mm-Bänder auf eine Kie-selgelplatte aufgetragen. Als Leerwert diente reines Ethanol. Die Proben wurden6 cm chromatographiert (mobile Phase: Chloroform/Aceton/Petroleum). Anschlie-ßend wurde die Platte vom Fließmittel befreit und die östrogenen Wirksubstanzenmit dem p-YES-Test detektiert.

Bei den höheren Konzentrationen sind Verunreinigungen des Standards zu er-kennen, die bei stärkerer Verdünnung unter die Detektionsgrenze fallen.

Das Verhältnis zwischen dem Messsignal und dem Logarithmus der aufgetrage-nen Masse ergibt eine typische sigmoide Dosis-Wirkungs-Kurve. Somit ist dieserTest in der Lage, östrogenwirksame Substanzen sowohl qualitativ als auch quanti-tativ zu bestimmen (Abb. 8.36) [8, 64, 65, 66].

Die Quantifizierung erfolgt mit bekannten östrogenwirksamen Substanzen alsReferenzensubstanzen, wie 17˛-Ethinylestradiol (EE2) oder 17ˇ-Estradiol (E2).Der Gehalt von unbekannten Wirkstoffen kann auch als östrogenwirksame Einheit(EEQ) angegeben werden anhand einer zuvor erstellten Dosis-Wirkungs-Kurve mitReferenzsubstanzen.


Abb. 8.35 Kalibrierung und Detektionsgrenze von E2 nach einer chromatographischen Entwick-lung mit dem p-YES-Test als Wirkungstest, wobei MUG als Substrat für die ˇ-Galaktosidaseeingesetzt wurde. (Mit freundlicher Genehmigung von Denise Spira und Sebastian Buchinger,Bundesanstalt für Gewässerkunde, Koblenz 2014)

Abb. 8.36 Dosis-Wirkungs-Beziehung der eingesetzten Masse an 17ˇ-Estradiol (E2) und demFluoreszenzsignal mit dem p-YES-Test. (Mit freundlicher Genehmigung von Denise Spira undSebastian Buchinger, Bundesanstalt für Gewässerkunde, Koblenz 2014)

8.8.2.1 Detektion hormonaktiver Stoffe in PorenwasserAls Porenwasser wird jener Wasseranteil bezeichnet, der in feinen Hohlräumen desBodens und des oberflächennahen Gesteins enthalten ist. Vier verschiedene Poren-wässer wurden auf die Gegenwart hormonaktiver Substanzen getestet, um somitEinflüsse auf die am Boden ansässige Biozönose bestimmen zu können.


Abb. 8.37 Detektion hormonaktiver Stoffe in vier verschiedenen Porenwässern mit dem p-YES-Test, wobei MUG als Substrat für die ˇ-Galaktosidase eingesetzt wurde. (Mit freundlicher Geneh-migung von Denise Spira und Sebastian Buchinger, Bundesanstalt für Gewässerkunde, Koblenz2014)

Die organischen Komponenten aus 50 ml Porenwasser wurden mithilfe einerFestphasenextraktion angereichert und in 1 ml Methanol wieder gelöst. 10 µl vonjeweils vier unterschiedlichen Porenwässern wurden als 8-mm-Banden auf eineDünnschichtplatte (KG60) appliziert. Als Kontrolle (Field Blank) wurden 50 mlLeitungswasser der gleichen Probenvorbereitung unterzogen und 10 µl des Extraktsauf die Platte appliziert. Als Positivkontrolle wurden 12,5 pg EE2 in Ethanol auf-getragen. Die Chromatographie erfolgte zweistufig durch eine Fokussierung derProben von 10 mm bis 20 mm mit Methanol (100 %) und anschließende Trennungder Substanzen von 20 mm bis 80 mm mit Ethylacetat/n-Hexan (50 : 50).

Abbildung 8.37 macht deutlich, dass in Probe 708 eine größere Menge an EE2als in der Kontrolle (12,5 pg) vorliegt. In Anbetracht des Anreicherungsfaktors von1 : 50 kann in dieser Probe von einer EE2-Konzentration von > 5 pg/l ausgegangenwerden.

8.8.3 Vorteile des p-YES-Testes und seineAnwendungsmöglichkeiten

Die Detektion hormonaktiver Stoffe mit der Dünnschichtchromatographie ist einsehr komplexes Verfahren, das jedoch in der Lage ist, diese Stoffe im Bereich von0,1 ng/l bestimmen zu können. Gerade für Proben mit sehr komplexer Matrix bietetdie Methode den Vorteil, diese Stoffe ohne Störung von Interferenzen zu bestim-

8.9 Schlussfolgerungen und Ausblick 279

men. Die Methode ist insbesondere für die Bestimmung von östrogenwirksamenStoffen geeignet in:� jeder Art von Wasserproben, wie z. B.:

– Trinkwasser und Rohwasser– Oberflächenwasser– Abwässer, insbesondere Abwässer mit einer hohen Kontamination von Bak-

terien und anderen Mikroorganismen– Abwässer mit einem hohen Salzgehalt– wässrigen Extrakten und Sickerwässern– Eluaten von Sedimenten und Porenwasser von Sedimenten– wässrigen Lösungen von Einzelsubstanzen und Substanzmischungen– Wasserproben mit einer hohen Trübung

� Sonnencremes [64, 65]� Pflanzenextrakten

Mit diesem Verfahren können ebenso native Proben mit einer komplexen Matrixohne Probenvorbereitung untersucht und quantifiziert werden.

8.9 Schlussfolgerungen und Ausblick

Die Dünnschichtchromatographie gehört zu den robustesten chromatographischenVerfahren, die seit über 40 Jahren zuverlässige Ergebnisse in der Analytik vonStoffen liefert. Molekularbiologische Testverfahren sind nicht nur in vitro durchzu-führen sondern gelingen auch auf einer Dünnschichtplatte. Die Wirkungstests aufdem Chromatogramm weisen Stoffe bei überlagerten, nicht vollständig getrenntenSubstanzgemischen selektiv nach.

I Die Kopplung der Dünnschichtchromatographie mit der anschließenden wirkungs-spezifischen Detektion erfüllt zwei Aufgaben:1. Nach der physikalischen Auswertung kann eine erste Identifizierung der Wirk-

stoffeverifiziertwerden, z. B. ob einmögliches chromatographisch identifiziertesFungizid auch fungizide Wirkung hat,

2. Die Gegenwart unbekannter Wirkstoffe (z. B. UV-inaktive Substanzen, StoffemitKonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze physikalischer Detektionsver-fahren) bzw. aktiver Metabolite kann aufgespürt werden [67].

Die Anwendungsgebiete der wirkungsbezogenen Analytik sind vielfältig understrecken sich von der Reinheitskontrolle über die Transformationsforschung vonChemikalien bis zum Aufspüren von bioaktiven Stoffen für die Pharmakognosie zurIdentifizierung neuer Heilsubstanzen [68]. Mit der wirkungsbezogenen Analytikkönnen Prozesse überwacht und unbekannte Schadstoffe sowie deren bioaktivenMetabolite gefunden werden.

Die Zusammenhänge in der Biologie können durch die Verbindung der instru-mentellen chemischen Analytik mit organismischen und suborganismischen Test-verfahren in Zukunft besser verstanden werden [69].


Die Kombination von Biotests mit chemischer Analytik eröffnet neue Möglich-keiten zum Aufspüren und zur Risikoabschätzung von problematischen Spurenstof-fen in der Umwelt. Dies insbesondere dadurch, dass mit verschiedenen suborganis-mischen Testverfahren Methoden zur Verfügung stehen, mit denen subletale (chro-nische) toxische (z. B. endokrine, mutagene oder kanzerogene) Wirkungen nachge-wiesen werden können. Eine Weiterentwicklung der wirkungsbezogenen HPTLC-Analytik bildet bereits die Grundlage zur Identifizierung von Schadstoffen durchKopplung der HPTLC mit der Massenspektrometrie [67].

Die wirkungsbezogene Analytik ist mehr als ein modernes Verfahren zur Detek-tion einzelner Substanzen. Hinter dieser Analytik steht eine Strategie, die versucht,die Komplexität der Stoffe in unserer Umwelt sowohl mit chemisch-analytischen,aber auch biologisch-biochemischen Verfahren interdisziplinär zu entschlüsseln. ImGegensatz zum herkömmlichen Analytikverfahren basiert dieses Konzept auf demsteten Ineinandergreifen von biologischen und chemisch-physikalischen Verfahren,um neben der biologisch selektiven Anreicherung bioaktiver Stoffe die Wirkstrukturermitteln zu können und nach der Identifizierung des Wirkstoffes dessen Wirkstär-ke auch bestimmen zu können. Diese Erkenntnisse wiederum sollen die Grundlagebilden für eine präzisere Risikoabschätzung in der Zukunft.

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http://dx.doi.org/10.1155/2013/283506

9Detektoren in derDünnschichtchromatographie

Die Stärke der Dünnschichtchromatographie liegt in ihrer einfachen Handhabung.Nicht zuletzt ist es das Auge, das überall verfügbar als qualitativer Detektor die-nen kann. Quantitativ lässt sich eine DC-Platte so nicht auswerten. Seit Anfang der1950er-Jahre wurde in der Papierchromatographie quantifiziert, indem das Papiermit Reagenzien transparent gemacht und die Schwächung des durchscheinendenLichtes gemessen wurde. Die Lichtschwächung wurde dabei mit Photomaterialienauf Basis der Silberphotographie bestimmt.

9.1 Transmissionsmessungen in derDünnschichtchromatographie

Mitte der 1960er-Jahre übertrug man die photometrischen Messungen der Licht-schwächung auch auf die DC. Da anfangs nur in Durchlicht gemessen werdenkonnte, wurden diese Messsysteme Densitometer genannt. Diese In-situ-Messme-thode war dem umständlichen und zeitaufwändigen Auskratzen und Extrahierenvon Substanzflecken deutlich überlegen, denn sie ermöglichte eine etwa um denFaktor 10 höhere Messempfindlichkeit [1]. Im Unterschied zur Küvettenmessungzeigt die photometrische Chromatogrammauswertung allerdings einige Besonder-heiten:� Die Substanz in der stationären Phase ist nicht gleich verteilt, wie das in einer

Lösung immer der Fall ist. Das Absorptionssignal ist daher nicht nur von derKonzentration, sondern auch von der Konzentrationsverteilung im Substanzfleckund damit indirekt auch von der Fleckgröße abhängig [2].

� Durch die Lichtstreuung in der stationären Phase ist die Weglänge des Lichtesnicht genau bestimmbar. Sie ist aber auf jeden Fall größer als die Schichtdickeder stationären Phase.

� Eine Änderung der Schichtdicke sollte einen Einfluss auf die Messung haben, dasowohl die Streuung als auch die Lichtabsorption in ihrer Größe von der Weg-länge abhängen, auf der alle Streu- und Absorptionsvorgänge ablaufen.


286 9 Detektoren in der Dünnschichtchromatographie

9.1.1 Das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz

Werden DC-Platten, ähnlich den Papieren der Papierchromatographie, in Durchlichtausgewertet, gilt zur Quantifizierung das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz [2]. DieWahrscheinlichkeit, dass ein Photon absorbiert wird, ist proportional zur Konzen-tration der absorbierenden Moleküle. Das wird durch folgende Formel ausgedrückt:

@I

ID �kc@x :

In dieser Gleichung ist I die Lichtintensität (bei einer bestimmten Wellenlänge)und @I ist die Änderung der Lichtintensität durch die DC-Platte mit der Schicht-dicke @x, die eine Konzentration von c an absorbierenden Molekülen enthält. DieIntensität des Lichtstrahls nach dem Passieren der Strecke d durch die Trennschichtist:

IdZI0

@I

ID �kc

dZ0

@x

lnId

I0

D ln.10/ lgId

I0

D �kcd :

Es ist bequem und üblich, den Logarithmus zur Basis 10 zu benutzen. Mitder Definition des Absorptionkoeffizienten (früher auch Extinktionskoeffizientgenannt)

" D k

ln 10D k

2;303

erhält man den Ausdruck des Bouguer-Lambert-Beer-Gesetzes.

A � � lgId

I0

� � lg T D "cd (9.1)

A Absorption (Extinktion)T TransmissionI Durchlichtintensität des ProbeflecksI0 Durchlichtintensität der freien Platte" molarer Absorptions- bzw. Extrinktionskoeffizientc Konzentration im Substanzfleckd Plattenschichtdicke

Das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz beschreibt den Zusammenhang zwischender Intensität des eingestrahlten Lichtes und des nach der Absorption verbleiben-den Lichtes. Die Beziehung ist nur gültig in nichtstreuenden Medien, weil derLichtverlust beim Passieren der Absorptionsschicht (die Lichtdifferenz zwischen I0

und Id) nur der Molekülabsorption der Analyte mit der Konzentration c zugeschrie-ben wird. Eventuelle andere Quellen des Lichtverlustes, wie z. B. Streuprozesse,werden nicht berücksichtig.

9.2 Remissionsmessungen in der DC und HPTLC 287

Die Ausdrücke für die Lichtintensitäten (I und I0) sind physikalische Parameterund mit Einheiten behaftet. Die Transmission T � Id / I0 als Ausdruck des Lichtver-lustes wird als einheitenloser Wert eingeführt.

Transmissionsmessungen in der DC haben einige Nachteile. Die üblichen statio-nären Phasen zeigen eine abnehmende Transparenz im Wellenlängenbereich unter-halb von 300 nm. Da auch Glasplatten in diesem Bereich nicht mehr transparentsind – denn sie bestehen aus einfachem Fensterglas und nicht aus Quarzglas –bleibt dieser wichtige Wellenlängenbereich für eine Messung ausgeschlossen. Dabei Transmissionsmessungen, im Vergleich zu Remissionsmessungen (Messungenin Reflexion), relativ viel Licht am Detektor ankommt, hielt man diese Art der DC-Auswertung lange Zeit für vorteilhafter [1].

H. Jork konnte im Jahre 1967 experimentell nachweisen, dass ein unmittelbarerZusammenhang zwischen Transmissionsänderungen und Schichtdickeschwankun-gen besteht [3]. Dies ist nach der Formel des Bouguer-Lambert-Beer-Gesetzes auchzu erwarten. Interessant war jedoch sein Befund, dass Remissionsmessungen die-se Schichtdickenabhängigkeit nicht zeigen [3]. Nach dieser Erkenntnis wurde dieProduktion von Durchlicht-Densitometern weltweit eingestellt. Der Aufschwungder Gelelektrophorese in der Bioanalytik hat neuerdings dazu geführt, dass einigeHersteller Transmissionsoptionen bei ihren DC-Scannern erneut anbieten.

9.2 Remissionsmessungen in der DC und HPTLC

Licht wird an glatten Oberflächen gerichtet reflektiert. Dieses gerichtete Licht kannman als „Glanz“ sehen, wenn man die Oberfläche einer DC-Platte unter kleinemWinkel gegen das Licht betrachtet. An rauen Oberflächen beobachtet man dagegeneine diffuse Lichtreflexion, bei der ungerichtetes Licht abgestrahlt wird. Diese Artder Lichtreflexion wird als Remission bezeichnet.

Im Jahre 1964 wurde von H. Jork ein Gerät beschrieben, mit dem man DC-Platten in Remission vermessen konnte [1, 4]. In Abb. 9.1 ist das Messprinzipder Remissionsmessung im Vergleich zur Transmissionsmessung abgebildet. BeideMethoden unterscheiden sich nur durch die Lage des Detektors zur DC-Platte. DasMessprinzip der Monowellenlängenscanner hat sich dabei bis heute nicht wesent-lich geändert, wie Abb. 9.2 zeigt. Ein schwacher monochromatischer Lichtstrahlwird durch Spiegel und Linsen über die Platte bewegt. Das reflektierte Licht wirdmeist von einem in einem Winkel von 45° zum einfallenden Licht angeordnetenPhotomultiplier aufgenommen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Dabeiwird die Platte mit geringen Lichtstärken angestrahlt, da das Licht schon ein di-sperses Element passiert hat, bevor es auf die Platte trifft. Der Messbereich einesDC-Scanners umfasst sowohl den UV-Bereich ab 200 nm als auch den sichtbarenBereich des Lichtes bis etwa 800 nm. Die vorgewählte Messwellenlänge bildet inden meisten Geräten einen Bereich von etwa ˙2,5 nm des gewählten Wertes ab.Die Ortsauflösung solcher Scanner liegt auf jeden Fall merklich über 300 µm, daauch ein Lichtstrahl unendlich kleiner Ausdehnung in der stationären Phase ge-streut und damit durch den über der Platte stehenden Detektor als Lichtfleck mit


a

b

L

L

P

P

D

D

M

M

Abb. 9.1 Dargestellt ist das Messprinzip einer DC-Transmissionsmessung (a) im Vergleich zueiner DC-Remissionsmessung (b). L Lampe, M Monochromator, P DC-Platte, D Detektor

relativ großem Durchmesser wahrgenommen wird. Im Unterschied zur Transmis-sionsmessung kann bei Remissionsmessungen das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetzprinzipiell keine Gültigkeit besitzen, denn das auftreffende Licht wird von der sta-tionären Phase sowohl absorbiert als auch gestreut. Es muss ja Streulicht geben,denn ohne Lichtstreuung auf der Oberfläche kann eine DC-Platte kein Licht inEinstrahlrichtung abgeben. Das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz besitzt aber – wieschon erwähnt – nur für nichtstreuende Medien Gültigkeit.

9.2.1 Die Kubelka-Munk-Gleichung

A. Schuster war 1905 der Erste, der sich mit dem Problem der gleichzeitigen Lich-tabsorption und -streuung befasste. Er stieß auf dieses Problem, als er die Streu-wirkung von atmosphärischen Nebeln berechnete [5]. Zur Lösung stellte er zweiDifferenzialgleichungen auf, die im Jahre 1931 von P. Kubelka und F. Munk zurBeschreibung von Farbanstrichen übernommen wurden [6]. Entsprechend der De-finition für die Lichtintensität bei Transmissionsmessungen (T � Id / I0) definierteSchuster einen Ausdruck für die Remission, in dem das nach einem Streuprozess

9.2 Remissionsmessungen in der DC und HPTLC 289

verbleibende Licht I ins Verhältnis zum ursprünglich eingestrahlten Licht I0 gesetztwird.

R1 D I

I0

Eine Erweiterung der Theorie nach Kubelka und Munk wird im nächsten Kapitelvorgestellt [7]. Der wichtige Punkt ist, dass Kubelka und Munk einen Ausdruck fürmehrfach gestreutes Licht formulierten, das in Remission gemessen wird [6, 9]. Inihrem vereinfachten Ansatz nahmen Kubelka und Munk an, dass Licht innerhalbdes streuenden Mediums gleichförmig in alle Raumrichtungen gestreut wird. DieKubelka-Munk-Formel, an die DC angepasst, wird in den Lehrbüchern wie folgtformuliert [9–11]:

KM D .1 � R1/2

2R1D a

sD c"

sD n"

VsD n"

Fds: (9.2)

R1 absoluter Remissionsgrad (bei unendlich dicker Schicht)a Absorptionskoeffizients Streukoeffizient der stationären Phasec Konzentration im DC-Fleck" molarer Absorptionskoeffizientn Stoffmenge Substanz im Fleckvolumen VF Fläche des Substanzspotsd Schichtdicke der stationären Phase

Die Kubelka-Munk-Funktion liefert eine angenäherte Lösung für DC-Auswer-tungen. Streng genommen gilt die Kubelka-Munk-Formel nur für DC-Schichten,die mit diffusem Licht bestrahlt werden. Gerichtete Reflexionen dürfen nicht auf-treten. Die Teilchen in der Schicht müssen deshalb regellos verteilt sein, und diePartikel der Schicht müssen wesentlich kleiner sein als die Dicke der Schicht. Diesemuss so dick sein, dass kein eingestrahltes Licht die DC-Schicht nach unten verlas-sen kann. H. Jork verlangt für die Gültigkeit der Kubelka-Munk-Formel außerdemmonochromatisches Licht für die Schichtbestrahlung, denn bei polychromatischemLicht würden Brechungs- und Beugungserscheinungen nicht einheitlich verlaufen.Für diese Behauptung führt Jork allerdings keine Begründung an.

Alle diese Bedingungen sind bei der Bestrahlung von DC-Platten eher schlechterfüllt. Insbesondere sind die Platten mit Schichtdicken zwischen 100 und 200 µmviel zu dünn, um das von oben eingestrahlte Licht zur Einstrahlrichtung hin voll-ständig zu streuen. Ganz im Gegenteil! Transmissionsmessungen sind ja nur mög-lich, weil ein nicht unerheblicher Teil des von oben eingestrahlten Lichtes die Plattedurchläuft und auf der Unterseite wieder austritt. Dickere Schichten helfen auchnicht weiter, weil größer Schichtdicken die chromatographische Auflösung undauch die Nachweisgrenze der Analyte wesentlich verschlechtern. Damit beschreibtdie Kubelka-Munk-Formel das Absorptions- und Streuverhalten von Licht in ei-ner DC-Trennschicht auf keinen Fall korrekt. Zumindest gilt dies für transparenteGlasplatten. Man versuchte das Remissionslicht zu verstärken, indem man Sorbens-schichten auf reflektierender Aluminiumfolie aufbrachte [12]. So konnte zwar das


reflektierte Licht verstärkt werden, aber es entstanden trotzdem Lichtverluste durchAbsorptionen an der Folie.

Trotz aller Einschränkungen spricht vieles für Remissionsmessungen. Der ab-solute Remissionsgrad nimmt z. B. bei kleineren Korngrößen zu [7, 8, 11, 12].Folglich sind die Voraussetzungen für die Gültigkeit der Kubelka-Munk-Formel aufHPTLC-Schichten eher erfüllt als auf DC-Schichten. Der Absorptionskoeffizientwie auch der Streukoeffizient hängen von der Schichtdicke ab. Da bei größererSchichtdicke die Lichtabsorption der stationären Phase sowie deren Streuintensi-tät zunehmen, sollte die Variation der Schichtdicke nur einen geringen Einfluss aufdas Remissionssignal zeigen. Jork konnte dies experimentell bestätigen [3].

Die Forderung nach Gleichverteilung eines Analyten in der bestrahlten Schichtist schwer zu realisieren. Am besten gelingt dies noch mit einer strichförmigen Auf-tragung der Probe und anschließender spaltförmiger Auslesung mit kleiner Orts-auflösung. Nur dann wird im Auslesesegment bei annähernd konstanter Substanz-konzentration im Messbereich vermessen [13]. Bei einer kreisförmigen Auftragungkann eine Gleichverteilung im Auslesesegment nur mit einer punktförmigen Aus-lesung erreicht werden. Der für diesen Zweck konstruierte Flying-spot-Scanner miteiner Ortsauflösung von größer als 300 µm2 ist aber eher für die relativ großen Sub-stanzflecke der DC- als für die kleinen Spots der HPTLC-Platten geeignet.

Gerichtete Reflexionen treten an DC-Platten nur unter sehr flachen Einstrahl-winkeln auf. Die Platte zeigt dann einen hellen „Glanz“. Um solche Reflexionenzu vermeiden, sollte möglichst senkrecht zur Platte eingestrahlt werden. Damit sinddie Daten für einen optimalen HPTLC-Remissionsscanner vorgegeben. Er solltespaltförmig mit möglichst kleiner Ortsauflösung messen, und Beleuchtung sowieDetektion sollten senkrecht zur Platte erfolgen.

Die Kubelka-Munk-Funktion beschreibt einen Zusammenhang zwischen trans-formiertem Messsignal (KM) und der Stoffmenge n im Substanzfleck (9.2). Umzwei Flecke vergleichen zu können, müssen diese allerdings die gleiche Fleckflä-che F besitzen. Bei der Aufstellung einer Kalibrierfunktion sollte daher immer mitgleichen Standard- und Probevolumina gearbeitet werden, damit die Fleckflächenvergleichbare Größe haben [7, 13].

Der Theorie nach sind in der Kubelka-Munk-Gleichung nur absolute Remissi-onswerte (R1) der Stoffmenge im Substanzfleck proportional. Der absolute Re-missionsgrad wird gleich eins (R1 = 1), wenn das einfallende Licht vollständig re-emittiert wird, wenn also keinerlei Absorption stattfindet (a = 0). Daraus folgt dannentsprechend (9.2) ein KM-Wert von KM = 0. Solch eine ideal streuende Substanz,die man als absoluten Weißstandard verwenden könnte, ist jedoch nicht bekannt.Fein verteiltes Magnesiumoxid, wie auch frisch gefälltes Bariumsulfat oder auchMagnesiumcarbonat kommen dem idealen Weißstandard am nächsten. Messtech-nisch zugänglich sind bei einer DC-Messung nur relative Remissionswerte, unddiese müssten unter Bezug auf einen (idealen) Weißstandard in absolute Remis-sionswerte umgerechnet werden. All dieser Einschränkungen wegen hat man derKubelka-Munk-Gleichung in der Vergangenheit wenig Aufmerksamkeit geschenkt,insbesondere, da absolute Remissionswerte von DC-Platten nicht erhalten werdenkönnen.

9.3 Diodenarray-Scanner 291

Trotzdem hat es immer wieder Versuche gegeben, die Kubelka-Munk-Formelfür die DC zu nutzen [1, 7, 11, 14–17]. Abbildung 9.3 zeigt ein typisches Densi-togramm einer Trennung von Coffein auf Kieselgelphase mit dem Fließmittel 2-Propanol/Cyclohexan/wässriger NH3 (25 %ig) (7 + 2 + 1, V / V). Die Bahn wur-de bei 273 nm vermessen. Das heißt, die Platte wurde mit Licht der Wellenlänge273 nm bestrahlt. Das von der Oberfläche rückgestreute Licht I wurde ins Verhältniszum ursprünglich eingestrahlten Licht I0 gesetzt und dann entsprechend der Kubel-ka-Munk-Gleichung transformiert. Ist die Theorie richtig, sollten die Flächen derCoffeinpeaks, also jeweils die Summe aller Coffeinsignale einer Bahn, eine lineareAbhängigkeit zur aufgetragenen Coffeinmasse zeigen.

9.3 Diodenarray-Scanner

9.3.1 Remissionsmessungenmittels Dioden-Array-Technik

In Abb. 9.4 ist eine 3-D-Aufnahme derselben Coffeintrennung abgebildet, die inAbb. 9.3 zu sehen ist. Sie wurde mit einem Diodenarray-Detektor innerhalb von22,5 Sekunden aufgenommen. Es wurde der Wellenlängenbereich von 200 bis350 nm detektiert. Der Informationsgehalt einer Diodenarray-Aufnahme ist we-sentlich größer als der eines einzelnen Densitogramms. Das Coffeinsignal wirdnicht nur bei einer Wellenlänge oder innerhalb eines Wellenlängenbereiches darge-stellt, sondern bei vielen verschiedenen Wellenlängen. In Abb. 9.4 sieht man, dassCoffein zwei Absorptionsmaxima besitzt. Das größere befindet sich bei 273 nm.

Üblicherweise wird eine Diodenarray-Messung nicht als 3-D-Bild dargestellt,sondern in Form eines Kontourplots, wie ihn Abb. 9.5 zeigt. Der Kontourplot be-steht aus der Darstellung einer Reihe von Spektren, die bei verschiedenen Trenn-strecken aufgenommen wurden. Bei der hier dargestellten Coffeintrennung wurdeüber eine Trennstrecke von 45 mm alle 100 µm ein Spektrum im Bereich von 200 bis350 nm gemessen. Der Kontourplot bildet damit 450 Einzelspektren ab, die jeweilsaus 512 Einzelmessdaten zusammengesetzt sind und innerhalb von 22,5 s aufge-nommen wurden. Da der Kontourplot mit 512 Einzeldioden registriert wurde, bildeter 512 verschiedene Densitogramme ab. Die optimalen Daten zur Quantifizierungeiner Trennung können nach der Messung am Computer bequem ermittelt werden.

9.3.2 Spezielle Lichtleiterinterfaces

Die erste Auswertung einer DC-Platte mittels Diodenarray-Technik publizierten G.Gauglitz und S. Bayerbach im Jahre 1989 [18]. Die Idee, die Diodenarray-Tech-nik zur Auswertung von Dünnschichtplatten zu benutzen, geht aber auf W. Wuthezurück [19]. Erst der Einsatz UV-durchlässiger Lichtleiterfasern in Verbindung miteinem neuartigen Interface ermöglichte die kommerzielle Nutzung der Diodenar-ray-Technik in der Dünnschichtchromatographie [20]. Durch die Verwendung UV-durchlässiger Lichtleiter in Kombination mit einer speziellen Lichtleiteranordnung


Abb. 9.2 Gezeigt ist ein typischer DC-Scanner mit eingezeichnetem Lichtweg. Die Platte wirdmit monochromatischem Licht von oben bestrahlt. Die Position des Detektors, einem Photomul-tiplier, kann verändert werden. Remissionsmessungen werden mit einem Detektor durchgeführt,der oberhalb der Platte angeordnet ist. Für Transmissionsmessungen wird der Detektor unter diePlatte gefahren. (Mit freundlicher Genehmigung der Fa. Biostep, Jahnsdorf)

kann Licht senkrecht von oben auf die Platte gebracht werden. Das gestreute Lichtwird von einem zweiten Faserbündel aufgenommen und zum Detektor geleitet [21].Während der Messung bewegt sich die DC-Platte mit konstanter Geschwindigkeitunter dem Lichtleiterinterface hindurch. Das Prinzip ist in Abb. 9.6 gezeigt.

Im Unterschied zur klassischen Monowellenlängentechnik wird bei Diodenar-ray-Aufnahmen mit polychromatischem Licht eingestrahlt. Erst das rückgestreuteLicht wird spektral zerlegt und dann bei verschiedenen Wellenlängen gemessenund digitalisiert. Nur mit Lichtleitern gelingt es, eine so große Lichtintensität aufdie Platte zu bringen, dass ein Diodenarray-Detektor simultan in einem breitenWellenlängenbereich messen kann. Ein Spektrum wird dabei registriert, ohne dassmechanische Komponenten gebraucht werden. Damit ist die Lichtleitertechnologiemit diesem einfachen Aufbau der klassischen, mit Spiegeln, Blenden und Linsenarbeitenden Lichttechnologie (Abb. 9.2) überlegen. Eine Justierung des Spektro-meters ist nicht nötig. Der Scanner ist z. B. nach einem Transport sofort messbereit.

Den ersten Versuch, diffuse Reflexionen (Remissionen) an makroskopischenOberflächen theoretisch zu deuten, wurde im Jahre 1760 von P. Bouguer gemacht.Bouguer nahm an, dass die diffuse Reflexion durch reguläre Spiegelungen anKristallflächen zustandekommt, die statistisch über alle Winkel verteilt sind. DieWinkelverteilung der diffusen Reflexion an HPTLC-Platten gehorcht nicht strengdem Lambert’schen Kosinusgesetz, sondern entspricht eher einem Seeliger’schenStrahler, da auch gerichtete Reflexionen von der DC-Oberfläche möglich sind [10].Wie schon erwähnt, beobachtet man gerichtete Strahlung besonders bei kleinenEinstrahlwinkeln. Das Lambertsche Kosinusgesetz [I = I0 cos(˛)] zeigt deutlich,dass die Lichtintensität der diffusen Reflexion nur bei senkrechter Einstrahlungund senkrechter Messung den maximalen Wert zeigt. Zur optimalen Lichtaus-beute einer diffusen Reflexionsmessung sollte bei einem DC-Scanner daher das


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 15 30 45Trennstrecke (mm)

KM

-Sig

nal

Abb. 9.3 Densitogramm einer Coffeinprobe mit dem Frontsignal bei 42 mm. Der Coffeinpeak istbei einer Trennstrecke von 20 mm zu sehen. Er wurde im spektralen Coffeinmaximum von 273 nmvermessen und entsprechend Gl. (9.9) transformiert

Abb. 9.4 Dargestellt ist der 3-D-Plot einer Coffeintrennung, aufgenommen mit einem Diodenar-ray-Scanner. Auf der x-Achse ist die Trennstrecke, auf der y-Achse die spektrale Wellenlänge undauf der z-Achse das KM-Signal aufgetragen

Licht senkrecht auf die zu vermessende Platte eingestrahlt und so gut wie mög-lich auch wieder senkrecht ausgelesen werden. Diese Forderung kann nur mitLichtleiterfasern geringen Durchmessers erfüllt werden, die als Sende- und Emp-


Abb. 9.5 Abgebildet ist die Kontourplot-Darstellung einer Coffeintrennung. Die Trennstreckewurde auf der x-Achse und die Wellenlänge (in nm) auf der y-Achse dargestellt. Die Bahn wurdemit einem TIDAS TLC 2010-System (der Fa. J&M Aalen, Deutschland) aufgenommen

Abb. 9.6 Dargestellt ist dasFunktionsprinzip eines Licht-leiter-Diodenarry-Scannersmit zwei parallel angeordne-ten Faserreihen [18, 21]

< 3.5 mm >

Lampe

HPTLC-Pla�e

Diodenarray-Detektor

X

Ybeweglicher Tisch

Lichtleiter

fangslichtleiter parallel angeordnet sind. Technische Lösungen benutzen entwedereine Einreihen- oder eine Doppelreihenanordnung. In der Einreihengestaltung sindz. B. 50 Lichtleiterfasern mit einem Innendurchmesser von jeweils 100 µm neben-einander angeordnet. Die Fasern dienen abwechselnd zur Plattenbeleuchtung undzum Auslesen des reflektierten Lichtes. Dieses Lichtleiterinterface ist einfach zuproduzieren und zeigt bei der Detektion eine hohe Lichtstärke. Es ist mit 5,5 mm


Breite allerdings relativ groß. Ein entsprechendes Doppelreihenlichtleiter-Interfacebesteht aus zwei parallel angeordneten Faserreihen zu jeweils 25 Einzelfasern imDurchmesser von je 100 µm (Abb. 9.6). Eine der beiden Reihen wird zur Beleuch-tung der Platte und die andere Reihe zur Detektion benutzt. Gleichzeitig wird diemessende Faserreihe auch als Spalt zur Bildabbildung auf den Monochromator ver-wendet. Die Interfaceversion mit drei parallel angeordneten Faserreihen erlaubt denAnschluss zweier unterschiedlicher Lampenarten, z. B. für Fluoreszenzmessungen.Die optischen Eigenschaften ähneln denen des Doppelreihenlichtleiters.

9.3.3 Ortsauflösung auf der Platte

Die mit solchen Interfaces gemessene Lichtintensität steigt mit zunehmendem Ab-stand des Interfaces von der Platte steil an, um sich bei größeren Abständen kaumnoch zu verändern. Bei Abständen von über 1 mm fällt die gemessene Lichtintensi-tät wieder ab. Der Befund ist einfach zu erklären. Jede Faser, die Licht auf die Plattetransportiert, formt einen runden Lichtfleck. Jede Faser, die Remissionslicht von derPlatte zum Detektor transportiert, liest ebenfalls einen kreisförmigen Plattenbereichaus. Es wird aber nur das Remissionslicht detektiert, das im Überlappungsbereichder beiden runden Flecke reflektiert wird. Bei kleinen Abständen ist die gemesseneLichtintensität gering, da sich Beleuchtungskegel und Auslesekegel nur zu einemkleinen Teil überlappen. Die Überlappung wird umso größer, je weiter sich dieFasern von der Plattenoberfläche entfernt befinden. Allerdings nimmt mit steigen-dem Abstand auch die eingestrahlte Lichtintensität ab. Im Abstand von 450 µmhalten sich beide Effekte in etwa die Waage. Die reflektierte Lichtintensität ist ineinem Bereich annähernd konstant, also unabhängig vom Abstand des Interfaceszur Plattenoberfläche. Bei größeren Abständen überwiegt der Lichtverlust durchden steigenden Abstand des Interfaces von der Plattenoberfläche, und die Intensitätdes gemessenen Lichtes nimmt wieder ab. Die gemessene Lichtintensität ist nureine Funktion des Interfaceabstandes zur Plattenoberfläche. Wird der Lichtleiterab-stand zur Platte auf etwa 450 µm fest justiert, bleibt die gemessene Lichtstärke auchbei kleinen Änderungen des Plattenabstandes konstant. Die Festlegung des Leseab-standes über der DC-Platte ist damit die einzige Justierung, die benötigt wird [21].Bei der Benutzung des Doppelreiheninterfaces wird die Auftragung wesentlichschmaler abgebildet, als es bei der Verwendung der Einreihenanordnung der Fallist. Die Ortsauflösung des Einreiheninterfaces wurde zu 140 µm ermittelt, währendman mit dem Doppelreiheninterface eine Ortsauflösung von besser als 100 µmerreicht [21].

Ein weiterer Vorteil der Lichtleitertechnologie besteht in dem geringen Abstanddes Lesekopfes zur Platte, der ein Messen bei Tageslicht ohne Abdunklung erlaubt.Der Messvorgang kann damit visuell beobachtet werden, und der Platz über derDC-Platte ist für weitere Aufbauten zugänglich.


0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

200. 250. 300. 350. 400. 450. 500. 550. 600.

Wellenlänge (nm)

Coun

ts

Abb. 9.7 Abgebildet ist das Streulichtspektrum einer Deuterium- und einer Wolframlampe, auf-genommen von einer leeren HPTLC-Platte. Rot Deuteriumlampe, blau Wolframlampe

9.3.4 Spektrale Lichtverteilung auf der Platte

In der Diodenarray-DC wird die Platte mit polychromatischem Licht bestrahlt, alsomit Licht aller Wellenlängen eines ausgewählten Bereiches. Die spektrale Vertei-lung des eingestrahlten Lichtes ist in der Regel nicht identisch mit der spektralenVerteilung des von der Platte reflektierten Lichtes, da Licht auch vom Sorbensma-terial absorbiert wird. Die spektrale Verteilung der reflektierten Lichtintensität J()(der Rohdatensatz einer Messung) setzt sich zusammen aus der auf die DC-Plat-te eingestrahlten spektralen Verteilung des Lampenlichtes I0() minus der von derPlattenoberfläche absorbierten Lichtintensität Iabs().

J ./ D I0 ./ � Iabs ./ (9.3)

J() RemissionslichtverteilungI0() eingestrahlte IntensitätsverteilungIabs() absorbiertes Licht

Die spektrale Verteilung des reflektierten Lichtes verschiedener Lichtquellen voneiner unbenutzten HPTLC-Platte zeigt Abb. 9.7. Dargestellt sind die Spektren ei-ner Deuterium- und einer Wolframlampe. Das Spektrum der Deuteriumlampe zeigt,dass diese nur für Messungen im UV-Bereich zwischen 190 und 400 nm eingesetztwerden kann. Die Wolframlampe findet ihren Einsatz im sichbaren Bereich (vis-Be-reich) ab 400 nm. Für Fluoreszenzmessungen kann eine LED (engl. light emittingdiode) eingesetzt werden, die z. B. eine Emission bei 365 nm mit einer Signalbreitevon nur ˙10 nm zeigt [22, 23]. Der Vorteil der LED liegt nicht nur in ihrer extremhohen Lichtintensität, sondern insbesondere auch in der Konstanz der Lichtabstrah-lung. Das macht sie für Fluoreszenzmessungen so geeignet.


Die Qualität einer DC-Aufnahme wird durch das Signal-Rausch-Verhältnis derMessung gekennzeichnet. Dazu muss die Intensität des Remissionslichtes mit einerausreichenden Messauflösung gemessen werden. Für eine aussagekräftige Analytiksollten mindestens 12 bit Auflösung, für eine gute Analytik mindestens 14 bit Mess-wertauflösung zur Verfügung stehen. Für Diodenarray-Messungen an DC-Plattenbedeutet dies, dass der Detektor für eine 12-bit-Aufnahme in Reflexion mindestens4096 Counts an gemessener Lichtmenge benötigt.

Ein Diodenarray-Scanner detektiert Lichtintensitäten, die von einer DC-Plattereflektiert werden. Dies ist nur möglich, weil das Plattenmaterial Licht nicht nurabsorbiert, sondern auch streut. Im Streulicht ist die Information enthalten, wie vielLicht die Analyte auf der Platte absorbiert haben. Man misst den Anteil des absor-bierten Lichtes eines Analyten also nicht direkt, sondern geht den Umweg über dasStreulicht. Der Verlust an Lichtintensität im Vergleich zwischen dem Spektrum der„leeren“ Platte und dem Spektrum der Probe, ergibt den Grad der Lichtabsorptioneiner Probe.

9.3.5 Transformationsalgorithmen in der Diodenarray-DC

In Abb. 9.8 ist die spektrale Verteilung des Remissionslichts J0() einer leeren DC-Platte neben der Remissionslichtverteilung eines Plattenbereiches, der die SubstanzBenzo[a]pyren enthält, graphisch dargestellt. Die Lichtverteilung, gemessen vonder sauberen Plattenoberfläche, entspricht weitgehend dem Spektrum der Deuteri-umlampe, die für diese Messung benutzt wurde. Das Spektrum des Benzo[a]pyren-Peaks J() hat ein völlig anderes Aussehen als das Spektrum der leeren Platte. Umbeide Aufnahmen in einer Formel zu kombinieren, hat sich der Quotient aus beidenSpektren bewährt.

R ./ D J.Probe/ ./

J.Vergleich/ ./D J ./

J0 ./(9.4)

R() relatives RemissionsspektrumJ() Spektrum des ProbespotsJ0() Spektrum der Plattenreferenz

Die relativen Remissionen für verschiedene Trennstrecken werden aus denQuotienten der entsprechenden Remissionsspektren JProbe() und eines an einembestimmten Plattenort aufgenommenem Referenzspektrum J0() (dem Vergleichss-pektrum) berechnet. So werden lampenunabhängige Remissionswerte erhalten, beidenen das spezifische Absorptionsverhalten der Plattenoberfläche kompensiertwird.

Jede vermessene DC-Bahn liefert damit ihr eigenes Referenzspektrum selbst.Dieses Referenzspektrum kann am Anfang oder am Ende einer Bahn liegen, et-wa da, wo die Probe noch nicht aufgetragen wurde, oder da, wo die Entwicklungschon beendet ist. Das Referenzspektrum kann aber auch so gewählt werden, dasses mitten in der Bahn zwischen einzelnen Substanzflecken liegt.


0

1

2

3

4

200 400 600

0

2000

4000

6000

8000

10000

200 400 600

Wellenlängen (nm)

J0 JProbe

J0

JProbeR =

a

b

Abb. 9.8 Dargestellt ist das relative Remissionsspektrum eines Benzo[a]pyren-Spots, der 125 ngBenzo[a]pyren enthält (a). Zum Vergleich sind die reflektieren Lichtintensitäten der leerenPlatte und der Benzo[a]pyren-Zone dargestellt (b). Blauer Graph leere Platte, roter Graph Ben-zo[a]pyren-Zone

Um den Absorptionsgrad bestimmen zu können, werden Vergleichs- und Pro-bespektrum über den Quotienten miteinander zur relativen Remission verrechnet.In Abb. 9.8a ist das relative Remissionsspektrum zu sehen, das aus den beidenSpektren der Abb. 9.8b über (9.3) berechnet wurde. Aus diesem Remissionsspek-trum ist zu entnehmen, dass Benzo[a]pyren im Bereich von 200 bis 400 nm mehrLicht als die „leere“ Platte absorbiert, denn die relativen Remissionen sind kleinerals eins. Offensichtlich strahlt der Benzo[a]pyren-Fleck im spektralen Bereich zwi-schen 400 und 500 nm aber mehr Licht als die reine Plattenoberfläche ab, denn dierelativen Remissionswerte sind größer als eins. Bei der Absorption von Licht fälltder Messwert mit steigender Konzentration des Analyten im Probefleck. Je mehrAnalyt vorhanden ist, umso mehr Licht wird von ihm absorbiert und umso wenigerLicht wird gestreut und damit vom Detektor registriert. Zweckmäßiger ist allerdingsein Wert, der mit steigender Substanzmenge auf der Platte größer wird.


Es wird damit ein Umrechnungsalgorithmus gesucht, der fallende Lichtemissio-nen bei steigender Substanzmenge in einen steigenden (transformierten) Messwertumwandelt. Rein mathematisch gesehen, kann dies durch folgende drei Algorith-men erreicht werden [24].

DA./ D 1 � R./ (9.5)

A./ D 1

R./� 1 (9.6)

LB./ D ln�

1

R./

�D � ln R./ (9.7)

Die letzte Formel (9.7) entspricht mathematisch dem Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz. Werte kleiner als eins werden willkürlich auf null gesetzt. Die Form der re-sultierenden Spektren ist identisch mit denen aus der Kehrwertberechnung A() ausdem Ausdruck (9.6), die Rechenwerte sind es allerdings nicht. Aus theoretischenÜberlegungen heraus soll die Transformationsformel (9.6) im Weiteren als „Remis-sion“ bezeichnet werden [2, 24]. Zur praktischen Auswertung von DC-Platten kannsowohl Ausdruck (9.6) als auch (9.7) verwendet werden. Die Formel (9.5) hat nurtheoretische Bedeutung.

Die im Vergleich zur Referenz höhere Lichtintensität der Benzo[a]pyren-Probeim Bereich von 400 nm bis 500 nm wird von der starken Fluoreszenz des Ben-zo[a]pyrens verursacht. Wertet man die Remissionswerte nach der Fluoreszenzfor-mel (9.8) aus, bleiben alle relativen Remissionswerte positiv, die größer als einssind [2]. Ist keine Fluoreszenz vorhanden, wird das transformierte Signal null. Da-mit bietet der Ausdruck eine brauchbare Formel, um Fluoreszenzmessungen aus-werten zu können.

F./ D R./ � 1 (9.8)

Die Theorie von Kubelka und Munk beschreibt ein ortsunabhängiges (isotropes)Streuverhalten innerhalb der stationären Phase. Licht wird zu gleichen Teilen nachoben in Remissionsmessrichtung und nach unten, in Richtung der Einstrahlung,gestreut.

KM./ D .1 � R.//2

2R./D 1

2

�1

R./� 1

�C 1

2.R./ � 1/ D a

s(9.9)

R() relative Remissiona Absorptionskoeffizients Streukoeffizient

Die Formel nach Kubelka und Munk (9.9) liefert für fallende Lichtintensitätenebenfalls steigende transformierte Messwerte und ist das arithmetische Mittel ausdem Kehrwert-Ausdruck (9.6) und der Formel für die Fluoreszenzberechnung (9.8).

Wie sich das Spektrum der relativen Remission aus Abb. 9.8 durch die An-wendung der verschiedenen Transformationsformeln verändert, ist in Abb. 9.9 gra-phisch dargestellt. Man erkennt z. B. sofort die Richtigkeit des Ausdrucks (9.9).Das Spektrum in Abb. 9.9b ist der Mittelwert aus dem Spektrum in Abb. 9.9a


0

0,5

1

1,5

2

2,5

Wellenlängen (nm)

Arb

itrar

y un

its

200 300 400 500 600

a

b

c

Abb. 9.9 Abgebildet sind das Fluoreszenzspektrum F() (a), das Kubelka-Munk-SpektrumKM() (b) und das Absorptionsspektrum A() (c) von 125 ng Benzo[a]pyren

und dem Spektrum in Abb. 9.9c. Wird zur Auswertung einer DC-Bahn die Kehr-wert-Umrechnung gewählt (Spektrum in Abb. 9.9c), werden Lichtschwächungenim Analytfleck positiv dargestellt. Werden die Messwerte nach der Fluoreszenzfor-mel umgerechnet (Spektrum in Abb. 9.9a), erscheinen fluoreszierende Plattenberei-che als positive Signale.

Werden die relativen Remissionswerte der Bahnmessung entsprechend des Ku-belka-Munk-Algorithmus umgerechnet (Spektrum in Abb. 9.9b), ergeben sich so-wohl für Fluoreszenzsignale als auch für Absorptionen positive Werte. Ein Kontour-plot, der die Kubelka-Munk-tranformierten Messwerte darstellt, gibt damit einenumfassenden Überblick über eine Trennbahn.

9.3.6 2-D-Auswertungen

Das interessante an 2-D-Trennungen ist, dass die Trennzahl im Vergleich zu einereindimensionalen Trennung dramatisch gesteigert werden kann [25]. Eine idealeVerteilung der Analyte über die Platte wird erreicht, wenn in orthogonalen Modigetrennt werden kann. Das ist z. B. der Fall, wenn in einer Richtung unter Nor-malphasen- und in der anderen Richtung unter RP-Bedingungen gearbeitet wer-den kann. Gut geeignet dafür sind Cyanopropylplatten, bei denen sich orthogonaleTrennbedingungen leicht durch die Wahl des Fließmittels (viel oder kein Wasser)einrichten lässt [26].

Der Nachteil von 2-D-DC-Trennungen ist, dass sich die quantitative Auswer-tung der Platte schwierig gestaltet, denn die üblichen Monowellenlängen-Scannersind für 2-D-Auswertungen wenig geeignet [27]. Möglich ist es, die ganze Platte


Abb. 9.10 Abgebildet ist eine 2-D-HPTLC-Trennung von 12 Sulfonamiden auf Cyanopropyl-platte. Gemessen wurde in Remission bei 276 nm. Die Sulfonamide sind: 1 Sulfacarbamid,2 Sulfadiazin, 3 Sulfadimidin, 4 Sulfaguanidin, 5 Sulfamerazin, 6 Sulfamethoxazol, 7 Sulfame-thoxypyridazin, 8 Sulfanilamid, 9 Sulfapyridin, 10 Sulfachinoxalin, 11 Sulfasomidin, 12 Sulfa-thiazol

bahnweise abzuscannen und aus diesen Daten ein Bild der 2-D-Trennung zu gene-rieren [28, 29]. M. Prosek erreichte so eine Ortsauflösung von 0,2 mm × 8 mm [28].H. Yamamoto erzielte eine Ortsauflösung in beiden Richtungen von 0,2 mm. Dieskann mit einem Diodenarray-Scanner auch erreicht werden, wenn ein speziellesLichtleiterinterface benutzt wird. Dieses Interface besteht aus einem inneren Licht-leiter mit 200 µm Durchmesser, der von neun Lichtleitern mit einem Innendurch-messer von je 100 µm umgeben ist. Der innere Lichtleiter transportiert das vonder Platte reflektierte Licht zum Spektrometer. Die äußeren Lichtleiter dienen zurPlattenausleuchtung. Abbildung 9.10 zeigt die 2-D-Trennung von 12 Sulfonamidenauf einer Cyanopropylplatte [25]. In der ersten Richtung wurde mit dem Fließmit-tel MTBE/Methanol/CH2Cl2/Cyclohexan/NH3 (25 %ig) (48 + 2 + 2 + 1 + 1, V / V)unter Normalphasenbedingungen getrennt. In der zweiten Richtung wurde die Mi-schung Wasser/Acetonitril/Dioxan/Ethanol (8 + 2 + 1 + 1, V / V) verwendet. Dieseswasserreiche Gemisch trennt im RP-Modus.

Die Sulfonamide zeigen teilweise recht ähnliche Strukturen und können dahernicht alle aufgetrennt werden. Trotzdem ist eine Quantifizierung fast aller Sul-fonamide möglich, weil sie bei verschiedenen Wellenlängen unterschiedliches Ab-sorptionsverhalten zeigen. In Abb. 9.11 wird der chromatographisch nicht getrennteBereich bei verschiedenen Wellenlängen gezeigt.


Abb. 9.11 Dargestellt ist der chromatographisch nicht getrennte Bereich bei verschiedenen Wel-lenlängen. a–c In dem mittigen Dreieck sind fünf Sulfonamide nur unvollständig aufgetrennt. In dsind zwei Sulfonamide und in e ist ein Sulfonamid sichtbar. f zeigt eine Fluoreszenzaufnahme desBereiches. Nur das Sulfonamid Sulfapyridin zeigt eine nennenswerte Fluoreszenz

In Abb. 9.11 ist der chromatographisch nur unvollständig aufgetrennte Bereichbei verschiedenen Wellenlängen dargestellt. In dem mittigen Dreieck sind fünf Sul-fonamide nur unvollständig aufgetrennt, was in Abb. 9.11a–c zu erkennen ist. Bei341 nm (Abb. 9.11d) sind dann nur noch zwei und in der Aufnahme beim 389 nm(Abb. 9.11e) nur noch ein Sulfonamid zu sehen. Abbildung 9.11f gibt eine Fluores-zenzaufnahme des Bereiches bei 467 nm wieder. Nur das Sulfonamid Sulfapyridinzeigt eine nennenswerte Fluoreszenz.

