Bundesweite Fortbildung für Bodenschutzbehörden sowie für interessierte Sachverständige und Pflichtige

LABO Förderprojekt B 4.13 des Länderfinanzierungsprogramms „Wasser, Boden und Abfall“ www.laenderfinanzierungsprogramm.de

MNA-Konzepte - Grundlagen & Vorgehensweise -

Möglichkeiten und Grenzen von Nachweismethoden

Dr. Kathrin R. Schmidt, TZW-DVGW

Untersuchung und Charakterisierung von Schadstofffahnen

NATURAL ATTENUATION (NA)

„Natürliche Schadstoffminderungsprozesse sind biologische, chemische

und physikalische Prozesse, die ohne menschliches Eingreifen zu einer

Verringerung (…) eines Stoffes im Boden oder Grundwasser führen“

Industrie- standort

ungesättigte Bodenzone

Wasserwerk Rezeptor

Aquifer gesättigte

Bodenzone

Grundwasser- Fließrichtung

Schadensherde Ablagerung

DNAPL (LCKW)

Aquitard

Schadstofffahne

LNAPL

Der biologische Abbau ist bei vielen Grundwasser-

schäden der maßgebende frachtreduzierende Prozess.

MIKROBIELLER ABBAU VON CHLORETHENEN

Aerob-oxidativer Abbau je weniger Chloratome desto leichter abbaubar

CO2

Cl-

H2O H H

C = C H Cl

Cl H

C = C Cl Cl

Cl Cl

C = C Cl Cl

Anaerob-reduktiver Abbau je mehr Chloratome desto leichter abbaubar

Auxiliar-

substrate

PCE

TCE

cDCE

VC

Ethen

H H

C = C Cl Cl

H H

C = C H H

H2

Chlorethene Sauerstoff

(Elektronen-Donoren) (Elektronen-Akzeptor)

werden oxidiert wird reduziert

Auxiliarsubstrate Chlorethene

(Elektronen-Donoren) (Elektronen-Akzeptoren)

werden oxidiert werden reduziert

O2

CH3 CH

3

CH3

S

O

MIKROBIELLER ABBAU VON AROMATEN (AKW)

Aromaten

(Elektronen-Donoren)

werden oxidiert

O2

CO2

H2O

Sauerstoff

(Elektronen-Akzeptor)

wird reduziert

Alternative Elektronen-Akzeptoren:

-25,4

Energiegewinn

am Beispiel

Naphtalin

(kcal/eeq)

NO3 N2 -23,9

Fe(III) Fe(II) -5,7

SO4 S2- -1,7

CO2 CH4 -1,0

OFFENE FRAGEN VOR ANWENDUNG VON MNA

welche Schadstoffe werden abgebaut?

welche Milieubedingungen sind erforderlich?

wie effizient ist der Abbau?

ist MNA ausreichend? (Zeitskala, Einhalten von Grenzwerten, Toxizitätsreduktion etc.)

Industrie- standort

ungesättigte Bodenzone

Wasserwerk Rezeptor

Aquifer gesättigte

Bodenzone

Grundwasser- Fließrichtung

Schadensherde Ablagerung

DNAPL (LCKW)

Aquitard

Schadstofffahne

LNAPL Welche Abbauprozesse sind

? ? ? ? im Untergrund wirksam?

NACHWEISMETHODEN

Schadstoffmuster

Redoxmilieu

Molekularbiologischer Nachweis (PCR)

Keimzahl-Bestimmung (MPN)

Mikrobiologische Abbauversuche

Isotopenuntersuchung

PCE EthenVCcDCETCEPCE EthenVCcDCETCE

Aerob/ anaerob

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C

E F G H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C

E F G H

D

12C Abbau schneller 13C Abbau langsamer

STANDORT 1: FRANKENTHAL, RHEINLAND-PFALZ

Schadstoffe: Chlorethene

Verursacher: Metallverarbeitender Betrieb

und chemische Reinigung

Flächige Schadstofffahne in der Innenstadt

Bislang P&T am Herd und MNA in der Fahne

SCHADSTOFFMUSTER

Schadstoffmuster am Standort

gibt Hinweise auf Abbauvorgänge

Abbau wird u.a. deutlich durch:

die Detektion spezifischer

Metabolite im Abstrom

sowie kürzere Fahnenlängen

für gut abbaubare und

hydrophile (weniger Retardation)

als für schlecht abbaubare und

hydrophobe Substanzen

PCE EthenVCcDCETCEPCE EthenVCcDCETCE

Acenapthen

3,6 mg/L

Naphthalin

31 mg/L

Wasserlöslichkeit

Metabolite der

anaerob-reduktiven

Dechlorierung:

cDCE ist Haupt-

kontaminant

wenig VC

relativ kurze Fahne

SCHADSTOFFMUSTER: CKW-STANDORT

PCE > 100 µg/L

TCE > 100 µg/L

cDCE > 100 µg/L

VC > 100 µg/L

0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m

REDOXMILIEU

Hydrochemische Standort-Bedingungen

grenzen mögliche Abbauprozesse ein

Redoxmilieu: Bewertung von

Elektronen-Akzeptoren (Sauerstoff, Nitrat, Eisen(III), Mangan(IV), Sulfat)

und/ oder Respirationsprodukten (Nitrit, Eisen(II), Mangan(II), Sulfid, Methan)

Informationen über die Verfügbarkeit

von Auxiliarsubstraten, Nährstoffen

O2 H2O

NO3 N2

Fe(III) Fe(II)

Mn(IV) Mn(II)

SO4 S2-

CO2 CH4

PCE > 100 µg/L

TCE > 100 µg/L

cDCE > 100 µg/L

VC > 100 µg/L

0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m

REDOXMILIEU: CKW-STANDORT

In verschiedenen

Fahnenbereichen

(lateral und vertikal)

liegen für

unterschiedliche

Abbauprozesse

geeignete

Bedingungen vor

MIKROBIOLOGISCHE BESTANDSAUFNAHME (PCR)

Nachweis von bestimmten Mikroorganismen

in Feldproben (Grundwasser, Boden)

PCR (Polymerase Chain Reaction):

Molekularbiologischer Nachweis der

DNA (= Erbgutinformation)

Schadstoff-abbauende Bakterien/

Enzyme liefern Informationen zum

Abbaupotential

Redox-aktive Bakterien/ Enzyme und

hydrochemische Daten ermöglichen

Beurteilung des Redoxmilieus Abbild

ung v

on h

ttp://b

bru

ner.

org

/bitn/b

r_c1.h

tm

PCE > 100 µg/L

TCE > 100 µg/L

cDCE > 100 µg/L

VC > 100 µg/L

0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m

PCE

TCE

cDCE

VC

Ethen

Desulfomonile sp.

Desulfuromonas sp.

Dehalobacter sp.

Dehalococcoides sp.

Korrelation von

PCR-Nachweis,

Schadstoffmuster

und Redoxmilieu

PCR-METHODE: CKW-STANDORT

MIKROBIOLOGISCHE BESTANDSAUFNAHME (MPN)

Nachweis von Mikroorganismen-Gruppen

mit bestimmten Leistungen in Feldproben

(Grundwasser, Boden)

MPN (Most Probable Number):

Wachstum und Keimzahl-Bestimmung

im Labor (Kulturverfahren)

Schadstoff-abbauende Bakteriengruppen liefern

Informationen zum Abbaupotential

Redox-aktive Gruppen und hydrochemische Daten

ermöglichen Beurteilung des Redoxmilieus

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

51 F 44 F 45 F 46 F Messstellen

Keim

e / g

Tro

cken

su

bsta

nz

Nitrat-Reduzierer

Sulfat-Reduzierer

Eisen-Reduzierer

aerobe VC-Verwerter

Aerobe VC-Verwerter sind weit verbreitet

Sulfat-Reduktion von untergeordneter Bedeutung gegenüber Nitrat- und Eisen-Reduktion

MPN-METHODE: CKW-STANDORT

< 6

,7

< 6

,7

< 6

,7

MIKROBIOLOGISCHE ABBAUVERSUCHE

Nachweis am Standort auftretender

mikrobiologischer Abbauprozesse

Standortmaterial (Grundwasser, Sediment)

Labor-Mikrokosmen oder in-situ (Bactraps)

Standort-nahe oder gezielt veränderte

Bedingungen

Untersuchung von Schadstoffabbau und

Redoxprozessen

Ch

lore

then

e,

Ch

lori

d [

µM

]

