Organdifferenzierung und Glykosidbildung bei in vitro kultivierten Blattexplantaten von Digitalis purpurea L; EinfluB verschiedener Wuchsstoffe, Nahrlosungen und Lichtverhaltnisse

Organ Differentiation and Glycoside-Formation in Tissues of Digitalis purpurea 1. Cultured in vitro; The Effect of Various Growth Substances, Basal Media and Light Conditions

WALTRAUD RUCKER, KURT ]ENTZSCH und MAX WrcHTL

In-stitut Hir Pharmakognosie der Universitat Wien, Austria und Institut fur Pharmazeut ische Biologie der Philipps-Universitat Marburg / L., G.F.R.

Eingegangen am 20. Dezember 1980 . Angenommen am 28. Januar 1981

Summary

In explants of Digitalis purpurea leaves the action of growth regulators on callus growth, organ formation and cardenolide synthesis is investigated. The compounds used are : indole acetic acid (IAA); naphthyl acetic acid (NAA); 2,4 dichlorphenoxy acetic acid (2,4 D) ; kinetin; gibberellinic acid A3 (GA3); applied in concentrations ranging from 10-7 gl ml to 5.10-5 g/ m!. Cultivation was carried out in basal media according to Heller and to Murashige and Skoog (M & S',1/2) under -different condi;tions oJ illumination.

Auxin (IAA or NAA 10-6 g/ ml) induces root differentiation in leaf explant; this effect is more enhanced by cultivation in Heller's medium under high light intensity than in M & S 1/2 medium under less intense illumination or in the dark. The root for­mation induced by IAA is altered under the addition of kinetin or GA3; root growth is ,inhibited and root formation is steadily replaced by other forms of differentiation. In the explants cultured in M & S 1/2 medium the inhibitory effect of the two growth substances is strongly pronounced. Besides root inhibition two further effects are observed with kinetin, being absent in Heller's medium but remarkable in M & S 1/2 medium (a) differentiation of buds due to higher concentrations of kinetin ; (b) with increasing concentrations of the cytokinin a shift of the activity zones from the upper portions of the leaf fragments, lying outside the medium, towards the lower portions, touched by the medium. This activity-shift can be recognized by regression of root formation in the upper regions and furtherance in the lower regions. The bud formation occurs preferably in the fragments near the border contacting the medium. GA3 applied singly or together with IAA leads to striking callus formation. 2,4 D leads to root anomalies and the callus assumes a friable consistency.

In the newly formed tissue the existence of cardenolides is demonstrable, however Ito a lesser extent than in leaf tissue of Digitalis purpurea. The amounts of cardiac gylco­sides produced in the root and callus tissue under the influence of IAA are not essentially altered by the simultaneous presence of kinetin or 2,4 D to IAA. GA3 exerts an inhibitory effect on the synthesis of glycosides_ From these experiments can be concluded that light

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influences the action which auxin exerts on glycoside formation in newly emerged roots of leaf explants. The tissue responds to a decrease of light intensity with a decrease of glycoside synthesis.

Key words: Organ differentiation, tissue culture, glycoside formation, Digitalis PUT­

purea.

Einleitung

An in vitro kultivierten Blattexplantaten entstehen unter geeigneten Na:hr- und Wuchsstoffbedingungen auWillige Wurzeldifferenzierungen, in welchen auch Car­denolide nachgewiesen werden konnten (Krtina, 1973). In einer folgenden Arbeit haben wir tiber den EinfluB von Indolessigsaure auf diese Wurzel- bzw. Glykosid­bildung bei Digitalisgeweben berichtet (Rucker et aL, 1976).

Die vorliegenden Untersuchungen waren der Frage gewidmet, ob auGer Indol­essigsaure auch Naphthylessigsaure oder Wuchsstoffkombinationen von Indolessig­saure mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsaure, Gibberellinsaure oder Kinetin ahnliche Differenzierungsleistungen an den BlavtexplantaJten auszulosen vermogen und ob sich durch Variation der NahrsalszlOsung oder der Lichtverhaltnisse zusatzliche Veranderungen feststellen lassen.

