Date post: | 06-Apr-2015 |
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Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung
von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Übersicht
Motivation
Messapparatur
- Aufbau
- Optimierung der Einstellungen
- Durchführung der Messungen
Auswertung
- Normierung der Messdaten
- Faltung der Messdaten
- Korngrößenabhängigkeit
Zusammenfassung & Ausblick
Quellen
Seite 2PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Motivation – Bacillus subtilis
Seite 4PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Bakterium „Bacillus subtilis“ ist Endosporenbildner
Endosporen Ähnlichkeit zu- Bacillus anthracis
- Clostridium botulinum
- Clostridium tetani
Große Mengen vonkristallinem Ca-DPAim „Core“
Rest besteht aus nicht-kristallinen Proteinen,DNA, etc…
Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA)
Seite 5PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Ca-DPA ist Salz der Dipicolinsäure,welche ebenfalls in einigen Sporenzu finden ist.
Ca-DPA = C7H3CaNO4
bildet monoklines Gitter mit 4Molekülen / Zelle
Spektroskopisch viel untersuchteSubstanz, jedoch kaum mittels EDX.
Detektion interessant für Brief- &Paketscanner etc.
Messapparatur – Schematischer Aufbau
Seite 8PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
fokussierter Röntgenstrahl
3D - Objekt
Primär-kollimator
Streu-kollimator L
Objektpunkt
eff. Streuwinkel
x
z
q s
q p
Fokus
Messapparatur – Änderung des Messwinkels
Seite 9PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
0
9000
0 20 40 60 80 100 120 140
Energy [keV]
rel.
Inte
nsi
ty
0
30000
0 20 40 60 80 100 120 140
Energy [keV]
rel.
Inte
nsi
ty
xy
L
zx
z
y
L
Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung
Seite 10PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
x
z
y
A
A
0
18000
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Energy [keV]
rel.
Inte
nsi
ty
xz
y
A
A
0
8500
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Energy [keV]
rel.
Inte
nsi
ty
Röhren-Parameter & Datenaufnahme
Seite 11PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
wesentliche Bestandteile der Röntgenanlage X-Ray-Tube (Philips) mit Wolfram-Röntgenanode:
energieauflösender Ge-Halbleiter-Detektor (Eurisys Mesures)
Röhren-Parameter Beschleunigungspannung bis 150keV
Anodenstrom bis 10mA
Datenaufnahme
Vorbereitungen für die Datenauswertung Energie-Kanal-Eichung mittels charakteristischer Linien: in Kanal ; in Kanal
keVK 59 keVK 67
Detektorspannung ( E) Vorverstärker
MCA (2048 Kanäle) mit ADC „winTMCA“ (PC-Software)
Ky
Kx
Ky
Kx
KKK
KK
KiKK
KK
i xxx
yyyx
xx
yyy
Kanalnummer
iyix
Energie [keV]
Normierung des Beugungsspektrums
Seite 12PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Problem:
Lösung:
Vorgehensweise:
1. Aufnahme des Transmissionsspektrums: Detektion ungebeugter Photonen bei geringem Anodenstrom (I=1mA um Detektor nicht zu schädigen)
2. Division des Beugungs- durch das Transmissionsspektrum (Für manche Energien ist die Intensität im Transmissionsspektrum nahe null Hohe Intensitäten im Divisionsspektrum, allerdings lediglich in uninteressanten Randbereichen.)
Strahlungsintensität über Energien nicht konstant(aufgrund Bremsstrahlung & charakteristischer Linien)
Normierung des Beugungsspektrums mittels Transmissionsspektrum:Abgesehen von Rauscheffekten lässt sich so obige Intensitätsabhängigkeit herausfiltern
Messapparatur – Optimierung (I)
Seite 13PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Vormessung mit Dipicolinsäure
Bestimmung der Netzebenen-
abstände d mittels Gauß-Fit
d [A] rel. Intensität
3.189 100
6.278 9
5.259 22
4.547 12
3.652 25
2.730 18
2.422 27
Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0
Seite 14PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
xSim2001 v1.0 Im Rahmen einer Diplom-Arbeit für diese Röntgenanlage erstelltes
Simulationsprogramm
basierend auf „Monte Carlo Verfahren“
Anlagenparameter einstellbar (Blendenöffnungen, Winkel, ROI,zu untersuchendes Objekt sowie dessen Position)
Simulation von Messungen (mit d-Werten) Durchführung von Simulationsläufen
für verschiedene Blendensysteme und Beugungswinkel
Ermittlung optimaler Parametereinstellungen
entsprechende Konfiguration der Röntenbeugungsanlage
Ergebnisse der besten Simulationen (Spektren)
Primäre Beugungsblenden: 1te Konfiguration: oben:0.4 mm, unten 0.25 mm
2te Konfiguration oben:1.5 mm, unten:1.25 mm
Sekundäre Beugungsblenden: gleiche Konfig. oben: 4.7/5.6 mm, unten 12.9/14 mm
Beugungswinkel: 38mrad
Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot
Seite 15PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Darstellung simulierter Beugungsmessungen
Messapparatur – Messung (I)
Seite 16PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Im Folgenden führten wir folgende Messungen durch:
1. Messung: Ca-DPA mit kleinen Blenden + Transmission
2. Messung: Ca-DPA mit großen Blenden + Transmission
3. Messung: Sporen + Untergrund + Transmission
Messapparatur – Messung (II)
Seite 17PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Ca-DPA Messung bei einem Winkel von 38mrad
