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2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 1
Paarweises Sequenzalignment• Methoden des Sequenzalignments
• Áustauschmatrizen
• Bedeutsamkeit von Alignments
• BLAST, Algorithmus – Parameter – Ausgabe http://www.ncbi.nih.gov
Diese Vorlesung lehnt sich eng an das BLAST Tutorial-
Buch (links) an, Kapitel 3-9
siehe auch Vorlesung Bioinformatik I von Prof. Lenhof,
Wochen 3 und 5
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 2
Sequenz-Alignment
Wenn man 2 oder mehr Sequenzen vorliegen hat, möchte man zunächst einmal
- ihre Ähnlichkeiten quantitativ erfassen
- Entsprechungen zwischen einzelnen Bausteinen beider Sequenzen erfassen
- Gesetzmässigkeiten der Konservierung und Variabilität beobachten
- Rückschlüsse auf entwicklungsgeschichtliche Verwandschaftsverhältnisse
ziehen
Wichtiges Ziel: Annotation, z.B. Zuordnung von Struktur und Funktion
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 3
Suche in Datenbanken
Identifiziere Ähnlichkeiten zwischen
einer neuen Testsequenz, deren
Struktur und Funktion unbekannt und nicht charakterisiert ist
und
Sequenzen in (öffentlichen) Datenbanken
deren Strukturen und Funktionen bekannt sind.
N.B. Die ähnlichen Regionen können die ganze Sequenz, oder Teile von
ihr umfassen!
Lokales Alignment globales Alignment
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 4
Informationstheorie
Wenn ein Kind auf jede Frage “nein” antwortet, enthalten die Antworten praktisch
keine Information. Wenn die Antworten “ja” oder “nein” sind, enthalten Sie mehr
Information.
Definition der Information:
p ist die Wahrscheinlichkeit einer Antwort.
Logarithmitsierte Werte zur Basis 2 heissen bits, aus binary und digit.
Wenn die Wahrscheinlichkeit, daß ein Kind kein Eis mag 0.25 ist, hat die Antwort
2 bits an Information. Die gegenteilige Information (es mag Eis) hat nur
0.41 bits an Information.
Bezüglich der Basis e, heisst die entsprechende Einheit nats.
p
ppH
2
2
log
1log)(
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 5
Information Theory
Tossing a coin is a source of head and tail symbols.
A message might be: tththtt
The letters A C G T are emitted from a DNA source. If the probability of any
particular symbol is simply 1/n the information of any symbol is log2(n). This value is
also the average.
The formal name for the average information per symbol is entropy.
If the symbols are not equally probable one has to weigh the information of each
symbol by its probability of occurring.
Shannon’s entropy:
A random DNA source has an entropy of:-{ (0.25)(-2) + (0.25)(-2) + (0.25)(-2) + (0.25)(-2) } = 2 bits
A DNA source with 90 % A or T and 10% C or G has an entropy of:
- { 2 (0.45)(-1.15) + 2 (0.05)(-4.32) } = 1.47 bits
n
iii pppH
12log)(
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 6
Amino Acid SimilarityDayhoff represented the similarity (observed exchange frequences between related
sequences) between amino acids as a log2 odds ratio, or lod score.
Lod score of an amino acid: take the log2 of the ratio of a pairing’s observed
frequency divided by the pairing’s randomly expected frequency.
Lod score = 0 → observed and expected frequencies are equal
> 0 → a pair of letters is common
< 0 → unlikely pairing
General formula for the score sij of two amino acids i and j.
ji
ijij pp
qs log With: individual properties pi and pj,
pairing frequency qjj,
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Ähnlichkeit der Aminosäuren
Beispiel: die relative Häufigkeit von Methionin und Leucin seien 0.01 und 0.1.
Durch zufällige Paarung erwartet man 1/1000 Austauschpaare Met – Leu.
Wenn die beobachtete Paarungshäufigkeit 1/500 ist, ist das Verhältnis der
Häufigkeiten 2/1.
Im Logarithmus zur Basis 2 ergibt sich ein lod score von +1 or 1 bit.
If the frequency of Arginine is 0.1 and its frequency of pairing with Leu is 1/500,
the lod score of an Arg – Leu pair is -2.322 bits.
Usually one uses nats, multiplies the values by a scaling factor and rounds them
to integer values → scoring matrices PAM and BLOSUM.