Material und Methode

Wir verwendeten 1/2- bis 11/2jahrige Digitalis purpurea-Pflanzen, die mit Hilfe der Gewebekultur vegetativ vermehrt und anschlieBend im Gewachshaus gehalten worden waren. Die bei der Kultivierung der Blattexplantate angewendete Vorgangsweise hat sich mehrfach bewahrt (Rucker et al., 1976). Da aufgrund fruherer Erfahrungen Wurzel- und Kalluswachstum weitgehend yom Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes abhangt, wahlten wir beim Ansetzen der Kulturen Blatter moglichst gleiche.r mittlerer GroBe. Als Medien dienten die Nahrsalzrezepte nach Heller (1953) und Murashige & Skoog (1962), letzteres jedoch auf die Halfte der angegebenen Konzentration verdunnt (M & S 1/2), Die Mikronahrstoffe wurden in beiden Fallen der Vorschrift nach Murashige & Skoog (1962) entsprechend zugefugt und den Medien einheitlich 3 % Saccharose beigegeben. Auf Zu­satze weiterer organischer Substanzen des M & S Mediums wurde verzichtet. Die einzeln oder in Kombination mit 10-6 g/ ml Indolessigsaure (IAA) verabreichten Wuchsstoffe hatten folgende KonzeJ1Jtrationen: Naphthylessigsaure (NAA) und 2,4-0ichlorphenoxyessig­saure (2,40) 10-6 g/ml, letztere auch 10-1 g/ml; Kinetin und Gibberellinsaure (GA ,) von 10-7 g/ml bis 5· 10-5 g/ ml. Mit einbezogen wurden auch die Phenylcarbonsauren: 3,4-Dihydroxyzimtsaure (Kaffeesaure, KS) und 3,4-Methylendioxyzimtsaure (MDZ), je­weils 10-4 Mol und 10-3 Mol, deren stimulierender EinfluB auf die IAA-Wirkung (Tomaszewski and Thimann, 1966) bekannt ist.

Die Kulturen wurden bei Temperaturen von 22°C bis 24 °C unter folgenden Licht­verhaltnissen gehalten:

- In der Mehrzahl der Versuche bei einem 12 Stunden Tag-Nacht-Rhythmus, - in einigen Fallen bei Dauerdunkel, oder - bei Tageslicht ohne direkte Sonneneinstrahlung.

Die Kultivierungsdauer betrug bei den meisten Versuchen 5 Monate. Wahrend die aus den verschiedenen Versuchsserien erhaltenen Kalli und Wurzeln (ca.

3 g bzw. ca. 10 g Trockengewebe) fur die Glykosidanalysen ausreichten, muBte bei den

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Organdifferenzierung und Glykosidbildung bei Digitalis purpurea L. 209

Knospendifferenzierungen die zur Untersuchung notwendige Materialmenge durch Ver­mehrung gewonnen werden. Die Knospen wurden dabei von den Blattfragmenten ent­fernt und auf an der Spitze eingedellte, i,n 250 ml Erlenmeyerkolben befindliche Falten­filter ubertragen, die in Niihrlosungen nach M & S 1/2 mit 3 DID Saccharose und je 10-8 g/ml IAA und Kinetin tauchten.

Zur Wachstumsbewertung dienten die Trockengewichte der gebiIdeten Wurzel- oder Kallusgewebe,

Die Histologischen Untersuchungen wurden an Paraffinschnitten nach AnEirben mit Methylenblau und Rutheniumrot durchgefuhrt.

Die Bestimmung der Cardenolide wurde mit lyophilisierten Kallus- bzw. Organgeweben in der gleichen Weise ausgefuhrt, wie sie in unseren fruheren Arbeiten jeweils fur chloro­phyllhaltige bzw. chlorophyllfreie Gewebe beschrieben wurde (Rucker et a!., 1976; Wicht! et a!., 1978).