0

5

10

15

20

25

30

35

0 7 17 26 31 35 38 45 59 61 63 66

Zeit [Tage]

Metabolitenbildung unter

anaeroben Bedingungen:

Stoffmengenerhaltung: aus

ca. 27 µmol PCE (4,3 mg) werden

ca. 27 µmol cDCE (2,6 mg)

Mineralisierung unter

aeroben Bedingungen

0

20

40

60

80

100

0 5 7 10 11 12 14 17 19

Zeit [Tage]

aerob-oxidativ anaerob-reduktiv

ABBAUVERSUCHE: CKW-STANDORT

sequentiell anaerob-aerobe

Schadstoff-Elimination

TCE Cl H

C = C Cl Cl

cDCE H H

C = C Cl Cl

PCE Cl Cl

C = C Cl Cl

cDCE H H

C = C Cl Cl

2 CO2 + 2 Cl- + H2O

Chlorid

cDCE

TCE

PCE

Nachweis mikrobiologischer NA-Prozesse

am Standort mittels chemischer Analytik

Quellen- und

Verursacherzuordnung

Quantifizierung des

biologischen Abbaus

Isotope = Atome desselben Elements mit unterschiedlicher

Anzahl an Neutronen, z.B. 12C (leicht) und 13C (schwer),

beide stabil, d.h. nicht radioaktiv

ISOTOPENUNTERSUCHUNG

Abbild

ung v

on h

ttp://w

ww

.agro

isola

b.d

e/im

ages/s

tabile

isoto

pe.g

if

Cl Cl

12C = 12C

Cl Cl

Cl Cl

12C = 12C

Cl Cl

Cl H

12C = 12C

Cl Cl

Cl H

12C = 12C

Cl Cl

Cl Cl

12C = 13C

Cl Cl

Cl Cl

12C = 13C

Cl Cl

Cl H

12C = 13C

Cl Cl

Cl H

12C = 13C

Cl Cl

leichtes Kohlenstoff-

isotop 12C

schnellere Umsetzung

schweres Kohlenstoff-

isotop 13C

langsamere Umsetzung

PCE TCE

ISOTOPEN: MIKROBIOLOGISCHE FRAKTIONIERUNG

Bakterien verwerten bevorzugt die leichten Isotope

Anreicherung der schweren Isotope in verbleibenden Schadstoff

Veränderung der Isotopenverhältnisse = Isotopenfraktionierung

Bakterien

setzen 12C schneller

um als 13C

13C

13C

13C 13C

12C 12C

12C 12C

12C 12C

12C

12C 12C 12C

12C

12C 12C

12C 12C

12C 12C 12C

12C

13C 13C

Ausgangsschadstoff

mit spezifischem

Isotopenverhältnis

gebildete

Verbindung

abgereichert

an 13C

„leichter“

13C

12C 12C

12C 12C 12C 12C

12C 12C 12C

12C

12C 12C

12C 12C

13C

verbleibende

Substanz

angereichert

an 13C

„schwerer“

13C 13C

12C

12C

12C

12C 12C

12C

13C

13C und

ISOTOPEN: MIKROBIOLOGISCHE FRAKTIONIERUNG

Isotopensignatur = Verhältnis von schweren zu leichten Isotopen in

Bezug zu einem Standard (δ-Notation)

13C/12C natürliches Verhältnis ca. 1 : 100

2H/1H natürliches Verhältnis ca. 1 : 10.000

-20

0

20

40

60

80

100

0% des Ausgangsschadstoff 25% 50% 75% 100%

Iso

top

en

-Sig

natu

r

ε = - 5 schwache

Fraktionierung

ε = - 30 starke

Fraktionierung

ε = - 15 mittlere

Fraktionierung

je höher die Anreicherungsfaktoren desto besser für Nachweis und Quantifizierung geeignet

korrekte Quantifizierung nur mit richtigem Anreicherungsfaktor möglich

ISOTOPEN: ANREICHERUNGSFAKTOREN

Isotopisch

schwerer

Isotopisch

leichter

PCE > 100 µg/L

TCE > 100 µg/L

cDCE > 100 µg/L

VC > 100 µg/L

0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m

13C-Isotopen-

anreicherung (Summen-

signaturen) im Feld

Bestimmung von

Anreicherungsfaktoren

in Mikrokosmen

Quantifizierung des

Abbaus im Feld

ISOTOPEN: CKW-STANDORT

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [Tage]