These integer values are called raw scores.
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Towards Karlin-Altschul statistical theoryRaw scores can be misleading because scaling factors are arbitrary.
More useful measure: normalized scores.
Converting a raw score to a normalized score requires a matrix-specific constant,
called lambda.
Lambda is approximately the inverse of the original scaling factor.
The observed frequencies for all pairs sum up to 1:
n
i
i
jijq
1 1
1
Write
as
where Sij are now the raw scores (integer values).
ji
ijij pp
qs 2log
ji
ijeij pp
qS log
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 9
ji
ijeij pp
qS log
Towards Karlin-Altschul statistical theory
Thus, a pairwise frequency (qij) is implied from individual amino acid frequencies
(pi und pj) and a normalized score (λSij).
Need to find λ so that:
ijSjiij eppq
n
i
i
j
Sji
n
i
i
jij
ijeppq1 11 1
1
Once λ is estimated, it is used to calculate the E-value of every BLAST hit.
The expected score of a scoring matrix is the sum of its raw scores weighted by their frequencies of occurrence.
20
1 1i
i
jijji sppE
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 10
Karlin-Altschul Statistik
Karlin und Altschul leiteten daraus nun die Bewertung der Signifikanz eines Alignments ab
(hier ohne Herleitung):
Fünf zentrale Annahmen:- eine positive Bewertung muß möglich sein- die erwartete Bewertung muß negativ sein- die Buchstaben einer Sequenz sind voneinander unabhängig und gleichverteilt - die Sequenzen sind unendlich lang sequences- Alignments enthalten keine gaps
SkmneE Die Anzahl an Alignments (E), die man während einer Suche in einer
Sequenzdatenbank zufällig erhält, ist eine Funktion der Größe des Suchraums
(m*n), der normalisierten Austauschbewertungen (λS), und einer Konstanten
(k).
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 11
Bewertungs- oder Austausch-Matrizen
– dienen um die Qualität eines Alignments zu bewerten
–Für Protein/Protein Vergleiche:
eine 20 x 20 Matrix für die Wahrscheinlichkeit mit der eine bestimmte
Aminosäure gegen eine andere durch zufällige Mutationen ausgetauscht
werden kann. –Der Austausch von Aminosäuren ähnlichen Charakters (Ile, Leu) ist
wahrscheinlicher (hat einen höheren Score) als der von Aminosäuren
unterschiedlichen Charkters (e.g. Ile, Asp).
–Matrizen werden als symmetrisch angenommen, besitzen also Form
einer Dreiecksmatrix.
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Substitutions-Matrizen
Nicht alle Aminosäuren sind gleich– Einige werden leichter ausgetauscht als andere– Bestimmte Mutationen geschehen leichter als andere– Einige Austausche bleiben länger erhalten als andere
Mutationen bevorzugen bestimmte Austausche– Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Codons– Diese werden eher durch Mutation der DNA mutiert
Selektion bevorzugt bestimmte Austausche– Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Eigenschaften und Struktur
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PAM250 Matrix
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 14
Beispiel für eine Bewertung
log (A B) = log A + log B
Die Bewertung (Score) eines Alignments ist die Summe aller
Bewertungen für die Paare an Aminosäuren (Nukleinsäuren) des
Alignments:
Sequenz 1: TCCPSIVARSNSequenz 2: SCCPSISARNT
1 12 12 6 2 5 -1 2 6 1 0 => Alignment Score = 46
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Dayhoff Matrix (1)
– wurde von M.O. Dayhoff aufgestellt, die statistische Daten über die
Austauschhäufigkeit von Aminosäuren sammelte
– Datensatz von eng verwandten Proteinsequenzen (> 85% Identität).
Diese können zweifelsfrei aligniert werden.
– Aus der Frequenz, mit der Austausche auftreten, wurde die 20 x 20 Matrix
für die Wahrscheinlichkeiten aufgestellt, mit der Mutationen eintreten.
– Diese Matrize heisst PAM 1. Ein evolutionärer Abstand von 1 PAM (point
accepted mutation) bedeutet, dass es 1 Punktmutation pro 100 Residuen
gibt, bzw. Dass die beiden Sequenzen zu 99% identisch sind.
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 16
Log odds Matrix: enthält den Logarithmus der Elemente der PAM Matrizen.