Ergebnisse

1. Kallus- und Organdifferenzierung

Unter dem Einflug von 10-6 g/ml IAA oder NAA erfolgt an Blattexplantaten von Digitalis purpurea rege Wurzelinduktion. 1m weiteren Verlauf der Kultivie-

Fig. 1; Callus and root differentiations in Digitalis leaf explants; the influence of gibberellin as compared with auxin. Medium according to Heller, cultivation period 5 months. - a) 10-6 g/ml IAA. A strong root system has developed; leaf explant and callus tissue are hardly visible amidst the root meshwork. - b) 10-6 g/ml IAA and 10-6 g/ml GA3. - c) 10-6 g/ml IAA and 10-5 g/ml GA3. The callus formation increases under the influence of GA3, while roOt formation decreases. - d) 5· 10-5 gl ml GA3. Callus formation can be observed in the leaf explant; the latter is greatly enlarged in length. Apart from occasional short and thin sprouts no root formation occurs.

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rung entwickeln sich unter geeigneten Nahrstoff- und Lichtverhaltnissen auffallende Wurzelsysteme (Abb. 1 a). Diese Wurzelbildung unter Auxinwirkung wird von anderen Differenzierungenabgelost, sobald auger IAA weitere Wuchsstoffe ver­abreicht werden.

Kinetin aUein regt Digitalis purpurea Blattgewebe nicht zu nennens­werten KaUus- oder Organdifferenzierungen an. In Kombinationsversuchen mit IAA wird durch steigende Kinetinkonzentrationen die Wurzel- und Kallus­bildung allmahlich zuriickgedrangt, bis schliemich unter dem Einflug von 10-5 g/ ml und 5 . 10-5 g/ml Kinetin an Stelle von Wurzeln Knospen differenziert wer­den (Tabelle und Abb. 2 a). Sie treten an der Blattspreite knapp oberhalb der Beriihrungslinie mit dem Medium auf und sind zunachst winzig klein. Einige dieser Knospen vergrogern sich im Verlauf der Kultivierung, wahrend zugleich neue ge­bildet werden; durch Obertragen in frische Nahrlosungen konnen sie weiter ver­mehrt werden (Abb. 2 b). Steigende Kinetinkonzentrationen fiihren zu einer Ver­schiebung des Bildungsortes der Gewebeneuformationen von den oberen Blattfrag­mentanteilen zu den unteren (Abb. 3 a-d).

Fig. 2: Bud differentiation in Digitalis purpurea leaf explants. Conditions of cultivation: basal medium according to Murashige and Skoog (at half of the indicated concentration). - a) 10-6 g/ml IAA and 10-5 g/ml kinetin. The buds are preferentially formed in those 'areas of the leaf fragments which are just above the level of the medium. - b) These buds are transferred to folded filters located in Erlenmeyer flasks; under the influence of 10-8g/ml IAA and kinetin they multiply to form multiple bud-cultures. - c) 10-5g/ml GA3 Under the influence of GA3 the buds develope on the upper parts of the leaf explants; elongated, thin shoots with tiny end buds grow out of the hard callus.

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Organdifferenzierung und Glykosidbildung bei Digitalis purpurea L. 211

Fig. 3: The influence of kinetin on the root differentiation of Digitalis leaf explants. Basel medium according to Murashige and Skoog (at half of the indicated concentration), cultivation period 5 months. The root formation which is stimulated by IAA is increasingly inhibited by kinetin, in proportion to the concentration of the latter. Organ and callus formation are displaced from the higher portions of the leaf fragments above the medium to the lower portions, which are either in contact with the medium or else in immediate neighbourhood to it. - a) IAA 10-6 glml and kinetin 10-7 g/m!. - b) IAA 10-6 glml :and kinetin 10-6 g/m!. - c) IAA 10-6 glml and kinetin 10-5 g/m!. - d) IAA 10-6 glml and kinetin 5 . 10-5 g/m!. - Apparent root formation can be observed in (a) and (b); whereby in (a) the root formation is limited to the upper fragment portions and in (b) to the lower portions; in (c) the root formation has already decreased and only isolated, small roots have developed on the lower segment of the leaf fragments; the root develop­ment in (d) is totaHy inhibited. The tissue segments which were in contact with the medium are clearly distinguishable in outlook, colour and surface structure from those portions that were outside the medium.