Ko

nzen

trati

on

- 50

- 30

- 10

10

30

50

VC mg/L VC δ13C

Iso

top

en

-Sig

natu

r

- 23,5 ‰

- 17,3 ‰

- 15,8 ‰

- 23,9 ‰

METHODE AUSSAGEKRAFT GRENZEN

Schadstoff-

muster

anaerob-reduktive

Dechlorierung nachweisbar

keine Information über aerob-

oxidativen Abbau

Redox-

milieu

Information über die

Randbedingungen des Abbaus

durch Verwendung von integrierenden

Mischproben Bewertung oft ungenau

PCR

Leitorganismen der anaerob-

reduktiven Dechlorierung

nachweisbar

kein Aktivitätsnachweis

Nachweis für aerob-oxidativen Abbau

in der Entwicklung

MPN aerobe VC-Verwerter

nachweisbar

kein Nachweis für anaerob-reduktive

Dechlorierung

teilweise relativ lange Inkubationszeit

Abbau-

versuche

detaillierte Charakterisierung

des Schadstoff-Abbaus

(Abbaureihenfolge,

erforderliche Bedingungen etc.)

relativ lange Zeitdauer, insbesondere

anaerob

keine ins Feld übertragbaren

Abbauraten

C-Isotopen

ermöglicht chemischen

Nachweis des Abbaus und

Quantifizierung

Interpretation der Ergebnisse teilweise

anspruchsvoll

BEWERTUNG DER METHODEN FÜR CHLORETHENE

STANDORT 2: RÜSGES, NORDRHEIN-WESTFALEN

Schadstoffe: PAK, BTEX, NSO-HET

Verursacher: Chemische Fabrik

Schadstofffahne ausgehend von

Werksgelände

MNA-Konzept wird umgesetzt

SCHADSTOFFMUSTER: AKW-STANDORT (PAK)

gut abbaubares, hydrophiles Naphthalin nur am

Fahnenbeginn nachweisbar

schlecht abbaubares, hydrophobes Acenapthen

reichert sich im Fahnenverlauf an

REDOXMILIEU: AKW-STANDORT

aerob

Fe(III)-reduzierend

Sulfat- reduzierend/ methanogen

In verschiedenen Fahnenbereichen liegen

für unterschiedliche Abbauprozesse

geeignete Bedingungen vor

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

Herd Abstrom Abstrom

60 m 130 m Ae

rob

e K

eim

e /

mL

Gru

nd

wa

ss

er Gesamtkeimzahl (flacher Horizont)

Gesamtkeimzahl (tiefer Horizont)

AKW-Verwerter (flacher Horizont)

AKW-Verwerter (tiefer Horizont)

MPN-METHODE: AKW-STANDORT

Höhere Keim-

zahlen im Herd

als im Abstrom

zeigen mikrobielle

Aktivität bei

Grundwasser-

Belastung

< 6

,7

< 6

,7

ABBAUVERSUCHE: AKW-STANDORT

+++ = Abbau innerhalb 50 Tage ++ = Abbau innerhalb 280 Tage, 12°C + = Abbau innerhalb 280 Tage, 20° C - = kein eindeutiger Abbau

Abbauaktivität hängt von

Redoxbedingung ab

RedoxzoneSulfat-

reduzierend

Fe(III)-/Sulfat-

reduzierendaerob

Ethylbenzol + + +++

Benzol + + +++

Naphthalin + ++ +++

Acenaphthen - - +++

Phenanthren - + +++

Fluoren - - +++

Dibenzofuran + + +++

Benzothiophen - + +++

2-Methylbenzofuran - - +++

Dibenzothiophen - - +++

Carbazol - - +++

2-Methyldibenzofuran - - +++

BT

EX

NS

O-H

ET

PA

K

13C-Isotopen-Anreicherung im Feld

qualitativer Nachweis des biologischen

Abbaus

ISOTOPEN: AKW-STANDORT

KE B7 [μg/L] δ13

C [‰]

isoPropylbenzol 14,4 -20,9±0,9

Indan 190 -21,8±0,6

GW 22 [μg/L] δ13

C [‰]