Score der Mutation i j
beobachtete Mutationsrate i j = log( )
aufgrund der Aminosäurefrequenz erwartete Mutationsrate
Die Wkt zweier unabhängiger Mutationsereignisse ist das Produkt der
Einzelwahrscheinlichkeiten.
Bei Verwendung einer log odds Matrix (d.h. bei Verwendung der
logarithmisierten Werte) erhält man den gesamten Score des Alignments
als Summe der Scores für jedes Residuenpaar.
Dayhoff Matrix (2)
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 17
Aus PAM 1 kann man Matrizen für grössere evolutionäre Entfernungen
herstellen indem man die Matrix mehrfach mit sich selbst multipliziert.
PAM250: – 2,5 Mutationen pro Residue– entspricht 20% Treffern zwischen zwei Sequenzen,
d.h. man beobachtet Änderungen in 80% der
Aminosäurepositionen.– Dies ist die Default-Matrize in vielen Sequenzanalysepaketen.
Dayhoff Matrix (3)
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 18
BLOSUM Matrix
Einschränkung der Dayhoff-Matrix:
Die Matrizen, die auf dem Dayhoff-Modell der evolutionären Raten basieren, sind
von eingeschränktem Wert, da ihre Substitionsraten von Sequenzalignments
abgeleitet wurden, die zu über 85% identisch sind.
Ein anderer Weg wurde von S. Henikoff und J.G. Henikoff eingeschlagen,
welche lokale multiple Alignments von entfernter verwandten Sequenzen
verwendeten.
Ihre Vorteile: - grössere Datenmengen- multiple Alignments sind robuster
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BLOSUM Matrix (2)
Die BLOSUM Matrizen (BLOcks SUbstitution Matrix) basieren auf der BLOCKS
Datenbank.
Die BLOCKS Datenbank verwendet das Konzept von Blöcken (lückenlose
Aminosäure-Signaturen), die charakteristisch für eine Proteinfamilie sind.
Aus den beobacheten Mutationen innerhalb dieser Blöcke wurden
Austauschwahrscheinlichkeiten für alle Aminosäurepaare berechnet und für eine
log odds BLOSUM matrix benutzt.
Man erhält unterschiedliche Matrizen indem man die untere Schranke des
verlangten Grads an Identität variiert.
z.B. wurde die BLOSUM80 Matrix aus Blöcken mit > 80% Identität abgeleitet.
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 20
Welche Matrix soll man benutzen?
Enge Verwandtschaft (Niedrige PAM, hohe Blosum)
Entfernte Verwandtschaft (Hohe PAM, niedrige Blosum)
Vernünftige Default-Werte: PAM250, BLOSUM62
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 21
Gewichtung von Lücken (Gaps)
Neben der Substitutionsmatrix braucht man auch eine Methode zur Bewertung
von Lücken.
Welche Bedeutung haben Insertionen und Deletionen im Verhältnis zu
Substitutionen?
Unterscheide Einführung von Lücken:
aaagaaa
aaa-aaa
von der Erweiterung von Lücken:
aaaggggaaa
aaa----aaa
Verschiedene Programme (CLUSTAL-W, BLAST, FASTA) empfehlen
unterschiedliche Default-Werte, die man wohl erst einmal verwenden sollte.
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 22
Needleman-Wunsch Algorithmus
- allgemeiner Algorithmus für Sequenzvergleiche
- maximiert einen Ähnlichkeitsscore
- bester Match = grösste Anzahl an Residuen einer Sequenz, die zu denen
einer anderen Sequenz passen, wobei Deletionen erlaubt sind.
- Der Algorithmus findet durch dynamische Programmierung das bestmögliche
GLOBALE Alignment zweier beliebiger Sequenzen
- NW beinhaltet eine iterative Matrizendarstellung
alle möglichen Residuenpaare (Basen oder Aminosäuren) – je eine
von jeder Sequenz – werden in einem zwei-dimensionalen Gitter dargestellt.
alle möglichen Alignments werden durch Pfade durch dieses Gitter
dargestellt.
- Der Algorithmus hat 3 Schritte: 1 Initialisierung 2 Auffüllen 3 Trace-back
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 23
Needleman-Wunsch Algorithm: Initialisierung
Aufgabe: aligniere die Wörter “COELACANTH” und “PELICAN” der Länge m =10 und n =7.
