This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

1252 W. v. BROCKE, E.REINHARD, G.NICHOLSON UND W.A.KÖNIG

phische Trennung von Tetra-O-TMS-Derivaten von Oktadecadiensäuremethylestern kombiniert mit nachfolgender Massenspektrometrie die Möglichkeit, auch natürliche komplexe Gemische von methylen-unterbrochenen und nicht-methylenunterbrochenen Oktadecadiensäuren zu untersuchen und die Lage der Doppelbindungen zu bestimmen *.

* Die kompletten Massenspektren der hier untersuchten Oktadecadiensäuremethylester können in tabellarischer Form angefordert werden.

Die Autoren danken den Herren Prof. R. T. HOL-MAN (Minnesota), Prof. F. D. GUNSTONE (St. Andrews) und Herrn Dr. R. K. BERTHUIS (Viaardingen) für die Überlassung synthetischer Oktadecadiensäuren bzw. deren Methylester. Wir sind Frl. ULRIKE KUPIETZ ZU großem Dank für die sorgfältige Mitarbeit und Hilfe bei der Auswertung der Massenspektren verpflichtet. Diese Arbeit wurde durdi Sachmittel des Bundesfor-schungsministeriums unterstützt.

Über das Vorkommen von 3-(l'.l'-Dimethylallyl)-scopoletin in Gewebekulturen von Ruta graveolens

The Occurrence of 3-(l / ,l /-dimethylallyl)-scopoletin in Tissue Cultures of Ruta graveolens

WOLFGANG VON BROCKE und ERNST REINHARD

Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Universität Tübingen

GRAEME NICHOLSON und WILFRIED A . KÖNIG

Lehrstuhl für Organische Chemie der Universität Tübingen

(Z. Naturforsch. 26 b, 1252—1255 [1971]; eingegangen am 19. August 1971)

In tissue cultures of Ruta graveolens the new coumarin 3-(l',l'-dimethylallyl)scopoletin (1) was found by combined gaschromatography-mass-spectrometry. The mass-spectra of 1, of its TMSi-deri-vative and of an isomer of 1 are discussed. 1 has not been observed so far in plants and tissue cultures of Rutaceae.

Über die Inhaltsstoffe, speziell Cumarine, die in Gewebekulturen von Ruta graveolens gebildet wer-den, liegen bisher noch keine umfassenden Analy-sen vor 3 . Wir unterzogen daher die Cumarine die-ser Gewebekulturen einer erneuten Untersuchung durch gaschromatographische Trennung 8 ' 9 in Ver-bindung mit einem Massenspektrometer.

Dabei konnte unter Berücksichtigung der Anga-ben über das Vorkommen von Cumarinen in der ganzen Pflanze sowie in Gewebekulturen von Ruta g. 3 ; 4 - 6 das Vorkommen von Psoralen, Bergapten, Xanthotoxin, Isopimpinellin, Rutamarin, Rutacultin, Chalepensin, 3-(l ' . l / -Dimethylallyl) -daphnetin-dimethyläther und 3-(l ' . l ' -Dimethylal-lyl)-herniarin nachgewiesen werden, wobei die drei letztgenannten Cumarine erstmalig in Gewebekultu-ren von Ruta g. gefunden wurden.

Sonderdruckanforderungen an Dr. WOLGANG VON BROCKE, Lehrstuhl f. Pharmazeut. Biologie d. Univ., D-7400 Tübin-gen, Wilhelmstr. 27.

Im Laufe dieser Untersuchung konnte in den Gewebekulturen 3-(l ' . l ' -Dimethylallyl) -scopoletin nachgewiesen werden 13. Dieses Cumarin wurde bis-her weder für die ganze Pflanze noch für Gewebe-kulturen von Ruta g. beschrieben.

Zur gaschromatographischen Trennung der Hv-droxicumarine im ätherischen Auszug von Gewebe-kulturen, die im Dauerdunkel gehalten wurden, wurde der eingeengte Extrakt mit A^,0-Bis-(tri-methylsilyl) -trifluoracetamid (BSTFA) silyliert. Dabei werden vorhandene Hydroxylgruppen mit einer Trimethylsilylgruppe veräthert. Diese Tri-methylsilyl-Derivate der Hydroxicumarine ergeben bei gaschromatographischen Trennungen scharfe Peaks 9 . Im Chromatogramm des derart behandelten Extraktes traten u. a. zwei neue Peaks neben den schon bekannten auf. Die Massenspektren dieser Ver-bindungen wiesen weitgehend Parallelen mit denen von 3-(l ' . l ' -Dimethylallyl) -daphnetindimethyläther resp. von Rutacultin auf. Die Mol.-Gew. wiesen je-

rsLJnt 100—1

50-

Jlu_JJj.ll

VORKOMMEN VON 3- ( l ' . l ' -DIMETHYLALLYL) -SCOPOLETIN

C H 3 0

( C H 3 ) 3 S . '