isoPropylbenzol 14,6 -17,9±0,5

Indan 91 -21,3±0,5

KE B8 [μg/L] δ13

C [‰]

isoPropylbenzol 3,2 -19,5±0,7

Indan 15 -18,5±0,5

METHODE AUSSAGEKRAFT GRENZEN

Schadstoff-

muster

Abreicherung leichter

abbaubarer Substanzen

erkennbar

reiner Konzentrations-Rückgang gibt

keinen Aufschluss über fracht-

reduzierende Prozesse

Redox-

milieu

Information über die

Randbedingungen des

Abbaus

durch Verwendung von integrierenden

Mischproben Bewertung oft ungenau

PCR/ MPN

gibt Informationen zu

Abbaupotential und

Redoxmilieu

PCR: kein Aktivitätsnachweis

MPN: teilweise relativ lange

Inkubationszeit

Abbau-

versuche

detaillierte Charakteri-

sierung des Schadstoff-

Abbaus

relativ lange Zeitdauer, insbesondere

anaerob

keine ins Feld übertragbaren Abbauraten

C-Isotopen

ermöglicht chemischen

Nachweis des Abbaus und

ggf. Quantifizierung

Interpretation der Ergebnisse teilweise

anspruchsvoll

PAK: aufgrund der Molekülgröße schwer

anwendbar

BTEX: aufgrund niedriger Anreicherungs-

faktoren schwer anwendbar

BEWERTUNG DER METHODEN FÜR AROMATEN

METHODE CHLORETHENE

27 ausgewertete Praxisfälle

AROMATEN

21 ausgewertete Praxisfälle

Schadstoff-

muster

bei allen Praxisfällen und

Forschungsvorhaben

bei allen Praxisfällen und

Forschungsvorhaben

Redox-

milieu

bei allen Praxisfällen und

Forschungsvorhaben

bei allen Praxisfällen und

Forschungsvorhaben

PCR bei 65% der Praxisfälle bei Forschungsvorhaben

bereits angewandt

MPN bei 45% der Praxisfälle bei 85% der Praxisfälle

Abbau-

versuche bei 80% der Praxisfälle bei 75% der Praxisfälle

C-Isotopen Daten-Basis am TZW nicht ausreichend

Die Auswertung stellt eine Auswahl dar, da weitere Substanzklassen

nicht berücksichtigt wurden.

Stand: September 2013

HÄUFIGKEIT DER ANWENDUNG AM TZW

PCE

Ethen

VC

cDCE

TCE

PCE

Ethen

VC

cDCE

TCE

Aerob/ anaerob

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C

E F G H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C

E F G H

D

12C schnell 13C langsam

BEWERTUNG DER VERSCHIEDENEN ISOTOPE

Isotopenmethoden ermöglichen

die Unterscheidung frachtreduzierender

von anderen NA-Prozessen

sowie die Quantifizierung im Feld

Isotope Chlorethene PAK/ NSO-HET BTEX

13C/12C +++ +/- ++ Die gleichzeitige

Betrachtung von

zwei Isotopen

(dual, 2D) liefert

weitergehende Informationen.

2H/1H +

Entwicklungs-

bedarf

Entwicklungs-

bedarf ++

37Cl/35Cl +

Entwicklungs- bedarf

nicht anwendbar

Schadstoffmuster wichtige erste Hinweise,

Daten liegen meistens vor

Redoxmilieu wichtige Randbedingung, Daten liegen oft vor

Mikrobiologische Bestandsaufnahme PCR: schneller Nachweis mikrobieller Potentiale

MPN: relativ schneller Nachweis mikrobieller Aktivitäten

Abbauversuche (Mikrokosmen) liefern umfassende Kenntnisse des Abbauverhaltens

Isotopenfraktionierung ermöglicht Unterscheidung zwischen Frachtreduktion durch

biologischen Abbau und anderen NA-Prozessen sowie Quantifizierung

ZUSAMMENFASSUNG Einzelfallbetrachtung: Je nach Komplexität eines

Standortes werden Methoden

für einen multiple-lines-of-

evidence-approach ausgewählt.