Konstruiere (m+1) (n+1) Matrix.
Ordne den Elementen der ersten Zeile und Reihe die Werte – m gap und – n gap zu.
Die Pointer dieser Felder zeigen zurück zum Ursprung.
C O E L A C A N T H
0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
P -1
E -2
L -3
I -4
C -5
A -6
N -7
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 24
Needleman-Wunsch Algorithm: Auffüllen
Fülle alle Matrizenfelder mit Werten und Zeigern gemäss von simplen Operationen, die
die Werte der diagonalen, vertikal, und horizontalen Nachbarzellen einschliessen.
Berechne
match score: Wert der Diagonalzelle links oben + Wert des Alignments (+1 oder -1)
horizontal gap score: Wert der linken Zelle + gap score (-1)
vertical gap score: Wert der oberen Zelle + gap score (-1)
ordne der Zelle das Maximum dieser 3 Werte zu. Der Pointer zeigt in Richtung des
maximalen Scores.
max(-1, -2, -2) = -1
max(-2, -2, -3) = -2
(Pointer soll bei gleichen Werte immer in eine bestimmte Richtung zeigen, z.B.
entlang der Diagonalen.
C O E L A C A N T H
0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
P -1 -1 -2
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 25
Needleman-Wunsch Algorithmus: Trace-back
Trace-back ergibt das Alignment aus der Matrix.
Starte in Ecke rechts unten und folge den Pfeilen bis in die Ecke links oben.
COELACANTH
-PELICAN--
C O E L A C A N T H
0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
P -1 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
E -2 -2 -2 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8
L -3 -3 -3 -2 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6
I -4 -4 -4 -3 -1 -1 -2 -3 -4 -5 -6
C -5 -3 -4 -4 -2 -2 0 -1 -2 -3 -4
A -6 -4 -4 -5 -3 -1 -1 1 0 -1 -2
N -7 -5 -5 -5 -4 -2 -2 0 2 1 0
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 26
Smith-Waterman-AlgorithmusSmith-Waterman ist ein lokaler Alignment-Algorithmus. SW ist eine sehr
einfache Modifikation von Needleman-Wunsch. Lediglich 3 Änderungen:
die Matrixränder werden auf 0 statt auf ansteigende Gap-Penalties gesetzt.
der maximale Wert sinkt nie unter 0. Pointer werden nur für Werte grösser als
0 eingezeichnet.
Trace-back beginnt am grösseten Wert der Matrix und endet bei dem Wert 0.
ELACAN
ELICANC O E L A C A N T H
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
L 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0
I 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0
C 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 1 0 3 2 1 0
N 0 0 0 0 0 0 0 1 4 3 2
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 27
FASTA Algorithmus – Schritt 1FASTA ist eine heuristische Methode zum Vergleich zweier Zeichenfolgen.
Der Algorithmus wurde 1985 von Lipman und Pearson entwickelt und 1988 verbessert.
FASTA vergleicht einen Eingabestring gegen eine einzelne Buchstabenfolge.
Wenn man eine ganze Datenbank nach Treffern zu einer Eingabesequenz absucht,
vergleicht FASTA die Eingabesequenz mit jedem Eintrag der Datenbank.
Der Algorithmus nimmt an, daß ein Alignment zweier Sequenzen einen Abschnitt mit absoluter
Übereinstimmung enthält und konzentriert sich auf identische Regionen.
Dies sind die einzelnen Schritte des FASTA-Algorithmus
1.
Wir geben einen ganzzahligen Parameter ktup vor (für k respective tuples), and suchen nach
identischen Substrings der Länge ktup in beiden Sequenzen.
Die empfohlenen Werte für ktup sind 6 für DNA- und 2 für Proteinsequenzvergleiche.
Die passenden Substrings der Länge ktup bezeichnet man als hot spots. Aufeinander folgende
hot spots werden entlang der Diagonale der dynamischen Programmierung gefunden
Dieser Schritt läßt sich effizient mit einer lookup- oder hash-Tabelle durchführen:
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 28
Lookup-Methode
Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Sequenz 1 n c s p t a ...