GA3 vermag, im Gegensatz zu Kinetin auch allein verabreicht, an den Blatt­explantaten sowohl Kalluswachstum als auch Wurzel- und Knospendifferenzierun­gen zu induzieren. Hinsichtlich der Kallusbildung ubertrifft der GA3-Einflug jenen der IAA, reicht aber in bezug auf die Wurzelbildung nicht an die Stimulations­wirkung der IAA heran (Tabelle). Einen deutlichen Unterschied zu den beim Kinetin beschriebenen Knospen zeigen die von GA3 hervorgerufenen winzigen Knospendifferenzierungen: Sie sitzen an langen dunn en Trieben, die aus dem harten Kallus am oberen Fragmentanteil herauswachsen (Abb. 2 c). Gleichzeitige Gaben von GA3 und IAA interferieren an der Organ- bzw. Kallusbildung (Tabelle und Abb. 1 a-d): Durch GA3 wird die Wurzelbildung herabgesetzt und umgekehrt geht die durch GA3 hervorgerufene betrachtliche Kallusbildung bei gleichzeitiger IAA-Wirkung eindeutig zuruck. Die Knospenbildung wird durch IAA vollsdndig

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214 WALTRAUD RUCKER, KURT ]ENTZSCH und MAX WrCHTL

Fig. 4: Influence cf 2,4 D cn rOOt and callus differentiation in Digitalis purpurea. Con­ditions of cultivation: Medium according to Heller; IAA 10-6 g/ mI and 2,4 D 10-7 g/ ml; cultivation period 5 months. - a) CaJlus and root formation on the upper cross surfaces of the explants. Roots with lengths of 1-2 cm and with small head like thickenings. No side roots are formed ( X 4). - b) Cross section of such a head like thickening on a root end. Inside these thickenings are mostly meristematic and parenchymatous tissues. The transition from !the actual roots to the vesicular root ends can he clearly discerned through the formation of tumescence. ( X 25). - c) Cross section of the callus. Lignified cells with reticular thickenings are irregularly distributed in the parenchyma ( X 100).

Organdifferenzierung und Glykosidbildung bei Digitalis purpurea L. 215

unterdrtickt. Zu erwahnen ware weiters das starke Streckungswachstum bei den Blattexplantaten unter GA3-EinfluB, das in diesem AusmaB bei nur mit lAA behandelten Kulturen nicht zu beobachten ist.

Unter dem EinfluB von 2,4 D mit lAA ist die gesamte Gewebeneubildung - Kallus- und Wurzeldifferenzierungen sind hier schwer voneinander trennbar -geringer als bei den mit lAA allein geztichteten Geweben (Tabelle). Besonders fal­len jedoch die durch 2,4 D ausgelosten morphologischen Veranderungen auf: Die Wurzeln werden stark reduziert und enden mit einem kopfchenartigen Gebilde, bestehend aus parenchymatischen und meristematischen Geweben (Abb. 4 a und b). Die Kalli, die teils dissoziiert teils kompakt sind, setzen sich vorwiegend aus Parenchym mit diffus verteilten kambialen Anteilen und Leitelementen zusammen (Abb. 4 c).

Durch die eingesetzten Phenylcarbonsauren - KS bzw. MDZ - lassen sich bei Digitalis purpurea keinerlei Verstarkungen der lAA-Stimulation, weder auf die Wurzelbildung noch auf das Kalluswachstum, nachweisen.