ANWENDUNGSBEISPIELE AUS KORA

Frankenthal Killisfeld

Schadstoff-

verteilung

Primärkontaminanten: PCE und TCE Primärkontaminanten: PCE und TCE

Abbauprodukte: cDCE ist Hauptkontaminant,

VC Abbauprodukte: cDCE, VC, Ethen

Redox

Redoxpotential (mV): 140 – 560 Redoxpotential (mV): 47 – 470

Sauerstoff (mg/L): < 0,1 – 5,5 Sauerstoff (mg/L): < 0,1 – 2,6

Nitrat (mg/L): < 0,5 – 100 Nitrat (mg/L): < 0,5 – 46

Eisen (mg/L): < 0,01 – 5,9 Eisen (mg/L): < 0,01 – 8,5

Methan (µg/L): < 10 – 530 Methan (µg/L): < 10 – 2000

MPN aerobe VC-Verwerter in 11 von 12 Proben

detektiert

verschiedene anaerobe und aerobe Verwerter-

Gruppen nachgewiesen

PCR

PCE à cDCE halorespiratorische Organismen

an mehreren Messstellen nachweisbar Dehalococcoides sp. (PCE à VC/Ethen) an

mehreren Messstellen nachweisbar Dehalococcoides sp. (PCE à VC/Ethen) nur

an BP46 nachweisbar

Abbau-

versuche

Anaerob-reduktiv: PCE/TCE à cDCE (VC) Anaerob-reduktiv: PCE/TCE à Ethen

Aerob-oxidativ: VC produktiv, cDCE

cometabolisch mit VC, cDCE produktiv

Aerob-oxidativ: VC produktiv, cDCE

cometabolisch mit VC

Isotopen

Anreicherungsfaktoren in Abbauversuchen

bestimmt

Abbau am Standort quantifiziert

Anreicherungsfaktoren in Abbauversuchen

bestimmt

Abbau-

schema

sequentiell anaerob-aerob: sequentiell anaerob-aerob:

PCE/TCE anaerob-reduktiv zu cDCE (VC) PCE/TCE anaerob-reduktiv zu VC/Ethen/Ethan

cDCE (VC) aerob-oxidativ zu CO2, H2O, Cl VC (cDCE) aerob-oxidativ zu CO2, H2O, Cl

PCR: ZUR VERFÜGUNG STEHENDE METHODEN

Parameter Qualitative PCR (ja/nein Ergebnis)

Quantitative PCR (Genkopien/mL)

Anaerob reduktiv dechlorierende

Organismen PCE Ethen: Dehalococcoides sp.

PCE cDCE: Desulfomonile, Desulfuromonas, Dehalobacter, Desulfitobacterium sp.

Anaerob reduktiv dechlorierende

Enzyme von Dehalococcoides PCE TCE (pceA), TCE Ethen (tceA), cDCE Ethen (vcrA), VC Ethen (bvcA)

Redoxprozesse Nitrat-, Eisen-, Sulfat-Reduzierer,

Methanogene, Acetogene, Anammox ()

Aromaten abbauende Enzyme Naphthalin-Dioxygenase,

Toluol-4-Monooxygenase () ()

Zell-Lyse

Membranfiltration

DNA-Extraktion und Reinigung

PCR = Polymerase Chain Reaction

Wasserprobe

Bakterien

DNA, Proteine,

Zelltrümmer

DNA

Amplifizierte DNA

PCR – DURCHFÜHRUNG

DNA = Erbgutinformation aller Zellen

Organismen-Nachweis anhand der

DNA für Ribosomen (= Proteinbaustelle,

in jeder Zelle enthalten)

enthält hoch konservierte Regionen

selbst nicht verwandte Arten haben

die gleiche Sequenz

und hoch variable Regionen jede Art

hat eine einzigartige Sequenz

Enzym-Nachweis anhand der DNA für Enzyme

Information über genetisches Potential,

aber nicht über aktuelle Aktivität

pic

ture

taken fro

m

http://b

bru

ner.