Die Aufnahme der 2-D-Platte generiert eine große Anzahl an Messdaten. Die inAbb. 9.10 dargestellte Aufnahme zeigt einen Plattenbereich von 68,4 mm × 68,4 mm,der in 342 Reihen zu jeweils 342 Einzelaufnahmen aufgelöst wurde. Jede Aufnah-me wurde im Wellenlängenbereich von 190 bis 1000 nm gemessen. Mit heutigenDiodenarray-Scannern lässt sich diese Aufnahme in 50 Minuten realisieren, wennjedes Spektrum mit 25 ms gemessen wird.

9.4 Videodensitometrie

Die Dünnschichtchromatographie besticht durch ihre simple Handhabung, die ohnegroßen Geräteaufwand auskommt. Am Anfang der chromatographischen Geschich-te war die Papier- bzw. die Dünnschichtchromatographie als Methode konzipiert,die das Auge als Detektor benutzt. Es wurde im sichtbaren Bereich des Lichtes ge-messen, also zwischen 400 und 800 nm. Analyte, die in diesem Bereich kein Lichtabsorbierten, wurden durch mehr oder weniger spezifische Reaktionen in Farb-stoffe umgewandelt. Die große Verbreitung von CCD-Kameras (Charge-coupling-device-Kameras) und Flachbettscannern bietet heute eine preiswerte Möglichkeit,im Bereich des sichtbaren Lichtes Daten elektronisch aufzunehmen und weiter-

9.4 Videodensitometrie 303

zuverarbeiten [30]. Der Ausdruck Videodensitometrie hat sich für diese Technikdurchgesetzt.

Moderne TLC-Scanner können in Absorption, Fluoreszenz und auch in Trans-mission messen. Sie decken dabei den gesamten Bereich von 200 bis 1000 nm ab.Ihr Nachteil ist ein relativ hoher Preis, sowohl bei der Anschaffung als auch imBetrieb. Aus diesem Grund ist die moderne Bildverarbeitung so interessant [1]. His-torisch gesehen wurden ab 1985 vermehrt Videokameras zum Ablichten von DC-Platten benutzt, doch Videokameras können die Platte nur im sichtbaren Licht ver-messen [31, 32]. Außerdem sind Videokameras zur Aufnahme von Bildsequenzengedacht. Daher ist hier die Bildauflösung normiert und in der Regel niedrig. Bes-ser geeignet für DC-Auswertungen sind CCD-Kameras, die Standbilder mit hoherAuflösung aufnehmen können. Die äußerst empfindlichen CCD-Kameras könnenin der gekühlten Version Licht überdies sehr empfindlich detektieren und sind, zu-mindest für Fluoreszenz- [33] und Lumineszenzmessungen, eine Alternative zumMonowellenlängen-Scanner.

Die heute weit verbreiteten Flachbettscanner können ebenfalls zur Abbildungund Digitalisierung von DC-Platten herangezogen werden. Handelsübliche Flach-bettscanner arbeiten mit Weißlicht und sind nur für farbige DC-Spots einsetzbar [34,35]. Wird die Platte statt mit weißem Licht mit einer UV-Lampe bestrahlt, könnenauch Fluoreszenzsignale vermessen werden [36].

9.4.1 CCD-Kameras

Schon früh versuchte man, mit Flächen-CCDs Dünnschichtplatten und Elektro-phoresegele auszuwerten. Historisch gesehen geht die erste Publikation zu diesemThema auf das Jahr 1968 zurück. K. Hannig und H. Wirth beschrieben eine neueelektronische Anordnung, basierend auf dem Prinzip des flying spot. Der Licht-punkt einer Kathodenröhre durchleuchtet transparente Gele. Auf der Gelrückseitewird das Licht mittels einer Fernsehkamera (Vidicon-Gerät) gemessen [37]. DiesesMessprinzip wird auch heute noch zur Auswertung transparenter Elektrophorese-gele benutzt. Die Auswertung zweidimensionaler Elektrophoresegele mithilfe einesKodak-Silberfilms wurde 1979 beschrieben [38]. Im gleichen Jahr wurde die Quan-tifizierung eines zweidimensionalen, radioaktiven Gels publiziert. Ein Filmscannermit 8-bit-Auflösung wandelte das Silberbild, das durch Auflegen des radioaktivenGels hergestellt worden war, in digitale Daten um. Die Auftragung der eingesetztenRadioaktivität gegen die gemessenen Scannergraustufen ergab einen nichtlinearenZusammenhang [39]. Die Auswertung von mit Coomassie-Blau gefärbten Protei-nen durch eine Videokamera wurde 1980 publiziert. Erhalten wurde eine lineareKalibrierfunktion im Bereich von 1,5 bis 6 µg Protein pro Auftragung [40]. Im glei-chen Jahr wurde die Auswertung einer mit Ninhydrin gefärbten Platte beschrieben,auf der die Antibiotika Benzylpenicillin und Kanamycin B getrennt wurden. Digi-talisiert wurden die gefärbten Substanzzonen mit einer Optomax-Fernsehkamera.Eine Quantifizierung wurde durchgeführt, indem logarithmierte Konzentrationengegen gemessene Zonenflächen ins Verhältnis gesetzt wurden [41]. Im Jahre 1983


wurde beschrieben, wie mithilfe einer RCA-Schwarz-Weiß-Kamera gefärbte (ver-aschte) Cholesterol- und Ceramidbanden vermessen wurden. Die Kamera arbeitetemit einem 280-Reihen- und 192-Zeilenarray und einer 8-bit-Signalauflösung. Er-halten wurde eine gekrümmte Kalibrierkurve im Bereich von 0,2 µg bis 4 µg proAuftragung [42]. M. Prošek und R. E. Kaiser publizierten 1984 ein ähnliches Er-gebnis für Mutterkorn-Alkaloide in einem Arbeitsbereich von 50 bis 300 ng proHPTLC-Zone [32].

In diesen ersten Publikationen zum Thema Videodensitometrie wurde immer mitmaximal 8 bit gemessen. Es wurden immer gekrümmte Kalibrierkurven erhalten,oder der Linearitätsbereich lag unter einer Zehnerpotenz, auch wenn die Messdatenteilweise logarithmisch transformiert wurden. An diesem Befund hat sich bis heutenichts geändert. Nur die Anzahl der Publikationen zum Thema ist stark gestiegen.

Im Gegensatz zu Messungen in Transmission oder Remission erhält man beider Auswertung in Fluoreszenz lineare Kalibrierfunktionen. In einer Publikationvon 1985 wurde beschrieben, dass Tetramethylrhodamin-isothiocyanat einen linea-ren Signalverlauf im Bereich von 2,5 bis 125 ng pro chromatographischer Zonezeigt [43], während Remissionsmessungen mittels Videodensitometrie lineare Ka-librierfunktionen allenfalls in einem Bereich von weniger als einer Zehnerpotenzergeben [44].

Das große Plus videodensitometrischer Aufnahmesysteme ist mittlerweise ihregeringe Größe und ihr niedriger Preis [45]. Aufgrund ihrer geringen Größe sind sietransportabel und einfach zu bedienen [46]. Gute, linear arbeitende CCD-Kamerasmit ausreichender digitaler Auflösung, die relativ preiswert sind und die man auchfür wissenschaftliche Zwecke verwenden kann, findet man im Bereich der Astro-nomie. Im Grunde genommen kann aber jede Handy-Kamera zur Auswertung vonDünnschichtplatten verwendet werden, wenn eine Signalauflösung von 8 bit genügtund halbquantitative Ergebnisse ausreichen.

Der größte Vorteil von CCD-Kameras gegenüber DC-Scannern liegt aber in derMöglichkeit begründet, zweidimensionale Trennungen einfach und schnell digita-lisieren zu können [47, 48]. Ihr Nachteil ist, dass für eine Quantifizierung durchRemissions- und Fluoreszenzmessungen eine homogene Ausleuchtung der Platteessenziell ist. Hier scheitern alle Kamerasysteme, die nicht mit einer aufwändi-gen Beleuchtungseinrichtung ausgerüstet sind, und damit geht der Mobilitätsvorteilwieder verloren. Aber, CCD-Sensoren sind auch im UV-Bereich einsetzbar.

In Abb. 9.12 ist die 2-D-Trennung von 12 Sulfonamiden gezeigt. Gefärbt wurdendie Sulfonamide mit Fluorescamin und ausgewertet bei 366 nm mit einer CCD-Ka-mera (Abb. 9.12a) bzw. in eine Leuchtbakterien-Suspension getaucht und mit einerlichtempfindlichen CCD-Kamera aufgenommen (Abb. 9.12b). Hier sieht man sehrschön, dass bei der Fluoreszenzmessung die Sulfonamidflecken heller als die Um-gebung strahlen. Es kann mit der Formel (9.8) ausgewertet werden. Bei der Plattein Abb. 9.12b liegt der Fall umgekehrt. Hier leuchtet der Plattenhintergrund unddie Zonen sind dunkel. Es empfiehlt sich eine Auswertung mit Formel (9.6). Einefluoreszierende Zone leuchtet nur unter Bestrahlung. Die Fluoreszenzintensität istdabei eine Funktion der Intensität des Anregungslichts. Zur Quantifizierung mussdie ganze Platte gleichförmig ausgeleuchtet sein, was technisch schwer zu realisie-


a b

Abb. 9.12 Dargestellt ist eine 2-D-Trennung von 12 Sulfonamiden auf Cyanopropylphase. a DiePlatte wurde mit Fluorescamin gefärbt und in Fluoreszenz bei 366 nm vermessen, b zeigt dieAuswertung mittels Leuchtbakterien

ren ist. Die Platte in Abb. 9.12b kann problemlos ausgewertet werden, da hier nurdafür gesorgt werden muss, dass die Leuchtbakterien gleichmäßig auf der Platteverteilt werden.

9.4.2 Flachbettscanner

CCD-Sensoren werden nicht nur in Kameras benutzt. Die weite Verbreitung zu-erst von Handscannern und dann von Flachbettscannern hat dazu geführt, dassmit Zeilenarrays auch DC-Platten ausgewertet werden [49]. Flachbettscanner be-leuchten die Platte strichförmig von der Unterseite. Während der Messung bewegensich Array und Lampe gleichmäßig über die Platte und bestrahlen Substanzzonengleicher Laufhöhe mit gleicher Lichtintensität. Damit ist bei Flachbettscannern ei-ne gleichmäßige Ausleuchtung der Plattenoberfläche kein Problem. Die üblichen,preiswerten Flachbettscanner beleuchten mit drei Dioden, die rotes, grünes undblaues Licht über Lichtleiter strichförmig auf die Platte übertragen. Eine Erwei-terung um UV-Licht lässt sich mit einer UV-Lampe problemlos durchführen [36],denn die CCD-Messzeile ist durch eine Platte aus einfachem Fensterglas geschützt.So kann UV-Licht mit Wellenlängen kleiner als 380 nm nicht auf den Sensor gelan-gen und die Messung verfälschen. Das Fensterglas wirkt hier als Kantenfilter.

Die preiswerteste Methode, Dünnschichtplatten mittels eines Zeilen-CCDs zuscannen, ist die Benutzung eines Handscanners [34]. Ein frühes Beispiel ist inAbb. 9.13 zu sehen. Dargestellt ist die Trennung der farbigen Kobalt- und Zink-Dithizonate (mit reinem Dithizon in der Mitte) auf einer Kieselgelplatte, getrennt


a b

Abb. 9.13 Dargestellt ist die Trennung von Kobalt- und Zink-Dithizon (mit Dithizon in der Mitte)auf einer Kieselgelplatte, getrennt mit Toluol und mit einem Handscanner aufgenommen. Darge-stellt sind zwei Bahnen der Trennung auf Kieselgelplatte (a) und eine Bahn, die als 3-D-Plotgezeichnet wurde (b) [34]

mit Toluol. Der Handscanner erreichte eine Signalauflösung von maximal 8 bit undkostete 1994 weniger als 80 DM.

Der Nachteil von Videodensitometern ist, dass eine spektrale Information nurbedingt und auch nur im Bereich des sichtbaren Lichtes zur Verfügung steht. Ei-ne spektrale Substanzidentifizierung oder eine Peak-Reinheitsüberprüfung ist somitnicht möglich. Viele Analyte sind farblos und zeigen keine native Fluoreszenz.Zu messen sind sie video-densitometrisch nur nach einer – der Messung vorge-schalteten – Derivatisierung. Geschickt gewählt, ersetzt eine spezifische Deriva-tisierung die Peakreinheitskontrolle, da im Idealfall nur der Analyt gefärbt wird.Damit entfällt die Notwendigkeit einer spektralen Peakreinheitsüberprüfung. EinBeispiel ist in Abb. 9.14 gegeben [50]. Gezeigt ist die Trennung von Benzocain(4-Ethylaminobenzoat) und dessen Abbauprodukt 4-Aminobenzoesäure auf Silica-gel LiChrospere® mit dem Fließmittel MTBE/Cyclohexan (1 + 1, V / V). Nach derTrennung wird die Platte mit Ehrlich-Reagenz behandelt. Dazu löst man 500 mg4-Dimethyl-amino-benzaldehyd in 50 ml MTBE und taucht die trockene Platte für2 Sekunden. Es resultieren bei Raumtemperatur charakteristische gelbe Zonen aufweißem Untergrund [50].


Abb. 9.14 Dargestellt ist die Trennung von Benzocain (großes Signal) und 4-Aminobenzoesäure(Signal bei 55 mm Trennstrecke). Gemessen wurde Bahn 3 aus Abb. 9.15

Zur Messung wurde der Flachbettscanner 16 bit Plustek OpticSlim 500 (TaiwanHead Office Plustek Inc. 13 F-1 No. 3 (Building F) Yuan Qu Street, Taipei 115Taiwan R.O.C.) in Verbindung mit der Auswertesoftware „Presto! ImageFolio 4“benutzt. Ausgewertet wurde der Blaukanal. Das Signal der 4-Aminobenzoesäure inAbb. 9.14 umfasst nur 0,1 % der Stoffmenge des Benzocainpeaks. Trotzdem könnenbeide Peaks (inklusive Rauschen) abgebildet werden. Das ist nur mit einem 16-bit-System möglich.

Üblicherweise wird bei DC-Trennungen strichförmig aufgetragen. Bei einer7 mm breiten Auftragung und einer spatialen Auflösung auf der Platte sollte solchein Strich mit etwa 70 Datenpunkten digitalisiert werden. Während der chromato-graphischen Entwicklung diffundieren die Analytmoleküle dieser Auftragung nachallen Seiten. Der Strich sieht in seiner Intensitätsverteilung dann aus wie ein Pla-teau mit schräg abfallenden Seiten. Zur Auswertung sollten (siehe Abb. 9.15) nurdie intensivsten Signale benutzt werden; man misst also im Bereich des Plateaus.Wenn hier z. B. 36 Einzelbahnen ausgewertet und daraus die Mittelwerte ermitteltwerden, reduziert sich das Rauschen im Vergleich zur Einzelbahn um den Faktorp

36 D 6.Die Darstellung der Bahn 3 als Densitogramm in Abb. 9.15b erfolgte mit der

Software ImageTLC®. Es wurden jeweils 30 Dioden gemittelt. Die Position derDioden wird durch einen breiten Balken angezeigt (Abb. 9.15c). Eine Kalibrierungbeider Substanzen, ausgewertet mit Formel (9.6), zeigt Linearität im Bereich von 5bis 2500 ng pro Auftragung [50].


b c

a

Abb. 9.15 Dargestellt ist das Bild einer mit Ehrlichs Reagenz gefärbten Platte (a), auf derBenzocain und 4-Aminobenzoesäure getrennt wurden, sowie die entsprechende Auswertung desBlaukanals (b, c), dargestellt in Falschfarben. b Das Densitogramm der dritten Bahn wurde über30 Einzeldioden gemittelt


9.4.3 Tipps zum Kauf eines CCD-Gerätes

Auf was sollte man nun achten, wenn man eine CCD-Kamera oder einen Flachbetts-canner für die Auswertung von Dünnschichtplatten einsetzen will? VerschiedeneAspekte müssen bei videodensitometrischen Auswertungen beachtet werden.� CCD-Kameras und Flachbettscanner besitzen die Option, farbig oder im Grau-

stufenmodus messen zu können. Man sollte immer den Farbmodus zur Aus-wertung von DC-Platten wählen, da hier drei getrennte Aufnahmen registriertwerden [51]. Die Platte wird dabei der Reihe nach mit den Farben rot, grün undblau beleuchtet. Bei Flachbettscannern übernehmen das drei Leuchtdioden. BeiCCD-Kameras ohne eigenes Beleuchtungssystem wird mit verschiedenen Fil-tern gearbeitet. Bei beiden Systemen stehen für die Auswertung drei unabhängiggemessene spektrale Bereiche (rot von 600 bis 750 nm, grün von 520 bis 565 nmund blau von 425 bis 450 nm) zur Verfügung, die einzeln oder zusammen genutztwerden können [32].

� Zum zweiten benötigt die quantitative Analyse einen Detektor, der Lichtintensi-täten linear in Messsignale umwandelt. Eine doppelte Lichtintensität muss aucheinen Messwert doppelter Größe ergeben. Dies kann bei konstanter Beleuch-tung einfach durch eine Verdopplung der Messzeit überprüft werden, denn ver-doppelte Messzeiten müssen ein verdoppeltes Messsignal zeigen. Mathematischgesehen ist das digitale Messsignal (der Grauwert) direkt proportional zur Be-leuchtungsstärke [35].In Abb. 9.16 zeigt die obere Gerade die gemessenen Bits einer weißen Platte,aufgetragen gegen die Messzeit, bei Beleuchtung mit einer weißen LED. ZurRauschunterdrückung wurde die Kamera auf �5 °C abgekühlt. An der unte-ren Gerade kann abgelesen werden, dass sich das Signal-Rausch-Verhältnis mitsteigendem Bit-Wert verbessert. Zur Erzielung eines optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses sollte der dynamische Messbereich der Kamera immer so weit wiemöglich ausgeschöpft werden.

� Damit ist Punkt drei angesprochen. Gebraucht wird ein System mit freier Wahlder Messzeit. Dies ist für jede CCD-Kamera gegeben, nicht aber für Flachbetts-canner.Bei den meisten Systemen wird die Bestrahlungsstärke allerdings exponentielldurch den sogenannten Gamma-Faktor verfälscht.

Grauwert D .Bestrahlungsstärke/�

�.menschliches Auge/ D 0;4

Durch diese exponentielle Veränderung wird die Dynamik der Aufnahme ver-größert und der logarithmischen Sehkurve des Auges angeglichen. Für lineareBeziehungen muss � = 1 gewählt werden! Beim Kauf eines CCD-Systems sollteman daher darauf achten, dass der Gamma-Faktor frei gewählt werden kann.

� Die digitale Auflösung der meisten Kameras beträgt 8 bit. Das gemessene Si-gnal wird in 28 = 256 verschiedene digitale Zahlen (Graustufen) umgewandelt.Obwohl preiswerte 8-bit-Kameras und Flachbettscanner nur bedingt zur Aus-


Abb. 9.16 Dargestellt ist das Messsignal als Bit-Wert der CCD-Kamera ST-1603ME gegen dieMesszeit. Gleichzeitig ist das gemessene Signal-Rausch-Verhältnis gegen die Messzeit aufgetra-gen [35]. Blaue Vierecke Messsignale als Bit-Werte, rote Dreiecke Signal-Rausch-Verhältnis

wertung von DC-Platten geeignet sind, kann mit ihnen quantitativ gearbeitetwerden. Der Arbeitsbereich ist zwar nur in einem kleinen Ausschnitt linear, aberman kann auch über eine nichtlineare Funktion wie z. B. ein Polynom zweitenGrades auswerten.Für eine quantitativ arbeitende Methode mit einem Linearitätsbereich von übereiner Zehnerpotenz sollte mit mindesten 12 bit gearbeitet werden, also mit ei-ner digitalen Signalunterscheidung von 212 = 4096 Werten. CCD-Kameras miteiner Auflösung von 16 bit sind noch besser, denn sie lösen ein Messsignal in216 = 65 536 Graustufen auf. Die so erzeugten Daten sind nicht schlechter alsdie Scannerdaten, die bei einer einzelnen Wellenlänge gemessen werden. Wennmöglich, sollte immer eine Kamera oder ein Flachbettscanner benutzen werden,die/der in der Lage ist, Signale mit 16-bit-Auflösung zu digitalisieren. Hier wirdjetzt der fünfte Aspekt wichtig.

� So gut wie alle Dateiformate zum Kodieren von Bildern arbeiten intern mit 8 bit.Damit hilft es nichts, wenn das Gerät mit einer Auflösung von 16 bit messenkann, der Computer im Anschluss aber nur 8-bit-Bilder speichert. Hier ist nur dasTIF-Format (Tagged Image File Format) in der Lage, 16-bit-Daten zu speichern.Man sollte sich daher versichern, dass das gewünschte Gerät die Daten als 16-bit-TIFF speichern kann.

� Die optische Auflösung des Systems sollte ausreichend sein, ein Densitogrammmit etwa 0,1 mm aufzulösen, damit man pro Zone genügend Messpunkte füreine Auswertung zur Verfügung hat. Eine Trennstrecke von 10 cm sollte alsomit etwa 1000 Messpunkten aufgelöst werden. Bei CCD-Kameras benötigt mandazu ein Array mit mindestens 1000 Datenpunkten in einer Dimension. Für ei-ne 10 cm × 10 cm große Platte ist daher ein quadratisches Array mit mindestens106 Pixel und einer guten Linse notwendig.


Abb. 9.17 Dargestellt ist eine Trennung von 300 ng Butyl-, Propyl-, Ethyl- und Methylparaben,gefolgt von der Auftragung einer Shampooprobe (5 und 10 µL), mit Vibrio-fischeri-Bakterien ge-messen [54]

Bei Flachbettscannern kommt man ohne aufwändige Optik aus. Hier wird je-weils eine Röhre auf die einzelne Diode gesetzt, die nur Licht von der Platten-position zum Detektor durchlässt, die sich genau senkrecht über der Messdiodebefindet. Diese Röhren sind etwa 5 mm lang und erlauben je nach Scangeschwin-digkeit eine optische Plattenauflösungen von mehr als 1200 dpi (engl. dots perinch, also Punkte pro Zoll). Da ein Zoll 2,54 cm beträgt, sind für eine Auflösungvon 0,1 mm pro Messpunkt etwa 250 dpi ausreichend, die von einem Flachbetts-canner auf jeden Fall erreicht werden.

9.4.4 Lumineszenzmessungenmit CCD-Kameras

CCD-Sensoren sind sehr lichtempfindlich und zeigen einen größeren dynamischenBereich als Photomultiplier [52, 53]. Diese Systeme sind damit ideal für Lumi-neszenz-Aufnahmen, wie sie schon zum Teil in Kap. 8 vorgestellt wurden. Dergroße Vorteil der Lumineszenzmessungen ist, dass sie keine Plattenbeleuchtung be-nötigen. Die Analytzone strahlt entweder aus sich selbst heraus oder hemmt eineUmgebungslumineszenz (Abb. 9.17). In beiden Fällen ist eine gleichmäßige Plat-tenausleuchtung überflüssig.

9.4.4.1 BiolumineszenzmessungenEin typisches Beispiel einer Aufnahme mit Umgebungslumineszenz ist die inAbb. 9.17 abgebildet Biolumineszenzanalyse.

Biolumineszenzaufnahmen ermöglichen das Messen von Toxizitätsäquivalen-ten. Die Platte wird nach der Trennung (und einer sorgfältigen Trocknung) in ei-


ne Leuchtbakteriensuspension getaucht und mit einer sehr lichtempfindlichen Ka-mera vermessen (CCD Kamera ST-1603ME mit einem Kodak-CCD-Array KAF-1603ME, bestehend aus 1,56 Megapixel, Santa Barbara Instrument Group, Inc.,Santa Barbara, USA). Das Array besteht aus 1530 � 1020 Sensoren (Pixel) der Grö-ße 13,8 mm × 9,2 mm. Jedes Pixel hat die Größe von 9 �m × 9 �m. Die Kamera istso lichtempfindlich, dass innerhalb von 10 Minuten das Licht der Leuchtbakterienauf der Platte die Dioden sättigt, also einen Messwert nahe 216 zeigt. Parabene hem-men die Leuchtkraft der Bakterien und werden als schwarze Zonen abgebildet. Diegraphische Darstellung der Signalschwächung in Abhängigkeit von der aufgetrage-nen Menge ergibt eine lineare Kalibrierkurve über zwei Zehnerpotenzen [54].

9.4.4.2 ChemolumineszenzmessungenChemolumineszenz bietet eine weitere Möglichkeit, Substanzen zum Leuchten zubringen. Die Methode wird häufig in der Ultraspurenanalyse eingesetzt. Erstaunli-cherweise wird sie relativ wenig in der DC genutzt. In diesem Bereich wurden nurwenige Arbeiten publiziert [55], obwohl die Vorteile klar beschrieben sind.

Chemolumineszenz auf der DC-Platte kann leicht durch Oxidation von Bis(2,4-dinitrophenyl)oxalat (DNPO) oder Bis(2,4,6-trichlorophenyl)oxalat (TCPO) ausge-löst werden. Beide Substanzen werden durch H2O2 schnell oxidiert. Bei Anwe-senheit einer fluoreszierenden Verbindung kann (muss aber nicht) die Reaktions-enthalpie zur Fluoreszenzanregung genutzt werden. Dies geschieht bei den obengenannten Verbindungen durch die Bildung einer reaktiven Zwischenstufe, einemgespannten cyclischen Molekül, das seine Energie auf planare Analyte übertragenkann (Abb. 9.18) [55].

Chemolumineszenz auf der DC-Platte ist einfach durchzuführen. Eine Lösungvon 250 mg DNPO in 40 ml n-Butylacetat wird mit 0,5 ml H2O2 (35 %ig) versetztund für 20 min geschüttelt oder ins Ultraschallbad gestellt. Die Oberphase dieserLösung kann für den Zeitraum von drei Stunden als Tauchlösung verwendet wer-den. Trockene, entwickelte Platten werden für eine Sekunde getaucht, kurz so langegetrocknet, bis keine Reflexionen der Tauchlösung auf der Oberfläche mehr zu se-hen sind, und dann mit einer sauberen Glasplatte bedeckt. Die Platte wird für bis zu30 Minuten mit einer extrem lichtempfindlichen CCD-Kamera aufgenommen. DieChemolumineszenz von Benzo[a]pyren ist auf der Platte noch nach zwei Stundenzu sehen, wie Abb. 9.19 zeigt.

Auf folgenden DC-Platten gelingt die Reaktion: Merck (Darmstadt, Deutsch-land) RP-18 (1.05559 und 1.05560), RP-18 WF254 (1.13124), RP-8 (1.3725), RP-2 (1.13726) und von Machery/Nagel (Düren, Deutschland): RP-18 W (811075).Erstaunlicherweise gelingt die Reaktion auf Merck RP-18-Glasplatten ohne Fluo-reszenzindikator (1.05914) nicht.

Die Methode ist sehr empfindlich. Benzo[a]pyren wurde auf RP-18-Aluminium-folie (Merck) mit Aceton und Essigsäureethylester (7 + 3, V / V) in einer ungesättig-ten Trogkammer entwickelt. Nach 30 min Messzeit ist noch ein Signal von 100 pgBenzo[a]pyren nachweisbar. Es wird ein Linearitätsbereich von 50 bis 8000 pg er-reicht [55].


Abb. 9.18 Reaktionsschema der Oxidation von TCPO zur Anregung von Benzo[a]pyren [55]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 20 40 60 80 100 120

Minuten

Cou

nts

Abb. 9.19 Gemessene Chemolumineszenz (in Counts) in Abhängigkeit von der DNPO-Konzen-tration. Grün 100 mg, rot 150 mg, blau 375 mg/100 ml n-Butylacetat


Abb. 9.20 Formel von 1,4-Bis-(5-Phenyloxazol-2-yl)-Benzol (POPOP) und 2,5-Diphenyloxazol(PPO)

9.4.4.3 RadiolumineszenzmessungenEine Probezone kann nicht nur mit Licht angeregt werden. Auch radioaktive Strah-lung ist dazu in der Lage [56, 57]. DC-Platten wurden nach dieser Methode bis-her nur durch Silberfilme ausgewertet. Mit den neuen CCD-Kameras sollte dieMethode viel sensitiver arbeiten. Das Arbeiten mit radioaktiven Proben ist aussicherheitstechnischen Gründen sehr aufwändig. Labors, die mit radioaktiven Pro-ben arbeiten dürfen, benutzen spezielle Detektorsysteme und sind daher nicht aufeine Radiofluoreszenzbestimmung angewiesen. Das mag erklären, warum zurzeitauf diesem Gebiet keine Forschung stattfindet. Trotzdem ist die Methode sehr in-teressant, denn man kann mit einer lichtempfindlichen CCD-Kamera sehr einfachradioaktive Zonen auswerten.

Es können die Szintillationsmittel 1,4-Bis-(5-Phenyloxazol-2-yl)-Benzol (PO-POP, Abb. 9.20), Naphthalin und 2,5-Diphenyloxazol (PPO, Abb. 9.20) in den Lö-sungsmitteln Toluol, Xylol oder Cumol verwendet werden. Die radioaktive Strah-lung der Probe regt Lösungsmittelmoleküle an, die ihre Energie auf die Szintilla-tormoleküle Naphthalin und PPO direkt übertragen. PPO strahlt dabei Licht um360 nm und Napthalin um 330 nm ab. Das Szintillatormolekül POPOP wandelt die-se Emissionen in Licht mit Wellenlängen um 410 nm um, das von einer CCD-Kamera empfindlich detektiert werden kann. Empfohlen werden Mischungen aus5 g PPO (2,5-Diphenyloxazol) und 0,3 g Dimethyl-POPOP in 1 l Toluol oder 0,6 gPPO, 0,01 g POPOP und 10 g Naphthalin, gelöst in einem Gemisch aus 60 ml Toluolund 40 ml 2-Methoxyethanol [57, 58].

9.5 Infrarot- und Raman-Detektion in der DC 315

9.5 Infrarot- und Raman-Detektion in der DC

9.5.1 DC-Messungen durch diffuse Reflektions-Infrarotanalyse

Die mit Abstand wichtigste Messmethode in der DC ist die Absorptionsmessungim Bereich von 200 bis 800 nm. Im Jahre 1989 gelang es mit der DRIFT-Technik,diesen Messbereich über 800 nm hinaus auszudehnen [59]. DRIFT steht für diffusereflectance infrared Fourier transform und beschreibt DC-Messungen im mittlerenIR-Bereich zwischen 400 cm�1 und 3550 cm�1. Oberhalb von 3550 cm�1 und imBereich zwischen 1350 und 100 cm�1 können keine Messungen durchgeführt wer-den, da Kieselgel hier starke Eigensignale zeigt. Für DRIFT-Messungen wird einhandelsübliches Fourier-Transform-IR-Spektrometer über eine externe Anordnungvon Linsen, Spiegeln und einen externen Schmalbanddetektor so umgebaut, dasseine DC-Platte ortsgesteuert in Reflexion vermessen werden kann [60]. Der IR-Lichtstrahl wird dabei über die Platte bewegt. Die Wellenlängenabhängigkeit desreflektierten Lichtes wird mit einem Michelson-Interferometer gemessen. Als ge-eignet hat sich Plattenmaterial erwiesen, das aus 10-µm-Partikel enger Korngrößeund einer Schichtdicke von 200 µm auf Glas besteht. Als Sorbens wird ein Gemischaus Kieselgel 60 und Magnesiumwolframat im Verhältnis 1 : 1 benutzt. Die DRIFT-Technik ermöglicht die Aufnahme von IR-Spektren, die reicher strukturiert sind alsUV-vis-Spektren und damit mehr Information enthalten [59].

Der Nachteil der Methode liegt in den hohen Kosten und der schlechten Nach-weisgrenze, die im Vergleich zu UV-Spektren um etwa den Faktor 500 geringer ist.Diese Technik ist daher nicht für den Spurenbereich geeignet, sondern wird z. B.bei pharmazeutischen Untersuchungen eingesetzt [61]. K.-A. Kovar konnte zeigen,dass für Coffein eine lineare Kalibrierkurve für den Bereich von 0,5 bis 2 µg erhal-ten wird, wenn mit der Kubelka-Munk-Gleichung linearisiert wird [61].

Die Methode der Fourier-transform-Photoakustik-Spektroskopie, im EnglischenFourier transformed infrared photoacoustic spectroscopy (FTIR-PAS) genannt, isteine Alternative zu den üblicherweise verwendeten IR-Detektoren. Diese Methodewird so gut wie kaum eingesetzt und soll daher hier auch nicht besprochen wer-den [62].

9.5.2 DC-Analyse durch Nahinfrarot-FT-Raman-Spektrometrie

Die Raman-Spektrometrie ist eine Technik zum Studium von Molekülschwingun-gen und Molekülrotationen. Die Methode wurde im Jahre 1928 von C. V. Ramanentwickelt. Sie beruht auf der nichtelastischen Streuung von monochromatischemLicht an Materie. Zur Beobachtung wird üblicherweise ein Laser oder eine LED alsmonochromatische Lichtquelle benutzt. Der Raman-Effekt tritt auf, wenn das einge-strahlte Licht nicht nur gestreut wird, sondern im Molekül auch Schwingungen undRotationen anregt. Damit sind Raman-Messungen Streulicht- und keine Absorp-tionsmessungen. Durch die nichtelastische Wechselwirkung findet eine Energie-übertragung zwischen dem Anregungslicht bzw. dem Streulicht und dem Molekül


statt. Neben der intensiven Linie des Streulichts, der Rayleigh-Stahlung beobachtetman daher zwei Serien von Streulicht unterschiedlicher Frequenzen, die als Sto-kes-Linien und Anti-Stokes-Linien bezeichnet werden. Die Stokes-Linien entstehen,wenn das Anregungslicht einen Teil seiner Energie an das Molekül abgibt und dortSchwingungen und Rotationen auslöst. Dabei beobachtet man Streulichtsignale miterniedrigter Frequenz (� � �0) (Stokes-Emission). Das Streulicht der monochro-matischen Lichtquelle mit der Frequenz v wird in seiner Energie verstärkt (Anti-Stokes-Emission), wenn das Molekül Schwingungs- und Rotationsenergie auf dasStreulicht überträgt. Dieser Vorgang wird als eine Serie von Lichtstreuungen beierhöhten Frequenzen (� + �0) gemessen. Aus den Frequenzen der Linien lassensich somit die Schwingungs- und Rotationsenergien des Moleküls ermitteln. DieElektronenwolke der Bindungselektronen wird während der Rayleigh-Streuung de-formiert. Das Ausmaß der Deformation, die Änderung der Polarisation im Molekül,bestimmt die Intensität der Raman-Streuung. Leicht zu polarisierende Molekülezeigen starke Raman-Streuungen. Dies ist komplementär zur IR-Spektrometrie, wogerade nicht die leicht zu polarisierenden Bindungen, sondern polare Bindungendie stärksten Signale zeigen.

Technisch wird die Raman-Spektrometrie meist durchgeführt, indem die Probemit einem Nd-YAG-Laserstrahl bei 1064 nm bestrahlt wird. Man wählt Einstrahl-wellenlängen von über 800 nm, um Störungen der Messung durch Fluoreszenzlichtzu vermeiden [63]. Das Streulicht der bestrahlten Probe wird auf einen Mono-chromator geleitet und spektral zerlegt. Das Streulicht um die Frequenz des Laser-strahls wird herausgefiltert. Raman-Spektren sind etwa so fein strukturiert wie IR-Spektren [63, 64] und können zur Substanzidentifizierung verwendet werden. DieDetektionsgrenzen liegen im unteren µg-Bereich (> 2 µg pro Zone) [63]. Raman-Messungen zeigen einen relativ starken Untergrund, um den das Spektrum korri-giert werden muss [64].

9.5.3 Messung vonDC-Spektrenmittels Surface-Enhanced RamanScattering Spectrometry (SERS)

Eine Alternative zur FT-Raman-Methode ist die Surface-Enhanced Raman Scatte-ring Spectrometry (SERS) [65, 66]. Wird auf einer DC- bzw. HPTLC-Platte eineSuspension aus Silberkolloid aufgetragen, beobachtet man eine bemerkenswerteVerstärkung der Raman-Signale. Die Raman-Streustrahlung an Molekülen, die aufMetalloberflächen adsorbiert sind, wird um den Faktor von 105 bis 106 verstärkt.Zur Durchführung von SERS-Messungen wird die getrocknete DC-Platte in einekolloidale Silbersuspension getaucht. Die Silbersuspension wird aus einem Teil ei-ner 1 mM wässrigen AgNO3-Lösung hergestellt, zu der man tropfenweise drei Teileeiner wässrigen 2 mM Natriumborhydrid-Lösung gibt [66]. SERS-Spektren könnenin einem Bereich von 400 bis 1600 cm�1 registriert werden, wozu ein übliches Ra-man-Spektrometer ausreicht. Angeregt durch einen 632-nm-Laser gelang es, aufeiner HPTLC-Platte mit einer Messzeit von nur 3 Sekunden 50 pg an Dibenzofuranzu detektieren. Das gemessene Spektrum ist unter Abb. 9.21 abgebildet.

9.6 Massenspektrometrische Detektion in der DC 317

Abb. 9.21 SERS/HPTLC-Spektrum von Dibenzofuran (50 pg), gemessen auf einer HPTLC-Sili-cagel-60-Platte. Die Platte wurde mit einem Silberkolloid beschichtet. (Aus [66], mit freundlicherGenehmigung von © Akadémiai Kiadó)

9.6 Massenspektrometrische Detektion in der DC

Eine weitere wichtige DC-Kopplungsmethode, die in Zukunft sicherlich noch anBedeutung gewinnen wird, ist die Massenspektrometrie [67]. Die Massenspektro-metrie (MS) zeigt unter den Aspekten Schnelligkeit, Nachweisstärke und Selektivi-tät entscheidende Vorteile gegenüber spektrometrischen Detektionsverfahren. DieKombination aus Massenspektrometrie und DC erweitert den Rahmen der Planar-trennungen entscheidend, da alle DC-MS-Systeme Spektren bereitstellen, aus de-nen Strukturdaten der Analyte abgeleitet werden können.

Die direkte Kopplung von DC und MS wird seit Jahren erforscht [67–69]. Ver-schiedene Ansätze wurden entwickelt, die sich in der Art der Ionisation des Ana-lyten und dessen Freisetzung von der Plattenoberfläche unterscheiden. Wird zurDesorption und Ionisation der Analyte ein Gas- oder Flüssigkeitsstrom von Mole-külen verwendet, spricht man von DESI (engl. desorption electrospray ionisation),EASI (engl. easy ambient sonic spray ionisation mass spectrometry) und DeSSI(engl. desorption sonic spray ionisation). DeSSI bewirkt im Unterschied zu DESIdie Analyt-Ionisation ohne anliegende Spannung, benötigt aber zur Desorption einehohe Gasgeschwindigkeit. Wird ein Laser für die Desorption und Ionisation einge-setzt, werden zur Methodenbeschreibung die Akronyme LDI (engl. laser desorpti-on ionisation), MALDI-MS (engl. matrix-assisted laser desorption/ionisation massspectrometry) und AP-MALDI-MS (engl. atmospheric pressure matrix-assisted la-ser desorption/ionisation mass spectrometry) verwendet. Sind es dagegen Atome


oder Moleküle, die die Analyte aus der Plattenoberfläche förmlich herausschlagen,spricht man von FAB (engl. fast atom bombardment) oder SIMS (engl. secondaryion mass spectrometry). Methoden, die eine thermische Desorption mit anschlie-ßender Ionisation anwenden, sind unter den Kürzeln DART (engl. direct analysis inreal time), APCI-MS (engl. laser desorption/atmospheric pressure chemical ionisa-tion mass spectrometry) und APGD-MS (engl. atmospheric pressure glow dischargemass spectrometry) bekannt. Interessante Plattenbereiche können auch durch Flüs-sigkeiten extrahiert werden, die im Anschluss massenspektrometrisch untersuchtwerden. Bekannt sind die Methoden LMJ-SSP (engl. liquid microjunction surfacesampling probe) und SSSP (engl. sealing surface sampling probe). Während beiLMJ-SSP-Systemen ein Flüssigkeitsstrom den Analyten direkt aus der Oberflächeherauslöst, wird bei der SSSP zuerst der Plattenbereich von der Umgebung abge-dichtet und dann extrahiert. Im Folgenden werden solche Methoden vorgestellt, diekommerziell verfügbar sind.

9.6.1 Direkte Plattenextraktion (SSSP)

Der „ChromeXtraktor“ [70–72] der Fa. CAMAG ist ein universell anwendbares In-terface, um DC-Oberflächen als Analytquelle mit den in der HPLC weit verbreitetenMS-Systemen koppeln zu können. Dieser Extraktor besteht aus einem 4 mm × 2 mmgroßen Stempel, der über der Analytzone platziert wird. Mit einer HPLC-Pumpewird dann eine Extraktionsflüssigkeit durch den abgedichteten Bereich der statio-nären Phase gepumpt und die Zone extrahiert. Der Extrakt wird gefiltert und dannzur Ionisierungsquelle des MS-Systems transportiert (Abb. 9.22). Diese einfacheund robust arbeitende Technik ermöglicht eine Ortsauflösung auf der Platte von et-wa 2 mm. Die Nachweisgrenzen liegen im ng-Bereich, abhängig vom verwendetenMassenspektrometer [41]. Das Extraktionssystem kann auch verwendet werden, umvon einer Zone FTIR- und Raman-Spektren zu messen.

9.6.2 MALDI-Technik (MALDI-MS)

Um MALDI-MS-Spektren aufnehmen zu können, muss die Platte zuerst vorbereitetwerden [73–75]. Dazu wird sie in eine Lösung getaucht, in der z. B. 2,5-Dihydro-xybenzoesäure enthalten ist. Die Platte wird dabei mit einer Substanz überzogen,die in der Lage ist, die Laserstrahlung zu absorbieren und die absorbierte Energieauf den Analyten zu übertragen, damit dieser von der Plattenoberfläche abgelöstwerden kann. Nach dem Tauchen und Trocknen wird die Platte in ein Hochvaku-um gebracht und mit einem Laser gescannt, dessen Licht auf der Platte absorbiertwird und den Analyten in einen angeregten Zustand überführt. Dieser wird da-bei desorbiert und ionisiert und dann im MS-System vermessen. Das Ergebnissolch einer MALDI-TOF-Messung zeigt Abb. 9.23. Hier wurden Membranlipidedirekt von der Oberfläche einer HPTLC-Platte aus vermessen. Die Membran-phosphorlipide wurden mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol/Wasser


AuslassEinlass

Fritte

Schneidkante

HPTLC-Folie

Abb. 9.22 Das ChromeXtractor-Interface. (Mit freundlicher Genehmigung von G. Morlock undH. Luftmann)

Abb. 9.23 DC-MALDI-Chromatogramm einiger Phospholipide. A Klassische Primulin-Färbungder getrennten Lipide auf einer HPTLC-Platte, B HPTLC-MALDI Bildanalyse derselben Platte,mit Falschfarben dargestellt, C Kontourplot-Darstellung der Trennstrecke auf der y-Achse gegendas Masse-Ladungs-Verhältnis (m / z-Werte) auf der x-Achse. Farbige Kreise kennzeichnen dieSignale der verschiedenen Lipide in der HPTLC-MALDI-Darstellung. (Mit freundlicher Geneh-migung von Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland)

(2 + 1 + 1, V / V) extrahiert und in einer Horizontalkammer mit dem FließmittelChloroform/Ethanol/Wasser/Triethylamin (35 + 35 + 7 + 35, V / V) aufgetrennt [74,75]. Eine Lösung aus 100 mg/ml Dihydroxybenzoesäure in Acetonitril/Wasser(1 + 1, V / V) wurde als MALDI-Matrix zur Laserabsorption verwendet. Die Mas-senspektren wurden automatisch eingelesen, die Ortsauflösung auf der Platte warbesser als 200 µm [74].


9.6.3 Atmosphärendruck-Massenspektrometrie

Das allgemeine Ziel in der DC-MS ist nach einem Statement von G. van Berkel,die Massenmessung von der Notwendigkeit zu befreien, in einem Hochvakuum zuarbeiten [68]. Die Anzahl der Methoden, Massenspektren ohne Hochvakuum, alsounter Atmosphärendruck, zu generieren, ist in den letzten Jahren stark angestie-gen [69]. Einige Techniken sind kommerziell verfügbar, wie DART [76, 77], EASI-MS [78], APCI-MS [79] oder DESI (engl. desorption electro spray ionisation) [80–83]. All diese Methoden erlauben es, Massenspektren unter Atmosphärendruck di-rekt von einer DC-Platte zu messen. Wegen der niedrigeren Ortsauflösung könneneinzelne Zonen – ähnlich wie bei UV-vis-Aufnahmen – direkt auf der Platte un-tersucht werden. Ein Nachteil aller Methoden ist die schlechte Reproduzierbarkeitdes Desorptionsprozesses. Quantitative Analysen können nur mithilfe von internenStandards durchgeführt werden.

Eine neue Variante der APCI-MS-Methode, die auf dem Prinzip der thermischenDesorption basiert, wurde vor Kurzem unter dem Akronym DART vorgestellt [76].Es konnte gezeigt werden, dass diese Methode in der Lage ist, HPTLC-Trennungenzu vermessen [77]. Das DART-System benutzt einen elektrisch angeregten Helium-Gasstrom, der mit Wasser aus der Umgebungsluft protonierte Wassercluster bildet.Diese Cluster übertragen ihre Energie auf den Analyten und bilden dabei Mole-külkationen aus. Das System zeigt eine Ortsauflösung auf der Platte von besser als3 mm und eine Nachweisgrenze im unteren ng-Bereich [77].

Die ebenfalls relativ neue Methode EASI-MS besticht durch ihr einfach gebau-tes Ionisationsinterface. Die Desorption und Ionisation auf der HPTLC-Oberflächewerden durch elektrisch geladene kleine Tropfen einer Ultraschallquelle bewirkt.Gesprüht wird mit einem leicht sauren 1 : 1-Gemisch aus Wasser und Methanol,dem 0,01 % Ameisensäure beigemischt wird. Die Ortsauflösung auf der Platte be-trägt 330 µm [78].

Die DESI-Methode benötigt hohe Spannungen und benutzt zur VernebelungStickstoff, der mit Methanol pur oder in Kombination mit Ameisensäure versetztwird [81, 82]. In Abb. 9.24 ist die DESI-Auswertung einer 2-D-Trennung abgebil-det. Das eingesetzte DESI-System ist im Detail unter [82] beschrieben. Eine 7 bis13 cm lange Edelstahlkapillare (0,84 mm Innendurchmesser, 1,27 mm Außendurch-messer) stellt die Verbindung zwischen der bei 200 °C arbeitenden Vernebelungs-einheit und der Plattenoberfläche her. Die Edelstahlkapillare wird unter Hochspan-nung (4 kV) gehalten [81]. Die Kapillarspitze wird etwa 2–3 mm oberhalb der Plat-tenoberfläche mit einem Winkel von ~55° fixiert [81]. Abbildung 9.24 zeigt einenDESI-MS-Kontourplot einer zweidimensionalen HPTLC-Trennung eines Trypsin-Verdaus [81]. Die Gesamtmenge von ~20 µg Protein wurde auf eine HPTLC-Cellu-loseplatte jeweils im Abstand von 10 mm von jeder Seite auf der linken Platteneckeaufgetragen. Die Trennung wurde in einer Normalkammer durchgeführt, und zwarmit 2-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (45 + 30 + 9 + 36, V / V) in der ersten Ent-wicklung und 2-Butanol/Pyridin/wässriger NH3/Wasser (39 + 34 + 10 + 26, V / V)in der zweiten Entwicklung, nachdem die Platte um 90° gedreht worden war. DieTrennstrecke betrug 50 mm in beide Richtungen. Die Massenbestimmung auf der


Abb. 9.24 Cytochrom-c-Trypsin-Verdau, getrennt auf einer ProteoChrom®-HPTLC-Cellulose-schicht und gefärbt mit ProteoChrom® Color Peptide Stain (beides von Merck, Darmstadt). Obenist eine 1-D- und eine 2-D-Trennung zu sehen. a zeigt die 2-D-Darstellung der Peptid-Massen-verteilung, gemessen mit einem LCQ Deca Ion Trap Mass Spectrometer (Thermo Scientific, SanJose, CA, USA). Der markierte Bereich zeigt die Peptidverteilung, die mit einem LTQ FT UltraHybrid (Thermo Scientific) gemessen und unter b abgebildet wurde. (Aus [81], mit freundlicherGenehmigung ©WILEY-VCH)

getrockneten Platte wurde mit einer LCQ-Deca-Ionenfalle und einem LTQ-FT-Ultra-Hybrid-Massenspektrometer durchgeführt [81]. Die gerasterte Messung derProteinprobe wurde mit einer Auflösung von 700 µm in jeder Richtung durchge-führt. Ein Plattenbereich von 45 mm × 47 mm wurde innerhalb von ~8,5 h vermes-sen [81]. Der Gesamtbereich ist unter Abb. 9.24c in Falschfarben dargestellt.

DESI-MS erreicht eine Ortsauflösung auf der Platte von besser als 100 µm [81].Die gerasterte Messung einer 10 mm × 10 mm DC-Platte mit einer Messgeschwin-digkeit von 100 µm/s wurde 2006 publiziert [82]. Nach der MS-Messung wurde diePlatte mit dem proteinspezifischen Reagenz ProteoChrom Color Reagent (Merck,Darmstadt, Deutschland) besprüht. Nach 5 min Trockenzeit bei Raumtemperaturwurde die Platte mit Ninhydrin besprüht und dann für 1–2 min auf 120 °C erhitzt.Die Proteine erscheinen als verschiedenfarbige Zonen. [Farbige Peptidzonen er-hält man auch durch Färben mit Folin-Reagenz oder Ninhydrin-Collidin-Reagenz


(bestehend aus 100 mg Ninhydrin, gelöst in 70 ml Methanol und mit 2,9 ml 2,4,6-Trimethylpyridin sowie mit 21 ml Essigsäure gemischt), die beide nach dem Sprü-hen auf 90 °C erhitzt werden müssen.]

Alle Atmosphärendruck-Methoden sind in gewisser Weise komplementär zuMALDI-MS-Messungen, denn MALDI ist überwiegend für die Messung großerMoleküle (> 500 Dalton) geeignet, wie Peptide, Proteine und Phosphorlipide. DieStärken der Methoden DESI, EASI, APCI und DART liegen eher bei der Detektionkleinerer Moleküle (< 500 Dalton).

9.7 DC-Radiochromatographie (DC-RC)

Radioaktive Isotope werden seit Jahren benutzt, um biochemische Stoffwechselwe-ge aufzuklären. Die Dünnschichtchromatographie spielt dabei eine wichtige Rolle.Radionuklide werden in der biochemischen und pharmazeutischen Forschung alsradioaktiver Spurenfinder eingesetzt, weil sie in extrem niedrigen Konzentrationenmessbar sind. Übliche Isotope, mit denen Zielsubstanzen markiert werden, sind 3H,14C, 35S, 32P, 18F, 99Tc oder 125I. Die ˇ- oder �-Strahlung dieser Isotope wird mitspeziellen Scannern detektiert, wobei verschiedene Techniken wie Gaszählrohr, ˇ-Positronen-Geiger-Müller-Zähler, �-Szintillationszähler oder Phosphor-Bildscan-ner Verwendung finden. Die verwendeten DC-Geräte werden in [84] ausführlichbeschrieben. Die klassischen DC-RC-Messmethoden sind die Flüssigszintillationund die Autoradiographie.

