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Partielle Resistenz Chorea Huntingtontransgener Mäuse gegen
globale cerebrale Ischämie
Anke Alexandra Alberty
Partielle Resistenz Chorea Huntingtontransgener Mäuse gegen
globale cerebrale Ischämie
Von der Medizinischen Fakultät derRheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Gradeseiner Doktorin der Medizingenehmigte Dissertation
vorgelegt von
Anke Alexandra Alberty
aus Mönchengladbach
Berichter: Herr UniversitätsprofessorDr.med. Johannes Noth
Herr ProfessorDr.med. Norbert Schrage
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2004
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothekonline verfügbar.
für
TE & OH
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung Seite 3
1.1 Chorea Huntington1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington1.4 Tiermodell1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen bei transgenen Mäusen1.6 Ziel der Arbeit
2. Material und Methoden Seite 11
2.1 Tiere und Tierhaltung2.2 Globale Ischämie2.3 Perfusion und Gehirnentnahme2.4 Fixation und Schneiden2.5 Färbungen2.6 Analyse2.7 Statistische Auswertung
3. Ergebnisse Seite 25
3.1 Gefäßstatus3.2 Genotypisierung3.3 15 min Ischämie3.4 20 min Ischämie3.5 60 min Ischämie3.6 Cycloheximid-Behandlung/20 min Ischämie3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittleren Läsionsgrößen3.8 Photos
4. Diskussion Seite 45
5. Zusammenfassung Seite 53
6. Referenzenliste Seite 55
7. Danksagung Seite 65
8. Lebenslauf Seite 67
Einleitung
3
1. Einleitung
1.1 Chorea Huntington
1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren
1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington
1.4 Tiermodell
1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen bei transgenenMäusen
1.6 Ziel der Arbeit
Einleitung
4
1.1 Chorea Huntington
1.1.1 Epidemiologie und Symptomatologie
Die Chorea Huntington (CH) wurde im Jahre 1841 erstmals von C.O. Waters
beschrieben. Benannt wurde die Krankheit jedoch nach dem Amerikaner George
Huntington, der sie im Jahre 1872 als Erbkrankheit von der Chorea minor abgrenzte.
Huntington hatte bei seinen Studien von Familien auf Long Island das klassische
Muster einer autosomal dominant vererbten Erkrankung beobachtet.
CH betrifft alle Rassen und hat in Europa und Nordamerika mit 4-8 Fällen/ 100000
Einwohner die höchste Prävalenz. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen
(Meierkord, 1994).
Die Krankheit manifestiert sich typischerweise zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr,
allerdings beginnen ca. 10 % der Erkrankungen vor dem 20. Lebensjahr. Diese als
Westphal-Variante bezeichnete Verlaufsform unterscheidet sich zusätzlich in den
Symptomen und in der Schwere der Erkrankung (Westphal, 1883).
Die Symptome bei CH sind durch die Trias choreatische Hyperkinesen, psychotische
Symptome und Demenz gekennzeichnet und lassen sich in Früh- und
Spätsymptome einteilen (vgl. Tab. 1).
Adulte Form Juvenile Form
Frühstadium Persönlichkeitsveränderungen, Persönlichkeitsveränderungen.Evtl. Depressives Syndrom, Kognitive Beeinträchtigung.Choreatische Hyperkinesen, Hypokinese, Hypomimie,Dysdiadochokinese, Ruhetremor.Dysarthophonie, Blicksakkaden-verlangsamung
Spätstadium Demenz, chronisch organische Demenz, Dysarthrie.Psychose.Dystone Hyperkinesen, Rigor, Ruhetremor,Rigor, Mutismus. Epileptische Anfälle.
Tab. 1 Symptome bei Chorea Huntington
Einleitung
5
Die adulte Form führt innerhalb von 15-20 Jahren zum Tod, die juvenile Form schon
nach 7-10 Jahren. Im Laufe der Erkrankung kommt es zu starkem Gewichtsverlust
und Kachexie. Der Tod tritt in den meisten Fällen durch Ateminsuffizienz oder durch
Infektionen, z.B. Aspirationspneumonie, ein.
1.1.2 Genetischer Defekt
CH gehört zu der wachsenden Gruppe der CAG-Triplet Erkrankungen. Hierbei
handelt es sich um Krankheiten, denen eine pathologisch verlängerte Cytosin-
Adenosin-Guanin Sequenz gemeinsam ist. Zu diesen Krankheiten zählen unter
anderem die Spinale Muskelatrophie (La Spada, 1991) und Formen der
Spinocerebellären Atrophien (Orr, 1993).
Der Gendefekt bei CH konnte im Jahre 1983 auf dem kurzen Arm des Chromosoms
4 (4p16.3) lokalisiert werden (Gusella, 1983) und wurde 10 Jahre später durch die
Huntington’s Disease Collaborative Research Group entschlüsselt.
Bei Normalpersonen schwankt die Anzahl von CAG-Triplets zwischen 9 und 34.
Eine Erhöhung der Wiederholungsrate auf über 38 macht ein Ausbrechen der
Krankheit sehr wahrscheinlich. Der Bereich zwischen 35 und 38 Wiederholungen ist
eine Indifferenzzone, in der eine genaue Aussage über einen eventuellen Ausbruch
der Krankheit nicht gemacht werden kann.
Zwischen Wiederholungsrate und Manifestationsalter gibt es eine inverse Beziehung:
Je höher die Wiederholungsrate, desto früher die Manifestation und desto schwerer
die Ausprägung der Krankheit. Bei der juvenilen Form findet sich daher eine
besonders hohe Wiederholungsrate, nicht selten mehr als 100 CAG-Triplets
(Wellington, 1997).
Die Sequenz CAG kodiert für die Aminosäure Glutamin. Die bei CH erhöhten Triplet-
Wiederholungen liegen in der Gensequenz, die für das Protein „Huntingtin“ kodiert.
Daher findet sich bei CH entsprechend der Triplet-Wiederholungen auch eine stark
verlängerte Polyglutaminkette im Huntingtin.
Huntingtin ist beim Gesunden ein rein zytoplasmatisches Protein, dessen Funktion
noch nicht vollständig geklärt werden konnte. Es ist innerhalb der Zelle mit dem
Cytoskelett und den Endosomen assoziiert, weshalb eine Beteiligung an
Transportvorgängen angenommen wird (DiFiglia, 1995). Huntingtin wird im gesamten
Organismus exprimiert.
Einleitung
6
Huntingtin ist für eine normale embryonale Entwicklung essentiell, die Ruptur des
Gens bei „knock-out“ Mäusen führt schon in der Embryonalphase zum Tod (Nasir,
1995). Eine protektive Wirkung des normalen Huntingtin bei exzitotoxischen Reizen
wird diskutiert (Sun, 2001).
Die normale Funktion des Huntingtins bleibt auch mit dem Gendefekt bestehen,
allerdings entwickelt es noch eine zweite, bislang nicht geklärte Wirkung, welche die
Pathologie der Chorea Huntington bewirkt. Dieses Prinzip bezeichnet man als „Gain
of Function“ (Sharp, 1996). Während bei Gesunden Huntingtin nur im Zytoplasma
vorhanden ist, wird das pathologisch verlängerte Polyglutamin vom Restprotein
abgespalten und bei CH Patienten auch im Zellkern gefunden. Im Zellkern haben die
Polyglutaminketten die Fähigkeit, sich aneinanderzulagern und große
Proteinaggregate zu bilden. Diese Proteinaggregate sind in der Lage, intranukleäre
Vorgänge zu stören (Cha, 2000).
1.1.3 Neuropathologie
Pathologisch-anatomisch kommt es bei CH zu einem Untergang von Neuronen und
einer Astrogliose, die vorwiegend das Striatum betrifft. Der Verlust von Neuronen
beginnt im Schwanz des Ncl. Caudatus und schreitet nach anterior und lateroventral
in Richtung Putamen fort. Die Reduktion der Neurone im Striatum kann bis zu 60 %
betragen (Vonsattel, 1985).
Auch im Neocortex findet sich ein Verlust an Neuronen, so dass das gesamte Gehirn
im Verlauf der Erkrankung bis zu 30 % an Gewicht verlieren kann.
Sowohl im Striatum als auch im Cortex sind nicht alle Neurone gleichmäßig
betroffen. Im Striatum degenerieren in erster Linie mittelgroße bedornte
Projektionsneurone, die GABA und Substanz P oder Enkephalin enthalten. Diese
Neurone wirken in erster Linie inhibitorisch auf die Substantia nigra und den Globus
pallidus pars medialis. Ausgespart bleiben cholinerge Interneurone, die mit ihren
Endigungen das Striatum nicht verlassen und unbedornte GABAerge Interneurone,
die Somatostatin, Neuropeptid Y und NADPH-Diaphorase enthalten.
Außerdem findet man in betroffenen Gehirnen später eine Atrophie im
Hypothalamus, im Corpus amygdaloideum und im Thalamus (Schmitz, 1999).
Immunhistochemisch lassen sich bei CH Patienten sog. intranukleäre
Einleitung
7
Einschlußkörper in vielen Bereichen des Gehirns nachweisen (Paulson, 1997). Diese
nehmen im Laufe der Erkrankung zu.
Intranukleäre Einschlußkörper sind immunhistochemisch positiv für Ubiquitin und
konnten außerdem mit Antikörpern gegen Polyglutamine nachgewiesen werden.
1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren
Unter Exzitotoxizität versteht man den möglichen toxischen Effekt exzitatorischer
Neurotransmitter im Zentralen Nervensystem. Durch eine unphysiologisch hohe
Konzentration endogener exzitatorischen Neurotransmitter, z.B. Glutamat, im
synaptischen Spalt werden postsynaptische Glutamatrezeptoren übermäßig erregt.
Es kommt zum Öffnen von Ionenkanälen und einer Überladung der Zelle mit
Calciumionen, mit der vermehrten Aktivierung calciumabhängiger Proteasen.
Dadurch kommt es zu einer Kaskade von Stoffwechselvorgängen, an deren Ende
der neurotoxische Zelltod steht (Pavon, 1998).
Eine pathogenetische Rolle der Exzitotoxizität wird bei verschiedenen
neurodegenerativen Erkrankungen, z.B Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und
vor allem CH diskutiert. Auch bei akuten Ereignissen, wie Traumen oder Ischämie
sind exzitotoxische Vorgänge ursächlich beteiligt (Faden, 1989). 1984 konnte durch
Mikrodialyse gezeigt werden, dass nach globaler und fokaler Ischämie die
extrazelluläre Glutamatkonzentration um das 10fache ansteigt (Benveniste, 1984).
Exzitatorische Neurotransmitter wie Glutamat vermitteln ihre exzitatorische Wirkung
in erster Linie über Glutamatrezeptoren. Im Säugetiergehirn werden nach
pharmakologischen Gesichtspunkten verschiedene Rezeptoren für exzitatorische
Aminosäuren unterschieden:
I. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat-Rezeptor (AMPA)
II. Kainat-Rezeptor
III. N-methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA)
IV. Metabotroper, Quisqualat-sensitiver Rezeptor (5 Untergruppen)
Die ersten drei Rezeptoren sind an Ionenkanäle gekoppelt, während der letzte G-
Protein assoziiert ist. Alle vier Rezeptoren gehören zu den Glutamat-Rezeptoren.
Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im ZNS.
Einleitung
8
1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington
Zum ersten Mal wurde das Phänomen der Exzitotoxizität mit CH im Jahre 1976 in
Verbindung gebracht. Nach einer Injektion von Kainat-Rezeptor-Agonisten in
Rattengehirne konnten neurochemische und neuropathologische Veränderungen
beobachtet werden, die denen bei CH ähnlich waren (Coyle, 1976). Allerdings waren
alle Zelltypen von der neurotoxischen Wirkung betroffen, so dass auf diese Weise
der typische selektive Zellschaden bei CH nur in eingeschränktem Maße reproduziert
werden konnte.
10 Jahre später wurde Ratten verschiedene Dosen Quinolinsäure (QA) injiziert.
Quinolinsäure ist ein endogener Tryptophan-Metabolit und wird im Gehirn
hauptsächlich zu Serotonin abgebaut. Nur über alternative Abbauwege können
Quinolinsäure und Kynurensäure entstehen. Quinolinsäure wirkt agonistisch am N-
Methyl-D-Aspartat-Rezeptortyp der Glutamatrezeptoren (NMDA-R). Bei der
immunhistochemischen Auswertung konnte festgestellt werden, dass nur Substanz-
P-haltige und GABAerge Projektionsneurone vom Zellschaden betroffen waren.
Somatostatin und Neuropeptid Y enthaltende Interneurone blieben ausgespart.
Damit imitiert dieses Modell deutlich mehr den bei CH beobachteten differenzierten
Zellschaden (Beal, 1986).
Durch intrastriatale Injektionen von Quinolinsäure konnten im Tierversuch einige der
bei CH auftretenden Verhaltensauffälligkeiten reproduziert werden (Block, 1993).
Aufgrund der Ähnlichkeit neuropathologischer Veränderungen nach exzitotoxischem
Zellschaden im Striatum mit den neuropathologischen Beobachtungen bei CH wird
angenommen, dass Exzitotoxizität bei der Pathogenese der CH eine ursächliche
Rolle spielen könnte.
1.4 Transgenes Tiermodell
Geeignete Tiermodelle sind für die Erforschung der Pathogenese, aber auch für die
Testung neuer Therapiemöglichkeiten unerlässlich.
Durch Übertragung des Exon 1 eines humanen Huntington Gens mit 130 CAG-
Triplet-Wiederholungen unter Kontrolle des humanen Promotors in das Mäusegenom
konnte 1996 ein zuverlässiges und bis heute genutztes Mausmodell für CH
entwickelt werden (Mangiarini, 1996). Es entstanden vier transgene Linien, von
Einleitung
9
denen die R6/1 Linie mit bis zu 115 CAG-Wiederholungen in vielen Studien
verwendet wird. Die Mäuse der R6/1-Linie entwickeln im Alter von 22-26 Wochen
einen charakteristischen, progredienten Phänotyp. Aufgrund der hohen Anzahl der
Triplet-Wiederholungen und des frühen Auftretens der ersten Symptome ist das
transgene Mausmodell am ehesten mit der humanen juvenilen Form („Westphal“) der
CH vergleichbar.
Die Symptome beginnen mit einem zunächst diskreten Ruhetremor und - ähnlich wie
beim Menschen - einer ataktischen Gangstörung. Eines der ersten Symptome bei
Mäusen ist das sogenannte „Clasping“. Werden gesunde Mäuse am Schwanz
hochgehoben, so strecken sie ihre Hinterbeine zur Seite, um sich zu stabilisieren.
Symptomatische Mäusen sind nicht in der Lage, ihre Beine auszustrecken, sie halten
die Extremitäten am Körper und rollen sich zusammen (to clasp, englisch:
umklammern) (Mangiarini, 1996). Transgene Mäuse können bis zu 60% ihres
Körpergewichtes verlieren. Im Endstadium treten vermehrt generalisierte epileptische
Anfälle auf, in deren Verlauf die Mäuse versterben können.
Neuropathologisch weisen die Gehirne transgener Mäuse eine deutliche globale
Atrophie auf. Allerdings konnten mit Beginn der Symptome keine fokalen
Degenerationsvorgänge festgestellt werden, insbesondere das Striatum ist zwar
verkleinert, Zeichen eines Zelluntergangs fehlen aber. Wie im menschlichen Gehirn
finden sich auch in den Gehirnen transgener Mäuse intranukleäre Einschlußkörper
(Davies, 1997).
Die R6/1 Linie des transgenen Mausmodells zeigt also in Neuropathologie und
Symptomatik deutliche Parallelen zu den Befunden beim Menschen. Es stellt somit
eine wertvolle Grundlage zur Erforschung der Pathogenese der CH und zur Testung
neuer therapeutischer Interventionen dar. Das transgene Mausmodell löste das
lange Zeit bei CH-Studien verwendete exzitotoxische Quinolinsäure-Tiermodell ab.
1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen beitransgenen Mäusen
Wie oben beschrieben kann durch stereotaktische Injektionen von Quinolinsäure der
spezifische striatale Neuronenuntergang bei CH imitiert werden. Sollte Exzitotoxizität
ursächlich an der Pathogenese der CH beteiligt sein, so wäre zu erwarten, dass
Huntington-transgene Mäuse besonders sensibel auf eine Injektion von
Quinolinsäure oder NMDA, also einen weiteren exzitotoxischen Reiz, reagieren.
Einleitung
10
Jedoch konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse der R6/1 Linie im Vergleich
zu Wildtyp-Mäusen resistent gegen diese Noxe sind (Hansson, 1999). Während es
bei nicht transgenen Mäusen zu den typischen exzitotoxischen Zelluntergängen kam,
wurde bei transgenen Mäuse bei gleicher Dosis keine oder eine deutlich geringere
Degeneration im Striatum beobachtet.
Eine Hypothese, die versucht, diesen scheinbaren Widerspruch aufzuklären, ist,
dass transgene Mäuse einer chronischen, aber nur subletal erhöhten
Glutamatkonzentration ausgesetzt sind. Durch eine reaktive Heraufregulation
potentiell protektiver endogener Schutzmechanismen der Neurone wären sie im
Sinne einer „Präkonditionierung“ gegen eine Überstimulation von Glutamat
geschützt. Dieses Phänomen ist bereits aus der Ischämieforschung bekannt.
In Ischämieversuchen haben kurzzeitige Gefäßokklusionen nach einem bestimmten
Zeitintervall einen protektiven Effekt bei einer weiteren Hypoxie. Dieses Phänomen
konnte sowohl am Herzen (Murry, 1986) als auch am Gehirn (Himori, 1991) gezeigt
werden.
1.6 Ziel der Arbeit
Aus der Beobachtung, dass transgene Mäuse gegen einen von außen eingebrachten
exzitotoxischen Reiz, nämlich eine Injektion von Quinolinsäure, resistent sind,
erwächst die Frage, ob diese Protektion nur auf direkte exzitotoxische Reize
beschränkt ist, oder ob eine eher generalisierte Protektion gegen Noxen, in deren
Pathogenese Exzitotoxizität eine Rolle spielt, vorliegt. Aufgrund der oben
beschriebenen Ähnlichkeiten und des schon bekannten Glutamatanstiegs bei
Ischämie, wird untersucht, ob CH transgene Mäuse auch gegen transiente globale
Ischämien verschiedener Dauer resistent sind. Hierbei wird insbesondere darauf
geachtet, ob der gegen exzitotoxische Noxen, wie z.B. Ischämie, besonders sensible
Hippocampus ebenfalls protektioniert ist. Sollte eine Protektionierung vorliegen, wird
in einem zweiten Schritt untersucht, ob diese durch eine vermehrte Synthese
protektiver Proteine bedingt ist. Die Gabe eines Proteinsyntheseinhibitors vor der
Durchführung der Ischämie müsste dann die Protektionierung aufheben.
Material und Methoden
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2. Material und Methoden
2.1 Tiere und Tierhaltung
2.2 Globale Ischämie2.2.1 Materialien2.2.2 Methode
2.3 Perfusion und Gehirnentnahme2.3.1 Materialien2.3.3 Methode
2.4 Fixation und Schneiden2.4.1 Materialien2.4.3 Methode
2.5 Färbungen2.5.1 Cresylviolett
2.5.1.1 Materialien2.5.1.2 Methode
2.5.2 Fluoro Jade2.5.2.1 Materialien2.5.2.2 Methode
2.5.3 Ubiquitin2.5.3.1 Materialien2.5.3.2 Methode
2.6 Analyse2.6.1 Geräte2.6.2 Methode
2.7 Statistische Auswertung
Material und Methoden
12
2.1 Tiere und Tierhaltung
Für die Tierversuche wurden transgene Mäuse der Jackson Laboratory Texas, sowie
nicht transgene Kontrolltiere verwendet. Es wurden Mäuse des Stammes R6/1
[B6CBATgN(Hdexon1)61gpb], die 115 Tripletwiederholungen aufweisen und im Alter
von 22-26 Wochen symptomatisch werden, verwendet. Das Alter der verwendeten
Mäuse betrug im Durchschnitt 26 Wochen. Die Mäuse wurden im Alter von 2
Wochen mittels PCR genotypisiert. Die Tierhaltung erfolgte im Gentechnischen
Arbeitsbereich S1 des Instituts für Versuchstierkunde und Zentrallaboratorium für
Versuchstiere der RWTH Aachen unter der Leitung von Prof. Dr. med. vet. W.
Küpper. Die Haltungsbedingungen entsprachen denen einer Trockenbarriere.
Materialhygiene wurde durch Sterilisation bzw. Desinfektion gewährleistet,
Personalkontrolle erfolgte durch Tragen von Schutzkleidung, Handschuhen,
Überschuhen, Mund- und Haarschutz. Die Mäuse wurden in einem vollklimatisierten
Tierstall bei einer Temperatur von 20°C +/- 2°C und einer relativen Luftfeuchte von
50% +/- 10% gehalten. Sie lebten in Makrolonkäfigen Typ II und III mit entstaubter
Weichholzfaser als Einstreu. Zugang zu Futter (Alleinfutter zur Haltung von Ratten
und Mäusen) und Wasser (entkalkt, durch zweifache Ozonierung und anschließende
UV-Bestrahlung entkeimt, Darreichung in Makrolonflaschen) erfolgte ad libitum. Der
Hell/Dunkel-Rhythmus betrug zwölf Stunden.
