Module Genitale - Künstliche Besamung

Spermabeurteilung

Johannes Kauffold & James Erices

• Methodisches Vorgehen

• Spermatologische Nomenklatur

• Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden

Spermatologische Untersuchung

Ziel der spermatologischen Untersuchung

Die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen ermitteln • Natives Sperma • Verdünntes Sperma • Besamungsportion Die präsumptive Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen

erfassen

Bei jeder Spermauntersuchung zu beachten:

Sie ist lediglich eine Information über die zu erwartende Fertilität der Spermien.

Es wird nur ein Teil des Ejakulates (oder der Besamungsportion) untersucht und bewertet.

Die Untersuchung eines einzigen Ejakulates dient zur Orientierung, ist aber nicht ausreichend für eine diagnostische Aussage.

Erneute Untersuchung (n), wenn notwendig, je nach Tierart nach 3 – 5 Tagen.

Samenuntersuchungen:

bei Besamungstieren: Mindestanforderungen und/oder Grenzwerte

bei Decktieren: o.g. Mindestanforderungen gelten nur als Bezugsgröße

bei Vatertieren für die Arterhaltung: Beurteilung anhand

der Grenzwerte

Spermatologische Untersuchungsverfahren Die biologische Samenuntersuchung umfasst:

makroskopisch mikroskopisch chemisch -

physikalisch

• Volumen • Farbe • Konsistenz • Geruch • Beimischungen

• Konzentration • Beweglichkeit

• Massenbewegung • Vorwärtsbewegung

• Anteil lebender Spermien • Resistenztests • Agglutination • Abnorme Spermien • Fremdzellen und andere

Beimengungen

• pH-Wert -

Osmolarität •

Makroskopische Untersuchung

• Volumen (Menge, ml)

tierartspezifisch abhängig von Alter, Rasse, Jahreszeit, Absamtechnik Bei Eber und Hengst wird das Ejakulat zunächst filtriert und dann das Volumen ermittelt.

Makroskopische Untersuchung

• Aussehen Farbe

elfenbeinfarben (Schaf, Ziege, Rind) weißlich (Rind, Pferd, Schwein) weißlich-gelb (Rind gelblich (Rind) weißlich-grau (Pferd) veränderte Farben rötlich (Hinweis auf frisches Blut) bräunlich (Hinweis auf altes Blut o. Schmutz) grau o. grünlich (Hinweis auf Eiterbeimengungen

Aussehen Konsistenz wird nur geschätzt, dient lediglich zur Groborientierung

lässt erste Rückschlüsse auf Spermiendichte zu

je spermienreicher das Ejakulat ist,

desto konsistenter ist es ! rahmig (Geflügel, Schaf, Ziege, Rind milchig (Rind, Pferd, Schwein, Hund) molkig (Pferd, Schwein, Hund) wässrig: abnorm, Hinweis auf Oligozoospermie oder Azoospermie

Bulle: Ejakulatmenge

Eber: Ejakulatmenge

Makroskopische Untersuchung

Geruch

- natives Sperma nahezu geruchlos - Harngeruch, fauliger Geruch, stark tierspezifischer Geruch: zu beanstanden

Beimengungen - Kotpartikel, Haare u.a. im Ejakulat: Ausdruck mangelhafter Hygiene beim Absamen Ejakulate verwerfen

Mikroskopische Untersuchung(1)

Spermienkonzentration • grobsinnlich

http://www.landwirtschaftskammer.de/landwirtschaft/tiergesundheit/rgd/deckbulle.htm

Mikroskopische Untersuchung(1)

Spermienkonzentration

• Def. Anzahl der Spermien pro Volumeneinheit Millionen Spermien pro µl, mm3, ml • Methoden: Auszählen der Spermien in einer Zählkammer (Hämozytometer) • sehr gute und zuverlässige Methode, vor allem für Unterscheidung zwischen Spermien und ejakulatfremden Zellen • für die Routine arbeits- und zeitaufwendig!

