Molekulare Diagnostik Krankheitserreger und ihre Diagnostik · Molekulare Diagnostik Institute for...

Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch

Krankheitserreger und ihre Diagnostik

•Bakterien

•Viren

•Parasiten/Protozoen

•Pilze

•Prionen



Definitionen

• Pathogene (Krankheitserreger, Keim)– Mikroorganismus oder Virus welcher eine infektiöse Krankheit

hervorrufen kann

• Mikroorganismen (Mikroben)– Mikroskopisch kleine Lebewesen (ausgenommen Viren)

• Infektion– Eindringen und Vermehren einer Mikrobe in einem Makroorganismus

• Virulenz– Maß der krankmachenden Eigenschaft eines Pathogens (auch

Bakterien)



Übertragungswege



Virulenzspektrum

Klinische Auswirkung:•Poliomyelitis bei Kindern: 0.1-1%•Röteln: 50%•Tollwut: 100%

AsymptotischeAsymptotischeInfektionInfektion

Klinische FKlinische Fäällelle

Latente InfektionLatente Infektion



Todesursachen im Vergleich Europa / Afrika

WHO, World Health Report 2002, Geneva, 2003

6%8%

86%

Infektionen,perinatale Urs.,ErnährungTumor, D.m., KHK,cerebrovask.,Psych.Verletzungen,Unfälle, Straftaten

71%

22%7%





Bakterien• Einzeller• Simple Struktur (Plasmamembran, keine Organellen)• Einteilung in grampositive und –negative Bakterien• Feinere Einteilung nach Morphologie (Kokken, Spirillen)



Koch's postulates (1876):

•The microorganism must be found in abundance in all organisms suffering from the disease, but should not be found in healthy organisms.

•The microorganism must be isolated from a diseased organism and grown in pure culture.

•The cultured microorganism should cause disease when introduced into a healthy organism.

•The microorganism must be reisolated from the inoculated, diseased experimental host and identified as being identical to the original specific causative agent.



Bakterielle Krankheiten



Mechanismen bakterieller Pathogenizität

• Invasion– Kolonialisierung (Adherenz (Adhesine) und

Multiplikation)– Produktion von Substanzen, welche die Invasion

unterstützen (Invasine)– Entwicklung von Resistenz gegen Immunantwort des

Wirtes



A macrophage extends a semiliquidprojection (a so-called pseudopodium) towards some bacteria in the foreground.

Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH



• A series of images shows (top left to bottom right) the process – called phagocytosis – by which some bacteria are ingested by a macrophage.

Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH



Mechanismen bakterieller Pathogenizität

• Invasion– Kolonialisierung (Adherenz (Adhesine) und

Multiplikation)– Produktion von Substanzen, welche die Invasion

unterstützen (Invasine)– Entwicklung von Resistenz gegen Immunantwort des

Wirtes• Toxigenizität

– Exotoxine (von Bakterien freigesetzt)– Endotoxine (ursprünglich nicht freigesetzt, können

aber auch in Zirkulation gelangen)



Beispiele für Exotoxine



Bakterielle Krankheiten• Tuberkulose• Cholera• Pest• Keuchhusten (Pertussis)• Botulismus• Lepra• Tetanus• Streptokokken• Staphylokokken• Neisserien

GonokokkenMeningokokken

• Enterokokken



Diagnostik bakterieller Krankheiten•Kultivierung auf Nährmedium

•Mikroskopie von Patientenproben• z.B. Gram-Färbung

•ELISA zur Detektion von Exotoxinen

•Real time PCR und/oder Sequenzieren zur Detektion bakterieller Nukleinsäuren• meistens: 23S oder 16S ribosomale RNA gene• Spezifische Gene (Heat shock proteins)• Spezies-spezifische Gene• Antibiotika-Resistenz-Marker (Bsp.: MRSA)

•Microarrays zur Multiplex-Detektion• Hybridisierung bakterieller DNA• Antikörper-Mikroarrays zur Detektion von Antigenen



Definition „Virus“Viren sind keine echten Lebewesen, sondern

replikationsfähige Nukleoproteinkomplexe

Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel

Viren sind für ihre Vermehrung (Replikation) auf eine Wirtszelle angewiesen

Viren vermehren sich nicht durch Zweiteilung, sondern durch Zusammenlagerung (assembly) der einzelnen Molekülkomponenten

Viren besitzen im Allgemeinen nur eine Art von Nukleinsäure (DNA oder RNA)





Viren• Die meisten viralen Infektionen verlaufen subklinisch!!!