2.2 Globale Ischämie
2.2.1 Materialien
Für die Durchführung einer globalen Ischämie wurden folgende Hilfsmittel verwendet:
• Gerät zur Überwachung der Atemfrequenz TC-ELEKTRONIK• Operationsmikroskop ZEISS• Narkosegerät DRÄGER• Inhalationskammer Eigene Herstellung• Inhalationsmaske Eigene Herstellung• Absaugvorrichtung für Narkosegase Eigene Herstellung• Temperatur-kontrollierter Operationstisch Eigene Herstellung• Rektales Thermometer HARVARD• Wattestäbchen HANDELSÜBLICH• Tupfer HANDELSÜBLICH
Material und Methoden
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• Durapore Klebeband DURAPORE• Skalpell FEATHER• Wundhaken Laborbestand• Verschiedene Pinzetten und Scheren Laborbestand• Gefäßclips Laborbestand• Hautfaden VICRYL• Nadelhalter Laborbestand• Schläuche verschiedener Dicke Laborbestand• Drei-Wege-Hahn Laborbestand• Halothan ASID• Distickstoffoxid LINDE• Sauerstoff LINDE• Bepanthen Augensalbe ROCHE• 0,9 %ige Kochsalzlösung DELTA-PHARMA• Aqua destillatum DELTA-PHARMA• Wärmelampe Laborbestand• Cycloheximid (C15H23NO4) CALBIOCHEM• Ethanol absolut Klinikumsapotheke• Waage Laborbestand
2.2.2 Methode
Die Operationen wurden im Gentechnischen Arbeitsbereich Sicherheitsstufe 1 der
Tierexperimentellen Abteilung der RWTH Aachen durchgeführt. Hierfür wurde uns
ein eigener, abgetrennter Operationsraum zur Verfügung gestellt, um Störungen und
die damit verbundene zusätzliche Belastung der Mäuse so gering wie möglich zu
halten.
Die Narkoseeinleitung erfolgte in einer Inhalationskammer mit 1 l O2, 1 l N2O und 3,5Vol% Halothan. Nach ca. 3 min setzte die Narkosewirkung ein und die Maus wurde
auf dem Rücken auf dem temperaturkontrollierten Operationstisch gelagert.
Die Temperatur des Operationstisches wurde auf 37°C eingestellt. Über die Nase der
Maus wurde die Inhalationsmaske gestülpt und die Halothandosis auf 1-1,5 Vol%
reduziert. Die entströmenden Narkosegase wurden durch eine eigene Vorrichtung
abgesaugt. Vorder- und Hinterbeine der Maus wurden vorsichtig gespreizt und mit
Durapore-Band befestigt.
Das rektale Thermometer wurde mit 0,9%iger Kochsalzlösung befeuchtet und
vorsichtig in den Enddarm der Maus eingeführt. Die Körpertemperatur der Maus
konnte so überwacht und konstant bei 37°C gehalten werden. Die Augen wurden mit
Bepanthen Augensalbe betupft, um ein Austrocknen während der Narkose zu
Material und Methoden
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verhindern. Durch gezielte Schmerzreize an den Hinterbeinen der Maus wurde die
Narkosetiefe überprüft und gegebenenfalls angepasst. Erst bei sicherer
Ausschaltung der Schmerzempfindung erfolgte der Hautschnitt.
Die Haut wurde vom Brustbeinansatz nach distal auf einer Länge von ca. 1½ cm
eröffnet. Nun erfolgte die stumpfe Präparation von Fettgewebe und Thymus in der
Mittellinie bis zur Tracheavorderwand. Das OP-Feld wurde dann mit 4 Wundhaken
vorsichtig gespreizt. Die weiteren Schritte erfolgten nun unter mikroskopischer
Kontrolle. Der Gefäß-Nerven-Strang um die Arteria carotis communis wurde stumpf
freigelegt und stellte sich wie folgt dar:
Innen: A. carotis communis
Mitte: N. vagus
Außen: V. jugularis interna.
Die Carotisloge wurde noch bedeckt vom M. sternocleidomastoideus, der ebenfalls
stumpf durchtrennt wurde. Die Carotisloge war nun gut einsehbar, und die A. carotis
communis wurde über eine Länge von 5-6 mm freigelegt. Der N. vagus und die V.
jugularis interna wurden hierbei vorsichtig nach lateral abpräpariert. Die A. carotis
communis wurde selektiv untertunnelt. Nun wurden auf beiden Seiten unter
sorgfältiger mikroskopischer Kontrolle passagere Gefäßclips angelegt und so für die
folgenden Zeiten der Blutdurchfluß durch die A. carotis communis unterbrochen:
(1) 15 Minuten 10 Mäuse
(2) 20 Minuten 12 Mäuse
(3) 60 Minuten 10 Mäuse
(4) 20 Minuten/vorherige Cycloheximidgabe 10 Mäuse
Das Operationsfeld wurde mit 0,9%iger Kochsalzlösung befeuchtet, um ein
Austrocknen zu verhindern. Meist konnte die Narkose nach Unterbrechung des
Blutflusses um weitere 0,5 Vol% reduziert werden. Diese Reduktion erfolgte unter
ständiger Kontrolle der Schmerzempfindung und der Atemfrequenz. Nach der
bestimmten Zeit wurden die Gefäßclips auf beiden Seiten entfernt und die
Kochsalzlösung wurde vorsichtig abgetupft. Die Reperfusion der beiden Aa. carotes
communes wurde unter dem Operationsmikroskop kontrolliert. Der Wundverschluss
erfolgte durch chirurgische Hautnaht. Nach der Operation wurden die Mäuse noch
eine Stunde unter einer Wärmelampe überwacht. 10 Mäuse wurden zusätzlich einen
Tag vor der Durchführung der globalen Ischämie mit Cycloheximid behandelt, um
unspezifisch die Proteinbiosynthese zu hemmen. Die Mäuse wurden hierfür
Material und Methoden
15
gewogen. Sie erhielten eine intraperitoneale Injektion von 10mg Cycloheximid pro
Kilogramm Körpergewicht. Cycloheximid war zuvor in unvergälltem Ethanol gelöst
worden.
Am nächsten Tag wurde an diesen 10 Mäusen nach oben beschriebenem Protokoll
eine 20minütige globale Ischämie durchführt.
2.3 Perfusion und Gehirnentnahme
2.3.1 Materialien
• 1 ml Spritze AMEFA• 20 ml Spritzen AMEFA• Nadeln verschiedener Größen TERUMO• Butterfly Nadelsystem VALUSET• Diverse Scheren, Pinzetten, Nadelhalter Laborbestand• Scharfer Löffel Laborbestand• Dickes Korkbrett Laborbestand• Aufbewahrungsgefäß für Gehirn Laborbestand• 0,9%ige Kochsalzlösung DELTA-PHARMA• Pentobarbital MERCK• 4%iges Paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 Eigene Herstellung• Schüttler GFL 3005• PH-Meter mit Eichlösungen SCHOTT• Reinstes Paraformaldehyd MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• 0,2 M Phosphate Buffer Saline (PBS) Eigene Herstellung• Heizplatte Laborbestand• Natriumhydroxid Pellets MERCK• 5N Hydrochlorid MERCK• 1N Natriumhydroxid MERCK• Magnetische Rührplatte mit Magnetrühren JANKE & KUNKEL
und Heizfunktion JANKE & KUNKEL• Grammwaage SARTORIUS• Pipetten EPPENDORF
2.3.2 Methode
Nach einer Überlebenszeit von 3 Tagen erfolgte die Gefäßdarstellung und Fixation.
Hierbei wurde die Maus zuerst durch eine intraperitoneale Injektion von 0,1 mg/kg
Körpergewicht Pentobarbital in eine finale Narkose gelegt.
Material und Methoden
16
Zuerst wurde intrakardial mit 20 ml 0,9%ige Kochsalzlösung perfundiert, um das Blut
aus den Gefäßen zu waschen. Dann wurden 0,5ml eines Gemisches aus 10%
Gelatine und 50 % Tinte zur Darstellung der Gefäße des Circulus arteriosus Willisi
injiziert. Dies erfolgte so lange, bis die Schleimhäute der Maus dunkel wurden.
Das beschriebene Gemisch aus Gelatine und Tinte ist flüssig bei Raumtemperatur
und fest bei 4% C. Daher wurde die tote Maus vor der Gehirnentnahme für 10 min in
den Kühlschrank gelegt. Danach erfolgte die Dekapitation und vorsichtige
Gehirnentnahme einschließlich der Gefäße. Das Gehirn wurde nun für 2 Tage in
4%igem PFA auf dem Schüttler bei ca. 50 Umdrehungen pro Minute (rpm) und 4°C
weiter fixiert.
2.4 Fixation und Schneiden
2.4.1 Materialien
• Diverse Aufbewahrungsgefäße Laborbestand• Schüttler GFL 3005• Löffel Laborbestand• Kimwipes Labortücher KIMBERLEY & CLARK• -80°C Tiefkühlschrank JEWETT• Kryostat LEICA CM 3050• Schneideklingen FEATHER• Pinsel Laborbestand• Pinzette Laborbestand• Rasierklingen Handelsüblich• Mit Silan beschichtete Objektträger ENGELBRECHT• Kryoboxen Laborbestand• 20%ige Sucrose Eigene Herstellung• flüssiges Isopentan Laborbestand• Jung’s Einbettmedium JUNG’S• Ethanol 100% Klinikumsapotheke• Auflichtmikroskop ZEISS
2.4.2 Methode
Nach der Fixation mit 4%igem PFA wurden die Gehirne für zwei Tage in 20%iger
Sucrose gelagert. Durch die Sättigung mit dieser Zuckerlösung wird die Gefahr der
Entstehung von Gefrierartefakten beim Einfrieren minimiert.
Material und Methoden
Die Sättigung mit Sucrose erfolgte bei 4°C auf einem Schüttler.
Vor dem Einfrieren wurde der Status des Circulus Arteriosus dokumentiert. Dies
erfolgte unter einem Binokular. Abb. 1 zeigt in schematischer Weise den Aufbau des
Circulus arteriosus Willisi bei Mäusen und insbesondere den Verlauf der A.
communicans posterior.
ACA: A. cerebri ante
ACM: A. cerebri med
ACI: A. carotis inter
ACP: A. cerebri pos
ACS: A. cerebellaris
AB: A. basilaris
PcomA: A. communica
Es wurde bei allen Gehirnen
Die Einteilung erfolgte in die
Gut Ausgeprägt („+“)
Hypoplastisch oder N
ACIPco
ACA
rior
ia
na
terior
superior
ns posterior
der Zustand
Gruppen:
icht Ausgeprä
mA
ACM
d
g
ACP
Abb. 1 Darstellung des Circulusarteriosus bei Mäusen
ACS AB17
er PcomA auf beiden Seiten dokumentiert.
t („-“)
Material und Methoden
18
Die Gehirne wurden auf einem Kryostaten bei –20°C in 20 µm dicke Schnitte
geschnitten. Die Gehirne wurden bis zum Ende des Hippocampus aufgeschnitten,
hierfür wurden in der Regel 40 Objektträger benötigt.
Von jedem Gehirn wurden außerdem 5 Schnitte aus einem für die Auswertung
unwichtigen Bereich „free floating“ in PBS gegeben und für eine spätere Ubiquitin-
Färbung aufbewahrt.
In Kryoboxen konnten die restlichen Schnitte für mehrere Monate im –80°C
Tiefkühlschrank aufbewahrt werden.