Zählkammer nach Thoma neu

Zählkammer nach Bürker-Türk

Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte

Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte

Aufziehen von Sperma in die Blutzellpipette bis zur Marke 0,5; anschließend aqua dest. bis zur Marke 1,01 (Verdünnung 1:200)

Durchmischen des Spermas mit aqua dest. durch Schütteln der Pipette

0,5

1,01

Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte

Einige Tropfen verwerfen, Pipettenspitze abtupfen und nächsten Tropfen auf vorbereitete Zählkammer auftragen

Vorbereitung der Zählkammer: Deckgläschen auf Zählkammer auflegen und fest andrücken bis Newton‘sche Farbringe sichtbar werden

Einen Tropfen des Sperma-aqua dest.-Gemisches wird auf die Zählkammer direkt vor dem Deckglas aufgebracht und gelangt dann durch Kapillarkräfte gleichmäßig in die Vertiefung der Zählkammer mit den Quadraten

Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte

- Auszählung bei 40-facher Vergrößerung - es werden nur Spermien gezählt, deren Köpfe innerhalb eines Quadrates oder auf der Begrenzungslinie unten und links liegen - gezählt werden 5 große Quadrate, ein großes Quadrat besteht aus je 16 kleinen Quadraten - die 5 großen Quadrate dürfen nicht direkt benachbart sein

2

3

4

5 4

16 1

Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte

Gesamtzahl ausgezählter Spermien (A) Fläche x Kammerhöhe x Verdünnungsgrad

in µl = A x 10000

D =

A x 10 in Mio./ml =

Mikroskopische Untersuchung(1)

Spermienkonzentration • Methode: Auszählen der Spermien mit fotoelektrischen Geräten: - Fotometer (Kolorimeter) • Weitere Methoden: - Coulter counter elektronischer Teilchenzählgerät - Durchflusszytometer Messung von fluoreszenzfarbstoff- markierten Spermien

Spermienmotilität subjektive Methoden: • Massenbewegung • Einzelbewegung

• Massenbewegung - fischzugartige, wellen- oder schwarmförmige Bewegung der Gesamtheit der Samenzellen - sie wird durch Konzentration und Vitalität der einzelnen Samenzellen verursacht - Untersuchung: Ein linsengroßer Spermatropfen auf einem Objektträger ohne Deckglas bei 80-100-facher Vergrößerung

Mikroskopische Untersuchung (2)

Beurteilung der Massenbewegung der Spermien bei Wiederkäuern

Bewegung Bewertung

keine Wellenbewegungen 0

langsame Wellenbewegungen +

lebhafte Wellenbewegungen ++

intensive Wellen- und Wirbelbildung +++

Mikroskopische Untersuchung(2)

Spermienmotilität • Einzelbewegung, in % differenziert nach: - vorwärtsbeweglichen Spermien (V) - ortsbeweglichen Spermien (O) - unbeweglichen Spermien (U) • Untersuchung: Ein senfkorngroßer Tropfen auf einem Objekträger mit Deckglas (200-400-fache Vergrößerung)

Vorwärtsbewegung der Samenzellen

Anforderung: Ein gutes Sperma soll unmittelbar nach der Gewinnung vorwärtsbewegliche Spermien aufweisen wie folgt:

Wiederkäuer ≥ 70% Eber ≥ 50%

Hengst ≥ 50% Rüde ≈ 75%

Bildauswertesystem für Motilitätsmessungen an Spermatozoen

Spermatozoenspuren farbig dargestellt

Bildschirmausdruck der Messergebnisse

Mikroskopische Untersuchung (2)

• Anteil lebender Spermien (Vitalität) - Feststellung mit Hilfe von Färbeverfahren - Eosin-Nigrosin-Färbung: lebende Spermien ungefärbt tote Spermien gefärbt (geschädigte Plasmamembran) Lebend-Tot-Rate (L –T – R) Anforderung: 75 - 25%

- Triple-Stain-Färbung (+ Akrosom; Trypanblau + Bismarck- Braun + Rosa-Bengal)

Färbung von Spermatozoen mit der Triple-stain-Technik zur Beurteilung der Vitalität und des Akrosomenstatus. A: lebendes Spermium mit intaktem Akrosom; B: lebendes Spermium ohne Akrosom; C: totes Spermium mit intaktem Akrosom; D: totes Spermium ohne Akrosom.

(Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)

Mikroskopische Untersuchung (3)

• Resistenztests

- Überprüfung der Lebensdauer des verdünnten Spermas bei Belastung (Routinediagnostik) Verringerung der Spermienmotilität • Haltetest: 72 h Lagerung bei bestimmter T° • Thermoresistenztest: mehrere Std. bei 38°C • HOS-Test (hypoosmotischer Schwelltest zur Testung der

Membranintegrität) • Tiefgefrierung

Mikroskopische Untersuchung (3)

• HOS

Mögliche morphologische Veränderungen, die durch den Einfluss der HOS-Lösung auftreten können. Die schraffierten Bereiche zeigen „Schwellungen“ am Spermatozoenschwanz an. Das links dargestellte Spermium zeigt keine Schwellung, es ist somit vom Verlust der Membranintegrität auszugehen.

(Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)

Mikroskopische Untersuchung (3)

• Agglutination

Im normalen Ejakulat keine Zusammenklumpung der Samenzellen

• Fremdzellen und andere Beimengungen - Epithel-, Blutzellen, Vorstufen der Spermien (Rund- zellen),Schmutzpartikel - Sperma ist nie keimfrei

Agglutination bei Ebersperma (Farelli-Färbung)

Bacteria-Sperm Interaction (Diemer et al., 1996)

E. coli!

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Mikroskopische Untersuchung (3)

• Abnorme Spermien - im normalen Ejakulaten treten morphologisch abweichende Spermienformen auf - keine verminderte Befruchtungsfähigkeit der Spermien, wenn sie 20% nicht überschreitet! Ätiologische Klassifikation der abnormen Samenzellen primäre Veränderungen sekundäre Veränderungen tertiäre Veränderungen - Methode: Färbung nach Papanicolaou

Morphologie

Schema für die Klassifizierung missgebildeter Spermien

(nach Leidl et al. 1971)

Schema für die Klassifizierung missgebildeter Spermien

(nach Leidl et al. 1971)

Schematische Darstellung der verschiedenen Spermiendefekte

Schematische Darstellung der verschiedenen Spermiendefekte

Chemisch-physikalische Untersuchung

• ph-Wert Messung, um metabolische Aktivität der Spermien zu erfassen Indikatorpapier (in der Routineuntersuchung ph-Meter (für exakte Messung)

• Osmolarität bei normalen Ejakulaten liegt der Wert zwischen 280 – 300 mOsmol (isotonischer Bereich)

pH-Wert des Spermas bei verschiedenen Haustieren

Tierart

Schwankungsbereich

Bulle

6,2 - 6,8

Bock

6,2 - 6,9

Eber

6,8 - 7,8

Hengst

6,8 - 7,4

Rüde

6,7 - 6,8

Spezielle Spermatologie Indikationen:

• Subfertilität bei klinisch unauffälligen Befunden und Normospermie

• Qualitätskontrolle von konserviertem Sperma • Ermittlung der Konservierfähigkeit von Sperma einzelner

Vatertiere • Wissenschaftliche Forschung vor allem über

Spermienphysiologie und Spermakonservierung • Einige Verfahren: CASA, Durchflusszytometrie,

Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA), Membranintegrität, In-Vitro- Kapazitationstests u. a.

Spezielle Spermatologie

Abbildung 1: Spermiensubpopulation Fluoreszenzoptische und durchflusszytometrische Darstellung von 4 Spermiensubpopulationen: Integrität von Spermienplasma- (PM) und Akrosommembran (AM) nach Doppelfärbung mit Propidiumjodid (PI) und FITC-PNA. Q1: PI-positive und FITC-PNA-negative Zellen: PM defekt, AM intakt; Q2: PI-positive und FITC-PNA-positive Zellen: PM und AM defekt; Q3: PInegative und FITC-PNA-negative Zellen: PM und AM intakt; Q4: PI-negative und FITC-PNA-positive Zellen: PM intakt, AM defekt.

Spezielle Spermatologie

Abbildung 3: Eberspermien „Ovidukt Explant Assay“: an ein Eileiterexplant gebundene Eberspermien. Vergrößerung × 250.

CASA – Computer Assistant Semen Analysis

Quelle: http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0093691X10002402-gr2.jpg Quelle: Internet

Spermatologische Nomenklatur

• Normospermie Alle Spermabefunde erfüllen Mindestforderungen. • Dysspermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen gering bis mittelgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf. • Pathospermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen hochgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf.

Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (1)

Normospermie entspricht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit der Potentia generandi

Dysspermie entspricht einer herabgesetzten Potentia generandi

Pathospermie entspricht völliger oder partieller Impotentia generandi

Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (2)

• Die Qualität des Ejakulates kann Auskunft über die Funktionsfähigkeit des Genitaltraktes geben • Die Aussagen der Spermabefunde sollten immer im Zusammenhang mit den klinischen Befunden erfolgen

Normospermie Potentia generandi zuchttauglich Dysspermie herabgesetzte Potentia generandi bedingt zuchttauglich Pathospermie völlige o. partielle Impotentia generandi zuchtuntauglich

Take Home Fragen

1. Worauf ist bei der spermatologischen Untersuchung zu achten? 2. Wie kann die Spermienkonzentration erfasst werden? 3. Welche Färbungen sind zur Beurteilung von Spermien gebräuchlich? 4. Was ist der HOS-Test? 5. Was verstehen Sie unter CASA?

