Date post: | 05-Apr-2015 |
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PROTEOMICS (2)Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars
Von: Tabea Mundinger
Betreuer: Benedikt Brors
Gliederung
Einleitung Pankreatitis, Pankreaskarzinom Durchführung Analysemethoden
2D PAGE Massenspektrometrie und Identifikation Western Blot Immunohistochemie
Ergebnisse Diskussion
Einleitung
2003 Sequenzierung des menschlichen Genoms Differentielle Genexpression kann in
verschiedenen Geweben verglichen werden (microarrays etc.)
Liefert nicht immer eindeutige Ergebnisse Warum?
Krankheiten beruhen oft auf Proteindefekten, nicht Genexpressionsdefekte
Proteomics als wichtige Methode in z.B. Krebsforschung
Einleitung
Anwendung Proteomics in Krebsforschung:
Shen et. al., Cancer Research Dez. 2004: Vergleich der Proteinexpressionsprofile von
normalem Gewebe, Gewebe befallen von Pankreatitis und Pankreaskarzinomgewebe 2D Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2D PAGE) Matrix-Assisted laser desorption/ionization time of
flight (MALDI-TOF)
Pankreas
Wichtigste Verdauungsdrüse im Körper Exokriner Teil:
Verdauungssäfte Bicarbonat Carbohydrasen, Esterasen, Proteasen, Nukleasen
Endokriner Teil: Hormone
Insulin, Glucagon, Somatostatin, Pancreatic Polypetide (PP)
Werden in den Langerhansschen Zellen hergestellt Kontrolieren hauptsächlich Glycogenolyse,
Glycogenese, Glucoseoxidation
Pankreatitis
Entzündnug der Bauchspeicheldrüse Selten, aber gefährlich
15% der Fälle enden tödlich Auslöser (unter Anderem):
Stoffwechselstörungen, Alkoholismus, Gallensteine, Durchblutungsstörungen, Infektionen (Mumps, Coxsackie-Virus)
Gefährlich weil freiwerdende Verdauungssäfte umliegende Gewebe beschädigen
Pankreasadenokarzinom
Entsteht meistens aus exokrinem Teil Selten (1-2% aller Krebsarten)
ABER: viert-häufigste Krebstodesursache Späte Erkennung: Anfangs nur leichte
Symptome Schwere Symptome (Oberbauchschmerzen,
Gelbsucht) später mehr als ½ der Fälle schon Metastasierung
Analysemethoden (1):2D PAGE
Kombination aus Isoelektrischer Fokusierung (IEF) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
1. Dimension: IEF: Gelstreifen mit immobilisiertem pH Seperation nach Isoelektrischem Punkt
2. Dimension: SDS-Page Seperation nach Molekulargewicht
Analysemethoden (2):MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
Time of Flight Co-Kristallisation von Protein und Matrix Energetische Anregung durch Laserimpuls Explosionsartige Teilchenablösung (Matrix
verhindert Fragmentierung der Proteine) Detektor: ToF
Misst Flugzeit der Proteine
Massenbestimmung
Analysemethoden (3):Western Blot Elektrophorese Blotting
Übertragung auf Nitrozellulose mittels Puffer Hybridisierung
Markierung mit Antikörpern (radioaktives oder enzymatisches Label)
Nachweis: Farbreaktion, Chemilumineszenz oder
Autoradiographie
Analysemethoden (4):Immunohistochemie Primärantikörperfärbung
Gegen ein spezifisches (schon bekanntes) Protein Sekundärantikörperfärbung
Gegen konstanten Teil des Primärantikörpers Label: enzymatisch, fluoreszierend
Hier: biotinyliert Signal wird verstärkt mehrere Antikörper können
binden Nachweis
Durchführung
Gewebeproben: 6x Normale Pankreasproben 7x Pankreatitis 6x Pankreaskarzinom 2x normale Gewebeproben von Karzinompatienten 1x Karzinom- und normale Pankreasprobe vom gleichen
Patient 2D PAGE MALDI-TOF Datenbanken Suche (MS-Fit 3.2.1) Verifikation
Western Blot, Antikörperfärbung (ICH)
Ergebnisse (Beispiel: Galectin-1) 1. Experiment: alle Proben getestet 2. Experiment:
6/8 Normal 5/7 Pankreatitis 4/6 Krebs Gewebe
29 Proteine wurden identifiziert Antioxidanten, Chaperone (oder Chaperon-
ähnliche Proteine), Calcium-abhängige Bindeproteine, Proteasen, Verdauungsenzyme, Signaltransduktionsproteine, ECM Proteine
Galectin-1
Schon durch mRNA Experimente mit Pankreas Karzinom in Verbindung gebracht
Zell-Adhesion
Reguliert Zellwachstum
Inhibiert Apoptose
Ergebnis (Galectin-1)
2D PAGE
MALDI-TOF
6x höhere Expression im Krebsgewebe
Validierung (Galectin-1)
Western Blot
4/6 Krebsgeweben 0/8 normalem Gewebe 0/7 Pankreatitis
Validierung (Galectin-1)
ICH
67% der Krebsgewebeproben (D) enthalten galectin-1
100% des Stromas (E) enthält galectin-1 Kein galectin-1 in normalem Gewebe (F)
Diskussion
Bestätigung von früheren Ergebnissen
Aber: Mehr als 30 von 40 untersuchten Proteinen
konnten durch neue Methoden erstmals mit Pankreaskarzinom in Verbindung gebracht werden
Vielen Dank!!!
Quellen:
Shen et al., Protein Expression Profiles in Pancreatic Adenocarcinoma Compared with Normal Pancreatic Tissue and Tissue Affected by Pancreatitis as Detected by Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry, CANCER RESEARCH 64, 9018–9026, December 2004
Iacobuzio-Donahue et al. Highly expressed genes in pancreatic ductal adenocarcinomas: a comprehensive characterization and comparison of the transcription profiles obtained from three major technologies. Cancer Res 2003;63:8614 –22
Person et al. Comparative identification of prostanoid inducible proteins by LC-ESI-MS/MS and MALDI-TOF mass spectrometry. Chem Res Toxicol 2003;16:757–7
http://www.m-ww.de/krankheiten/innere_krankheiten/pankreatitis.html http://www.m-ww.de/krankheiten/krebs/pankreaskarzinom.html http://de.wikipedia.org/wiki/2D-Gelelektrophorese http://www.lexikon-glossar.de/Antikoerperfaerbung.html http://www.unics.uni-hannover.de/analytik/GrundlagenAnalytik/Analytik%202/Makromo/Maldi
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