2.5 Färbungen
2.5.1 Cresylviolett
• 4%iges Paraformalinaldehyd eigene Herstellung• 0,1 M Phosphate Buffer Saline (PBS) eigene Herstellung• Cresylviolettlösung eigene Herstellung• 70%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 80%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 96%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 100%iger Alkohol Klinikumsapotheke• Xylollösung Klinikumsapotheke• DPX-Eindeckmedium FLUKA• Deckgläser ENGELBRECHT• Natriumacetat Klinikumsapotheke• Reine Essigsäure MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• PH-Meter mit Eichlösungen SCHOTT• Wärmeplatte MEDAX• Magnetische Rührplatte mit Magnetrührern JANKE & KUNKEL• Wärmeschrank HERAEUS• Küvetten Labor der Neurol.Klinik• Messzylinder SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Bechergläser SCHOTT DURAN• Pipetten EPPENDORF
Cresylviolett wurde wie folgt hergestellt:
• 5,44 g Natriumacetat wurden in 200 ml Aqua destillatum (pH 3,8-4) gelöst
• Auf 800 ml Aqua destillatum wurden nun 9,8 ml Essigsäure gegeben
• Zu dieser Lösung wurde die Cresyl-Natriumacetatlösung gegeben
Material und Methoden
19
• Die Lösung wurde über Nacht im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert und am
darauffolgenden Tag filtriert
Zur Färbung mit Cresylviolett mußten die Schnitte mindestens eine Stunde vorher auf
einer Wärmeplatte bei 40°C aufgetaut und getrocknet werden.
Nach dem Trocknen erfolgte eine Postfixation für 5 min in 4% PFA. Danach wurden
die Schnitte für 3 x 5min in 0,1M PBS gespült.
Die Cresylfärbung wurde dann folgendermaßen durchgeführt:
• 2 min Aqua destillatum
• 5 min Cresylviolett (je nach Frische der Lösung)
• zum Differenzieren jeweils15 sec. 70%iger Alkohol
15 sec. 80%iger Alkohol
15 sec. 96%iger Alkohol
3 min. 100%iger Alkohol
• 5 min Xylollösung, um die Schnitte völlig zu dehydrieren und so auf das
Einbettmedium DPX, das auf Xylolbasis hergestellt wird, vorzubereiten
• Nach der Xylollösung wurden die Schnitte für ca. 1 min getrocknet, dann
wurde auf jeden Schnitt ein dicker Tropfen DPX gegeben und die Schnitte
vorsichtig eingedeckt. Hierbei war es besonders wichtig, Luftblasen unter dem
Deckgläschen zu verhindern.
• Die fertigen Objektträger wurden nun für einige Stunden bei Raumtemperatur
getrocknet und konnten danach ausgewertet werden.
2.5.2 Fluoro-Jade-B
Für die Fluoro-Jade-B-Färbung wurden die folgenden Chemikalien und Hilfsmittel
verwendet:
• 4%iges PFA Eigene Herstellung• 0,1 M PBS Eigene Herstellung• Fluoro-Jade-B Stock Solution HISTO-CHEM• 0,06%ige Kaliumpermanganat-Lösung Eigene Herstellung• Reine Essigsäure MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• Schüttler GFL 3005• Wärmeplatte MEDAX• Xylollösung Klinikumsapotheke• DPX-Eindeckmedium FLUKA
Material und Methoden
20
• Deckgläser ENGELBRECHT• Küvetten Labor der Neurol.Klinik• Messzylinder SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Bechergläser SCHOTT DURAN• Pipetten EPPENDORF
Auch für die Fluoro-Jade-B-Färbung wurden die Objektträger mindestens eine
Stunde vorher auf der Wärmplatte bei ca. 40°C aufgetaut und getrocknet.
Danach erfolgte die Postfixation wie oben beschrieben.
Fluoro-Jade-B ist ein anionisches saures Fluorescein-Derivat und hat eine
spezifische Affinität für degenerierende Neurone.
Für jeden Färbevorgang wurde eine frische Fluoro-Jade-B-Gebrauchslösung
angesetzt. Hierzu wurde die Stammlösung 1:10 mit Aqua destillatum verdünnt.
Reine Essigsäure wurde ebenfalls mit Aqua destillatum im Verhältnis 1:1000
verdünnt. Zu 96 ml dieser 0,1%igen Essigsäure wurden nun 4 ml der verdünnten
Fluoro-Jade-B-Lösung gegeben, so daß eine 0,0004%ige Gebrauchslösung
entstand.
Die Fluoro-Jade-B-Färbung wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt:
• Nach der Postfixation 10 min 0,06%iges Kaliumpermanganat bei
Raumtemperatur auf dem Schüttler
• Danach 2 min Spülen mit Aqua destillatum
• Für 20 min Inkubation in 0,0004%iger Fluoro-Jade-B-Gebrauchslösung,
hierbei wurde die Küvette lichtdicht abgedeckt
• Spülen für 3x1min in Aqua destillatum
• Danach wurden die Schnitte für ca. 10 min auf der Wärmeplatte bei 40°C
getrocknet
• Dehydrierung mit Xylol für 30 sec
• Danach wurden die Schnitte für ca. 1 min getrocknet und dann wie oben
beschrieben eingedeckt.
• Die Schnitte wurden nun für einige Stunden abgedunkelt getrocknet und
konnten danach unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet werden.
Material und Methoden
21
2.5.3 Ubiquitinfärbung
• 0,1 M PBS Eigene Herstellung• Methanol Klinikumsapotheke• 30%ige Peroxidase (H2O2) ALDRICH• Triton X Eigene Herstellung• Normal Goat Serum (NGS) SIGMA• Anti-Ubiquitin, made in rabbit DAKO• Anti-Rabbit, made in goat, biotyniliert VECTOR• Vectastain ABC-Kit Standard VECTOR
(Avidin Biotin Complex)• Diaminobenzidin (DAB) SIGMA• DAB-Puffer (10x) Eigene Herstellung• Aqua destillatum MILLIPORE• Pipetten EPPENDORF• Milligrammwaage SARTORIUS• Grammwaage SARTORIUS• Magnetische Rührplatte mit Magnetrührern JANKE & KUNKEL• Schüttler GFL 3005• Bechergläser SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Meßzylinder SCHOTT DURAN• Ethanol 50%, 70%, 80%, 96%, 100% Klinikumsapotheke• Xylol Klinikumsapotheke• Deckgläser ENGELBRECHT• Bleach Klinikumsapotheke• Pipettierplatten Labor der Neurol.Klinik• Mikroskop ZEISS• Gelatinierte Objektträger ENGELBRECHT
Für die Ubiquitinfärbung wurden die während des Schneidevorgangs in 0,1M PBS
gesammelten „free floating“ Schnitte verwendet. Für jedes Gehirn standen 5 Schnitte
zur Verfügung.
Diese Schnitte wurden zuerst für 3 x 3 min in 0,1M PBS gespült. Dann erfolgte die
Ubiquitinfärbung nach folgendem Protokoll:
• Endogener Peroxidase-Block: für 10 min in einer Lösung aus 50% 0,1M PBS,
47% Methanol, 3% 30%ige Peroxidase (H2O2) bei Raumtemperatur auf dem
Schüttler, ca. 40 rpm
• Danach für 3 x 3 min Spülen in 0,1M PBS
• Die Blocking Solution für den Serum Block wurde zu 95% aus 0,5%igem
Triton X und 5% NGS hergestellt. Es wurde die doppelte Menge hergestellt,
Material und Methoden
22
da auch bei der Inkubation mit dem Primärantikörper Blocking Solution
verwendet wurde
• Der Serum Block erfolgte für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler
• Der Primärantikörper Anti-Ubiquitin wurde im Verhältnis 1:1000 zur Blocking
Solution gegeben. Hierin wurden die Schnitte über Nacht auf dem Schüttler
bei 4°C inkubiert.
• Am darauffolgenden Tag wurden die Schnitte zunächst für 3 x 3 min in
0,1M PBS gespült
• Danach erfolgte die Inkubation mit dem biotinylierten Zweitantikörper
Anti-Rabbit in einer Lösung aus 5% Normal Goat Serum und 95% 0,5%iges
Triton X. Der Zweitantikörper wurde in einem Verhältnis von 1:250 zugegeben.
• Die Inkubation erfolgte für eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur
• Danach erfolgte wiederum ein Waschschritt wie oben beschrieben
• Das ABC-Kit wurde mit einem Tropfen Avidin und einem Tropfen Biotin auf
5 ml 0,1M PBS angesetzt. Die Schnitte wurden hierin für eine Stunde auf dem
Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert.
• Danach erfolgte wiederum ein Waschschritt wie oben beschrieben
• Für die Farbreaktion wurden 5 mg DAB, 1 ml DAB-Puffer, 9 ml Aqua
destillatum und 2µl H2O2 gemischt. Da DAB sehr giftig ist, wurden spezielle
Handschuhe getragen sowie unter dem Abzug gearbeitet.
• Die Farbreaktion dauerte zwischen 4 und 6 min, aber immer für alle Schnitte
gleich lang, um einen Vergleich zwischen den verschiedenen Gehirnen ziehen
zu können.
• Die Farbreaktion wurde durch Übertragen der Schnitte in PBS gestoppt
• DAB wurde durch Bleichlösung inaktiviert und gesondert entsorgt
• Die Schnitte wurden auf gelatinierte Objektträger aufgezogen und über Nacht
getrocknet
• Am nächsten Tag erfolgt die Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe
nach folgendem Protokoll:
o Aqua destillatum 2 min
o Ethanol 50% 2 min
o Ethanol 70% 2 min
o Ethanol 96% 2 min
Material und Methoden
23
o Ethanol 100% I 2 min
o Ethanol 100% II 2 min
o Xylol I 2 min
o Xylol II 2 min
• Danach wurden die Objektträger für ca. eine Minute luftgetrocknet und
anschließend mit DPX eingedeckt.
2.6. Analyse
2.6.1 Geräte
Für die Auswertung und photographische Dokumentation der Gehirne wurden
folgende Geräte verwendet:
• Licht-und-Fluoreszenzmikroskop Axiocam ZEISS
• Kameravorrichtung ZEISS
• Bildbearbeitungsprogramm Axiovision ZEISS
• Tabellenkalkulationsprogramm EXCEL MICROSOFT
2.6.2 Methode
Zur Bewertung der Läsionsgröße wurde folgende Einteilung vorgenommen, wie sie
von Pulsinelli et al 1979 beschrieben wurde:
Läsionsgruppe 0 : keine neuronale Schädigung
Läsionsgruppe 1 : bis zu 30% der Neurone geschädigt
Läsionsgruppe 2 : 31 bis 60% der Neurone geschädigt
Läsionsgruppe 3 : mehr als 60% der Neurone geschädigt
Zur Bestimmung der Läsionsgruppe wurde der gesamte Hippocampus betrachtet. Es
wurde jeweils der Hippocampus in beiden Hemisphären auf Höhe des Nucleus
subthlamicus ausgewertet.