Module Genitale - Künstliche Besamung

Spermaaufbereitung & -konservierung

Johannes Kauffold & James Erices

Samenaufbereitung für den Einsatz in der instrumentellen Samenübertragung

Verwendung als:

unverdünntes Frischsperma

flüssigkonserviertes Sperma

gefrierkonserviertes Sperma

Konservierungsdauer:

wenige Stunden

einige Tage

unbegrenzte Zeit

Spermaverarbeitung (oder Spermaaufbereitung)

Spermaverdünnung Spermakonservierung

Wirkung der Verdünnung auf die Spermien:

Aufgabe der Konservierung:

lebensverlängernd Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien

Anforderungen an die Verdünnungsmittel

Vergrößerung des Ejakulatvolumens

Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva

Ausreichende Pufferkapazität und geeigneter pH-Wert

Erhaltung des osmotischen Gleichgewichtes

1. Vergrößerung des Ejakulatvolumens

Zweck: maximale Nutzung des genetischen Potentials eines Vatertieres

Beispiele:

Bulle: von einem einzigen Ejakulat können 150 Besamungsportionen hergestellt werden (TG-Sperma)

Eber: 1000 Spermaportionen pro Jahr (Flüssigsperma)

Zu beachten ist:

Besamungserfolg sinkt ab, wenn die Zahl der Spermien pro Dosis einen bestimmten Schwellenwert unterschreitet!

2. Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva

Verdünnermedien enthalten u.a. folgende Grundsubstanzen:

als Energiespender: - Glukose, Fruktose, Laktose, Natriumcitrat, Milch, Trockenmagermilch

als Kryoprotektiva - Glycerol, Eidotter

als keimhemmende Substanzen: - Antibiotika (EU: Penicillin, Streptomycin, Lincomycin, Spectomycin)

Warum Eidotter als Komponente von Verdünnermedien?

Vorteile des (frischen, keimfreien) Hühnereigelbs:

Schutz vor Kälteschock ( Bildung einer Lezithinhülle rings um die Spermien → Anabiose)

es enthält Glukose, Aminosäuren, Vitamine, Enzyme

Nachteile:

sehr guter Bakteriennährboden

nicht sterilisierbar

Antibiotika?

Vor allem für flüssigkonserviertes Sperma

essentiell!

Verhalten von Bakterien in Lösungen in vitro

• Bakterien sind ziemlich “abgehärtet” und gut adaptiert an die Umgebung

• Bakterien betrachten Verdünner als ideale Kulturmedien

Adapted from Banwart, 1979

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Time storage Number bacteria (cfu/ml) 0 h 0 – 2.4 Mio 48 h 0 – 3 Mio 96 h 0 – 6.4 Mio

Chansilpa (1987), Penicillin-Streptomycin

Bakterielle Belastung abhängig von die initialen Menge, zusätzlichem Eintrag & Lagerungszeit

Flüssigkonserviertes Sperma

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

• Trend zu längerer Haltbarkeit und Lebensdauer

Extended-chilled semen (porcine)

0 2 4 6 8 10 12

1970

1980

1990

2000

year

storage time (days)

2000199019801970

Bakterien können proliferieren!

Bacterial Contaminant Growth in Extended Boar Semen (16C)

1

1E+08

1E+16

1 2 3 4 5 6 7

Days Stored

Am

ount

of

Bac

teria

(Log

gr

owth

) Extender AExtender BExtender C

Flüssigkonserviertes Sperma

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Example Generation Intervals

• Achromobacter xylosoxidans • Serratia marcescens • Inoculated 105 total CFU in broth • Monitor transmittance (630 nm) till plateau

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

-5.E+07

0.E+00

5.E+07

1.E+08

2.E+08

2.E+08

3.E+08

3.E+08

4.E+08

4.E+08

5.E+08

5.E+08

0 1 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 82 86 90 94 98

Hours

Bac

teri

al n

um

ber

37°C 22°C 16°C

Achromobacter xylosoxidans

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Serratia marcescens

0.E+00

1.E+08

2.E+08

3.E+08

4.E+08

5.E+08

6.E+08

7.E+08

8.E+08

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Hours

Bac

teri

al n

umbe

r

37°C 22°C 16°C

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Isolate Temp. Generation time