Bei Flüssigszintillationsmessungen wird die DC-Zone nach der Trennung aus-gekratzt und mit einem Szintillatorcocktail versetzt. Dieser besteht aus einer Szin-tillatorsubstanz und einem Lösungsmittel. Die radioaktive Strahlung der markiertenProbe regt Lösungsmittelmoleküle an, die ihre Energie auf Szintillatormoleküleübertragen. Die Szintillatormoleküle geben anschließend ihre Anregungsenergie inForm von Licht ab, das mit einem Photomultiplier gemessen wird. Die Lichtinten-sität dieser Messungen ist direkt proportional zur Radioaktivität der ausgekratztenZone. Die Methode kann auch auf der Platte durchgeführt werden, was unter Ab-schn. 9.4.4.3 schon beschrieben wurde.

Bei autoradiographischen Bestimmungen wird die DC-Platte auf einen Röntgen-film gelegt, der so belichtet wird. Nach der Entwicklung des Silberfilms wird dasBild mit einem Densitometer ausgewertet, wobei Spaltscanner, digitale Kamerasoder Flachbettscanner eingesetzt werden können [85]. Moderne Geräte erlaubenheute Messungen ohne Röntgenfilme.

9.7.1 Direkte Radioaktivitätsmessungen auf der Platte

Zur direkten Messung aller ˇ- und �-emittierenden Isotope wird ein Zählgasdurch die Wechselwirkung mit der radioaktiven Zone ionisiert. Dies verursachteinen Elektronenstrom, der proportional zur Radioaktivität der DC-Zone fließt.3H-markierte Verbindungen können dabei nur mit einem geöffneten Schutzfenster

9.7 DC-Radiochromatographie (DC-RC) 323

detektiert werden, da die Tritiumstrahlung Glas nicht durchdringen kann. Das kannzu Schwierigkeiten im Routinebetrieb führen, weil der unter Hochspannung ste-hende Messdraht z. B. Staub anzieht. Messungen bei geschlossenem Schutzfenstervermeiden dies. Isotope mit starker Emission wie 14C-Atome können z. B. durcheine dünne Mylar-Folie gemessen werden, was den Routinebetrieb vereinfacht.Bei hochenergetischen ˇ-Emissionen wird als einfachste Messmethode ein Geiger-Müller-Zählrohr verwendet. Während der Vermessung einer DC-Bahn können dieaufgetrennten radioaktiv markierten Substanzen an Aktivität verlieren, da häufigmit Isotopen niedriger Halbwertszeiten gearbeitet wird. Daher wird das Geiger-Müller-Zählrohr relativ schnell über die Bahn bewegt. Alle Messsysteme zeigeneine hohe Messempfindlichkeit, Linearität über 4–5 Zehnerpotenzen und Ortsauf-lösungen von 0,5–3 mm [84]. Die Messzeit einer DC-Bahn liegt, in Abhängigkeitdes zu messenden Isotops, zwischen 1 bis 10 Minuten.

9.7.2 Phosphorbildplatten-Speicherung

Die Phosphorbild-Speicherung ist eine neue Methode zur ortsaufgelösten Messungvon Radioaktivitäten auf der DC-Platte. Nach der Trennung der mit Radionuk-liden markierten Analyte wird die DC-Platte in Kontakt mit einer sogenanntenPhosphorbildplatte (engl. phosphor imaging plate) gebracht. Die Phosphorbildplat-te ist ein wieder verwendbarer, mechanisch flexibler Speicher von Radioaktivi-tät. Die Bildplatte besteht aus mehreren Schichten. Auf einer Grundplatte ist einenur mm-Bruchteile dicke, strahlungsempfindliche Schicht (engl. photo-stimulablelayer) aufgetragen, die mit einer Schutzschicht überzogen ist. Die strahlungsemp-findliche Schicht besteht aus eingebetteten Phosphorkristallen, die durch radioak-tive Strahlung in einen metastabilen, energetisch angehobenen Zustand versetztwerden. Diese Platte wird der radioaktiven Strahlung über mehrere Stunden bis Ta-ge ausgesetzt. Dabei speichert die Bildplatte die radioaktive Strahlung, die von denmarkierten Analyten auf der DC-Platte ausgesandt wird, als latentes Bild. DiesesBild kann mit einem Laserstrahl ausgelesen werden [86]. Der Laserstrahl deak-tiviert den Anregungszustand der Phosphorkristalle und induziert eine Radiolumi-neszenz (engl. photo-stimulated luminescence, PSL), die mit einem Photomultiplierdetektiert werden kann. Eine Rasterung der Phosphorbildplatte erlaubt 2-D-Aus-wertungen mit sehr guter Ortsauflösung, hoher Empfindlichkeit und einem großenLinearitätsbereich [86].

Die hohe Empfindlichkeit der Phosphorbildtechnik kann gesteigert werden,wenn das latente Bild der Phosphorbildpatte mehrfach ausgelesen wird. Durch dieDeaktivierung beim Lesen wird das Folgesignal zwar schwächer, aber eine Auf-summierung aller Messsignale erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis gegenüber derersten Messung erheblich. Dies kann zur Verkürzung der Expositionszeit benutztwerden, oder zur Steigerung der Messempfindlichkeit [86]. In Abb. 9.25 ist einChromatogramm eines Rattenserums abgebildet, in dem 14C-markierte Substanzenaufgetrennt wurden. Die DC-Platte wurde mit einer dünnen Folie belegt, auf die dieBildplatte gelegt und belichtet wurde. Ein Bio-imaging Analyzer (Fuji Photo Film,


800

700

600

500

400

300Inte

nsity

(P

SL)

200

100

0

2nd scan 3rd scan

1st scan

Sum of 5 scans

4th scan5th scan

Distance (in mm)0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Abb. 9.25 Chromatogramm eines Rattenserums, das mit einer 14C-markierten Substanz ver-setzt wurde. Als Sorbens wurde Kieselgel 60 F254 mit dem Fließmittel Chloroform/n-Hex-an/Ethanol/25 %iger (w / v) wässriger NH3 (75 + 15 + 9 + 1, V / V) verwendet. Die radiolumino-graphische Messung wurde durchgeführt, nachdem die DC-Platte der Phosphorbildplatte für 65 hausgesetzt war. Gezeigt ist der Intensitätsverlust bei der Plattenauslesung während aufeinanderfolgender Messungen. (Aus [85], mit freundlicher Genehmigung © Akadémiai Kiadó)

Japan) wurde zur Messung des latenten Bildes benutzt. Die Auswertung wurde mitder BAS Reader Software, von Raytest Isotopenmessgeräte GmbH (Straubenhardt),durchgeführt. Die Auslesung der Platte als 50 µm große Bildpunkte mit einer Inten-sitätsauflösung von 8 bit/Pixel wurde unmittelbar nach der Exposition durchgeführt.Es wurde abgedunkelt gemessen, um den Signalverlust zu minimieren [85].

Phosphorbildauswertungen erlauben höhere Ortsauflösungen als digitale Auto-radiographie und sind daher ideal zur Auswertung von 2-D-Trennungen. Dies zeigteine Platte in Abb. 9.26, auf der N6-Methyladenosin (m6A) vermessen wurde [87].N6-Methyladenosin wurde in der mRNA verschiedenster Eukaryonten gefunden,wo es zwischen codierenden und nichtcodierenden Bereichen vorkommt. Zur Auf-trennung des Pflanzenmaterials mittels 2-D-DC wurde dieses mit 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase in Anwesenheit von 1 ml [�-32P]ATP (6000 Ci/mmol) versetzt.Probevolumina von 2 µl wurden auf 20 cm × 20 cm großen Celluloseplatten auf-

Literatur 325

Abb. 9.26 Zweidimensionale DC-Messung von m6A in Arabidopsis-poly(A)-RNA. a Zweidi-mensionale DC-Analyse in-vitro-transkribierter RNA, die m6A und normales Adenosin enthält, bschematisches Diagramm der Positionen verschiedener Nucleotidspots, c zweidimensionale DC-Analyse des gesamten RNA-Extraktes zwei Wochen alter Arabidopsis-Setzlinge, d zweidimen-sionale DC einer poly(A)-RNA aus zwei Wochen alten Arabidopsis-Setzlingen. Das m6A : A-Verhältnis ist 1,5 %. A Adenosin, C Cytosin, G Guanosin, U Uracil, mA, mC, mU, mG, m6Amethylierte Nucleotide. (Aus [87], mit freundlicher Genehmigung © American Society of PlantBiologists)

getragen und mit Isobutylsäure/0,5 M wässrigem NH3 (5 + 3, v / v) in der erstenund 2-Propanol/HCl/Wasser (70 + 15 + 15, V / V) in der zweiten Dimension ent-wickelt. Zur Identifizierung der Nucleotidzonen wurden synthetisch hergestelltemethylierte und nichtmethylierte RNAs verwendet. Die Quantifizierung der radio-aktiven Nucleotidzonen wurde mit einem Phosphorbildplattensystem (K-Screen;Kodak) und dem Bio-Rad Molecular Imager FX durchgeführt [87].

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10Diffuse Reflexion an DC- und HPTLC-Platten

H. Jork wertete DC-Platten Mitte der 60er-Jahre des letzten Jahrhunderts quanti-tativ durch Intensitätsmessung von reflektiertem Licht aus [1]. Er benutzte dazumonochromatisches Licht, das von der DC-Plattenoberfläche reflektiert wurde. Diemeisten der heute kommerziell vertriebenen DC- bzw. HPTLC-Scanner arbeitenimmer noch nach diesem Verfahren, das durch S. Ebel [2] automatisiert wurde. DasMessprinzip ist einfach. Wird eine DC- oder HPTLC-Platte mit Licht bestrahlt, wirddieses Licht zum Teil als diffuse (ungerichtete) Reflexion zurückgeworfen. In demzurückgeworfenen Licht steckt die Information über die Substanzverteilung auf derPlattenoberfläche.

10.1 Das Lambert’sche Kosinusgesetz

Den ersten Versuch, die diffuse Reflexion (Remission) an makroskopischen Ober-flächen theoretisch zu deuten, wurde von Pierre Bouguer 1760 unternommen. Bou-guer nahm an, dass die diffuse Reflexion durch reguläre Reflexionen an Kristall-flächen zustande kommt, die statistisch über alle Winkel verteilt sind. Aus derRichtung ˛ gesehen hat die Fläche F der HPTLC-Platte nur noch die scheinbareGröße dF = Fcos(˛). Die Lichtstärke dI der Richtung ˛ besitzt dann nur noch denKosinusanteil der eingestrahlten Lichtintensität I0. Angenähert gilt für das Remis-sionslicht dJ, das von der Platte abgestrahlt wird, das Lambert’sche Kosinusgesetz:

dJ .˛/ D I0dF cos .˛/ : (10.1)

I0 eingestrahlte LichtintensitätdF Flächenanteil˛ EinstrahlwinkeldJ Anteil des diffus reflektierten Lichtes

Die Winkelverteilung der diffusen Reflexion an DC- und HPTLC-Platten ge-horcht nicht streng dem Lambert’schen Kosinusgesetz, sondern entspricht eher ei-nem Seeliger’schen Strahler, da auch eine gerichtete Reflexion von der Plattenober-fläche möglich ist [3]. Gerichtete Reflexionen beobachtet man besonders bei kleinen


332 10 Diffuse Reflexion an DC- und HPTLC-Platten

Abb. 10.1 SchematischeDarstellung eines Lam-bert’schen Strahlers [3]

I0cosαJ

Jcosβ

α β

Einstrahlwinkeln. Eine HPTLC-Platte glänzt, wenn das Tageslicht in einem kleinenWinkel gerichtet reflektiert wird.

Die Winkelverteilungen des Lambert’schen Strahlers lassen erkennen, dass nurbei senkrechter Einstrahlung und senkrechter Messung die Lichtintensität der diffu-sen Reflexion den maximalen Wert zeigt (Abb. 10.1). Zur optimalen Lichtausbeutebei Reflexionsmessung sollte das Licht also stets senkrecht auf die zu vermessen-de Platte eingestrahlt und so gut wie möglich auch senkrecht wieder ausgelesenwerden.

Das von einer Lampe auf eine DC- oder HPTLC-Platte eingestrahlte Licht wirdvon den Partikeln der Plattenbelegung gestreut und in alle Richtungen abgelenkt.Geht man davon aus, dass die Strahlung isotrop ist, also nach allen Richtungengleiche Intensität besitzt, kann der Strahlungsstrom dJ innerhalb eines Volumenele-mentes mit dem Lambert’schen Kosinussatz berechnet werden.

d= DZ

dF dx D dx

�=2Z0

dJ

I0 cos .˛/ d˛d˛

Auf die Ebene bezogen, die von der diffusen Strahlung getroffen wird, gilt dieWinkelverteilung

dJ

d˛2I0 sin.˛/ cos .˛/

und damit:

d= D dx

�=2Z0

2 sin.˛/d˛ D 2dx: (10.2)

Beim Durchdringen einer differenziellen Schichtdicke dx legt das Licht diedurchschnittliche Weglänge 2dx zurück. Die Weglänge diffuser Strahlung ist da-mit doppelt so groß wie die Dicke der durchlaufenen Schicht [3]. Das erklärt diehohe Nachweisstärke moderner HPTLC-Platten, obwohl die Trennschicht, in dergemessen wird, nur eine Dicke von 0,1 bis 0,2 mm besitzt.

10.2 Theorie der diffusen Reflexion 333

Werden DC- oder HPTLC-Platten mithilfe eines Scanners quantitativ ausge-wertet, wird als Nachteil immer wieder der zu kleine lineare Arbeitsbereich derMethode genannt. In der Tat findet man allenfalls im Bereich einer Zehnerpotenz ei-ne direkte lineare Beziehung zwischen dem Remissionslicht und der aufgetragenenSubstanzmenge. Dies ist jedoch nicht eine Schwäche der Methode! Vielmehr wirdbei der Auswertung übersehen, dass das Remissionslicht prinzipiell nicht propor-tional zur aufgetragenen Substanzmenge abgestrahlt wird. Die Vorgänge auf und inder Trennschicht sind vielschichtig und kompliziert. Sogar eine Durchlichtmessungzeigt ja keine lineare Beziehung zwischen gelöster Substanzmenge und durchge-lassenem Licht! Vielmehr gilt das Lambert-Beer-Gesetz mit einer logarithmischenAbhängigkeit.

10.2 Theorie der diffusen Reflexion

Wird eine DC- oder HPTLC-Platte mit Licht einer Strahlungsquelle der IntensitätI0 bestrahlt, kann ein Teil des Lichtes von der Oberfläche gestreut und als Remissi-onslicht J zurückgeworfen werden [3–7].

Ein Teil des eingestrahlten Lichtes verlässt die Platte – wie in Abb. 10.2 gezeigt –als Transmissionslicht auf der Rückseite. Aus Abb. 10.2 wird aber auch deutlich,dass Licht innerhalb einer Platte trotz aller Reflexionen, falls es nicht absorbiertwird, einmal die Platte nach oben oder unter verlassen muss. Das nach oben, zurEinstrahlrichtung hin, gestreute Licht wird Remissionslicht genannt. Dieses Re-missionslicht (J) zeigt in etwa die gleiche spektrale Verteilung wie das Licht derStrahlungsquelle, obwohl das Sorbens dieses Licht teilweise absorbiert. Befindetsich auf der Plattenoberfläche ein Analyt, wird auch dieser das Licht der Strahlungs-quelle in irgendeiner Form absorbieren. Das zurückgeworfene Licht transportiertalso eine wellenlängenabhängige Information sowohl über das Plattenmaterial alsauch über die sich auf der Platte befindlichen Substanzen.

Licht wird an Partikeln innerhalb einer Schicht gestreut. Als Modell kann die-se Gesamtschicht in virtuelle Einzelschichten unterteilt werden. Die eingestrahlteLichtintensität I0 kann entweder absorbiert oder gestreut werden. Die Lichtintensi-tät J steht für das Licht, welches zur Plattenoberfläche hin gestreut wird. Die vonder Platte absorbierte Lichtmenge wird mit Iabs abgekürzt. Das Verhältnis der ab-sorbierten Lichtmenge zur eingestrahlten Lichtintensität wird per definitionem alsAbsorptionsfaktor a bezeichnet.

a � Iabs

I0

Der Absorptionskoeffizient a steht für den Anteil der Lichtabsorption, währendder entsprechend definierte Streukoeffizient s den Anteil des Streulichtes beschreibt.Zusammengefasst findet sich genau das in der folgenden Gleichung wieder.

I0 D J C Iabs D sI0 C aI0 D I0.s C a/ (10.3)


I0 J

T

(Remissionslicht)(eingestrahltes Licht)

I1.Schicht

3.Schicht

IT (Transmissionslicht)

R0=J/I0

(diffuse Rückstreuung)

2.Schicht

Abb. 10.2 Lichtreflexionen in einer DC-Schicht. I0 eingestrahltes Licht, J gestreut reflektiertesLicht

I0 eingestrahlte LichtintensitätJ diffuse Reflexion an der Plattenoberfläche (J = sI0)s Streukoeffizient (s = J / I0)a AbsorptionskoeffizientIabs absorbierte Lichtintensität

In (10.3) steht der Anteil aI0 der eingestrahlten Lichtintensität I0 für die Lichtab-sorption und der Anteil sI0 für das Streulicht. Wenn beide Koeffizienten (a und s)als konstant angesehen werden (bzw. wenn eine konstante Verteilung in der Trenn-schicht angenommen wird) und das ganze eingestrahlte Licht entweder absorbiertoder gestreut wird, gilt für die beiden Koeffizienten folgender Zusammenhang [8,9]:

s D .1 � a/ : (10.4)

Es ist bekannt, dass beide Koeffizienten, der Streukoeffizient und der Absorp-tionskoeffizient, voneinander abhängig sind [3, 7]. Nach der Theorie von Kubelkaund Munk ist nur der Quotient beider Koeffizienten konstant [5]. Dieses Verhaltenstreuender Partikel ist einfach zu verstehen. Kleine Partikel können Licht besserstreuen als große Partikel. Sie erscheinen daher heller als große Partikel, bei de-nen das Licht weniger reflektiert und damit mehr absorbiert wird. Die VerbindungCuSO4 � 5 H2O zum Beispiel ist in ihrer Kristallform blau und wird allein durchMörsern weiß. Das Mörsern reduziert den Partikeldurchmesser und damit auch dieAbsorptionsweglänge [3].

Die Kubelka-Munk-Theorie wird in der Planarchromatographie üblicherweisebenutzt, um Remissionsmessungen, die mit steigender Stoffmenge im Wert ab-nehmen, so umzuformen, dass ein Messwert mit steigender Stoffmenge auch in


seinem Wert steigt. Häufig wird jedoch behauptet, die Kubelka-Munk-Theorie be-schreibe die wahren Verhältnisse auf der Platte nicht richtig. Insbesondere wirddarauf verwiesen, dass die Voraussetzungen dieser Theorie – isotrope Einstrah-lung, unendliche Schichtdicke und gleichmäßige Streuung in der Schicht – bei DC-und HPTLC-Platten nicht zutreffen. Außerdem wird angeführt, dass die Beschrei-bung der Lichtstreuung durch zwei Vektoren die Sache zu vereinfacht darstellt.Vielleicht ist aber nur die mathematisch doch recht aufwändige Beschreibung derTheorie mithilfe zweier Differenzialgleichungen schuld an dem Unverständnis, dasder Kubelka-Munk-Theorie häufig entgegengebracht wird. Eventuell ist es für dasVerständnis der komplexen Prozesse, die in einer Trennschicht ablaufen, verständ-licher, wenn diese Schicht als ein Stapel vieler dünner Einzelschichten aufgefasstwird [10]. Moderne HPTLC-Schichten zeigen Schichtdicken von 100 bis 200 µm,bei einer mittleren Korngröße von 5 µm. Damit kann eine solche Schicht auch alsStapel beschrieben werden, der aus 20 bis 40 dünnen Einzelschichten aufgebaut ist.Lichtabsorption und Lichtstreuung laufen mutmaßlich eher in den oberen Schichteneines solchen Stapels ab.

Was passiert mit dem Licht in den verschiedenen Schichten? Ein Teil des ein-gestrahlten Lichtes wird sowohl von der Probe als auch von der Schicht selbstabsorbiert. Der Absorptionskoeffizient a vereinigt diese beiden Absorptionsprozes-se und beschreibt mit aI0 den Anteil des absorbierten Lichtes. Das nicht absorbierteLicht wird in der Schicht gestreut, und dieses gestreute Licht wird von der Platteno-berfläche als J1, entgegen der Einstrahlrichtung, abgegeben.

J1 D I0 � Iabs D I0 � aI0 D I0 .1 � a/ (10.5)

Bei isotroper Lichtstreuung wird aus einer Einzelschicht heraus mit gleicher In-tensität nach oben und nach unten gestreut. Die gleiche Lichtintensität, die als J1

die oberste Schicht der Platte (nach oben) verlässt, bestrahlt nach unten die zwei-te virtuelle Plattenschicht. Von diesem Licht wird der Anteil aJ1 absorbiert, undder Anteil J1(1 � a) gestreut. Der verbleibende Lichtanteil Jsec der zweiten Schichtberechnet sich damit zu:

Jsec D J1 .1 � a/ D I0.1 � a/2 : (10.6)

Die Hälfte dieses Lichtes wird als J2 in Richtung der Plattenoberfläche gestreutund beleuchtet damit die erste virtuelle Plattenschicht von unten. Die andere Hälftedieses Streulichtes beleuchtet als I2 die dritte virtuelle Schicht von oben.

Die Lichtintensität in der ersten virtuellen Schicht setzt sich damit zusammenaus der Hälfte des nicht absorbierten Einstrahllichtes [I0(1 � a) / 2] und der Hälftedes nicht absorbierten Lichtes in der zweiten Schicht [J2(1 � a) / 2]. Die Summebeider Lichtintensitäten wird zur Hälfte als J1 in Richtung der Plattenoberflächeabgestrahlt und beleuchtet mit der anderen Hälfte die zweite virtuelle Schicht alsI2(J2 = I2) von oben. Zusammengefasst geschrieben folgt:

J1 D 1

2.1 � a/ I0 C 1

2.1 � a/ J2 D .1 � a/

2I0 C .1 � a/3

23I0 :


I0

pI0

p0q1I0

p2I0

pqI0

pq2I0

p2qI0

p2qI0

2p2q2I0

2p2q3I0

2p3q2I0

p3I0

5p3q4I0

2p3qI0

p3qI0

3p3q2I0

3p4qI0

5p3q3I0

5p4q2I0

5p4q3I0

p4I0

J

p4qI0

4p4q2I0

9p4q3I0

1.

2.

3.

4.

5. Schicht4p5qI0

Abb. 10.3 Schematische Darstellung der Wechselwirkung des einfallenden Lichtes (I0) mit fünfvirtuellen Trennschichten. Der Anteil q von I0 wird in Richtung der Plattenoberfläche gestreut undder Anteil p wird in Richtung der Einstrahlung gestreut. Der Ausdruck für die ersten fünf Glie-der der Gesamtreflexion ergibt sich damit zu: J = qI0 + pq2I0 + 2p2q3I0 + 5p3q4I0 + 14p4q5I0 + . . .Mit p = q (bei isotroper Strahlung) wird der Ausdruck für die ersten fünf Glieder zu:J = qI0 + q3I0 + 2q5I0 + 5q7I0 + 14q9I0 + . . .

Die von Kubelka und Munk vertretene Ansicht, innerhalb einer Schicht wirdisotrop gestreut, muss dabei nicht unbedingt zutreffen. Wird Licht an Partikelnmit einem Durchmesser gestreut, der größer als die Wellenlänge des eingestrahltenLichtes ist, erfolgt die Streuung unsymmetrisch. Je größer der Quotient aus Partikel-durchmesser und Einstrahlwellenlänge ist, desto weniger Licht wird in Richtung derEinstrahlung rückgestreut. Der größere Anteil wird in Richtung der Lichteinstrah-lung gestreut [1]. Liegt keine isotrope Streuung vor, werden die Nachbarschichtenüber und unter einer virtuellen Schicht von dieser mit unterschiedlicher Intensitätbeleuchtet. Um diesen Sachverhalt mathematisch beschreiben zu können, wird hierder Rückstreufaktor k eingeführt. Der Rückstreufaktor k soll den Anteil Streulichtbeschreiben, der in Richtung der Plattenoberfläche gestreut wird. Logischerwei-se beschreibt dann der Anteil (1 � k) den Teil des Streulichtes, der in Richtungdes Plattenbodens gestreut wird, also in Richtung der Lampen-Einstrahlung. InAbb. 10.3 ist die Wechselwirkung des Einstrahllichtes (I0) mit den ersten fünf virtu-ellen Schichten einer Trennschicht schematisch dargestellt. Zur besseren Übersichtwird der nicht absorbierte Streulichtanteil, der zur Plattenoberfläche abgegebenwird, mit q = k(1 � a) abgekürzt. Der Anteil des Streulichtes, der zum Plattenbo-den gerichtet ist, wird als p = (1 � k)(1 � a) geschrieben.


Für die von der Platte nach oben hin abgestrahlte Lichtintensität (die Streu-lichtintensität J1) ergibt sich zusammengefasst folgender Ausdruck:

J1

I0

D 20q C 1

1 � 221p1q2 C 1 � 3

1 � 2 � 322p2q3 C 1 � 3 � 5

1 � 2 � 3 � 423p3q4

C 1 � 3 � 5 � 7

1 � 2 � 3 � 4 � 524p4q5 C 1 � 3 � 5 � 7 � 9

1 � 2 � 3 � 4 � 5 � 625p5q6 C : : : C :

Der Remissionswert R0, definiert als Quotient aus J1 und I0, konvergiert gegeneinen Ausdruck, der nur noch die Faktoren a und k enthält.

R0 D J1

I0

D q C pq2 C 2p2q3 C 5p3q4 C 14p4q5 C 42p5q6

C 132p6q7 C 429p7q8 C : : :

D1X

nD0

Cnq.pq/n D 1

2 .1 � a/ .1 � k/

�1 �

q1 � 4k.1 � a/2 .1 � k/

�

(10.7)Die Brüche in (10.7), zusammen mit den Potenzen zur Basis 2, ergeben die Vor-

faktoren 1, 2, 5, 14, 42, 132, 429 usw., die als Catalan numbers (Cn) bekannt sind.Die Catalan-Zahlen treten bei einer Anzahl von Problemen zur Kombinatorik in Er-scheinung. Die Catalan-Reihe wurde zum ersten Mal von Leonhard Euler (1707–1783) im 18. Jahrhundert beschrieben. Benannt ist sie nach dem belgischen Mathe-matiker Eugène Charles Catalan (1814–1894). Die n. Catalan-Zahl kann für n 0folgendermaßen berechnet werden [11, 12]:

Cn D .2n/Š

.n C 1/ŠnŠ:

Das Endergebnis in (10.7) ist nicht direkt einsichtig. Es gilt aber die BeziehungR0 D pR0

2 C q , die wie folgt bewiesen werden kann [11, 12]:

pR02 C q D q C p

1XnD0

Cnq.pq/n

!2

D

q C p�

q C pq2 C 2p2q3 C : : : �

q C pq2 C 2p2q3 C : : : � D

q C pq2 C p�pq2q C qpq2

C p�q2p2q3 C pq2pq2 C 2p2q3q

C : : : D

q C pq2 C 2p2q3 C 5p3q4 C : : : D1X

nD0

Cnq.pq/n :


Diese Gleichung kann nach R0 aufgelöst werden

R02 � R0

pC q

pD 0

�R0 � 1

2p

�2

D 1

4p2� q

p

R0 D 1

2pCs

1

4p2� q

pD 1

2p� 1

2p

s1 � 4p2q

pD 1

2p

�1 �p

1 � 4pq�

und ergibt so den Endausdruck in der Beziehung (10.7). Wird dieser Ausdruck nachder Ziffer 1 aufgelöst, erhält man in einer Reihe von Schritten

1 � 4pq D .1 � 2pR0/2 D 1 � 4pR0 C 4p2R02

� pq D �pR0 C p2R02

� q D �R0 C pR02 D R0 .pR0 � 1/

die unten stehende Gleichung. Aus den Definitionen von p und q folgt der Ausdruck(p + q) = (1 � a), der sich zu p + q + a = 1 umschreiben und einsetzen lässt.

pR0 C q

R0

D 1 D a C p C q

Nach a aufgelöstq

R0

� q C pR0 � p D a

q

�1

R0

� 1

�C p .R0 � 1/ D a

ergibt sich mit den Definitionen von p und q die erweiterte Kubelka-Munk-Glei-chung [12].

KM.R0; k 0; k 1/ D k

�1

R0

� 1

�C .1 � k/ .R0 � 1/ D a

.1 � a/(10.8)

R0 Remission (R0 = J / I0)k Rückstreufaktor (k 0 und k 1)a Absorptionskoeffizient

Interessant an (10.8) ist, dass die Messwerte (R0 = J / I0) in keiner linearen Be-ziehung zum Absorptionskoeffizient a stehen, sondern zum Quotienten aus a und s,wie aus (10.4) zu entnehmen ist. Dieses Ergebnis ist die Kernaussage der Kubelka-Munk-Gleichung [5].

Gleichung 10.8 zerfällt in zwei additiv miteinander verbundene Teile. Die Um-formung zu (10.9) zeigt einen vorderen Teil, der die Rückstreuung beschreibt (also k


enthält) und einen hinteren Teil, der unabhängig vom Rückstreufaktor ist, aber trotz-dem Remissionslicht beschreibt. Dieser Teil des Ausdrucks beschreibt die Fluores-zenzstrahlung.

KM D k

�1

R0

� R0

�C .R0 � 1/ D a

.1 � a/(10.9)

Die Ausdrücke (10.8) bzw. (10.9) werden im Weiteren zur Auswertung von DC-Scans benutzt. Sie sind streng genommen nicht ganz korrekt abgeleitet, da alleScanner gerichtetes Licht zur Einstrahlung auf die Platte verwenden und eben keinStreulicht. Allerdings wird aus dem gerichteten Licht nach wenigen Reflexionenan den Sorbenspartikeln eine mehr oder weniger isotrope Streulicht-Strahlung [4].Auch wenn ein Scanner kein Streulicht zur Beleuchtung der Platte verwendet, kanndies in erster Näherung angenommen werden.

10.2.1 Der Spezialfall der Kehrwertgleichung

Bei der Vermessung einer DC- oder HPTLC-Bahn wandert die Platte mit konstanterGeschwindigkeit unter dem Lichtleiterinterface durch. Dabei nimmt der Detektoreine Reihe von Spektren auf. Ein Kontourplot vereint alle Einzelspektren einer DC-Bahn in einem Bild. Die folgenden Kontourplots (Abb. 10.4, 10.5 und 10.6) zei-gen das Ergebnis einer Trennung von 125 ng Benzo[a]pyren über eine Strecke von45 mm. Die Probe (1 µl) wurde strichförmig auf eine Rp-18-HPTLC-Platte (Merck)aufgetragen und mit dem Laufmittel Methanol/Aceton (8 + 3, V / V) aufgetrennt.Pro Bahn wurden 450 Spektren gemessen.

Die gemessenen Rohdaten können mit (10.8) in transformierte Kubelka-Munk-Werte umgerechnet werden. Die erlaubten Werte des Rückstreufaktors k liegen imBereich zwischen 0 und 1. Der Extremfall k = 1 beschreibt eine Situation, in derkein Licht aus der ersten virtuellen Schicht in die zweite virtuelle Schicht von obenstrahlt. Mit k = 1 folgt aus (10.8) die Remissionsformel:

RR./ D�

1

R0

� 1

�D a

.1 � a/: (10.10)

Diese Gleichung erlaubt folgende Deutung. Das ganze Licht, mit dem die Plattebestrahlt wird, wird als I0a in der ersten virtuellen Schicht absorbiert oder mit demAnteil J1 = J = I0(1 � a) von der Platte nach oben gestreut. Daraus folgt die Glei-chung R0 = (1 � a), die mit (10.10) identisch ist. Damit beschreibt der Ausdruck(10.10) einen Zustand auf der DC-Platte, bei dem jedes Molekül die Möglichkeithat, beliebig viel Licht zu absorbieren. Wie viel Licht das ist, legt der Absorptions-koeffizient fest. Damit gilt Ausdruck (10.10) nur für Zonen geringer Analytkonzen-tration, in denen Analytmoleküle Licht absorbieren könnten und nie durch andereMoleküle „abgeschattet“ werden. Dementsprechend zeigt diese Formel bei höhererAnalytstoffmenge in einer Zone Abweichungen von der Linearität.


Abb. 10.4 Abgebildet ist der Kontourplot eines Benzo[a]pyren-Flecks, nach der Remissionsfor-mel Gl. (10.10) berechnet

In Abb. 10.4 ist der Kontourplot eines Benzo[a]pyren-Spots, berechnet nach(10.10), abgebildet. Farbig gezeichnet sind die positiven Rechenwerte von (10.8).Sie repräsentieren die Plattenbereiche, auf denen Licht absorbiert wird [9, 12–14].Zur Trennung wurde eine Platte mir Fluoreszenzindikator benutzt. Die Abschat-tung dieses Indikators durch den Analyten erscheint in Abb. 10.4 als Absorption imBereich von 480 bis 560 nm.

10.2.2 Der Spezialfall der Fluoreszenzformel

Den zweiten Extremfall des Ausdrucks (10.8) bzw. (10.9) erhält man für den Wertk = 0. Es folgt die Fluoreszenzformel, bei der im Kontourplot nur die Fluoreszenze-mission als positive Werte erscheint [12, 13]:

FL./ D .R0 � 1/: (10.11)

Für k = 0 wird ein Fall beschrieben, bei dem kein Licht mehr in Richtung derPlattenoberfläche gestreut wird. Dies tritt ein für den Fall, dass a gegen eins und sgegen null geht. Das einfallende Licht wird nur absorbiert und nicht gestreut. DerAusdruck a/(1 � a) geht dann gegen unendlich, erlaubt also keine physikalischeAussage mehr. Wird trotzdem Licht über der Platte gemessen, kann es sich nur imFluoreszenzlicht handeln.


Abb. 10.5 Dargestellt ist der Kontourplot einer Benzo[a]pyren-Trennung, nach der Fluoreszenz-formel (10.11) berechnet

Die Rohdaten der in Abb. 10.4 gezeigten Trennung wurden unter Verwendungder Fluoreszenzformel (10.11) ausgewertet und als Abb. 10.5 dargestellt. Im Kon-tourplot erscheinen als positive Werte nur Fluoreszenzsignale. Benzo[a]pyren zeigtdrei starke Fluoreszenzsignale oberhalb von 400 nm. Fluoreszierende Verbindun-gen sind relativ selten und können auf diese Art sicher identifiziert und meist auchproblemlos quantifiziert werden.

10.2.3 Der Spezialfall der Fluoreszenzformel

Die Kubelka-Munk-Theorie basiert auf der Annahme einer isotropen Streuung in-nerhalb der Trennschicht. Der Rückstreufaktor wird bei dieser Annahme zu k = 1 / 2.

KM./ D 1

2

�1

R0

� 1

�C 1

2.R0 � 1/ D .1 � R0/2

2R0

D a

.1 � a/D a

s(10.12)

Werden die relativen Remissionswerte der Bahnmessung entsprechend des Ku-belka-Munk-Algorithmus umgerechnet (10.12), ergibt sich der in Abb. 10.6 darge-stellte Kontourplot. Die resultierende Auswertung ist die Summe aus dem Remissi-ons- und dem Fluoreszenzplot. Die Berechnung mittels der Kubelka-Munk-Formelgibt damit einen umfassenden Überblick über eine Trennbahn, denn es werden Ab-sorptionen ebenso wie Fluoreszenzen als positive Signale angezeigt [12, 13].


Abb. 10.6 Abgebildet ist der Kontourplot eines Benzo[a]pyren-Fleckes, nach der Kubelka-Munk-Formel Gl. (10.12) berechnet

Mit der Kubelka-Munk-Formel wird berücksichtigt, dass Licht gestreut werdenkann und damit für eine Absorption an der Probe nicht (mehr) zur Verfügung steht.Die Formel liefert lineare Abhängigkeiten bei hohen Konzentrationen einer Pro-be, da hier berücksichtigt wird, dass die Probemoleküle weitgehend „abgeschattet“vorliegen. Dementsprechend zeigt die Kubelka-Munk-Formel bei niedrigen Stoff-mengen Abweichungen von der Linearität.

Während bei der Fluoreszenzformel kein Pseudo-Absorptionssignal des abge-schatteten Fluoreszenzindikators zu sehen ist, erscheint es in Abb. 10.6 erneut, dahier neben den Fluoreszenzwerten auch Absorptionswerte dargestellt werden.

10.3 Masseabhängige Remission

Gleichung 10.8 beschreibt eine lineare Abhängigkeit zwischen Messwerten unddem Absorptionskoeffizienten. Dabei wird angenommen, dass dieser in der Sor-bensschicht einen konstanten Wert besitzt. Es wird auch vorausgesetzt, dass dieAnalytkonzentration in der Schicht konstant ist. Beide Annahmen sind sicherlichnicht richtig. Ganz im Gegenteil, die örtliche Analytkonzentration innerhalb derTrennzone hängt von ihrem Abstand zur Oberfläche ab und besitzt eine unbekannteVerteilung. Nehmen wir einmal an, die gesamte Analytmenge befindet sich in derersten virtuellen Schicht und absorbiert die halbe einstrahlende Lichtintensität. Dieandere Hälfte des eingestrahlten Lichtes wird zu gleichen Teilen von der Schicht

10.3 Masseabhängige Remission 343

Richtung Plattenoberfläche und zur zweite Schicht hin abgestrahlt. Dann wird einRemissionswert oberhalb der Schicht von R1 = 0,25 gemessen. In einem zweitenBeispiel soll der Analyt vollständig in der zweiten Schicht lokalisiert sein. In die-sem Fall wird von der ersten Schicht die Hälfte des Lichtes zur Plattenoberflächehin abgestrahlt, was einen Remissionswert von R1 = 0,5 ergibt. Der nicht abgestrahl-te Teil des Lichtes bestrahlt die zweite Schicht von oben. Davon wird die Hälfteabsorbiert und der Rest zu gleichen Teilen zur dritten und zur ersten Schicht re-flektiert. In der ersten Schicht wird das von unten rückgestreute Licht aber nur zurHälfte von der Plattenoberfläche abgestrahlt. Es wird damit die Gesamtmenge anLicht von R1 = 0,5 + 1 / 16 gemessen, ein Wert, der sich vom dem im ersten Beispielunterscheidet. Das Ergebnis zeigt, in welchem Ausmaß ein Messwert durch dieAnalytverteilung in der Sorbensschicht beeinflusst wird. Das Ergebnis lässt vermu-ten, dass die Kenntnis der Verteilung des Analyten in der Sorbensschicht essenziellfür eine erfolgreiche Quantifizierung sein sollte. Leider ist uns die Verteilung derAnalytmenge in der Sorbensschicht unbekannt. Da wir zur Berechnung eines End-ergebnisses aber immer Probe und Standard miteinander vergleichen, müssen wirnur Sorge tragen, dass sich deren Verteilung in der Schicht nicht unterscheidet.Dann, und nur dann, können wir erfolgreich quantifizieren, ohne die Analytvertei-lung in der Sorbensschicht zu kennen. Das erklärt auch, warum gerade die Trock-nung der Platte als analytische Handlung so wichtig ist, denn beim Trocknen wirddie chromatographische Analytverteilung im Sorbens massiv geändert.

Das Phänomen der Lichtabsorption auf einer DC-Platte kann auch beschriebenwerden, ohne auf die Vorgänge innerhalb der Sorbensschicht einzugehen. Es wirdeinfach akzeptiert, dass Licht durch das Sorbens und eventuell durch einen sichim Sorbens befindlichen Analyten absorbiert wird. Der Gesamtabsorptionsfaktor abeschreibt einen Absorptionsfaktor für den Untergrund (au) und einem Absorpti-onsfaktor für die Analytsubstanz (as). Der Substanzabsorptionsfaktor as wird vonder Art und Menge des sich auf der Trennplatte befindlichen Analyten bestimmt,während der Untergrundabsorptionsfaktor au die Absorption der „leeren“ Plattebeschreibt, also nur von der Art des Beschichtungsmaterials abhängt. Bei einerhomogenen Verteilung des Analyten im Sorbens wirken Substanzabsorption undPlattenabsorption gleichzeitig.

Die Intensität der Lichtemission J, die von der Plattenoberfläche in Richtung De-tektor abgegeben wird, setzt sich aus der eingestrahlten Lichtintensität der LampeI0 minus der Lichtabsorption der Probe (Iabs,s) und minus der Lichtabsorption desPlattenuntergrunds (Iabs,u) zusammen. Zusammengefasst geschrieben folgt:

J D I0 � .Iabs;s C Iabs;u/ : (10.13)

Wenn beide Absorptionsvorgänge gleichzeitig ablaufen, „sieht“ der Untergrundnur die Lichtintensität I0 minus des vom Analyten absorbierten Lichtes. Der Unter-grundabsorptionsfaktor wird wie folgt definiert:

au � Iabs,u

I0 � Iabs,s:


Für den Substanzabsorptionsfaktor gilt entsprechend:

as � Iabs,s

I0 � Iabs,u:

Setzt man diese Gleichungen in (10.13) ein und löst nach Iabs,s bzw. Iabs,u auf,erhält man Ausdrücke, die nur von as und au abhängen. Für den Substanzabsorpti-onsfaktor Iabs,s ergibt sich:

Iabs,s D fI0 � b.I0 � Iabs,s/aucgas

Iabs,s D I0as � bI0au � Iabs,saucas

D I0.as � auas/ C Iabs,sasau

Iabs,s

I0

D as � asau

1 � asau:

Ein analoges Ergebnis erhält man für die Untergrundabsorption:

Iabs,u

I0

D au � asau

1 � asau:

Der Gesamtabsorptionsfaktor a lässt sich aus der Summe der beiden Einzelab-sorptionen berechnen.

a D Iabs,s

I0

C Iabs,u

I0

D as C au � 2asau

1 � asau(10.14)

Es gilt nun zu überprüfen, ob der berechnete Gesamtabsorptionsfaktor eine Pro-portionalität zur Masse m des Analyten zeigt. Dazu wird der Ausdruck für a aus(10.14) in den Ausdruck a / (1 � a) von (10.8) oder (10.9) eingesetzt. Man erhält:

a

1 � aD as C au � 2asau

1 � as � au C asau:

Bei dem Faktor für die Substanzabsorption as ist noch dessen Massenabhän-gigkeit durch das Einführen eines spezifischen Substanzabsorptionsfaktors am zuberücksichtigen. Bei m Masseneinheiten wird der Anteil mam an Licht absorbiert.

Iabs,s � mamI0

Der nicht absorbierte Lichtanteil verlässt als Remissionslicht die Platte oder wirdals Iabs,u vom Plattenuntergrund absorbiert.

Iabs,u D .1 � m/amI0 :

Damit wird der Substanzabsorptionsfaktor zu

as � Iabs,s

I0 � Iabs,uD mam

1 � am.1 � m/

10.3 Masseabhängige Remission 345

und ergibt in den Ausdruck a / (1 � a) eingesetzt:

a

1 � aD as.1 � 2au/ C au

.1 � as/.1 � au/D mam.1 � 2au/ C au Œ1 � am.1 � m/�

Œ1 � am.1 � m/ � mam� .1 � au/:

Durch Umformen zeigt dieser Ausdruck einen linearen Zusammenhang zwi-schen dem Quotienten a / (1 � a) und den aufgetragenen Analytmassen. Als Ach-senabschnitt ergibt sich ein Ausdruck, der nur vom Untergrundabsorptionsfaktor au

abhängt.a

1 � aD mam.1 � au/ C au.1 � am/

.1 � am/.1 � au/a

1 � aD m

am

.1 � am/C au

.1 � au/

(10.15)

Damit ist nachgewiesen, dass die nach (10.8) oder (10.9) transformierten Remis-sionssignale [über den Quotienten a / (1 � a)] eine lineare Abhängigkeit zur Sub-stanzmasse m des Analyten zeigen [8, 9]. Dies gilt für alle Wellenlängen () derMessung, auch wenn aus Platzgründen die Wellenlängenabhängigkeit bei den Grö-ßen R, I und J nicht ausgeschrieben wurde.

Nicht berücksichtigt bei der obigen Ableitung ist, dass Licht an den Rändern derPlatte und an der Plattenrückseite austritt und damit dem Streulicht innerhalb derPlatte verloren geht. Um dies zu berücksichtigen, wird als Referenz nicht die ur-sprüngliche Lichtintensität I0 der Lampe benutzt, sondern das reflektierte Licht J0

der „leeren“ Trennplatte. Man rechnet also so, als ob die Plattenbeschichtung keinLicht absorbiert. So wird Iabs,u = 0, und damit muss auch au = 0 werden, da ja I0 undIabs,s positive Werte besitzen. Das solchermaßen korrigierte Remissionssignal (R)zeigt, in (10.16) transformiert, eine direkte Abhängigkeit zur aufgetragenen Sub-stanzmasse m.

k

�1

R� R

�C .R � 1/ D m

am

.1 � am/(10.16)

R korrigierte Remission [R () = J() / J0()]k Rückstreufaktor (k 0 und k 1)m Analytmasseam Analyt-Absorptionsfaktor

Die Kalibrierkurve solchermaßen ausgewerteter Signale ist in einem großenKonzentrationsbereich linear, stellt also eine Gerade dar, die auch durch den Ur-sprung verläuft. Damit kann die geschickte Wahl des Referenzspektrums J0()auch eine störende Untergrundabsorption eliminieren. Die Wahl des Referenzspek-trums wird damit zum Schlüssel einer erfolgreichen Bahnauswertung. Bei der Wahldes Referenzspektrums sollte allerdings nie der Bereich einer Signalzone gewähltwerden, denn sonst erscheint die Basislinie im Negativen, und die Signale sind zumTeil verschwunden.

Zur Bestätigung der Theorie wurden verschiedene Coffeinmengen auf Kieselgelaufgetrennt, mit einem Diodenarray-Scanner gemessen und mit (10.16) ausgewertet[12]. Die erhaltenen Kalibrierkurven wurden in Abb. 10.7 in einem Bereich von 1


a

0

1

2

3

4

0 250 500 750 1000ng Caffeine

0 250 500 750 1000ng Caffeine

0 250 500 750 1000ng Caffeine

0 2500 5000 7500 10000ng Caffeine

KM

(0.

5) n

on-s

pher

ical

par

ticle

sb

0

2

4

6

8

10

12

14

16

KM

(0.

9) n

on-s

pher

ical

par

ticle

s

c

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

KM

(0.

68)

norm

al p

artic

les

d

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

KM

(0.

68)

non-

sper

ical

par

ticle

s

Abb. 10.7 Kalibrierkurven für Coffein nach einer Trennung auf Kieselgel 60 mit dem Fließmittel2-Propanol/Cyclohexan/25 %iger (w / v) wässriger NH3 (7 + 2 + 1, V / V). a Rohdaten, mit der er-weiterten Kubelka-Munk-Gleichung (10.16) und k = 0,5 ausgewertet, b Rohdaten mit k = 0,9, c, dRohdaten, ausgewertet k = 0,68

bis 1000 ng und 1 bis 10 000 ng dargestellt. Alle Kurven gehen durch den Ursprung,weil als Referenz das Remissionslicht der leeren Platte verwendet wurde. EinigeUnterschiede im Linearitätsverhalten zeigen sich, abhängig von den k-Werten. Miteinem Rückstreufaktor von k = 0,9 ergibt sich eine durchhängende Kurve [15]. Mitder Auswertung eines k-Faktors von k = 0,5 erhält man eine gekrümmte Kurve. Nur

10.4 Vereinfachte Formeln 347

ein Wert in der Mitte dieser beiden Faktoren, bei k = 0,68, zeigt Linearität über vierZehnerpotenzen.

10.4 Vereinfachte Formeln

Die k-Werte der meisten HPTLC-Platten bewegen sich im Bereich zwischen k = 0,6und k = 1,0. Für beliebige k-Werte kann (10.15) folgendermaßen angenähert werden[15, 16]:

k.1 � R/1k

R� m

am

.1 � am/: (10.17)

Die so berechneten Werte unterscheiden sich kaum von den richtigen Werten der

(10.16). Für k = 0,667 kann der Ausdruck 2.1�R/3=2

3Rverwendet werden. Ähnliche

Formeln sind unter [16, 17] zu finden.

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[15] Treiber LR (1974) Standardization of the direct spectrophotometric quantitative analysis ofchromatograms. IV. A comparative study on the most common mathematical treatments of thin-layer densitometric problems. J Chromatogr 100:123–135

[16] Loyalka SK, Riggs CA (1995) Inverse problem in diffuse reflectance spectroscopy: Accuracyof the Kubelka-Munk equation. Appl Spectro 49:1107–1110

[17] Dahm DJ, Dahm KD (2007) Interpreting diffuse reflectance and transmittance. NIR publica-tions, Chichester

11Fluoreszenz in der DC- und HPTLC-Schicht

Die Messung von Fluoreszenzlicht in der DC ist eine empfindliche Methode zurQuantifizierung fluoreszierender Substanzen [1–9]. Beim Bestrahlen solcher Ver-bindungen wird die Energie des absorbierten Lichtes durch Überführen eines Elek-trons in ein antibindendes Niveau gespeichert. Fällt das energetisch angehobeneElektron in den Grundzustand zurück, kann die entsprechende Energiedifferenz alsLicht abgestrahlt werden. Vorraussetzung dafür ist, das für die Verbindung keinschnellerer Weg existiert, die aufgenommene Energie strahlungslos wieder abzuge-ben.

11.1 Theorie der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz

Fluoreszenz und Phosphoreszenz beobachtet man bei höheren Wellenlängen als derdes Anregungslichts. Im Prinzip sollte jede Verbindung, die Licht absorbieren kann,auch wieder Licht als Fluoreszenz abgeben können. Es gibt aber nur relativ weni-ge Substanzen, die eine Fluoreszenz zeigen, denn die meisten Verbindungen gebenihre Anregungsenergie in Form von Wärme an die Umgebung ab. Zu einer Fluo-reszenz führen in der Regel nur n ! �*- oder � ! �*-Elektronenübergänge.Die Übergänge aus einem nichtbindenden Niveau auf ein angeregtes �*-Orbital(n ! �*-Übergang) haben dabei eine längere Lebensdauer als die reinen �-Orbi-talübergänge. Wegen ihrer längeren Lebensdauer finden angeregte Elektronen ausn ! �*-Übergängen eher einen Weg zu einer strahlungslosen Deaktivierung alsElektronen aus � ! �*-Anregungen. Bei Polyaromaten oder Verbindungen oh-ne freie Elektronenpaare findet man daher eher fluoreszierende Vertreter als beisolchen Aromaten, deren Substituenten nichtbindende Elektronenpaare wie Ether-oder Carbonylgruppen besitzen. Die Substanzen Biphenyl und Stilben fluoreszie-ren z. B., weil sie ausgeprägte �-Elektronensysteme besitzen. Im Diphenylketonentspricht der niedrigste angeregte Zustand einem n ! �*-Übergang. Die Sub-stanz fluoresziert nicht. Werden z. B. Carbonylverbindungen mit Phenylhydrazinumgesetzt, bilden sich fluoreszierende Hydrazone. Die analoge Reaktion mit Dini-trophenylhydrazin liefert wegen der nichtbindenden Elektronen der Nitrogruppen


350 11 Fluoreszenz in der DC- und HPTLC-Schicht

keine fluoreszierenden Derivate. Die enzymatische Abspaltung einer Acetylgrup-pe oder die säure- oder basenkatalysierte Hydrolyse unter Bildung fluoreszierenderGrundkörper, ist ein Grundprinzip der postchromatographischen Derivatisierungen.