org

/bitn/b

r_c1.h

tm

DNA = DESOXYRIBONUCLEINSÄURE

entstandene DNA-Stränge bilden die

Vorlage für den nächsten Durchgang

bei jedem Durchgang wird die DNA-

Menge verdoppelt

exponentielle Vervielfältigung

Polymerase Primer

1

3

2

Auftrennung der doppel-

strängigen DNA

Anlagerung der Primer

Vervollständigung der Einzel-

stränge zum Doppelstrang

PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION

bp= Basenpaare +

- Start

2176 bp 1766 bp

1230 bp 1030 bp

653 bp 517 bp 453 bp 394 bp 298 bp 220 bp

154 bp

Gel-elektrophoretische Trennung des

PCR-Produkts in einem Agarose-Gel

DNA ist negativ geladen

wandert im elektrischen Feld zur

Anode (Plus-Pol)

das Agarose-Gel bildet ein Molekülsieb

kleinere Fragmente wandern

schneller

Auftrennung der DNA-Fragmente

nach ihrer Größe

AUSWERTUNG EINER PCR-REAKTION

REAKTIONSSCHEMA QUANTITATIVE PCR

l

l l

l

l

l

l l

+ Farbstoff

Zugabe von Fluoreszenz-

farbstoffen zur PCR-Reaktion

ungebunden

wenig Fluoreszenz

Bindung an doppelsträngige

DNA Fluoreszenz

Exponentielle Zunahme der

Fluoreszenz mit exponentieller

Vervielfältigung der DNA

Messung der zunehmenden

Fluoreszenz als Maß für die

DNA-Menge einer Probe

MPN: ZUR VERFÜGUNG STEHENDE METHODEN

Parameter Quantitativ

(Keime/mL)

aerobe Schadstoffabbauer

VC-Verwerter

PAK-Verwerter

NSO-Heterozyklen-Verwerter

BTEX-Verwerter

aerobe Gesamtkeimzahl (GKZ) Redoxprozesse

Nitrat-Reduzierer (anaerob: NO3 N2)

Eisen-Reduzierer (anaerob: Fe(III) Fe(II))

Sulfat-Reduzierer (anaerob: SO4 S2-)

Methanogene (anaerob: CO2 CH4)

Nitrifikanten (aerob: NH4 NO2 NO3)

Nitrat-Ammonifizierer (anaerob: NO3 NO2 NH4)

Wasserprobe

dekadische

Verdünnungsreihe

Inkubation in selektiven

Nährmedien unter

verschiedenen Bedingungen

Auszählung der

bewachsenen Röhrchen

Berechnung der Keimzahlen

MPN – DURCHFÜHRUNG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

E

F

G

H

D

10

10

10

10

10

10

10

10

0

-1

-2

-3

-4

-5

-6

-7

Sterilkontrollen

PCR MPN

anwendbar

auf

Grundwasser- und

Bodenproben

Grundwasser- und

Bodenproben

Nachweis

von spezifischen

Bakterienarten mit

bestimmter Abbauleistung

von Bakterien mit

bestimmter Abbauleistung

Arten müssen bekannt und

molekularbiologisch

charakterisiert sein

Arten müssen nicht

bekannt sein

alle Abbauprozesse nur produktive

Abbauprozesse

quantitativ quantitativ

Präsenz, keine Aktivität Aktivität unter

Laborbedingungen

Zeitbedarf 2 – 3 Tage 1 bis 6 Wochen

VERGLEICH DER METHODEN PCR UND MPN

Wasserproben Befüllung der Gefäße direkt im Feld

ggf. Zugabe von Sediment, Schadstoffen, Auxiliarsubstraten, Nährstoffen

Inkubation unter relevanten Bedingungen

Proben-Entnahme und Analytik auf Schadstoffabbau und Redoxchemie

Bewertung des Standort-spezifischen Abbaupotentials

ABBAUVERSUCHE – DURCHFÜHRUNG

Bestimmung von Standort-spezifischen Faktoren in Abbauversuchen empfehlenswert

-35-30-25-20-15-10-50

anaerob PCE zu TCE

anaerob TCE zu cDCE

anaerob cDCE zu VC

anaerob VC zu Ethen

aerob TCE zu CO2

aerob cDCE zu CO2

aerob VC zu CO2

anaerob Benzol

anaerob Toluol

anaerob Xylole

aerob Benzol

aerob Toluol

aerob XyloleAnreicherungsfaktor ε [‰]

unterschiedliche Faktoren für

cDCE und VC anaerob bzw. aerob

Daten aus

Aelion, 2010:

ISOTOPEN: ANREICHERUNGSFAKTOREN