Primärblenden: 0.4mm / 0.25mm 1.5mm / 1.25mm
Messapparatur – Messung (III)
Seite 18PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Sporen Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 1.5mm / 1.25mm
Gemessene Spektren Divisionsspektrum
Auswertung – Normierung (I)
Seite 19PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Division der Spektren, dann:- Fit der Peaks und Bestimmung/Vergleich der d-Werte
- Untersuchung der Peakverbreiterung
- Rekonstruktion
Auswertung – Netzebenen (II)
Seite 20PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Vergleich der d-Werte zu Referenz [1]
Gute Übereinstimmung bei gleichen Anlagenparametern(kleine Blendenkonfiguration)
Verschiebung zu größeren d-Werten bei größeren Blenden(wg. Asymmetrie)
Peak Energie [keV] d [Å] Abweichung [%]
1 38.04 ± 0.02 8.584 ± 0.005 -2.8
2 50.36 ± 0.02 6.484 ± 0.003 -1.5
3 69.34 ± 0.08 4.710 ± 0.006 +2.8
4 82.52 ± 0.05 3.957 ± 0.002 +0.1
5 98.23 ± 0.09 3.324 ± 0.003 +2.3
Auswertung – Blendenverbreiterung (III)
Seite 21PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Aus der Winkelunsicherheit ΔΘ folgt eine Peakverbreiterung- Bragg-Gleichung liefert Energie … und daher Unsicherheit
- Winkelunsicherheit nicht exakt bekannt
Experimentelle Verbreiterungenaus Gauß-Fits werden gewichtetgefittet („Verbreiterungsfaktoren“)
Abschätzung zeigt Überein-stimmung mit Größenordnung
sin2d
nhcE E
d
nhcE
E
cotsin2
Auswertung – Faltung (I)
Seite 22PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Dk
kngkfgf
Dgf
)()()(
:, Diskrete Faltung:
Problem: Nicht-konstanter Faltungskern verursacht im diskreten Fall „stark nicht-stetige“ Resultate
- Blendenverbreiterung ΔE ~ E
- Korngrößenänderung ΔE ~ 1/E
Abhilfe: Spline-Interpolation “zwischen zwei Kernen“
Realisierung eines Algorithmus mit Matlab
Auswertung – Faltung (II)
Seite 23PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Verwendung von Gaußkernen
Beispiel: Faltung von zwei Peaks mit lin. Verbreiterung ~ E
2
0
2exp)(
w
xxAxg
Auswertung – Faltung (III)
Seite 24PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Rekonstruktion der gemessenen Ca-DPA-Spektren aus- d-Werten
- Intensitäten
- Verbreiterungsfaktoren
Auswertung – Faltung (IV)
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Vergleich mit Simulation
Fehlende d-Werte werden bestätigt
Ähnlich Resultate, jedoch geringere Übereinstimmung
Auswertung – Faltung (V)
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Ziel: Rekonstruktion des relevanten Bereich des Sporenspektrums aus Ca-DPA Spektrum
Algorithmische Minimierungder Differenzspektren inMaximumnorm
Annahmen- Generelle Verschmierung durch
biologische Probe(Grundverbreiterung)
- Korngrößenverkleinerung deskristallinen Ca-DPA(Scherrerverbreiterung)
Auswertung – Faltung (VI)
Seite 27PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Faltung von Ca-DPA Spektrum mit Verbreiterungskern
Aufgabe:Suche Verbreiterung, s.d. Abstände der beidenMaxima im Sporenspektrum mit denen im gefalteten Spektrum etwa übereinstimmen:
Auswertung – Korngröße (I)
Seite 28PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger
Problem: Linker Peak weist zuwenig Intensität auf
Möglicher Grund: Korngrößenverkleinerung
Scherrer – Formel
- Hier ist Δ die Peakverbreiterung, K der Scherrer-Formfaktor und L die Korngröße
- Kleine Kristallite Größere Verbreiterung
Idee: Faltung des verbreiterten Spektrums mit einem gemäß 1/E verbreiternden Kerns.
EEL
Khc
L
K 11
coscos
Auswertung – Korngröße (II)
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1/E Kernverhalten kann ersten Peak vergrößern
Recht gute Übereinstimmung, Abweichung 8-10 %
Aber: Zu ungenau – Verbreiterung korrespondiert zu Korngrößen im Bereich ~1nm nach Scherrer
Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...?
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Zusammenfassung Vormessung & Simulation
wichtige Voraussetzung zur Parameter-Optimierung
Messung und Auswertung der aufgenommenen Spektren Bestimmung der d-Werte,
Intensitäten
Halbwertsbreiten
Matlab-Analyse zur RekonstruktionSporen-Spektrums aus Ca-DPA-Spektrum mittels Faltung
Fazit / Ausblick Spektrum konnte mittels Faltung rekonstruiert werden
Ursachen der Verbreiterung nicht gänzlich geklärt
Bilden eines Entfaltungskern: Sporen Ca-DPA
Kurze Messzeiten & schnelle Algorithmen zur Auswertung für spätere kommerzielle Anwendung notwendig
Quellen
1. „Möglichkeiten zur Identifikation von Bakterien-Endosporen durch kohärente Röntgenstreuung“Diplomarbeit 2004DANIELA FELLINGER
2. „The Crystal Structure of Calcium Dipieolinate Trihydrate (A Bacterial Spore Metabolite)“Acta Cryst. (1968). B 24, 571GERALD STRAHS AND RICHARD E. DICKERSON
3. „Quantitative simulation of coherent X-ray scatter measurements on bulk objects“Journal of X-Ray Science and Technology 12 (2004) 83-96H. Bomsdorf, T. Müller, H. Strecker
4. Wikipedia Commons
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit & Interesse
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