Sequenz 2 a c s p r k
Position in
Aminosäure Protein A Protein B pos A – pos B
a 6 6 0
c 2 7 -5
k - 11
n 1 -
p 4 9 -5
r - 10
s 3 8 -5
t 5
Aminosäuren c, s, und p haben den gleichen Offset. So erhält man schnell das mögliche
Alignment.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 29
FASTA Algorithmus – Schritt 2
Finde nun die 10 besten Diagonalläufe der Hot spots in der Matrix.
Eine Diagonale ist eine Reihe von benachbarten hot spots auf der gleichen
Diagonale (müssen nicht unbedingt auf der Diagonale benachbart sein, d.h.
Zwischenräume zwischen den hot spots sind erlaubt).
In einem Duchlauf müssen nicht alle hot spots auf der Diagonale liegen und
die Diagonale kann mehr als einer der 10 besten Durchläufe enthalten.
Um die Diagonalen-Durchläufe zu bewerten gibt FASTA jedem hot spot eine
positive Bewertung und den Zwischenräumen zwischen
aufeinanderfolgenden hot spots eines Runs eine negative Bewertung, die
mit zunehmender Entfernung abnimmt. Dann wird die Summe gebildet.
Mit diesem Bewertungsschema findet FASTA die 10 Diagonalläufe mit der
höchsten Bewertung.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 30
FASTA Algorithmus – Schritt 3
Ein Diagonalenlauf bezeichnet ein Paar von alignierten Substrings.
Das Alignment setzt sich aus Treffern (hot spots) und Nichttreffern (dazwischen)
zusammen. Es enthält jedoch keine Indels, da es aus einer einzigen Diagonale
besteht.
Als nächstes bewerten wir die Läufe mit einer Aminosäure- (Nukleotid-)
Austauschmatrix und wählen den besten Lauf.
Das beste einzelne Teilalignment in diesem Schritt heisst init1.
Weiterhin wird eine Filterung durchgefühhrt und alle Diagonalläufe mit relativen
geringen Bewertungen gelöscht.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 31
FASTA Algorithmus – Schritt 4
Bis jetzt wurden keine Indels in den Teilalignments erlaubt. Wir versuchen nun,„gute“ Diagonalläufe aus eng benachbarten Diagonalen zu kombinieren, und erreichendadurch ein Teilalignment mit Indels.Die „gute“ Teilalignments stammen aus dem vorherigen Schritt (Bewertung > alsein cut-off Wert) und versuchen, sie zu einem einzigen großen Alignment mithoher Bewertung zu kombinieren, das einige Gaps enthält.
Dazu konstruieren wir einen gerichteten, gewichteten Graph, dessen Vertices dieTeilalignments aus dem vorherigen Schritt sind. Das Gewicht jedes Vertix entsprichtder Bewertung des entsprechenden Teilalignments.Dann verbinden wir Vertex u mit Vertex v falls das Teilalignment von v in einer tieferen Reihe beginnt als es endet. Wir geben dieser Verbindung ein negativesGewicht, das der Anzahl an zwischen u und v einzufügenden Gaps entspricht.FASTA bestimmt dann in diesem Graphen einen Pfad mit maximalem Gewicht.
Dieses ausgewählte Alignment entspricht einem einzelnen lokalen Alignment der beiden Strings. Das beste Alignment in diesem Schritt wird mit initn bezeichnet.Wie im vorherigen Schritt werden Alignments mit relativ geringer Bewertung gelöscht.
Dann kommen noch 2 weitere Schritte ...
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 32
FASTA Algorithmus – graphisch
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 33
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
• Findet das am besten bewertete lokale optimale Alignment einer
Testsequenz mit allen Sequenzen einer Datenbank.
• Sehr schneller Algorithmus, 50 mal schneller als dynamische
Programmierung.
• Kann verwendet werden um sehr grosse Datenbanken zu durchsuchen, da
BLAST eine vor-indizierte Datenbank benutzt
• Ist ausreichend sensititv und selektiv für die meisten Zwecke
• Ist robust – man kann üblicherweise die Default-Parameter verwenden
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 34
BLAST Algorithmus, Schritt 1
• Für ein gegebenes Wort der Länge w (gewöhnlich 3 für Proteine) und
eine gegebene Score-Matrix
Erzeuge eine Liste aller Worte (w-mers), die einen Score > T erhalten,
wenn man sie mit dem w-mer der Eingabe vergleicht
P D G 13
P Q A 12
P Q N 12etc.
unterhalb Schranke (T=13)
Test Sequenz L N K C K T P Q G Q R L V N Q
P Q G 18
P E G 15 P R G 14
P K G 14 P N G 13
benachbarte Wörter
Wort
P M G 13
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 35
BLAST Algorithmus, Schritt 2
jedes benachbarte Wort ergibt alle Positionen in der Datenbank, in
denen es gefunden wird (hit list).