Gibt ein angeregtes Molekül seine aufgenommene Energie als Licht ab, werdenzwei Deaktivierungswege unterschieden. Läuft die Lichtemission sehr schnell ab(< 10�8 s), nennt man diese Lichtabgabe Fluoreszenz. Braucht der Vorgang etwaslänger (> 10�3 s), nennt man ihn Phosphoreszenz. Bei der Fluoreszenz wird Licht –fast immer nach Stabilisierung auf dem Singulett-Term des niedrigsten angeregtenSchwingungsniveaus – direkt abgestrahlt.

In der Regel zeigt das Absorptionsspektrum eine spiegelbildliche Struktur desentsprechenden Fluoreszenzspektrums. Dies ist in Abb. 11.1 am Beispiel desAbsorptions- und Emissionsspektrums von Benzo[a]pyren dargestellt. Die �-Elektronen aus dem Benzo[a]pyren-Grundzustand werden in die verschiedenenSchwingungsniveaus des angeregten Zustands angehoben. Das entsprechendeTermschema dieses Vorgangs ist in Abb. 11.1c, über den dargestellten Absorp-tions- (Abb. 11.1a) und Emissionsspektren (Abb. 11.1b), abgebildet. Die einzelnenBanden des Benzo[a]pyren-Spektrums entsprechen den verschiedenen Elektronen-übergängen aus dem Grundzustand in die unterschiedlichen Schwingungsniveausdes angeregten Zustands. Nach der Anregung relaxieren die Moleküle sehr schnellund strahlungslos unter Wärmeabgabe in den Schwingungsgrundzustand desniedrigsten angeregten Niveaus. Wegen dieses Energieverlustes ist ein Fluoreszenz-spektrum im Vergleich zum Absorptionsspektrum immer zu höheren Wellenlängen(niedrigeren Energien hin) verschoben. Man nennt diese Energiedifferenz die Sto-kes-Verschiebung, benannt nach Sir Georg Gabriel Stokes (1819–1903), der dieseEnergiedifferenz schon 1858 als Stokes’sches Gesetz beschrieb. Das Gesetz besagt,dass die Wellenlänge des Anregungslichtes immer kleiner ist als die Wellenlängedes Emissionslichtes. Berechnet wird die Stokes-Verschiebung aus der Differenzder intensivsten Absorptions- und Emissionsbande. Nach einiger Zeit (< 10�8 s)fallen die angeregten Elektronen energetisch auf die verschiedenen Energieniveausder Schwingungszustände des nichtangeregten Grundzustandes zurück. Damit istklar, warum Absorptions- und Emissionsspektren Spiegelbildcharakter haben. Beider Energieabgabe werden die Schwingungszustände in umgekehrter Reihenfolgeder Anregung besetzt [9].

Während einer Fluoreszenzemission ändert sich der Spin der beteiligten Elek-tronen nicht. Man spricht daher von einem Singulett-Übergang. Liegt Phospho-reszenz vor, befindet sich das angeregte Elektron in einem Spinzustand, der imVergleich zum Grundniveau einen entgegengesetzten Spin besitzt. Man nennt solchein Niveau auch einen „Triplett-Term“. Bei der Stabilisierung auf das niedrigsteangeregte Schwingungsniveau hat das angeregte Elektron seine ursprüngliche Spi-nausrichtung geändert. Der Übergang zum spinumgekehrten Grundniveau ist fürsolch ein Triplett-Elektron „verboten“ und läuft nur mit einer geringen Wahrschein-lichkeit ab. Das ist der Grund für die große Zeitspanne von bis zu mehreren Minu-ten, innerhalb derer sich das Elektron durch Aussenden von Phosphoreszenzlichtdeaktiviert.

11.2 Fluoreszenzverstärkung auf der DC-Platte 351

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1


Abs

orpt

ion

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Fluo

resz

enz

Stokes-Verschiebung

Relaxa�on

0

0

2

23

1

1

3

V=

V‘=

(ex) (em)

a b

c

Abb. 11.1 Abgebildet ist das Absorptions- und Emissionsspektrum von Benzo[a]pyren, aufge-nommen auf einer RP-18-Platte. a Das Benzo[a]pyren-Absorptionsspektrum liegt zwischen 300und 400 nm, b sein Emissionspektrum zwischen 400 und 470 nm, c Das Jablonski-Energiedia-gramm mit den verschiedenen Schwingungsniveaus korrespondiert mit dem Absorptions- und demEmissionsspektrum. ex Anregung (engl. excitation), em Emission

11.2 Fluoreszenzverstärkung auf der DC-Platte

Angeregte Moleküle zeigen Fluoreszenz nur, wenn sie ihre aufgenommene Energienicht thermisch abgeben können. Nur dann emittieren sie ihre Anregungsenergie inForm von Licht. Substanzen mit Kontakt zu Lösungsmittelmolekülen oder zu Mo-lekülen der stationären Phase verlieren ihre Absorptionsenergie meist strahlungslosund zeigen damit keine oder nur eine geringe Fluoreszenz. Das ist der Grund,warum häufig empfohlen wird, DC-Platten zur Fluoreszenzverstärkung in viskoseFlüssigkeiten wie Paraffin oder Triton-X zu tauchen (siehe auch Abschn. 7.2.1). DieMoleküle dieser viskosen Flüssigkeiten lagern sich zwischen Platte und Analytenein und verhindern einen Kontakt zur stationären Phase. So können fluoreszie-rende Analyte ihre Anregungsenergie nicht durch Kontakt zur Plattenoberfläche,


Abb. 11.2 Absorptions- und Fluoreszenzspektren von 1,7 µg Pyren, gemessen auf Kieselgel. Derungetauchte Fleck zeigt breite, unstrukturierte Absorptionsbanden und so gut wie keine Fluores-zenz. Der getauchte Fleck zeigt scharfe Absorptionsbanden und eine starke Fluoreszenz. BlauAbsorptionsspekren, rot Fluoreszenzspektren, dicke Linien ungetauchter Fleck, dünne Linien ge-tauchter Fleck

sondern nur über eine Fluoreszenz abgeben. Die thermische Deaktivierung wirdals „Quenching“ bezeichnet. Man unterscheidet viskositätsabhängige Prozesse, dieals statisches Quenchen bezeichnet werden, und diffusionskontrollierte Abläufe,die man dynamisches Quenchen nennt [10]. Statisches Quenchen wird durch denKontakt der Analytmoleküle mit dem Sorbensmaterial hervorgerufen. Beim dyna-mischen Quenchen spielt die Bildung von Analytkomplexen eine Rolle [10].

Die Wahrscheinlichkeit eines Zusammenstoßes zwischen angeregten und nicht-angeregten Analytmolekülen steigt mit der Konzentration. Bei solch einem Zusam-menstoß wird Energie übertragen, wodurch sich das Fluoreszenzspektrum verän-dert. Aromatische Kohlenwasserstoffverbindungen wie z. B. Pyren können in hohenKonzentrationen Assoziate bilden. In Abb. 11.2 sind Absorptions- und Fluores-zenzspektren einer Pyrenzone dargestellt, in der 1,7 µg Pyren enthalten sind. DieSpektren wurden von einer Kieselgelplatte gemessen. Das Absorptionsspektrum istals blaue, dicke Line im Bereich von 200 bis 400 nm dargestellt. Das entsprechen-de Fluoreszenzspektrum ist als dicke rote Linie gezeichnet. Wird diese Pyrenzonein eine wässrige Natrium-Pentasulfonat-Lösung getaucht und erneut vermessen, er-hält man die in Abb. 11.2 abgebildeten, jetzt aber mit dünnem Strich gezeichnetenAbsorptions- und Fluoreszenzspektren.

Die ungetauchte Pyrenzone zeigt breite, wenig strukturierte Banden, deren Ma-xima im Vergleich zu dem getauchten Fleck zu niedrigeren Wellenlängen hin ver-schoben sind. Das Absorptionsspektrum des getauchten Flecks zeigt scharfe, gutstrukturierte Banden. Die Fluoreszenzspektren der getauchten und ungetauchtenZone unterscheiden sich ebenfalls. Bei der ungetauchten Zone ist das Fluoreszenz-

11.2 Fluoreszenzverstärkung auf der DC-Platte 353

signal nur als eine kleine Schulter um 480 nm zu erkennen. Diese Fluoreszenzwird von einem Pyren-Excimerkomplex emittiert [10]. Ein Excimer ist ein Asso-ziat, das aus einem angeregten und einem nicht angeregten Molekül besteht [10]. Inder getauchten Zone erscheinen scharf strukturierte Fluoreszenzbanden zwischen360 und 400 nm, die identisch sind mit Pyren-Fluoreszenzspektren in Lösung [10].Auch das Signal um 480 nm ist zu sehen, allerdings viel intensiver als das desungetauchten Pyrens. Das Tauchen in Natrium-Pentasulfonat-Lösung ist für eineFluoreszenzverstärkung dieses Signals um etwa den Faktor 6 verantwortlich. Ins-gesamt hat sich durch das Tauchen die Fluoreszenzintensität aller Pyrensignaleum den Faktor 10 erhöht. Der Befund kann erklärt werden, wenn man davon aus-geht, dass Pyren in der Zone in relativ hoher Konzentration vorliegt. Damit habendie Moleküle untereinander Kontakt, was die breiten Absorptionsbanden und dieExcimerfluoreszenz erklärt. Die fehlenden Fluoreszenzsignale zwischen 360 und400 nm belegen, dass Pyren in diesem Spot nicht als isoliertes Molekül, sondernimmer in Kontakt zur Plattenoberfläche vorkommt. Es fluoresziert nur, wenn zwi-schen der Plattenoberfläche und einem angeregten Pyrenmolekül noch ein weiteres,nicht angeregtes Molekül sitzt. Dieses Assoziat ist verantwortlich für die Excimer-fluoreszenz. Beim Tauchen schieben sich Pentasulfonatmoleküle sowohl zwischendie einzelnen Pyrenmoleküle, was das Verschwinden der breiten Absorptionsban-den erklärt, als auch zwischen Pyrenmoleküle und Plattenoberfläche. So könnenauch isoliert vorhandene Pyrenmoleküle Fluoreszenz (zwischen 360 und 400 nm)zeigen. Außerdem wird der strahlungslose Energietransfer vom Excimer auf diePlatte behindert, was die Excimerfluoreszenz steigert [11]. Taucht man die Plattezur Fluoreszenzverstärkung in eine entsprechende Lösung, so ist dies nichts weiterals eine Verschmutzung der Platte, die die Analytmoleküle quasi „einpackt“ unddaran hindert, ihre Anregungsenergie durch Kontakt zur Platte wieder abgeben zukönnen [11].

Den Vorgang illustriert auch Abb. 11.3. Hier sind die Fluoreszenzspektren vongetauchten Pyrenzonen unterschiedlicher Konzentration abgebildet, gemessen aufeiner Kieselgelplatte. Mit steigenden Konzentrationen nimmt die Fluoreszenz dermonomeren Pyrenmoleküle ab, während die der Excimere ansteigt.

Zur Verstärkung von Fluoreszenzsignalen auf Kieselgel muss der Weg zur strah-lungslosen Deaktivierung der Analytmoleküle blockiert werden. Unzählige Veröf-fentlichungen empfehlen das Sprühen oder Tauchen mit viskosen Lösungen wiePEG, Tensiden, Aminen oder anderen Verunreinigungen. So können Fluoreszen-zen auf der Platte verstärkt und auch stabilisiert werden [8, 12–19]. Der Ausdruck„Fluoreszenzverstärkung“ (engl. enhancement of fluorescence) hat sich dafür ein-gebürgert. Einen ausgezeichneten Überblick gibt H. Jork [12]. Der theoretischeHintergrund wird – oft kontrovers diskutiert – in [8, 11, 13, 14, 18, 19] dargestellt.Zur Fluoreszenzverstärkung können alle Moleküle mit niedrigem Dampfdruck be-nutzt werden, die sich erfolgreich zwischen Probe und fester Phase einlagern undselbst weder zu viel Licht absorbieren noch eine Eigenfluoreszenz zeigen. Aufunpolaren RP-Phasen ist die Verstärkung nicht so effektiv, da hier die fluoreszie-renden Substanzen wegen der lipophilen Belegung der Platte an sich schon einestarke Fluoreszenz zeigen [17]. Diese Belegung fungiert dabei als „eingebauter Ab-


Abb. 11.3 Abgebildet sind die Fluoreszenzspektren von Pyren. Zur Fluoreszenzverstärkung wur-de die HPTLC-Platte in eine wässrige Hexansulfonsäure-Lösung getaucht. Die Spots enthalten11,7 µg, 5,1 µg und 1,7 µg Pyren (bei 480 nm indiziert). Eine weitere Zone mit 11,7 µg Pyren wurdenicht getaucht [11]. Rot 11,7 µg, grün 5,1 µg, hellblau 1,7 µg Pyren (getaucht), dunkelblau 11,7 µgPyren (nicht getaucht)

standshalter“. Hier erreicht man durch eine gezielte Verunreinigung auf der Platteallenfalls Fluoreszenzverstärkungen um den Faktor 2 [11]. Fluoreszenzauswertun-gen sollte man daher – wenn es möglich ist – immer auf RP-18-Phase durchführen.So spart man sich den zusätzlichen Tauchvorgang zur Fluoreszenzverstärkung.

11.3 Quantitative Fluoreszenzmessung auf der DC-Platte

Probemoleküle in lichtstreuender Umgebung zeigen die Fluoreszenz JF, wenn ab-sorbiertes Licht in Fluoreszenzlicht umgewandelt wird. Das Ausmaß dieser Um-wandlung wird von der Quantenausbeute qF beschrieben, dem Proportionalitäts-faktor zwischen Fluoreszenzlicht und Anregungslicht. Die Lichtintensität, die voneiner Probe absorbiert wird, kann aus der Differenz der von einer sauberen Plattereflektierten Lichtintensität (J0) und der Lichtintensität (J) berechnet werden, dievon der Probe gestreut wird.

JF D qF.J0 � J / D qFJ0.1 � R/ (11.1)

JF abgestrahlte FluoreszenzintensitätqF Quantenausbeute der FluoreszenzJ0 Lichtintensität, reflektiert von einer sauberen PlattenoberflächeJ reflektiertes (gestreutes) Remissionslicht bei der Wellenlänge des eingestrahlten

Lichtes

11.3 Quantitative Fluoreszenzmessung auf der DC-Platte 355

R relative Remission (R = J/J0)Die Quantenausbeute der Fluoreszenz beschreibt den Anteil an absorbiertem

Licht, das in Fluoreszenzlicht umgewandelt werden kann.

qF D emitierte Photonen

absorbierte PhotonenD kF

kF C kd C kisc

qF Quantenausbeute der FluoreszenzkF Geschwindigkeitskonstante der Fluoreszenzumwandlung aus absorbiertem

Lichtkd Geschwindigkeitskonstante der strahlungslosen Energieabgabe (dissipative

Energieabgabe)kisc Geschwindigkeitskonstante des Intersystem Crossings (Umwandlung in Phos-

phoreszenzlicht)Der Faktor der Quantenausbeute wird umso kleiner, je größer die Geschwindig-

keitskonstanten zur Umwandlung in Phosphoreszenzlicht oder zur strahlungslosenEnergieabgabe sind. Gerade der Faktor kd lässt sich experimentell beeinflussen.Durch geeignete Tauchlösungen kann eine strahlungslose Energieabgabe des ange-regten Moleküls hinausgezögert werden. Die Konstante kd , die die Geschwindigkeitder strahlungslosen Energieabgabe beschreibt, wird so klein gehalten.

11.3.1 Fluoreszenz in streuendenMedienbei niedriger Analytkonzentration

In der Spurenanalyse haben wir es mit Rückstreufaktoren von k ~ 1 zu tun. Aus dererweiterten Kubelka-Munk-Theorie erhält man eine lineare Abhängigkeit zwischender zu messenden Masse und dem Messsignal, wenn der Quotient R = J/J0 über denAusdruck (1 � R)/R transformiert wird (siehe (10.10)). Aus (11.1), um 1/R erwei-tert, erhält man:

JF

J0RD qF

.1 � R/

RD qFm

am

s: (11.2)

Wenn in diesem Ausdruck R durch R = s/(a + s) substituiert (aus [1 � R]/R = a/s)und gleichzeitig die Beziehung (s + a) = 1 berücksichtigt wird (10.4), folgt:

JF D mJ0qFam

s

s

.a C s/D mJ0qFam : (11.3)

Die reflektierte Lichtintensität J der Probezone bei der Fluoreszenzwellenlängebesteht aus der Summe an Streulicht J0F und der Fluoreszenz (JF = J � J0F). Glei-chung 11.3 kann daher folgendermaßen umgeschrieben werden:

J � J0F

J0FD .RF � 1/ D J0

J0FmqFam : (11.4)


J reflektiertes Remissionslicht bei der Wellenlänge des FluoreszenzlichtesJ0F reflektierte Lichtintensität der sauberen Platte bei der Wellenlänge des Fluores-

zenzlichtesJ0 Lichtintensität (bei der Wellenlänge der Lichtabsorption), reflektiert von einer

sauberen Plattenoberflächem AnalytmasseqF Quantenausbeute der Fluoreszenzam Masseabsorptionskoeffizient der Probe

Bei kleinen Analytkonzentrationen ist die Intensität des Fluoreszenzlichtes di-rekt proportional zur Analytmasse in der DC-Schicht. Diese Gleichung beschreibtden entscheidenden Vorteil von Fluoreszenzmessungen im Vergleich zu Messungenin Absorption: Das Messsignal vergrößert sich mit steigender Einstrahlintensität J0.Die Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessung kann mit hochintensiv strahlendenBeleuchtungsquellen wie Laser extrem gesteigert werden. Auch kann eine längereMesszeit das Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenzmessung verbessern. Dieserweitert den Einsatzbereich der Fluoreszenz-DC im Bereich der Spurenanalytikerheblich [20, 21].

11.3.2 Fluoreszenz in streuendenMedienbei hoher Analytkonzentration

Bei hohen Massekonzentrationen in einer Probenzone beschreibt die Kubelka-Munk-Gleichung (10.12) einen linearen Zusammenhang zwischen Lichtabsorptionund Analytmasse. Es gilt:

KM D .1 � R/2

2RD 1 � s

sD a

sD m

am

s: (11.5)

Die von der Probe absorbierte Lichtmenge wird entsprechend des Faktors derQuantenausbeute qF in Fluoreszenzlicht umgewandelt. Es gilt daher (11.1). Wirddiese Gleichung quadriert und durch 2R im Nenner erweitert, führt dies zu folgen-dem Ausdruck [21]:

JF2

J02 2R

D qF2 .1 � R/2

2RD qF

2mam

s: (11.6)

Das Quadrat des Fluoreszenzlichtes, geteilt durch den Remissionswert der Ab-sorption, ist der absorbierenden Substanzmasse m proportional. Der Ausdruck für Rkann mit (a = 1 � s) (aus 10.4) entsprechend (10.7) auch folgendermaßen geschrie-ben werden:

R D 1

s� 1

s

p1 � s2 D 1

1s

C 1s

p1 � s2

D s

1 C p1 � s2

:

11.3 Quantitative Fluoreszenzmessung auf der DC-Platte 357

Wird (11.6) nach JF2 aufgelöst und R substituiert, folgt:

JF2 D mJ0

2qF2 2am

1 C p1 � s2

:

Wird berücksichtigt, dass bei einer großen Analytmenge in der Schicht das Lichtvon diesem sehr stark absorbiert wird, also ein kleiner Streukoeffizient resultiert,kann die obige Gleichung mit s � 1 zu einem Ausdruck vereinfacht werden, beidem das Quadrat des Fluoreszenzlichtes der Probemasse direkt proportional ist:

JF2 D mJ0

2qF2am : (11.7)

JF abgestrahlte Fluoreszenzintensitätm AnalytmasseqF Quantenausbeute der FluoreszenzJ0 Lichtintensität, reflektiert von einer sauberen Plattenoberflächeam Masseabsorptionskoeffizient der Probe

Wird berücksichtigt, dass die reflektierte Lichtintensität J der Probezone aus derSumme an Streulicht J0F und der Fluoreszenz JF zusammengesetzt ist, kann (11.7)auch folgendermaßen umgeschrieben werden:

.J � J0F/2

J0F2

D .RF � 1/2 D J02

J0F2mqF

2am : (11.8)

Gleichung 11.8 sollte zur Auswertung von Fluoreszenzmessungen mit hoherMassekonzentration benutzt werden, um eine lineare Kalibrierfunktion zu erhalten.

Die Ausdrücke zeigen nur bei Fluoreszenzsignalen positive Werte.In Abb. 11.4 ist die Kalibrierkurve von Flupirtin ausgewertet, einem zentral wir-

kenden Schmerzmittel. Die Nachweisgrenze von Flupirtin liegt bei 200 ng pro DC-Zone. Werden die Messwerte mit (11.8) transformiert, erhält man Linearität bis5000 ng pro Zone.

11.3.3 Kontourplot zur Fluoreszenzauswertung

Die Auswertung von Fluoreszenzemissionen nach (11.4) oder (11.8) ergibt einenschnellen Überblick über alle fluoreszierenden Zonen einer DC-Bahn. Fluoreszenz-messungen sind wesentlich spezifischer als Absorptionsmessungen, da nur relativwenige Substanzen eine Eigenfluoreszenz besitzen.

Abbildung 11.5 zeigt die Trenung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 als Kontour-plot (von rechts nach links). Die beiden Aflatoxine G1 und G2 zeigen Fluoreszenzenoberhalb von 470 nm. Unser Auge sieht diese Fluoreszenzen als grüne Farbe, daherdie Abkürzung „G“. Die Emissionen der B-Aflatoxine liegen unterhalb von 470 nmund erscheinen dem Auge blau, daher die Abkürzung „B“. Es können noch Fluo-reszenzspektren von weniger als 100 pg Aflatoxin pro Zone detektiert werden. Die


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Flurpirtin (ng)

Flu

ores

zenz

0 1000 2000 3000 4000 5000

Abb. 11.4 Dargestellt ist die Kalibrierkurve von Flupirtin (einem zentral wirkenden Schmerzmit-tel), ausgewertet mit (11.8). Die Nachweisgrenze von Flupirtin liegt bei 200 ng

Abb. 11.5 Fluoreszenz-Kontouplot einer Aflatoxintrennung auf Kieselgel (0,1 mm Schichtdicke)mit Methyl-tert-butylether (MTBE)/Wasser/Methanol/Cyclohexan (240 + 2,5 + 10 + 5, V / V) alsFließmittel. In den Zonen enthalten sind 210 pg Aflatoxin B1 und G1 und 70 pg Aflatoxin B2 undG2 [22]

11.4 Platten mit Fluoreszenzindikator 359

in Abb. 11.5 abgebildeten Aflatoxinzonen erlauben Peakreinheitsuntersuchungenum sicherzustellen, dass die einzelnen Aflatoxine vollständig voneinander oder vonBeiprodukten getrennt wurden. Dies ist eine Voraussetzung zur korrekten Quantifi-zierung [22].

11.4 Plattenmit Fluoreszenzindikator

Manche DC- oder HPTLC-Platten enthalten in ihrer stationären Phase einen Fluo-reszenzfarbstoff. Bei den kommerziell erhältlichen Platten sind zwei verschiedeneVerbindungen in Gebrauch, die beide bei 254 nm angeregt werden können. Man-ganaktiviertes Zinksilicat fluoresziert grün und ist nicht säurestabil. SäurestabilesMagnesiumwolframat wird mit F254s abgekürzt und fluoresziert hellblau. BeideFluoreszenzfarbstoffe emittieren Licht im Bereich zwischen 480 und 520 nm. Ab-sorbiert ein Analyt Licht um 254 nm, wird der in die Trennschicht eingearbei-tete Fluoreszenzfarbstoff weniger Anregungslicht erhalten und eine entsprechendschwächere Fluoreszenz als die benachbarten Zonen zeigen. Man nennt dieses Phä-nomen „Fluoreszenzlöschung“. Die Fluoreszenzlöschung solcher Platten wird auchvon einem Diodenarray-Scanner registriert. Ein Beispiel ist in Abb. 11.6 dargestellt.Hier wurde eine Magenprobe aufgearbeitet und chromatographiert. Der Kontour-plot (Abb. 11.7) zeigt zwei getrennte Substanzen: Zopiclon bei 19,8 mm Laufhöheund Doxepin bei 27,3 mm Laufhöhe. Doxepin lässt um 250 nm eine starke Absorp-tion erkennen. Der in der stationären Phase enthaltene Fluoreszenzfarbstoff wirddaher im Wellenlängenbereich um 250 nm vom Doxepin abgedeckt und kann selbstnur wenig Licht absorbieren. Daher kann der Fluoreszenzfarbstoff der Doxepinzonezwischen 500 nm und 550 nm auch so gut wie kein Fluoreszenzlicht emittieren. DasReferenzspektrum zur Berechnung der Remissionswerte wurde bei 36,0 mm aufge-nommen. Dort ist die starke Fluoreszenz des Farbstoffes zu sehen, aber dieses Lichtfehlt beim Doxepinsignal, das ja über den Quotienten aus Referenz- und Analyt-spektrum berechnet wird. Das Fluoreszenzlicht ist „gelöscht“ und man sieht beimDoxepinfleck ein zusätzliches Absorptionssignal zwischen 480 nm und 550 nm.

Die Verbindung Zopiclon zeigt kaum eine Absorption um 250 nm. Der Fluores-zenzfarbstoff in der Zopiclonzone kann daher angeregt werden und emittiert Fluo-reszenzlicht fast in der gleichen Lichtintensität wie beim Referenzspektrum. Daherfehlt beim Zopiclon-Peak das Signal der Fluoreszenzlöschung zwischen 500 nmund 550 nm fast vollständig.

Die Spektren von Zopiclon und Doxepin sind in Abb. 11.6 dargestellt. Beim Do-xepinspektrum erkennt man das starke Absorptionssignal der Fluoreszenzlöschungzwischen 480 nm und 550 nm. Das entsprechende Signal im Zopiclonspektrum istdagegen nur schwach ausgeprägt.

Bei Spektrenvergleichen muss eine eventuelle Fluoreszenzlöschung mit in Be-tracht gezogen werden. Entweder darf nur der Bereich unter 480 nm berücksichtigtwerden, oder die Referenzspektren werden mit und ohne Fluoreszenzindikator re-gistriert.


0

0,5

1

1,5

Wellenlänge (nm)

-lg (R

)

Zopiclon

Doxepin

200 300 400 500 600

Abb. 11.6 Abgebildet sind ein Doxepinspektrum und ein Zopiclonspektrum, aufgenommen aufeiner HPTLC-Platte mit Fluoreszenzindikator. Die Signale der Fluoreszenzlösung sind im Bereichvon 480 nm bis 550 nm zu erkennen. Grün Doxepin, rot Zopiclon

Abb. 11.7 Abgebildet ist der Kontourplot einer Doxepin- (bei 27,3 mm Laufhöhe) und Zopiclon-trennung (bei 19,8 mm Laufhöhe), aufgenommen auf einer HPTLC-Platte mit Fluoreszenzindika-tor. Die Signale der Fluoreszenzlösung sind im Bereich von 480 nm bis 550 nm zu erkennen

Die Signale der Fluoreszenzlöschung können problemlos für eine Quantifizie-rung herangezogen werden.

Literatur 361

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12Chemometrie in der HPTLC

Chemometrie beschreibt die Anwendung mathematisch-statistischer Methoden aufanalytische Daten. Das Ziel dabei ist nicht nur, so viel Informationen wie mög-lich aus den Messdaten abzuleiten. Chemometrische Methoden helfen auch bei derAuswahl der optimalen Messparameter. In diesem Kapitel werden Methoden zurSubstanzidentifizierung, zur Überprüfung der Zonenreinheit und zur Messplanungvorgestellt.

12.1 Bestimmung von Rf-Werten

Die historisch älteste chemometrische Anwendung in der DC ist sicherlich dieBestimmung genauer Rf-Werte. Hatte man früher die Rf-Werte noch über Längen-messungen mit einem Lineal direkt auf der Platte bestimmt, so werden sie heuteelektronisch aus einem Densitogramm ermittelt. Trotzdem schwanken auch hier dieErgebnisse, wenn man nicht einige einfache Regeln beherzigt.

Normalphasentrennungen auf Kieselgelplatten reagieren sehr empfindlich aufWasser, und so hängen die Rf-Werte einer Normalphasentrennung sehr stark vomWassergehalt der Atmosphäre ab. Das führt dazu, dass im Sommer regelmäßigandere Rf-Werte als im Winter gemessen werden, auch wenn identisches Platten-material verwendet wird. Um konstante Rf-Werte zu erhalten, sollte man die Plattefür etwa 10 min bei 120 °C trocknen lassen und dann an einem Ort konstanter Luft-feuchtigkeit aufbewahren. Eine Luftfeuchte von etwa 38 % ist dazu eine gute Wahl.Zur Entwicklung bietet die Industrie spezielle Entwicklungskammern an, in denendie Platte vorkonditioniert wird und eine gleichbleibende Luftfeuchtigkeit gewähr-leistet ist. Eine Vorkonditionierung kann auch erreicht werden, wenn die Plattevor der Entwicklung in eine Doppeltrogkammer gestellt wird, die in der zweitenKammer mit einer Konditionierflüssigkeit beschickt wurde. Welche Flüssigkeitendefinierte Luftfeuchten erzeugen, ist in Kap. 6 beschrieben.

Zu einer genauen Bestimmung von Rf-Werten sollte man die Plattenschicht überdie ganze Länge dort einritzen, wo der Fließmittelfluss enden soll. Dann könnensich bei der Entwicklung die Poren über die ganze Entwicklungsstrecke vollstän-


364 12 Chemometrie in der HPTLC

dig füllen. Dazu muss die Platte noch einige Zeit in der Kammer stehen gelassenwerden, auch wenn die Front das Ende der Entwicklungsstrecke erreicht hat. Ein„Nachlaufen“ erreicht man nicht, wenn man eine Platte direkt aus der Entwick-lungskammer nimmt. Dann sind im oberen Bereich der Entwicklung die Poren nurunvollständig gefüllt und eine Sättigungskonzentration ist noch nicht erreicht. Auchdie Schichtdicke der Trennschicht hat einen Einfluss auf den Rf-Wert. Ist diese nichtgleichmäßig, kann der Rf-Werte ebenfalls schwanken. Daher sollte man auf selbstgegossene Platten verzichten.

In der forensischen Analytik hat sich ein Verfahren bewährt, das zur genauenErmittlung von Rf-Werten mehrere Substanzen parallel zur Probe mitlaufen lässt[1, 1b]. Diese Referenzsubstanzen bekannter Rr-Werte müssen den ganzen Bereichder Trennung abdecken. Die bekannten Rf-Werte werden graphisch – als korrigiertehRf-Werte – gegen die Rf-Werte der Trennung aufgetragen. Stimmen beide Mess-reihen überein, ergibt sich eine durchgehende Gerade. Bei Abweichungen zeigt dieGerade charakteristische Knicke. Üblicherweise werden hRf-Werte verwendet, diesich aus den üblichen Rf-Werten durch die Multiplikation mit 100 ergeben.

Den hRf-Wert des Analyten bestimmt man nun aus der Teilgeraden der beidenReferenzwerte, zwischen denen der hRf-Wert des Analyten liegt. Zeigt der Analytz. B. den gemessenen hRf-Wert hRf(g) = 60, kann der korrigierte Wert graphisch ausder Auftragung als hRF(k) = 55 ermittelt werden.

Zur numerischen Berechnung wird die Gerade verwendet, die durch die benach-barten Referenzwerte (hier: R2 und R3) gebildet wird. Der korrigierte hRf-Wertwird über folgende Formel berechnet [1]:

hRF.k/ D .hR3 � hR2/k

.hR3 � hR2/g

.hRF.g/ � hR2g/ C hR2k : (12.1)

Werden die entsprechenden Werte des in Abb. 12.1 dargestellten Beispiels einge-setzt, korrigiert die Gleichung den Messwert hRf = 60 in den korrigierten MesswerthRF = 55.

hRF.k/ D 74 � 52

72 � 58.60 � 58/ C 52 D 55

Die Einführung korrigierter hRf-Werte ist ein vorzügliches Mittel zur Standardi-sierung von DC-Messungen. Korrigierte hRf -Werte eignen sich hervorragend zumDatenaustausch zwischen Laboratorien, zur Erstellung von Tabellen, zur Identifi-zierung von Substanzen und zum Einsatz in der Datenverarbeitung [1]. Die Praxiszeigt, dass eine gute Übereinstimmung von korrigierten hRf -Werten verschiede-ner Laboratorien gegeben ist. Die korrigierten Werte zeigen sich stabil gegenüberzahlreichen Einflüssen [1].

12.2 Substanzidentifizierungen über UV-vis- und Fluoreszenzspektren 365

R1

R2

R3

0

100

0 100

R f(g

emes

sen)

Rf (korrigiert)20 52 74

19

58

7260

55

Abb. 12.1 Abgebildet ist das Verfahren zur graphischen Ermittlung korrigierter hRf-Werte

12.2 Substanzidentifizierungen über UV-vis- undFluoreszenzspektren

Der große Vorteil der Diodenarray-DC liegt in der Online-Registrierung von Spek-tren direkt auf der DC-Platte und der Möglichkeit, diese Spektren für weitere Rech-nungen zu benutzen. Eine intelligente Verarbeitung dieser Daten kann die Aussa-gekraft einer DC-Trennung wesentlich steigern. Neben der Identifizierung einerSubstanz durch ihr Spektrum ist insbesondere das Kriterium der Peakreinheit füreine Quantifizierung von herausragender Bedeutung. Weiter können die spektralenDaten geschickt eingesetzt werden, um bei einer Quantifizierung einen minimalenGesamtfehler zu erhalten.

Um einen Überblick über die Trennung auf einer DC-Bahn zu bekommen, solltevor einer weiteren Bearbeitung zuerst der Kontourplot der vermessenen Bahn dar-gestellt werden. Dazu muss ein Referenzspektrum [J()0,korr] ausgewählt werden,das mit allen anderen Spektren verrechnet wird. Üblicherweise benutzt man als Re-ferenzspektrum die Aufnahme eines „leeren“ Plattenbereiches [2, 3]. Geeignet sindBahnanfänge vor der Probeauftragung bzw. Plattenbereiche, die hinter der Laufmit-telfront liegen. Es kann allerdings auch ein Spektrum aus der Mitte der Trennung alsReferenz gewählt werden. In der Diodenarray-DC ist die Wahl des Referenzspek-trums eine wirkungsvolle Möglichkeit, um Untergrundstörungen im Densitogrammzu beseitigen [2]. In der Vergangenheit wurde für diesen Zweck die Verwendungvon sogenannten Dualscannern empfohlen, die einerseits die Probebahn und ande-rerseits den Plattenuntergrund aufnehmen und miteinander verrechnen [4, 5]. In derDiodenarray-DC lassen sich insbesondere Matrixeffekte während der Auswertungdurch die geschickte Wahl eines Referenzspektrums wirkungsvoll unterdrücken.Als Faustregel hat sich dabei die Empfehlung bewährt, das Referenzspektrum mög-licht in die Nähe der zu bestimmenden Substanzzone zu legen.


0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

200 250 300 350 400 450

-lg(R

)

Wellenlänge (nm)

a

b

Abb. 12.2 Abgebildet ist das Benzo[a]pyren-Spektrum, gemessen als Absorptionsspektrum in Lö-sung (a) und von einer HPTLC-Platte in Remission (b)

Die aus den Rohdaten berechneten UV-vis-Spektren entsprechen weitgehendden Spektren, die auch in Lösung gemessen werden [6]. In Abb. 12.2a ist dasAbsorptionsspektrum von Benzo[a]pyren und, im Vergleich dazu, das entsprechen-de, von einer Kieselgelplatte über die logarithmische Umrechnung (9.7) erhalteneRemissionsspektrum in Abb. 12.2b abgebildet. Beide Spektren sind so gut wieidentisch. Eine leichte Verschiebung der Peakmaxima und der Peakhöhen einigerSignale untereinander haben ihre Ursache wahrscheinlich in den unterschiedlichenchemischen Umgebungen, in denen Benzo[a]pyren aufgenommen wurde.

Auch die von einer DC-Platte gemessenen Fluoreszenzspektren gleichen denentsprechenden Spektren aus Lösungen. In Abb. 12.3a ist dem von einer Kieselgel-platte aufgenommenen Pyren-Fluoreszenzspektrum das entsprechende Spektrumeiner Pyrenlösung in Abb. 12.3b gegenübergestellt [7]. Beide Spektren unterschei-den sich nur minimal. Die Pyren-Fluoreszenzspektren sind extrem abhängig vonder Konzentration des Pyrens im Substanzfleck. Bei höheren Konzentrationen ver-schiebt sich die Fluoreszenz zu höheren Wellenlängen, da jetzt nicht mehr Pyren-monomere, sondern Pyrendimere (Excimere) das Fluoreszenzlicht abstrahlen [8].

Durch den Vergleich von Spektren im UV-vis-Bereich können die meisten Sub-stanzen schnell und sicher identifiziert werden. Das funktioniert natürlich nur fürSubstanzen, deren Spektren in einer Spektrenbibliothek gesammelt vorliegen. Es-senziell ist ein Algorithmus zum Spektrenvergleich.

12.3 Korrelationsspektroskopie 367

0

1,5

3

4,5

350 400 450 500 550 600

Wellenlänge (nm)

Fluo

resz

enz

a b

Abb. 12.3 Abgebildet ist das Fluoreszenzspektrum von Pyren, gemessen von der HPTLC-Plat-te (a) und in Lösung (b). (Aus [7], mit freundlicher Genehmigung © Royal Society of Chemistry)

12.3 Korrelationsspektroskopie

Diodenarray-DC ermöglicht den schnellen Zugriff auf UV-vis-Spektren für chemo-metrische Auswertungen. Hier ist insbesondere der Spektrenvergleich zu nennen.Von allen bekannten rechnerischen Verfahren arbeitet der Spektrenvergleich übereine Korrelationsrechnung am wirkungsvollsten. Zusätzlich kann dieser Algorith-mus auch zur Überprüfung der Peakreinheit benutzt werden.

12.3.1 Korrelationsrechnung

Beim Vermessen (Scannen) einer DC-Bahn werden relative Remissionswerte erhal-ten, indem jeder Messwert eines Spektrums durch den entsprechenden Messwertdes Vergleichsspektrums geteilt wird.

R ./ D JProbe ./

J0 ./

Die Transformation dieser Remissionswerte z. B. über die Kehrwertfunktion(12.2) ist ein geeigneter Algorithmus, um Daten für eine Korrelationsrechnung


bereitzustellen.

A./ D 1

R ./� 1 (12.2)

Natürlich kann bei fluoreszierenden Substanzen für einen Spektrenvergleichauch die spektrale Verteilung der Fluoreszenzintensität verwendet werden. Hierkann allerdings das Fluoreszenzspektrum von der Charakteristik der einstrahlendenLampe abhängen, und unter Umständen werden geräteabhängige Spektren gemes-sen. Zum Spektrenvergleich über eine Korrelationsrechnung werden die Dateneines transformierten Analytspektrums, also die Absorptionswerte A1 bis An derMesswellenlängen 1 bis n, in einem Datenfeld (=) zusammengefasst.

= D

0BBB@

1; A1

2; A2

::: ;:::

n; An

1CCCA

Zur Berechnung der Autokorrelation dieses Vektors wird jeder Messwert einerWellenlänge quadriert. Für n Wellenlängen ergibt sich der Vektor == [9].

== D

0BBB@

A1 � A1

A2 � A2

::::::

An � An

1CCCA

Die Autokorrelation des Referenzspektrums (<<) berechnet sich völlig analog.Für den Vektor der Kreuzkorrelation werden die transformierten Messwerte derProbe AJ Wellenlänge für Wellenlänge mit den Werten des transformierten Refe-renzspektrums AR multipliziert. Es resultiert der Vektor =<:

=< D

0BBB@

AJ1 � AR1

AJ 2 � AR2

::::::

AJ n � ARn

1CCCA :

Anschließend werden die Messwerte der einzelnen Vektoren über ihre Anzahlaufsummiert. Für die Autokorrelation des Analytspektrums wird dies durch denAusdruck (

Pn1 ==) dargestellt. Nachdem alle Datenvektoren über ihre n Werte

aufsummiert wurden, wird der Klassifizierungsgrad @ nach folgender Formel be-stimmt [9].

@ DPn

1 =<Pn1 <<

sPn1 <<Pn1 == 100 .%/ (12.3)

Der Wert von @ beschreibt einen Spektren-Fit, der bei völliger Identität zwischenAnalyt- und Referenzspektrum den Wert 100 % ergibt. Unterscheiden sich zwei

12.3 Korrelationsspektroskopie 369

Abb. 12.4 Abgebildet sinddie Diphenhydraminspektreneiner Referenz und aus einerUrinprobe. Blau Urinprobe,rot Referenz

0

100

200

300

400


Spektren, berechnet sich ein Klassifizierungsgrad von kleiner als 100 %. Die Güteder direkt von der Platte gemessenen Spektren erlaubt eine Identifizierung auch inschwieriger Matrix [9–11]. Als Beispiel ist in Abb. 12.4 das bandenarme Spektrumvon Diphenhydramin sowohl als Referenzspektrum als auch als Probespektrum ei-ner Urinprobe dargestellt. Beide Aufnahmen sind ungeglättet wiedergegeben undwurden mit einer Messzeit von jeweils 0,5 Sekunden pro Spektrum aufgenommen.Die Substanz Diphenhydramin wird mit einem Fit von über 95 % identifiziert.

12.3.2 Kombinierte Substanzerkennungmittels Rf-Wertenund UV-vis-Spektren

Sowohl eine Identifizierung über den Rf-Wert als auch über das Spektrum ist sehraussagekräftig. Werden beide Verfahren kombiniert, erhält man eine mächtige Me-thode zur Substanzidentifizierung. Es können sogar Substanzen mit fast identischenSpektren sicher identifiziert werden [10]. Man trennt dazu unter konstanten Be-dingungen über eine durch Ritzen der Platte fest vorgegebene Strecke, trocknet,bestimmt den Rf-Wert und registriert das Spektrum. Bei einer Diodenarray-Auf-nahme kann das bequem am Computer erfolgen. Nun berechnet man die Differenzder Rf-Werte zwischen Probezone und Referenz und verrechnet diese auf folgendeWeise mit dem Fit-Faktor (12.3) des Spektrenvergleichs:

@Rf D @ .1 � �Rf/ : (12.4)

Weicht der Rf-Wert der Referenz vom gemessenen Wert ab, ergibt der Klammer-ausdruck einen Wert kleiner als eins. Damit zeigt der kombinierte Fit-Faktor einen


Wert von unter 100 % an. Ist das Ergebnis nicht eindeutig, kann die Platte erneut,jetzt aber mit einem anderen Fließmittel entwickelt, werden. So erhält man eineweitere Differenz von zwei Rf-Werten, die erneut in (12.4) eingesetzt werden kann.Bei drei durchgeführten Trennungen (A–C) ergibt sich die folgende Berechnungs-formel:

@Rf 3 D @ .1 � �RfA/ .1 � �RfB/ .1 � �RfC/ :

Auf diese Art konnten in drei Entwicklungsschritten 28 Benzodiazepine, dieuntereinander fast identische Spektren zeigen, allein durch die Bestimmung ihrerspektralen Fit-Faktoren und ihrer Rf-Werte identifiziert werden [10].

12.3.3 Überprüfung der Peakreinheit

Das Ziel einer DC-Trennung ist in der Regel die Quantifizierung des Analyten.Dazu muss nicht nur die Analytzone im Densitogramm erkannt werden; es mussauch sichergestellt sein, dass sie nicht durch andere Substanzen verunreinigt ist.Man nennt dieses Vorgehen eine Überprüfung der Peakreinheit.

In Abb. 12.5 ist der Kontourplot einer Trennung von pharmazeutisch wirksa-men Substanzen aus dem Urin eines Schmerzpatienten dargestellt. Es können achtverschiedene Substanzen identifiziert werden. Unter anderem ist Codein bei einerLaufhöhe von 13,6 mm zu sehen. Dank der hohen Rechengeschwindigkeit heutigerComputer kann eine ganze Bibliothek von Referenzspektren innerhalb kürzesterZeit mit allen Spektren einer DC-Aufnahme verglichen werden. So lässt sich schnelldas Spektrum einer Zielsubstanz in den Spektren eines Kontourplots finden.

Die Identifizierung von Codein im Kontourplot Abb. 12.5 erfolgte durch denVergleich aller 450 Einzelspektren des Kontourplots mit einem Codein-Referenz-spektrum. Für alle 450 Einzelvergleiche entsprechend der Kreuzkorrelationsfor-mel (12.3) wird jeweils ein Fit-Wert berechnet. Alle berechneten Fit-Werte sindin Abb. 12.6 graphisch über dem Densitogramm der Trennung (ausgewertet bei273 nm) aufgetragen. Die rote Fit-Funktion zeigt um die Laufhöhe 14 mm einenrechteckigen Peak mit der Höhe 99,8 %. Damit ist Codein in der Probe durch denhohen Fit-Faktor eindeutig identifiziert.

Das Faltungssignal ermöglicht in dieser Probe nicht nur eine sichere Identifizie-rung der Substanz Codein. Es können noch mehr Informationen gewonnen werden.Die rechteckige Form der Fit-Kurve über dem Codein-Peak ist ein Beleg dafür,dass sich unter diesem Signal kein Gemisch, sondern eine Reinsubstanz mit einemeinheitlichen UV-Spektrum verbirgt. Mit der Fit-Funktion kann so die Peakrein-heit eines Signals leicht überprüft werden. Wird eine Rechteckform erhalten, zeigtdie Fit-Funktion einen sauberen Peak an. Besteht ein Signal aus unterschiedlichenSubstanzen, dann zeigt die Fit-Funktion keine Rechteckform, sondern einen ge-krümmten Verlauf [9]. In Abb. 12.7 ist die Urinprobe erneut als Densitogrammdargestellt, diesmal bei 280 nm aufgenommen. In der Mitte des Densitogramms,im Trennstreckenbereich zwischen 20 mm und 25 mm, zeigt sich ein breites Signal.Erneut wurden die verschiedenen Spektren des Kontourplots mit den Bibliotheks-

12.4 Wahl der Auswertungswellenlänge 371

Abb. 12.5 Abgebildet ist der Kontourplot einer Urinprobe mit einem Codeinsignal bei 13,6 mmLaufhöhe

spektren verglichen. Die Fit-Funktion in Abbildung 12.7 wurde aus dem Vergleicheines Coffein-Referenzspektrums mit allen Spektren des Kontourplots erhalten. Ei-ne Übereinstimmung von 98 % an der Peakflanke des breiten Signals macht es sehrwahrscheinlich, das dieser DC-Fleck Coffein enthält.

Es müssen allerdings noch andere Substanzen in der Zone enthalten sein, denndie Fit-Funktion zeigt eine charakteristische Krümmung und eben keine Recht-eckstruktur. Gekrümmte Fit-Funktionen belegen, dass DC-Zonen mehrere Kom-ponenten enthalten, eine Peakreinheit also nicht gegeben ist. Oft reicht es zur Über-prüfung der Peakreinheit, wenn die Spektren einer Zone am Anfang, in der Mitteund am Ende jeweils mit dem ganzen Peak verglichen werden. Zeigen alle dreiVergleiche ein Rechteck, kann man davon ausgehen, dass in dem gewählten Spek-tralbereich keine zweite Substanz die Quantifizierung stört.

12.4 Wahl der Auswertungswellenlänge

Das Ziel einer DC-Trennung ist in der Regel die Quantifizierung des Analyten, wasüber die Integration des Substanzsignals im Densitogramm erreicht wird. Anhandder Auswertung eines Kontourplots entscheidet man sich für die Wahl einer be-stimmten Messwellenlänge oder eines bestimmten Wellenlängenbereiches, aus demheraus das Densitogramm erstellt wird. Üblicherweise wählt man zur Erstellung ei-


0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Trennstrecke (mm)

Sig

nalin

tens

ität

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fit (

%)

Abb. 12.6 Abgebildet ist das aus einem Kontourplot (Abb. 12.5) bei 273 nm extrahierte Densi-togramm einer Urinprobe. Das Densitogramm ist überlagert durch die Fit-Funktion, die aus denKontourplot-Spektren und dem Codein-Referenzspektrum berechnet wurde. Blau Densitogramm,rot Fit-Funktion

nes Densitogramms die Wellenlänge aus, bei der ein Analyt die größte Absorptionoder die intensivste Fluoreszenz zeigt.

Nur mit guten Gründen entscheidet man sich gegen die Wahl der intensivs-ten Signale, wenn z. B. bei unvollständigen Trennungen Interferenzen mit anderenSubstanzsignalen auftreten oder die Intensität des Remissionslichtes im Signal-maximum zu gering ist. In Abb. 12.8 und Abb. 12.9 sind die Kontourplots einerTrennung von 16 PAKs, getrennt auf einer RP-18-HPTLC-Platte, zu sehen, die überdie Fluoreszenzformel (Abb. 12.8a), die Remissionsformel (Abb. 12.8b) und dieKubelka-Munk-Gleichung (Abb. 12.9) ausgewertet wurden [6].

Mit der Kubelka-Munk-Formel werden sowohl die Absorptionen als auch dieFluoreszenzsignale positiv dargestellt. Man sieht damit auf einen Blick, bei wel-chen Wellenlängen eine Quantifizierung Erfolg verspricht. Damit zeigt die Kubel-ka-Munk-Auswertung die Zusammenfassung der Fluoreszenz- und der Absorpti-onsauswertung, also die graphische Verifizierung von (9.9). Die Trennkapazität derHPTLC-Trennung reicht nicht aus, alle 16 PAKs dieser Probe in einem Lauf zutrennen. Die verschiedenen PAKs zeigen aber gut strukturierte Absorptions- undFluoreszenzspektren, sodass man für die verschiedenen polyaromatischen Kohlen-wasserstoffe jeweils einen Wellenlängenbereich finden kann, bei dem sich dieseSubstanz ohne Störungen durch Nachbarsignale quantifizieren lässt. Auf diese Wei-

12.5 Statistischer photometrischer Fehler (Detektorvarianz) 373

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Trennstrecke (mm)

Sig

nalin

tens

ität

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fit (

%)

Abb. 12.7 Dargestellt ist das Densitogramm einer Urinprobe, gemessen bei 280 nm. Überlagertist das Chromatogramm mit der Fit-Funktion für Coffein. Blau Densitogramm, rot Fit-Funktion

se kann die Diodenarray-DC die Trennstärke bzw. die Trennzahl einer DC-Methodeerheblich erhöhen.

12.5 Statistischer photometrischer Fehler (Detektorvarianz)

Ein DC-Scanner misst Lichtintensitäten mit einem Photometer, das aus einer Reihevon Bauteilen besteht, die zum statistischen Rauschen des Messwertes beitragen.Dies sind vor allem die Lichtquelle, der Empfänger, der Verstärker und die A/D-Wandlerkarte. Daneben wird die Güte einer Messung immer auch dadurch ver-schlechtert, dass vom Scanner zwei Intensitätsspektren gemessen und miteinanderzu einem Remissionswert (entsprechend 12.5) verrechnet werden. Dazu addiert sichdann noch der Fehler der Dunkelstrommessung. Nur die Remissionswerte (engl. re-flectance) werden im Weiteren als fehlerbehaftet angesehen.