M-15 317

1253

332

M-43 289

M-55 277

M-73 259

Iii •..-Ijl... J , . - | .ky l , j l r J U . J . I j l . . ' , • • • ; - - , - v • • I^J-.• • J ^ l . -IjlH.. pillnl'i ..llljLi u i

M-27 305

^ V — f . L ,

50 100 150 200

n3 250

rrv, 300 m/e

Abb. 1. Massenspektrum des synthetischen 3-(l'.l'-Dimethylallyl)-scopoletin-TMS; Retentionszeit 32,7 Minuten. m1 = 303,5, m2 = 263,5, m 3 = 2 3 0 , 5 , m 4 = 2 0 1 , 5 .

ret.Jnt 100 — 1

5 0 -

73

Ji.. ,I.JJ,LI...I,I

M-15 332 317 )

M-43 289

M-73 259

M-55 277

1 J.i 11.1 jji. i.i i|j •i.l...JiL[.li-iil|lii.HL[i.liillji....i.ir. —i|i 1. • - i . .^ . ....i|kili., •[...iilL[ y u « . i i j ^

M-27 305

i L »p l»JI».llt..|l.l I|l..l.l.l| jll . . •••.I..llj |»l»il ...ln.iailü. I..IIII.M „MI.M... 1 1 T | 1 ^

m̂ rrij rrij m̂ 50 100 150 200 250 300 m/e

Abb. 2. Massenspektrum des später erscheinenden trimethylsilylierten „Isomerenpartners", identisch mit Abb. 1 ; Retentions-zeit 32,7 Minuten. m^SOS.S , m2=263,5, 7n3 = 230,5, m4 = 201,5.

rel. Jnt t o o — I

73

1 |i I Uli,. • a-lJtlil

M-15 317

M-55 277

ill,!,!, IjiUlh.lll | nl|i Jllil

M-73

J | . . J [ | | | . •.Ijijlh..iJ.JLip MJjfck ijUML- 1-jJf»—rtaik

M-43 239

M-27 ,305

332

MJ '"2 250 50 100 150 200 250 300 m/e

Abb. 3. Massenspektrum des früher im Chromatogramm erscheinenden trimethylsilylierten Isomerenpartners; Retentionszeit 29,4 Minuten. 7^ = 303,5, m 2 = 2 6 3 , 4 . m3 = 230,5, m 4 = 2 0 1 , 5 .

Hinweis: m1, m2 usw. Position des Ubergangssignals beim Zerfall metastabiler Ionen.

1254 W. v. BROCKE, E. REINHARD, G. NICHOLSON UND W. A. KÖNIG

re l .Jnt . 100-1

5 0 -

CH3O

M - 4 3 217

M-15 245

M® 260

M-55 205

69

77

j j

91 165 129

| 157

lillljl I.l|lll,. lllllll, lllllj. lll|llilmi|niillltl. i llljllll I Ullilill, 111,1)1

M-27 233

50 100 150 2 0 0 250 m/e

CH30>

m/e 233 (17V.)

- CO |

CH30V^X . h o - W A O ^

m/e 205 (59*/.)

CH 3 0

H O ^ ^ O ^ O

MG 260 (100V.)

- C2H5 -| * CH2

H O ^ ^ O ^ O m/e 231 (9V.)

- C<H7-» .161,5

c^OY^f^fC"2] ' H O ^ ^ O ^ O J m/e 205 (59V.)

- CH3-

- C O m/e 185 (17V.)