P D G 13
P Q G 18P E G 15 P R G 14P K G 14 P N G 13
P M G 13 PMG Database
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Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 36
Traditional BLAST programs
Sequence 1
Sequ
ence
2
AlignmentsGapped alignments
Search Space
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Seeding
Sequence 1
Sequ
ence
2
Word hits
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 38
Neighboorhood for 3-letter words
BLOSUM62 PAM200Word Score Word ScoreRGD 17 RGD 18KGD 14 RGE 17QGD 13 RGN 16RGE 13 KGD 15EGD 12 RGQ 15HGD 12 KGE 14NGD 12 HGD 13RGN 12 KGN 13AGD 11 RAD 13MGD 11 RGA 13RAD 11 RGG 13RGQ 11 RGH 13RGS 11 RGK 13RND 11 RGS 13RSD 11 RGT 13SGD 11 RSD 13TGD 11 WGD 13
Choice of cut-off Twill affect seeding
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 39
Seeding
Sequence 1
Sequ
ence
2
Word clustersIsolated words
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 40
BLAST Algorithm: Extension
• Program tries to extend seeds in both directions by adding residue
pairs until the added score is smaller than a cut-off.
• After terminating the extension, the alignment is trimmed back to that
with the maximal score.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 41
PSI-BLAST
“Position-Specific Iterated BLAST”
– Entfernte Verwandtschaften lassen sich besser durch Motiv- oder Profil-
Suchen entdecken als durch paarweise Vergleiche
– PSI-BLAST führt zunächst eine BLAST-Suche mit Gaps durch.
– Das PSI-BLAST Programm verwendet die Information jedes signifikanten
Alignments um eine positionsspezifische Substitionsmatrix zu konstruieren,
die an Stelle der Eingabesequenz in der nächsten Runde der Datenbank-
Suche verwendet wird.
– PSI-BLAST kann iterativ verwendet werden bis keine neuen signifikanten
Alignments mehr gefunden werden.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 42
BLAST Input
Notwendige Schritte um BLAST einzusetzen (im Zeitalter des Internets!):
Wähle einen Webserver (EBI = European Bioinformatics Institute, NCBI =
National Center for Biotechnology Information …)
• gib Testsequenz ein (cut-and-paste)• wähle die Nukleotid bzw. Aminosäure-Sequenzdatenbank, die durchsucht
werden soll• wähle Parameter um Output zu steuern (Zahl der Sequenzen …)• wähle Parameter für das Alignment (z.B. Austauschmatrix, Filter,….)
Testsequenz =MAFIWLLSCYALLGTTFGCGVNAIHPVLTGLSKIVNGEEAVPGTWPWQVTLQDRSGFHFCGGSLISEDWVVTAAHCGVRTSEILIAGEFDQGSDEDNIQVLRIAKVFKQPKYSILTVNND ITLLKLASPARYSQTISAVCLPSVDDDAGSLCATTGWGRTKYNANKSPDKLERAALPLLT NAECKRSWGRRLTDVMICGAASGVSSCMGDSGGPLVCQKDGAYTLVAIVSWASDTCSASS GGVYAKVTKIIPWVQKILSSN
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 43
BLAST Output (1)
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 44
Kleine Wahrscheinlichkeit deutet an, dass der Treffer wohl nicht zufällig zustande kam.
BLAST Output (2)
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 45
Niedrige Scores mit hohen Wahrscheinlickeiten deuten an, dass dies wohl keine guten Treffer sind.
BLAST Output (3)
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 46
Bedeutung des Alignments in BLAST
P-Wert (Wahrscheinlichkeit) – Gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der der Score eines Alignments
zufällig zustande kommen kann.
Je näher P bei Null liegt, desto grösser die Sicherheit, dass ein
gefundener Treffer ein richtiger Treffer (homologe Sequenz) ist.