R./ D J./

J0./(12.5)

Die Frage ist, in welcher Weise sich der Fehler der Messung beim Umrechnenverändert [12–16]. Die Unsicherheit der durch eine Remissionsmessung unter An-nahme eines konstanten Gerätefehlers bestimmten relativen Masse @m=m hängt


Abb. 12.8 Abgebildet ist der Kontourplot einer Trennung von 16 polyaromatischen Kohlen-wasserstoffen (EPA-Standard) auf einer RP-18-Platte, entwickelt mit dem Laufmittel Metha-nol/Aceton (8 + 3, V / V). Dargestellt ist der Kontourplot, ausgewertet mit der Fluoreszenzformel(9.8) (a) und die Auswertung über die Remissionsformel (9.6) (b) [6]


Abb. 12.9 Abgebildet ist der Kontourplot einer Trennung von 16 polyaromatischen Kohlenwas-serstoffen, ausgewertet mit der Kubelka-Munk-Formel [6]

von dem Transformationsalgorithmus ab, mit dem ein Remissionswert in eine kon-zentrationsabhängige Größe umgerechnet wird. Dieser relative Fehler berechnetsich aus den zwei fehlerbehafteten Messgrößen J und J0, die beide zum Fehler imEndergebnis beitragen. Im Folgenden werden die relativen Fehler der verschiedenenBerechnungsarten abgeleitet, die zur Fehlerabschätzung der einzelnen Messmodiausreichen. Zur besseren Übersicht ist bei den folgenden Ableitungen die Wellen-längenabhängigkeit der Remission nicht gesondert gekennzeichnet.

12.5.1 Der Fehler im Kehrwertmodell

Das Kehrwertmodell (Remissionsmodell) wird bevorzugt bei niedrigen Analytkon-zentrationen benutzt, um Linearität zwischen den Messwerten (entsprechend 12.5)und der Masse in der Analytzone herzustellen. Es wird die Berechnungsformel zurLinearisierung verwendet:

m D const.�

1

R� 1

�:

Die Änderung des Endergebnisses einer Messung (des Massewertes einer Zone)bei sich ändernden Remissionswerten berechnet sich zu:

@m

@RD @

@R

�const.

�1

R� 1

�D �const.

1

R2:


Der relative Fehler im Endergebnis dieser Berechnungsmethode ergibt sich da-mit zu:

@m

mD �const.

R2

R

const..1 � R/@R D � 1

.1 � R/

@R

R: (12.6)

Der minimale Fehler des Rechenmodells „Remission“ liegt bei R = 0,5.Bei der Umrechnung über ein Auswertemodell zu masseabhängigen Werten ge-

hen die Unsicherheiten der beiden Messungen J0 und J in den Endwert ein. Derrelative Fehler der Massenänderung dm/m hängt auch davon ab, ob eine Ände-rung der gemessenen Lichtintensität dI abhängig oder unabhängig vom MesswertJ selbst ist. Photomultiplier, deren Rauschen durch das Quantenrauschen bestimmtwird, zeigen eine Abhängigkeit dJ von J. Bei der Verwendung eines Diodenar-ray-Detektors ist ebenfalls eine Abhängigkeit dJ von J vorhanden, die als @R �p

R geschrieben werden kann. Eine ausführliche Diskussion dieses Problems fin-det sich bei G. Kortüm und anderen [12–16]. Wird die Beziehung @R � p

R in denAusdruck für den relativen Fehler eingesetzt und dann graphisch gegen die Remis-sionswerte aufgetragen, ergibt sich Abb. 12.9.

12.5.2 Der relative Fehler im Kubelka-Munk-Modell

Die Fehlerberechnung nach dem Kubelka-Munk-Modell ist relativ umfangreich, dadas Modell eine komplizierte Umrechnung benötigt.

m D const..1 � R/2

2RD const.

�1

2R� 1 C R

2

�

Die relative Änderung der Masse bei sich ändernden Remissionswerten berech-net sich im Kubelka-Munk-Modell zu:

@m

@RD @

@Rconst. �

�1

2R� 1 C R

2

D const. �

�� 1

2R2C 1

2

D const. � R2 � 1

2R2:

Damit ergibt sich der relative Fehler dieser Berechnungsmethode zu:

@m

mD�R2 � 1

.1 � R/2

@R

R: (12.7)

Diese Formel ist identisch mit dem in der Literatur angegebenen Ausdruck [17].

@m

mD .R C 1/

.R � 1/

@R

R

Der minimale Fehler dieses Rechenmodells liegt bei R = 0,4139.


12.5.3 Der relative Fehler im logarithmischen Absorptionsmodell

Das Kubelka-Munk- und das Remissionsmodell sind Teillösungen der erweiter-ten Kubelka-Munk-Theorie. Werden Messwerte entsprechend dieser Theorie umge-rechnet, können lineare Kalibrationsgeraden in einem weiten Messbereich erhaltenwerden. Beim logarithmischen Modell „logarithmische Absorption“ ist dies nichtder Fall. Trotzdem lohnt es sich, bei DC-Messungen über den Einsatz dieser Formelnachzudenken, denn dieser Rechenalgorithmus zeigt ein günstiges Fehlerfortpflan-zungsverhalten. Wird der logarithmische Ausdruck zur Linearisierung verwendet,ändert sich die Messunsicherheit der Masse bei sich ändernden Remissionswertenzu:

m D �const. ln R D const. ln

�1

R

�

@m

@RD @

@RŒ�const. ln R� D �const.

1

R:

Der relative Fehler im Endergebnis dieser Berechnungsmethode ergibt sich da-mit zu:

@m

mD �const.

�const. ln R

1

R@R D 1

ln R

@R

R: (12.8)

Der minimale Fehler des Rechenmodells „logarithmische Absorption“ liegt beiR = 0,4343!

Fehlertechnisch zeigt das logarithmische Absorptionsmodell Vorteile gegenüberden (zu linearen Kalibrationsfunktionen führenden) Modellen nach Kubelka/Munkund dem Kehrwert-Modell „Remission“. Dies zeigt die Abb. 12.10.

Diese graphische Darstellung der abgeleiteten Fehlerkurven zeigt die starke Ab-hängigkeit des relativen Fehlers von den Remissionswerten. Insbesondere für Werteüber R = 0,9 steigt der Fehler bei allen Linearisierungsmodellen stark an. Hohe Re-missionswerte werden in der Spurenanalytik gemessen. Eine geringe Probemengeauf der Platte kann also nie mit einem kleinen statistischen Fehler bestimmt werden.Für Werte von R < 0,9 können sowohl die logarithmische Absorptions- als auch dieRemissionsformel uneingeschränkt eingesetzt werden. Dies gilt für den Kubelka-Munk-Ausdruck nur bedingt. Den Linearisierungsfehler minimiert man, wenn manmöglichst nur in einem Bereich zwischen R = 0,1 und R = 0,9 arbeitet!

12.5.4 Der relative Fehler im Fluoreszenzmodell

Einen Sonderfall in der Fehlerbetrachtung stellt die Auswertung nach dem Fluores-zenzmodell dar. Aus der Umrechnungsformel ergibt sich eine direkte Proportiona-lität zwischen der Masse im Substanzfleck und der Fluoreszenz. Es gilt:

m D const. ŒR � 1� :


Abb. 12.10 Dargestellt sind theoretische Fehlerkurven des Kubelka-Munk-Modells, der rezipro-ken Berechnung des Remissionsmodells und des logarithmischen Absorptionsmodells. Es wurdejeweils mit der Annahme @R D p

R gerechnet. Rot Kubelka-Munk-Modell, blau Remission, grünlogarithmisches Absorptionsmodell

Der relative Fehler berechnet sich zu:

@m

mD @R

.R � 1/: (12.9)

Die Fehlerkurve im Fluoreszenzmodell besitzt kein Minimum. Bei Remissions-werten im Bereich von R � 1 sind relative Fehler sehr groß und werden für stei-gende Fluoreszenzintensitäten immer kleiner. Allgemein gilt: Je größer die Fluo-reszenzintensität ist, umso kleiner ist die Messunsicherheit!

12.5.5 Minimierung des statistischen Photometerfehlers

Die Fehlerbetrachtungen der verschiedenen Messwertumrechnungen zeigen, dassein minimaler Fehler nur dann erreicht wird, wenn der Wert J in etwa die halbe In-tensität von J0 zeigt, R sich also etwa zu dem Wert 0,5 berechnet. Dies gilt nicht nurin der DC, sondern auch für UV-vis- oder HPLC-Auswertungen. Bei Durchlicht-messungen wird allerdings mit hohen Lichteinstrahlungen (I0) gearbeitet, sodass


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

200 250 300

Wellenlänge (nm)

-lg(R

) (ar

ea)

R: 0,4074 (0,58%)

R: 0,0755 (1,01%)

Abb. 12.11 Abgebildet ist ein Coffeinspektrum mit dem relativen Flächenfehler aus acht Messun-gen. Dargestellt sind die resultierenden Remissionswerte bei verschiedenen Wellenlängen und dieresultierenden Auswertefehler der Peakflächenmessung

man den Messwert der Probe (I) immer im Absorptionsmaximum messen sollte.Trotzdem resultieren bei Messungen in klarer Lösung Remissionswerte, die eherbei 0,9 als bei 0,5 liegen.

Bei Messungen in streuender Materie liegen die Verhältnisse ganz anders. DieDC-Platte schluckt sehr viel Licht. Damit sind die J0-Werte wesentlich kleiner alsbei Durchlichtmessungen in klarer Lösung. Bei stark absorbierenden Probezonenkann der Wert von J dann schon sehr klein werden. Oder anders ausgedrückt:Stark absorbierende Lösungen zeigen R-Werte im Bereich über 0,5, während Streu-messungen bei stark absorbierenden Zonen R-Werte eher im Bereich unter R = 0,5liegen. Da alle Fehlerkurven im Bereich von R � 0 und R � 1 steile Flanken zeigen(Abb. 12.10), resultieren dort große Fehler. Abbildung 12.10 zeigt deutlich, dassman diese Bereiche meiden sollte.

Generell sollte man zu kleine J-Werte meiden. Es ist bei der Auswertung vonkonzentrierten DC-Zonen daher manchmal sinnvoller, nicht bei der Wellenlänge dermaximalen Absorption zu messen. In Abb. 12.11 sind die relativen Flächenfehlereiner Coffeinzone hoher Konzentration bei verschiedenen Wellenlängen dargestellt.Es ist gut zu erkennen, dass nicht der Maximalwert in der Spektrenabsorption,sondern nur der optimale Remissionswert für die Größe des relativen Fehlers ver-antwortlich ist. Diese Coffeinbestimmung sollte daher bei der minimalen spektralenAbsorption um 240 nm und nicht im Absorptionsmaximum durchgeführt werden.

Wie schon betont, wird ein minimaler Fehler bei Absorptionsmessungen immerdann erhalten, wenn die Lichtintensität J der Substanzzone etwa halb so groß istwie die Intensität J0 des Vergleichs. Generell arbeitet man immer dann im optimalenFehlerbereich, wenn die Remissionswerte zwischen 0,1 und 0,9 liegen. Primär ist esalso wichtig, die DC-Platte mit einer möglichst hohen Lichtintensität zu bestrahlen,damit J0 einen großen Wert zeigt. Im Weiteren sollte J dann etwa den halben Wertvon J0 zeigen. Dies ist bei Spurenanalysen leider nicht zu erreichen.


Remission: R = 0,928 Relativer Fehler : 2,23%

R = 0,895 Fehler: 1,17%

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0 5 10 15 20 25 30 35

mm

(1-R

)

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0 5 10 15

mm

Coffein

Abb. 12.12 Abgebildet sind zwei Coffeintrennungen über 35 mm und 15 mm Trennstrecke. Ge-trennt wurde auf Kieselgel mit dem Laufmittel Isopropanol/Cyclohexan/25 %iger NH3 (7 + 2 + 1,V / V)

In Abb. 12.12 wird gezeigt, wie durch geschickte Wahl der Trennbedingungenmit einem reduzierten Fehler quantifiziert werden kann. Eine verdünnte Geträn-keprobe wurde achtmal über Trennstrecken von 15 mm und 35 mm chromatogra-phiert. Bei der kürzeren Entwicklungsstrecke ist der Coffeinpeak entsprechend desChromatographiegesetzes höher als das Coffeinsignal der 35-mm-Trennung undzeigt damit ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis. Der günstigere Remissionswertermöglicht einen wesentlich geringeren Präzisionsfehler von 1,17 % im Vergleichzu 2,23 % bei der 35-mm-Trennung. Eine unnötige Trennstrecke kostet also nichtnur Zeit, sondern verschlechtert auch die Präzision, da die Signale in ihrer Höhekleiner und auch breiter werden und damit eher R-Werte in der Nähe von R = 1zeigen.

12.6 Bündeln von Dioden und Glätten der Daten

Wurde eine Probesubstanz während der Entwicklung vollständig von allen Begleit-verbindungen abgetrennt, kann eine beliebige Messwellenlänge zur Darstellungdes Densitogramms gewählt werden. Die Diodenarray-DC bietet hier eine Reihevon Auswertemöglichkeiten, die weit über das hinausgehen, was Monowellenlän-gen-Scanner leisten. Eine DC-Bahn wird in der Diodenarray-DC nicht mit einemDetektor, sondern mit mehreren Hundert Detektoren simultan bei verschiedenenWellenlängen aufgenommen. Da die Signale von UV-vis-Spektren relativ großeWellenlängenbereiche abdecken, bietet es sich an, mehrere Messwellenlängen zueinem einzigen Densitogramm zu kombinieren. So kann das Signal-Rausch-Ver-hältnis verringert werden [18]. Werden n verschiedene Signalspuren zu einem Den-sitogramm kombiniert, sinkt das Rauschen um den Faktor

pn.

12.6 Bündeln von Dioden und Glätten der Daten 381

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Trennstrecke (mm)

stinuyrartibr

A

a

b

Abb. 12.13 Densitogramm von 250 ng Benzo[a]pyren (a) und die 100-fache Verstärkung des Den-sitogramms (b)

Abbildung 12.13 zeigt die Trennung von 250 ng Benzo[a]pyren. Die Bahn wur-de in Remission ausgewertet und das Densitogramm über 25 Dioden gemittelt. DasRauschen wurde so um den Faktor

p25 D 5 unterdrückt. Der Vorteil einer Bünde-

lung von Dioden liegt aber nicht nur in einer Rauschunterdrückung, sondern auchin der Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Verhältniszahlen von 5000 : 1können erreicht werden. Der kleine Peak bei 27 mm in Abb. 12.13 enthält nur 0,3 %der Fläche des Benzo[a]pyren-Signals.

In Abb. 12.14 sind verschiedene Densitogramme einer Trennung von 125 ng Di-phenhydramin dargestellt. Das Densitogramm der Abb. 12.14a wurde bei 200 nmmit nur einer Diode aufgenommen. Das Rauschen der Basislinie ist gut zu erkennen.Werden die Messsignale von sieben Dioden im Bereich um 200 nm gemittelt, wirddas Rauschen etwa um den Faktor 3 zurückgedrängt (Abb. 12.14b). Mehr Diodenkönnen sinnvoll nicht kombiniert werden, da das Absorptionssignal von Diphenhy-dramin oberhalb von 200 nm schnell abfällt (siehe Abb. 12.4).

Eine Unterdrückung des Rauschens kann auch über eine Zusammenfassung be-nachbarter Messwerte erreicht werden. Man nennt diesen Vorgang eine Glättung.Auch auf diese Weise kann das Rauschen effektiv reduziert werden. In der Literatursind eine ganze Reihe unterschiedlichster Glättungsalgorithmen publiziert worden[18, 19]. Im einfachsten Fall werden verschiedene, nebeneinander liegende Mess-werte über einen gleitenden Mittelwert miteinander verrechnet. Das Densitogrammin Abb. 12.14c wurde von einer Diode bei 200 nm aufgenommen und anschließendgleitend über jeweils sieben Werte gemittelt. Die Messwerte 1 bis 7 ergeben den ers-ten Mittelwert, die Werte 2 bis 8 den zweiten Mittelwert usw. Dieses auf den erstenBlick sehr erfolgreiche Glättungsverfahren hat aber, wie alle anderen Glättungsver-fahren auch, einen entscheidenden Nachteil: Es verfälscht das Densitogramm. DasRauschen kann zwar zurückgedrängt werden, doch wird der Diphenhydraminpeakverbreitert. Das beeinflusst die Auflösung zweier Signale untereinander und kann


0

0,1

0,2

0,3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Trennstrecke (mm)

Arb

itrar

y un

its

a

b

c

Abb. 12.14 Dargestellt ist jeweils das Densitogramm von 125 ng Diphenhydramin. a gemessenmit einer Diode bei 200 nm, b gemittelt über 7 Dioden im Bereich 200–204 nm, c geglättet überdie gemittelten Werte 7 benachbarter Messpunkte. Am Densitogramm (a) angewendet ist die ma-nuelle Peakintegration über Kreuz. Der Flächenwert wird aus beiden Integrationen als Mittelwertberechnet. Die Höhe wird über dem Kreuzungspunkt der beiden Basislinien gemessen

auch das quantitative Ergebnis verändern. Glättungsalgorithmen sollten daher nuräußerst zurückhaltend eingesetzt werden.

12.7 Peakintegration: Fläche oder Höhe?

Nach der Messung und der mathematischen Transformation der Messdaten, müs-sen die Substanzsignale integriert werden. Mit Integration ist die Aufsummierungder Einzelmesswerte eines Signals zu einem Summenmesswert gemeint, der denganzen Peak repräsentiert. Ein UV-vis- oder Fluoreszenzdetektor liefert bei jederEinzelmessung pro ausgelesenem Plattenbereich einen konzentrationsabhängigenMesswert (bzw. ein konzentrationsabhängiges Spektrum). Der vermessene Plat-tenbereich ist dabei ein Schnitt durch die Plattenschichtdicke mit den Ausmaßendes Lesespalts. Werden diese Signale über die Breite des Peaks aufsummiert, wirdaus der Fläche des Plattenschnitts ein Volumenelement und aus der gemessenenKonzentration eine Stoffmenge. Dies kann auch aus der Beschreibung der chro-matographischen Verteilung abgeleitet werden. Für x Gleichgewichtseinstellungenergibt sich (im Kap. 2) der Ausdruck n.ˇ C �/x mit (ˇ + � = 1). Wird die Vertei-lung des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase aufsummiert, ergibt dieVerteilungsfunktion den Wert eins. Das gilt ebenso für das Integral der Gauß-Funk-

12.7 Peakintegration: Fläche oder Höhe? 383

tion, die ja die Binomialverteilung mathematisch vertritt.

f .x/ D n

C1Z�1

1

p

2 e� .x�zS /2

2�2 dx D n

Das Integral über den Peak repräsentiert die Stoffmenge des Analyten. DiePeakintegration ist eine Minimax-Aufgabe. Man versucht so viel Peakfläche wiemöglich mit möglichst wenigen Datenpunkten zu beschreiben. Oder anders aus-gedrückt: Man nimmt möglichst wenige Datenpunkte der Basislinie mit in denFlächenwert des ganzen Peaks [20].

Viele Integrationsprogramme setzen die Integrationsgrenzen automatisch. Mansollte aber immer die Option besitzen, die Integrationsgrenzen selbst setzen zu kön-nen. Diese „Handintegration“ ist natürlich eine mehr oder weniger willkürlicheAngelegenheit. Man sollte als Analytiker bei zweifelhaften Integrationsergebnis-sen der Software aber lieber selbst aktiv werden und diese Ergebnisse korrigieren.Man sollte anzweifelbare Ergebnisse nicht einfach akzeptieren, weil sie von einemIntegrationsprogramm berechnet wurden. Man sollte die eigene Verantwortung fürdas Ergebnis nie auf ein anonymes Programm übertragen! Die Willkürlichkeit ei-ner manuellen Integration kann man dadurch relativieren, dass man verschiedenePersonen bittet, die Integrationsgrenzen zu setzen. Als Endwert nimmt man danneinfach den Mittelwert der verschiedenen Ergebnisse. Oft hat man Schwierigkei-ten, bei stark verrauschten Signalen die Peakgrenzen richtig zu erkennen. Rauschengehört sowohl zur Basislinie als auch zum Peak! Man sollte daher die Peakgren-zen auf keinen Fall oberhalb des Rauschens ansetzen. Bewährt hat sich vielmehrdas überkreuzte Integrieren mit anschließender Flächenmittlung, das in Abb. 12.14ebenfalls dargestellt ist.

Beim Integrieren hat man das Problem, ob man über die Peakfläche oder diePeakhöhe auswerten soll. Die Gauß-Funktion erreicht eine maximale Höhe vonf (zS) = .1=

p2 /. Es besteht ein funktioneller Zusammenhang zwischen Signal-

höhe H, Stoffmenge n und Signalbreite .

H D n1

p

2

Nach dem Chromatographiegesetz hängt die Signalbreite jedoch vom Rf-Wertab. Laufen die Proben nicht gleichmäßig, kann es hier bei gleicher Stoffmengezu unterschiedlichen Höhenwerten kommen. Meist ergeben Höhenauswertungengeringere Unsicherheiten in der Präzision, wenn sie mit der Auswertung über dieFläche verglichen werden. Dies hängt damit zusammen, dass bei der Flächenaus-wertung auch die Peakseiten mit ins Endergebnis einfließen. Die optimalen Wertevon R < 0,9 werden oft nur im Signalmaximum, nicht aber an den Flanken ge-messen. Bei einer Flächenintegration gelangen damit auch verrauschte Daten mitungünstigen Remissionswerten in das Endergebnis. Zur Steigerung der Präzisionin der Spurenanalytik ist die Höhenauswertung aus fehlertechnischer Sicht sehr


Abb. 12.15 Dargestellt ist die Trennung von vier Nukleinbasen und Coffein. Guanin (a), Cytosin(b) und Coffein (c) sind vollständig voneinander getrennt, während Uracil (d) und Thymin (e) bei53 mm nur unvollständig aufgelöst sind [21]

gut geeignet. Wird bei einer Höhenauswertung allerdings nur ein einziger Mess-wert berücksichtig, kann die Reduzierung des Präzisionsfehlers leicht zu Lastender Analysenrichtigkeit gehen. Daher wird für DC-Trennungen in der Regel eineFlächenauswertung empfohlen. Präzise und richtig kann allerdings auch mit einerHöhenauswertung gearbeitet werden, wenn ein gemittelter Höhenwert aus mehre-ren Messdaten im Bereich des Signalmaximums verwendet wird.

Sind Signale unvollständig getrennt, können die Peakgrenzen der einzelnen Si-gnale nicht sicher erkannt werden. Dann setzt man die Grenzen für das gesamte„Gebirge“ und wertet die einzelnen Peaks am besten über ihre Höhe aus.

12.8 Mehrwellenlängen-Spektrometriezur Mehrkomponentenanalyse

Ein großer Nachteil der DC ist ihre begrenzte Trennkapazität, denn in der Regelwerden Trennzahlen von nicht mehr als 15 erreicht. Oft können Substanzen nurteilweise aufgetrennt werden. Abbildung 12.15 zeigt die unvollständige Trennungvon Uracil und Thymin. Der Peak bei 53 mm Trennstrecke besteht aus diesen beidenSubstanzen.

12.8 Mehrwellenlängen-Spektrometrie zur Mehrkomponentenanalyse 385

Auch bei einer unvollständigen Trennung lassen sich die Signale quantifizieren.Das Absorptionsverhalten der Substanzen muss sich nur bei genügend vielen Wel-lenlängen unterscheiden.

Zur rechnerischen Separation wird angenommen, dass der nicht aufgelöste Peakaus zwei Substanzen A und B besteht. Weiter wird angenommen, dass ein linea-rer Zusammenhang zwischen den transformierten Messwerten und den Massen inder unvollständig aufgetrennten Substanzzone besteht. Der aus dem Streuverhal-ten und der Absorption zusammengefasste Koeffizient ("0) ist eine stoffspezifischeGröße, die nur von der Wellenlänge und dem Streuverhalten der Sorbensschichtabhängt. Befinden sich zwei Substanzen der Massen mA und mB in einer Zone,wird das Absorptions-Streu-Verhalten der Einzelverbindungen ein additives Ge-samtsignal zeigen, wenn ein linearer Zusammenhang zwischen den transformiertenMesswerten und den Substanzmassen besteht. Für die Substanzen A und B kanndies folgendermaßen ausgedrückt werden:

KM./Gemisch D "0A./mA C "0

B./mB :

In die wellenlängenabhängigen Messwerte des Scanners gehen beide Massenein. Unterscheiden sich die beide Substanzen in ihren Spektren, sodass die eineSubstanz (A) bei einer Wellenlänge Licht absorbiert und die zweite Verbindung (B)dort keine Absorption zeigt (ihr Messwert bei dieser Messwellenlänge also null ist),kann die Substanz A auch ohne Trennung quantifiziert werden. Hier stört SubstanzB die Messung nicht. Liegt dieser einfache Fall nicht vor, benötigt man eine zwei-te Messung, denn um zwei Unbekannte bestimmen zu können, werden mindestenszwei Gleichungen benötigt. Da in der Diodenarray-DC bei mehreren Wellenlän-gen gleichzeitig gemessen wird, ist das in der Regel kein Problem. Es werden zweiverschiedene Wellenlängen (1 und 2) so gewählt, dass sich die Absorptionen ge-nügend unterscheiden.

KM.1/Gemisch D "0A.1/mA C "0

B.1/mB

KM.2/Gemisch D "0A.2/mA C "0

B.2/mB

Sind die Koeffizienten der Substanzen A und B für beide Wellenlängen bekannt,können die Massen beider Substanzen durch zwei Messungen bei verschiedenenWellenlängen bestimmt werden. Die Werte der Koeffizienten erhält man am ein-fachsten durch Messung der Reinsubstanzen bei den entsprechenden Wellenlängen.Wenn sich nur zwei Substanzen nicht vollständig aufgetrennt haben, können alsReferenzspektren auch die auf der jeweiligen „sauberen“ Peakseite des Doppel-peaks gemessenen Spektren Verwendung finden. Rein formal lassen sich beideGleichungen durch Einsetzen ineinander lösen. Allerdings müssen sich die Ab-sorptionswerte beider Verbindungen hinreichend unterscheiden, um ein eindeutigesErgebnis zu erhalten. Wird das Zweikomponentengemisch bei mehr als zwei Wel-lenlängen vermessen, können die Konzentrationen der beteiligten Verbindungenüber eine Matrix bestimmt werden. Stehen für die Berechnung von n Unbekannten


0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Trennstrecke (mm)

lgR

a

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Trennstrecke (mm)

lgR

b

Abb. 12.16 Abgebildet sind das ursprüngliche Densitogramm mit den beiden unvollständig auf-gelösten Peaks bei einer Trennstrecke von 54 mm (siehe Abb. 12.15) (a), die zwei aus einerMehrkomponentenanalyse gewonnenen Densitogramme (b). Die Signale für Uracil und Thyminsind rechnerisch aufgetrennt [21]

m Gleichungen zur Verfügung (mit m > n), nennt man ein solches Gleichungssys-tem überbestimmt. Mit überbestimmten Gleichungssystemen wird zusätzlich dasRauschen unterdrückt. Werden die spektralen Daten als Vorfaktoren (a und b) unddie Massen als x-Werte abgekürzt, erhält man ein Gleichungssystem zweier Glei-chungen, deren Messwerte sich additiv aus zwei Teilsummen zusammensetzen.

y1 D ax11 C bx12

y2 D ax21 C bx22

12.8 Mehrwellenlängen-Spektrometrie zur Mehrkomponentenanalyse 387

Abb. 12.17 Gezeigt ist die Trennung eines Rosmarinextraktes (Rosmarini folium), getrennt aufKieselgel 60 mit dem Fließmittel Toluol/Ethylacetat/Ameisensäure (5 + 4 + 1, V / V) und mit demReagenz Tetraphenylborat-HCl. a Kontourplot aller Absorptionen, b photographische Aufnahmeder Trennung, c Kontourplot aller Fluoreszenzen

Das Gleichungssystem wird in der Matrixschreibweise zu:

ˇˇx11 x12

x21 x22

ˇˇˇˇabˇˇ D

ˇˇy1

y2

ˇˇ :

Die Determinante det(X) dieser Matrix lautet:

det.X/ D x11x22 � x12x21 :

Die Koeffizienten können nach der Cramer-Regel wie folgt bestimmt werden:

a D 1

det.X/x22y1 � x12y2 (12.10)

b D 1

det.X/x11y2 � x21y1 : (12.11)

Die Densitogramme in Abb. 2.7, 2.8, 6.9, 6.10, 6.12 und 6.20 wurden auf dieseWeise ausgewertet. Auch die unvollständige Trennung in Abb. 12.15 kann durcheine einfache Rechnung in zwei getrennte Densitogramme umgewandelt werden


(Abb. 12.16). Dazu werden zwei Spektren links (52 mm) und rechts (56 mm) derSignalflanken des nicht aufgelösten Signals aufgenommen. Bei zwei Wellenlängen(235 nm und 280 nm) werden nun über eine Mehrkomponentenanalyse zwei Densi-togramm berechnet, die in Abb. 12.16b dargestellt sind.

12.9 Neue Visualisierungsmethoden in der DC

Fluoreszenzsignale können im Bereich über 400 nm auch vom Auge wahrgenom-men werden. Unter UV-Licht (bei 365 nm Einstrahlung) lassen sich z. B. Pflanzen-extrakte nach einer Neu-Färbung durch ihre verschiedenen leuchtenden Substanz-zonen leicht unterscheiden. Eine Kombination dieser Bilder mit den entsprechendenFluoreszenzspektren erhöht den Informationsgehalt einer Darstellung.

In Abb. 12.17 ist die Trennung eines methanolischen Rosmarinextraktes abgebil-det, aufgenommen unter UV-Licht bei 365 nm. Der Extrakt wurde auf Kieselgel 60mit dem Fließmittel Toluol/Ethylacetat/Ameisensäure (5 + 4 + 1, V / V) aufgetrenntund mit dem Tetraphenylborat/HCl-Reagenz gefärbt. Die farbigen Zonen wurden

Abb. 12.18 Dargestellt ist die Trennung eines Rosmarinextraktes, getrennt auf Kieselgel und mitTetraphenylborat/HCl-Reagenz gefärbt. Abgebildet sind das Photo der Trennung (b), der Kontour-plot in Fluoreszenz (a) und zwei übereinander gelegte Densitogramme (gemessen bei 460 nm und680 nm) (c)

Literatur 389

mit den entsprechenden Fluoreszenzspektren graphisch kombiniert. Aus dem resul-tierenden Bild von Kontourplot und Farbaufnahme lassen sich viele Informationenentnehmen. Die mittlere Spur (Abb. 12.17b) zeigt das Photo der Bahn, aufgenom-men in Fluoreszenz mit einer UV-366-Anregung. Der Kontourplot der Abb. 12.17agibt die Absorptionen der Bahn im Bereich von 400 bis 800 nm wieder. Der Kon-tourplot der Abb. 12.17c stellt alle Fluoreszenzen der DC-Bahn dar. Blaue Zonenemittieren Fluoreszenzlicht unterhalb von 600 nm, rote Zonen zeigen Fluoreszen-zen zwischen 650 und 700 nm. Im Absorptions-Plot sind eine Reihe unvollständiggetrennter Bereiche erkennbar. Im Gegensatz dazu zeigt der Fluoreszenzplot nurBasislinien getrennter Signale.

Abbildung 12.18a stellt erneut den Fluoreszenz-Kontourplot der Trennung dar.Die blau fluoreszierenden Zonen zeigen signifikant andere Spektren als die ro-ten Bereiche. In Abb. 12.18c sind zwei übereinander gelegte Densitogrammeabgebildet, die bei 460 nm und 680 nm aus dem Kontourplot der Abb. 12.18aextrahierte wurden. Diese Densitogramme eignen sich zur quantitativen Auswer-tung. Die Kombination von Kontourplot, Densitogramm und Farbbild der DC-Bahn (Abb. 12.18b) erhöht den Informationsgewinn einer Trennung einfach durchGegenüberstellung der Bilder.

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13Quantitative Auswertung in der HPTLC

Ziel einer quantitativen Messung ist die Gehaltsbestimmung des Analyten. DieMesswerte müssen dazu in Gehaltswerte umgerechnet werden. Die Umrechnunggelingt, wenn die mathematische Beziehung zwischen Mess- und Gehaltswertenbekannt ist. Dieser funktionelle Zusammenhang wird durch eine Kalibrierung be-stimmt. Das Ergebnis wird in der Regel als Gehaltsbereich angegeben. Zur besserenÜbersicht werden Messsignale im Weiteren als y-Werte und Gehaltswerte als x-Werte bezeichnet.

13.1 DerMittelwert

Bei einer Analyse werden die Messwerte nicht nur durch die Masse m des Analyten(oder seine Konzentration c) beeinflusst, sondern auch durch die zufällige Fluktua-tion der Messwerte. Diese Fluktuation nennt man Rauschen. Rauschen wird erfolg-reich durch Mehrfachmessungen unterdrückt. Die Angabe eines Ergebnisbereichessetzt ebenfalls eine Mehrfachmessung voraus, und damit stellt sich die Frage, wieEinzelmessungen zueinander bewertet werden sollen. Mit guten Gründen kann manz. B. die ersten Messwerte einer Messreihe verwerfen, weil die Erfahrung mit derentsprechenden Probe erst noch gewonnen werden muss. Auch können Einzelmess-werte, die im Vergleich zu allen anderen Ergebnissen entweder zu groß oder zu kleinausfallen, mit einem Ausreißertest einfach eliminiert werden. Der entscheidendePunkt ist aber, dass wir nur Messungen ins Endergebnis übernehmen sollten, denenwir trauen. Gibt es eine gute Begründung, einem Messwert nicht zu trauen, sollteman erneut messen. Auf jeden Fall sollte man es unterlassen, aus irgendwelchenKriterien heraus Messwerte zu eliminieren, denn wir haben vor der Generierungeines Endergebnisses keine Information über den Gehalt der Probe (sonst würdenwir ja nicht messen).

Carl Friedrich Gauss (1777–1855) hat in seiner Theorie der Beobachtungsfehlervorgeschlagen, aus der Mitte aller Messwerte einen Wert so zu wählen, dass alleMesswerte zu gleichen Anteilen (also gut demokratisch) repräsentiert werden [1].Die quadratische Summe der Differenzen (SdD) zwischen einem (diese Forderung


392 13 Quantitative Auswertung in der HPTLC

erfüllenden) Erwartungswert NY und den einzelnen Messwerten soll dabei ein Mi-nimum betragen. Damit ein positiver Rechenwert erhalten wird, verlangt Gauss,dass statt der Summe der Abstände die Summe der quadratischen Abstände einMinimum ergeben soll. Dieses „Prinzip der kleinsten Quadrate“ führt bei der Mehr-fachmessung einer Probe (mit i Messungen) zu der Formel:

Xi

�yi � Y

2 � Minimum :

Um nach einer allgemein geltenden Regel das Minimum einer Formel berechnenzu können, muss diese Formel nach dem Zielwert abgeleitet und die Ableitung aufden Wert Null gesetzt werden.

@Pi

�yi � Y

2@y

D 0 D 2X

i

�yi � Y

.�1/

0 D �2X

i

yi C 2X

i

Y D � 2X

i

yi C 2nY

Nach NY aufgelöst folgt:

Y D 1

n

Xi

yi : (13.1)

Dieser (demokratische) Erwartungswert wird Mittelwert einer Messreihe ge-nannt. Er ist identisch mit dem arithmetischen Mittel einer Zahlenreihe.

Hinter dieser Art der Rechnung steht die stillschweigende Erkenntnis, dass alleMesswerte einer Messreihe gleich zu behandeln sind, da sie alle zu jeweils glei-chen, konstanten Bedingungen erarbeitet wurden. Messwerte einer Messreihe kön-nen daher nur mit einer einzigen Begründung eliminiert werden; wenn Hinweisevorliegen, dass bei der Messung die Gleichheit der Messbedingung für diesen einenMesswert nicht vorgelegen hat. In einem solchen Fall sollte der Messwert eliminiertund nach Herstellung gleicher und konstanter Messbedingungen erneut bestimmtwerden. Das mehr oder weniger willkürliche Eliminieren von Messwerten aufgrundirgendwelcher Annahmen zur Probe setzt ein Wissen über diese voraus, das durchdie Messung erst gewonnen werden soll.

13.2 Varianz und Präzision

Auch eine noch so aufwändige Versuchsgestaltung kann die Messbedingungen niekonstant halten. Damit werden sich die Einzelmesswerte einer Messreihe immervoneinander unterscheiden. Wenn die Messbedingungen aber nach bestem Wissenkonstant gehalten wurden, sind Variationen der Einzelmesswerte untereinander nurauf zufällige Veränderungen während der Messung zurückzuführen.

13.2 Varianz und Präzision 393

13.2.1 Die Definition der Varianz

Jeder Messwert trägt eine Unsicherheit aus der Messung in sich, die von Gauss alsStandardabweichung fsdv.y/g einer Einzelmessung bezeichnet wurde. Die Mess-unsicherheit eines einzelnen Messwertes kann nicht bestimmt werden. Bei zweiMesswerten kann die Differenz jedem der beiden als Unsicherheit zugeordnet wer-den. Allgemein ist die Varianz aller Einzelmessungen bestimmbar aus den minima-len Abständen dieser Einzelmesswerte zu einem ausgesuchten Wert der Messreihe.Der ausgesuchte Wert mit dem minimalen Abstand zu allen anderen Messwertenwurde schon berechnet; es ist der Mittelwert einer Messreihe.

Nehmen wir einmal an, wir messen die Probe ohne ein massen- oder konzentra-tionsabhängiges Signal. Dann lässt sich das Rauschen als direkt bestimmen.

y D 0 ˙

Für n Messungen quadriert gilt dann, wir haben einen positiven Wert, der dasRauschen beschreibt. Wir können schreiben:

nXiD1

yi2 D n2 :

Setzen wir voraus, dass alle Messungen unabhängig voneinander ablaufen, dannsind die Produkte der verschiedenen Varianzen immer null (z. B. 1 2 = 0, aber1 1 = 2). Für diesen Fall können wir schreiben:

nX

iD1

yi

!2

DnX

iD1

yi2 D n2 :

Die Summer der quadrierten Abweichungen der Einzelwerte vom Mittelwertkann so geschrieben werden:

nXiD1

.yi � NY /2 D

nXiD1

yi2 � 2

nXiD1

yiNY C

nX

iD1

NY!2

:

Mit NY D 1n

nPiD1

yi erhalten wir:

nXiD1

�yi � NY 2 D n2 � 2

nXiD1

yi

1

n

nXiD1

yi C

nXiD1

1

n

nXiD1

yi

!2

D

n2 � 2

n

nX

iD1

yi

!2

C n1

n2

nX

iD1

yi

!2

nXiD1

�yi � NY 2 D n2 � 1

n

nX

iD1

yi

!2

D n2 � 2:


Lösen wir nach dem Rauschen auf, ergibt sich:

2 D 1

n � 1

nXiD1

�yi � NY 2 : (13.2)

Für diesen Spezialfall ist das Rauschen bestimmbar. Gleichung 13.2 hat allge-meine Gültigkeit, auch für Messwerte größer als null (z. B. +z), weil wir schreibenkönnen:

nXiD1

.z C yi / � .z C NY /

�2 DnX

iD1

�yi � NY 2 :

Die Einzelvarianz der Probe beschreibt die Präzision der Einzelmesswerte. Bei ei-ner kleinen Varianz schwanken die Messwerte nur wenig um den Mittelwert. Einesolche Messreihe wird präzise genannt, im Gegensatz zu einer unpräzisen Messung,bei der die Messwerte stark um den Mittelwert schwanken, die Varianz also großist.

13.2.2 Relative Varianz

Die Einzelvarianz (Probevarianz) beschreibt die Unsicherheit eines jeden Mess-wertes in einer Messreihe. Da die Messwerte alle unter identischen Bedingungengeneriert werden, ist es berechtigt, jedem der Einzelmesswerte die gleiche Unsi-cherheit (2) zuzuschreiben. Bezieht man diese Varianz – als relative Unsicherheitder Messreihe – auf den Mittelwert, erhält man die relative Varianz (2

rel):

rel2 D 2

NY 2: (13.3)

Der Präzisionsfehler einer DC-Analytik setzt sich aus einer Reihe von Einzel-fehlern zusammen. Diese Einzelfehler als relative Varianzen setzen sich additiv zurGesamtvarianz der ganzen Arbeitskette zusammen. Die Bestimmung der relativenVarianzen der einzelnen analytischen Teilschritte ist ein mächtiges Instrument, dieSchwächen einer DC-Analytik aufzudecken. Um die Gesamtunsicherheit (den Ge-samtfehler) einer Methode zu minimieren, sollten bei der Ausarbeitung einer Me-thode alle fehlerbehafteten Einzelschritte eingehend untersucht und die Einzelfehlerminimiert werden [2–8]. Die Größe der einzelnen Varianzen ist unterschiedlich undoft auch nicht beeinflussbar. Meistens reicht es zur Optimierung einer Methode aus,die größten Werte in der Kette zu verkleinern.

Die Gesamtvarianz einer DC-Methode setzt sich aus folgenden (relativen) Ein-zelvarianzen zusammen [6, 8, 9]:

2 D 2P C 2

V C 2C C 2

D C 2E C 2

K :

13.2 Varianz und Präzision 395

2P rel. Varianz der Probeaufarbeitung

2V rel. Varianz der Probeauftragung

2C rel. Varianz der DC-Entwicklung

2D rel. Detektorvarianz (Varianz der Messung)

2E rel. Varianz der Messwertumrechnung (Linearisierung)

2K rel. Varianz der Kalibrierung

Was verbirgt sich nun hinter den einzelnen Varianzen? Der Wert der relativen Ge-samtvarianz setzt sich aus der Detektorvarianz (2

D) des Messsystems, der Unsicher-heit in der Probevorbereitung (2

P), der relativen Varianz bei der Probeauftragung(2

V) und der relativen Varianz der chromatographischen Trennung (2C) zusammen

[2–5]. Zwei Beiträge zur Gesamtvarianz werden in der Literatur selten thematisiert:die relative Varianz in der Auswertung (2

E) und die Varianz der Kalibrierung (2K)

[8]. Die Varianz der Auswertung beinhaltet alle Unsicherheiten, die nach der Mes-sung in den Daten entstehen. Die Unsicherheit einer manuellen Integration oder dieUnsicherheiten, die durch eine Flächen- oder Höhenberechnung auftreten, sind hierbeispielhaft zu nennen. Auch die Varianzen, die durch die verschiedenen Linea-risierungsalgorithmen entstehen (Abschn. 12.5), gehören in diese Kategorie. DieVarianz in der Kalibrierung ergibt sich aus der Nutzung der unterschiedlichen Ka-libriermodelle. Alle diese relativen Varianzen tragen zur Endvarianz (2) bei.

Die praktische Erfahrung lehrt, dass die Varianz der Auftragung und die Varianzin der Probevorbereitung bei weitem den größten Beitrag zur relativen Gesamt-varianz leisten. Die Unsicherheit in der Probevor- und -aufbereitung (2

P) entstehtdurch eine Vielzahl an Operationen bei der Vorbereitung der Probe für eine Auf-tragung. Sie kann vermieden werden, wenn man die Probe direkt auf die Platteauftragen kann. Die Varianz in der Auftragung (2

V) wird hauptsächlich durch ma-nuelles Applizieren der Probelösung verursacht. Hier kann ein computergesteuerterAuftrageautomat die Varianz deutlich senken. Die Unsicherheit in der chroma-tographischen Entwicklung (2

C) wird durch instabile Entwicklungsbedingungenverursacht. Diese Varianz ist häufig ein Positionsfehler bei der Detektion, verur-sacht durch inkorrekte Platzierung der Trennplatte in der Entwicklungskammer [2–4]. Dieser Fehler kann sehr gravierend sein, wenn Probe und Standard unterschied-liche Trennstrecken durchlaufen. Die Detektorvarianz resultiert durch einen nichtkorrigierten Dunkelstrom am Detektor, falsches Justieren des Lesekopfes, Ände-rungen der Schichtdicke, Positionsfehler beim Justieren des Einstrahllichtes unddas Arbeiten des Detektors selbst. Um die Varianz des Detektors zu reduzieren,empfiehlt sich bei der Verwendung einer CCD-Messeinheit das Messen bei mög-lichst niedrigen Temperaturen. Zur Vermeidung von Positionsfehlern haben sichSchlitzscanner bewährt, die bei der Diodenarray-DC als Lichtleiterarray verfüg-bar sind [8]. Die Analyse der Gesamtvarianz ist ein mächtiges Werkzeug, um dieSchwächen einer DC-Methode zu erkennen. Wie man die verschiedenen Arten derVarianz messen kann, ist in der Literatur beschrieben [1, 5]. Gesamtvarianzen von1 % bis 2 % wurden beschrieben [5]. In der Praxis ist es sehr schwierig, eine Ge-samtunsicherheit von weniger als 5 % zu erreichen.


13.2.3 Bestimmung der relativen Varianz

Als Beispiel einer für die DC typischen Methode sei die Bestimmung von Cof-fein aus Kaffee aufgeführt. Zur Bestimmung der verschiedenen Varianzen wurdeaus einer Lösung eine Probe Coffein computergesteuert und strichförmig auf ei-ne einzige Bahn aufgesprüht. Da der Kaffe ohne Probevorbereitung direkt auf dieBahn gesprüht wurde, entfällt die Unsicherheit in der Probevorbereitung (2

P D 0).Wird strichförmig mit einer Breite von 6–7 mm aufgesprüht, kann die Varianz derchromatographischen Trennung vernachlässigt werden, da die Bahn auch bei leich-tem Schräglaufen vom Scannerinterface in der Mitte vermessen wird; damit gilt2C D 0. Zur Bestimmung der Detektorvarianz wurde eine einzelne Bahn mehr-fach vermessen und das Coffeinsignal automatisch integriert [8]. Wird mit einerautomatisch integrierenden Software gearbeitet, wird jeder Peak nach gleichen Kri-terien integriert, was die Varianz auf null bringt. Ein Fehler beim automatischenSetzen der Integrationsgrenzen macht sich nur noch in der Richtigkeit bemerkbar.Die gemessene relative Standardabweichung des Detektors beträgt 0,49 %. Damitgilt 2

D D 0;492. Es wurde mit der logarithmischen Transformation ausgewertet(9.7), die die kleinste Varianz ergibt (siehe Abschn. 12.5). Die Größe der Vari-anz in der Auswertung (2

E) ist aber nicht bestimmbar. Im Anschluss wurden neunProben auf neun verschiedene Bahnen gesprüht. Die relative Varianz eines Coffein-standards, der neunmal in gleicher Menge auf verschiedenen Bahnen aufgetragen,entwickelt und vermessen wurde, berechnet sich zu 1,23 % [8]. In dieser Varianzsind die Unsicherheit der Auftragung, die Detektorvarianz und die Varianz derAuswertung enthalten. Die relative Varianz in der Auftragung (2

V) ist damit dieDifferenz zwischen der Gesamtvarianz und der Detektorvarianz mit der Varianz derMesswertumrechnung. Damit gilt:

p1;232 � 0;492 D 1;129.

Die Varianz in der Kalibrierung wurde zu 1,18 % bestimmt. Dazu wurden neunMessbahnen aufgetragen und ausgewertet. Dieser niedrige Wert deutet auf eine klei-ne Varianz in der DC-Entwicklung hin. Oft ist das nicht der Fall, besonders wennschlecht gestrichene Platten benutzt werden oder wenn zu nahe am Plattenrand auf-getragen wird. Die Probe kann z. B. auch schief laufen und es ist dann möglich,dass der Scanner die Bahn nicht zentral, sondern am Rand vermisst. R. E. Kaiserweist besonders darauf hin, dass die Chromatographie selbst oft den größten Fehlerverursacht [2–4]. Eine hohe Varianz in der DC-Entwicklung ist deshalb so gefähr-lich, weil sie häufig nicht nur einen Präzisionsfehler, sondern auch einen Fehlerin der Richtigkeit verursacht. Daher sollten Probe- und Standardbahnen immer ab-wechselnd aufgetragen werden, damit sich trotz einer eventuell großen Varianz vonBahn zu Bahn diese Unsicherheit nur in der Präzision und nicht auch in der Richtig-keit der Bestimmung bemerkbar macht [2–4]. Die Gesamtbilanz der Analyse siehtfolgendermaßen aus:

2rel P C 2

rel V C 2rel C C 2

rel D C 2rel E C 2

rel K D 2rel

D 0 C 1;1292 C 0 C 0;492 C 0 C 1;182 D 1;705:

13.3 Präzision, Richtigkeit und Genauigkeit 397

Hier zeigt sich ein entscheidender Vorteil der DC-Analytik, der greift, falls dieProbe direkt und ohne Probevorbereitung auf die Platte aufgebracht werden kann:Die Varianz der Probeaufarbeitung wird vernachlässigbar klein. Eine optimal arbei-tende DC-Methode kann damit Ergebnisse mit einem Gesamtpräzisionsfehler vonunter 2 % erreichen. In der Regel liegt der Gesamtfehler aber, auch ohne Berück-sichtigung der Unsicherheit in der Probeaufarbeitung, zwischen 2 und 5 %.

13.3 Präzision, Richtigkeit und Genauigkeit

Die Differenz zwischen dem gemessenen Gehaltswert und dem richtigen (wahren)Wert einer Probe, den man leider meist nicht kennt, wird als Messfehler bezeichnet.Ist die Abweichung zwischen dem Ergebnis einer Bestimmung und dem wahrenWert der Probe klein, wurde richtig gemessen. Bei einem merklichen Unterschiedzwischen dem Messergebnis und dem wahren Wert einer Probe, ist die Richtigkeitder Messung nicht gegeben.

Damit werden bei analytischen Messungen zwei grundsätzlich verschiedeneFehlerarten unterschieden, der Präzisionsfehler, der durch die Unsicherheit derMesshandlung entsteht und als Streuung um den Mittelwert angegeben wird, undder systematische Fehler, um den die ganze Messung falsch ist. Letzterer beschreibtdie Abweichung der Messung vom wahren Gehaltswert. Der Kehrwert des systema-tischen Fehlers wird auch als Richtigkeit bezeichnet. Der Ausdruck im Englischenist measurement trueness.

Präzisionsfehler werden durch individuell wechselnde Versuchsbedingungenverursacht, denn bei einem Präzisionsfehler liegt eine mangelnde Wiederholbar-keit vor. Daher werden Präzisionsfehler auch als „individuelle Fehler“ bezeichnet.Ein systematischer Fehler, der alle Einzelmessungen in gleichem Maße betrifft,liegt vor, falls z. B. ein Messgerät bei jeder Messung immer die gleiche Abwei-chung zeigt. Systematische Fehler können nur entdeckt werden, wenn zusätzlichmit einem anderen Messgerät oder noch besser, mit einem anderen Messverfahrengemessen wird. Auch das Zumischen einer bekannten Substanzmenge zur Probeund deren korrekte Wiederfindung kann die Richtigkeit einer Analysenmethodebelegen. Der Begriff „Genauigkeit“ (engl. measuremnet accuracy) wird verwendet,wenn eine Messung sowohl richtig als auch präzise ist.

Häufig wird versucht, durch Normierungen von Messabläufen (z. B. nach DIN)die Messfehler zu minimieren. Man sollte sich allerdings bewusst sein, dass keineProbe der anderen gleicht und damit eine Normierung allenfalls den Präzisions-fehler senken kann. Um richtige Ergebnisse zu erhalten, sollte man entsprechendder GLP-Richtlinien (gute Laborpraxis) eigenverantwortlich entscheiden, ob maneine Norm übernimmt oder als (meist einziger!) Kenner der vorliegenden Probeden Analysenablauf auf dieses spezielle Messproblem abstimmt. Im Übrigen giltin der Analytik ähnlich wie beim Schießen: Je kleiner das Ziel, um so größer dieTreffunsicherheit. Bei kleinen Konzentrationen wird die Messung ungenauer. Mess-ergebnisse aus der Spurenanalytik besitzen in der Regel eine große Varianz.


13.4 Die Standardnormalverteilung (Gauß-Funktion)

Die zufällige Verteilung von Messwerten zeigt den typischen Verlauf einer Gauß-Kurve, so wie es in Abb. 13.1 dargestellt ist. Der Geltungsbereich der Gauß-Funkti-on erstreckt sich aus abstrakten mathematischen Gründen von �1 bis +1, obwohlMesswerte selbstverständlich nie negative Werte einnehmen können. Die Gauß-Funktion oder Standardnormalverteilung wird durch folgenden Ausdruck beschrie-ben als

f .x/ D A

p

2 e� .x��/2

2�2 (13.4)

mit der Höhe

H D A

p

2 D 0;3989

A

: (13.5)

In den beiden Ausdrücken (13.4) und (13.5) steht A für die Fläche der Gauß-Funktion, H für die Höhe, für die Standardabweichung und µ für das Maximumder Funktion.