Die an den Blattexplantaten ausgelosten Differenzierungen zeigen eine deutlicche Abhangigkeit der Wuchsstoffeffekte von der Zusammensetzung der Nahrsalzlo­sung. Vergleiche zwischen beiden angewandten Nahrlosungen zeigen folgende Un­terschiede: 1m Heller-Medium tritt die lAA-Wirkung auf die Wurzel- und Kallus­bildung starker auf als in der M & S 1/2-Nahrsalzlosung; dies ist sowohl an der Zahl der wurzelbildenden Explantate als auch aus der GroBe der Wurzeln er­sichtlich. 1m Gegensatz dazu werden die Kinetin-Effekte im M & S 1/2-Medium viel starker als im Heller-Medium begtinstigt; die Wurzelbildung wird deutlicher gehemmt, die Induktion von Knospen beschrankt sich iiberhaupt auf das M & S 1/2-Medium und auch die bei steigender Kinetinkonzentration zu beobachtende Ver­schiebung des Entstehungsortes der Neubildungen (Abb. 3 a-c) tritt viel deutlicher bei den Kulturen aus M & S 1/2_ als aus Heller-Medien zutage. Unter GA3-Ein­wirkung werden die Kallusgewebe gleichermaBen in beiden Nahrlosungen gebildet, bei Wurzeln und Knospen hingegen ergeben sich clem KinetineinfluB ahnliche Un­terschiede mit Ausnahme der Verschiebung des Entstehungsortes der Neubildungen. Unter 2,4 D-EinfluB stehen Wurzellange und Dissoziationsgrad der Kallusbildungen ebenfalls in Abhangigkeit der Nahrsalze, wobei die morphologischen 2,4 D-Effekte bei Verwendung von M & S 1/2 gegentiber dem Heller-Medium verstarkt sind.

Auch die Belichtung der Gewebekulturen stellt einen wesentlichen Faktor dar. Die untersuchten Lichtverhaltnisse, vom 12-Stunclen-Tag mit hoher Lichtintensitat tiber Tageslichtbedingungen bis zu Dauerdunkel bewirken eine eindeutige Abnahme sowohl der Wurzel - als auch cler Kallusbildung in den Kulturen.

2. Glykosidbildung

Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, treten bei den meisten Versuchen sowohI III

den neu gebildeten Wurzeln als auch in den Kallusgeweben Glykoside auf, die III

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den Abb. 5 und 6 einzeln angeflihrt sind. Unter dem Einflug von IAA werden synthetisiert: Purpureaglykosid B und Digitalinum verum in Mengen von 20 mg pro 100 g trockenen Gewebes, Digitoxin, Purpureaglykosid A, Gluco­verodoxin SOWle Glucoevatromonosid hingegen III genngeren Mengen. In Gegenwart von NAA ergeben sich bis auf geringe quantitative Unter­schiede und das Fehlen von Glucoevatromonosid und Glucoverodoxin sehr ahnliche Resultate. Durch Kombination von IAA mit anderen Wuchs­stoffen treten bei ziemlich gleichbleibendem Glykosidgehalt Veranderun­gen III den Glykosidspektren auf. Zusammen mit 2,4 D kommt es an

QJ Inhaltsstoffe SOmg ~ _/100g Trockenes Gewebe E

.~~ID- Sir PB 0 GEWEBE Dt. Gt. PA GGII GOY Gyd DVo 001.

fAA r-vuRZro <x, <10 ~ 20 (10 (10 20 1 ,0'6

KALLUS (10 (10 ~ 20 '0

5 ,t-A6

2A D KALLUS • ~ 20 ~ 20 ~ ]0 ~ 20

• 30 OllJQnbll<!