Die Einteilung in Läsionsgruppen wurde anhand der Cresylfärbung vorgenommen.
Hierbei wurde besonders darauf geachtet, daß dem Untersuchern nicht bekannt war,
Material und Methoden
24
ob es sich um ein transgenes oder ein nicht transgenes Tier handelt.
Die Fluoro-Jade-Färbung wurde in erster Linie dazu verwendet, die mit der
Cresylfärbung vorgenommene Einteilung zu verifizieren.
Mit der Ubiquitinfärbung konnte der Genstatus des jeweiligen Tieres noch einmal
bestätigt werden.
2.7 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit der exakten Version des Mann-Whitney-U-
Test. Hierbei handelt es sich um einen nicht-parametrischen Test, der zwei nicht
gepaarte Gruppen vergleicht.
Das Ergebnis des Tests ist der sogenannte P-Wert. Der P-Wert beschreibt die
Wahrscheinlichkeit, daß ein Unterschied im Mittelwert der beiden Gruppen rein
zufällig ist. Der P-Wert reicht also von 0 bis 1.
Es wurde ein Schwellenwert von p < 0,01 festgelegt. Als „Null-Hypothese“ wurde
festgelegt, daß transgenen und nicht transgene Mäuse die gleiche mittlere
Läsionsgröße aufweisen.
Ist der P-Wert nun kleiner als der Schwellenwert von 0,01, so kann die Nullhypothese
verworfen werden und ein Unterschied in der mittleren Läsionsgröße der transgenen
und nicht-transgenen Mäuse kann als signifikant angesehen werden.
Da die Hippocampi beider Hemisphären ausgewertet wurden, also zwei Hippocampi
pro Gehirn, kommt es bei der statistischen Auswertung zu Gesamtsummen von 20
Werten pro Ischämie-Gruppe, bzw. 24 Werten in der Gruppe „20 min Ischämie“.
Um zu prüfen, ob der Genstatus einen statistisch signifikanten Einfluß auf die
Ausprägung des Circulus arteriosus Willisi hat, wurde der Χ2-Test durchgeführt. Mit
dem Χ2-Test für Unabhängigkeit wird untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen 2
Variablen, hier dem Genstatus und der Ausprägung des Circulus arteriosus Willisi,
besteht. Das Ergebnis des Χ2-Tests ist der P-Wert, der die Wahrscheinlichkeit einer
Abhängigkeit der Variablen voneinander angibt. Es wurden außerdem X2-Tests
durchgeführt, um die Korrelation zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und
der Läsionsgröße, bzw. der Verteilung auf die Ischämiezeiten, zu prüfen.
Ergebnisse
25
3. Ergebnisse
3.1 Gefäßstatus
3.2 Genotypisierung
3.3 15 min Ischämie
3.4 20 min Ischämie
3.5 60 min Ischämie
3.6 Cycloheximid-Behandlung / 20 min Ischämie
3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittleren Läsionsgrößen
3.8 Photos
3.8.1 Circulus arteriosus
3.8.2 Ubiquitinfärbungen
3.8.3 Übersichtsaufnahmen Cresyl/Fluoro Jade
3.8.4 Detailaufnahmen 15 min Ischämie
3.8.5 Detailaufnahmen 20 min Ischämie
3.8.6 Detailaufnahmen 60 min Ischämie
Ergebnisse
26
3.1 Gefäßstatus
Der Status der Arteria commnunicans posterior (PcomA) wurde bei allen operierten
Tieren mittels Auflichtmikroskopie an den mit Tinte perfundierten Gefäßen
festgestellt. Die Verteilung des Gefäßstatus wird in der folgenden Tabelle deutlich:
15 min Ischämie 20 min Ischämie 60 min Ischämie Cyclo/20 min Isch.
tg nt tg nt tg nt tg nt
+ 6 4 4 6 6 8 5 8
- 4 6 8 6 6 0 5 2
Tab. 2 Vorhandensein einer PcomA in bezug auf die Ischämiezeiten und den Genstatus
+ PcomA ist gut erhalten nt: nicht transgen- PcomA ist hypoplastisch oder fehlt tg: transgen
Mittels X2-Tests wurde geprüft, ob eine Abhängigkeit besteht zwischen
Vorhandensein einer PcomA und:
1. - Genstatus
2. - Läsionsgröße
3. - Verteilung auf die Ischämiezeiten durchgeführt.
Zu 1: Der Χ2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,1699 keinen statistisch
signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und
Genstatus der Mäuse.
Zu 2: Der X2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,2831 keinen statistisch
signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und der
Läsionsgröße.
Zu 3: Der X2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,0139 keinen statistisch
signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und der
Läsionsgröße.
Ergebnisse
27
3.2 Genotypisierung
Bei allen operierten Tieren wurde der durch PCR im Alter von 2 Wochen bestimmte
Genstatus durch eine Ubiquitinfärbung geprüft. Bei den transgenen Mäusen fanden
sich entsprechend zahlreiche Ubiquitin-positive intranukleäre Einschlußkörper, vor
allem in Neuronen des Cortex und Hippocampus, die bei nicht transgenen Mäusen
nie zu finden sind. (vgl Abb. 9 und 10)
Nur bei einer Maus (60 min Ischämie) konnte der Genstatus nicht bestätigt werden.
Bei dieser als nicht transgen genotypisierten Maus fanden sich im Cortex und
Hippocampus intranukleäre Einschlußkörper, die als eindeutiges Zeichen für
Transgenität gewertet werden müssen. In der Gruppe 60-min-Ischämie gingen daher
6 transgene und 4 nicht transgene Mäuse in die Auswertung ein.
Bei allen anderen Mäusen konnte der durch PCR bestimmte Genstatus bestätigt
werden.
Ergebnisse
28
3.3 15 min Ischämie
Die Läsionsgrößen nach 15 minütiger Ischämie sind in Tabelle 2 und 3
zusammengefasst. Bei den transgenen Mäusen zeigte sich eine durchschnittliche
Läsionsgröße von 0,4 +/- 0,21 (x +/- SEM). Bei den nicht transgenen Mäusen betrug
die mittlere Läsionsgröße 2,3 +/- 0,28 (x +/- SEM). In Abbildung 2 ist dies graphisch
dargestellt.
Der Unterschied zwischen den mittleren Läsionsgrößen der transgenen und nicht
transgenen Tiere ist signifikant.
Maus Seite LGre 0
127 C1 ♀ B1li 0
re 0127 C1 ♀ A3
li 0
re 1125/1 ♀ A1
li 2
re 0128 B1 ♀ A1
li 1
re 0128 B1 ♀ A2
li 0
Maus Seite LGre 3
126/1 ♀ A2li 3
re 3130 A1 ♂ A1
li 1
re 1135 A1 ♀ A3
li 1
re 3130 A1 ♀ A2
li 3
re 2126/1 ♀ A5
li 3
Tab. 3 Läsionsgrößender einzelnen transgenenMäuse nach 15 minIschämie
Tab. 4 Läsionsgrößender einzelnen nichttransgenen Mäuse nach15 min Ischämie
Ergebnisse
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
3Lä
sion
sgrö
ße
Transgene
Abb. 2 Graphische Darstellung von MitteMäuse in der Gruppe „15 min Ischämie“
Mäuse Nicht tra
lwert und SEM für
*
29
nsgene Mäuse
transgene und nicht transgene
Ergebnisse
30
3.4 20 min Ischämie
Die Läsionsgrößen nach 20 minütiger Ischämie sind in Tabelle 4 und 5
zusammengefasst. Bei den transgenen Tieren fand sich eine durchschnittliche
Läsionsgröße von 0,45 +/- 0,10 (x +/- SEM) und bei nicht transgenen Tieren von 1,5+/- 0,29 (x +/- SEM) (vgl. Abb. 3).
Der Unterschied in den mittleren Läsionsgrößen der transgenen und nicht
transgenen Mäusen ist statistisch signifikant.
Maus Seite LGre 2129 B1 ♂ A5li 1re 0129 B1 ♀ A1li 1re 0122/2 ♂ A3li 0re 0120/2 ♂ A1li 0re 0129 B1 ♀ A2li 0re 1129 B1 ♂ A4li 1
Maus Seite LGre 1128 C2 ♂ A4li 1re 0128 C2 ♂ A3li 1re 2128 C2 ♂ A1li 2re 0128 C2 ♀ A1li 1re 3128 C2 ♂ A2li 3re 3128 C2 ♀ A2li 1
Tab. 5 Läsionsgrößender einzelnen transgenenMäuse nach 20 minIschämie
Tab. 6 Läsionsgrößender einzelnen nichttransgenen Mäuse nach20 min Ischämie
Ergebnisse
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00Lä
sion
sgrö
ße
Transgene
Abb. 3 Graphische Darstellung von MiMäuse in der Gruppe „20 min Ischämie“
Mäuse
ttelwert u
*
31
Nicht transgene Mäuse
nd SEM für transgene und nicht transgene
Ergebnisse
32
3.5 60 min Ischämie
In Tabelle 6 und 7 sind die Läsionsgrößen der transgenen und nicht transgenen
Tiere nach 60-minütiger Ischämie dargestellt. Die mittlere Läsionsgröße bei
transgenen Tieren betrug 0,58 +/- 0,23 (x +/- SEM). Bei den nicht transgenen Tieren
fand sich eine mittlere Läsionsgröße von 0,75 +/- 0,34 (x +/- SEM) (vgl Abb. 4).
Die Null-Hypothese kann nicht verworfen werden. Der Unterschied in den mittleren
Läsionsgrößen der transgene und nicht transgenen Mäuse ist nicht signifikant.
Maus Seite LGre 0
120 ♀ B3li 1
re 1130 C ♀ A3
li 0
re 0123/2 ♀ A2
li 2
re 0120/2 ♀ A1
li 0
re 0120/2 ♀ B2
li 2
re 1128 C ♀ E A3
li 0
Maus Seite LGre 1
123/2 ♀ A3li 1
re 0120/2 ♀ B1
li 0
re 0130 C1 ♀ A1
li 1
re 0130 C1 ♂ A1
li 3
Tab. 7 Läsionsgrößender einzelnen transgenenMäuse nach 60 minIschämie
Tab. 8 Läsionsgrößender einzelnen nichttransgenen Mäuse nach60 min Ischämie
Ergebnisse
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
Läsi
onsg
röße
Transgene Mäuse Nicht trans
Abb. 4 Graphische Darstellung von Mittelwert und Stransgene Mäuse in der Gruppe „60 min Ischämie“
33
gene Mäuse
EM für transgene und nicht
Ergebnisse
34
3.6 Cycloheximid-Behandlung/20 min Ischämie
Die Läsionsgrößen nach Vorbehandlung mit Cycloheximid und 20 minütiger Ischämie
sind in Tabelle 8 und 9 dargestellt. Bei den transgenen Mäusen zeigte sich eine
durchschnittliche Läsionsgröße von 0,9 +/- 0,22 (x +/- SEM), während sie bei nicht
transgenen Tieren 2,8 +/- 0,13 (x +/- SEM) (vgl Abb. 5)
Der Unterschied in den Mittelwerten der Läsionsgrößen der transgenen und nicht
transgenen Mäuse ist signifikant.