Häufigkeit

-2σ +2σ

wahrerWert

Mittelwert

zufälligerFehler

g

systematischerFehler

μ

Abb. 13.1 Gezeigt ist die Darstellung des zufälligen und systematischen Fehlers, mit dem Mittel-wert µ und der Standardabweichung einer Gauß-Funktion

13.4 Die Standardnormalverteilung (Gauß-Funktion) 399

13.4.1 Die Fläche der Gauß-Verteilung

Die Fläche A beschreibt die Summe aller Funktionswerte, also das Integral derFunktion. Die Verteilungsfunktion besitzt am Mittelwert µ ihren größten Wert H.Die Breite der Funktion, vom Wendepunkt zum Mittelwert gemessen, wird als Stan-dardabweichung bezeichnet. Die Höhe der Gauß-Funktion ist über den Kehrwertder Standardabweichung linear mit der Fläche der Funktion verbunden.

Der Bereich ˙1 um den Mittelwert umfasst 68 %, ˙2 (genau: 1,96 ) umfasst95 % und der Bereich ˙3 (genau 3,09 ) umfasst 99,8 % der Gesamtfläche einerGauß-Funktion.

Wird ein Messergebnis aus einer großen Anzahl von Einzelmessungen als Mit-telwert mit einem Intervall von ˙2 um den Mittelwert angegeben, sollte der wahreWert zu 95 % (mit einer Wahrscheinlichkeit von p = 0,95) in diesem Bereich liegen.Die Irrtumswahrscheinlichkeit ˛ berechnet sich nach der Formel ˛ D 1 � p fürdiesen Fall zu ˛ = 0,05. Die Irrtumswahrscheinlichkeit beträgt also 5 %. Geben wirein Endergebnis mit ˛ = 0,05 als µ ˙ 2 an, erwarten wir den wahren Wert mit einerWahrscheinlichkeit von 95 % in diesem Bereich.

13.4.2 Quantile der Gauß-Verteilung

Messwerte mit ihrem Vertrauensbereich werden als Bereich auf einer x-Achse dar-gestellt. Das Treffen einer Entscheidung ist statistisch gesehen die Beantwortungder Frage, ob der Funktionsbereich eine Grenze überdeckt oder nicht. Immer wennzu klären ist, ob ein Wertebereich (z. B. der Bereich Mittelwert ˙ Vertrauensbe-reich) über oder unter einem vorgegebenen Grenzwert liegt, haben wir es mit einersogenannten einseitigen Testfrage zu tun. Statistisch gesehen wird dabei geprüft, obder als Gauß-Fläche dargestellte Vertrauensbereich den Grenzwert überlappt odernicht. Diese Fragestellung ist typisch für die Beantwortung der Frage, ob ein Grenz-wert überschritten wurde, also die Ungleichung (Vertrauensbereich > Grenzwert)gilt.

Mathematisch ausgedrückt entspricht das Integral der Standardnormalverteilungvon �1 bis zu einer oberen Grenze z˛ genau dem Wert (1 � ˛).

F.z/ D 1 � ˛ Dz˛Z

�1

A

p

2 e� .z��/2

2�2 dz

Die obere Grenze (Schranke) wird als Quantil z˛ bezeichnet. Die Restfläche

F.z/ D ˛ D1Z

x˛

A

p

2 e� .z��/2

2�2 dz

entspricht einer statistischen Irrtumswahrscheinlichkeit. Wenn die Frage lautet, obein Grenzbereich innerhalb gewisser Grenzen liegt, so ist zu fragen, ob der Ver-


1 ‒ α α

α α1 ‒ 2α

Einseitige Testung (α = 0,05)

Zweiseitige Testung (α = 0,05)

a

b

Abb. 13.2 Dargestellt ist eine einseitige Testfrage (für ˛ = 0,05) (a) und eine zweiseitige Test-frage (für ˛ = 0,05) (b). Bei der zweiseitigen Testung muss also in der Tabelle bei einem˛ = 0,05 + 0,05 = 0,1 nachgesehen werden

trauensbereich einer Messung innerhalb oder außerhalb dieser Grenzen liegt. Hiermuss ein zweiseitiger Test angewendet werden. Mathematisch gesehen muss dieFrage beantwortet werden, ob der Vertrauensbereich zwischen zwei Grenzen liegt.Bei einer gewählten Irrtumswahrscheinlichkeit ˛ haben wir zwei Integrationsgren-zen. Die Fläche unter der Funktion der Standardnormalverteilung ist das Integralvon der unteren Grenze �z˛/2 bis zur oberen Grenze +z˛/2 (Abb. 13.2).

F.z/ D 1 � ˛ DCz˛=2Z

�z˛=2

A

p

2 e� .z��/2

2�2 dz

Eine typische zweiseitige Fragestellung ist ebenfalls die Frage, ob zwei Werteinnerhalb ihrer Unsicherheit gleich sind. Hier muss gefragt werden, ob die beidenUngleichungen (Vertrauensbereich Grenzwert) und (Vertrauensbereich Grenz-wert) gelten. Es müssen also zwei Fragen beantwortet werden, ob etwas „größeroder gleich“ bzw. „kleiner oder gleich“ ist. Auch das ist die Frage nach einer zwei-seitigen Entscheidung. Dies kommt von dem Wort „gleich“ in der Fragestellung.Fragen wir, ob etwas „gleich“ ist, müssen wir beantworten, ob ein Wert „über“ oder„unter“ etwas liegt. Erst wenn beide Fragen verneint werden, ist das „gleich“ bestä-

13.4 Die Standardnormalverteilung (Gauß-Funktion) 401

tigt. Soll diese Frage mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von ˛ = 0,05 beantwortetwerden, wird nach der Fläche der Standardnormalverteilung von (1 � 2˛) gefragt!

Die Schranken von z˛ der Normalverteilung sind üblicherweise vertafelt. Da-bei wird die Irrtumswahrscheinlichkeit einseitiger Fragestellungen ˛ vorgegeben,ebenso wie der Vertrauensbereich p = 1 � ˛ oder für zweiseitige Fragestellungenp = 1 � 2˛. Gesucht ist dabei die zugehörige Schranke der Verteilungsfunktion z˛

bzw. z˛ /2. Zur Berechnung von z˛-Werten wird üblicherweise die Approximations-formel nach Hastings angewendet.

z D q � a0 � q.a1 C a22q/

1 C q.b1 C q.b2 C qb3//(13.6)

mitq D

p�2 ln.1 � p/ :

a0 = 2,515517a1 = 0,802853a2 = 0,010328b1 = 1,432788b2 = 0,189269b3 = 0,001308

Die Approximationsformel gilt für 0,5 < p < 1. Für den Fall 0 < p < 0,5 erhält manspiegelbildlich negative Werte, entsprechend zp = �z1�p. Für den Trendtest nachvon Neumann werden diese z˛-Werte ebenfalls zur Schrankenberechnung benötigt.

13.4.3 Test auf Normalverteilung

Am Anfang einer jeden statistischen Auswertung sollte die Frage stehen, ob die ge-wonnenen Daten konsistent mit einer Normalverteilung sind. Dazu können (nebender Anwendung bestimmter Tests wie des Kolmogoroff-Smirnov-Lilliefors-Tests)die Daten normiert und graphisch direkt mit den Daten der Normalverteilung ver-glichen werden (Quantile-Quantile-Plot). Nehmen wir als Beispiel acht Messdateny1 bis y8 aus einer Chlormequat-Fluoreszenzmessung (500-ng-Auftragung, Peak-flächen: 2,974, 2,773, 2,728, 2,988, 3,099, 3,169, 3,219, 3,356). Der Mittelwertdieser Messreihe berechnet sich zu Y = 3,0383 und die Standardabweichung zusdv = 0,21636. Nun wird der Mittelwert von den Messdaten abgezogen und dieserWert durch die Standardabweichung geteilt. Damit sind die Daten entsprechend derNormalverteilung normiert, denn der Mittelwert der Messreihe liegt jetzt bei null.

Nun werden die Quantile der Standardnormalverteilung für unterschiedlichep-Werte berechnet. Dazu werden acht p-Werte gleicher Abstände (p1 = 0,0625,p2 = 0,1875, p3 = 0,3125, . . . , p8 = 0,9375) in (13.6) eingesetzt und die dazugehöri-gen Quantile (zp-Werte) berechnet. Diese werden graphisch gegen die nach Größesortierten normierten Messwerte aufgetragen. Sind die Messwerte „gaußverteilt“,ergibt sich eine Gerade, die durch den Ursprung verläuft (Abb. 13.3).


-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

-2 -1 0 1 2

(xi-X

)/sdv

Quantile (zpi)

Abb. 13.3 Dargestellt ist der Q-Q-Plot für acht Messwerte

Die Darstellung zeigt sehr schön, dass ein Wert aus der Geraden herausfällt. Mankann diese Art der Testung auch als Ausreißertest anwenden, um missliebige Datenzu eliminieren.

13.5 Die Student-Verteilung (t-Verteilung)

Streng genommen gehorchen die Messwerte einer Messreihe nur dann einer Stan-dardnormalverteilung, wenn sie voneinander unabhängig gewonnen wurden. W. S.Gosset wies im Jahre 1908 unter dem Pseudonym Student nach, dass der Funkti-onsverlauf bei einer reduzierten Anzahl der Messwerte etwas flacher und breiterverläuft als bei einer Gauß-Verteilung. Sie gehorchen der sogenannten Student-Verteilung, die häufig auch als t-Verteilung bezeichnet wird [1]. Bei analytischenMessreihen liegt immer eine endliche Anzahl von Messwerten vor. Daher darf inder Regel nicht die Standardnormalverteilung, sondern nur die Student-Verteilungzur Beschreibung der Daten reduzierter Messreihen verwendet werden. Der Schätz-wert für die Varianz einer Messreihe fvar.y/g geht erst ab etwa 30 Einzelmessungenin die Varianz ( ) der Standardnormalverteilung über.

2 Š var.y/n>30

Bei Messreihen mit weniger als 30 Messwerten muss daher immer mit der Stu-dent-Verteilung gearbeitet werden. Man bezieht sich dann zwar auf die Gauß-Ver-teilung, korrigiert diese bei Berechnungen der Vertrauensbereiche jedoch mit einemFaktor.

13.6 Fehlerfortpflanzung in der DC 403

Tab. 13.1 Aufgelistet sind die Student-Faktoren für die Irrtumswahrscheinlichkeiten von ˛ = 0,05,0,01 und 0,002

˛ = 0,05 ˛ = 0,01 ˛ = 0,002

1 12,706 63,657 318,309

2 4,303 9,925 22,327

3 3,182 5,841 10,214

4 2,776 4,604 7,173

5 2,571 4,032 5,893

6 2,447 3,707 5,208

7 2,365 3,499 4,785

8 2,306 3,355 4,501

9 2,262 3,250 4,297

10 2,228 3,169 4,144

11 2,201 3,106 4,025

12 2,179 3,055 3,930

. . . . . . . . . . . .

60 2,000 2,660 3,232

. . . . . . . . . . . .

1 1,960 2,576 3,090

Dieser Umrechnungsfaktur wird als Student-Faktor t(f, ˛ ) bezeichnet und hängtsowohl von der Irrtumswahrscheinlichkeit ˛ ab, mit der das Messergebnis ange-geben werden soll, als auch von der verbleibenden Anzahl an Freiheitsgeraden (f )dieser Messreihe. In Tab. 13.1 sind die Student-Faktoren für drei verschiedene Irr-tumswahrscheinlichkeiten aufgelistet.

222 D t2.˛D0;05;f /var.y/n<30 (13.7)

Die Anzahl der Freiheitsgrade bestimmt sich aus der Anzahl der Messwerte mi-nus der aus der Messreihe schon gewonnenen Daten. Wird z. B. aus einer Messreihemit n Daten nur der Mittelwert bestimmt, bleiben f = n � 1 Freiheitsgrade übrig.

13.6 Fehlerfortpflanzung in der DC

Die Varianz wurde als Streumaß einer Messreihe eingeführt. Man kann mit gutenGründen davon ausgehen, dass Messwerte immer normalverteilt sind und jedemEinzelmesswert eine (aus einer Messreihe bestimmbare) mittlere Messunsicherheitvon ˙ zugeschrieben werden kann.

Die Frage ist nun, wie sich die Varianz (bzw. die Standardabweichung) einesEndwertes ändert, wenn dieser aus den Messergebnissen mehrerer Messreihen be-rechnet wird. Betrachten wir als Beispiel die Berechnung des Mittelwertes aus


zwei Einzelmessungen. Jede der beiden Messungen (m1 und m2) soll die gleicheMessunsicherheit besitzen. Wie machen sich beide Unsicherheiten im Endergebnisbemerkbar?

mend D .m1 C m2/=2

Wird die Messunsicherheit ˙ berücksichtig, kann man schreiben:

2mend ˙ 2end D m1 ˙ 1 C m2 ˙ 2 :

Für die Unsicherheit des Endergebnisses gilt damit:

˙2end D ˙1 ˙ 2 :

Um die lästigen Vorzeichen zu beseitigen, wird die Gleichung quadriert.

42end D 2

1 C 22 C 212

Das Produkt aus den beiden Standardabweichungen (12) wird Covarianz ge-nannt. Werden beide Messwerte unabhängig voneinander bestimmt, ist die Unsi-cherheit der ersten Messung bei der zweiten null, da beide Messungen nichts mit-einander zu tun haben. Damit ist die Covarianz zweier unabhängig durchgeführterMessungen immer null. Man kann sich dies am Beispiel zweier aufeinanderfolgen-der (also zeitlich unabhängiger) Messereignisse klar machen: Wird nur der ersteMesswert bestimmt, ist die Messunsicherheit im zweiten null, da ja noch nicht ge-messen wurde. Das Produkt aus beiden Unsicherheiten ist damit ebenfalls null.Covarianzen sind immer null, wenn die Fehler nicht gleichzeitig gemacht wer-den. Vereinfacht kann daher für den Fall voneinander unabhängiger Messungengeschrieben werden:

42end D 2

1 C 22 :

Mit den beiden partiellen Ableitungen:

�@mend

@m1

�D 1I

�@mend

@m2

�D 1

gilt folglich auch:

42end D

�@mend

@m1

�2

21 C

�@mend

@m2

�2

22 :

Das auf Gauss zurückgehende Fehlerfortpflanzungsgesetz wird in seiner all-gemeinen Form folgendermaßen formuliert: Die Varianz einer Funktion berech-net sich, indem die Funktion nach allen fehlerbehafteten Größen abgeleitet undquadriert wird. Dieser Ausdruck wird mit der Varianz der fehlerbehafteten Größemultipliziert. Die entsprechenden Zwischenglieder (Covarianzen) sind – wie obenausgeführt – bei unabhängig voneinander durchgeführten Messungen in der Regel

13.7 Kalibriermodelle 405

null. Kompliziert werden Rechnungen, bei denen Covarianzen berücksichtigt wer-den müssen.

Für die Varianz eines Mittelwertes aus n Messwerten mit der jeweiligen Mes-sunsicherheit von ˙ eines jeden Einzelmesswertes gilt damit:

2NY

DnX

iD1

24

@Y

@yi

!2

2i

35 D

�12

n21

2 C : : : C 12

n22

n

�

D n1

n22

2NY

D 1

n2:

(13.8)

Für Messreihen mit weniger als 30 Einzelmesswerten folgt:

var. NY / D 1

nvar.y/ : (13.9)

Der Vertrauensbereich um einen Mittelwert, unter Berücksichtigung des jeweili-gen Studentfaktors, berechnet sich damit zu:

sdv. NY / D 1pn

sdv.y/ : (13.10)

Mit anderen Worten: Durch n Mehrfachmessungen kann das Rauschen um denFaktor

pn reduziert werden.

13.7 Kalibriermodelle

Die Bestimmung des funktionellen Zusammenhangs zwischen Masse, Stoffmengeoder Konzentration und dem Messsignal wird Kalibrierung genannt. Dieses Ver-fahren funktioniert natürlich nur, wenn solch ein funktioneller Zusammenhang auchvorliegt. Es sollte nicht von einer Eichung gesprochen werde, da diese Form der(definitionsgemäß richtigen!) Festlegung nur Behörden wie Eichämtern erlaubt ist.Allgemein beschreibt man die Kalibrierungsfunktion als:

y D f .x/ :

Löst man die Kalibrierfunktion nach x auf, erhält man die analytische Funktion.Das Endergebnis ist dann eine Funktion der Messwerte y.

fxag D f �1.y/

Werden die Messwerte eingesetzt, erhält man das analytische Endergebnis x.


13.7.1 Lineare Kalibrierung (Geradenausgleich)

In vielen Lehrbüchern zur Statistik wird bei einer linearen Abhängigkeit zwischenMess- und Gehaltswerten eine Ausgleichsrechnung über folgende Geradenglei-chung vorgenommen [1].

y.x/ D b C ax :

Mit a wird die Steigung der Geraden (die Messempfindlichkeit) und mit b derenAchsenabschnitt bezeichnet. Bei einer Kalibrierung steht x für die Konzentratio-nen, die Massen oder Stoffmengen, die die Messwerte y verursachen. Nach Gausskann man die Ausgleichsfunktion am besten über die quadrierten Abweichungenberechnen. Diese sollen ein Minimum einnehmen.

SSr DnX

iD1

.yi � y.x//2 D Minimum

Die Ableitung von Ssr nach dem Achsenabschnitt b ergibt:

@SSr

@bD @

@b

nCXiD1

.yi � b � axi/2 D 0

@SSr

@bD

nCXiD1

2 .yi � b � axi/ .�1/ D

�2

nCXiD1

yi C 2nCb C 2a

nCXiD1

xi D 0:

Teilt man beide Seiten durch 2 und formt nach b um, ergibt sich:

b D 1

nC

nCXiD1

yi � a1

nC

nCXiD1

xi D YC � aXC :

Bei einer Kalibrierung ist diese Geradengleichung nur in dem durch xmin undxmax festgelegten Arbeitsbereich definiert. Außerhalb dieses Arbeitsbereiches lassensich keine Aussagen über den Verlauf der Kalibriergeraden machen, auch wenn dortdie Gerade mathematisch eindeutig beschrieben ist. Der Achsenabschnitt b steht fürden Messwert der Stoffmenge null und liegt somit immer außerhalb des Arbeits-bereiches [1]. Ein Messwert wird definitionsgemäß immer durch eine Stoffmengehervorgerufen. Oft wird aber die obige Formel in der Weise interpretiert, dass einMesswert ohne Stoffmenge als „Blindwertbestimmung“ oder „Blankmessung“ demWert b zugeordnet wird. Diese Sicht der Dinge beinhaltet einige Probleme. Umeinen Messwert als Blindwert identifizieren zu können, muss sichergestellt sein,dass keine Substanz, eventuell als Verunreinigung, das Messsignal verursacht. Da-mit stellt sich das Problem, dass eine Messung etwas bestimmen soll, was nichtvorhanden ist. Eindeutig messbar ist aber nur ein eindeutiges Signal. Wird bei einer


5Y-axis

4

3

2

1

{a0}

z

u

X-axis

Y(x)=YC+ a(x-XC)

z=(y-YC)

x/y:XC/YC u/z:0/0

u=(x-XC)

XCXmin Xmax

*

**

*

** *

*

**

5 10 15 20 25

Abb. 13.4 Dargestellt ist die Verschiebung einer linearen Kalibrierfunktion y(x) = ax + b zur Funk-tion Y.x/ D YC C a.x � XC/

Messung kein Signal detektiert, ist der Schluss auf Abwesenheit einer Substanz lo-gisch nicht zwingend. Wird eine Substanzmenge mehrfach vermessen, ergibt sicheine Signalverteilung entsprechend einer Gauß-Kurve. Dies ist die Grundlage derhier vorgestellten Fehlerrechnung. Für eine Mehrfachmessung der Stoffmenge nullkann dies nicht gelten, da ein resultierendes Gauß-Signal mit dem Maximalwertnull auch negative Stoffmengen umfassen müsste. Der Wert für den Achsenab-schnitt b ist damit fehlertheoretisch nicht behandelbar. Erschwerend kommt für dieAnalyse von Messdaten nach der obigen Geradengleichung hinzu, dass die beidenAusgleichsparameter a und b statistisch nicht voneinander unabhängig sind.

Den analytischen Forderungen besser gerecht wird eine Geradengleichung, diedurch die Steigung (Empfindlichkeit des Messverfahrens) und den Datenschwer-punkt der Messreihe (als optimaler Messwert) beschrieben wird. Man kann daserreichen, wenn der Nullpunkt der Gleichung y(x) = b + ax von 0/0 auf YC=XC

verschoben wird. Diese neue lineare Kalibriergleichung vermeidet den Ausdruck„Achsenabschnitt“ [5, 7, 9–11].

Y.x/ � YC D a.x � XC/ (13.11)

Das Vorgehen ist in Abb. 13.4 dargestellt.

13.7.2 Bestimmung der Datenschwerpunkte

Im Sinne der Minimierung der Summe der quadratischen Abweichungen SdD (Sum-me der Differenzen) errechnet sich der Wert Y c (bzw. analog der Wert Xc) für nC


Messwerte nach der Gleichung zu:

SSr DnX

iD1

�xi � XC

2 D Minimum :

Die Abkürzung xi steht dabei für die Einzelwerte (in x) einer Messreihe. Für diebeiden Schwerpunkte XC und YC folgt:

@SSr

@XCD @

@XC

nCXiD1

�xi

2 � 2xi XC C XC2�

D �2

nCXiD1

xi C 2nCXC D 0 :

Die Datenschwerpunkte YC (und XC) sind nach folgenden Formeln berechenbar:

YC D 1

nC

nCXiD1

yi (13.12)

und

XC D 1

nC

nCXiD1

xi : (13.13)

Per definitionem werden nur Messwerte, also nur y-Werte, als fehlerbehaftet be-trachtet. Natürlich sind die Einwaagen und damit die Substanzwerte (x-Werte) einerKalibrierung fehlerbehaftet, da auch sie durch eine in der Regel fehlerbehafteteHandlung zustande kommen. Die bei der Einwaage und der Auftragung gemachtenFehler pflanzen sich jedoch in die Messwerte fort und werden dort berücksichtigt.Die mittlere Streuung aller Messwerte einer Messreihe, also die Einzelstreuungdes einzelnen Messwertes, errechnet sich aus der Fehlerquadratsumme der Aus-gleichsfunktion, geteilt durch die Anzahl der Freiheitsgerade (f ). Zur Bestimmungder Fehlerquadratsumme werden alle quadratischen Abweichungen zwischen denEinzelmesswerten und den mit der Ausgleichsfunktion berechneten theoretischenWerten aufsummiert. Die Zahl f bezeichnet die Anzahl der Messdaten minus derAnzahl der Daten, die aus dieser Datenmenge schon gewonnen wurde. Bei der Mit-telwertsbildung gilt (wegen nur einer Rechenoperation, der Festlegung von YC) derAusdruck f = n � 1. Für die Varianz var(y) einer Messreihe, bei der die Steigung aund der Datenschwerpunkt YC festgelegt werden, folgt so:

var.y/ D SsR

fD 1

nC � 2

nCXiD1

�yi � YC � a.xi � XC/

2: (13.14)

Die Messdaten werden an die Ausgleichsfunktion (13.11) angeglichen. Der Frei-heitsgrad berechnet sich damit zu f = nc � 2.


13.7.3 Bestimmung der Geradensteigung

Die Standardabweichung eines Einzelwertes berechnet sich aus der Wurzel derVarianz. Der Regressionskoeffizient a wird ebenfalls über eine Minimierung derSumme der quadratischen Abweichungen ermittelt. Mit

SdD DnCX

iD1

.yi � Y.x//2 D Minimum

folgt durch Einsetzen und Ableiten von SdD nach a:

@SdD

@aD @

@a

nCXiD1


2 D 0

@SdD

@aD

nCXiD1

2�yi � YC � a.xi � XC/

��.xi � XC/

DnCX

iD1

�2�yi � YC

�xi � XC

C 2a

nCXiD1

�xi � XC

2 D 0:

Für die Bestimmung von YC wird analog vorgegangen.

@SdD

@YCD @

@YC

nCXiD1


2 D 0

@SdD

@YCD

nCXiD1

2�yi � YC � a.xi � XC/

.�1/ D 0

D �2

nCXiD1

yi C 2�nCYC

C 2a

nCXiD1

�xi � XC

D 0

Die beiden erhaltenen Gleichungen zur Bestimmung von a und YC lauten zu-sammengefasst und jeweils durch 2 gekürzt:

nCYC C a

nCXiD1

�xi � XC

DnCX

iD1

yi

0YC C a

nCXiD1

�xi � XC

2 DnCX

iD1

�yi � YC

�xi � XC

:

Damit kann die Bestimmung von a und YC durchgeführt werden, denn es stehenzwei Gleichungen für zwei Unbekannte zur Verfügung. Zu beachten ist, dass ausder Definition des Datenschwerpunktes XC folgt:

nCXiD1

�xi � XC

D 0 :


Als Matrix geschrieben folgt:

ˇˇ nC C 0

0 CnCP

iD1

�xi � XC

2ˇˇ ˇˇYC

a

ˇˇ D

ˇˇˇ

nCPiD1

yi

nCPiD1

.yi � YC/ .xi � XC/

ˇˇˇ :

Die Matrix wird abgekürzt geschrieben:ˇˇnC 0

0 Sxx

ˇˇˇˇYC

a

ˇˇ D

ˇˇP

yi

Sxy

ˇˇ :

Diese Matrizengleichung kann, wie in Abschn. 12.8 beschrieben, über die Cra-mer-Regel aufgelöst werden. Die Determinante von S berechnet sich zu det.S/ DnCSxx �02. Die inverse Matrix S�1 erhält man aus der invertierten S-Matrix, geteiltdurch die Determinante (Cramer-Regel). Für den Ausdruck S�1Y folgt:

S�1Y DˇˇYC

a

ˇˇ D 1

nCSxx

ˇˇSxx 0

0 nC

ˇˇˇˇP

yi

Sxy

ˇˇ :

Damit folgt für YC aus der oberen Reihe der inversen Matrix sofort die schonabgeleitete Gleichung:

YC D 1

nCSxx

Sxx

Xyi D 1

nC

nCXiD1

yi : (13.15)

Den Ausdruck für die Steigung a (die Methodenempfindlichkeit) kann völliganalog aus der Matrix abgelesen werden:

a D 1

nCSxx

nCSxy D Sxy

Sxx

: (13.16)

13.7.4 Varianzbestimmung der Steigung und des Schwerpunktes

Zur Berechnung von a und YC ist die Schreibweise der Gleichungen als Matrix nichtunbedingt nötig, da das Ergebnis aus dem Gleichungssystem auch ohne großenAufwand direkt abgeleitet werden kann. Zur Berechnung des Vertrauensbereichesder Analysenfunktion ist die Schreibweise als Matrix jedoch nützlich, denn dieinverse Matrix S�1, multipliziert mit der Varianz der Einzelwerte, beschreibt dieVarianz-Covarianz-Matrix des Gleichungssystems. Diesen Sachverhalt drückt fol-gende Gleichung aus:

ˇˇ var.YC/ cov.YC; a/

cov.a; YC/ var.a/

ˇˇ D 1

nCSxx

ˇˇSxx 0

0 nC

ˇˇ var.y/ : (13.17)

13.8 Der F-Test 411

Aus der Varianz-Covarianz-Matrix stehen alle Varianzen der Regressionspara-meter zur Berechnung des Vertrauensbereiches der Kalibrierfunktion unmittelbarzur Verfügung. Aus der Gleichung ist auch direkt ersichtlich, dass die Covarian-zen zwischen YC und a jeweils null sind. Die Varianzen der Regressionsparameterergeben sich zu:

var.YC/ D 1

nCvar.y/ : (13.18)

beziehungsweise

var.a/ D 1

Sxx

var.y/ : (13.19)

Hier sei ein kurzer Einschub erlaubt. Wird eine Geradengleichung der FormY = ax + b verwendet, stehen an den Stellen der Covarianzen die Werte ˙xi und�˙xi. Die beiden Ausgleichsparameter a und b sind also nicht voneinander unab-hängig.

13.8 Der F-Test

Zu beachten ist, wie var(y) berechnet wird. Nach der oben angegebenen Definitionbeschreibt var(y) das geschätzte Streumaß der Stichprobe, also die mittlere Einzel-varianz eines jeden Messwertes. Aus den Kalibrierungsdaten werden die zwei Wertea und YC festgelegt. Die Varianz der Einzeldaten, aus der Differenz der Messwertezu den berechneten Werten bestimmt, wird durch nC � 2 geteilt.

var.y/ D SdD

nC � 2D 1

nC � 2

nCXiD1


2

Hieraus folgt eine wichtige Einschränkung für eine Kalibrierung nach demModell der linearen Regression. Die vorgestellte Formel darf nur verwendet wer-den, wenn die Varianzen der Einzelmesswerte im ganzen Bereich der Kalibrierunggleich groß sind. Diese Forderung wird auch als Homoskedastizität bezeichnet [5,7–12].

Zur Überprüfung dieser Forderung müssen die Varianzen an den verschiedenenStellen der Kalibrierungsgeraden mindestens einmal verglichen werden. Dazu wer-den die Varianzen an den Extremwerten der Geraden durch mindestens sechs Mess-werte bestimmt. Die Messungen an den Rändern des Arbeitsbereiches reichen zurÜberprüfung der Homoskedastizität aus, da die Streuung der Daten innerhalb desArbeitsbereiches entweder konstant ist oder kontinuierlich zu- oder abnimmt. Damitwird der Fisher’sche F-Test am schärfsten, wenn die Messungen an den Grenzen desArbeitsbereiches vorgenommen werden. Die statistische Fragestellung lautet nun:Sind jeweils zwei der gemessenen Varianzen gleich, gilt also var(yA) = var(yB)? Be-kannt ist, dass der Quotient zweier Varianzen der Fisher’schen F-Verteilung folgt:

TF D var.yA/

var.yB/: (13.20)


Tab. 13.2 Aufgelistet sind die Werte der F-Verteilung für die Irrtumswahrscheinlichkeit ˛ = 0,05für verschiedene Freiheitsgrade

FN/FD 2 3 4 5 6 7 8

2 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37

3 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85

4 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04

5 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82

6 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15

7 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73

8 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44

Es muss beachtet werden, dass TF > 1 gilt und damit der größere Varianzenwertim Zähler stehen muss. Die Prüfgröße TF wird direkt mit der Schranke der F-Vertei-lung (bei gegebenen Freiheitsgraden und vorgegebener Irrtumswahrscheinlichkeit)verglichen. Dabei wird mit f N (Freiheitsgrad Zähler) und f D (Freiheitsgrad desNenners) bei vorgegebener Irrtumswahrscheinlichkeit 2˛ /2 mit dem Wert der F-Ver-teilung verglichen (Tab. 13.2). Liegt die berechnete Prüfgröße über der Schranke,dürfen die Varianzen der Kalibrierung nicht zusammengefasst werden. In diesemFall muss der Kalibrierungsbereich neu, und damit in der Regel kleiner, gewähltwerden.

13.9 Der Vertrauensbereich imModellder „linearen Regression“

Wegen der endlichen Datenzahl muss – wie schon diskutiert – statt mit der Normal-verteilung mit der Student‘schen t-Verteilung gerechnet werden. Hierbei bezeichnettc den Student-t-Faktor, der von der gewählten Irrtumswahrscheinlichkeit ˛ undvon der Anzahl der Freiheitsgrade abhängt. Bei dem Modell der „linearen Re-gression“ ist – wie schon erwähnt – die Anzahl der Freiheitsgrade f = n � 2, damit der Steigung a und dem Datenschwerpunkt YC zwei Ausgleichsparameter ausden Messdaten festgelegt wurden. Die Standardabweichungen müssen mit demStudent-t-Faktor korrigiert werden. Dementsprechend werden alle Varianzen derEinzelwerte um das Quadrat des t-Faktors ergänzt. Die Gesamtvarianz des Aus-gleichmodells „lineare Regression“ berechnet sich, indem der Ausdruck nach allenfehlerbehafteten Größen abgeleitet und quadriert wird. Da keine Covarianzen exis-tieren, vereinfacht sich die Rechnung.

vary.x/ D�

@y.x/

@YC

�2

var.YC/ C�

@y.x/

@a

�2

var.a/

D var.y/

nCC .x � XC/

2 var.y/

Sxx

13.10 Die Analysenfunktion der linearen Regression 413

ng

15

12

9

6

3

**

**

**

*

*

*

*

100 200 300 400 500

Abb. 13.5 Dargestellt ist der Vertrauensbereich einer Kalibrierung, berechnet nach dem Aus-gleichsmodell „lineare Regression“

Den Analytiker interessiert mehr der Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion.Der Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion (auch Konfidenzintervall genannt) fürdas Ausgleichsmodell „lineare Regression“ ergibt sich durch Einsetzen der Gera-dengleichung (13.11) zu:

cnf fy.x/g D y.x/ ˙ tC

svar.y/

nCC�Y.x/ � YC

2a2Sxx

var.y/ : (13.21)

Anschaulich setzt sich der Vertrauensbereich (das Vertrauensband oder auchKonfidenzintervall genannt) aus der Unsicherheit der Daten in y-Richtung und derUnsicherheit der Steigung zusammen. Der Vertrauensbereich ist damit eine von xabhängige Funktion der Standardabweichung. Am Datenschwerpunkt YC ist dasVertrauensband am schmalsten (Abb. 13.5). Hier wird die kleinste Unsicherheit imEndergebnis erhalten und hier sollte der Messwert des Analyten liegen.

13.10 Die Analysenfunktion der linearen Regression

Nach der Aufstellung der Kalibrierfunktionen erfolgt die eigentliche Analyse. Miteiner Mehrfachbestimmung von na Messungen wird die Probe vermessen und derMittelwert YA nach folgender Formel berechnet:

YA D 1

na

naXiD1

yi :


Anschließend wird der Mittelwert der Messung in die Kalibrierfunktion einge-setzt und auf den gesuchten Gehalt umgerechnet. Graphisch werden die y-Werte(die Messwerte) an der Kalibrierfunktion auf die Achse der x-Werte (Gehaltswer-te) gespiegelt. Der Gehalt xa der Probe berechnet sich beim Modell der linearenRegression aus der Kalibrierfunktion zu:

fxagLR D Ya � YC

aC XC : (13.22)

Die Varianz des Endergebnisses ergibt sich wiederum entsprechend der Me-thode des Gauß’schen Fehlerfortpflanzungsgesetzes. Dazu müssen die Ausdrückeder Analysenfunktionen nach den fehlerbehafteten Größen abgeleitet und quadriertwerden. Für den Ausdruck der linearen Regression folgt:

varfxagLR D�

@fxagLR

@YC

�2

var.YC/ C�

@fxagLR

@a

�2

var.a/ C�

@fxagLR

@Ya.x/

�2

var.Ya/ :

Covarianzglieder zwischen den Daten der Kalibrierung und der Analysenmes-sung existieren nicht, da beide Messreihen unabhängig voneinander durchgeführtwerden. In der DC werden Kalibrierungsdaten und Analysendaten zwar auf einerPlatte vermessen, aber mit unterschiedlichen Auftragungen. Zur Vermeidung vonCovarianzen muss daher nur sichergestellt werden, dass beim Scannen einer Bahnnicht die Nachbarbahn teilweise mitgemessen wird. Ohne Covarianzglieder folgtfür die Gesamtvarianz der Analysenfunktion:

varfxagLR D var.YC/

.�a/2C

Ya � YC

�a2

!2

var.a/ C var.Ya/

a2:

Die Varianz der Analysenwerte berechnet sich dabei analog zu (13.18).

var.Ya/ D 1

na

var.y/

Vom Wert her sollte die Varianz der Messwerte (var(y)) der Varianz der Einzel-messwerte aus der Kalibrierung entsprechen, denn Kalibrierungsdaten und Analy-sendaten werden mit der gleichen Messmethode im gleichen Messbereich ermittelt.Werden die Ausdrücke für var.YC/ und var(a) mit den entsprechenden Student-t-Faktoren eingesetzt, folgt für den Vertrauensbereich der Messung nach dem Modellder linearen Regression:

varfxagLR D var.y/

a2

"tna�1

2

na

C tnc�22

nc

C tnc�22�Ya � YC

2a2Sxx

#:

13.10 Die Analysenfunktion der linearen Regression 415

cnf{x1}

cnf{x2} > cnf{x1}

cnf{x2}

var(y2 ) = var(y1)

var(y1)

var(y2)

*

*

*

**

*

**

*

Abb. 13.6 Dargestellt ist der Vertrauensbereich einer Kalibrierung, berechnet nach dem Modell„lineare Regression“. An der Geraden gespiegelt sind normalverteilte Messwerte. Die Unsicher-heiten in den umgerechneten Gehaltswerten setzen sich aus den Messunsicherheiten der Probe undder Kalibriergeraden zusammen

Durch Einsetzen der Kalibrierfunktion folgt:

cnffxagLR D Xa ˙vuutvar.y/

a2

"tna�1

2

na

C tnc�22

nc

C tnc�22�fxagLR � XC

2Sxx

#:

(13.23)Da sich die Anzahl der Kalibriermessungen und die Anzahl der Probemessungen

in der Regel unterscheiden, müssen unterschiedliche Student-t-Faktoren und even-tuell auch unterschiedliche Freiheitsgrade für Kalibrierung und Analyse eingesetztwerden. In Abb. 13.6 ist die Umrechnung über (13.23) graphisch dargestellt. Vor-gegeben ist die Unsicherheit zweier Messungen, die mit den Varianzen var(y1) undvar(y2) gleich groß sein sollen.

Die Umrechnung der Messwerte in Gehaltswerte entspricht graphisch einerSpiegelung an der Kalibriergeraden. Der Vertrauensbereich der Kalibriergeradenist im Schwerpunkt kleiner als an den Extremwerten. Damit wird auch die Unsi-cherheit der zu Gehaltswerten umgerechneten Messwerte im Schwerpunkt kleinerals im Bereich der Extremwerte. Damit gilt conffx1g < conffx2g. Um eine Mes-sunsicherheit in den Gehaltswerten so klein wie möglich zu halten, sollte bei einerKalibrierung also immer im Schwerpunkt der Kalibriergeraden gemessen werden.Graphisch sieht man auch den großen Einfluss der Steigung. Je größer die Stei-gung der Kalibriergerade (die Methodenempfindlichkeit) ist, umso kleiner wirddie Unsicherheit in den umgerechneten Messwerten. In (13.23) wird ja durch dieSteigung geteilt! Hat man bei der Kalibrierung zwei Verfahren zur Auswahl, z. B.


eine Kalibrierung in Remission und eine in Fluoreszenz, sollte die Methode mit dergrößeren Methodenempfindlichkeit (also der größten Geradensteigung) gewähltwerden.

Häufig wird, um Zeit zu sparen, nur eine einzige Kalibrierlösung angesetzt,aus der heraus verschiedene Volumina als Kalibrierung aufgetragen werden. Die-ses Vorgehen ist fehlertechnisch nicht korrekt, da hier die Varianzen der Einwaageund der Probevorbereitung ignoriert werden. Man rechnet sich den Fehler kleiner,als er ist! Außerdem geht man das Risiko eines systematischen Fehlers ein, da ei-ne fehlerhafte Einwaage in der einzigen benutzten Kalibrierlösung nicht erkanntwerden kann [13]. Den Arbeitsaufwand beim Einwiegen kann man sich mit ei-nem einfachen Vorgehen reduzieren. Sind die Kalibrierlösungen stabil, kann mansie mehrfach benutzen. Dann reicht es im Routinebetrieb aus, jeden Tag nur ei-ne einzige neue Lösung herzustellen. Dazu verwirft man eine zufällig ausgesuchteKalibrierung und stell diese neu her. Die anderen Lösungen benutzt man für dieKalibrierung erneut. So braucht nicht für jede Messung ein vollständiger Satz anKalibrierlösungen eingewogen werden [13].

13.11 Quantitative Analyse über die Methodedes externen Standards

Bei der Methode des externen Standards wird eine lineare Abhängigkeit zwischenMesswert und Gehalt der Form y = ax vorausgesetzt. Dies ist eine Geradengleichungohne Achsenabschnitt. Ist diese Abhängigkeit gegeben, kann auf eine Auswertungüber eine Kalibrierfunktion verzichtet und stattdessen über die Methode des ex-ternen Standards ausgewertet werden. In der DC ist diese Vereinfachung meistensnur für transformierte Daten entsprechend der erweiterten Kubelka-Munk-Funktionzulässig. Werden andere Formen der Transformierung benutzt, muss der Lineari-tätsbereich gegebenenfalls etwas kleiner gewählt werden. Die Methode des externenStandards kann aber auf keinen Fall für funktionelle Zusammenhänge mit einemAchsenabschnitt ungleich null angewendet werden.

In der Regel wird bei einer Analyse nicht nur ein Messwert gemessen, sonderndie Messung wird einige Male wiederholt [5]. Wenn der Standard m-mal und dieProbe n-mal gemessen werden, kann statt mit den Einzelmesswerten yi auch mitdem Mittelwert NY gerechnet werden. Für den Mittelwert des Analysenmesswertesgilt beispielsweise:

Ya D 1

n

nXiD1

yai :

Wenn Xa die mittlere Substanzmenge der zu bestimmenden Substanz in derAnalyse (der Probe) und XS die mittlere Substanzmenge des Standards ist und diezugehörigen Mittelwerte der Messung mit YS und Ya abgekürzt werden, gilt:

aXa

aXsD Ya

Ys:

13.11 Quantitative Analyse über die Methode des externen Standards 417

Damit kann (bei gleicher Steigung) aus zwei Messungen der unbekannte Ge-halt der Probe Xa berechnet werden. Es folgt für die mittlere Substanzmenge derAnalyse:

Xa D XsYa

Ys: (13.24)

Die Gesamtvarianz der Bestimmung wird nach Gauss bestimmt, indem die Be-rechnungsformel für Xa nach den fehlerbehafteten Größen abgeleitet, quadriert undmit den entsprechenden Einzelvarianzen multipliziert wird. Die Varianz des End-ergebnisses berechnet sich zu:

var.Xa/ D

ıXa

ıYa

!2

var.Ya/ C

ıXa

ıYs

!2

var.Ys/

D

Xs

YS

!2

var.Ya/ C

� XsYa

.YS/2

!2

var.YS/:

Hier wird vorausgesetzt, dass nur Messwerte und nicht auch Gehaltswerte (x-Werte) fehlerbehaftet sind. Diese Vereinfachung ist zulässig, da fehlerhafte Ge-haltseinwaagen sich in den Messwerten spiegeln. Die Varianzen der Mittelwerteberechnen sich entsprechend der Formel für die Varianz eines Mittelwertes zu:

var.Ya/ D var.y/

n:

Diese Rechnung ist auch für var.YS/ gültig. Hier muss nur durch die Anzahlder Standardmessungen (m) geteilt und mit dem entsprechenden quadrierten Stu-dent-Faktor multipliziert werden. Die Varianz einer Einzelmessung var(y), die beider Bestimmung von Ya oder YS gleich sein sollte, berechnet sich dabei nach derüblichen Varianzformel.

var.Xa/ D

XsYa

YS

!2 "var.y/

nYa2

C var.y/

mYs2

#:

Für das Endergebnis wird der Vertrauensbereich unter Berücksichtigung der ent-sprechenden Student-Faktoren berechnet. Der Vertrauensbereich cnf( ) der Analyseergibt sich zu:

cnf.Xy; t/ D Xa ˙ XsYa

Ys

vuutvar.y/

tn�1

2

nYa2

C tm�12

mYs2

!: (13.25)

Durch die zwei Einzelbestimmungen (Yaund YS) zur Ermittlung von Xa entsteht(mit m = n) ein um den Betrag von

p2. größerer Fehler als bei der Messung einer

einzelnen Messreihe (z. B. von Ya).


13.12 Kalibrierfunktion eines Polynoms zweiten Grades

Kalibrierungen in der Dünnschichtchromatographie sind messtechnisch bedingt nurlinear, wenn die erweiterte Kubelka-Munk-Umrechnung oder die korrekte Fluo-reszenzformel benutzt wird. Häufig ist es aber sinnvoller, mittels anderer Linea-risierungsmodelle auszuwerten. Dann benutzt man entweder einen kleineren Kali-brierbereich, um mit dem Modell der linearen Regression arbeiten zu können, oderman gleicht mit Hilfe einer Polynomfunktion aus. Eine Polynomfunktion als Aus-gleichsmodell bietet sich auch an, wenn bei höheren Konzentrationen nichtlineareSättigungserscheinungen auftreten. Ideal für die DC ist eine Ausgleichsfunktionüber ein Polynom 2. Grades. Polynome höheren Grades sollte man meiden, da siewegen der Vielzahl zu bestimmender Parameter fehlertheoretisch wenig Gewinnbringen. Bei der Verwendung eines Polynoms 2. Grades als Kalibrierfunktion wird,ebenso wie bei dem Verfahren der linearen Kalibrierung, von folgender, statistischrelevanter Schreibweise ausgegangen.

y.x/ D YC C a1.x � XC/ C a2.x2 � XC

2/ (13.26)

Aus der Schreibweise wird deutlich, dass eine Ausgleichsrechnung über ein Po-lynom auch als mehrdimensionale lineare Regression aufgefasst werden kann. DerFunktionsverlauf ist über a1 linear mit x verknüpft. Außerdem ist die Funktion li-near durch a2 mit der quadratisch transformierten Funktion von x verbunden. DieEmpfindlichkeit (E) des Analysenverfahrens entspricht mathematisch der erstenAbleitung der Kalibrierfunktion.

E.x/ D a1 C 2a2x (13.27)

Die Empfindlichkeit der gekrümmten Funktion ist, im Gegensatz zur linearenRegression, vom jeweiligen Konzentrationswert abhängig. Zur Beschreibung derVerfahrensempfindlichkeit wird daher meist der Ausdruck für die Konzentration inder Mitte des Arbeitsbereiches angegeben. Die Mittelwerte XC und YC berechnen

sich entsprechend des Modells der linearen Regression. Für XC2

gilt:

XC2 D 1

nC

nCXiD1

xi2 :

13.12.1 Vertrauensbereich des Polynoms zweiten Grades

Die beiden Regressionsparameter a1 und a2 berechnen sich über den üblichenWeg der Summenminimierung der quadratischen Abweichungen. Aus Gründen der

13.12 Kalibrierfunktion eines Polynoms zweiten Grades 419

Übersichtlichkeit werden folgende Abkürzungen eingeführt:

Sxx DnCX

iD1

�xi � XC

2

Sx2 DnCX

iD1

�xi

2 � XC2�

Sxx2 DnCX

iD1

�xi � XC

�xi

2 � XC2�

Sx2x2 DnCX

iD1

�xi

2 � XC2�2

Sxy DnCX

iD1

�xi � XC

�yi � YC

Sx2y DnCX

iD1

�xi

2 � XC2� �

yi � YC :

Damit ergeben sich die Minimierungsbedingungen zur Bestimmung von a1 unda2 zu folgenden Ausdrücken:

@SdD

@a1

D 0 D ��Sxy C a1Sxx C a2Sxx2

@SdD

@a2

D 0 D ��Sx2y C a2Sx2x2 C a1Sxx2

:

Es folgen zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten, die über folgende Matrixgelöst werden können.

ˇˇ Sxx Sxx2

Sxx2 Sx2x2

ˇˇˇˇa1

a2

ˇˇ D

ˇˇ Sxy

Sx2y

ˇˇ

Die Regressionsparameter a1 und a2 berechnen sich aus der Matrix nach derCramer-Regel zu:

a1 D Sx2x2Sxy � Sxx2Sx2y

SxxSx2x2 � .Sxx2/2

a2 D SxxSx2y � Sxx2Sxy

SxxSx2x2 � .Sxx2/2:

Die inverse Matrix S�1

S�1 D 1

SxxSx2x2 � .Sxx2/2

ˇˇSx2x2 �Sxx2

�Sxx2 Sxx

ˇˇ


multipliziert mit der Varianz einer Einzelmessung ergibt wiederum die Varianz-Co-varianz-Matrix, aus der die Varianzen der Regressionsparameter direkt entnommenwerden können.ˇ

ˇ var.a1/ cov.a1; a2/

cov.a2; a1/ var.a2/

ˇˇ D 1

det.S/

ˇˇSx2x2 �Sxx2

�Sxx2 Sxx

ˇˇ var.y/ :

Die Determinante det(S) steht für:

det.S/ D SxxSx2x2 � .Sxx2/2 :

Aus der Varianz-Covarianz-Matrix kann direkt abgelesen werden, dass bei einerAusgleichsfunktion über ein Polynom 2. Grades die Covarianzterme ungleich nullsind und damit bei einer Fehlerrechnung berücksichtigt werden müssen. Zu beach-ten ist wieder, wie var(y) zu berechnen ist. Nach der oben angegebenen Definitionbeschreibt var(y) das geschätzte Streumaß der Stichprobe. Da aus den Kalibrierda-ten nach dem Polynommodell 2. Grades drei Werte festgelegt werden (a1, a2 undYC), wird die Varianz der Einzeldaten aus der Differenz zwischen Messwerten undberechneten Werten ermittelt und dann durch nC � 3 geteilt. Damit folgt für dieVarianz einer Einzelmessung aus nC Messdaten:

var.y/ D 1

nC � 3

nCXiD1

�Oyi � YC � a1.xi � XC/ � a2.xi

2 � XC2/�2

:

Die Varianzen var(a1) und var(a2) können aus der Varianz-Covarianz-Matrix un-mittelbar abgelesen werden. Die Berechnung von var(YC) erfolgt entsprechend derMethode der linearen Regression. Ein Polynom 2. Grades besitzt die drei fehlerbe-hafteten Regressionsparameter YC, a1 und a2. Nach dem Fehlerfortpflanzungsgesetzfolgt für die Gesamtvarianz var(y(x)) der Ausdruck:

vary.x/ D�

@y.x/

@YC

�2

var.YC/ C�

@y.x/

@a1

�2

var.a1/ C�

@y.x/

@a2

�2

var.a2/

C 2

�@y.x/

@a1

��@y.x/

@a2

�cov.a1; a2/:

Der Ausdruck für die Covarianzen kann doppelt gezählt werden, da nach der Va-rianz-Covarianz-Matrix beide Covarianzen (cov(a1,a2) und cov(a2,a1)) gleich sind.Das Einsetzen der Varianzen für YC, a1 und a2 sowie der Covarianz führt zu der nurvon den Messdaten der Kalibrierung abhängigen Varianzfunktion:

var f Oy.x/g D var.y/

nCC .x � XC/

2 Sx2x2

det.S/var.y/C

.x2 � XC

2/2 Sxx

det.S/var.y/C

2.x � XC/.x2 � XC

2/�Sxx2

det.S/var.y/

: (13.28)

13.12 Kalibrierfunktion eines Polynoms zweiten Grades 421

15

12

9

6

3

ng

**

**

***

*

*

*

100 200 300 400 500

Abb. 13.7 Abgebildet ist der Vertrauensbereich einer Kalibrierung, berechnet über das Modell„Polynom 2. Grades“

Der Student-t-Faktor hängt von der Anzahl der Freiheitsgrade ab, der hier mitf = nc � 3 gegeben ist. Für den Vertrauensbereich (das Konfidenzintervall) gilt mitder Standardabweichung, der Wurzel aus der Gesamtvarianz (sdv), folgender Aus-druck:

cnff Oy.x/g D Oy.x/ ˙ tcsdvf Oy.x/g : (13.29)

Wie im Modell „lineare Regression“ ist auch hier zu beachten, dass cnf f Oy.x/gimmer nur in y-Richtung interpretiert werden darf. Eine Besonderheit des Vertrau-ensbereiches dieser parabolischen Kalibrierfunktion sei hier kurz aufgezeigt. ImGegensatz zum Konfidenzintervall des Geradenausgleichs, das im Punkt XC einMinimum aufweist, resultieren bei einem Polynom 2. Grades zwei Minima: bei XC

und bei XC2, wie in Abb. 13.7 zu sehen ist.