fAA KfN v.utZELN (10

'" 20 '0 (10 <10 '0

4 '0' 6 KALWS (10 ~ 10 .30

fAA GA3 I'NRZELN (10 '0 2 ,0'&

KALLUS <10

GA3 WURZro '0 J

KALLUS <10

fAA KS WURZElN '0 • 20 6 10,6

KALLUS • 20

7 ,f~!'8 2~D KALLUS ,0 '0 10 10' 6

Fig. 5: Graphic presentation showing the amount of cardiac glycosides in root and callus tissues cultivated in vitro under the influence of various growth stimulators. The figures indicate the glycoside content in mg pro 100 g dried tissue. Abbreviations: Dtx = digitoxin, Gtx = gitoxin, Str = strospesid, P A = purpurea glycoside A, PB = purpurea glycoside B, GGt! = glucogitaloxin, Gev = glucoevatromonoside, Gvd = glucoverodoxin, DVe = Digitalinum verum, GGts = Glucogitoside.

~ Wurzeln Inhaltsstoffe SDmg~ _1100g TrockonosGew.

o WUCHS i!MlsuCHS Dtx Gtx Sir PA PB 0011 Gov Gvd DVo I'" STOFF INGUNG

10 g/ml Lichl (10

'" 20 '" 20 ,0

- NAA 11 '0' 6

Togoslicht '0 e-12 Dunkolhoit

1 Lichl (10 (10 '" 20

(10 (10 I- 20 - IAA 8

10' 6 Tagoslicht (10 (10 (10 I- 20

e-9 PUnkolhoit ~ 10

Fig. 6: Graphic presentation of the cardiac glycoside content in roots formed in vitro in leaf explants under various light-conditions. The figures give the glycoside content in mg pro 100 g dried tissue. For abbreviations see Figure 5.

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Stelle VOn Glucoev,attromonosid und Glucoverodoxin zur Bildung VOn Gitoxin, unter zusatzlichem Kinetineinflug entsteht Glucogitaloxin, dafiir fallt die Synthese von Glucoevatromonosid aus. Zugabe von GA3 zu den IAA-haltigen Medien be­wirkt sowohl in der Wurzeln als auch in den Kallusgeweben einen starken Riick­gang der Glykosidbildung; in den Wurzeln sind noch geringe Mengen von Gluco­evatromonosid und Glucoverodoxin nachweisbar, in den Kalli ist nur mehr wenig Digitalinum verum zu finden. Bei GA3 allein sind ebenfalls nur sehr geringe Gly­kosidmengen zu verzeichnen. Bemerkenswerterweise kommt hier, im Gegensatz zu allen iibrigen Versuchen, Glucogitosid in den Wurzeln vor. Die Phenylcarbonsauren KS und MDZ (10-4 Mol und 10-3 Mol) bewirken, ahnlich dem GA3-Einflug, eine starke Abnahme der Glykosidsynthese gegeniiber den Versuchen mit IAA allein. Durch die Behandlung mit MDZ wird die Cardenolidbildung vollstandig unter­driickt.

Verminderung der Belichtung wird von den Zellen nicht nur mit Hemmung der Wurzel- und Kallusbildung sondern auch mit einem Riickgang der Glykosid­synthese beantwortet (Abb. 6).

Gesonderte Betrachtung verlangt die Glykosidbildung in den aus Knospengewe­ben entstandenen Kalli. Das Ausgangsmaterial - in vitro an den Blattexplantaten entstandene Knospen, die weitervermehrt wurden - besteht aus Blattgeweben in jugendlichem Stadium, deren Zellen noch nicht zur Glykosidsynthese befahigt sind. Trotzdem sind die daraus unter 2,4 D- und IAA-Einflug gewachsenen Kalli sehr wohl imstande, die Glykoside Strospesid, Purpureaglykosid A und Digitalinum verum in Mengen von 10 mg pro 100 g trockenen Gewebes zu synthetisieren.