Ausbruch der Krankheit auch für Virus lebensbedrohlich.• Jeder Virus kann nur in bestimmten Zelltypen oder Geweben überleben.

• Virale Replikation:– Adsorption– Penetration– Enthüllung– Replikation des Genoms– Reifung– Freisetzung



Einteilung von Viren



Viren• DNA Viridae

Parvo- (Fetusfehlbildung, Hauterkrankungen)

Papova- (Papillomaviren: Warzen, Zervixkarz.)

Adeno- (Erkältungen, Durchfall)

Herpes-Alpha-Virinae (orale, genitale Erkrankung, Windpocken)Beta-Virinae (CMV: Fieber, Lungen-, Leber-, Netzhautentzündg.)Gamma-Virinae (Epstein Barr Virus: Pfeiffer-Drüsenfieber)

Pox- (Pocken)

• BakteriophagenViren, deren Wirte Bakterien sind



• RNA ViridaePicorna-

Enterovirus Poliomyelitis V-Kinderlähmung, Coxsackie-V-abakterielle Meningitis, FieberHepatitis A (Serotyp 72)-Hep A

Revo-Rota- und Coloradoviren (Magen-Darmtrakt)

Paramyxo-Paramyxo V

Mumps-VirusMorbilli V

Masern-VirusRinderpest-VirusHundestaupe-Virus

Pneumo VMäusepneumonie-Virus



• RNA ViridaeRhabdo-

Vesiculo VLyssa V

Tollwutvirus (Virus gelangt ins ZNS-bis zur Herzlähmung)

Bunya- (fieberhafte Erkrankungen)

Toga-Alpha-VFlavi-V (West Nil V, FSME:Frühsommer-Meningo-Enzephalitis, Gelbfieber)

Rubi-V (Rötelnvirus-Missbildungen in Schwangerschaft)

Retro-Spumavirinae (biolog. Wirkung unbekannt)

Oncovirinae (für Mensch und Tier gefährlich-Krebs)

Lentivirinae (HIV-AIDS)



Diagnose von Viren• Virusisolierung (Anzüchten in Tieren, Bakterien- oder Zellkultur)• Direkter Virennachweis (Elektronenmikroskop, Nukleinsäuren)• Indirekter Nachweis (Plaquemethode)• Serodiagnose (z.B. ELISA zum Antiköpernachweis: IgG, IgM)



VirusisolierungEventuell infiziertes Probenmaterial (z.B. von Menschen) wird auf Testsysteme übertragen:

Hühnerembryonen (bebrütete Hühnereier-selten)SäuglingsmäuseZellkulturen (Monolayer)

Das Auftreten von typischen Krankheitssymptomen im Testsystem zeigt Virus in Probenmaterial an:

CPE (zytopathischer Effekt)Plaques (Lysen)



Direkter Virusnachweis• Elektronenmikroskopie (hohe Viruskonz. nötig)

PockenvirenRotavirenCoronaviren (SARS)

• Elektronenmikroskopische Viruspartikelzählung (Zugabe einer bekannten Menge an Latexpartikeln-interner Standard)



Indirekter Virusnachweis• Plaque Methode

Aussäen von Monolayer auf festem Nährboden (Agar)

Infektion mit Probenmaterial (verschiedene Verdünnungen herstellen)

Virus lysiert Zelle, diese wiederum nur Nachbarzellen, dabei entstehen Plaques (Löcher im Zellrasen)

Pro Virus entsteht ein Plaque

Automatisches Zählen von Plaques durch „colony counting“



Serodiagnostik

• Komplementbingungsreaktion (KBR)• Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Neutralisationstest (NT)• Immunfloureszenz• Nukleinsäurehybridisierung