Negative Effects (12X)

Achromobacter xylosoxidans

16 °C 15.12 hr 7.5 d

22 °C 12.1 hr 6.05 d

37 °C 8.21 hr 4.1 d

Serratia marcescens

16 °C 4.26 hr 2.13 d

22 °C 2.20 hr 1.1 d

37 °C 1.01 hr 0.5 d

(Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

Anforderungen an ein AB

• Ausreichend in Menge • Muss in die Bakterien eindringen können & • Abtöten/Deaktivieren • Hängt ab vom: Bakterium & AB & Extender

• Drawbacks: Unwirksamkeit/Resistenzen

3. Pufferkapazität und pH-Wert des Verdünners

optimale Pufferkapazität: Verhinderung von Spermienschädigungen infolge der aeroben und anaeroben toxischen Stoffwechselprodukte (Citronensäure, TRIS, EDTA, TES, HEPES) geeigneter pH-Wert: Verhinderung der herabgesetzten Motilität der Spermien infolge pH-Wert-Senkung

Tierart Sperma Verdünner Bulle 6,2 - 6,8 6,0 - 6,5 Bock 6,2 - 6,9 6,5 - 7,0 Eber 6,8 - 7,8 7,0 - 7,5

Hengst 7,0 - 7,5 ca. 7 Rüde 6,7 - 6,8 6,5 - 6,9

pH-Wert des Spermas und des Verdünners

4. Osmolarität der Verdünnermedien

Osmolarität normaler Ejakulate: 280 - 300 mOsmol

Abweichungen von den osmotischen Normalverhältnissen:

> → Änderungen der Membranpermeabilität

< → Herabsetzung der Spermienvitalität,

< 200 mOsmol/l: Herabsetzung der Spermienmotilität

Samenkonservierung

• Haltbarmachung des Samens für einen begrenzten oder unbegrenzten Zeitraum Samenübertragung

Auswirkungen des Kühlschocks auf die Samenzellen

Frisch ejakuliertes Sperma verliert seine Viabilität, wenn es schnell und bei einer Temperatur < 15°C abgekühlt wird

Samenzellen von Eber, Bulle, Bock sind empfindlicher gegenüber dem Kälteschock

Auswirkungen des Kälteschocks: – Herabsetzung der Motilität – Freisetzung von Enzymen – Ionentransport über die Membran – Verlust von Membranlipiden

Methoden der Spermakonservierung

Konservierung bei Temperaturen über dem Nullpunkt (Flüssigsperma)

bei Kühlschranktemperatur (+5° C)

bei Raumtemperatur (+15 bis 25° C)

Tiefgefrierkonservierung TG-Verfahren oder LN2-Verfahren (bei –196°C)

Samenkonservierung

Unter Kryokonservierung (von griechisch κρύος, krýos = Kälte und lateinisch conservare = erhalten, bewahren) versteht man das Aufbewahren von Zellen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, die Vitalität der Zellen nahezu unbegrenzt aufrechtzuerhalten, obgleich das biologische System in den Aggregatzustand eines Festkörpers übergeht.

Tiefgefrierkonservierung

Üblich: Bulle, Bock, Hengst, Rüde Unüblich: Eber

Tiefgefrierkonservierung

Phasen Temperaturverschiebung Spermagewinnung und -beurteilung

37 32°C

Spermaverdünnung und -konfektionierung

32 23°C*

Spermaäquilibrierung 23 5°C Spermatiefgefrierung 5 -95 -196°C Spermalagerung - 196°C Auftauen -196 27 37°C**

Tiefgefrierkonservierung

(Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)

Tiefgefrierkonservierung

Manuelles Einfriergerät NICOOL LM10

Halbautomatisches Einfriergerät NICOOL BAG MS21

(Quelle: Internet)

Tiefgefrierkonservierung

(Quelle: Internet)

PC-gesteuerte Einfriergeräte MINICOOL 40 PC und NICOOL PLUS PC

Schäden?

Prinzipiell überall – sensibel Akrosom & DANN.

Take Home Fragen

1. Welche Arten der Konservierung von Sperma kennen Sie? 2. Bei welcher Tierart sind die Spermien besonders kälteempfindlich? 3. Welchem Zweck dienen Verdünner? 4. Welchem Zweck dienen Antibiotika im konserviertem Sperma & welche Anforderungen bestehen an sie? 3. Was verstehen Sie unter Kryokonservierung?