Diskussion

1. Kallus- und Organdifferenzierung

Die fiir Wurzel- und Knospendifferenzierungen m vitro notwendigen Umwelt­bedingungen (Gautheret, 1969; Gresshoff, 1978; Halperin, 1969; Kamada and Harada, 1979; Skoog and Miller, 1957; Skoog, 1971; Scott, 1972) werden bei Digitalis purpurea bestatigt: Urn Wurzeldifferenzierungen an den Blattexplantaten zu erreichen, kann als Auxin sowohl IAA als auch NAA appliziert werden. Unter dem Einflug zunehmender Kinetinkonzentrationen kommt es zur Hemmung der durch IAA angeregten Wurzelbildung und anschliegend zur Differenzierung von Knospen. Fiir die Wurzelhemmung unter Kinetin wird eine Blockierung der IAA­Wirkung durch das Cytokinin angenommen (Eriksen, 1974). Die Abnahme der Wurzelbildung konnte ebenso auf einem beschleunigten Abbau der IAA unter Kinetineinwirkung beruhen (Gaspar and Xhaufflaire, 1967; Riicker und Markotai, 1980). Die an Topinambur erhaltenen Ergebnisse iiber die fiir eine Wurzelinduktion erforderliche Belichtung werden bei Digitalis bestatigt (Gautheret, 1969).

Trotz der Khnlichkeit der Reaktionen bei Topinambur-Rhizomgewebe und Digitalis-Blattgewebe in IAA-Gegenwart reagieren diese ganz unterschiedli,ch, wenn

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die Phenylcarbonsauren KS oder MDZ zusatzlich beigegeben werden; bei T opinam­bur verstarken sie die Auxinwirkung auf die Wurzel- bzw. Kallusbildung (Rucker, 1971) nicht aber bei Digitalis.

Die Gibberellinwirkung manifestiert sich in der Ausbildung eines grogen kom­pakten Kallusgewebes an den BlartexplantaJten. Histologisch ergeben sich ahnliche Bilder wie bei den unter IAA-Wirkung gewachsenen Geweben: Parenchym mit eingelagerten liberovascularen Aktivitatszentren. Eine bei anderen Geweben nach GA3-Behandlung beobachtbare Verminderung oder Vermehrung dieser Zentren ist bei Digitalis nicht zu verzeichnen (Minocha and Halperin, 1974; Saussay et Gautheret, 1974). GA3 vermag Wurzelbildung in geringem Ausmag zu induzieren, die durch IAA angeregte Wurzeldifferenzierung hingegen wird bei gleichzei·tiger GA3-Einwirkung deutlich gehemmt. Gibberelline werden fur Induktion und Ent­wicklung von Wurzeln nicht als Hauptfaktor angesehen, da ihr Einflug in vielen Fallen ohne Effekt bleibt (Coleman and Greyson, 1976; 1977; Sco~t, 1972). Xhnliche Reaktionen wie an Digitalis purpurea-Blattgeweben - Forderung oder Hemmung der Wurzelbildung in Abhangigkei!t davon, ob GA3 allein resp. gemein­sam mit IAA eingesetzt wird - konnten Gautheret und Mitarbeiter an Rhizom­gewebe von Topinambur beobachten. Sie fanden, dag Gibberellin bei «Licht­kulturen» eine Hemmung, bei «Dunkelkulturen» hingegen eine Stimulation des IAA-Effektes auf die Wurzelbildung verursacht (Gautheret, 1966; Tizio et aI., 1970).

Bei der unter Cytokinineinflug eintretenden Aktivitatsverlagerung von den obe­ren zu den unteren Fragmentanteilen durfte es sich kaum urn eine Polaritatsum­kehr der Blattfragmente handeln sondern eher urn eine Veranderung der Per­meabilitat und Speicherkapazitat jener Zellen, die mit Kinetin in direktem Kon­takt sind. Mothes und Mitarbeiter (1961) haben ihre Resultate aus Alterungsver­suchen, wobei die Widerstandsfahigkeit von BlaJttgeweben gegenuber Temperatur­einfliissen durch Kinetinbehandlung erhoht war, in diesem Sinne interpretiert.