Maus Seite LGre 1
123/1 ♀ A1li 1
re 1130 A1 ♂ A2
li 0
re 0123/1 ♀ A3
li 0
re 2123/1 ♂ A3
li 1
re 1130 B1 ♂ A4
li 2
Maus Seite LGre 3
138 B1 ♂ A2li 2
re 3138 B1 ♂ A4
li 3
re 2138 B1 ♂ B2
li 3
re 3138 B1 ♂ B3
li 3
re 3138 B1 ♂ B6
li 3
Tab. 9 Läsionsgruppender transgenen Mäusenach Behandlung mitCycloheximid und 20 minIschämie
Tab. 10 Läsionsgruppender nicht transgenenMäuse nach Behandlungmit Cycloheximid und 20min Ischämie
Ergebnisse
00,25
0,50,75
11,25
1,51,75
22,25
2,52,75
33,25
Läsi
onsg
röße
Transgene
Abb. 5 Graphische Darstellung dertransgenen Mäuse in der Gruppe „Cyclohe
*
35
Mäuse Nicht transgene Mäuse
Mittelwerte und SEM der transgenen und nichtximid und 20 min Ischämie“
Ergebnisse
36
3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittlerenLäsionsgrößen
Da die Läsionsgröße bei nicht transgenen Mäusen mit der Ischämiedauer variierte,
wurde die Läsionsgröße der nicht transgenen Mäuse mit 100 % gleichgesetzt, so
dass ein direkter Vergleich für jeden Zeitpunkt möglich ist. Die Läsionsgröße der
transgenen Mäuse ist in Prozent der Kontrollen (+/- SEM) angegeben. Nach 15 und
20 Minuten globaler Ischämie sind die Läsionen der transgenen Mäuse signifikant
kleiner, während nach 60 minütiger Ischämie der Unterschied nicht mehr signifikant
ist. Eine Vorbehandlung mit Cycloheximid hatte keinen Einfluß auf die Läsionsgröße
nach 20 min globaler Ischämie.
Nicht transgeneKontrollmäuse Transgene Mäuse
Umrechnung % % der Kontrolle
SEM SEM
15 min Ischämie 100 12,17 17,4 9,13
20 min Ischämie 100 19,33 30 6,67
60 min Ischämie 100 22,4 77,3 24,4
Cycloheximid +20 min Ischämie 100 4,64 32,1 7,86
Tab. 11 Tabellarische Darstellung der Läsionsgrößen nach globaler Ischämie bei nichttransgenen Kontrollmäusen und transgenen Mäusen
Ergebnisse
0
20
40
60
80
100
120
140Lä
sion
sgrö
ße in
Pro
zent
Nicht transgene Kontrollmäuse Transgene Mäuse
Abb. 6 Graphische und tabellariscIschämie bei nicht transgen
15 min 2 Ischämie Is
*
*he Darstellung der Läsionsgrößen naen Kontrolltieren und transgenen Mä
0 min 60 min Cyclochämie Ischämie 20 m
*
37
ch globalerusen
heximid+in Ischämie
Ergebnisse
38
3.8 Photos
3.8.1 Circulus arteriosus
Abb. 7 Abb. 8
ACP
AB ACS A. communicans post
Abb. 7 und 8 zeigen beispielhaft die Variabilität im Gefäßstatus der von uns
behandelten Mäuse. Deutlich sind die A. basilaris (AB), die Aa. cerebellares
superiores (ACS) und die Aa. cerebri posteriores (ACP) erkennbar.
Auf Abb. 7 ist zwischen den ACS und ACP auf keiner Seite eine Verbindung sichtbar,
die A. communicans posterior fehlt. Besonders deutlich wird dies im Vergleich mit
Abb. 8, in der auf beiden Seiten eine gut ausgeprägte A. communicans posterior
erkennbar ist.
Ergebnisse
3.8.2 Ubiquitinfärbungen
200 µm 200 µm
Abb. 9
Abb.9 zeigt dieÜbersichtsvergrößerung desHippocampus eines nichttransgenen Tieres, Abb.10die eines transgenen Tieres.In stärkerer Vergrößerung(Abb.10a und Abb.10b) sinddeutlich die intranukleärenEinschlußkörper erkennbar
25 µm
Abb.10a
10 µm
Abb.10b
Abb.10
39
Ergebnisse
40
3.8.3 Übersichtsaufnahmen Cresyl und Fluoro Jade nach15 min Ischämie
Abb.11 Abb.12
Abb.13 Abb.14
Abb. 11- 14 zeigen repräsentativ die Übersichtsaufnahmen des Hippocampus eines
transgenen Tieres mit LG 0 (links) und eines nicht transgenen Tieres mit LG 3
(rechts) nach 15 min Ischämie (beide x50).
Insbesondere in der Fluoro Jade Färbung (Abb. 14) wird deutlich, dass nach 15
minütiger Ischämie der gesamte Hippocampus geschädigt ist (beide x50).
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm
Ergebnisse
41
3.8.4 Detailaufnahmen 15 min Ischämie
Abb.15 Abb.16
Abb.17 Abb.18
In der Detailvergrößerung (x200) bei Cresylviolettfärbung ist in der oberen Reihe
deutlich der Unterschied in der Zelldichte als Hinweis auf den durch die Ischämie
hervorgerufenen Neuronenverlust des Hippocampus zu erkennen. Abb. 15 zeigt den
Hippocampus eines transgenen Tieres mit LG 0 nach 15 min Ischämie. Die Zellen
sind gleichmäßig groß mit gut abgrenzbaren Nuclei. Es sind keine Lücken oder
Ausdünnungen im Zellband erkennbar.
Abb. 16 zeigt eine deutliche Ausdünnung des CA 1-Sektors des Hippocampus einer
nicht transgenen Maus. Die Zellen wirken plump und aufgequollen. Einige Vakuolen
sind sichtbar. Dieser Zellschaden entspricht der LG 3, d.h. über 70 % der Neurone
sind geschädigt.
In der Fluoro-Jade-Färbung (x200) in der unteren Reihe konnte die Einteilung zu den
Läsionsgruppen 0, bzw. 3 bestätigt werden.
25 µm 25 µm
25 µm 25 µm
Ergebnisse
42
3.8.5 Detailaufnahmen 20 min Ischämie
Abb.19 Abb.20
Abb.21 Abb.22
Auf der linken Seite ist repräsentativ der intakte Hippocampus (LG 0) einer
transgenen Maus nach 20 min Ischämie dargestellt.
Rechts stellt ist ein kompletter segmentaler Zelluntergang im CA1-Sektor des
Hippocampus einer nicht transgenen Maus erkennbar (LG 2).
25 µm 25 µm
25 µm 25 µm
Ergebnisse
43
3.8.6 60 min Ischämie
Abb.23 Abb.24
Abb.25 Abb.26
Nach 60 min Ischämie konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der Größe
der Läsionen festgestellt werden. Beispielhaft ist in Abb. 23 und 25 eine transgene
Maus mit LG 2 und in Abb. 24 und 26 eine nicht transgenen Maus mit LG 3
dargestellt. Besonders in der Fluoro Jade wird deutlich, dass bei der nicht transgenen
Maus (Abb.26) ein geringfügig größerer Schaden als bei der in Abb. 25 dargestellten
transgenen Maus vorliegt.
25 µm 25 µm
25 µm 25 µm
Diskussion
44
Diskussion
45
4. Diskussion
Zusammenfassend ist festzustellen, dass nach 15 minütiger und 20 minütiger
globaler Ischämie die Läsionen im CA-1-Sektor des Hippocampus bei transgenen
Tieren signifikant kleiner sind als bei nicht transgenen Mäusen. Mit Zunahme der
Ischämiedauer nimmt der Unterschied der mittleren Läsionsgrößen zwischen
transgenen und nicht transgenen Tieren ab. Nach 60 Minuten globaler Ischämie ist
dabei der Unterschied in der mittleren Läsionsgröße der transgenen, bzw. nicht
transgenen Tiere nicht mehr signifikant. Eine Protektion der transgenen Mäuse
gegen Ischämie besteht also nur innerhalb eines engen zeitlichen Rahmens.
Um zu prüfen, ob die Expression protektiver Proteine mit kurzer Halbwertszeit für die
Ischämietoleranz verantwortlich ist, wurde eine Vorbehandlung mit dem
Proteinsynthesehemmer Cycloheximid durchgeführt. Diese hat keinen Einfluss auf
die Resistenz der transgenen Mäuse, so dass andere Ursachen der Protektion in
Betracht gezogen werden müssen. In der Literatur wird vielfach auf die Abhängigkeit
des Ausmaßes des neuronalen Schadens des Hippocampus bei globaler oder
fokaler Ischämie von der Vollständigkeit des Circulus arteriosus hingewiesen.
Es ist bekannt, dass vor allem Mäuse des Stammes CBA (Barone, 1993) und des
Stammes C57Black/6 (Fujii, 1997 und Kitagawa, 1998) eine nur hypoplastisch
angelegte oder komplett fehlende Arteria communicans posterior (PcomA) haben.
Bei Nagetieren wird der Hippocampus durch die A. choroidea anterior, ein Ast der
A. carotis interna, und über die Arteria cerebri posterior versorgt. Durch die
Unterbrechung des Blutflusses in der A. carotis communis kann der Hippocampus
über den oben beschriebenen Weg nicht mehr versorgt werden. Die Blutversorgung
kann somit nur noch über die PcomA erfolgen (Özdemir, 1992). Daraus kann
gefolgert werden, dass bei einer fehlenden oder nur hypoplastisch angelegten
PcomA die Läsion nach globaler Ischämie im Hippocampus größer sein muss als bei
einem gut angelegten Gefäß.
Auch bei den von uns verwendeten Mäusen des Stammes CBA & C57Black/6 konnte
eine starke Variabilität des Circulus arteriosus Willisi festgestellt werden. Eine
Beziehung zwischen der Vollständigkeit des Circulus arteriosus Willisi und dem
Genotyp bestand jedoch nicht. Ferner konnte eine Beziehung zwischen Ausprägung
der PcomA und Läsionsgröße, wie oben beschrieben, bei unseren Experimenten
nicht festgestellt werden. Es zeigte sich keine signifikante Abhängigkeit zwischen der
Diskussion
46
Anlage einer A. com. post. und Läsionsgröße in der CA1 Region des Hippocampus.
Insgesamt waren die Zahl der analysierten Hippocampi mit und ohne kollateraler
Blutversorgung innerhalb der verschiedenen Gruppen überwiegend ausgeglichen
verteilt (Tab. 2). Die einzige Ausnahme waren die Tiere mit 60 min Ischämiezeit. Die
post mortem durchgeführte Analyse ergab, daß die A. com. post. in der
Kontrollgruppe zufällig bei allen Tieren gut angelegt war und bei den transgenen
Mäusen hingegen in der Hälfte der Fälle fehlte.