Abb. 4. Massenspektrum von synthetischem 3-(l'.l'-Dimethylallyl)-scopoletin unter Benutzung des Direkteinlaßsystems (1). m1 = 193, m 2 = 161,5.

wie sie in Ruta g.-Callusgewebe vorliegen, ist eine hohe Intensität des Molekularions, welches oft audi den Basepeak liefert. Ausgenommen hiervon sind

- CH 2 =CHK' . R.U-.L " Cumarin-Derivate, nach der Art des Imperatorins, die eine y-y-Dimethylallyl-o;ci-gruppe besitzen, die sehr leicht unter Wasserstoffumlagerung 2-Methyl-butadien eliminiert ( M c - L a f f e r t y - U m l a g e r u n g ) und dabei zunächst das Ion M®-68 ergibt, so daß die charakteristischen Fragmentierungsmerkmale der einfachen Cumarin-Derivate verloren gehen. Solche Verbindungen zeigen eine geringe Intensi-tät des Molekularions. Als weitere Ausnahme muß noch die Essigsäureeliminierung12 (M®-60) im Massenspektrum des Rutamarins genannt werden. Neben dem hohen M®-Peak fällt weiterhin eine oft mehrmalige, ausgesprochen signifikante CO-Abspal-tung7 auf (M®-28), die je nach Substituenten der Cumarine mit dem Verlust eines CHg-Radikals alter-niert8. Die Eliminierung von CO aus dem Ion m/e 245 im Spektrum des 3-(l'.l /-Dimethylallyl)-scopoletins läßt sich durch einen metastabilen Peak bei 193 sichern. Charakteristisch speziell für die Fragmentierung der S^l'.l'-Dimethylallyl)-cuma-rin-Derivate ist neben den schon erwähnten Merk-malen das Auftreten von M®-27- und M®-55-Bruch-stücken, die sich auf den Verlust einer C2H3- bzw. C4H7-Gruppe 7 zurückführen lassen. Der Verlust der C4H7-Gruppe wird im Spektrum des 3 - ( l ' . l ' -Di -methylallyl)-scopoletins durch den metastabilen Peak m/e 161,5 gesichert.

Die TMS-Derivate fragmentieren ähnlich den nicht silylierten Substanzen, wrobei jedoch die Abspaltung

- r a

m/e 129 (13V.) — m/e 157 (11V.)

Abb. 5. Vorschlag eines Fragmentierungsschemas für 3 - ( l ' . l ' -Dimethylallyl)-scopoletin 7 — D i e TMS-Derivate verhalten

sich analog.

doch darauf hin, daß jeweils eine Methoxigruppe durch eine Hydroxylgruppe ersetzt sein mußte. Durch Vergleich mit synthetischem Material, das uns freundlicherweise von Prof. R. D. H. MURRAY und Dr. M. M. BALLANTYNE, Glasgow, zur Verfügung gestellt wurde, konnte für eine dieser Verbindun-gen die Struktur des 3-(l /.l'-Dimetlhylallyl)-sco-poletin gesichert werden.

CHaOx A \

j j q / V A Q /

3- (l'.l'-Dimethylallyl) -scopoletin (1)

Ein wichtiges massenspektrometrisches Charak-teristikum einfacher Cumarine und Furocumarine,

VORKOMMEN VON 3- (l'.l'-DIMETHYLALLYL) -SCOPOLETIN 1255

eines Methylbruchstückes aus der Schutzgruppe das Spektrum unübersichtlicher gestaltet. Typisch wei-terhin ist der Verlust von -SiCCHg^ (M®-73), bei dem 3-substituierten Scopoletin-TMS-Derivat beleg-bar durch einen metastabilen Peak bei m/e 201,5 und das Auftreten der Bruchstücke m/e 75 und 73, welche •Si(CH3)3 bzw. -Si(CH3)2OH darstellen. Der Base-peak beim TMS-Derivat wird von m/e 73 gestellt. Auffallend ist auch beim silylierten 3-( l ' . l ' -Di-methylallyl)-scopoletin, das Auftreten von M®-27 und M®-55, wobei für die letztgenannte Fragmen-tierung der metastabile Peak m/e 230,5 spricht. Die übrigen metastabilen Peaks m/e 303,5 und m/e 263,5 kommen durch die Abspaltung eines Methylradikals vom Molekularion bzw. durch den CO-Verlust des Ions m/e 317 zustande.

Die beiden neu gefundenen Substanzen verhalten sich in den relativen Intensitäten der einzelnen Bruchstücke analog dem Isomerenpaar Bergapten/ Xanthotoxin, d. h. bis auf genau reproduzierbare Unterschiede in den relativen Intensitäten zeigen sie vollkommen gleiche Fragmentierung. Ahnliche Ver-hältnisse liegen z. B. auch beim Isomerenpaar Pim-pinellin/Isopimpinellin vor 8. Daraus läßt sich schlie-ßen, daß es sich bei den beiden Substanzen um ein Isomerenpaar handelt. Dies muß jedoch noch durch Synthese oder Isolierung und anschließende Analyse gesichert werden.