• Diagnostik Influenza Virus

Nachweis von Antikörper gegen den Virus



Komplementbingungsreaktion (KBR)• Patientenserum (inaktiviert)

zufügen von Testantigenen mit bekannter Menge

• Sind Antikörper im PatientenserumKomplex aus Antigen und Antikörper bildet sich

Zugabe von Komplement, gefolgt von Erythrozyten und Antikörper: Kein Farbumschlag-Infektion:

Sind Antikörper im Patientenserum, bindet das Komplement zur Gänze an den entstandenen Antikörper-Antigen Komplex-Kein Komplement übrig für die Hämolyse der Erys!

Farbumschlag-keine InfektionSind keine Antikörper im Patientenserum, bindet Komplement an die Erys, es kommt zur Hämolyse, diese zeigt somit an, dass keine Infektion besteht!!





Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Hämagglutinine sind Oberflächenstrukturen mancher Viren

(Rötelvirus)• Hämagglutinine verklumpen rote Blutkörperchen (Agglutination)• Vom Körper gebildete Antikörper richten sich gegen diese

Hämagglutinine

• Testprinzip: Patientenserum werden Hämagglutinine zugegebenAntikörper in der Patientenprobe: Hämagglut. werden

gebunden. Eryzugabe führt zu keiner AgglutinationKeine Infektion: Hämagglutinine binden an zugegebene

Erythrozyten: Agglutination





Neutralisationstest (NT)

• Testprinzip: Patientenprobe wird def. Menge an Antigen (zu testendes Virus z.B.) zugegeben.

Infektion: Antikörper der Patientenprobe neutralisieren zugegebenes Antigen und Lösung ist nicht mehr imstande Zellkultur zu infizieren.

Keine Infektion: Keine Antikörper, damit wird zugegebenes Antigen nicht von Patientenprobe neutralisiert und kann damit Zellen infizieren!!



Immunfluoreszenz• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum• Testprinzip: empfindliche Zellkultur wird mit dem zu

untersuchenden Virus infiziert

Zugabe von Patientenserum: Bei Infektion: Antikörper des Serum neurtalisieren Virus und Zellen werden nicht zytopathischKeine Infektion: keine Antikörper, daher ist Virus imstande Zellen zu infizieren

Zugabe von fluoreszensmarkierten Antikörpern, die den Erstantikörper binden

Bei Infektion: Antikörper-Antikörper Komplex, damit enststeht Fluoreszenz, im Mikroskop zu beobachten.Keine Infektion: Kein Erstantikörper, keine Bindung an fluoreszenzmarkierten Antikörper möglich, keine Fluoreszenz



NukleinsäurehybridisierungDient dem Nachweis viraler Gene in der Patientenprobe

Testprinzip Southern Blot:DNA aus Patientenprobe wird isoliert, fragmentiert, auf Gel

aufgetragen und auf Nitrozellulose geblottet. Verwendung radioaktiv markierter Gensonden (DNA Fragmente

des nachzuweisenden Virus) zur Hybridisierung mit der Blot-DNA.

Infektion: es kommt zu einer Hybridisierung, auf der Photoplatteentstehen Schwärzungen

Keine Infektion: Gensonden sind nicht homolog zur Patientenprobe, keine Hybridisierung, keine Schwärzung.



Sothern blot:



Microarrays zur parallelen Detektion mehrerer Pathogene



Diagnostik Influenza VirusNachweis viraler Antigene

• Nur 1-4 Tage nach Krankheitsbeginn möglich!• Proben: Nasen-, Rachen-, Alveolarsekret

ImmunfluoreszenzELISAVirusanzucht in Zellkultur

• Hoch spezialisiert, nur in wenigen Labors möglich:PCR

Retrospektiv: serologischer Antikörpernachweis

KBR, ELISA, Immunfloureszenz



Influenzavirus

Adenovirus

HIV Virus

Date post:	06-Sep-2019
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