E-Wert (Erwartungswert)– E = P * Anzahl der Sequenzen in Datenbank– E entspricht der Anzahl an Alignments eines bestimmten Scores, die
man zufällig in einer Sequenz-Datenbank dieser Grösse erwartet
(wird z.B. für ein Sequenzalignment E=10 angegeben, erwartet man 10
zufällige Treffer mit dem gleichen Score). Dieses Alignment ist also
nicht signifikant.– Treffer werden in BLAST nur ausgegeben, wenn der E-Wert unterhalb
einer Schranke liegt.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 47
Grobe Anhaltspunkte
P-Wert (Wahrscheinlichkeit) – A. M. Lesk
P 10-100 genaue Übereinstimmung
P zwischen 10-100 und 10-50 nahezu identische Sequenzen, zum
Beispiel Allele oder SNPs
P zwischen 10-50 und 10-10 eng verwandte Sequenzen,
Homologie gesichert
P zwischen 10-10 und 10-1 in der Regel entfernte Verwandte
P > 10-1 Ähnlichkeit vermutlich nicht signifikant
E-Wert (Erwartungswert)
E 0,02 Sequenzen vermutlich homolog
E zwischen 0,02 und 1 Homologie ist nicht auszuschliessen
E 1 man muss damit rechnen, dass diese gute
Übereinstimmung Zufall ist.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 48
Traditional BLAST programs
Program Database Query Typical uses
BLASTN Nucleotide Nucleotide Mapping oligonucleotides, cDNAs and PCR products
to a genome, screening repetitive elements; cross-species
sequence exploration; annotating genomic DNA; clustering
sequencing reads
BLASTP Protein Protein Identifying common regions between proteins; collecting
related proteins for phylogenetic analyses
BLASTX Protein Nucleotide Finding protein-coding genes in genomic DNA; determining
translated into if a cDNA corresponds to a known protein
protein
TBLASTN Nucleotide Protein Identifying transcripts, potentially from multiple organisms,
translated similar to a given protein; mapping a protein to genomic DNA
into protein
TBLAST Nucleotide Nucleotide Cross-species gene prediction at the genome or transcript
translated into translated into level; searching for genes missed by traditional methods
protein protein or not yet in protein databases
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 49
BLAST Output (4)
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 50
BLAST Output (5)
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 51
BLAST Output (6)
Although good contentof identical and positivepositions, both hits havehigh E-values due totheir short length.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 52
Tips für den Einsatz von BLAST
Verwende nicht stur die Standardparameter “You get what you look for”.
Führe Kontrollen durch, besonders in der twilight zone.
z.B. Schüttle die Sequenz durcheinander und wiederhole die Suche.
Falls die variierte Sequenz ähnliche Ergebnisse liefert, beruht das
Alignment auf einer systematischen Verfälschung, oder die Parameter sind
nicht empfindlich genug gewählt
Setze Komplexitätsfilter ein wenn erforderlich.
Maskiere Repeats in genomischer DNA.
Teile große Genomsequenzen in Stücke auf um die Suche zu beschleunigen.
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 53
Tips für den Einsatz von BLAST
Sei skeptisch gegenüber hypothetischen Proteinen.
Erwarte Verunreinigungen in EST Datenbanken.
In der Theorie sind ESTs Sequenzierungs-reads von cDNA, cDNA wird von
mRNA erhalten und die mRNAs stammen direkt von den Genen.
Allerdings entsprechen ESTs oft keinen Genen, sondern gehöhren zu Exons bzw.
UTRs, dem Überlappteil eines Repeats ...
2. Vorlesung WS 2004/05
Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 54
Zusammenfassung
Paarweises Sequenzalignment ist heute Routine, aber nicht trivial.
Mit dynamischer Programmierung (z.B. Smith-Waterman) findet man
garantiert das Alignment mit optimaler Bewertung.
Vorsicht: die Bewertungsfunktion ist nur ein Modell der biologischen Evolution.
FASTA ist erheblich schneller als dynamische Programmierung.
Am schnellsten ist BLAST und seine Derivate.
Beide geben sehr robuste und brauchbare Ergebnisse für Proteinsequenzen.
FASTA ist für Nukleotidsequenzen zuverlässiger.
Multiple Sequenzalignments sind in der Lage, entferntere Ähnlichkeiten
aufzuspüren und bieten ein besseres funktionelles Verständnis von Sequenzen
und ihren Beziehungen
Kommt nächste Woche dran.