Auffällig ist, daß bei diesen Kontrolltieren der Mittelwert der Läsionsgröße nach 60-
minütiger Ischämie überraschenderweise kleiner war als bei den Kontrolltieren
kürzerer Ischämie von 15- bzw. 20-minütiger Dauer. Im Vergleich zu den transgenen
Mäusen, die trotz teilweise fehlender A. com. post. ebenfalls durchschnittlich nur
kleine Läsionsgrößen aufwiesen, ergab sich kein signifikanter Unterschied im
Ausmaß des ischämischen Schadens.
Dadurch ergibt sich eine alternative Möglichkeit der Interpretation der Ergebnisse:
Vielleicht ist der nach 60-minütiger Ischämie scheinbar fehlende Unterschied der
ischämischen Toleranz zwischen den transgenen und den nicht-transgenen Tieren
auf eine unterschiedliche Variabilität des Circulus Arteriosus Willisi zurückzuführen
und nicht auf die bei den transgenen Mäusen in ihrer Kapazität bereits überforderte
Kompensationsmechanismen.
Da die Frage nach der Anlage einer A. com. post. für jedes einzelne Versuchtier nur
post mortem zweifelsfrei geklärt werden konnte, war eine gleichmäßigere Verteilung
der Tiere im vorhinein unter diesem Gesichtspunkt nicht möglich. Nur eine
Wiederholung des Experimentes mit weiteren Versuchstieren könnte hier letztlich
eine zweifelsfreie Klärung bringen.
Für die fehlende Übereinstimmung zwischen Ausprägung der PcomA und der
Läsionsgröße in den anderen Ischämiegruppen gibt es mehrere mögliche Gründe.
Einer dieser Gründe liegt in der Durchführung der transienten globalen Ischämie. In
der Literatur sind mehrere Methoden zur Durchführung einer fokalen oder globalen
Ischämie an Mäusen oder Ratten beschrieben worden. Eine transiente globale
Ischämie wurde zuerst an Ratten 1977 von Siemkowicz und Hansen durch Anlegen
einer aufblasbaren Halsmanschette und gleichzeitiger Hypotension auf 50 mm Hg
durchgeführt. Auch von anderen Experimentatoren wurde eine globale Ischämie
immer in Verbindung mit einer Hypotension durchgeführt (Benveniste, 1984).
Allerdings handelte es sich auch hierbei um Ratten.
Diskussion
47
Da es aufgrund des geringen Blutvolumens bei Mäusen nicht möglich ist, eine
kontrollierte Hypovolämie und konsekutive Hypotension durchzuführen, musste bei
unserer Versuchsdurchführung darauf verzichtet werden.
Es ist zu erwarten, dass zusätzliche Schwankungen des Blutdruckes zur Variabilität
des hippocampalen Schadens beitragen, so dass dies eine Grenze der
Zuverlässigkeit unserer Versuchsdurchführung darstellt. Der Einfluss des Genotyps
auf das Ausmaß des neuronalen Schadens war jedoch so dramatisch, dass trotz der
zu erwartenden hohen Variabilitäten bereits bei normalen Gruppengrößen deutlich
signifikante Ergebnisse zustande kamen.
Ein zweites methodisches Problem ist das bis heute nicht letztlich befriedigend
gelöste Problem der einwandfreien histologischen Identifizierung aller
degenerierender Neurone. Wir benutzten zur Einteilung in die Läsionsgruppen die im
19. Jahrhundert eingeführte Kresylviolett-Färbung (Herxheimer, 1899). Kresylviolett
färbt Zellkerne und Nisslschollen blauviolett an, rot färben sich die Granula von
Mastzellen und z.B. Knorpelgrundsubstanz. Das restliche Gewebe bleibt farblos.
Zeichen einer neuronalen Degeneration in der Kresylviolett-Färbung sind
Schrumpfung, Vakuolisierung und hyperchromatische Nucleoli (Schmued, 1997).
Diese Zeichen können jedoch auch durch Artefakte während der Fixation oder des
Schneidens oder durch nicht-letale Veränderung in der Morphologie der Zelle
hervorgerufen werden. Auf der anderen Seite können die ersten Anzeichen einer
neuronalen Degeneration so unauffällig sein, dass sich die betroffenen Zellen kaum
von gesunden Zellen unterscheiden lassen und es zu einem falsch negativen
Ergebnis kommt.
Fluoro-Jade hingegen ist spezifisch für degenerierende Neurone, ein Phänomen, das
in Anlehnung an die Silbernitratfärbung, die ebenfalls nur degenerierende Neurone
anfärbt, als „Argyrophilie“ bezeichnet wird (Schmued, 1997). Fluoro-Jade-B zeigt eine
noch höhere Affinität für degenerierende Neurone bei nahezu keiner
Hintergrundfärbung (Schmued, 2000). Fluoro-Jade-B färbt degenerierende Neurone
unabhängig vom Mechanismus ihrer Degeneration an. Dies konnte für verschiedene
Neurotoxine, verschiedene Glutamatagonisten, das mitochondriale Toxin 3-
Nitropropionsäure, diverse Metalle, Methamphetamin (Eisch, 1998) und bei
einseitiger Enukleation gezeigt werden (Schmued, 1997).
Aufgrund der unabhängigen Übereinstimmung in den beiden Techniken ist davon
auszugehen, dass die erhobenen Ergebnisse tatsächlich ein zuverlässiges Maß für
Diskussion
48
die Anzahl degenerierender Neurone, bzw. das Ausmaß des hypoxischen
hippocampalen Schadens darstellen.
Das von uns beobachtete Phänomen einer ischämischen Toleranz wurde bereits
mehrfach an Gehirnen von Versuchstieren gezeigt. 1991 entdeckten Himori et al,
dass nach repetitiven transienten cerebralen Attacken Mäuse mit jeder neuen
Attacke weniger sensibel wurden, einen ischämischen Schaden zu entwickeln
(Himori, 1991). In weiteren Versuchen konnten sie zeigen, dass sowohl eine gerade
noch nicht schädigende 10- minütige Ischämie als auch die Gabe von 1nmol NMDA
intraventrikulär 30 Minuten vor einer erneuten Gabe einer toxischen NMDA-Dosis die
sonst später auftretenden Verhaltensauffälligkeiten weitgehend verhindern konnten.
Außerdem war die Mortalität durch diese Vorbehandlung stark erniedrigt (Himori,
1991). Hiermit wurde gezeigt, dass es dieses am Herzen schon bekannte, und als
„Ischämische Präkonditionierung“ bezeichnete Phänomen, auch am Gehirn gibt.
Es stellt sich somit die Frage, ob auch bei der von uns beobachteten ischämischen
Toleranz bei CH-transgenen Mäusen ähnliche Mechanismen wie bei der
ischämischen Präkonditionierung zugrunde liegen. Es wird davon ausgegangen,
dass die Ursache der Protektion bei ischämischer Präkonditionierung im
wesentlichen in einer verstärkten Exprimierung kurzlebiger protektiver Proteine, z.B.
sog. heat-shock-Proteine (HSP) liegt. So konnte 1992 von Marini et al in Zellkulturen
gezeigt werden, dass zur Ausbildung der Neuroprotektion de-novo-mRNA- und
Proteinsynthese notwendig waren (Marini, 1992). HSP werden durch zellulären
Stress, wie z.B. Ischämie, (Lindquist, 1986) induziert . HSP sind zur Reparatur
fehlgefalteter Proteine durch Rückfaltung in ihre physiologische Tertiärstruktur
notwendig. Im Zusammenhang mit cerebraler Ischämie ist besonders das HSP70
von Bedeutung. Es kommt physiologischerweise im Mäuse- oder Rattengehirn nicht
vor und wird nach verschiedenen Stimuli sehr rasch induziert.
Gonzalez et al konnten 1991 zeigen, dass HSP70 Expression nach globaler
cerebraler Ischämie zuerst in den Zellen des CA-1-Sektors, und erst später in
anderen Sektoren induziert wird (Gonzalez, 1991). Auch nach ischämischer
Präkonditionierung steigt HSP-70 an, wie Kitagawa et al. 1990 zeigen konnten. Sie
beobachteten gleichzeitig eine weitgehende Toleranz gegenüber einem zweiten,
stärkeren ischämischen Reiz und postulierten eine protektive Wirkung der HSP
(Kitagawa, 1990).
Diskussion
49
Ebenso werden nach verschiedenen Stimuli, z.B. durch globale und fokale Ischämie,
sog. „Immediate-Early-Genes“ (IEG) exprimiert. Während die Synthese der meisten
„messenger-Ribonukleinsäuren“ (mRNA) und ihrer Proteine nach cerebraler
Ischämie abnimmt, werden einige IEG spezifisch induziert (Kinouchi, 1994). So
konnten 1993 An et al zeigen, dass nach fokaler Ischämie die Expression der IEG c-
fos, c-jun und junB erhöht war, während junD unverändert war (An, 1993). Die
Expression der IEG’s ist reversibel. Durch die IEG kommt es zur Aktivierung
sogenannter „late-genes“, die wichtige Funktionen im Zellstoffwechsel oder
Überleben der Zelle ausüben. Eines dieser „late-genes“ ist der „nerve-growth-factor“
(NGF), der das Nervenwachstum und –regeneration fördert (An, 1993). NGF wird
nach cerebraler Ischämie vermehrt exprimiert (Guégan, 1998) und spielt eine Rolle
bei der Inaktivierung freier Radikale (Guégan, 1998).
Läge der ischämischen Toleranz tatsächlich eine vermehrte Produktion solcher
kurzlebiger protektiver Proteine zugrunde, so müsste die Toleranz durch eine
kurzfristige Blockierung der Proteinbiosynthese aufzuheben sein. So konnten Barone
et al zeigen, dass eine vorherige Gabe von Cycloheximid die Toleranzentwicklung
durch ischämische Präkonditionierung komplett eliminierte (Barone, 1998).
Zur Überprüfung, ob auch bei der von uns bei CH-transgenen Mäusen beobachteten
ischämischen Toleranz die Expression kurzlebiger protektiver Proteine eine Rolle
spielt, wurden einige Mäuse vor der cerebralen Ischämie mit Cycloheximid
behandelt. Überraschenderweise konnte hierdurch die Protektion nicht aufgehoben
werden, so dass vermutlich andere Mechanismen der Toleranzentwicklung bei CH-
transgenen Mäusen zugrunde liegen müssen. In guter Übereinstimmung mit unseren
Ergebnissen stehen die Beobachtungen von Hansson et al, dass HSP70 im Gehirn
transgener Mäuse im Vergleich zu nicht transgenen Mäusen nicht erhöht sind
(Hansson, 1999).