13.12.2 Analysenfunktion des Polynoms zweiten Grades

Wird die Ausgleichsfunktion für das Polynom zweiten Grades nach ihren x-Wertenaufgelöst, ergibt sich ein relativ komplizierter Ausdruck. Die Daten der Analysen-messung werden wieder als Mittelwert Ya angegeben. Wegen der Wurzel in derAnalysenfunktion sind mathematisch zwei Resultate möglich. Natürlich kommt nurdem positiven Ausdruck der Wurzel eine analytische Bedeutung zu, da es negative


Stoffmengen oder Konzentrationen nicht geben kann.

fxagP2G Ds

Ya � YC C a1XC

a2

C XC2 C

�a1

2a2

�2

� a1

2a2

(13.30)

Die Varianz des Endergebnisses berechnet sich entsprechend der Methode desFehlerfortpflanzungsgesetzes. Dazu müssen die Ausdrücke der Analysenfunktio-nen nach den fehlerbehafteten Größen a1, a2, YC und Ya abgeleitet und quadriertwerden.

varfxagP2G D�

@fxagP2G

@YC

�2

var.YC/ C�

@fxagP2G

@a1

�2

var.a1/

C�

@fxagP2G

@a2

�2

var.a2/ C�

@fxagP2G

@Ya.x/

�2

var.Ya/

C 2

�@fxagP2G

@a1

��@fxagsP2G

@a2

�cov.a1; a2/

Zu beachten ist, dass zwei unterschiedliche Student-Faktoren, tc für die Kalibrie-rung und ta für die Analysenwerte, in der Formel vorkommen. Mit der Abkürzung

A Ds

Ya � YC C a1XC

a2

C XC2 C

�a1

2a2

�2

und den folgenden Ableitungen

@fxagP2G

@YCD � 1

2a2A

@fxagP2G

@a1

D 1

2a2A

�XC C a1

2a2

�� 1

2a2

@fxagP2G

@a2

D � 1

2a22A

��.Ya C YC/ � a1XC � a1

2

2a2

�C a1

2a22

@fxagP2G

@Ya

D 1

2a2A

13.13 Überprüfung auf systematische Fehler 423

sowie den verschiedenen Varianzen

var.YC/ D 1

nCvar.y/

var.a1/ D Sx2x2

SxxSx2x2 � .Sxx2/2var.y/

var.a2/ D Sxx


cov.a1; a2/ D �Sxx2


var.Ya/ D 1

na

var.y/

kann die Gesamtvarianz berechnet werden.

cnf fXag D Xa ˙pvarfxagP2G (13.31)

Die Wahl des Verfahrens, lineare Regression oder Polynom 2. Grades, sollteimmer vom berechneten Vertrauensbereich des Endergebnisses abhängig gemachtwerden. Dem Rechenweg mit der kleinsten Unsicherheit sollte dabei der Vorzuggegeben werden.

13.13 Überprüfung auf systematische Fehler

Bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer Substanz geht man in derRegel davon aus, dass diese Bestimmung spezifisch und selektiv ist. Man nimmtalso an, dass keine weiteren Substanzen die Bestimmung stören. Man meint, in derchromatographisch abgetrennten Zone nur die Zielsubstanz zu messen. Man kannjedoch nie sicher sein, dass die Probematrix nicht doch einen störenden Einflussauf die Bestimmung ausübt. Mit den bis jetzt besprochenen Bestimmungsverfahrenlineare Regression, externer Standard und Polymerregression können Aussagen zurPräzision der Bestimmung getroffen werden; zur Richtigkeit der Methode werdenkeine Aussagen gemacht. Eine Methode liefert aber nur dann richtige Ergebnisse,wenn die Matrix sich nicht störend auswirkt. Systematische Abweichungen in derAnalyse werden in zwei Gruppen eingeteilt: konstante und proportionale systema-tische Abweichungen.

13.13.1 Konstante systematische Abweichungen

Bei konstanten systematischen Abweichungen handelt es sich um Abweichungen,die unabhängig von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes sind. Um die-sen Matrixeffekt erkennen zu können, muss die Bestimmung mit einer prinzipiell


anders arbeitenden Methode durchgeführt werden. Sind die hierbei erzielten Ergeb-nisse im Rahmen der Messunsicherheit mit den schon gefundenen Werten identisch,kann man konstante systematische Abweichungen ausschließen. In der DC kanndas Vorliegen einer konstanten systematischen Abweichung durch eine Remissi-onsmessung mit und ohne Färbereaktion überprüft werden. Gerade die Reaktionzu fluoreszierenden Derivaten eignet sich hervorragend zur Überprüfung konstan-ter systematischer Abweichungen, da hier auch das Messverfahren ein anderes ist.Hier ist die DC viel flexibler als andere chromatographische Methoden.

13.13.2 Proportionale systematische Abweichungen

Proportionale systematische Abweichungen sind von der Konzentration der zu be-stimmenden Komponente abhängig. Auch hier besteht die Möglichkeit, diesen sys-tematischen Fehler mit einer anderen Bestimmungsmethode, die diese systemati-sche Abweichung nicht zeigt, zu erkennen. Es bestehen jedoch noch zwei weitereMöglichkeiten, systematische Abweichungen zu erkennen bzw. zu beheben: Manführt die Kalibrierung direkt in der Probematrix durch oder mischt der Probe einedem Analyten ähnliche Substanz zu. Diese Methoden nennen sich „Standardadditi-onsverfahren“ und „Methode des internen Standards“.

13.14 Methode des internen Standards

Bei der Methode des internen Standards wird eine lineare Abhängigkeit, eineFunktion ohne Achsenabschnitt, zwischen Messwert und Gehalt vorausgesetzt.Zur Durchführung wird der Probe wie auch dem Standard eine definierte Mengeeiner dem Zielmolekül (dem Analyten) ähnlichen Substanz zugegeben. Bei vielenUmweltanalysen ist der interne Standard (die ähnliche Substanz) der deuterierteAnalyt. Der interne Standard ist in diesem Fall von den chemischen Eigenschaftenher identisch mit dem Zielmolekül, besitzt jedoch statt Protonen an den entspre-chenden Stellen Deuteriumkerne.

Wenn xr die Substanzmenge der zu bestimmenden Substanz im Standard und xs1

die Substanzmenge des internen Standards ist und die zugehörigen Messwerte ys,r

und yr sind, gilt:xr

xs1D aryr

asys,rD K

yr

ys,r:

Aus den Daten der Standardmessung lässt sich jetzt ein Umrechnungsfaktor Kbestimmen.

K D xrys,r

xs1yr

Für die zu bestimmende Substanzmenge in der Probe xa mit dem Messwert ya

sowie die zugesetzte Menge an internem Standard xs2 mit dem zugehörigen Mess-

13.14 Methode des internen Standards 425

wert ys,a gilt ebenfalls:xa

xs2D K

ya

ys,a:

Aus den vier Messungen kann der unbekannte Gehalt der Probe xa berechnetwerden. In der Regel wird aber nicht ein Messwert (z. B. Ya der Probe) genommen,sondern die Messung wird einige Male wiederholt. Wenn nun die Kalibrierung m-mal und die Probe n-mal gemessen wird, müssen statt der Einzelmesswerte y dieMittelwerte NY in die obige Formel eingesetzt werden. Es gilt:

Xa D KXs2Ya

Ys,aD XrYs,r

Xs1Yr

Xs2Y a

Ys,a: (13.32)

Die Gesamtvarianz der Bestimmung wird nach Gauss bestimmt, indem die Be-rechnungsformel nach den fehlerbehafteten Größen (den y-Ausdrücken) abgeleitet,quadriert und mit den entsprechenden Einzelvarianzen multipliziert wird. Die Vari-anz des Endergebnisses Xa berechnet sich danach zu:

var.Xa/ D

ıXa

ıYa

!2

var.Ya/ C

ıXa

ıYs,a

!2

var.Ys,a/

C

ıXa

ıYr

!2

var.Yr/ C

ıXa

ıYs,r

!2

var.Ys,r/:

Die Varianzen der Mittelwerte berechnen sich entsprechend der Formel für dieVarianz eines Mittelwertes aus n Einzelwerten zu:

var. NY / D 1

nvar.y/ :

Werden die Varianzen der n Analysenmessungen (Ya und Ys,a) und die Varianzender m Messungen der internen Standards (Yr und Ys,r) jeweils als gleich angenom-men, folgt:

var.Xa/ D

XrYs,r

Xs1Yr

Xs2Ya

Ys,a

!2 "2var.y/

nYa2

C 2var.y/

mYs2

#:

Der Vertrauensbereich berechnet sich zu:

cnf.Xy; t/ D Xa˙

2

XrYs,r

Xs1Yr

Xs2Ya

Ys,a

!vuutvar.y/

tn�1

2

nYa2

C tm�12

mYs2

!:

(13.33)

Durch die vier Messreihen (Ya, Ys,a, Yr und Ys,r) zur Ermittlung von Xa entstehtdamit ein um

p2 größerer Fehler als bei einer Bestimmung nach der Methode des


externen Standards, bei dem nur zwei Messreihen benötigt werden. Bei der Metho-de des internen Standards ist die analytische Richtigkeit des Endergebnisses größer,weil eventuelle Verluste bei der Aufarbeitung der Probe rechnerisch kompensiertwerden.

Über die Methode des internen Standards kann auch quantifiziert werden, ohnedass bekannte Mengen auf die Platte aufgetragen werden müssen. Steht z. B. keinautomatisch arbeitendes Auftragegerät zur Verfügung, können Probe und Standard,jeweils mit internem Standard versetzt, mit einer Pipette „frei“ aufgetragen wer-den. Dabei braucht das reale Auftragevolumen nicht bekannt zu sein und kann sichauch von Auftragung zu Auftragung ändern. Konstant ist auf jeden Fall der Um-rechnungsfaktor K, über den unterschiedliche Auftragevolumina herausgerechnetwerden können. Zusammengefasst wird bei der Messung nach der Methode des in-ternen Standards bewusst eine Erniedrigung der Präzision in Kauf genommen, umdie Richtigkeit der Analyse zu erhöhen!

13.15 Standardadditionsverfahren

Beim Standardadditionsverfahren wird die Probe vermessen, und dann werden imAnschluss definierte Mengen der Zielsubstanz zugegeben [14]. Anschließend wirddie Probe erneut vermessen. Eine proportionale systematische Abweichung liegtvor, wenn sich die Steigung der in Gegenwart der Matrix gemessenen linearenAbhängigkeit zwischen Mess- und Gehaltswerten von der Steigung einer linearenKalibrierung der Reinsubstanz unterscheidet. Natürlich kann die Methode der Stan-dardaddition auch zur Bestimmung des Probegehaltes herangezogen werden. Dahier in Gegenwart der Matrix, die nicht bekannt sein muss, kalibriert wird, werdenproportionale systematische Fehler von vorneherein ausgeschlossen. Die Bestim-mung ist aufwändiger als nach der Methode des externen Standards, liefert aberbei einer unbekannten Matrix in der Regel richtige Ergebnisse [14]. Es ist dahersinnvoll, hier diese Methode auch fehlertechnisch zu besprechen.

Folgende Bedingungen müssen vorliegen, um nach der Methode der Standardad-dition arbeiten zu können. Die Probe soll die Zielsubstanz in der Menge x0 enthaltenund die Methodenempfindlichkeit Aa besitzen. Damit verursacht die Menge x0 denMesswert y0 und es gilt:

y0 D Aax0 : (13.34)

Wird die Probe mehrfach gemessen, soll der Mittelwert von k Messung als Y0

bezeichnet werden.

Y0 D 1

k

kXiD1

y0i

Wird der Probe die Substanzmenge xa zugegeben, wird der Messwert ya gemes-sen. Die zugesetzte Substanzmenge xa ist aber nur für einen Teil des Messwertesverantwortlich, nämlich für die Differenz (ya � y0). Damit gilt auch:

ya � y0 D Aaxa :

13.15 Standardadditionsverfahren 427

Werden beide Gleichungen vereinigt und bei der Aufstockung mehrere verschie-dene Substanzmengen zugesetzt, folgt die Gleichung:

Aax0 � y0 D 0 D Aaxa � ya C y0 :

Mit den Mittelwerten

Xa D 1

n

nXiD1

xai und Ya D 1

n

nXiD1

yai

ergibt sich nach x0 aufgelöst:

x0 D 1

Aa

.2Y0 � Ya/ C Xa : (13.35)

Die Probe wird k-mal vermessen und es wird n-mal aufgestockt. Die SteigungAa der Aufstockungen kann analog zur Methode „lineare Regression“ zu

Aa DPm

iD1

�yai � Ya

�xai � Xa

Pm

iD1

�xai � Xa

2 D Sxy

Sxx

berechnet werden. Die optimalen Arbeitsbedingungen ergeben sich aus der Feh-lerbetrachtung nach dem Gauß-Verfahren. Die Messwerte y0i und yai sind die feh-lerbehafteten Größen in Formel (13.35). Nach ihnen muss der Ausdruck abgeleitetund quadriert werden, um die Varianz von x0 zu erhalten. Da die fehlerbehafte-ten Messwerte in den Ausdrücken Aa, Ya und Y0 (und nicht Xa) stecken, wirdFormel (13.35) nach diesen Ausdrücken abgeleitet. Da die Messungen der Probe(Y0) unabhängig zur Messung der Aufstockung (Ya) durchgeführt werden, sind hierkeine Covarianzen zu berücksichtigen. Die Steigung Aa wird zwar aus den Aufsto-ckungsmessungen Ya berechnet, aber im Kapitel „lineare Regression“ wurde schongezeigt, dass auch zwischen diesen beiden Größen keine Covarianz besteht. Damitfolgt nach der Methode der Gauß’schen Fehlerfortpflanzung für die Varianz von x0:

var.x0/ D�

@x0

@Aa

�2

var.Aa/ C�

@x0

@Ya

�2

var.Ya/ C�

@x0

@Y0

�2

var.Y0/ :

Die Varianz der Steigung Aa berechnet sich zu:

var.Aa/ D 1

Sxx

var.y/ :

Die Varianzen der Mittelwerte Ya und Y0 ergeben:


var.Ya/ D 1n

var.y/ und var.Y0/ D 1k

var.y/. Damit folgt für die einzelnen Teil-ausdrücke der Varianz von x0:

�@x0

@Aa

�2

var.Aa/ D

�2Y0 � Ya

Aa2

!21

Sxx

var.y/

�@x0

@Ya

�2

var.Ya/ D��1

Aa

�21

mvar.y/

�@x0

@Y0

�2

var.Y0/ D�

2

Aa

�21

kvar.y/:

Der Gesamtausdruck für den Vertrauensbereich von x0 ergibt sich, unter Berück-sichtigung von Ausdruck (13.35), zu:

var.x0/ D 1

Aa2

264 4

kvar.Y0/ C var.Ya/

0B@ 1

mC

�x0 � NXa

2Pi

�xai

� NXa

21CA375 : (13.36)

Der Vertrauensbereich berechnet sich aus (13.36) zu:

cnf.x0/ D x0 ˙ 1

Aa

vuuuut4t2k�1

kvar.Y0/ C var.Ya/t2

m�2

0B@ 1

mC

�x0 � NXa

2Pi

�xai

� NXa

21CA :

(13.37)Zur optimalen Messung mittels der Standardadditionsmethode sollten mindes-

tens vier Messungen der Probe (Y0) und fünf Messungen als Aufstockung (Ya)durchgeführt werden, damit der Student-Faktor genügend klein wird. Für die DCist dies ideal, denn neun Messungen passen gerade auf eine Seite einer 10 × 10 cmgroßen HPTLC-Platte. Außerdem empfiehlt es sich, in etwa mit der Gehaltsmengeder Probe als Schwerpunkt der Aufstockung aufzustocken, da dann der Klammer-ausdruck (x0 � Xa) null wird, also keinen Beitrag zur Varianz leistet.

Werden nun die Messwerte gegen die um den Gehalt der Probe korrigiertenGehaltswerte der Probe und der Aufstockung graphisch aufgetragen, muss eine Ur-sprungsgerade resultieren, auf der alle Messwerte liegen. Ist dies nicht der Fall,stimmt irgendetwas mit der Messung nicht, und die Methode der Standardadditionkann bei dieser Analytik nicht verwendet werden. Zur Überprüfung der Richtigkeiteiner Methode reicht es, die Steigung der Aufstockung mit der Steigung der matrix-frei gewonnenen Kalibrierfunktion zu vergleichen. Bei Matrixeffekten ist es jedochmanchmal sinnvoll, direkt über die Methode der Standardaddition zu quantifizieren.So werden Matrixeffekte bei der Quantifizierung mit berücksichtigt.

13.16 Mittelwert-t-Test 429

13.16 Mittelwert-t-Test

Die Frage, ob zwei Steigungswerte gleich sind bzw. ob die Ergebnisse zweier Mess-verfahren statistisch gesehen identisch sind, kann durch einen Mittelwert-t-Testentschieden werden. Dies ist ein zweiseitiger Test. Zur Prüfung eines statistischenUnterschiedes zwischen zwei normalverteilten Werten (x1 und x2) aus zwei vonein-ander unabhängigen Analysenserien (die normalverteilt sein müssen), kann nachW. S. Gosset folgende Prüfgröße (PG) benutzt werden:

PG Dˇˇx1 � x2

sdvd

ˇˇr

n1n2

n1 C n2

:

PG Prüfgröße des zweiseitigen t-Testsx1, x2 Mittelwerte zweier Messreihenn1, n2 Datenanzahl beider Messreihensdvd gewichtete Standardabweichungvar1,2 Varianzen beider Messreihen

Die gewichtete Varianz vard berechnet sich zu:

sdvd Ds

.n1 � 1/ var12 C .n2 � 1/ var2

2

n1 C n2 � 2

Die berechnete Prüfgröße wird mit den Tabellenwerten der Student-Funktionverglichen. Dazu wählt man die gewünschte Irrtumswahrscheinlichkeit und be-rechnet die Freiheitsgrade (f = n1 + n2 � 2) beider Mittelwerte. Ist der Tabellenwertgrößer als die Prüfgröße (PG Tabellenwert), zeigen beide Mittelwerte nur einenstatistischen (also zufälligen) Unterschied und können damit als identisch angese-hen werden. Der Test wird eingesetzt, um die Ergebnisse zweier Messungen mitunterschiedlichen Methoden miteinander zu vergleichen. Zum Beispiel kann so dieFrage beantwortet werden, ob die Ergebnisse einer Fluoreszenz- und einer Absorp-tionsmessung der gleichen Probe identische Gehaltswerte ergeben. Es kann auchuntersucht werden, ob der Mittelwert einer Stichprobe aus n Einzeldaten mit einemSollwert übereinstimmt.

Die Überprüfung, ob der gemessene Mittelwert x statistisch relevant einen Min-dest- oder Höchstwert über- oder unterschreitet, ist ein einseitiger Test. Dafür kannfolgende Prüfgröße verwendet werden:

PG Dˇˇx � xsoll

sdva

ˇˇpn :

PG Prüfgröße des einseitigen t-Testsx Mittelwerte der Messreihexsoll Mindest- oder Höchstwertsdva Standardabweichung der Messreihen Anzahl Messdaten der Messreihe


Verglichen wird die Prüfgröße mit dem Tabellenwert der Student-Funktion fürdie gewählte Irrtumswahrscheinlichkeit und für den Freiheitsgrad f = n � 1.

Literatur

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[14] Spangenberg B (2012) Quantifying quaternary herbicides by standard addition method. J Pla-nar Chromatogr 25:262–268

14Analysenplanung und Validierungin der HPTLC

Mit dem kurzen Überblick über die Theorie der DC, insbesondere über die Pla-nung der verschiedenen Analysenschritte wie Phasenwahl, Auftragung, Entwick-lung, Messung und Auswertung soll das vorliegende Buch einen Anwender in dieLage versetzen, eigene DC-Methoden zu entwickeln. Dabei kommt es aber nichtnur auf die Entwicklung irgendeiner DC-Methode an. Die Methode muss vielmehrauch das leisten können, was man von ihr erwartet, und dazu muss sie auf ihreAnsprüche hin geprüft werden. Man nennt solch eine Methodenprüfung eine Vali-dierung.

14.1 Begriffsdefinitionen bei der Validierung

Die Validierung von Analysenmethoden ist in verschiedenen Richtlinien behandelt[1–3]. Diese Richtlinien können als Grundlage einer Methodenvalidierung auchfür die Dünnschichtchromatographie dienen. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahlvon Publikationen, die sich mit der Validierung unterschiedlichster Messmethodenbefassen [4–6]. Mit der Validierung von DC-Methoden beschäftigen sich [7–15]ebenso wie mit den dabei häufig gemachten Fehler [16, 17].

Die meisten der oben angesprochenen Richtlinien zur Validierung von Analysen-methoden führen nur die Definitionen der verwendeten Begriffe auf. Dies ist nötig,um sicherzustellen, dass von den gleichen Dingen gesprochen wird. Außerdem bie-tet die Strukturierung der analytischen Handlungen einen besseren Überblick überdie doch relativ komplizierten Abläufe. Nach J. K. Taylor sollte eine analytischeHandlung in vier hierarchisch gegliederte Bereiche aufgeschlüsselt werden [5, 6].Taylor unterscheidet zwischen Technik, Methode, Prozedur und Protokoll.

Unter einer „Technik“ wird die Art des wissenschaftlichen Prinzips verstanden,das zum Einsatz kommt. Dieses Buch handelt z. B. von der Technik „Planarchro-matographie“ unter Einsatz eines wellenlängenabhängig messenden optischen Plat-tenscanners. Unter der verwendeten „Methode“ wird eine bestimmte Adaption dergewählten Technik an das Messproblem verstanden. Unter diesem Begriff wird alldas aufgelistet, was an speziellen Anwendungen aus der gewählten Technik für die


432 14 Analysenplanung und Validierung in der HPTLC

Analyse gebraucht wird. Das kann die Wahl des Phasensystems sein (RP- oder Nor-malphase), die Erarbeitung des optimalen Laufmittels, die Wahl des Messverfahrens(Remissions- oder Fluoreszenzmessungen), die Wahl der besten Messwellenlänge,die Kammerwahl usw. Im Bereich „Prozedur“ werden die Handlungen aus demKapitel „Methode“ so zu Papier gebracht, dass ein möglichst fehlerfreies Nachar-beiten möglich wird. Dazu muss in jedem Arbeitsbereich eine SOP (engl. standardoperation procedure) erstellt werden, die eine korrekte Verwendung der einzelnenProzeduren, vom Abwiegen der Standards bis zur Berechnung des Endwertes, be-schreibt. Im „Protokoll“ werden spezielle Direktiven für eine Prozedur festgelegt,von denen nicht abgewichen werden darf. Hier steht z. B. der Grenzwert, nachdem sich die Ablehnung einer Produktionscharge oder die Freigabe von Lebensmit-teln richtet. In der Regel ist es das Protokoll, das den Aufsichtsbehörden gemeldetwird und nach dem sich die Einschätzung einer analytischen Arbeit zu richtenhat.

Bei einer Validierung werden alle vier Teilbereiche der Analytik mit dem Zieluntersucht, zu klären, ob sie brauchbare analytische Daten produzieren können.Damit ist die Validierung einer Methode die Vorbedingung zur Gewinnung vonanalytischen Daten. Eine Methodenvalidierung liefert eine Antwort auf die Frage,ob die verwendete Methode dieser Technik mit der vorliegenden Prozedur die imProtokoll festgelegten Anforderungen erfüllen kann. Eine Validierung stellt nichtsicher, dass diese Methode die Anforderungen auch erfüllt.

Der Inhalt des „Protokolls“ richtet sich nach den spezifischen Messproblemendes Anwenders und kann hier nicht allgemein behandelt werden. Auch das Kapitel„Prozedur“ hängt von den spezifischen Gegebenheiten des Anwenders ab und sollhier nicht behandelt werden. Mit der Wahl der Dünnschichtchromatographie alsanalytische Technik wird auch eine Diskussion zur „analytischen Technik“ über-flüssig. Damit verbleibt nur noch die Diskussion zum Thema „Methode“. Nur re-lativ wenige Veröffentlichungen behandeln die Validierung von Dünnschichtchro-matographie-Methoden [7–17]. In diesem Kapitel sollen die wichtigsten Vorausset-zungen einer erfolgreichen DC-Methodenvalidierung angesprochen werden.

Eine Methodenvalidierung kann von dem Prozess der Methodenentwicklungnicht getrennt werden, denn bei einer Methodenentwicklung muss die anschlie-ßende Validierung zeigen, ob der Zweck der Methode, das Bestimmen richtigerGehaltswerte, auch erreicht wurde. In Publikationen zur Validierung analytischerMethoden treten eine Reihe von Begriffen auf, die für ganz bestimmte Sachver-halte stehen, wie Präzision (engl. precision), Richtigkeit (engl. accuracy, oderbesser: trueness), Wiederholbarkeit (engl. repeatability), Spezifität (engl. spe-cificity), Nachweisgrenze (engl. limit of detection), Bestimmungsgrenze (engl.limit of quantification), Linearität (engl. linearity) und Arbeitsbereich (engl.range). Eine Analysenmethode muss auf alle diese Sachverhalte hin abgeprüftund gegebenenfalls, im Laufe einer erneuten Methodenentwicklung, angepasstwerden [18].

14.2 Methodenvalidierung 433

14.2 Methodenvalidierung

14.2.1 Überprüfung der Selektivität

Der Begriff der Spezifität steht für eine erfolgreiche Messung einer einzelnen Sub-stanz, meist ohne Abtrennung. Eine Methode arbeitet spezifisch, wenn aus einerMischung heraus nur die zu bestimmende Substanz, ohne Verfälschung durch an-dere Substanzen, ein Signal zeigt. Dies ist so gut wie nie der Fall. Es gibt eigentlichkeine spezifischen Messmethoden.

Zeigen verschiedene Substanzen in einem Gemisch ein Signal, kann die Ziel-substanz nur nach befriedigender Abtrennung von ihren Begleitstoffen bestimmtwerden. Gelingt eine vollständige Abtrennung, wird der Begriff Selektivität einerTrennung benutzt. Eine Messung ist selektiv, wenn zwar viele Substanzen ein De-tektorsignal ergeben, aber die zu bestimmende Substanz ohne Störung der anderengemessen werden kann. Man sollte daher den Begriff „Spezifität“ meiden und durchden Ausdruck „Selektivität“ ersetzen [19].

Die zu bestimmende Substanz wird in der Regel als Analyt bezeichnet, der sichmit Begleitstoffen (der sogenannten Matrix) zusammen in einer Probe befindet.Eine DC-Methode arbeitet selektiv, wenn der Analyt von allen anderen Substan-zen der Probe in einem Rf-Bereich von 0,1 bis 0,9 ausreichend abgetrennt wird.Unter ausreichend abgetrennt versteht man in der Regel eine Auflösung von min-destens R = 1,25. Um sicherzustellen, dass eine abgetrennte Zone (ein Peak) nichtin sich mehrere Substanzen enthält, muss vor einer Quantifizierung die Peakrein-heit durch Vergleich der Spektren mit einem Referenzspektrum überprüft werden.Bei einer Peakidentifizierung und einer Peakreinheitsbestimmung mittels UV-vis-Spektren sollte man in der DC (lampenabhängige) Fluoreszenzspektren vermeiden.Bei der Verwendung von Deuterium- und Wolframlampen sollte man die �lg(R)-Formel oder den Kehrwertausdruck (1/R) � 1 und nicht die Kubelka-Munk-Linea-risierung benutzen. Bei der Verwendung stabil strahlender LEDs kann auf dieseEinschränkung verzichtet werden. Hier können auch Fluoreszenzspektren zur Sub-stanzidentifizierung und zur Überprüfung der Peakreinheit verwendet werden.

Generell sollte immer versucht werden, die Selektivität einer Methode primärüber die Variation der Trennparameter zu erreichen. DC-Methoden sind für Be-stimmungen mit hoher Selektivität prädestiniert, da bei Normalphasen- oder RP-Trennungen alle denkbaren Laufmittel verwendet werden können. Auch kann diestationäre Phase schnell gewechselt werden. Erst wenn eine DC-Trennung nur un-zureichend gelingt, sollten Färbereaktionen benutzt werden. Häufig reicht bei einerunzureichenden Trennung schon die geschickte Wahl der Messwellenlänge aus, umdie Selektivität der Bestimmung zu gewährleisten.

Die Stärke der DC liegt in einer Normalphasenentwicklung auf Kieselgel. Dieerste Wahl der stationären Phase wird daher immer Kieselgel sein, da hier auchbei der Auswahl der mobilen Phase die größte Flexibilität besteht. Mit einer Nor-malphasenchromatographie kann die Selektivität einer Trennung am schnellstenerreicht werden. Außerdem zeigt die Kieselgelphase von allen DC-Sorbenzien diegeringste Eigenabsorption an Licht. Soll die Trennung über eine Fluoreszenzmes-


sung detektiert werden, empfiehlt sich allerdings die Verwendung einer RP-18-Phase, da Fluoreszenzen auf unpolaren Phasen intensiver leuchten als auf polarenPhasen. Verteilungschromatographische Trennungen sind oft günstig auf Cellulo-sephase durchzuführen. Bei 2-D-Trennungen lohnt sich der Einsatz von CN- oderNH2-Phasen. Eine Besonderheit stellt die Aminophase dar, da hier Carbonylverbin-dungen durch Hitzederivatisierung, ohne Einsatz von Chemikalien, in fluoreszie-rende Verbindungen überführt werden können.

In der Diodenarray-DC sollten generell HPTLC-Platten – in den Größen 10 cm× 10 cm oder 20 cm × 10 cm – verwendet werden, da die enge Korngrößenvertei-lung der HPTLC im Vergleich zur TLC schärfere Trennungen zulässt. Die mobilePhase sollte so gewählt werden, dass kritische Paare bei einem Rf-Wert um 0,33liegen, denn hier zeigt die DC ihre optimale Trennleistung. Die Peakverbreiterungwährend der Entwicklung kann minimiert werden, wenn keine zu langsam laufen-den Fließmittel Verwendung finden. Diese Empfehlung stützt sich auf die Theorie.Fließmittel hoher Viskosität (bzw. kleiner Permeabilität) zeigen trotzdem gute Er-gebnisse und sollten auf jeden Fall ausprobiert werden.

Die Güte der Trennung wird maßgeblich durch die Art der Auftragung beein-flusst. Generell sollte man strichförmig aufsprühen, um den Positionsfehler zu mini-mieren und die Plattenoberfläche nicht zu beschädigen. Je schmaler die Auftragungist und je weniger aufgetragen wird, desto besser gelingt die Trennung. Bei pola-ren stationären Phasen wie Kieselgel sollte die Probe in einem möglichst unpolarenLösungsmittel aufgetragen werden. Bei unpolaren Phasen wie RP-18-Platten sollteumgekehrt mit möglichst polaren Lösungsmitteln aufgetragen werden. Hier mussman allerdings beachten, dass einige RP-18-Phasen bei hohen Wassergehalten inder Probelösung nicht mehr benetzbar sind. Dann sollte auf die wasserbenetzbarenRP-18-Phasen der verschiedenen Hersteller ausgewichen werden. Bei diesen Pha-sen sind nicht alle SiOH-Gruppen derivatisiert. Die Trennung kann daher leichtverändert gegenüber nichtwasserbenetzbaren RP-18-Phasen ausfallen. Bei TLC-Platten muss die Auftragung optimal etwa 10 mm und bei HPTLC-Platten etwa5 mm oberhalb der Immersionslinie liegen. Es sollte strichförmig aufgetragen wer-den, damit bei einer maximalen Probemenge eine optimale Peakauflösung erreichtwerden kann. Oftmals empfiehlt es sich, einen längeren Trocknungsschritt zwischenAuftragung und Trennung einzuschieben, damit Lösungsmittelreste aus der Auftra-gung die Trennung nicht beeinflussen.

Oft wird von einer DC-Methode verlangt, dass der Analyt von allen bekanntenVerunreinigungen in der Probe ausreichend abgetrennt wird. Dazu werden der Pro-be die vermuteten Verunreinigungen als Reinsubstanz zugesetzt, um die Leistungs-fähigkeit der Trennung zu testen. Sind mögliche Verunreinigungen nicht bekannt,sollte der Analyt zusammen mit der Matrix gestresst werden. Zum Stressen der Pro-ben kann diese mit Säuren und Basen, mit Oxidationsmittel, durch Feuchtigkeit, mitreduzierenden Substanzen (z. B. Zink und Salzsäure) behandelt werden, oder dieProbe ist UV-Licht und hohen Temperaturen auszusetzen. So werden Abbaupro-dukte erhalten, die als Verunreinigungen wahrscheinlich sind. Nach der Trennungaus der gestressten Probe wird die Peakreinheit des Analyten entweder durch eine


spektrale Untersuchung oder (bzw. auch ergänzend) durch eine zweidimensionaleEntwicklung mit einem anderen Laufmittel überprüft.

14.2.2 Anzahl der Messungen

Am Anfang einer Methodenentwicklung stellt sich immer die Frage, wie häufigeine Probe gemessen werden soll. Der Vertrauensbereich eines Mittelwertes setztsich z. B. aus der Varianz der Einzelmesswerte [var(y)], dem Student-Faktor t undder Anzahl der Messungen n folgendermaßen zusammen:

Y ˙ cnf.Y / Ds

tn�12

nvar.y/ D tn�1p

nsdv.y/ : (14.1)

In Ausdrücken für die Vertrauensbereiche aller Messmethoden kommt immerder Ausdruck t=

pf bzw. t=

pn vor (14.1). Wird dieser Ausdruck graphisch gegen

die Freiheitsgrade f aufgetragen, ergibt sich die in Abb. 14.1 dargestellte Funktion:In Abb. 14.1 sieht man, dass für die Anzahl der Freiheitsgrade mindestens f = 5

gelten sollte, weil ab diesem Wert die Kurve nicht mehr so stark abfällt. Man solltedaher eine Mittelwertsbestimmung mit mindestens sechs, eine lineare Kalibrierungmit sieben und eine Polynomkalibrierung mit mindestens acht Messtupeln durch-führen.

14.2.3 DC-Auftragung undMessen einer Bahn

Zur quantitativen Auswertung von DC-Platten sollte automatisiert und auf jedenFall strichförmig aufgetragen werden. Nur so erreicht man kleine Standardabwei-chungen bei der Analyse, und nur so kann ein Scanner optimal Lichtabsorptionenmessen. Gerade strichförmiges Auftragen vermindert Positionsfehler bei der Bahn-detektion! Ein Abstand von 5 mm zum seitlichen Plattenrand muss unbedingt ein-gehalten werden, um ungleiche chromatographische Bedingungen zu vermeiden.Bei Lichtleiteraufnahmen sollte die Auftragebreite zwischen 5 und 7 mm betragen,je nach Breite des verwendeten Interfaces. Die strichförmige Auftragung muss aufjeden Fall breiter als das verwendete Messinterface sein. Die Trennungen sollten ineinem Bereich von 0,05 < Rf-Wert < 0,95 ablaufen, um überhaupt eine Trennung zugewährleisten.

Kalibrierlösungen, wie auch Proben, sollten ungeordnet aufgetragen werden.Auf keinen Fall sollte auf der DC-Platte eine geordnete Auftragung (z. B. linksdie Standards, rechts die Proben) zu sehen sein. Der Hintergrund dieser Empfeh-lung ist, dass die Schichtdicke einer DC-Platte nicht unbedingt konstant sein muss.Angenommen, auf einer Seite sei sie signifikant dünner als auf der anderen. Beizufälligen Auftragungen wird die ungleichmäßige Schichtdicke zu einer Erhöhungder Messvarianz führen. Trägt man jedoch so auf, dass z. B. die niedrigeren Ka-librierung auf der dünneren Seite liegen, wird sich eine systematisch verfälschte


Abb. 14.1 Dargestellt ist der Ausdruck t=p

f , gegen die Anzahl der Freiheitsgrade aufgetragen,berechnet für p = 0,95 %

Steigung der Kalibrierfunktion ergeben. Das Ergebnis zeigt dann nicht nur einegrößere Varianz als auf einer gleichmäßig gearbeiteten Platte, sondern es gerät auchsystematisch falsch. In der Literatur wird daher die sogenannte „Data-pair-Technik“zur Auftragung empfohlen.

Beim Scannen einer Bahn müssen die Parameter Messgeschwindigkeit und Plat-tenvortrieb so gewählt werden, dass eine Substanzzone durch mindestens 25 Da-tenpunkte erfasst wird. Die Remissionswerte sollten in einem Bereich von 0,1 bis0,9 liegen. Auch sollte eine Bahn – wenn möglich – immer ungetaucht vermessenwerden. Je weniger Arbeitsschritte bis zum Endergebnis anfallen, umso kleiner istdie Unsicherheit im Endergebnis.


14.2.4 Die Kalibrierung in der DC

Das Erstellen einer Kalibrierung ist bei einer Methodenentwicklung meist der ersteArbeitsschritt. Hierbei wird nicht nur der Arbeitsbereich, sondern auch die Detekti-onsmethode festgelegt [18].

14.2.4.1 Generelle Aspekte zur KalibrierungGenerell werden zwei verschiedene Arten der Kalibrierung unterschieden: die phy-sikalische und die chemische Kalibrierung [6]. Durch eine physikalische Kalibrie-rung wird die Funktionsfähigkeit eines Messgerätes überprüft. Bei DC-Scannernwird z. B. vor Inbetriebnahme des Gerätes der Dunkelstrom gemessen, und dieserWert wird dann von allen nachfolgenden Messwerten abgezogen. Auch die Justie-rung der x- und y-Koordinaten eines Scannertisches relativ zu einem Ursprungswertist eine physikalische Kalibrierung und wird automatisch beim Einschalten des Ge-rätes durchgeführt. Die korrekte Einstellung des Abstandes, den das Messinterfaceüber der Platte einnehmen soll, ist ebenfalls eine physikalische Kalibrierung.

Eine chemische Kalibrierung dient der funktionalen Bestimmung zwischen vor-gegebener Stoffmenge und der Messgröße. Dazu müssen unabhängige Einwaagenvermessen werden. Nicht zulässig ist eine einmalige Einwaage, aus der durch Ver-dünnen die entsprechenden Kalibrierstandards hergestellt werden, denn bei diesemVorgehen ist die Gefahr eines systematischen Fehlers durch eine fehlerhafte Ein-waage zu groß. Auch würde bei solch einer Vorgehensweise die Varianz der Probe-aufarbeitung ignoriert. Es müssen mindestens sechs, besser zehn Kalibrierlösungenfür eine Kalibrierung hergestellt werden. Der Arbeitsbereich sollte so angelegt sein,dass sich die zu erwartende Konzentration der Probe in der Mitte des Arbeits-bereiches befindet. Über die Kalibrierfunktion kann ein Messwert dann in einenGehaltswert umgerechnet werden.

14.2.4.2 Linearität einer KalibrierungIn den ICH-Richtlinien [1] wird von Linearität der Kalibrierfunktion gesprochen,obwohl eine Kalibrierung nicht unbedingt linear sein muss. Hier spielt die einseitigeFixierung auf UV-vis-Spektrometrie und HPLC eine Rolle, da wegen der Gültig-keit des Lambert-Beer-Gesetzes bei beiden Techniken immer Linearität zwischenKonzentration und Messsignal gegeben ist.

Wenn illustriert werden soll, dass die Kalibrierfunktion linear ist, dann sollteman die individuelle Steigung zwischen zwei Messwerten gegen die Kalibrierfunk-tion graphisch darstellen. In Abb. 14.2 wurden Messwerte gegen den Analytgehaltdurch eine blaue Kurve abgebildet. Die Ausgleichsfunktion, nach der Geradenglei-chung berechnet, sieht problemlos aus. Der Korrelationskoeffizient berechnet sichzu 0.99152 und deutet damit auf einen hohen Grad an Linearität hin. Die Differen-zen zweier aufeinanderfolgender Messwerte sind rot dargestellt, zusammen mit derentsprechenden Ausgleichsfunktion.

Bei den Steigungswerten (Abb. 14.2, rot) ist ein eindeutiger Trend zu erkennen.Die Abstände aufeinanderfolgender Messwerte werden immer kleiner. Damit istkeine Linearität im Arbeitsbereich gegeben, und die Daten wären besser über einen


Abb. 14.2 Messdaten, ausgewertet nach einer linearen Regression und Trendanalyse über dieSteigungswerte jeweils zweier aufeinanderfolgender Messwerte. Blau lineare Regression, rotTrendanalyse

Polynomausgleich ausgewertet worden. Die graphische Darstellung der Messwer-tedifferenz kann einen Trend sehr empfindlich anzeigen. Statt einer graphischenAuftragung kann ein Trend auch durch den Vergleich der Streuung der Messwerteum den Mittelwert (var(y)) im Vergleich zur Differenzenbildung aufeinanderfolgen-der Messwerte (entsprechend der Methode Trendtest nach Neumann) nachgewiesenwerden. Die quadrierte Abweichung der Messwerte vom Mittelwert wurde schonals Varianz eingeführt. Wird in die Formel für die Varianz die Mittelwertsdifferenzdurch zwei aufeinanderfolgende Messwert ersetzt, erhält man die mittlere quadra-tische Abweichung von aufeinanderfolgenden Messwerten:

2 D 1

nC � 1

nC�1XiD1

.yiC1 � yi /2 : (14.2)

Der Prüfwert (TN) ist definiert als der Quotient aus dem Streuungsquadrat derMesswertdifferenzen und der Varianz (engl. ratio of the mean square successivedifference to the variance).

TN D 2

var.y/D

nC�1PiD1

.yiC1 � yi /2

nCPiD1

.yi � YC/2

: (14.3)


Liegen trendfreie Messwerte vor, die einer Normalverteilung gehorchen, so ist 2 etwa doppelt so groß wie var(y). Sobald ein Trend vorliegt, werden im Mittel dieaufeinanderfolgenden Differenzen kleiner und es folgt: 2 < var(y). Als Schrankefür den Trendtest nach Neumann (VN) kann als Näherung die Schranke der Nor-malverteilung (z˛) verwendet werden. Es gilt:

VN D 2 � 2z˛

sn � 2

.n � 1/.n C 1/: (14.4)

Die Prüfgröße TN (aus (14.3) wird nun mit der Schranke (VN) in (14.4) vergli-chen. Die Daten zeigen einen Trend, wenn sich aus der Rechnung TN < VN ergibt.

In der DC-Analyse sollte die Wahl der Kalibrierfunktion ausschließlich nach derGröße des Gesamtfehlers einer Methode erfolgen. Dazu testet man einen Daten-satz (Kalibrierung und Messdaten eines Analyten) über verschiedene Kalibrierfunk-tionen und verschiedene Linearisierungsmodelle, bzw. man testet in der erweiter-ten Kubelka-Munk-Gleichung verschiedene Rückstreufaktoren. Zweckmäßigerwei-se sollte man sich dann für die Kombination mit der geringsten Messunsicherheit imEndergebnis entscheiden. Damit werden auch alle Tests auf Linearität überflüssig,die nur die Wahl einer linearen Kalibrierfunktion im Arbeitsbereich nachträglichsanktionieren sollen. Beliebt ist hier immer wieder die Angabe eines Korrelations-koeffizienten. Da dieser in den meisten Fällen Werte nahe eins zeigt, sanktioniert erhäufig alle Arten von Kalibrierung als linear.

14.2.4.3 Der Arbeitsbereich einer KalibrierungZur Festlegung des Arbeitsbereiches (engl. range) sollten verschiedene Messme-thoden (Remission, Fluoreszenz, selektive Färbung, Biodetektion usw.) ausgetestetund die Kalibrierung mit der größten Steigung auswählt werden, denn hier erreichtman die größte Messempfindlichkeit. Dann sollte der Auswertealgorithmus mit demkleinsten Fehler bestimmt werden. Den kleinsten Gesamtfehler einer DC-Kalibrie-rung erhält man bei Remissionsmessungen in der Regel über eine Auswertung nachder linearen Regression in Kombination mit der �lg(R)-Transformation. Allerdingsist deren linearer Arbeitsbereich nicht sehr groß. Wird ein größerer Arbeitsbereichgewünscht, sollte eine Polynomauswertung benutzt oder nach der erweiterten Ku-belk-Munk-Theorie linearisiert werden. Dabei hat es sich gezeigt, dass für eine DC-Analytik die Auswertung über ein Polynom zweiten Grades in den meisten Fällenvöllig ausreicht. Höhere Polynomgrade sind häufig unvorteilhaft, da sie wegen dergrößeren Anzahl an Fit-Parametern – bei gleicher Messunsicherheit – mehr Kali-brierdaten benötigen als lineare Funktionen.

In der Literatur empfohlen wird eine Kalibrierung, die aus acht möglichst äqui-distanten Konzentrationen besteht, mit denen zehn Datenpunkte gemessen werden[8, 18]. Die kleinste und die größte Konzentration sollte jeweils doppelt aufgetragenwerden. Auch muss zumindest einmal die Varianzengleichheit (Homoskedastizität)über den ganzen Arbeitsbereich nachgewiesen worden sein. Dazu bestimmt man dieVarianzen von jeweils sechs Auftragungen an den beiden Rändern des Arbeitsberei-ches. Diese müssen sich im Rahmen des statistischen Fehlers als gleich erweisen,


was mit einem Fisher’schen Varianzentest überprüft werden kann. Stellt man eineUngleichheit der Varianzen an den Seiten des Arbeitsbereiches fest, muss diesereingeengt werden, bis Varianzengleichheit herrscht.

Ist ein sehr großer Arbeitsbereich gewünscht, bleibt bei Remissionsmessungennur die Auswertung nach der erweiterten Kubelka-Munk-Transformation. Für ei-ne Analyse bei hohen Konzentrationen ist die Kubelka-Munk-Transformation mitk = 1/2 als einzige Methode zur Auswertung geeignet, da andere Modelle hier schonin den Sättigungsbereich laufen und keine Empfindlichkeit mehr zeigen.

Fluoreszenzmessungen sind sehr empfindlich und werden oft in der Spuren-analytik eingesetzt. Sie zeigen in der Regel in einem großen Arbeitsbereich einenlinearen Zusammenhang zwischen aufgetragener Analytmasse und resultierendemMesssignal. Will man bei höheren Konzentrationen arbeiten, muss mit sogenannten„Sättigungeffekten“ gerechnet werden. Die Kalibrierfunktion knickt dann bei hohenAnalytmengen ab und verläuft parallel zur x-Achse. Hier kann der Arbeitsbereichdurch die Verwendung des quadrierten Fluoreszenzsignals ausgeweitet werden.

14.2.4.4 Kalibrationsfreie Methoden (externer und interner Standard)Häufig wird in der Routineanalytik mit der Methode des externen Standards ge-arbeitet, um umfangreiche Kalibriermessungen zu vermeiden. Dabei wird aus der(mehrfachen) Vermessung der Probe und eines Standards über Dreisatzrechnungder Analytgehalt direkt bestimmt. Dieses Vorgehen ist nur erlaubt, wenn ein linearerZusammenhang zwischen Messgröße und aufgetragener Stoffmenge (Konzentrati-on in der Zone) vorliegt. Auch darf die Analysenfunktion keinen Achsenabschnittzeigen. Ist nur eine der beiden Bedingungen nicht erfüllt, liefert diese „Einpunkts-kalibrierung“ methodisch falsche Werte. Daher muss vor dem Einsatz der Methodedes externen Standards die Linearität der Kalibrierfunktion im Arbeitsbereich zwin-gend überprüft werden. Wenn man DC-Trennungen mit der Methode des externenStandards auswerten will, kommt man an der Theorie der erweiterten Kubelka-Munk-Transformation nicht vorbei. Alles Gesagte gilt auch für die Methode desinternen Standards und die Standardadditionsmethode.

14.2.4.5 Optimierte KalibrierungKann mit der Methode des externen Standards nicht gearbeitet werden, empfiehltes sich, eine Standardlösung im Gehalt unterhalb und oberhalb des zu überprü-fenden Wertes mehrfach zu vermessen. Die Standards können z. B. bei 80 % und120 % des zu überprüfenden Gehaltes liegen. Innerhalb eines so kleinen Messbe-reiches ist fast immer eine lineare Abhängigkeit zwischen Messwert und Gehaltgegeben. Damit kann hier jedes Linearisierungsmodell verwendet werden. Durchdie Messung bei zwei unterschiedlichen Gehalten ist es auch unerheblich, ob dieKalibrierfunktion einen Achsenabschnitt besitzt oder nicht. Darüber hinaus kanndie Anzahl der Kalibriermessungen entscheidend reduziert werden, wenn nach derMethode der optimierten Kalibrierung gearbeitet wird [20]. Dabei wird ein einzigerKalibriersatz für mehrere Bestimmungen benutzt. Bei jeder neuen Analyse werdenaus diesem Kalibriersatz zufällige Werte eliminiert und neu vermessen. So wirdzur Quantifizierung eine zeitlich fortlaufende Kalibrierung benutzt, die den Mess-

14.4 Wie werden richtige Ergebnisse erhalten? 441

aufwand erheblich verringert und zeitlich auftretende systematische Fehler schnelloffenbart [20].

14.3 Die Präzision in der DC

Der Test auf Präzision liefert die Information über das Zufallsrauschen (den Zufalls-fehler) des gesamten Analysenablaufs, bestehend aus Probenahme, Aufarbeitung,Messung und Berechnung. In den ICH-Richtlinien ist die Präzision einer Metho-de auf drei verschiedenen Ebenen definiert: Wiederholbarkeit der Analyse (engl.repeatability), zeitliche Wiederholbarkeit (engl. intermediate precision) und Wie-derholbarkeit zwischen verschiedenen Laboratorien (engl. reproducibility). Unterder Wiederholbarkeit einer Messung versteht man die prozentuale Standardabwei-chung, bezogen auf den Gehalt einer homogenen Probe. In den Richtlinien wirdin der Regel mindestens eine sechsfache Bestimmung der Probe innerhalb eineskurzen Zeitraums durch dieselbe Person vorgeschrieben. Bei der zeitlichen Wie-derholbarkeit wird die gleiche Probe an verschiedenen Tagen durch verschiede-ne Personen mit unterschiedlicher Ausrüstung vermessen, und anschließend wirddie relative Standardabweichung berechnet. Bei der Reproduzierbarkeit von Mess-ergebnissen bestimmen verschiedene Laboratorien identische Proben zu verschie-denen Zeiten. Die Bestimmung von Reproduzierbarkeiten ist nur nötig, wenn Mess-methoden auf andere Laboratorien übertragen werden sollen.

Wie kann die Messunsicherheit einer DC-Methode minimiert werden? Grund-sätzlich dürfen die Remissionswerte bei Quantifizierungen nur in einem Bereichvon 0,1 bis 0,9 liegen. Damit bestimmt diese Vorgabe probeabhängig die Menge derAuftragung! Auch sollte man immer ein Referenzspektrum wählen, das neben demzu quantifizierenden Peak gemessen wurde. Nur so wird eine Störung des Platten-untergrunds minimiert. Den kleinsten Fehler erhält man bei einer Auswertung überdie Absorptionsformel [�lg(R)] bzw. über die erweiterte Kubelka-Munk-Transfor-mation. Die originale Kubelka-Munk-Transformation sollte nur benutzt werden,wenn im Bereich hoher Stoffmengen gemessen werden soll. Die Erfahrung zeigtaußerdem, dass die Verwendung einer Integrationssoftware meistens kleinere Stan-dardabweichungen liefert als eine manuelle „Handintegration“.

