Monophyllidin, a new alkaloid L-proline derivative from Zanthoxylum monophyllum Oscar J. Patiño, Luis E. Cuca

Materia: Química de productos naturales Maestra: Dra. Norma F. Santos Sánchez Alumna: Jhanina Rodríguez Fernández

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN CIENCIAS: PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS

Contenido de la exposición:

I. Introducción.

II. Objetivos del estudio.

III. Importancia de estudio

IV. Metodología.

V. Resultados.

VI. Bibliografía

VII. Anexo.

? Cultivo de tomate infectado por F. oxysporum f. sp. lycopersici.

Zanthoxylum monophyllum

• Aislar un nuevo metabolito derivado de L-prolina, de la

corteza de Zanthoxylum monophyllum.

• Elucidar la estructura de este nuevo metabolito por el

análisis espectroscópico extensivo de datos.

• Caracterizar 4 componentes a tráves del análisis

espectral, comparándolo con los datos reportados.

monophyllidin

thalifoline berberine

S-Tyrosine

Proline

Berberine is Natural Alkaloid Extracted from Natural Herbs, Used to Support the Body for those Concerned with:* Intestine, Blood Pressure, Blood Sugar & Cholesterol Health* Healthy Maintenance of Bacteria, Fungus, Yeast (Candida) and Intestinal Parasites.

monophyllidin

thalifoline

jathrorrhizine berberine

3β-glucositosterol

Corteza seca y molida de Z. Monophyllum

(150.5g)

Maceración EtOH 96%

- Solubilización en Et2O-H2O (1:1) (ultrasonido).

- Acidificar HCl , pH2

Extracción L-L con Et2O

Basificación NH4OH (pH 9)

- Extracción L-L CHCl3

Fracción de alcaloides solubles en

CHCl3

Fase acuosa: Extracción L-L con

CHCl3-EtOH

CC Flash (Eluyendo CHCl3‐MeOH) para:

Berberina, jathrorrhizina, 3b-glucositosterol, (-)-

monophyllidina

CC Flash (Eluyendo CHCl3‐MeOH) para:

thalifolina

Diagrama de flujo N°1: Extracción y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la corteza de Zanthoxylum monophyllum.

Respecto a las técnicas para la extracción y aislamiento de compuestos

Para separación Cromatográfica en columna:

- Cromatografía flash (CF)

Fase estacionaria: Sílica gel Merck (70-230 Messh)

- Cromatografía analítica:

Sílica gel 60 PF254 (0.25mm)

Respecto a las técnicas empleadas para la elucidación estructural y caracterización de los compuestos

• Para espectros de RMN de 1H y 13C y espectros 2D (COSY, HMQC, HMBC ): Espectrómetro Bruker Avance 400,

Operado a 400 MHz para 1H y a 100 MHz para 13C.

Solvente: Cloroformo deuterado (CDCl3)

. Los espectros de masas:

- Equipo Shimadzu LCMS‐IT‐TOF , para ESI en modo positivo.

- Equipo Shimadzu GCMS‐QP2010, para EIMS y CIMS

• Los espectros Infrarrojo (IR) : Espectrómetro Perkin Elmer FTIR Panagon 500 serie 1000.

• Rotación óptica específica : Polarímetro Polartronic Schmidt- Haensch.

• Control de pureza:

Punto de fusión (fusiómetro Fisher Jhons )

Respecto al ensayo antibacterial y antifúngico: • Para actividad antibacteriana: Método de difusión radial contra cepas de bacterias

estándar.

Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus fecalis ATCC 29212 y Gram (‐): Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella tiphymurium, cepas ATCC 14028s y MS7953.

• Para actividad antifúngica: Método de bioautografía directa Fusarium oxysporum f. sp. lycopercisi.

Fotografías de una cromatoplaca empleada en el ensayo de actividad antifúngica de los compuestos sintéticos.

1.- El componente monophyllidin fue obtenido como un sólido cristalino blanco:

- Test de reactivo Dragendorffs positivo.

- Punto de fusión: 150-151°C

- Pico del Ion molecular protonado: [M+H]+ 324.1343 m/z .

- HRESIMS: 324.1447 (C16H21NO6).