Ein Vergleichsspektrum des synthetischen 3 - ( l ' . l ' -Dimethylallyl) -scopoletin-TMS erwies sich als iden-tisch mit dem Spektrum des im Chromatogramm später erscheinenden Isomerenpartners. Die Reten-tionszeiten betrugen 32,7 min für 3-(l'.l'-Dimethyl-

1 E . REINHARD, G . CORDUAN U. 0 . H . VOLK, Planta m e d . [Stuttgart] 16, 8 [1968].

2 P. R. WHITE, A Handbook of Plant tissue culture, Lan-caster 1943.

3 W . STECK, B . K . BAILEY, J. P . SHYLUK U. 0 . L . GAMBORG, Phytochemistry 10,191 [1971].

4 J. REISCH ,1. NOVAK, K . SZENDREI U. E . MINKER, A c t a pharmac. medica 4, 179 [1967].

5 J . REISCH, K . SZENDREI, E . MINKER U. I . NOVAK, Tetra-hedron Letters [London] 41, 4395 [1968].

8 J. REISCH, K . SZENDREI, E . MINKER U. I. NOVAK, Tetra-hedron Letters [London] 49,4305 [1970].

7 H . BUDZIKIEWICZ, C. DJERASSI U. D . H . WILLIAMS, " S t r u c -ture Elucidation of Natural Products by Mass Spectro-metry", Bd. 2, 1964, S. 254 ff., Holden-Day Inc., San Francisco.

allyl)-scopoletin-TMS und das später erscheinende silylierte Isomer. Das im Chromatogramm früher erscheinende Isomer hat die Retentionszeit von 29,4 Minuten.

Experimentelles

Kultur und Extraktion

Die Gewebe wurden im Dauerdunkel auf einem modifizierten Nährmedium nach W H I T E 2 kultiviert. Der Nähragar enthielt außer den anorganischen Salzen pro l 0,1 mg Thiamin, 2 mg Auxin (1-iNaphthylessig-säure), 0,2 mg Kinetin, 70 ml Cocosmilch und 20 g Saccharose neben 6,5 g Agar-Agar. 28 Tage nach dem Umimpfen wurden die Kulturen gefriergetrocknet, mit Seesand p.a. verrieben und 800 mg Gewebe (Trocken-gewicht)) 3-mal 2 Stdn. mit je 120 ml Äther im Soxhlet-Apparat extrahiert. Nach dem Abziehen des Äthers wurde mit 400^1 BSTFA in einem Reaktions-gefäß mit Teflonstopfen 1 Stde. bei 80 °C silyliert. Die erhaltene Lösung wurde gaschromatographisch ge-trennt.

Bedingungen der Gaschromatographie/Massenspektro-metrie

Gerät: LKB 9000. Säule: ifs Zoll Stahlsäule, Länge 6 Ft, Chromosorb W / A W / D M C S 7 0 - 8 0 mesh 3% OV 17, Trägergas He, 24 ml/Minute. Säulentempera-tur: 160 °C linear 2 °C/min bis 256 °C/20 min iso-therm, Injektor: 220 °C, Separator: 250 °C, Ionen-quelle: 250 °C, Detektor: Totalionenstrom, Massen-spektren : Elektronenenergie 70 eV, Kathodenmaterial: Rheniumband, Beschleunigungsspannung 3,5 kV.

Für das Spektrum der nicht silylierten Reinsubstanz stand ein heizbares Direkteinlaßsystem mit gleichzeiti-ger Wasserkühlung zur Verfügung. Die Probe wurde aus einem Glasröhrchen direkt in die Ionenquelle ver-dampft.

8 T . FURUYA, H . KOJIMA U. H . SATO, C h e m . pharm. B u l l . [Tokyo] 15,1362 [1967].

9 T . FURUYA U. H . KOJIMA, J. Chromatogr . [ A m s t e r d a m ] 29,382 [1967].

1 0 E . REINHARD, G . . CORDUAN U.. W . V. BROCKE, H e r b a hungarica, im Druck.

1 1 KUO-HSIUNG LEE U. T . O . SOINE, J. p h a r m a c . Sei . 5 8 , 6 7 5 [1969].

1 2 J. REISCH, I . NOVAK, K . SZENDREI U. E . MINKER, A c t a pharmac. Suecica 4, 179 [1967].

1 3 M . M . BALLANTYNE, R . D . H . MURRAY U. A . B . PENROSE, Tetrahedron Letters [London] 39, 4155 [1968].