CH-transgene Mäuse weisen nicht nur eine Toleranz gegen ischämische Reize auf,
sondern auch gegen eine Vielzahl weiterer Noxen. Hickey et al konnten 2000 zeigen,
dass R6/2 Mäuse im Alter von 7-10 Wochen im Vergleich zu Kontrolltieren kleinere
striatale Läsionen nach Injektion des mitochondrialen Toxins 3-Nitropropionsäure (3-
NP) aufwiesen (Hickey, 2000). 3-NP ist ein irreversibler Inhibitor der
Succinatdehydrogenase (Komplex II der Atmungskette), der nach systemischer
(Gould, 1982) und intrastriataler Injektion (Beal, 1993 A) normalerweise im Striatum
und Putamen einen deutlichen Neuronenverlust mit beginnender Gliose hervorruft
Diskussion
50
(Beal, 1993A). Weiterhin besteht bei transgenen CH-Mäusen eine Resistenz gegen
Exzitotoxizität durch Glutamatagonisten, z.B. Quinolinsäure und Kainat (Hansson,
1999). Will man die eher generalisierte Toleranz gegenüber unterschiedlichen Noxen
mit einem Mechanismus abklären, so müsste dieser an einem Stoffwechselschritt
ansetzen, der allen oben beschriebenen Noxen gemeinsam ist, bzw. das
gemeinsame Ergebnis ihrer Wirkungen ist.
Eine solche mögliche Hypothese zur Toleranzentwicklung bei CH-transgenen
Mäusen, die die Toleranz auf alle verschiedenen Noxen erklären könnte, beschäftigt
sich mit der Fähigkeit der Mitochondrien, freies übermäßiges Calcium zu speichern.
Danach könnten die Mitochondrien der transgenen Mäuse durch ein ständiges
Überangebot an Calcium Mechanismen aufgebaut haben, Calcium vermehrt
abzufangen und die Zelle somit vor einem Calcium-vermittelten Zelltod zu schützen.
Auch nach ischämischer Präkonditionierung durch kurze subletale Ischämie war bei
den dadurch resistenten hippocampalen Neuronen der Calcium-Einstrom in die Zelle
während einer zweiten Ischämie unverändert hoch. Die Mitochondrien der
resistenten Neurone waren jedoch in der Lage, das erhöhte intrazelluläre Calcium
vermehrt zu eliminieren und dadurch die Aktivierung calciumabhängiger Proteasen
zu verhindern und den Zelltod zu verringern (Ohta, 1996). Die Zelle hat also durch
ischämische Präkonditionierung Mechanismen aufgebaut, mit einem erhöhtem
intrazellulären Calciumgehalt umzugehen. An CH-transgenen Mäusen konnten
Hansson et al zeigen, dass der basale cytoplasmatische Calciumspiegel in
resistenten striatalen R6/2 Neuronen um das 5fache erhöht war (Hansson, 2001).
Diese Neurone unterliegen also einem kontinuierlich erhöhten, subletalen
Calciumreiz, der eine Anpassung der Zelle, vergleichbar mit der Präkonditionierung
bei ischämischer Toleranz, bewirkt und die Induktion von
Kompensationsmechanismen induziert. Da auch die von uns durchgeführte
ischämische Toxizität im Anfang wesentlich über Exzitotoxizität vermittelt wird,
könnte hier eine mögliche Erklärung für die beobachtete Resistenz liegen. Eine
Erklärung für die von uns beobachtete zeitliche Begrenzung der Toleranz könnte die
Erschöpfung der Kompensationsmechanismen nach 60 minütiger Ischämie sein.
Überraschenderweise wurde kürzlich festgestellt, dass nicht alle CH-transgenen
Mäuse eine erhöhte Toleranz gegen exzitotoxische Reize aufweisen.
Eine Mauslinie, die nicht wie die R6/1-Linie nur Exon 1 des Huntington-Gens,
sondern das gesamt mutierte Huntington-Gen exprimieren, weist sogar eine erhöhte
Diskussion
51
Empfindlichkeit gegenüber Exzitotoxizität auf (Zeron, 2002). Die fehlende Co-
Expression des nicht mutierten Anteils des Huntingtin könnte also bei der
Toleranzentwicklung CH-transgener Mäuse eine Rolle spielen. Weitere
vergleichende Untersuchungen in den verschiedenen Modellen werden notwendig
sein, den protektiven Effekt des mutierten Huntingtins in dem von uns verwendeten
Modell besser zu verstehen.
Zusammenfassung
52
Zusammenfassung
53
5. Zusammenfassung
Exzitotoxizität beschreibt den neurotoxischen Effekt übermäßiger Freisetzung
erregender Neurotransmitter wie Glutamat im zentralen Nervensystem. Es wird
vermutet, dass Exzitotoxizität eine wichtige Rolle sowohl bei akuten ischämischen
neuronalen Zellschäden als auch bei chronisch neurodegenerativen Erkrankungen
wie Chorea Huntington (CH) spielt. Überraschenderweise hat man jedoch
herausgefunden, dass CH transgene Mäuse resistent gegen intrastriatale Injektionen
von exzitotoxischen Substanzen wie Glutamatagonisten sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob CH transgene Mäuse auch resistent
gegenüber einer globalen cerebralen Ischämie sind. Hierbei wurden die Neurone des
Hippocampus untersucht, die die niedrigste ischämische Toleranz aufweisen. Eine
globale cerebrale Ischämie wurde durch beidseitige vorübergehende Okklusion der
A. carotis communis unter Narkose an CH transgenen Mäusen und Kontrollmäusen
durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass transgene Mäuse nach 15 und 20 minütiger
Ischämie einen signifikant geringeren neuronalen Zellschaden im Hippocampus
aufweisen als Kontrolltiere. Nach 60 minütiger Ischämie zeigen beide Tiergruppen
keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß des Zellschadens mehr.
Eine derartige Toleranz gegenüber globaler cerebraler Ischämie kann experimentell
auch durch sogenannte „Präkonditionierung“ erzeugt werden, wobei vorausgehende
kurzzeitige Ischämien zu einer ischämischen Toleranz durch Überexpression
kurzlebiger Proteine, wie z.B. sogenannten heat-shock-Proteine, führt. Um zu prüfen,
ob eine vermehrte Synthese kurzlebiger Proteine auch der Grund der Protektion CH
transgener Mäuse ist, wurde Mäusen 24 Stunden vor Durchführung der globalen
cerebralen Ischämie der unspezifische Proteinsynthesehemmer Cycloheximid
verabreicht. Dies hatte jedoch keinen Effekt auf das Ausmaß der ischämischen
Toleranz der CH transgenen Tiere. Es ist daher anzunehmen, dass die kurzzeitige
Überexpression kurzlebiger protektiver Proteine nicht die Ursache der vermehrten
Resistenz gegenüber der ischämischen Noxe bei CH transgenen Mäusen ist. Es
handelt sich somit um einen anderen Toleranzmechanismus als er der ischämischen
Präkonditionierung zugrunde liegt, wie er bisher noch nicht beschrieben wurde.
Diese Ergebnisse belegen, dass eine erhöhte Toleranz nicht nur im Striatum sondern
auch im Hippocampus CH transgener Mäuse besteht und diese Toleranz nicht nur
gegen Exzitotoxizität, sondern auch gegenüber einer globaleren Noxe wie Ischämie
Zusammenfassung
54
nachweisbar ist. Während der Gendefekt der CH letztlich zu einer chronischen
Neurodegeneration führt, induziert er im transgenen Mausmodell zumindest
vorübergehend eine Toleranz gegenüber akuten Noxen.
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Danksagung
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Danksagung
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7. Danksagung
Mein Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. J. Noth, der es mir als Direktor der
Neurologischen Klinik ermöglicht hat, eine anspruchsvolle und interessante
Dissertation durchzuführen.
Besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer, Herrn Priv-Doz. Dr. Christoph
Kosinski bedanken, der mir sowohl während der experimentellen Arbeit als auch
während des Verfassens der Dissertationsschrift stets unterstützend zur Seite
gestanden hat. Unter seiner Betreuung konnte ich wissenschaftliche Arbeits – und
Denkensweisen erlernen, die mir in meinen weiteren Berufsweg eine große Hilfe sein
werden. Für das freundschaftliche Verhältnis, auch mit Herrn Dr. Johannes Schiefer,
danke ich ganz besonders. Herrn Dr. Johannes Schiefer gilt weiterhin mein Dank für
die aussergewöhnliche Hilfe bei den Tierexperimenten.
Desweiteren gilt ein besonderer Dank Frau Barbara Müller, die mir während der
immunhistochemischen Aufarbeitung im Labor immer mit Rat und Tat zur Seite
gestanden hat. An dieser Stelle möchte ich auch meinen Mitdoktoranden,
insbesondere Sabine Oliva und Mirjam Kaul für die gute Zusammenarbeit und das
freundschaftliche Arbeitsklima danken.
Herrn Universitätsprofessor Dr. Küpper und den Mitarbeitern der
Tierversuchsabteilung möchte ich für die Anleitung im Umgang mit den
Versuchstieren und die Zurverfügungstellung der Räumlichkeiten danken.
Lebenslauf
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Lebenslauf
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8. Lebenslauf
Persönliche AngabenName : Anke Alexandra AlbertyAdresse : Venner Strasse 7
41068 MönchengladbachTelefon : 02161-561899e-mail : [email protected] : 05.11.1976Geburtsort : Mönchengladbach
Schulbildung1983 - 1987 Gemeinschaftsgrundschule Wegberg1987 - 1996 Maximilian-Kolbe-Gymnasium, Wegberg1993 - 1994 Internatsaufenthalt in England, Woldingham School of the
Sacred Heart, Surrey05/1996 Abitur am Maximilian-Kolbe-Gymnasium, Wegberg
Studium1996 - 1998 Vorklinische Ausbildung an der Martin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg1998 - 2003 Klinische Ausbildung an der RWTH Aachen07/1998 Ärztliche Vorprüfung mit der Note „Befriedigend“ (3,0)07/1999 Erstes Staatsexamen mit der Note „Befriedigend“ (3,0)04/2002 Zweites Staatsexamen mit der Note „Gut“ (1,6)05/2003 Drittes Staatsexamen mit der Note „Gut“ (2,0)
Klinische Erfahrung03/1999 Famulatur in der Inneren Abteilung des Luisenhospitals,
Aachen03/2000 Praxisfamulatur bei Dr. Arnulf Stefes, Facharzt für
Allgemeinmedizin, Aachen08 - 09/2000 Famulatur in der Neurologischen Abteilung des Grey Bruce
Regional Health Centre, Owen Sound, Kanada04 - 08/2002 Erstes Tertial des Praktischen Jahres in der Chirurgischen
Klinik der Kliniken Maria-Hilf, Mönchengladbach08 - 11/2002 Zweites Tertial in der Klinik für Innere Medizin an der Tulane
University, New Orleans, USA12/2002 - 3/2002 Drittes Tertial in der Neurologischen Klinik der Kliniken Maria-
Hilf, Mönchengladbach
Berufliche Tätigkeitab 6/2003 Ärztin im Praktikum in der Neurologischen Klinik der Kliniken
Maria-Hilf, Mönchengladbach
Private Interessenab 1982 Geigen - und Klavierunterricht
Mitglied des Niederrheinischen JugendsinfonieorchestersMitglied des Euregio-Jugendorchesters
1994 - 1996 Gemeinnützige Arbeit im Altenheim Wegberg