- Bandas IR: 3451, 1725 cm-1; 3451cm-1; 1600,1498,1462 cm-1

- 1HNMR: δ 33,0; 55,8 y 56,2 (metilos) - Correlaciones COSY y HMBC.

Correlaciones COSY (COrrelated Spectroscopy) y HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence (HMBC)

2.- Todos los componentes aislados demostraron actividad antibacterial por el método de de difusión radial en contr a de bacterias Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus fecalis ATCC 29212 y Gram (‐): Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella tiphymurium, cepas ATCC 14028s y MS7953.

3.- La mínima cantidad de thalifolina y jathrorrhizina fue de 100ug para inhibir el crecimiento fúngico; mientras que los otros componentes fueron inactivos.

• Oscar J. Patiño, O.J., Cuca, L.E. (2011). Monophyllidin, a new alkaloid L-proline derivative from Zanthoxylum monophyllum. Phytochemistry Letters. 22-25.

• COSY, Use our NMR service, 2D NMR, NMR techniques, Back to home page ©Roy Hoffman, The Hebrew University, Revised 2010-11-24T10:56+02. Disponible en: http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/2d/cosy/cosy.html

Reactivo de Dragendorff:

Bi(NO3)3 en HN3-KI en agua destilada.

• Resultado (+): Precipitado naranja o pardo anaranjado

ESI

• Se introduce el analito (que será ionizado) disuelto en un solvente más volátil por un capilar de metal muy pequeño y cargado Debido a la repulsión de las cargas eléctricas, el líquido se sale del capilar y forma un aerosol, una nube de pequeñas gotas (10 μm) altamente cargadas.

• Conforme el solvente se evapora, las moléculas de analito se aproximan, se repelen y finalmente, cuando la repulsión de las cargas positivas vence la tensión superficial, estallan las gotas (Explosión de Coulomb).

• El proceso se repite hasta que el analito está libre de solvente, de modo que no quedan más que iones.

• Los iones se mueven hacia el analizador de masa

• LC‐MS‐IT‐TOF Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas empleando trampa de iones y detección de tiempo de vuelo.

• δ Desplazamiento químico

• δC Desplazamiento químico en 13C

• δH Desplazamiento químico en 1H

• Et2O Éter etílico

• EtOH Etanol

• ESI Ionización por electrospray

• CDCl3 Cloroformo deuterado

• CC Cromatografía en columna

• HMBC Y HMQC:

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (HMQC) and Heteronuclear Multiple Bond Coherence (HMBC) are 2-dimensional inverse H,C correlation techniques that allow for the determination of carbon (or other heteroatom) to hydrogen connectivity.

HMQC is selective for direct C-H coupling and HMBC will give longer range couplings (2-4 bond coupling).

COSY

is a useful method for determining which signals arise from neighboring protons (usually up to four bonds). Correlations appear when there is spin-spin coupling between protons, but where there is no coupling, no correlation is expected to appear.

This method is very useful when the multiplets overlap or when is extensive second order coupling complicates the 1D spectrum.

Four-bond and five-bond correlations are apparent when plotted to lower contours (fig. 8). These separate the spectrum into four groups of protons in a manner that is much clearer than the 1D spectrum.

• . Aromaric region of the 2D COSY spectrum of 12,14-ditbutylbenzo[g]chrysene showing mostly three-bond correlations (a four-bond correlation between H10 and H11 is also visible

Método de difusión radial contra cepas de bacterias estándar.

• En un ensayo típico se toma una colonia aislada de cada cepa y se siembra en 3 mL de tripticasa de soya (TSB) para las bacterias Gram (+) y 3 mL de base Luria Broth (LB) para las bacterias Gram (‐). Se incuban a 37 °C con agitación constante durante la noche. Del cultivo resultante se toman 200 μL y se inoculan en 20 mL de TSB o LB según el caso y se incuban por 5 horas a 37 °C con agitación constante hasta que los microorganismos se encuentren en la fase logarítmica. Posteriormente se centrifugan las suspensiones por 10 minutos a 10000 rpm a 4 °C, se retira el sobrenadante y el sedimento obtenido se resuspende en 10 mL de buffer de fosfato salino (PBS) pH 7.2, realizando luego 3 lavados con PBS

Reveladores de componentes:

- Vapor de Iodo.

- Luz UV.

- Reactivo de Dragendorff