14.4 Wie werden richtige Ergebnisse erhalten?

Die Richtigkeit einer Messung beschreibt die Differenz (den Bias) des Messwerteszum wahren Gehaltswert der Probe. Die Richtigkeit einer Messung kann z. B. durchden Vergleich mit einem zweiten, unabhängigen Messverfahren oder durch die Ana-lyse eines zertifizierten und daher im Gehalt genau bekannten Referenzmaterialsüberprüft werden. Bei komplexen Proben ist die Bereitstellung einer zertifiziertenMischung mit allen Störsubstanzen in der Matrix zu kompliziert, um im Laborall-tag durchgeführt zu werden. Hier empfiehlt sich die Methode des internen Standardsoder die Standardadditionsmethode.


Bei der Methode des internen Standards wird der Probe eine dem Analyten ähnli-che Substanz beigemischt und im Rahmen der Probeaufarbeitung mit aufgearbeitet.Steht ein massenselektiver Detektor zur Verfügung, kann der interne Standard z. B.der isotopenmarkierte Analyt sein. Verluste während der Probeaufarbeitung werdenso rechnerisch kompensiert.

Bei der Standardadditionsmethode werden der Probe verschiedene Analytmen-gen als Standard zugemischt. So wird – im Gegensatz zur Methode des internenStandards – auch der Standard (und nicht nur der Analyt) in Gegenwart der Matrixvermessen. Das Standardadditionsverfahren ist aus dem Aspekt der Messrichtigkeitdem in- und externen Standard vorzuziehen.

14.4.1 DieWiederfindungsrate

Die Wiederfindungsrate einer Analyse des Referenzstandards wird meistens alsProzentwert des Messergebnisses (cm) angegeben, bezogen auf den zertifiziertenWert (csoll). Bei n Messungen errechnet sich die prozentuale Wiederfindungsrate wnach folgender Formel:

w D 100 %

n

nXiD1

cm.i/

csoll.i/: (14.5)

Bei dieser Methode wird der Standard ohne Matrixeinfluss vermessen. Man kannder Probe auch eine definierte Menge bzw. verschiedene Mengen an Analyt zumi-schen. Anschließend werden die Analytgehalte der Mischungen bestimmt und alsprozentuale Wiederfindungsrate angegeben, berechnet auf den zugemischten Ge-halt.

14.4.2 Bestimmung der Richtigkeit über Aufstockungen

Am einfachsten überprüft man die Richtigkeit einer Methode, indem die Steigungs-werte der Kalibriergeraden mit und ohne Matrix gemessen und dann miteinanderverglichen werden.

In Abb. 14.3 z. B. wurden verschiedene Mengen eines anionischen Tensides(Perfluoroctan-Sulfonat) aus Wasser (blaue Messwerte) und einem chromathalti-gen Galvanikbad (rote Messwerte) extrahiert, mittels HPTLC von Begleitstoffenabgetrennt und in Fluoreszenz vermessen. Die Methode ist für eine sehr empfind-liche Bestimmung anionischer Tenside als Summenparameter geeignet. Die beidenberechneten Steigungswerte sind identisch, was mit einem Mittelwert-t-Test über-prüfbar ist, aus dem Plot in Abb. 14.3 aber auch direkt abgelesen werden kann.Identische Steigungen (Methodenempfindlichkeiten) zeigen an, dass die Matrix beider Bestimmung keinen Einfluss zeigt.

14.4 Wie werden richtige Ergebnisse erhalten? 443

Abb. 14.3 Gezeigt sind die Gehaltswerte eines Pinakryptol-Tensid-Ionenpaars, ausgeschütteltaus Wasser und aus einer Galvanikprobe. Dazu wurden zu 10 ml einer anionischen Tensidprobe(pH < 5) die Menge von 1 ml des kationischen Farbstoffs Pinakryptol-Gelb (100 mg in 100 ml Me-thanol) und 2 ml Essigsäureethylester zugegeben und das gebildete Ionenpaar ausgeschüttelt. AufKieselgel 60 wird mit n-Propanol/MeOH/2,5 M NaCl/NH3 (25 %) (3 + 1 + 1 + 1, V / V) zu 50 mmentwickelt und in Fluoreszenz bei 480 nm vermessen. Blau Wasserprobe, rot Galvanikprobe

14.4.3 DieWiederfindungsfunktion

Die Richtigkeit einer Methode kann alternativ auch über die Aufstellung einer Wie-derfindungsfunktion überprüft werden, falls weder eine geeignete Aufstocksubstanznoch eine unabhängig arbeitende zweite Messmethode zur Verfügung steht. Zur Be-stimmung der Wiederfindungsfunktion wird die Probe in ihrem Gehalt bestimmt.Dieser Wert wird als „Sollgehalt“ genommen. Dann werden mindestens sechs un-terschiedliche Probemengen aufgearbeitet und vermessen. Die verschiedenen Ana-lytmengen in diesen Proben müssen den ganzen Arbeitsbereich abdecken. Die ge-messenen Analytmengen werden graphisch gegen die für die Probemengen be-rechneten Sollgehalte aufgetragen. Dabei wird die Konzentration des Testresultates(cm) auf der y-Achse gegen die Sollkonzentration der Probe (csoll) auf der x-Ach-se gezeichnet. Die ideale Wiederfindungsfunktion zeigt die Steigung 1 und denAchsenabschnitt 0. Besitzt die Funktion einen Achsenabschnitt, liegt ein additi-ver systematischer Fehler vor. Der systematische Fehler ist hier analytunabhängigund identisch mit dem Achsenabschnitt [6]. Bei einer Steigung ungleich eins liegtein multiplikativer, analytabhängiger systematischer Fehler vor [6]. Bestimmbar istdieser Fehler durch die Abweichung von der idealen Steigung.


Abb. 14.4 Dargestellt ist die Wiederfindungsfunktion von Diquat aus Wasser. Die Steigung be-trägt 0,6379 und der Achsenabschnitt 79,7 ˙ 88

In Abb. 14.4 wurden verschiedene Mengen des Pestizids Diquat aus einem Li-ter Wasser über Ionenaustauschersäulen angereichert und vermessen. Die Sollwertesind auf der x-Achse und die gemessenen Werte auf der y-Achse dargestellt. DieSteigung der Wiederfindungsfunktion beträgt a = 0,6379 ˙ 0,04, es werden also imMittel nur 63,8 % ˙ 4 % der eingesetzten Diquat-Menge wiedergefunden. Damitzeigen die Aufarbeitung und Messung einen systematischen multiplikativen Fehler.Der Achsenabschnitt der Funktion ist 79,7 ˙ 88. Es wird kein additiver systemati-scher Fehler gemessen.

Systematische Fehler entstehen meistens durch eine fehlerhafte Kalibrierung undsollten so weit als möglich minimiert oder am besten ganz ausgeschlossen werden.Auf jeden Fall müssen systematische Fehler bei der Angabe eines Endergebnis-ses mit berücksichtigt werden! Eine Methode ist akzeptabel, auch wenn sie einensystematischen Fehler zeigt. Wichtig ist, dass der Fehler bekannt ist, und dass ei-ne funktionelle Abhängigkeit zwischen Messgröße und Gehalt besteht. Liegen alleMesswerte der Wiederfindungsfunktion im Bereich eines berechneten Vertrauens-bereiches, gilt die Richtigkeit der Methode als nachgewiesen.

14.5 Vertrauensbereich einer Messung

Der Vertrauensbereich einer Messung wird auch als Konfidenzintervall (Cm) be-zeichnet. Er berechnet sich aus der statistischen Abweichung der Messwerte vomMittelwert (zufälliger Fehler) und dem Bias (B), der systematischen Abweichungder Daten vom wahren Wert. Der Vertrauensbereich wird in der Regel für eine

14.6 Bestimmungs- und Nachweisgrenze 445

Abb. 14.5 Dargestellt ist die Berechnung des Vertrauensbereichs einer Messung, dargestellt umden Mittelwert als X ˙ Cm. Der Vertrauensbereich besteht aus einem zufälligen und einem syste-matischen Fehler

Irrtumswahrscheinlichkeit von ˛ = 0,05 (5 %) bestimmt. Damit berechnet sich dasKonfidenzintervall der Bestimmung z. B. eines Mittelwertes aus n Messwerten mitdem systematischen Fehler (B), dem Student-Faktor (tn�1) für f = n � 1 Freiheits-grade und der Varianz var(x) zu:

Cm D ˙�B C tn�1var.x/p

n

: (14.6)

Wie Abb. 14.5 zeigt, muss zur Einhaltung eines vorgegebenen Toleranzlimits(Lp) der Gesamtvertrauensbereich (Cm) einer Messung kleiner als das Toleranzlimitsein [6].

14.6 Bestimmungs- und Nachweisgrenze

Die Angabe einer Bestimmungs- und der Nachweisgrenze kann weitreichende Fol-gen zeigen. Gerade die Nachweisgrenze sollte unabhängig von irgendwelchen Vor-gaben bestimmbar sein, denn sie beschreibt die Grenze zwischen „messbar“ und„nicht mehr messbar“. Als Beispiel für die Bedeutung im täglichen Leben magman sich eine Dopingkontrolle vorstellen. Hier erwartet man die Aussage „gedopt“oder „nicht gedopt“. Ein negatives Resultat, bei dem der Messwert unter der Nach-weisgrenze bleibt, hat keine weiteren Konsequenzen, weder für den Sportler nochfür das analytische Labor. Ein positives Resultat, bei dem der Messwert über derNachweisgrenze liegt, hat gravierende Konsequenzen. Daher muss eine korrekt be-stimmte (gemessene!) Nachweisgrenze als Entscheidungskriterium ein möglichst


kleines Risiko eines falsch positiven Resultates (˛-Fehler) gewährleisten, alleinschon, um teure juristische Folgen für den Analytiker zu vermeiden.

Für die Berechnung der Bestimmungsgrenze und der Nachweisgrenze (engl. li-mit of quantification, LOQ, und limit of detection, LOD) wurden eine Reihe vonVorschlägen gemacht [18]. Die ICH-Guidelines definieren die Bestimmung derNachweisgrenze als eine individuelle Bestimmung der kleinsten Menge an Ana-lyt in der Probe, die zwar noch gemessen, aber nicht unbedingt quantitativ erfasstwerden kann. In der Regel wird bei einer Dreifachmessung gefordert, dass die Si-gnalhöhe oder -fläche im Vergleich zur Rauschhöhe einer leeren Messung für dieNachweisgrenze LOD 3 : 1 und für die Bestimmungsgrenze LOQ 9–10 : 1 be-tragen soll.

14.6.1 Die Nachweisgrenze (LOD)

Im Jahre 1956 hatte H. Kaiser vorgeschlagen [21], als Entscheidungskriteriumfür die „Nachweisgrenze“ den Student-Faktor für den unendlichen Freiheits-grad bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p = 0,9973 zu nehmen. Dieser istt(p = 0,9987, 1 ) = 3,00. Kaiser schreibt dazu [21]: „Für den sicheren Nachweis einesStoffes ist zu fordern, dass die Differenz zwischen der analytischen Messgröße xund dem mittleren Blindwert größer ist als ein bestimmtes Vielfaches der Standard-abweichung der Blindwerte.“ Das Signal-Rausch-Verhältnis S/N (engl. signal tonoise ratio) ist der Kehrwert der relativen Varianz. Bei mehreren Messungen solltedieses (nach H. Kaiser) über 3 liegen, damit man den Wert x sicher vom Rauschender Messung var(x) unterscheiden kann.

S

ND x

var.x/D 1

rel var.x/ 3 (14.7)

In den ICH-Guidelines wird dieser Ansatz übernommen. Die Detektionsgrenzesollte als Quotient des Signal-Rausch-Verhältnisses zwischen 3 und 2 : 1 liegen [1].Es wird gleichzeitig empfohlen, die Nachweisgrenze aus der Kalibrierfunktion zuberechnen, mit var(x) als der Varianz (berechnet nach 13.14) und mit A als Steigungder Kalibrierung [1]:

LOD D 3var.x/

A: (14.8)

Alternativ kann die Berechnung der Nachweisgrenze auch aus dem Vertrauens-bereich der Kalibrierfunktion erfolgen [18, 22–25].

14.6.2 Die Bestimmungsgrenze (LOQ)

Die Bestimmungsgrenze wird in den ICH-Guidelines als eine individuelle Bestim-mung definiert, bei der der kleinste Wert des Analyten in der Probe noch mit einerakzeptablen Präzision quantifiziert werden kann. In den ICH-Guidelines und auch

14.6 Bestimmungs- und Nachweisgrenze 447

Abb. 14.6 Dargestellt ist die Berechnung der Bestimmungsgrenze (LOQ) nach dem EURA-CHEM-Ansatz

der Europäischen Pharmakopöe wird für die Bestimmungsgrenze (LOQ, engl. limitof quantification) mehr oder weniger willkürlich gefordert, dass ihr Signal-Rausch-Verhältnis einen Wert von 10 : 1 betragen soll. Es wird gleichzeitig empfohlen, dieBestimmungsgrenze aus der Kalibrierfunktion mit (14.9) zu berechnen, mit var(x)als der Varianz (berechnet nach 13.14) und A als Steigung der Kalibrierfunktion [1]:

LOQ D 9var.x/

A: (14.9)

Eine alternative Methode zur Messung der Bestimmungsgrenze ist als EURA-CHEM-Ansatz publiziert worden [2]. Hierzu werden bei unterschiedlichen Kon-zentrationen nahe der Bestimmungsgrenze jeweils fünf Messungen gleicher Kon-zentration ausgewertet. Die relativen Standardabweichungen werden entsprechendAbb. 14.6 graphisch gegen die vermessene Konzentration aufgetragen [2]. Bei einer(gerade noch) akzeptierbaren relativen Standardabweichung (z. B. 10 %) wird ausdem Graphen die entsprechende Bestimmungsgrenze als Konzentrationswert ab-gelesen. Als vorgegebene relative Standardabweichungen werden häufig 10 % fürVerunreinigungen in Reinsubstanzen und 15 % in Mischungen bzw. im pharmazeu-tischen Endprodukt vorgegeben [1, 2].

14.6.3 Die Bestimmungsgrenze (LOQ) und Nachweisgrenze (LOD),berechnet aus dem Vertrauensbereich der Kalibrierung

Die Definition von H. Kaiser zur Nachweisgrenze hat einiges für sich. Insbesonderekann er den Wert „dreifaches Rauschen der Blindwerte“ statistisch begründen, dendie Nachweisgrenze größer als der mittlere Blindwert sein soll. Das Problem diesesAnsatzes liegt natürlich in der Benutzung des Blindwertes für die Definition, dessen


Abb. 14.7 Dargestellt ist die Peakbreite der Gauß-Verteilungen von Blindwert (blank), LOD undLOQ. Die Basis-Peakbreite beträgt jeweils 6

Wert an sich und dessen Rauschen als bekannt vorausgesetzt wird. Leider kann manweder den Blindwert noch dessen Rauschen messen.

Geht man nun von einer Kalibrierfunktion Y = AX aus, also einer Geraden ohneAchsenabschnitt, kann der Blindwert durch Extrapolation als Y-Wert bei X = 0 be-stimmt werden. Auch die Varianz des Blindwertes lässt sich so bestimmen, wennder Vertrauensbereich der Kalibrierung extrapoliert wird. Wird der Vertrauensbe-reich für ein ˛ = 0,002 berechnet, ergibt sich nach Tab. 13.1 für die Basis-Peakbreiteder Gauß-Funktion eine Breite von 6 . In Abb. 14.7 ist das Vorgehen graphischdargestellt. Das aus den Daten der Kalibrierfunktion extrapolierte Blanksignal (mit6- -Basis-Signalbreite) ist links dargestellt. In 3- -Abstand (3-Sblank-Abstand inAbb. 14.7) liegt das LOD-Signal, ebenfalls mit einer 6- -Basis-Signalbreite. DieWahrscheinlichkeit für den LOD, falsch negativ bestimmt worden zu sein, liegtbei ß, dem Flächenanteil des Überlappungsintegrals zwischen Blind- und LOD-Verteilungsfunktion. Der falsch positive Fehler (˛-Fehler) liegt bei 1 % und wirddurch das Überlappungsintegral der Blindwertverteilung mit der LOD-Verteilungbeschrieben. Man befindet sich bei dieser Definition juristisch gesehen also auf „dersicheren Seite“ [22–24].

Zur Durchführung stellt man die Kalibrierfunktion mit dem entsprechenden Ver-trauensbereich von ˛ = 0,002 graphisch dar. Die Nachweisgrenze des Verfahrenswird über den Schnitt des unteren Vertrauensbands mit der x-Achse definiert. Dortist der y-Wert des unteren Vertrauensbands gleich null. In Abb. 14.8 ist das z. B.bei 22 ng Paraquat der Fall. Zur Bestimmung von Detektions- und Nachweisgrenzewird der Wert des oberen Vertrauensbands am Schnittpunkt des unteren Vertrauens-bands mit der x-Achse ermittelt. In Abb. 14.8 liegt dieser Schnittpunkt (Punkt A) beiden Koordinaten X = 22 ng Paraquat und Y = 2,5 Area-Einheiten (also Flächenein-heiten). Am oberen Bereich des Vertrauensbandes wird nach rechts (parallel zur x-Achse) eine Gerade gezeichnet. Der Schnitt dieser Geraden mit der Kalibrierfunk-

14.7 Robustheit der DC-Methode 449

Abb. 14.8 Dargestellt ist die Berechnung der Detektionsgrenze (LOD) und der Bestimmungs-grenze (LOQ) nach [18]

tion beschreibt die Detektionsgrenze (LOD), die in Abb. 14.8 bei 22,1 ng Paraquatliegt. Der Schnitt der Geraden mit dem unteren Vertrauensband (Punkt B) wird in Y-Richtung zur Gerade verlängert. Der untere Wert des Vertrauensbandes bei diesemY-Wert legt die Bestimmungsgrenze (LOQ) fest. In Abb. 14.8 ist das bei 47,6 ngParaquat der Fall.

Der Vorteil der Methode ist einleuchtend: Es werden keine individuellen Vor-gaben zur Berechnung benötigt. Nachweis- und Bestimmungsgrenze können denstatistischen Daten der Kalibrierung bzw. ihres Vertrauensbereiches direkt entnom-men werden.

14.7 Robustheit der DC-Methode

Die Robustheit einer Methode ist definiert als das stabile Verhalten gegenüber klei-nen, willkürlichen Änderungen der Arbeitsbedingungen [1, 2]. Man sollte bei allenDC-Methoden z. B. kleine Wechsel in der Laufmittelzusammenstellung untersu-chen, um die Trennfähigkeit bei ungenauer Mischung des Fließmittels abschätzenzu können. Insbesondere ist bei adsorptionschromatographischen Trennungen aufdas Verhalten bei kleinen Änderungen im Wassergehalt des Fließmittels zu achten.Häufig ist eine sich ändernde Luftfeuchtigkeit auch verantwortlich für eine Ände-rung des Laufverhaltens, weil aktive Zentren des Sorbens blockiert werden. DieserEinfluss auf das Trennverhalten muss sehr genau untersucht werden. Gegebenen-falls müssen Platten unter konstanten Bedingungen gelagert werden, und dies mussin der Vorschrift auch so festgehalten werden.

Zur Erarbeitung reproduzierbarer DC-Ergebnisse sollte auch der Einfluss einerunregelmäßig gestrichenen stationären Phase berücksichtigt werden. Die Probe-auftragung sollte immer quer zur Streichrichtung der Platte erfolgen, da nur so


der Einfluss der Plattenunebenheiten ausgeglichen werden kann. Die 10 cm × 10 cmgroßen HPTLC-Platten werden anbieterseitig im rechten Winkel zur Streichrich-tung geschnitten. Wenn möglich, sollte daher immer an der scharfen Schnittkanteaufgetragen werden. Auch empfiehlt es sich, Probe und Standard abwechselnd auf-zutragen, um eventuell bestehende Plattenunebenheiten ausgleichen zu können. Da-mit wird unter Umständen der Präzisionsfehler vergrößert, auf jeden Fall aber dieRichtigkeit verbessert. Wie schon erwähnt, sollte bei der Auftragung ein Abstandvon 0,5 bis 1 cm zum Plattenrand immer eingehalten werden.

Eine Vorkonditionierung der Platte ist in den meisten Fällen nicht nötig. ImInteresse einer stabilen Trennung sollten immer unkonditionierte, luftgetrockneteSchichten verwendet werden. Auf jeden Fall sollte man die Platte nie bei Tempe-raturen von über 120 °C thermisch voraktivieren, auch wenn dies in vielen Vor-schriften verlangt wird. Ist der Wassergehalt der stationären Phase ein Problem,weil die Rf-Werte je nach Luftfeuchtigkeit (oder Jahreszeit) stark schwanken, soll-te in Räumen mit stabilem Klima gearbeitet werden. Zumindest die Platten solltenunter stabilen klimatischen Bedingungen gelagert werden. Hier bietet die Industriemit klimatisierten Entwicklungskammern bequeme technische Lösungen an. Diealternative Verwendung von RP-Phasen kann bei diesem Problem ebenfalls Abhilfeschaffen.

Als Entwicklungskammer sollten nur Horizontalkammern mit ungesättigterDampfphase oder Vertikalkammern ohne Kammersättigung verwendet werden.Diese Kammerarten zeigen die schnellsten und häufig auch die stabilsten Ergeb-nisse. Auf jeden Fall verbrauchen sie die wenigsten Lösungsmittel. Werden beidieser Art der Entwicklung ˇ-Fronten beobachtet, muss mit Kammersättigung ge-arbeitet werden. Hier bieten sich kleine Doppeltrogkammern an, in denen man diePlatten auch vorkonditionieren kann. Für viele Trennungen mit kritischen Fließ-mittelkombinationen liefert diese Kammerart die stabilsten Ergebnisse. Wird mitKammersättigung gearbeitet, müssen die Bedingungen (Einsatz von Löschpapier,Sättigungszeit, Temperatur, Konditionierzeit) genau dokumentiert und bei einerAnalyse auch eingehalten werden. Die Entwicklungsstrecke für HPTLC-Plattensollte zwischen 3 und 8 cm Trennstrecke liegen. Optimal sind Trennstrecken zwi-schen 4 und 5 cm, da hier die Platte in einer Horizontalkammer von zwei Seitengleichzeitig entwickelt werden kann.

Alle diese Bedingungen sollten bei kleinen Veränderungen nur geringe Einflüs-se auf die Trennleistung der Methode haben. Ist der Einfluss groß, muss bei derschriftlichen Niederlegung der Prozedur speziell darauf eingegangen werden. Oftführt bei unstabilen Trennbedingungen nur ein Wechsel der stationären Phase zueiner stabilen Methode.

14.8 Kontrollkarten in der Routineanalytik

Die Dünnschichtchromatographie ist eine Parallelmethode, die viele Proben gleich-zeitig verarbeiten kann. Probe und Standard sollten dabei abwechselnd auf einerPlatte aufgetragen werden. Wegen der großen Kapazität der Trennplatten werden

Literatur 451

Plattenbereiche für die eigentliche Analytik oft nicht benötigt. Natürlich kann man,quasi auf Vorrat, mehr Proben als nötig auftragen. Es empfiehlt sich jedoch in derRoutineanalytik, immer auch eine Kontrollprobe (ein zertifizierter Standard oderein Gemisch ähnlich laufender Substanzen) mit zu entwickeln. Die Auflösung je-der Trennung kann so, abhängig vom Messtag und relativ zum Langzeitstandard,dokumentiert werden. Man sollte auch, parallel zur Probeplatte, regelmäßig eineReferenzplatte mit bekannten Substanzen mitlaufen lassen. Die Messgrößen (Auf-lösung, Rf-Werte, Gehalt, Nachweisgrenze, Laufhöhe usw.) solcher Referenzplat-ten liefern, zeitlich in Form von Kontrollkarten dargestellt, einen ausgezeichnetenÜberblick über die Langzeitstabilität einer Methode. Auf diese Weise kann überlängere Zeiträume die Robustheit einer Methode praktisch nebenher überwacht unddokumentiert werden.

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Sachverzeichnis

1,3-Dioxoindan, 1961,3-Naphthalendiol, 1961-2 Naphthochinon-4-sulfonsäure-Reagenz,

2001-Naphtholreagenz, 1962,2-Di-(4-tert-octylphenol)-1-picrylhydrazyl,

2202,3-Diaminonaphthalin, 1752,3-Diaminonaphthalin-Reagenz, 2142,4-Dinitrofluorobenzol, 1832,4-Dinitrophenylhydrazin, 1972,4-Dinitrophenylhydrazinreagenz, 1972,6-Dibromchinon-4-chlorimid, 1982,6-Dichlorchinon-4-chlorimid, 1992,6-Dichlorphenol-indophenol, 190, 199, 2532D-Chromatographie, 1622-Aminophenol, 1962-Diphenylacetyl-1,3-indandion-1-hydrazon,

1812-Methoxybenzaldehyd, 1943,5-Dinitrobenzoylchlorid, 1843-Methyl-2-benzothiazolin-3-on hydrazon HCl

(MBTH), 1994-(2-Pyridylazo)resorcinol (PAR), 1754-(4-Nitrobenzyl)-pyridine (NBP), 2204-(Dimethylamino)-benzaldehyd, 1934-Aminoantipyrin, 1984-Aminohippursäure, 1964-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyle-3-pyrazolin-

5-on, 1984-Anisidin, 1964-Bromphenacyl-bromid, 1804-Methoxybenzaldehyd, 1935,5-Dimethylcyclohexane-1,3-dione, 1968-Hydroxychinolin, 2148-Hydroxychinolin-Reagenz, 214

9,10-Dihydro-9-oxoanthrazen, 19517-Hydroxicorticosteoid, 178

AAbbott, D. C., 119Absorptionskoeffizient, 286accuracy, 397Ackermann, H., 238Acridin, 190Acridinorange, 190Acrylamid, 182, 194Adsorption, 19adsorption chromatography, 15Adsorptionschromatographie, 15, 21, 24, 57,

87Adsorptionsenergie, 59Adsorptionsisotherme, 22Adsorptionsmodell nach L. R. Snyder, 59Aflatoxin B1, 358Aflatoxin B2, 358Aflatoxine, 180Akkad, R., 236aktivierte Olefines, 221Aktivität der stationären Phase, 58Aktivitätsanalyse, 219Aktivitätsparameter, 93Aktivkohle, 58Albumine, 182Aldehyde, 175, 199Alizarin, 214Alizarinreagenz, 213Alkohole, 180, 185alkylierende Substanzen, 220Alternaria brassicicola, 263Aluminiumchlorid-Reagenz, 212Aluminiumoxid, 22, 66Ambrus, A., 235

453B. Spangenberg und C. Weins, Quantitative Dünnschichtchromatographie,DOI 10.1007/978-3-642-55102-4, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

454 Sachverzeichnis

AMD, 156Amine, 185Aminohippursäurereagenz, 197Aminophase, 71Aminophenolreagenz, 197Aminoplatte, 9Ammoniumbicarbonat-Reagenz, 215Ammoniumheptamolybdat, 209Ammoniummonovanadat, 191Analyt, 16analytische Funktion, 405Andreev, L. V., 63Anilino-naphthalen-1-sulfonsäure, 190Anilin-Aldose-Reagenz, 195Anilin-Diphenylamin-Phosphorsäure-

Reagenz, 195Anilin-Phthalsäure-Reagenz, 196Anionenaustauscher, 75Anisaldehyd, 193Anisaldehydreagenz, 193Anisidinreagenz, 197ANS-Reagenz, 190Anthron, 195Antibiotika, 268Antimon(III)-Chlorid, 211Antimykotika, 262Anti-Stokes-Linien, 316antizirkulare Entwicklung, 145Antrachinon, 221Anzahl der realen Trennstufen, 45Anzahl theoretischer Trennstufen, 36APCI-MS (laser desorption/atmospheric

pressure chemical ionisation massspectrometry), 318, 320

APGD-MS (atmospheric pressure glowdischarge mass spectrometry), 318

Approximationsformel nach Hastings, 401AP-MALDI-MS (atmospheric pressure

matrix-assisted laserdesorption/ionisation massspectrometry), 317

Arbeitsbereich, 432, 439Ascorbinsäure, 220Aspergillus niger, 263Atmosphärendruck, 320Auflösung, 40, 42Aufstockungsmethode, 441Auftragebreite, 117, 123Auftrageort, 121Ausschlusschromatographie, 58automated multiple development, 156Azeotrope, 101azeotrope Fließmittelgemische, 102

Aziridine, 221

BBacillus subtilis, 269, 270Barbiturate, 179Barrett, C. B., 10Barton-Reagenz, 191Basissignalbreite, 39Bayerbach, S., 10, 291Beate-Smith, E. C., 31Belenkij, B. G., 50Benzidin, 187Benzo[a]pyren, 381Benzodiazepinen, 180Benzoesäure, 180Berberin, 69, 190Besthorn-Reagenz, 199Bestimmungsgrenze, 432, 446Beyerinck, M. W., 7Bias, 441binary digit, 219Bladt, 189BN-Kammer, 132bonded phases, 70Borsäure, 69, 110Bouguer, P., 292, 331Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz, 286Bratton-Marshall-Reagenz, 207Brenner, M., 132Bromierungen, insitu, 179Bromkresolgrün, 190Buchinger, S., 276

CCapsaicinoide, 179Carbamate, 179Carr-Price-Reagenz, 211Catalan, E. C., 337Catalan-Zahlen, 337Catecholamine, 218CCD-Kameras, 303Cellulose, 74Cellulose-Phasen, 24charring reagents, 191Charring-Reagenzien, 191chemische Kalibrierung, 437chemischer Detektor, 172Chemometrie, 363Chinidin, 215Chinin, 215chirale DC-Phasen, 77Chlor, gasförmig, 179Chloramin-T-NaOH-Reagenz, 206

Sachverzeichnis 455

Chloramin-T-Reagenz, 205Chloramin-T-Säurereagenz, 205Chloramin-T-Trichloressigsäure-Reagenz, 206Chlorierungen, insitu, 179Chloromequat, 203Cholestanol, 179Cholesterol, 179Cholinesterasehemmtest, 234Chromatographiegesetz, 33, 37, 39Chromato-plates, 8ChromeXtraktor, 318Cladosporium cucumerinum, 263Codein, 203Coffein, 293, 346Consden, R., 7, 162Cortisol, 182Covarianz, 420Cramer, F., 9Cramer-Regel, 387, 410, 419Creatin, 218Creatinin, 218Cumarin, 221Curvularia lunata, 263Cyanophase, 24, 70Cyanoplatte, 9Cytochrom-c, 321

DDallas, M. S. J., 10Dampfphase, 129, 137Dansylazirin, 183Dansylchlorid, 182Dansylhydrazin, 182Dansylsemicadaverin, 184Dansylsemipiperizid, 184DART (direct analysis in real time), 318, 320Data-pair-Technik, 122, 436Dausend, C., 275DC-Auflösung, 41DC-Scanner, 10de Zeeuw, R. A., 129Densitogramm, 17Densitometer, 10, 285Derivatisierung, postchromatographisch, 173Derivatisierung, prächromatographisch, 173DESI (desorption electrospray ionisation),

317, 320Desorption, 19DeSSI (desorption sonic spray ionisation), 317Detektorvarianz, 373Diastereomere, 78Diazoalkane, 221Diazotierung, 206

Diazotierungen, insitu, 180Diazotierungsreaktionen, 206Dibenzofuran, 317Dichlorfluorescein, 190Dichlorphenol-indophenol, 190Diethyldithiocarbamate, 175Difenzoquat, 203diffuse reflectance infrared Fourier transform,

315Diffusionskoeffizient, 43, 44, 50Digitalisglykoside, 179DIH-Reagenz, 182Dimedon, 175, 196Dimedon-Phosphorsäure-Reagenz, 196Dimroth, K., 99Dinitrophenylhydrazin, 181Diodenbündelung, 380Dioden-Array-Detektor, 10Dioden-Array-Lichtleiterscanner, 11Dioden-Array-Technik, 291Diolplatte, 9Diphenhydramin, 369Diphenylborsäureanhydrid, 202Diphenylborsäure-2-aminoethylester, 201Dipoleigenschaften, 97Diquat, 203direkte Radioaktivitätsmessungen, 322Dissoziationsgleichung, 107Dithizon, 174DNFB-Reagenz, 183DOOB-Reagenz, 202Doppeltrogkammer, 134Dosis-Wirkungs-Kurve, 276DPPH, 220DPPH-Reagenz, 220Dragendorff-Reagenz, 211DRIFT, 315

EEASI (easy ambient sonic spray ionisation

mass spectrometry), 317EASI-MS, 320Ebel, S., 10, 331Eberz, G., 256Eddy-Diffusion, 43, 47Ehrlich-Reagenz, 193, 306Eichung, 405einseitiger Test, 399Einstein’sches Diffusionsgesetz, 48Einwegkapillaren, 122Einzelvarianz, 394Eisen(III)-chlorid-Reagenz, 213Ekkert-Reagenz, 193

456 Sachverzeichnis

eluotrope Reihe, 92elution chromatography, 15Elutionschromatographie, 3, 15endokrine Disruptoren, 273enhancement of fluorescence, 353Entwicklung, linear, 145Entwicklung, zentrifugal, 144, 145Entwicklung, zentripetal, 145Entwicklungsstrecke, 19Epoxide, 221EP-Reagenz, 193Ester, 179Ethylcarbamat, 194Euler, L., 337Excimer, 353externer Standard, 416Extinktionskoeffizient, 286

FFAB (fast atom bombardment), 318Fehlerfortpflanzung, 403Fehlerfortpflanzungsgesetz, 404Festphasenextraktion (SPE), 115Feundlich, H., 21Fisher’schen F-Verteilung, 411Flachbettscanner, 305Fließgeschwindigkeit, 19Fließmittel, 28, 87Fließmitteloptimierung, 103Fließmittelstärke, 91Fluorescamin, 183Fluorescin-Isothiocyanat, 185Fluoreszenz, 10, 350Fluoreszenzderivatisierung,

prächromatographisch, 181Fluoreszenzformel, 340Fluoreszenzindikator, 8Fluoreszenzindikatoren, 79Fluoreszenzlicht, 349Fluoreszenzlöschung, 359Fluoreszenzverstärkung, 353Fluoreszindikator, 359Färbereagenzien, 171Fokussierung, 118Folin-Ciocalteu-Reagenz, 219Folin-Reagenz, 200, 321Formaldehyd, 175Fourier transformed infrared photoacoustic

spectroscopy (FTIR-PAS), 315Frei, R. W., 176, 181Front, 18frontal chromatography, 15Frontalchromatographie, 3, 15

Frontgradient, 87, 137Fronting, 22Fungizide, 262Funk, W., 175, 181Furfuralreagenz, 195

Ggas chromatography, 15Gasphasenreaktionen, 215Gauglitz, G., 10, 291Gauß-Funktion, 35, 36, 383, 398Gauß-Signal, 39, 40gebundene Kieselgelphasen, 70Geiger-Müller-Zählrohr, 323Geiss, F., 11, 61, 94, 129, 135, 142Geiss, G., 146Genauigkeit, 397Gibbs-Reagenz, 198Giddings, J. C., 47GLP-Richtlinien, 397Glucosamin, 218Glucosereagenz, 194Glykoside, 179Goppelsröder, Ch. F., 3Goppelsröder, F., 25Gordon, A. H., 7Gosset, W. S., 402, 429Gotto, A. M., 215Gradient, 153Gradient, antiparallel, 154Gradientenentwicklung, 16Gradienten-Chromatographie, 147grafted TLC, 163Graphit, 58Grinberg, N., 65Grüss, J., 6Guiochon, G., 11, 43gute Laborpraxis, 397

HhRf-Wert, 26Hall, N. F., 8Halogenierungen, insitu, 179Halpaap, H., 8Hamman. R. L., 10Hannig, K., 303Harnsäure, 218Harnstoff-HCl-Reagenz, 198Hauck, E., 63Hauck, H. E., 9HCl-Reagenz, 216Hefendehl, F. W., 10Herbizide, 253

Sachverzeichnis 457

HETP, height equivalent to a theoretical plate,46

high-performance thin-layer chromatography,62

high-performance thin-layer plates, 50HILIC, 159Hill-Reaktion, 253Homoskedastizität, 411, 439Honegger, C. C., 140Horizontalkammer, 18, 136Horizontal-S-Kammer, 135Hormone, 274Hostettmann, K., 263HPLC-Säule, 30HPTLC, 50, 62H-Kammer, 136Hydrolysereaktionen, insitu, 178hydrophile Interaktionschromatographie, 159

IIdentifizierung bioaktiver Stoffe, 232Imprägnierung mit Borsäure, 69Imprägnierung mit Coffein, 69Imprägnierung mit EDTA, 69Imprägnierung mit Silberkationen, 67Indandionreagenz, 196Integration, 382intermediate precision, 441interner Standard, 424, 440In-situ-Reaktionen, 177Iod, 178Iod als Detektor, 171Iodierungen, insitu, 179Iod-Kaliumiodid-Reagenz, 209Ionenaustauscherharze, 77Ionenfalle, 321Ionenpaarreagenzien, 110Isonicotinsäurehydrazid, 181Isonicotinsäurehydrazidreagenz, 197Isotherme, 21Isotope, 322Isotope, radioaktiv, 322isotrop, 332Izmailov, N. A., 7

JJensen-Reagenz, 206Jork. A., 10Jork, H., 187, 218, 287, 331, 353Jost, W., 9

KKaiser, H., 446

Kaiser, R. E., 8, 11, 50, 62, 117, 118, 146, 160,304, 396

Kalibrierfunktion, 415Kalibrierung, 405Kaliumhexacyanoferrat(III), 198Kaliumhexaiodoplatinat-Reagenz, 213Kammersättigung, 130, 133Kapazitätsfaktor, 27, 30, 31, 34, 36kapillare Sättigung, 130, 141Karrer, P., 1Kationenaustauscher, 75Keller, G. J., 8Ketone, 175, 199Kieselgel, 8, 22, 66Kieselgel 50.000, 74Kieselgel 60, 67Kieselgur, 22, 74Kirchner, J. G., 8, 10, 177, 181Klose, A., 135Knox-Konstante, 43, 49Kodierungen von DC-Platten, 79Kompressionsfaktor, 151Konfidenzintervall, 413, 421Kontakt-Spotting-Verfahren, 123Kontaktwinkel, 20Kontourplot, 291Korngröße, 61Korngröße, mittlere, 64Korngrößenverteilung, 50, 65Korrelationsrechnung, 367Korrelationsspektroskopie, 367korrigierte hRf-Werte, 364Kovar, K. A., 315Kraus, L., 136Kubelka, P., 288, 334Kubelka-Munk-Formel, 341, 342Kubelka-Munk-Theorie, 335Kuhn, R., 6

LLabyrinthfaktor, 44Lambert’sches Kosinusgesetz, 292, 331Langmuir, I., 21Laufmittel, 28, 87LDI (laser desorption ionisation), 317LED, 315Lichtabsorption an Plattenoberflächen, 80Lichtintensität, 10Lichtleiter, 10, 293Liesegang, R. E., 6lineare Kalibrierung, 406Linearität, 432Linearkammer, 133

458 Sachverzeichnis

liquid chromatography, 15Lithiumsulfat (Li2SO4*4H2O), 220LMJ-SSP (liquid microjunction surface

sampling probe), 318LOD, 446Lösungsvermittler, 138LOQ, 446Luftmann, H., 319

MMagnesiumsilikat, 22, 66Maillard-Reaktion, 218MALDI-MS (matrix-assisted laser

desorption/ionisation massspectrometry), 317, 318

Mandelin-Reagenz, 191Manganreagenz, 192Marfeys Reagenz, 78Marquis-Reagenz, 192Martin, A. J. P., 6, 22, 32Martin, M. M., 10Martin-Beziehung, 31, 78Martin-Synge-Gleichung, 27, 31Masseabhängige Remission, 342Massenspektrometrie (MS), 317Matrix, 114measurement trueness, 397Mehrfachentwicklung, 155Mehrwellenlängen-Spektrometrie, 384Meinhardt, J. E., 8Mendoza, C. E., 234Mepiquat, 203Merck AG, 8Messempfindlichkeit, 406Messfehler, 397Messrichtigkeit, 442Methode des externen Standards, 416, 440Methode des internen Standards, 424, 442Methode, Validierung, 431, 432Methodenempfindlichkeit, 410Methyl-NBD-hydrazin, 176Michelson-Interferometer, 315Mikrons, 312Miller, J. M., 8, 177Mittelwert, 391Mittelwert einer Messreihe, 392Mittelwert, gleitend, 381Mittelwert-t-Test, 429MNBDH, 184MNBD-hydrazin, 176Móricz, A. M., 270mobile Phase, 16, 28, 87Modifier, 58, 139

Moleküldiffusion, 45Müller, M. B., 275Monoschicht Fließmittelmoleküle, 59Morlock, G., 182, 319Morphinderivate, 182Munk, F., 289, 334

NN,N,N0,N0-Tetramethyl-1,4-phenylendiamin,

208N,N-Dimethyl-1,4-phenylendiamin, 208N,N-DPDD-Reagenz, 208N6-Methyladenosine, 324Nachweisgrenze, 62, 432, 446Naphthochinon-4-sulfonsäure, 200Naphthole, 180, 190Naphthylamine, 179Natriumborhydrid, 178Natriummolybdat (Na2MoO4*2H2O), 220Natriumnitroprussid (Na2[Fe(CN)5NO]), 187Natrium-Tetraphenylborate (Na[B(C6H5)4],

203Natriumwolframat (Na2WO4*2H2O), 220Naturstoff-Reagenz, 201NBDH, 184NBD-chlorid, 201NBD-chlorid-Reagenz, 183, 201NBD-hydrazin, 176NBP-Reagenz, 221Nd-YAG-LASER, 316Nernst, W. H., 23Nernst’sches Verteilungsgesetz, 23Neu, R., 201NH2-Phasen, 24Niederwieser, A., 132, 140Nilrot, 190Ninhydrin, 186, 321Nitrierungen, insitu, 180Normalkammer, 133Normalphasensysteme, 57Normalphasentrennung, 24nucleophile Reaktion, 221nucleophile Reaktionsfähigkeit, 220N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-

dihydrochlorid, 207N-Kammer, 133Nyiredy, Sz., 97, 105

OOberflächenspannung, 19Ochratoxin A, 180Östriol, 182ß-Blocker, 182

Sachverzeichnis 459

ß-Front, 138ß-Galaktosidase, 275östrogene Wirkung, 274Online-Chromatographie, 16OPLC, 49, 161o-Nitrophenylisocyanat, 185o-Phenylendiamin, 195o-Phenylendiamin-Reagenz, 197o-Phenylenediamin, 196o-Toluidin, 208Oxidationsreaktionen, insitu, 178

PPAK, 178, 179Palladium(II)-chlorid-Reagenz, 213Papaverin, 203Papierchromatographie, 16, 23Paraffin, 189Paraquat, 203Partikelgröße, 50partition chromatography, 15Patulin, 180, 182Pauly-Reagenz, 207Pazur, J. H., 244Peakbreite, 38Peakintegration, 382Peakreinheit, 370Penicillium expansum, 263Phenole, 198phenolische Antioxidantien, 219Phenolsteroide, 179Phenothiazine, 178Phenylbutazon, 179Phenylendiamin, 195Phenylhydrazin, 181, 197Phenylhydrazinreagenz, 197Phenylisocyanat, 185Phospholipide, 209, 319phosphor imaging plate, 323Phosphorbildplatte, 323Phosphorbildplatten-Speicherung, 323Phosphoreszenz, 350Phosphormolybdänsäure, 192Photomultiplier, 323photo-stimulable layer, 323photo-stimulated luminescence, PSL, 323physikalische Kalibrierung, 437Phytoanalytik, 189Pikrinsäure, 187Pilocarpin, 203Pinakryptolgelb, 190Planarchromatographie, 16planarchromatographisch, 16

Plattenschichtdicke, 64Plattenvorbeladung, 141Plinius, C., 2Polaritätsindex, 98, 109Polyacryl-Gelelektrophorese (PAGE), 16Polyamid, 76Polynom, 418Poole, C. F., 64, 121POPOP, 314Porendurchmesser, 65Porenvolumen, 61, 65postchromatographische Derivatisierung, 186Primulae-flos-Extract, 204Primulin-Färbung, 319PRISMA-Modell, 106Probeauftragung, 113Probevorbereitung, 113Präparative Layer Chromatographie (PLC), 64Präzision, 392, 432, 441Präzisionsfehler, 397Prošek, M., 10, 304Protokoll, Validierung, 432Protonenakzeptoreigenschaften, 98Protonendonatoreigenschaften, 98Prozedur, Validierung, 432Puffer, 107p-YES-Test, 275Pyren, 353Pyrethroide, 221Pyridin-4-carbonsäurehydrazid, 197Pyridoxal, 194

QQuantenausbeute, 355Quantifizierung, 10Quantil, 399QuEChERS-Ansatz, 114Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and

Safe, 114

RRf-Werte, Bestimmung, 363Radikalfänger-Aktivität, 220Radiochromatographie (DC-RC), 322Raman, C. V., 315Raman-Spektrometrie, 315Randerath, K., 8range, 439Rayleigh-Stahlung, 316reale Plattenhöhen, 53Redox-Enzyme, 244Reed, L., 3reflectance, 373

460 Sachverzeichnis

Reflexion, 10Reichard, C., 99Reichardt’s dye, 99Reitsema, R. H., 8Remission, 10Remissionsformel, 339Remissionslicht, 10, 331Remissionsmessung, 287Remissionswerte, 373repeatability, 441reproducibility, 441Reproduzierbarkeit, 441Resorufin, 190retardation factor, 25Retentionsfaktor, 25Rf-Wert, 25Rf-Wert (empirisch), 25Rf

0-Wert (Thermodynamisch), 26Rhizopus sp., 263Rhodamin, 190Rhodoturula rubra, 263Richtigkeit, 397, 432, 441Rm-Wert, 31, 32Rohrschneider, L., 96Romanic, B. M., 244Rückstreufaktor, 336Rotations-Planarchromatographie (RPC), 160Routledge, E. J., 274, 275RP-1, 70RP-2, 70RP-8, 70RP-18, 8, 70RP-18-Phase, 71RP-HPLC, 43RP-Trennung, 24Rubeansäure, 214Rubeanwasserstoff-Reagenz, 214Runge, F. F., 2Ruß, 58

SSaccharomyces cerevisiae, 275Salicylaldehyd, 202Salkowski-Reagenz, 213Salpetersäurereagenz, 217Saunders, D. L., 49, 149Schadstoffanalytik, 228Schichtmaterialien, 61Schichtqualität der DC-Platte, 41Schiff’sche Basen, 218Schlitt, H., 135Schmalkammer, 134Schönbein, Ch. F., 3

Schönborn, A., 276Schulz, W., 260Schuster, A., 288Schwack, W., 236Schwermetallscreening, 174Screeningtests, 219Seeliger’schen Strahler, 292Segura, R., 215selbst hergestellte Platten, 79Selektivität, 433Selektivitätsfaktor, 98Selektivitätsterm, 41Serinhydrolase, 235Shraiber, M. S., 7Signalauflösung in der DC, 39Signal-Rausch-Verhältnis, 381Signalverbreiterung in der DC, 43Silberkolloid, 316Silbernitratreagenz, 212SIMS (secondary ion mass spectrometry), 318Singulett-Übergang, 350Siouffi, A., 43Snyder, L. R., 49, 59, 90, 96, 149Snyder‘sche Pealauflösung, 41Säurekonstante, 108Solvachrom-Ansatz, 99Solvatationsenergie, 88Solvent-Bar-Microextraction/Silikamonolith

(SBME/SM), 115SOP, 432Sorbinsäure, 180Sorption, 58, 129Sorptionsstellen, 58Sorptionszentren, 91sorptive Sättigung, 130Spektren, 10spezifische Oberfläche, 65Spezifität, 432, 433sphärische Partikel, 67Spira, D., 276Spottest, 103SSSP (sealing surface sampling probe), 318Stahl, E., 8, 49, 61, 135standard operation procedure, 432Standardabweichung, 36, 399Standardadditionsmethode, 428, 440Standardadditionsverfahren, 426Standardnormalverteilung, 398stationäre Phase, 57statistischer photometrischer Fehler, 373Sterigmatocystin, 180, 218Steroidhormone, 218Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE), 114

Sachverzeichnis 461

Stoffmenge, 23Stärke (nach Zulkowsky), 209Stokes, G. G., 350Stokes-Linien, 316Stokes-Verschiebung, 350strahlungsempfindliche Schicht, 323Student-Faktor, 403Student-Verteilung, 402Substanzabsorptionsfaktor, 343Sucralose®, 140, 218Sulfonamide, 178Sumpf-Schachtelhalm-Extrakt, 202Sumpter, J. P., 274, 275Surface-Enhanced Raman Scattering

Spectrometry (SERS), 316S-Kammer, 134Synge, R. L. M., 6, 23systematischer Fehler, 397, 423

TTailing, 22Taylor, J. K., 431Tebuconazol, 264Technik, Validierung, 431Temperaturabhängigkeit von DC-Trennungen,

32tert-Butylhypochlorit, 218tert-Butyl-Hypochlorid-Reagenz, 218Testosteron, 182Tetraphenylborat, 387Tetraphenylborat-Reagenz, 202Tetrazolblau, 191theoretische Trennböden, 37thermische Umsetzungen, 218thermodynamischer Rf

0-Wert, 26Thiabendazol, 191Thiobarbiturate, 179Thioflavin, 190Thionylchlorid, 179Thiooxamid, 214Thomson, J., 119Tillmans-Reagenz, 190, 199TPDD-Reagenz, 208Transmission, 10Transmissionsmessung, 287Trennstufen, 37, 38Trennstufenzahl, effektiv, 42Trennzahl nach Kaiser, 50Trichloressigsäurereagenz, 217Trifluoressigsäure, 178Trifluoressigsäureanhydrid, 180Triphenyltetrazolium-Chlorid, 270Triplett-Term, 350

Trogkammer, 132, 133TRT-Technik, 165TRT-Trennung, 167Tswett, M. S., 4Tyihák, E., 161Tyrosin, 219

UUltrafiltration, 261Umbelliferon, 190Universalreagenz auf Naturstoffe, 201universelle Reagenzien, 191Untergrundabsorptionsfaktor, 343Urease, 243UTLC-Platte, 63, 82UV-vis-Spektren, 367

VValidierung, 431van Berkel, G., 320Van Dijck, H., 145Vanillin-Reagenz, 192van-Deemter-Gleichung, 46, 47van-Deemter-Gleichung, lokal, 48Varianz, 36, 392Varianz der Auftragung, 54Varianz-Covarianz-Matrix, 411, 420Vario-KS-Kammer, 132, 135, 143Verdrängungschromatographie, 15Veresterungen, insitu, 180Verstärkung der Fluoreszenz, 189Verteilungschromatographie, 15, 22, 57, 87Verteilungsgleichgewichte, 20Verteilungskoeffizient, 23, 31Vertrauensband, 413Vertrauensbereich, 413, 421, 444vibrio fischeri, 255Viskosität, 19Vitalitätstest, 269Vorbeladung, 132Vorkonditionierung, 450

WWagner, H., 189wahrer Rf-Wert, 26Wasserstollperoxid, 191Weins, C., 256, 275Weißstandard, 81Weisemann, C., 256Westall, R. G., 31Wiederfindungsfunktion, 443Wiederfindungsrate, 442Wiederholbarkeit, 432, 441Wiederholbarkeit, zeitlich, 441

462 Sachverzeichnis

Wiederholbarkeit, zwischen Laboratorien, 441

Willstädter, R. M., 6

Winterlin, W., 239

Wintersteiger, R., 181

Winterstein, A., 6

wirkungsbezogene Analytik, 227

Wirth, H., 303

Wursters Blau, 208

Wursters Rot, 208, 209

Wurster-Reagenz, 207

Wuthe, W., 291

YYeast Estrogen Screen, 275YES, 275

Zzentripetale Entwicklung, 145Zimtaldehydreagenz, 194Zinn(IV)-chlorid-Reagenz, 216Zirkonoxidchlorid-Reagenz, 212zirkulare Trennungen, 144Zirkularentwicklung, 133Zlatkis, A., 62zweiseitiger Test, 400

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Quantitative Dünnschichtchromatographie ||

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