2,4 D fuhrt zu Wurzelanomalien. Xhnliche Veranderungen treten auch bei Pisum sativum, Cymbidium, Antirrhinum majus auf (Eliasson and Palen, 1972; Nagl und Riicker, 1972; Sangwan and Harada, 1975). Dissoziationsverstarkung bei Kallus­geweben zahlt ebenfalls zu einem haufigen Charakteristikum der 2,4 D-Wirkung (Sangwan and Harada, 1975).

In Abhangigkeit von der verwendeten Nahrlosung treten sowohl Verstarkung als auch Verminderung der IAA- und Kinetin-Effekte auf. Befunde von unter­schiedlichen IAA- und Kinetinwirkungen, je nach Zuchtung in einem Heller- oder M & S-Medium werden bei Geweben von Lactuca sativa oder Pisum sativum be­schrieben (Doreschug and Miller, 1967; Leroux, 1973). Die Zusammensetzung der verwendeten Nahrlosungen unterscheidet sich im Stickstoffanteil, der im Heller­Medium als Nitrat geboten, wesentlich niedriger ist als in der modifizierten Form des M & S-Mediums, das Nitrat und Ammonsalze enthalt. Die Forderung der Wur­zel- oder Knospenbildung bei Kultivierung in Heller- bzw. in M & S-'/2-Medien

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laBt vermuten, daB in niedrigen Stickstoffkonzentrationen die Auxinwirkung, in hohen Stickstoffkonzentrationen die Cytokininwirkung stimuliert wird. Diese und ahnliche Befunde (Tripathi, 1974; Welander, 1978) weisen darauf hin, daB der Einflu~ der Mineralsalze auf die Differenzierung gegebenenfalls iiber den Hor­monhaushalt reguliert wird.

2. Glykosidbildung

Wie in friiheren Untersuchungen (Krtina, 1973; Riicker et ai., 1976) treten Gly­koside in Wurzel- ebenso wie in Kallusgeweben auf. In Abhangigkeit von der Wuchsstoffzusammenstellung und der Belichtungsintensitat andern sich der absolute Gehalt und die Zusammensetzung des gebildeten Glykosidgemisches. Die Unter­schiede zu Literaturangaben (Kartnig et ai., 1976, 1979; Wichtl et ai., 1978) diirften auf Verschiedenheiten der Versuchsbedingungen und auf Schwankungen in der Cardenolidbildung (Weiler, 1979) zuriickzufiihren sein. In Dbereinstimmung mit Literatur-Ergebnissen steht die geringe Ausbeute an Herzglykosiden (Kartnig et ai., 1976, 1979; Lui and Staba, 1979; Nickel and Staba, 1977; Pilgrim, 1972). J edoch sei hervorgehoben, da~ uns in den hier beschriebenen Versuchen erst­mals ein Cardenolidnachweis in Kallusgeweben gelungen ist, die aus cardenolid­freien Knospengeweben geziichtet wurden.

In vorangegangenen Untersuchungen (Wichtl et ai., 1978) hatten wir feststellen konnen, da~ die Bildung von Primarglykosiden bei fortschreitender Blattentwick­lung relativ spat einsetzt. Nunmehr ergibt sich, da~ die unter dem Einflu~ bestimm­ter Wirkstoffe oder durch zu geringe Belichtung induzierte Hemmung in erster Linie die Synthese der Primarglykoside betrifft.

Frau Ing. Brigitte Grauwald und Herrn Dip!.-Ing. Julius Markotai sei fiir die Sorgfalt bei der Durchfiihrung der Versuche gedankt. Die finanziellen Zuwendungen des Fonds zur Forderung der wissenschaftlichen Forschung, der tlsterreichischen N ationalbank und der Stadt Wien waren fiir die vorliegende Arbeit eine wertvolle Unterstiitzung.

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